CN104491870A - 来自lt亚基的细胞穿膜肽lta2作为细胞内药物运输载体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开来自LT亚基的细胞穿膜肽LTA₂作为细胞内药物运输载体的应用，所述LTA₂的序列如SEQ ID NO：1所示。以及提供一种融合蛋白药物的制备方法，所述融合蛋白由LTA₂肽段与可作用药物的蛋白通过连接肽Linker连接获得。本发明首次发现LTA₂这一肽段具有穿透细胞膜的功能，并可携带蛋白等大分子以细胞内吞的方式进入体外多种细胞内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。LTA₂穿膜效率高，阳离子氨基酸数量少，安全无细胞毒性，潜在的不安全因素相对较少。本发明与先前发现的TAT、MPG等重组蛋白N端穿膜肽不同，是与一种重组蛋白的C端穿膜肽，在穿膜重组药物蛋白设计方面增添了新的选择。

Description

来自LT亚基的细胞穿膜肽LTA2作为细胞内药物运输载体的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地讲，涉及一种来自LT亚基的细胞穿膜肽LTA₂作为跨膜载体的应用。

背景技术

细胞膜是细胞与周围环境进行物质交换和信息传递的重要通道，它以磷脂质双层作为基本骨架，在骨架上镶嵌有各种类型的膜蛋白以及与膜蛋白结合的糖和脂质。细胞膜的特殊结构使其具有了膜内部疏水、膜两侧亲水的特性，再加上膜内具有特殊作用的孔隙和跨膜蛋白，使其能够调控细胞内外物质的运输。由于其对物质特殊的选择透过性，对细胞形成保护的同时，也将许多潜在的生物大分子药物阻挡在细胞之外。

许多生物大分子，如多肽、蛋白质、核酸不能进入细胞，难以在目标器官和组织的细胞中发挥作用，从而限制了他们在体内的应用。虽然通过物理方式，诸如：电穿孔法、显微注射法、穿孔素蛋白法等，能够将生物大分子导入到细胞内。但是，导入效率低、对细胞刺激大、靶向性不强，操作复杂等缺点，极大地限制了这类方法的应用。因此，很多研究者致力于寻求更为有效的穿膜方式。

近年来，研究者发现了一类具有特殊功能的短肽，如TAT、PEP-1、MAP、MPG、Penetratin、Stearyl-R8、MPGΔNLS，这类短肽不但能够直接穿过细胞膜进入细胞，而且能够介导外源蛋白、核酸、脂质体等大分子进入细胞。这些具有细胞穿透功能的短肽被命名为细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)。

穿膜肽的穿膜机制至今还不完全清楚，不同的细胞穿膜肽跨膜机制不同，目前被广泛认可的方式包括以下三种：1、反相胶粒模型(inverted micelle model)，穿膜肽通过细胞膜上磷脂分子的移动形成反相胶粒结构，进而进入胞浆；2、孔隙结构模型(pore formation model)，穿膜肽在细胞膜上形成跨膜的孔隙结构而进入胞浆；3、内吞方式进行细胞摄取。

细胞穿膜肽可以通过化学交联或基因融合表达等方式携带各种大分子。CPPs携带的物质可以为蛋白质(荧光蛋白、核酸酶等)、多肽(100个氨基酸残基以下)、核酸、化学小分子药物、纳米颗粒、噬菌体颗粒、荧光素、脂质体、超顺磁性粒子等。最大可以运载分子量120kDa、直径40mm的大分子物质，且目前没有明确的证据表明穿膜肽具有运载极限。穿膜肽的转导作用具有许多独特之处。穿膜肽对生物大分子的转运效率高，进入细胞速度快，对细胞毒性低，生理状态下稳定、无免疫性。这种多肽介导的生物活性分子透膜技术，在许多方面优于物理的透膜方式，而且肽链可以进行多种修饰，这类短肽在未来的细胞给药中将会发挥重要作用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供LTA₂肽段作为细胞内药物运输载体的应用。

本发明的第二个目的在于提供LTA₂肽段在制备细胞内药物运输载体中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种融合蛋白药物的制备方法。

为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：LTA₂肽段作为细胞内药物运输载体的应用，所述LTA₂的序列如SEQ ID NO：1所示。即：

DTCNEETQNLSTIYLREYQSKVKRQIFSDYQSEVDIYNRIRDEL(SEQ IDNO：1)(天冬氨酸一苏氨酸一半光氨酸一天冬酰氨一谷氨酸一谷氨酸一苏氨酸一谷氨酰胺一天冬酰氨一亮氨酸一丝氨酸一苏氨酸一异亮氨酸一酪氨酸一精氨酸一谷氨酸—酪氨酸—谷氨酰胺—丝氨酸—赖氨酸—缬氨酸—赖氨酸—精氨酸—谷氨酰胺—异亮氨酸—苯丙氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—酪氨酸—谷氨酰胺—丝氨酸—谷氨酸—缬氨酸—天冬氨酸—异亮氨酸—酪氨酸—天冬酰氨—精氨酸—异亮氨酸—精氨酸—天冬氨酸—谷氨酸—亮氨酸)。本发明所提供的细胞穿膜肽LTA2，采用基因工程重组蛋白表达方法制备。

作为一个优选方案，所述药物运输载体可携带核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和/或小分子物质以细胞内吞的方式进入细胞。

作为一个优选方案，所述药物为抗肺癌、抗乳腺癌和抗结肠癌药物。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：LTA₂肽段在制备细胞内药物运输载体中的应用。

作为一个优选方案，所述药物运输载体可携带核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和/或小分子物质以细胞内吞的方式进入细胞。

作为一个优选方案，所述药物为抗肺癌、抗乳腺癌和抗结肠癌药物。

为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：一种融合蛋白药物的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白由LTA₂肽段与可作用药物的蛋白通过连接肽Linker连接获得。

作为一个优选方案，所述可作用药物的蛋白包括活性多肽、抗癌药物蛋白、活性蛋白质分子。特别是抗肿瘤活性蛋白分子。所述细胞内药物可用于离体细胞，也可以用于体内细胞。

本发明所提供的细胞穿膜肽LTA₂是来源于大肠杆菌不耐热肠毒素蛋白(Heat labile enterotoxin,LT)(A亚基)的一段多肽序列，其具有细胞膜穿透能力。本发明首次发现LTA₂这一肽段具有穿透细胞膜的功能，并可携带蛋白等大分子跨膜进入体外多种细胞内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。因此，本发明提供了所述细胞穿膜肽LTA₂在作为药物运输载体或在制备药物运输载体中的应用，特别是在细胞内药物运输载体的应用，其中所述药物运输载体可携带生物分子包括核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和小分子以及其他大分子物质跨膜进入细胞。含有所述细胞穿膜肽LTA₂肽段，以及使用这些肽链基因构建的表达载体或所述表达载体的转基因细胞系、重组菌或重组病毒也均属于本发明的保护范围。

本发明的优点在于，穿膜效率高，10min后就可在细胞中检测到与其融合表达的荧光蛋白，与其它生物蛋白来源的CPP相比，LTA₂作为一种国际公认安全佐剂的无毒亚基肽段，阳离子氨基酸数量少，安全，无细胞毒性，潜在的不安全因素相对较少。本发明与先前发现的TAT、MPG等重组蛋白N端穿膜肽不同，是与一种重组蛋白的C端穿膜肽，在穿膜重组药物蛋白设计方面增添了新的选择。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更为广阔的应用前景。

附图说明

图1为樱桃红荧光蛋白mCherry重组质粒以及樱桃红荧光蛋白与LTA₂细胞穿膜肽通过连接肽Linker蛋白组成的重组蛋白mCherry-Linker-LTA₂的重组质粒设计策略。

图2为载体构建基因扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中，1、2为mCherry蛋白基因扩增条带；3、4为Linker蛋白基因扩增条带；5、6为LTA₂基因扩增条带。

图3为mCherry蛋白和mCherry-Linker-LTA₂蛋白纯化SDS-PAGE图，其中，1.mCherry蛋白诱导前全菌体电泳条带；2.mCherry蛋白诱导后全菌体电泳条带；3.mCherry-Linker-LTA₂蛋白诱导前全菌体电泳条带；4.mCherry-Linker-LTA₂蛋白诱导后全菌体电泳条带；5、6mCherry纯化后电泳条带；7、8mCherry-Linker-LTA₂纯化后电泳条带。

图4为穿膜肽作用于人结肠癌细胞(HCT-116)荧光显微镜图，其中，1.明视野mCherry蛋白作用12小时；2.暗视野mCherry蛋白作用12小时；3.明视野mCherry-Linker-LTA₂蛋白作用12小时；4.暗视野mCherry-Linker-LTA₂蛋白作用12小时。

图5为蛋白对人结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(Bcap-37)与人肺癌细胞(A549)作用后荧光显微镜图。其中，1.mCherry蛋白作用于人结肠癌细胞(HCT-116)12小时；2.mCherry-Linker-LTA₂蛋白作用于人结肠癌细胞(HCT-116)12小时；3.mCherry蛋白作用于人乳腺癌细胞(Bcap-37)12小时；4.mCherry-Linker-LTA₂蛋白作用于人乳腺癌细胞(Bcap-37)12小时。5.mCherry蛋白作用于人肺癌细胞(A549)12小时。6.mCherry-Linker-LTA₂蛋白作用于人肺癌细胞(A549)12小时。

图6为mCherry-Linker-LTA₂蛋白在4℃和37℃下作用于人结肠癌细胞(HCT-116)12小时后，流式细胞仪测定细胞内平均荧光强度(Mean)的柱状分析图。

图7在盐酸氯丙嗪、β-环糊精、磷酸氯喹以及LY294002四种细胞内吞抑制剂作用下，mCherry-Linker-LTA2蛋白作用于人结肠癌细胞(HCT-116)12小时后，流式细胞仪测定细胞内平均荧光强度(Mean)的柱状分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.pET24a-mCherry与pET24a-mCherry-linker-LTA₂重组质粒的构建

试剂与试剂盒：DNA聚合酶DNA Polymerase Pyrobest^TM，限制内切酶(NdeI、Xho I、BamH I、Sal I、Not I)、DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1，琼脂糖凝胶回收试剂盒TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer.4.0，质粒抽提试剂盒TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0购置于宝生物工程有限公司(大连)。胰化蛋白胨、酵母提取物购置于Oxoid公司(英国)。硫酸卡那霉素购自Sigma-Aldrich公司(美国)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。

质粒与菌株：质粒pET-24a(+)(Novagen，美国)，E.coliDH5α(Invirogen，美国)作为质粒扩增菌株。

试剂配制：

LB液体培养基：称取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，用去离子水定容到1L，121℃高压灭菌20min，常温保存。

LB固体培养基：称取胰化蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g，琼脂粉1.5g，用去离子水定容到100ml，121℃高压灭菌20min，常温保存。

硫酸卡那霉素(50μg/ml)：称取1g，溶于20mlddH2O，使用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。

TAE电泳缓冲液(50×)：称取Tris碱242g，量取冰醋酸57.1ml，0.5M EDTA(pH8.0)100ml，加去离子水定容至1L。

琼脂糖凝胶(3％)：称取3g琼脂糖，加入TAE(1×)l00ml，加热溶解，待冷却60℃左右，加入Gel Red核酸染液(100×)1ml，插好梳子，倒胶。

pET24a-mCherry重组质粒的构建

引物设计:

正向引物：5’GGAATTCCATATGGCCATCATCAAGGAGTTCAT 3’

反向引物：5’CCGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC 3’

PCR反应体系：

模板1μl，正向引物1μl，反向引物1μl，dNTP Mixture(各2.5mM)(2.5mM)4μl，10×Pyrobest Buffer II5μlPyrobest DNA Polymerase(5U/μl)0.25μl，ddH2O37.75μl，总体积50μl。

PCR反应条件：1、预变性：95℃10min；2、变性：95℃30sec，退火：55℃30sec，延伸：72℃1min，30个循环；3、再延伸：72℃10min。

琼脂糖凝胶电泳检测目的片段扩增情况，并使用凝胶回收试剂盒回收DNA片段。将回收的PCR产物与载体pET24a(+)分别进行双酶切。

双酶切PCR回收产物：mCherry基因片段15μl，10×H Buffer 3μl，Nde I1.5μl，Xho I 1.5μl，ddH2O 9μl，总体积30μl。

双酶切载体：pET24a(+)10μl，10×H Buffer 3μl，Nde I 1.5μl，Xho I 1.5μl，ddH2O 14μl，总体积30μl。

将酶切后的mCherry片段和pET24a(+)载体在16℃恒温水浴的条件下，连接8小时。

连接体系：mCherry片段9ul，pET24a(+)载体2ul，连接试剂盒Solution I 9ul，总体积20ul。

将连接产物转化感受态E coli DH5α，挑取单菌，LB培养基试管摇菌过夜，通过菌液PCR验证是否有目标条带，将验证的含有目标分子量条带的菌液送样测序。基因测序正确，pET24a-mCherry重组质粒构建成功。

pET24a-mCherry-linker-LTA₂重组质粒的构建

mCherry基因片段引物设计：

正向引物：5’GGAATTCCATATGGCCATCATCAAGGAGTTCAT 3’

反向引物：5’CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC 3’

PCR反应体系：模板1μl，正向引物1μl，反向引物1μl dNTP Mixture(各2.5mM)(2.5mM)4μl，10×Pyrobest Buffer II5μl，Pyrobest DNA Polymerase(5U/μl)0.25μl，ddH₂O 37.75μl，总体积50μl。

PCR反应条件：1、预变性：95℃10min；2、变性：95℃30sec，退火：55℃30sec，延伸：72℃1min，30个循环；3、再延伸：72℃10min。

Linker基因片段

引物设计：

正向引物：

5’CGCGGATCCGGTGGAGGAGGTTCTGGAGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGTAGCGTCGACGCGT 3’

反向引物：

5’ACGCGTCGACGCTACCTCCGCCACCACTTCCACCGCCTCCAGAACCTCCTCCACCGGATCCGCG 3’

PCR反应体系：正向引物25μl，反向引物25μl，总体积50μl。

PCR反应条件：1、预变性：95℃10min；2、梯度降温95℃-25℃，-1℃/min，70个循环；3、保温稳定25℃10min。

LTA₂基因片段引物设计：

正向引物：5’ACGCGTCGACGATACTTGTAATGAGGAGACCC 3’

反向引物：5’ATAAGAATGCGGCCGCTAATTCATCCCGAATTCTGTTAT3’

PCR反应体系：

模板1μl，正向引物1μl，反向引物1μl，dNTP Mixture(各2.5mM)(2.5mM)4μl，10×Pyrobest Buffer II 5μl，Pyrobest DNA Polymerase(5U/μl)0.25μl，ddH₂O37.75μl，总体积50μl。

PCR反应条件：1、预变性：95℃10min；2、变性：95℃30sec，退火：55℃30sec，延伸：72℃50sec，30个循环；3、再延伸：72℃10min。

pET24a-mCherry-linker-LTA₂载入了三段基因，本发明采用分步构建策略，先将中间的Linker基因插入到载体中，再将两侧的mCherry基因和LTA₂基因依次插入载体中，通过酶切，酶连，转化感受态细胞，每一段基因测序正确后，再将下一段基因连入载体中。

琼脂糖凝胶电泳检测目的片段扩增情况，并使用凝胶回收试剂盒回收Linker基因片段。将回收的Linker基因片段与载体pET24a(+)分别进行双酶切。

双酶切PCR回收产物：Linker基因片段15μl，10×T Buffer 4.5μl，BamH I1.5μl，Sal I 1.5μl，ddH₂O 7.5μl，总体积30μl。

双酶切载体：pET24a(+)载体10μl，10×T Buffer 4.5μl，BamH I 1.5μl，Sal I1.5μl，ddH₂O 12.5μl，总体积30μl。

将酶切后的mCherry片段和pET24a(+)载体在16℃恒温水浴条件下，连接8小时。

连接体系：Linker基因片段11ul，pET24a(+)载体2ul，连接试剂盒SolutionI 9ul，总体积20ul。

将连接产物转化感受态E.coli DH5α，挑取单菌，LB培养基试管摇菌过夜，通过菌液PCR验证是否有目标条带，将验证的含有目标分子量条带的菌液送样测序。基因测序正确，pET24a-Linker重组质粒构建成功。

琼脂糖凝胶电泳检测目的片段扩增情况，并使用凝胶回收试剂盒回收mCherry基因片段。将回收的mCherry基因片段与载体pET24a-Linker分别进行双酶切。

双酶切PCR回收产物：mCherry基因片段15μl，10×H Buffer 3μl，Nde I1.5μl，BamH I 1.5μl，ddH₂O 9μl，总体积30μl。

双酶切载体：pET24a-Linker载体10μl，10×H Buffer 3μl，Nde I 1.5μl，BamHI 1.5μl，ddH₂O 14μl，总体积30μl。

将酶切后的mCherry片段和pET24a-Linker重组质粒在16℃恒温水浴条件下，连接8小时。

连接体系：mCherry基因片段11ul，pET24a-Linker重组质粒片段2ul，连接试剂盒Solution I 9ul，总体积20ul。

将连接产物转化感受态E coli DH5α，挑取单菌，LB培养基试管摇菌过夜，通过菌液PCR验证是否有目标条带，将验证的含有目标分子量条带的菌液送样测序。基因测序正确，pET24a-mCherry-Linker重组质粒构建成功。

琼脂糖凝胶电泳检测目的片段扩增情况，并使用凝胶回收试剂盒回收LTA₂基因片段。将回收的LTA₂基因片段与载体pET24a-mCherry-Linker分别进行双酶切。

双酶切PCR回收产物：LTA₂基因片段15μl；10×H Buffer 3μl，BSA 3μl，Sal I 1.5μl，Not I 1.5μl，ddH₂O 6μl，总体积30μl。

双酶切载体：pET24a-mCherry-Linker重组质粒10μl，10×H Buffer 3μl，BSA3μ，Sal I 1.5μl，Not I 1.5μl，ddH₂O 11μl，总体积30μl。

将酶切后的LTA₂片段和pET24a-mCherry-Linker重组质粒在16℃恒温水浴条件下，连接8小时。

连接体系：LTA₂基因片段11ul，pET24a-mCherry-Linker重组质粒片段2ul，连接试剂盒Solution I 9ul，总体积20ul。

将连接产物转化感受态E.coli DH5α，挑取单菌，LB培养基试管摇菌过夜，通过菌液PCR验证是否有目标条带，将验证的含有目标分子量条带的菌液送样测序。基因测序正确，pET24a-mCherry-Linker-LTA2重组质粒构建成功。

实施例2.mCherry蛋白和mCherry-linker-LTA₂蛋白的表达与纯化

试剂与试剂盒：异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IsopropylB-D-I-Thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素购自Sigma-Aldrich公司(美国)，Ni-NTA亲和柱以及填料购置于Biorad公司(美国)，蛋白分子量标准品Premixed Protein Marker(Low)，蛋白上样缓冲液4×Protein SDS PAGE LoadingBuffer，购置于宝生物工程有限公司(大连)。Bradford蛋白质定量试剂盒购置于天根生化科技有限公司(北京)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。

菌株和质粒：E.coli BL21(DE3)(Invirogen，美国)作为质粒表达菌株。重组质粒pET24a-mCherry、pET24a-mCherry-linker-LTA₂为本发明上述阶段所构建。

试剂配制：

5×蛋白电泳缓冲液(Tris-甘氨酸)：称取Tris碱15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加双蒸水定容至1L。

15％蛋白电泳分离胶：量取ddH₂O 2.3ml，30％丙烯酰胺5.0ml，Tris-HCI(pH6.8)2.5ml，10％SDS 100μl，10％APS 100μl，TEMED 100μl，混合均匀。

5％蛋白电泳浓缩胶：量取ddH₂O 3.15ml，30％丙烯酰胺0.75ml，Tris-HCI(pH 6.8)0.57ml，10％SDS 45μl，10％APS 45μl，TEMED 4.5μl，混合均匀。

考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝(R-250)2g，量取乙醇200ml，冰醋酸100ml，去离子水750ml，滤纸过滤，室温保存。

蛋白脱色液：量取乙醇200ml，去离子水750ml，冰醋酸50ml，混合均匀，室温保存。

组氨酸标签蛋白纯化缓冲液：

平衡缓冲液：20mM Tris-HCI，0.5M NaCI，10mM咪唑，pH7.4。

结合缓冲液：20mM Tris-HCI，0.5M NaCI，20mM咪唑，pH7.4。

冲洗缓冲液：20mM Tris-HCI，0.5M NaCI，50mM咪唑，pH7.4。

洗脱缓冲液：20mM Tris-HCI，0.5M NaCI，400mM咪唑，pH7.4。

透析缓冲液：20mM Tris-HCI，0.5M NaCI，5％甘油，pH7.4。

使用质粒抽提试剂盒将已构建好且测序正确的重组质粒pET24a-mCherry和pET24a-mCherry-linker-LTA₂从克隆宿主菌E.coliDH5α中抽提出来，分别转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。从转化平板上挑取单克隆，接种于含有5ml LB培养基(含50μl/ml卡那霉素)的试管中，37℃，200rpm培养10小时。将培养后的菌液以1:100的比例转接于含有100ml LB培养基(含50μl/ml卡那霉素)的摇瓶中，37℃，200rpm培养，待OD600达到0.6时(约2.5小时)，加入诱导剂IPTG(终浓度0.5mM/ml)，30℃诱导培养10小时。诱导培养结束后，4℃，8000rpm离心10min，弃去上清，收集菌体。通过SDS-PAGE全菌体蛋白电泳分析，诱导后含有pET24a-mCherry和pET24a-mCherry-linker-LTA₂重组质粒的两种工程菌蛋白表达情况。mCherry蛋白和mCherry-linker-LTA₂融合蛋白理论计算的相对分子质量分别为28.8KD和35.7KD。电泳结果显示在29.0KD附近和29.0KD与44.3KD之间分别出现一条强表达带，符合两种蛋白各自预期分子质量大小。

向离心后的菌体中加入平衡缓冲液，充分重悬菌体后，在冰浴的条件下超声破碎菌体。超声条件：超声功率110w，超声3sec，间歇5sec，循环200次。待菌液破碎至澄清状态时，可认为破碎完全。超声结束后4℃，12000rpm，超速离心15min，收集破碎后的上清和沉淀。分别取少量上清和沉淀的样品，通过SDS-PAGE电泳鉴定，发现目标蛋白主要存在于在超声破碎液的上清液中，mCherry蛋白和mCherry-linker-LTA₂蛋白主要以可溶的形式表达，少量以包涵体的形式存在。

将装有Ni-NTA亲和树脂的纯化柱固定好，加入10倍体积的ddH₂O，冲洗除去纯化柱中的含20％乙醇的纯化柱保存液。加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡纯化柱。向纯化柱中缓慢加入破碎后的上清液，可以观察到红色的mCherry蛋白和红色的mCherry-linker-LTA₂蛋白会结合到纯化柱上。带上清液全部流过纯化柱后，依次加入10倍柱体积的结合缓冲液与10倍柱体积的冲洗缓冲液，以洗去纯化柱上结合的其他杂蛋白。最后使用含有400mM咪唑的洗脱缓冲液将纯化柱上吸附的目标蛋白洗脱下来，并将其收集到灭菌的EP管中，暂时保存于4℃。取少量纯化收集的样品，通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯化情况。通过Ni-NTA亲和层析，目标蛋白得到有效纯化，纯化的蛋白纯度大于80％。

将收集的蛋白样品装入透析袋中，4℃进行透析处理24小时，中间更换一次透析液，以除去蛋白溶液中的咪唑。分别收集透析后的mCherry蛋白和mCherry-linker-LTA₂蛋白，使用Bradford蛋白质定量试剂盒(考马斯亮蓝染色法)，测定纯化透析后两种蛋白的浓度。通过测定两种蛋白纯化液在595nm处的吸光度，与使用BSA标准品测定绘制的标准曲线，计算出两种蛋白的浓度。

实施例3.LTA₂蛋白对细胞的穿膜与转载运输作用

试剂和细胞株：McCoy's 5A培养基，RPMI-1640培养基，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶购置于Gibco公司(美国)，青链霉素混合液购置于索莱宝公司(北京)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。Hct-116细胞株、Bcap-37细胞株与A549细胞株购置于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海)。

试剂配置：

10％胎牛血清培养基的配制:量取180ml McCoy's 5A培养基或180mlRPMI-1640培养基，加入20ml胎牛血清，再加入2ml 100×青链霉素混合液，混合均匀后置于4℃保存。

磷酸盐缓冲液的配制：称取8NaCl，1.42gNa₂HPO₄，0.24gKHPO₄，0.2g KCl，少量超纯水溶解后，加超纯水定容至1L。121℃高压灭菌20min，室温保存。

细胞的复苏：从液氮中取出细胞冻存管，迅速将其置于37℃水浴中，不停地摇动，使细胞快速溶解；然后将其移入9ml的培养基中，900rpm离心8min；弃去上清，再加入4ml新鲜培养基，吹打均匀后，移入培养瓶中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。过夜后，换培养液除去死细胞。

将处在对数期生长的Hct-116细胞、Bcap-37细胞与A549细胞的培养瓶加入胰蛋白酶进行细胞的消化，用倒置显微镜观察，待细胞变圆，部分从瓶壁上脱落时，加入培养基终止消化。将Hct-116细胞、Bcap-37细胞与A549细胞按1×10⁵个细胞/孔的接种密度接种于24孔板。每种细胞接种18个样品孔，设实验组及对照组。

待细胞贴壁，更换培养液，继续培养至细胞占据样品孔底部面积约80％时，进行蛋白作用实验。实验组加入终浓度为2.5μl/ml、5μl/ml、10μl/ml的融合蛋白mCherry-linker-LTA₂，阴性对照组加入相同浓度的mCherry蛋白。37℃培养箱孵育，作用10min、30min、1h、6h、12h、24h、48h后进行观察。弃去细胞上清培养液，PBS洗涤三次，置于荧光显微镜下观察mCherry-linker-LTA₂融合蛋白穿膜及胞内定位情况。

Hct-116细胞中加入mCherry-linker-LTA₂融合蛋白孵育10min后，荧光显微镜下就可以观察到细胞轮廓被荧光蛋白着色，而mCherry蛋白作用的对照组细胞观察不到红色荧光。作用3小时就可以观察到细胞内清晰、明亮的红色荧光，这时mCherry-linker-LTA₂蛋白作用的Bcap-37细胞和A549可以观察到较微弱的荧光。24小时后mCherry-linker-LTA₂蛋白作用的Hct-116细胞、Bcap-37细胞与A549细胞都能观察到明亮的荧光，而Hct-116细胞的荧光更强，这可能是由于细胞类型的差异导致的穿膜效率不同的原因，而mCherry蛋白作用的Hct-116细胞、Bcap-37细胞与A549细胞对照实验组依然无法观察到荧光。48小时之后，mCherry-linker-LTA₂作用的实验组荧光更加明显，而对照组mCherry蛋白作用的细胞仅仅能观察到非常微弱的荧光，这可能是由于蛋白作用时间过长，细胞内吞作用导致细胞摄入了少量的mCherry荧光蛋白。通过实验组和对照的对比可以看出显示LTA₂可携带大分子(樱桃红荧光蛋白mCherry)高效穿膜进入细胞。

实施例4.LTA₂穿膜机制探究

试剂和细胞株：McCoy's 5A培养基，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶购置于Gibco公司(美国)，青链霉素混合液购置于索莱宝公司(北京)。盐酸氯丙嗪、β-环糊精、磷酸氯喹购置于生工生物工程股份有限公司(上海)。LY294002购置于上海碧云天生物技术有限公司(江苏)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。Hct-116细胞株购置于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海)。

试剂配置：

10％胎牛血清培养基的配制：量取180ml McCoy's 5A培养基，加入20ml胎牛血清，再加入2ml100×青链霉素混合液，混合均匀后置于4℃保存。

磷酸盐缓冲液的配制：称取8NaCl，1.42gNa₂HPO₄，0.24gKHPO₄，0.2g KCl，少量超纯水溶解后，加超纯水定容至1L。121℃高压灭菌20min，室温保存。

盐酸氯丙嗪(50mg/ml)：称取250mg，溶于5mlddH₂O，使用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，-20℃保存。

β-环糊精(50mg/ml)：称取250mg，溶于5mlddH₂O，使用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，4℃保存。

磷酸氯喹(50mg/ml)：称取250mg，溶于5mlddH₂O，使用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，-20℃保存。

1.低温对LTA₂穿膜效率的影响

将处在对数期生长的Hct-116细胞培养瓶加入胰蛋白酶进行细胞的消化，用倒置显微镜观察，待细胞变圆，部分从瓶壁上脱落时，加入培养基终止消化。将Hct-116细胞按1×10⁵个细胞/孔的接种密度接种于50mm细胞培养皿。细胞接种6个培养皿中。待细胞贴壁，更换培养液，继续培养至细胞占据样品孔底部面积约80％时，进行蛋白作用实验。

分别向6个细胞培养皿中加入终浓度为20uM的mCherry-linker-LTA₂蛋白，三个一组分别在4℃和37℃两个条件下孵育细胞10小时后进行观察。弃去细胞上清培养液，PBS洗涤三次，置于荧光显微镜下观察。加入胰蛋白酶进行细胞的消化，1000rpm离心10分钟，收集细胞沉淀，使用PBS将细胞重悬，使用流式细胞仪进行细胞内荧光测定。

通常认为细胞的内吞途径是一种依赖能量途径，低温时，细胞的能量代谢几乎停滞，即低温能够阻断细胞内吞途径。若LTA₂肽段的穿膜方式是通过内吞途径实现，那么温度的变化必然会影响胞内荧光含量。本实验选用在4℃和37℃两个条件探索温度是否影响其穿膜效率来推测其穿膜方式。荧光显微镜的观察现象以及流式细胞仪的结果均表明低温对LTA₂穿膜效率影响很大。LTA₂肽段穿膜可能与细胞内吞机制相关。

2.内吞抑制剂对LTA₂穿膜效率的影响

将处在对数期生长的Hct-116细胞培养瓶加入胰蛋白酶进行细胞的消化，用倒置显微镜观察，待细胞变圆，部分从瓶壁上脱落时，加入培养基终止消化。将Hct-116细胞按1×10⁵个细胞/孔的接种密度接种于24孔板。细胞接种15个样品孔，设实验组及对照组。

分别向孔板中加入盐酸氯丙嗪(PBS稀释，终浓度30μM)、β-环糊精(PBS稀释，终浓度100μM)磷酸氯喹(PBS稀释，终浓度100μM)，LY294002(PBS稀释，终浓度100μM)，再加入等量的终浓度为20uM的mCherry-linker-LTA₂蛋白，观察四种内吞抑制剂对mCherry-linker-LTA₂蛋白进入细胞的影响。37℃条件下，孵育10小时，弃去细胞上清培养液，PBS洗涤三次，置于荧光显微镜下观察。加入胰蛋白酶进行细胞的消化，1000rpm离心10分钟，收集细胞沉淀，使用PBS使细胞重悬，使用流式细胞仪进行细胞内荧光测定。

实验通过培养细胞与不同的内吞抑制剂孵育，考察内吞抑制剂对LTA₂及其所携带的mCherry蛋白进入细胞情况的影响。其中盐酸氯丙嗪能够引起网格蛋白网络在内涵体膜上的组装并阻止细胞表面上的被膜小窝组装，抑制网格蛋白介导的内吞作用。β-环糊精能够清除细胞膜表面的胆固醇，抑制胞膜窖介导的内吞作用。磷酸氯喹是一种可以装入内涵体和溶酶体这样的酸性囊泡的弱碱，从而抑制内涵体酸化和溶酶体酶活性，通过抑制内涵体成熟影响内吞作用。LY294002能够抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3激酶)的活性，降低细胞巨胞饮作用来抑制细胞内吞作用。

荧光显微镜下观察的现象和流式细胞仪结果都显示盐酸氯丙嗪能够显著抑制LTA₂及其所携带的mCherry蛋白进入细胞，细胞膜表面网格蛋白对LTA₂穿膜进入细胞发挥着重要作用。磷酸氯喹以及LY294002对LTA₂及其所携带的mCherry蛋白进入细胞略有影响，而β-环糊精对其入细胞几乎没有影响。

上述实验结果表明LTA₂穿膜进入细胞的过程是一种能量依耐的由网格蛋白介导的内吞作用，而内涵体成熟与巨胞饮作用也可能在其跨膜过程中发挥着一些作用。

本发明发现了一种来源于大肠杆菌不耐热肠毒素LT(A亚基)的细胞膜穿透肽，命名为LTA₂。通过与mCherry樱桃红荧光蛋白融合表达的重组蛋白mCherry-linker-LTA₂的进行的一系列体外实验，表明LTA₂具有较强的穿膜能力，并可携带大分子荧光蛋白mCherry跨膜进入包括肠癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤细胞在内的多种细胞，而不影响其所携带生物活性分子的功能，对细胞无毒副作用。通过一系列的药理实验，表明LTA₂穿膜进入细胞的过程是一种能量依耐的由网格蛋白介导的内吞作用，理论上能够被内吞作用摄入的大分子或小分子物质都可以被LTA₂穿膜肽携带进入细胞内，因此LTA₂可以作为药物运输载体携带核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和/或小分子物质跨膜进入细胞。

本发明显示LTA₂作为一种新的细胞穿膜肽，可向细胞内运送生物活性分子(如蛋白质、多肽等药物)可用作细胞内药物运输的载体。LTA₂的开发将穿膜重组药物蛋白设计、体外培养细胞的蛋白转导、细胞内蛋白或多肽药物呈递又提供了一新型的胞内运输工具。LTA₂是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体工具。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.LTA₂肽段作为细胞内药物运输载体的应用，其特征在于，所述LTA₂的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的LTA₂肽段作为细胞内药物运输载体的应用，其特征在于，所述药物运输载体可携带核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和/或小分子物质以细胞内吞的方式进入细胞。

3.根据权利要求1所述的LTA₂肽段作为细胞内药物运输载体的应用，其特征在于，所述药物为抗肺癌、抗乳腺癌和抗结肠癌药物。

4.LTA₂肽段在制备细胞内药物运输载体中的应用。

5.根据权利要求4所述的LTA₂肽段在制备细胞内药物运输载体中的应用，其特征在于，所述药物运输载体可将其携带的核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和/或小分子物质以细胞内吞的方式进入细胞。

6.根据权利要求4所述的LTA₂肽段在制备细胞内药物运输载体中的应用，其特征在于，所述药物为抗肺癌、抗乳腺癌和抗结肠癌药物。

7.一种融合蛋白药物的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白由LTA₂肽段与可作用药物的蛋白通过连接肽Linker连接获得。

8.根据权利要求7所述的一种融合蛋白药物的制备方法，其特征在于，所述可作用药物的蛋白包括活性多肽、抗癌药物蛋白、活性蛋白质分子。