CN112694522B - 一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽及其应用，该细胞穿膜肽由22个氨基酸组成，其氨基酸序列为：YGRKKRRQRRRHLFYWKLRFCF。本发明首次发现源于NMDA 2A受体第三跨膜区域C端一段多肽序列设计的细胞穿膜肽2A‑CPP。该多肽在低浓度下具有较好的细胞膜穿透能力，又因具有2A受体的特异靶向性，干扰NMDA受体内化，抑制ERK磷酸化，故可携带蛋白质等生物分子跨膜进入体外多种细胞(包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、原代培养细胞及传代培养细胞等)内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。而在高浓度下，又可产生细胞破膜作用，血循环半衰期大于6h，能保持较好的细胞形态，保证细胞表面抗原被充分检测。

Description

一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医疗领域，具体是指一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽2A-CPP及其应用。
背景技术
磷脂双分子层结构的细胞膜对维持细胞的结构和功能起着非常重要的作用，选择性地让一些小分子物质进出细胞，而一些外源性物质尤其是亲水性大分子物质则不能够通过细胞膜进入细胞内部，这对运载一些诊断和治疗潜力生物活性分子、药物进入细胞内构成了障碍。细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs)的一个重要特点是可以携带多种不同大小和性质的生物活性物质进入细胞，包括小分子化合物、染料、多肽、多肽核酸(peptide nucleo acid,PNA)、蛋白质、质粒DNA、siRNA、200nm的脂质体、噬菌体颗粒和超顺磁性粒子等，这一性质为其成为靶向药物的良好载体提供了可能。CPPs作为载体的优势在于低毒性和无细胞类型的限制，尽管CPPs可输送不同类型的物质进入细胞，但其实际应用多集中于寡肽、蛋白质、寡聚核苷(oligonucleotides，ONs)或类似物的细胞转运。因此，如何引导这些物质穿透细胞膜是一个迫切需要解决的问题。
目前介导生物大分子穿透细胞膜的方法主要包括细胞穿膜肽、脂质体、腺病毒、纳米颗粒、影细胞等，而细胞穿膜肽是一类以非受体依赖方式，非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，它们的长度一般不超过30个氨基酸且富含碱性氨基酸，氨基酸序列通常带正电荷。人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV-1)的反式转录激活因子(Tramactivating transcriptional activator,TAT)是第一个被发现的细胞穿透肽，它凭借一种无毒的、高效的方式进入细胞。此外，如果蝇艇角同源异形域(antennapedia homodomain,ANTP)、单纯疱疹病毒I型VP22转录因子、多聚精氨酸(Rn)等蛋白结构域，也具有介导异源蛋白、寡聚核苷酸、脂质体等大分子直接透过细胞膜进入细胞的功能。
一般来说，细胞穿膜肽可通过以下三种方式进入细胞：第一是直接穿膜进入细胞，此种方式是非能量和温度依赖性的，Veach等研究发现TAT蛋白在4℃和37℃具有同样的内化效率，并且在ATP删除的细胞中，内化过程仍没有被阻止；第二种是胞吞介导的移位作用，这种机制不同于直接转运，它是一种能量依赖的转运方式，这种传导机制又可以进一步分为两大类：吞噬作用和胞饮作用。吞噬作用主要发生于结构较大的颗粒货物的吸收，胞饮作用主要出现于对可溶解性货物的吸收。胞饮作用发生于各种类型的细胞中。已被报道的CPPs所用的胞饮方式有巨胞饮、网格蛋白依赖途径、胆固醇依赖网格蛋白介导途径和小窝蛋白/网格蛋白非依赖型途径等；第三种是通过形成某种跨膜结构发生的转导模式，这种机制的穿膜机理是通过反相胶束结构形成，与疏水性膜结合，然后进入细胞内。为什么同样的CPPs却存在不同的穿膜机制和通路，究其原因主要是其穿膜机制会受到诸多因素的影响，如所携带“货物”分子的大小、理化特性的不同、穿膜目标细胞的不同、CPPs的使用浓度和实验操作条件等。因CPPs的理化特性和穿膜机制不同，所以不同的CPPs在不同领域(肿瘤治疗、抗炎、生物成像、核酸与蛋白质的传送)的应用各有其倾向性。
N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体是中枢神经兴奋性离子型谷氨酸受体的一种，在中枢神经系统中有两个重要的生理功能：突触传递的调控和参与神经可塑性的调节，特别是对于长时程增强(long-term potentiation，LTP)这种学习和记忆的可能机制，具有重要的调节作用，另外在缺血性神经元坏死、神经退行性变、癫痫、药物成瘾等多种神经系统病理、生理过程中起重要作用。已经被鉴定出来的NMDA受体共有7种：GluN1、GluN2A～D、GluN3A/B。NMDA受体是由不同亚基构成的异四聚体。GluN1亚基是形成功能性NMDA受体必需的亚基，GluN1的缺失会导致NMDA受体失去其所有的功能。经典的NMDA受体是由2个GluN1和2个GluN2(A或B)组合形成，需同时结合谷氨酸和甘氨酸才能被激活，从而发挥其生物学功能,其中GluN1提供甘氨酸结合位点，GluN2提供谷氨酸结合位点。GluN2家族分布呈现明显的区域性，GluN2A和GluN2B在端脑和间脑占优势，GluN2C主要表达与小脑和各种选择核团，而GluN2D则主要表达与间脑和中脑，同时在肺、肾、心脏、胰腺、淋巴等外周组织中也有少量分布。Retchless等利用点突变及单通道记录的方法，鉴定了GluN2A和GluN2B靠近细胞内的第三次跨膜结合区域(M3)的一个氨基酸残基GluN2A为丝氨酸Ser632，GluN2C和GluN2D为亮氨酸(leucine)，而GluN2A C端的两个丝氨酸残基Ser900A和Ser929分别控制着含有GluN2A亚基的NMDA受体的开放率。因此，NMDA受体亚基的胞内端可磷酸化的氨基酸残基如丝氨酸，决定着NMDA受体亚基的特异性。
目前尚未有专门针对中枢神经系统NMDA受体设计的可干扰NMDA受体功能的穿膜肽。
发明内容
为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽及其应用，该细胞穿膜肽基于GluN2A内化相关的第三跨膜结构域设计的穿膜肽2A-CPP也是出于特异性结合NMDA 2A受体的特点，可以干扰NMDA受体激活后对下游信号通路(如ERK等)进一步激活，从而干扰神经元或者神经胶质细胞的细胞活性。
为实现上述目的，本发明的第一个方面是提供一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽，该细胞穿膜肽由22个氨基酸组成，其氨基酸序列为：YGRKKRRQRRRHLFYWKLRFCF。
本发明还提供基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽的用途，用于干扰N-甲基-D-天冬氨酸受体激活后对下游信号通路的激活，从而干扰神经元或者神经胶质细胞的细胞活性。
本发明还提供基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽的用途，用于细胞破膜剂。
本发明还提供基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽的用途，作为多肽药物载体，用于特异性抑制神经元细胞细胞外调节蛋白激酶磷酸化水平。
本发明利用2A-CPP可以进入细胞并靶向NMDA受体抑制下游ERK等信号通路，这样的多肽在抑制神经系统肿瘤细胞生长，或者抑制其它表达NMDA受体的肿瘤细胞(如部分肺癌细胞，乳腺癌细胞)生长增值等方面有很大潜在的应用价值。
本发明设计的穿膜肽2A-CPP是基于NMDA的GluN2A亚基的C端序列设计而成的。同样的，我们基于GluN2A内化相关的第三跨膜结构域设计的穿膜肽2A-CPP也是出于特异性结合NMDA 2A受体的特点，可以干扰NMDA受体激活后对下游信号通路(如ERK等)进一步激活，从而干扰神经元或者神经胶质细胞的细胞活性。另外，很多肿瘤细胞也会表达NMDA受体，并参与肿瘤细胞的分化，增殖。我们设计的2A-CPP多肽可以针对这些特定的肿瘤细胞，干扰其ERK等信号通路的活性，进而产生抗肿瘤作用。
本穿膜肽的另一个应用是在高浓度下可以作为细胞破膜剂使用，众所周知的是选择细胞破膜剂的原则有三种：1.能保持细胞的形态，在用前向角(FSC)/侧向角(SSC)分析时，能准确定位不同细胞种类；2.细胞膜表面抗原的抗体结合能力保持良好，细胞表面抗原检测可靠性高；3.能同时准确地检测细胞内外的抗原。几种常见的细胞破膜剂有0.05％皂角素(saponin)、0.1％曲拉通(Triton X-100)、70％乙醇。我们知道流式细胞仪检测细胞DNA、内抗原，如与细胞凋亡有关的P53蛋白、Bcl-2蛋白、及细胞内因子IL-4、IFN-γ等，均需要首先使流动的、完整的细胞膜产生可通透抗体的小孔，即所谓的破膜过程，细胞破膜剂即可应用于此过程。破膜的好坏直接影响荧光染色的效果和结果的分析，特别是在细胞内外抗原同时检测时尤其重要。而我们设计的穿膜肽Acpp可以有效穿过细胞膜并保持细胞形态，保障细胞表面的抗原被充分检测到。
本发明首次发现源于NMDA 2A受体第三跨膜区域C端一段多肽序列设计的细胞穿膜肽2A-CPP。该多肽在低浓度下具有较好的细胞膜穿透能力，又因具有2A受体的特异靶向性，干扰NMDA受体内化，抑制ERK磷酸化，故可携带蛋白质等生物分子跨膜进入体外多种细胞(包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、原代培养细胞及传代培养细胞等)内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。而在高浓度下，又可产生细胞破膜作用，血循环半衰期大于6h，能保持较好的细胞形态，保证细胞表面抗原被充分检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1NMDA各亚基的内质网跨膜区域信号序列；
图2Acpp穿膜肽各氨基酸位点亲水性图谱解析；
图3本发明2A-CPP穿膜肽二级结构中存在的α螺旋及折叠预测示意图；
图4本发明2A-CPP穿膜肽可以抑制由Bic/4AP诱导的ERK磷酸化水平的上升；
图5本发明2A-CPP穿膜肽的细胞溶血率曲线；
图6HEK293细胞半抑制浓度IC50曲线；
图7HEK293细胞加入2A-CPP-FITC后细胞形态的变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明的2A-CPP穿膜肽前导肽段为带有HIV病毒穿膜基序(YGRKKRRQRRR)的短肽，后续肽段是基于GluN2A受体第三跨膜结构域C端氨基酸短肽设计的(图1)，利用NCBI数据库进行Blast比对检查这段基序的特异性，发现所有匹配序列几乎均属于不同种属的GluN2A亚单位，说明Acpp后续短肽的基序非常保守，具有非常高的特异性。2A-CPP穿膜肽的制备采用目前已经成熟的多肽固相合成法合成，该方法成本较低且便于质控。
穿膜肽的氨基酸序列为：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-His-Leu-Phe-Tyr-Trp-Lys-Leu-Arg-Phe-Cys-Phe(酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸-组氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸-赖氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸)；
简写为YGRKKRRQRRRHLFYWKLRFCF，由22个氨基酸组成，分子质量为3101.73，理论等电点为11.89，为阳离子型CPP，即带有正电荷碱性氨基酸，脂肪族指数35.45，亲水性总均值为-1.605，表明其亲水性较好(图2)，经蛋白二级结构预测后存在α螺旋结构(图3)，带正电荷和α螺旋结构都是具有穿膜功能的重要特征。
当用10μM的2A-CPP处理神经元细胞时，随着作用时间的延长，可以显著抑制由Bic/4AP诱导的细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平的上升(图4)，但是在两种非神经元的细胞株中如HEK293、星形胶质细胞均不能抑制由EGF诱导的ERK磷酸化水平的上升。说明2A-CPP短肽对ERK磷酸化的抑制只局限在神经元中。也提示GluN2A的运输在由突触活性诱导的ERK信号通路的激活中起到了重要的作用。为抑制肿瘤发生机制中ERK磷酸化水平升高提供了一个潜在多肽药物载体。
而用高浓度的2A-CPP多肽稀释液处理血细胞时，我们可以看到溶血率在20％左右(图5)，说明此多肽能改变细胞膜渗透性，促进胞外物质进入细胞，因此可以用来流式细胞仪检测细胞DNA、内抗原等的实验前处理步骤。
试验例1细胞毒性实验
接种细胞：取96孔板，每孔加入含有5*103个细胞培养液，37℃，5％二氧化碳培养箱24h，使细胞贴壁。
培养细胞：配置不同浓度的穿膜肽，同时设三个阴性对照孔，37℃，5％二氧化碳培养6h。
显色：贴壁细胞每孔加入10μl Cell Counting Kit-8，继续孵育0.5-2h。比色：选择490nm波长，在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值，处理数据得到细胞存活率。结果见图6；
试验例2细胞破膜实验
实验使用终浓度为40μM的带FITC绿色荧光标记的2A-CPP处理未转染的HEK293细胞，以含有FITC的培养基作为空白对照。实验在高倍显微镜下采用HILO(Highly Inclinedand Laminated Optical Sheet，HILO，高度倾斜和层压光学片)模式观察穿膜肽对细胞的破膜过程，步骤如下：
1.调节实验仪器使显微镜处于全内反射状态；
2向外调节激光束，使全内反射处于临界状态，再稍外移激光，将观测模式调为HILO模式；
3加入2A-CPP-FITC，设定记录时间间隔为5min，记录约2-4小时。在激发波长为488nm下用荧光显微镜观察到HEK293细胞形态，如图示7变化。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
试验例3穿膜肽的突变序列
NMDA受体有不同的亚型，例如含GluN2A的受体亚型(GluN2A/NMDAR)以及含GluN2B的受体亚型(GluN2B/NMDAR)。不同亚单位组成的NMDA受体亚型的突触定位，通道特性以及所介导的下游信号通路都有着很大的差别。因此我们设计了多种突变体形式的多肽序列。提供一种基于GluN2B亚基的细胞穿膜肽，该细胞穿膜肽由23个氨基酸组成，其氨基酸序列为：YGRKKRRQRRRNGHVYEKLSSIE。一种基于改变2A的跨膜区域YWKL中的Y(酪氨酸)，突变为A(丙氨酸)，其氨基酸序列为：YGRKKRRQRRRHLFAWKLRFCF，以及将YWKL的L(亮氨酸)突变为A的多肽序列：YGRKKRRQRRRHLFYWKARFCF。这些穿膜肽的突变序列都能在不同程度上起到跨膜的作用。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg His Leu Phe Tyr Trp
1 5 10 15
Lys Leu Arg Phe Cys Phe
20

Claims (4)

1.一种基于GluN2A亚基的细胞穿膜肽，其特征在于：该细胞穿膜肽由22个氨基酸组成，其氨基酸序列为：YGRKKRRQRRRHLFYWKLRFCF。
2.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽用于制备药物的用途，其特征在于：用于干扰N-甲基-D-天冬氨酸受体激活后对下游信号通路的激活，从而干扰神经元或者神经胶质细胞的细胞活性。
3.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽用于制备药物的用途，其特征在于：用于细胞破膜剂。
4.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽用于制备药物的用途，其特征在于：作为多肽药物载体，用于特异性抑制神经元细胞细胞外调节蛋白激酶磷酸化水平。
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