WO2017109756A2 - Péptidos sintéticos moduladores del receptor nmda - Google Patents

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Edwin Alfredo REYES GUZMÁN
Nohora Angélica VEGA CASTRO
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Universidad Nacional De Colombia
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention is related in the field of peptide modulators of the activity of the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) receptor. Specifically refers to two antagonist synthetic peptides ion influx through the NMDA receptor and at a peptide with agonist activity on the NMDA receptor in rat hippocampal neuron cultures.
  • NMDA N-Methyl-D-Aspartate
  • NMDAR N-methyl-D-aspartate receptor
  • NMDA receptors are presented as sets of tetramers of two GluN1 subunits of binding of glycine and two glutamate-binding subunits, of which there are four types (GluN2A, GluN2B, GluN2C and GluN2D). Both types of GluN2A and GluN2B subunits are considered as the main ones for the operation of NMDA receptors in neurons of the system central nervous system (CNS) (Madden, 2002).
  • CNS central nervous system
  • the GluN2 subunit controls a wide range of functional properties of NMDA receptors, and Differentially expressed throughout the Nervous System Central (CNS) (Akazawa et al., 1994; Monyer et al., 1994).
  • Each subunit of the NMDA receptor is composed of of four domains, including the extracellular domain amino-terminal (ATD), the ligand-binding domain extracellular (LBD), the transmembrane domain (TMD) and the intracellular carboxyl-terminal domain (CTD) (Sobolevsky et al., 2009).
  • NMDA receptors require two coincident events: 1) The binding of glutamate and glycine, and 2) the simultaneous depolarization of the membrane, which eliminates the blockage by Mg 2 + at the level of the channel pore, giving rise to the Ca 2+ influx.
  • the entry of Ca 2 + produces a partial inhibition of NMDA receptors through a dependent calcium inactivation, thus preventing an intracellular Ca 2 + overload (Krupp et al., 1999).
  • the regulation of NMDA receptors is disabled, resulting in excessive influx of Ca 2+ through the NMDA receptor, triggering multiple catabolic processes intracellular, and thus inducing neuronal death (Lipton., 2006).
  • Conotoxins are small peptides produced by marine invertebrates of the genus Conus. These conotoxins represent rigid protein compounds rich in amino acid cysteine (4-6 residues) in very well defined, and synthesized thanks to a complex mechanism that allows its great variability and efficiency in paralyzing their prey, thus ensuring success evolution of this species (Olivera., 1997). It has been determined that conotoxins are characterized by a enormous specificity, binding to receptors well defined muscle or nerve cells, where they act as antagonists of ion channels, blocking its functionality.
  • Conantokins correspond to small peptides (17-27 amino acids), poor in disulfide bridges unlike the others conotoxins, found in Conus poisons geographus, and have a high affinity to block NMDA receptor, with potential effect anticonvulsant and antinociceptive.
  • conantokin-G CGX-1007
  • Con-G a peptide of 17 amino acids (SEQ ID NO: 1) that is characterized by the presence of five residues of the modified amino acid carboxyglutamate ( ⁇ - carboxyglutamate or Gla), this toxin presents competitive and non-competitive antagonism by the subunits of the NMDA receptor (Prorok and Castellino, 2007).
  • the ⁇ -carboxyglutamate residues allow coordination of divalent ions (Ca 2+, primarily) which gives ⁇ -helix form to conantokin-G (Myers et to the., 1990).
  • Conantokin-G As an antagonist on NMDA receptors has been evaluated in different scenarios. Conantokin G has been found to have neuroprotective effects in an ischemic event and in staurosporine-induced apoptosis (Williams et al., 2002). However, the neuroprotective effect of conantokin G in an excitotoxic context and in particularly in ischemia has not been well established. Recently a study in organotypic cultures of hippocampus and in HEK293 cells where they were expressed different combinations of receptor subunits NMDA (Alex et al., 2011), showed an effect neuroprotective of conantokin G in an environment excitotoxic.
  • conantokin presented a effect as an effective blocker of the subunits GluN2B and GluN2A, suggesting that conantokin G is a powerful molecule with a neuroprotective effect against a excitotoxic environment and this effect is mediated at the of different subunits of the NMDA receptor, in in contrast to previously described studies about the selectivity of Conantokin-G towards GluN2B subunit.
  • N-Methyl-D-Aspartate N-Methyl-D-Aspartate
  • the present invention is related in the field of peptide modulators of the activity of the NMDA receptor. It specifically refers to two synthetic antagonist peptides derived from Conantokin-G sequence and a peptide with NMDA receptor agonist activity.
  • the first synthetic peptide to appear in This invention is the one listed in SEQ ID NO: 2, featured in the sequence listing.
  • the peptide has a molecular weight of 1975.03 g / mol, is mainly hydrophilic nature and acid character.
  • the second synthetic peptide to be introduced in this invention is related in the sequence SEQ ID NO: 3, featured in sequence listing.
  • the peptide has a molecular weight of 1981.99 g / Mol, it is mainly hydrophilic in nature and character acid.
  • NMDA receptor evoked currents The activity of peptides SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 on NMDA receptor evoked currents was evaluated using the electrophysiological technique ⁇ Patch Clamp ⁇ (Hamill et al., 1981) and in configuration Whole Cell, setting the voltage to -70 mV (Voltage Clamp) in a primary culture of Hippocampal neurons from Sprague rat E18 embryos Dawley. Receiver evoked currents were evaluated NMDA by application of 100 ⁇ M NMDA and 10 ⁇ M Glycine, in the absence and presence of peptides SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 at concentrations of 10, 100 and 500 ⁇ M.
  • the peptide presented in the sequence showed a reduction in activity at the level of ionic influx of the NMDA receptor in a dependent manner concentration in cultures of hippocampal neurons, thus Likewise, the effect of the peptide (SEQ ID NO: 2) did not alter the recovery of receptor activity by new NMDA / Glycine applications, these data indicate a antagonistic effect of the peptide (SEQ ID NO: 2) on the NMDA receptor.
  • the peptide (SEQ ID NO: 2) I show selectivity towards the GluN1-a / GluN2B complex on GluN1-a / GluN2A, indicating that the peptide of this invention is selective and antagonizes GluN2B subunit of the NMDA receptor, analogous to the Known antagonism for Conantokin-G.
  • peptides Due to the low affinity of peptides (SEQ ID NO: 2, IC50 113 ⁇ M) and (SEQ ID NO: 3, IC50 181.3 ⁇ M) in neuronal cultures, to generate antagonism of the NMDA receptor, compared with reports of affinity of classical NMDA receptor antagonists (Ogden and Traynelis., 2011), including Conantokin-G (IC50 0.1 ⁇ M, Teichert et al., 2007), peptides (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) may represent an interesting pharmacological potential due to high dissociation NMDA receptor, and avoid adverse effects presented by classical receptor antagonists NMDA.
  • This invention also presents a third peptide with the sequence SEQ ID NO: 4.
  • This peptide has a molecular weight of 1948.08 g / Mol, it is mainly hydrophilic in nature and character acid.
  • the peptide presented as SEQ ID NO: 4 From the electrophysiological evaluation performed in neuronal cultures, the peptide presented as SEQ ID NO: 4, by itself it showed agonist activity towards the NMDA receptor. This peptide SEQ ID NO: 4, generated input currents via NMDA receiver at a 500 ⁇ M concentration. This peptide is presented also as an interesting pharmacological agent for processes such as memory and learning where required enhance NMDA receptor activity.
  • A Input currents (Whole cell) due to the application of 100 ⁇ M of NMDA and 10 ⁇ M of Glycine. The currents from left to right were obtained of the same neuron. The latest current graph corresponds to the overlap (Merge) between the first stimulation (black) and the last one (gray). It is noted that the magnitude of the current is maintained as that stimulations are performed and no changes are seen significant in the deactivation kinetics of each stream.
  • B Current inhibition evoked NMDA receptor using the antagonist (+) - MK801 in hippocampal neurons.
  • the peptides SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 have antagonistic effect on currents Evoked NMDA receptor in hippocampal neurons. Effect of 10, 100 and 500 ⁇ M of peptide SEQ ID NO: 2 (A) and peptide SEQ ID NO: 3 (B). Currents evoked (whole cell) of the NMDA receptor are obtained with applications of 100 ⁇ M of NMDA and 10 ⁇ M of Glycine, two applications were made initials (1-2, on the abscissa axis) of agonist, followed by four applications (3-6) of the peptide and finally two applications of NMDA (7-8, washout) to assess recovery after crash, each application was made after 4 minutes.
  • Peptide SEQ ID NO: 2 is selective towards the GluN2B subunit of the NMDA receptor. Inhibition of evoked currents per 100 ⁇ M of NMDA and 10 ⁇ M Glycine in HEK293 cells expressing the subunits NR1a / NR2B (A) and NR1a / NR2A (B) applying 500 ⁇ M of the peptide SEQ ID NO: 2.
  • the Red lines represent the blockage produced by the peptide. Electrophysiological recordings are performed 24 hours after transfection. 3-4 cells were evaluated in each case.
  • Agonist effect of peptide SEQ ID NO: 4 on the NMDA receptor (A) Stimulation with 500 ⁇ M of the peptide SEQ ID NO: 4 for 10 seconds in evoked currents (Whole Cell) of the NMDA receptor per 100 ⁇ M NMDA and 10 ⁇ M Glycine. (B). The Stimulation with 500 ⁇ M of the peptide SEQ ID NO: 4 for 10 seconds produces an inrush current which is blocked by 10 ⁇ M of (+) - MK-801.
  • the evoked currents of the NMDA receptor are achieved by applying 100 ⁇ M of NMDA (Sigma) and 10 ⁇ M Glycine (Sigma) for 5 seconds, then the agonists were washed by means of infusion with the bath solution. Given the macroscopic current desensitization that occurs in this type of channels (Nahum-Levy et al., 2001) performed successive stimulations at intervals of 4 minutes, time needed to allow recovery channel activity, which allowed to record stable input currents at a fixed potential of -60 mV that were taken as a control (Fig. 1, A).
  • (+) - MK-801 (Dizocilpine, Tocris) was used, it acts by binding at the level of the channel pore. that prevents the influx of Ca 2+ (Wong et to the., 1986).
  • the application of 10 ⁇ M of (+) - MK-801 caused a decrease of more than 50% of the response obtained by the stimulation of 100 ⁇ M of NMDA and 10 ⁇ M of Glycine ( Figure 1, B).
  • (+) - MK-801 generated an almost total blockage of the response, which in most cases no current recovery was observed after washing.
  • the peptides presented in this invention correspond to analogues of Conantokin-G, and the Molecular target of this is the GluN2B subunit of the NMDA receptor, it was necessary to determine electrophysiologically the presence of the subunit GluN2B at different days in vitro, for this the compound Ro 25-9681, which is a highly blocker selective activity-dependent towards that subunit (Fischer et al., 1997). However, to get a block less than 50% of the evoked response using 100 ⁇ M of NMDA and 10 ⁇ M of Glycine was necessary to make consecutive stimuli using 1 ⁇ M of Ro 25-9681 (Fig. 1, C). Compound Ro 25-9681 exhibits dependent blocking of activity and does not allow recovery of activity receiver after blocking. These responses were evaluated between DIV 7-14 finding a blockage significant significance of the evoked responses indicating that the GluN2B subunit is present in cultures in vitro both young and mature (Waxman and Linch, 2005).
  • Peptide SEQ ID NO: 2 is a peptide of 17 amino acids mainly hydrophilic and of character acid.
  • the peptide stocks were prepared in aqueous solution.
  • the peptide was added to the solution extracellular or bath solution using the same perfusion conditions that were performed for the NMDA applications.
  • this peptide at a concentration of 500 ⁇ M is inhibiting both subunits by more than 50% of the maximum current, but does not block with the same potentiates the GluN2B subunit as peptide SEQ ID NO: 2, this indicates that the affinity and selectivity towards that subunit is less.
  • the GluN2B and GluN2A subunits present a high degree of similarity in their sequence and given the selectivity of SEQ ID NO: 3 towards GluN2A, you may think mutated amino acids are playing an important role in the interaction towards GluN2A.
  • the other peptide that occurs in this invention in the sequence listing as SEQ ID NO: 4 also corresponds to a peptide of 17 amino acids, containing 90% of the amino acid content of the peptides presented above as, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, but with the sequence in random order. From the functional evaluation of this peptide SEQ ID NO: 4 on the evoked currents of the NMDA receptor in hippocampal neurons, the peptide was found to be generating an immediate input current to the application of the same, in addition to the current obtained due to NMDA stimulation (Fig. 6, A).
  • NMDA receptor subunits mainly (GluN2B) can improve learning and memory (Tang et al, 1999, 2001; Cao et al, 2007).
  • Clinical trials of agonists targeting the glycine binding site in the NMDA receptor have led to the idea that receptor potentiation may have a benefit therapeutic (Heresco-Levy, 2000; Coyle and Tsai, 2004; Shim et al, 2008; Labrie and Roder, 2010).
  • the peptide that in this invention is presented as SEQ ID NO: 4, and has an agonist effect pharmacology may be of importance to regulate NMDA receptor activity in processes such as memory and learning.
  • Example 1 Primary culture of Hippocampal Neurons from Sprague Dawley rat embryos of 18 days of gestation E18 .
  • hippocampal neurons Primary cultures of hippocampal neurons that were prepared from of 18-day-old Sprague Dawley rat embryos (250-300 g). All animals were used in according to the guidelines and in correspondence with the endorsement of the ethics committee of New York University Langone Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. The extraction procedure and culture were based on what was reported by Longart et al., 2004 and Beaudoin III et al., 2012.
  • Rats were sacrificed by CO 2 chamber inhalation ( ⁇ 10 min, 15 psi) and subsequent cervical dislocation. A cesarean section was performed to extract the embryos, which were placed in cold dissection medium (DPBS, 1X, (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium, Gibco) plus 1% Penicillin / Streptomycin (Gibco)). The embryo sac was removed from each individual embryo and the embryos were placed in a Petri dish with cold dissection medium. With the help of forceps, the skin covering the head and skull was removed, then the brain was cleared and the cerebrum-cerebellum complex was extracted.
  • DPBS, 1X cold dissection medium
  • Penicillin / Streptomycin Gibco
  • the cerebellum was carefully removed and an average of 10-12 brains were collected in the middle of cold dissection. Subsequently, the cerebral hemispheres were separated and the meninges were removed. Once the meninges were removed, the hippocampus could be seen. Using forceps carefully, the hippocampi from each hemisphere were removed and transferred to a 15 mL Falcon tube with 2 mL of cold dissection medium.
  • the hippocampi were washed twice with 2 mL of cold dissection medium.
  • 300 ⁇ L of 0.25% trypsin (Gibco) was added to the Falcon with the 2 mL of dissection medium with the hippocampi and it was placed in an incubator at 37 ° C for 20 minutes with constant rotation. After this, trypsin was inhibited by adding 5 mL of complete Neurobasal medium (Neurobasal Medium (Gibco) supplemented with 2% B27 (Gibco), 1% Penicillin / Streptomycin (Gibco) and 0.5 mM Glutamax (Gibco)).
  • the previous solution was discarded and two washes were carried out, first with 5 mL and then with 10 mL of complete neurobasal medium.
  • the hippocampi were mechanically dissociated in this final volume, using glass Pasteur pipettes whose tips were previously fire-polished to have 3 sizes (large, medium and small).
  • Dissociation consisted of passing the hippocampi through the tips of the Pasteur pipettes 10 times per tip, first using the large tip, then the medium tip and finally with the small tip, until a cell suspension was obtained.
  • This cell suspension was passed through a filter (Cell Srainer, 70 ⁇ M, BD Falcon) to separate undissociated tissue.
  • Cell count and viability were performed using the trypan blue method in a hemocytometer or Neubauer chamber, the cells were seeded at a density of 60,000-80,000 cells per well in 12-mm circular slides for electrophysiology, after coating with a mixture of Poly-D-lysine (37.5 ⁇ g / ml, Sigma-Aldrich) and Laminin (2.5 ⁇ g / ml, Invitrogen) in 24-well plates.
  • Some neuron cultures were maintained in 500 ⁇ L of Neurobasal medium (Gibco) supplemented with 2% B27 (Gibco), 1% Penicillin / Streptomycin and 0.5 mM Glutamax (Gibco) and in other cultures B27 was replaced by 2% of Fetal Bovine Serum.
  • Electrophysiological recordings were performed in a Whole Cell, Voltage Clamp configuration, as described in the electrophysiology section for neurons maintained in B27 between DIV (days in vitro) 7-20, and for neurons in fetal bovine serum between DIV5-15. Between 4-7 cells were evaluated for each peptide.
  • HEK293 cells Human Embryonic Kidney
  • ATCC Manassas, VA
  • ATCC Manassas, VA
  • DMEM high glucose medium Invitrogen
  • fetal bovine serum Heat Inactivated Fetal Bovine Serum, HI FBS, Invitrogen
  • the cells were transfected with the cDNAs encoding the NMDA receptor subunits each separately, using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in Opti-MEM medium.
  • the transfection ratio was, NR1a / NR2A 1: 3, NR1a / NR2B 1: 3.
  • Half of the medium was removed by complete DMEM and the cells were kept in the presence of 500 ⁇ M Ketamine to prevent excitotoxicity via NMDA receptor after transfection.
  • electrophysiological recordings were performed in a Whole Cell, Voltage Clamp configuration, as described in the next section. GFP positive cells were picked, with an Olympus microscope coupled to a fluorescence system. Between 3-5 cells were evaluated for each peptide.
  • Electrophysiological recordings were obtained from hippocampal neurons (different IVD) using the Pach Clamp technique in whole cell configuration (Hamill et al., 1981; Sackmann and Neher., 1983), with an Axopatch 200B amplifier (Axon Instruments, Union City, CA) and analyzed using the Clampfit 10.4 program (Axon Instruments, Union City, CA), keeping the membrane potential at -60 mV (Voltage clamp) and room temperature.
  • the neurons were placed in an extracellular medium (bath solution) containing; 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.0 mM CaCl 2 , 10 mM Hepes, 10 mM D-glucose, pH 7.4 (Huang et al., 2010).
  • bath solution containing; 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.0 mM CaCl 2 , 10 mM Hepes, 10 mM D-glucose, pH 7.4 (Huang et al., 2010).
  • the intracellular solution contained; 110 mM Cs-gluconate, 20 mM CsCl, 10 mM Hepes, 10 mM EGTA, 4 mM Mg-ATP, 0.4 mM Na-GTP, pH 7.3 (adjusted with CsOH).
  • Micropipettes borosilicate were prepared in a P-97 puller model (Sutter Instruments) and in a micro-forge MF-90 (Narishige), and had resistance in the 1-3 M ⁇ extracellular solution. They were used Silver Chloride (AgCl) electrodes previously chlorinated. To carry out the records using Whole Cell it was first necessary to achieve Cell attached configuration.
  • NMDA receptors To elicit evoked responses from NMDA receptors, these were activated by applying to neurons the NMDA agonist (Sigma) and the Glycine coagonist (Sigma) for 5 seconds and at different concentrations using a system infusion pumps (pencil perfusion).
  • NMDA agonist Sigma
  • Glycine coagonist Sigma
  • pencil perfusion pencil perfusion
  • SEQ ID NO: 2 The peptides that are presented were evaluated in this invention as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, each separately using the perfusion system mentioned above and released to the extracellular medium or bath solution.
  • the recording time was 4 minutes.
  • the application of peptides and agonists and coagonists Depending on the case.
  • the application time of each peptide was 10 seconds, starting 5 seconds before stimulating for 5 seconds with the NMDA agonist and Glycine coagonist.
  • washing or perfusion was performed with the bath solution or extracellular solution for remove peptides and agonists.
  • 8 records per cell two initial registers as a control stimulating with NMDA / Glycine, then 4 registers with the application of peptides plus NMDA / Glycine and two final records only with NMDA / Glycine to evaluate canal recovery.
  • Each record was made 4 minutes from each other.
  • CGX-1007 prevents excitotoxic cell death via actions at multiple types of NMDA receptors. NeuroToxicology 32: 392–399.
  • Citri A Malenka RC. 2008. Synaptic plasticity: multiple forms, functions, and mechanisms. Neuropsychopharmacology. 33 (1): 18-41.
  • Conantokin G is an NR2B-selective competitive antagonist of N-methyl-D-aspartate receptors. Mol Pharmacol. 58 (3): 614-23.
  • NMDA N-Methyl-D-aspartate
  • the anticonvulsant MK-801 is a potent N-methyl-D-aspartate antagonist. Proc Natl Acad Sci U S A. Sep; 83 (18): 7104-8.
  • NR2B-selective conantokin peptide inhibitors of the NMDA receptor display enhanced antinociceptive properties compared to non-selective conantokins. Neuropeptides. 42: 601–609.

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Abstract

La presente invención provee una serie de péptidos moduladores de la actividad del receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA). Específicamente hace referencia a dos péptidos sintéticos antagonistas del influjo iónico a través del receptor NMDA con especificidad hacia las subunidades GluN2B y GluN2A del receptor MMDA y a un péptido con actividad agonista sobre el receptor NMDA en cultivos de neuronas hipocampales de rata.

Description

PÉPTIDOS SINTÉTICOS MODULADORES DEL RECEPTOR NMDA
La presente invención está relacionada en el campo de los péptidos moduladores de la actividad del receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA). Específicamente hace referencia a dos péptidos sintéticos antagonistas del influjo iónico a través del receptor NMDA y a un péptido con actividad agonista sobre el receptor NMDA en cultivos de neuronas hipocampales de rata.
El receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) constituye el principal subtipo de receptores de glutamato y normalmente participa en la transmisión sináptica excitatoria rápida. Estos receptores se expresan ampliamente, y han sido implicados en procesos fisiológicos tales como el desarrollo neuronal, plasticidad sináptica, memoria y aprendizaje y numerosas condiciones patológicas (Citri y Malenka., 2008). También se ha involucrado al NMDAR, en procesos como el daño isquémico (Hardingham y Bading., 2010), dolor crónico, psicosis, y los principales trastornos degenerativos como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer (Mony et al., 2009a; Traynelis et al., 2010).
Los receptores NMDA se presentan como conjuntos de tetrámeros de dos subunidades GluN1 de unión de glicina y dos subunidades de unión a glutamato, de los cuales hay cuatro tipos (GluN2A, GluN2B, GluN2C y GluN2D). Ambos tipos de subunidades GluN2A y GluN2B son consideradas como las principales para el funcionamiento de los receptores NMDA en las neuronas del sistema nervioso central (SNC) (Madden, 2002).
La subunidad GluN2 controla una amplia gama de propiedades funcionales de los receptores NMDA, y se expresa diferencialmente en todo el Sistema Nervioso Central (SNC) (Akazawa et al., 1994; Monyer et al., 1994). Cada subunidad del receptor NMDA está compuesta de cuatro dominios, que incluyen el dominio extracelular amino-terminal (ATD), el dominio de unión a ligando extracelular (LBD), el dominio transmembrana (TMD) y el dominio carboxilo-terminal intracelular (CTD) (Sobolevsky et al., 2009).
La activación de los receptores NMDA requiere dos eventos coincidentes: 1) La unión de glutamato y glicina, y 2) la despolarización simultánea de la membrana, que elimina el bloqueo por parte del Mg2+ a nivel del poro del canal, dando lugar al influjo de Ca2+. En condiciones fisiológicas, la entrada de Ca2+ produce una inhibición parcial de los receptores NMDA a través de una inactivación calcio dependiente, impidiendo así una sobrecarga de Ca2+ intracelular (Krupp et al., 1999). Bajo condiciones patológicas, sin embargo, esa regulación de los receptores NMDA está desactivada, lo que resulta en exceso del influjo de Ca2+ a través del receptor NMDA, desencadenando múltiples procesos catabólicos intracelulares, y por lo tanto induciendo muerte neuronal (Lipton., 2006).
Dado el complejo funcionamiento del receptor NMDA en la transmisión sináptica, procesos de memoria y aprendizaje y que está altamente implicado en procesos patológicos como el daño isquémico, la farmacología en relación a la regulación del receptor se ha centrado en probar antagonistas dirigidos al sitio de unión de glutamato, al sitio de unión de la glicina, al canal y a sitios de regulación alostérica del receptor, todos como agentes neuroprotectores en múltiples ensayos preclínicos, sin embargo estos acercamientos han fallado (Green, 2002; Parsons et al., 2002; Lo et al., 2003; Hoyte et al., 2004; Small y Tauskela, 2005; Wang y Shuaib, 2005; Muir, 2006). En el caso de agentes bloqueadores del canal (aptiganel, Cerestat; CNS 1102), y del sitio de unión a glutamato, los niveles de antagonismo necesarios para generar neuroprotección, afectan la función cardiovascular y alteran la cognición (efectos psicóticos) (Small and Tauskela, 2005; Muir, 2006). Gavestinel (GV150526), dirigido al sitio de unión a glicina, también falló en la neuroprotección deseada (Sacco et al., 2001). Un antagonista selectivo de la subunidad GluN2B CP-101,606 es aparentemente insuficiente para protección del daño isquémico severo (Yurkewicz et al., 2005). En otro tipo de patologías como Alzheimer y Parkinson el agente Memantine ha presentado resultados prometedores dada su baja afinidad y rápida cinética de disociación, características que no presentan los antagonistas clásicos (Kotermanski and Johnson, 2009).
Otro tipo de antagonistas derivados de venenos naturales han sido probados contra el receptor NMDA. Una clase de estos venenos son las Conotoxinas, que son pequeños péptidos producidos por invertebrados marinos del género Conus. Estas conotoxinas representan compuestos de naturaleza proteica rígidos y ricos en el aminoácido cisteína (4-6 residuos) en posiciones muy bien definidas, y sintetizados gracias a un complejo mecanismo que permite su gran variabilidad y eficiencia en la parálisis de sus presas, garantizando así el éxito evolutivo de esta especie (Olivera., 1997). Se ha determinado que las conotoxinas se caracterizan por una enorme especificidad, uniéndose a receptores bien definidos de células musculares o nerviosas, donde actúan como antagonistas de los canales iónicos, bloqueando su funcionalidad.
Un tipo de conotoxinas, las Conantokinas, corresponden a pequeños péptidos (17-27 aminoácidos), pobres en puentes disulfuro a diferencia de las demás conotoxinas, se encuentran en venenos de Conus geographus, y presentan una alta afinidad para bloquear el receptor NMDA, con potencial efecto anticonvulsionante y antinociceptivo. (Layer et al., 2004; Xiao et al., 2008).
Dentro de este grupo se encuentra la conantokina-G (CGX-1007) ó Con-G, un péptido de 17 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) que se caracteriza por la presencia de cinco residuos del aminoácido modificado ácido gama carboxiglutamato (γ-carboxiglutamato ó Gla), esta toxina presenta antagonismo competitivo y no competitivo por las subunidades del receptor NMDA (Prorok y Castellino, 2007). Los residuos γ-carboxiglutamato permiten la coordinación de iones divalentes (Ca2+, principalmente) lo que le confiere forma α-hélice a la Conantokina-G (Myers et al., 1990).
Varios acercamientos con péptidos análogos de la Conantokina-G, en los que se ha reemplazado parcial y totalmente, los residuos γ-carboxiglutamato por alanina y especialmente por glutamato, (Lin et al., 1999; Chandler et al., 1993), han permitido determinar que la actividad antagonista de la Conantokina-G contra los receptores NMDA depende fuertemente de los residuos del amino-terminal, donde los residuos γ-carboxiglutamato tienen un papel estructural y funcional, especialmente los residuos Gla3 y Gla4 (Blandl et al., 1998; Zhou et al., 1996; Warder et al., 1998).
Junto con los residuos γ-carboxiglutamato, se ha descrito también que la Leu5 de la cononatokina-G parece ser el determinante molecular que permite que esta toxina presente especificidad con el dominio de unión al ligando (LBD) (residuo Met 739 ubicado en el dominio D2 del LBD) de la subunidad GluN2B del receptor NMDA, generando alta selectividad y antagonismo competitivo por esta subunidad (Donevan y McCabe., 2000; Sheng et al., 2010).
El papel de la Conantokina-G como antagonista sobre los receptores NMDA se ha evaluado en diferentes escenarios. Se ha encontrado que la conantokina G tiene efectos neuroprotectores en un evento isquémico y en apoptosis inducida por estaurosporina (Williams et al., 2002). Sin embargo el efecto neuroprotector de la conantokina G en un contexto excitotóxico y en particular en la isquemia no ha sido bien establecido. Recientemente un estudio en cultivos organotípicos de hipocampo y en células HEK293 donde se expresaron diferentes combinaciones de las subunidades del receptor NMDA (Alex et al., 2011), mostró un efecto neuroprotector de la conantokina G en un ambiente excitotóxico. En este estudio la conantokina presentó un efecto como bloqueador efectivo de las subunidades GluN2B y GluN2A, lo que sugiere que la conantokina G es una potente molécula con efecto neuroprotector ante un ambiente excitotóxico y este efecto es mediado a nivel de diferentes subunidades del receptor NMDA, en contraposición a los estudios descritos previamente acerca de la selectividad de la Conantokina-G hacia la subunidad GluN2B.
Debido que a la fecha no hay un tratamiento farmacológico eficaz para regular los procesos involucrados en las patologías dependientes del receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA), se hace necesario la búsqueda de nuevos fármacos o farmacoterapia dirigida hacia los diferentes sitios moduladores del receptor NMDA.
La presente invención está relacionada en el campo de los péptidos moduladores de la actividad del receptor NMDA. Específicamente hace referencia a dos péptidos sintéticos antagonistas derivados de la secuencia de la Conantokina-G y a un péptido con actividad agonista del receptor NMDA.
El primer péptido sintético que se presenta en esta invención es el relacionado en la SEQ ID NO: 2, presentado en la lista de secuencias. El péptido tiene un peso molecular de 1975.03 g/Mol, es principalmente de naturaleza hidrofílica y de carácter ácido.
El segundo péptido sintético que se presenta en esta invención es el relacionado en la secuencia SEQ ID NO: 3, presentado en la lista de secuencias. El péptido tiene un peso molecular de 1981.99 g/Mol, es principalmente de naturaleza hidrofílica y de carácter ácido.
En esta invención para el péptido que se presenta como SEQ ID NO: 2, se ha reemplazado los cinco residuos del aminoácido modificado gama-carboxiglutamato presentes en la Conantokina-G (posiciones 3,4,7,10 y 14) por el aminoácido aspartato (Asp) de forma que toda la secuencia SEQ ID NO: 2 contiene aminoácidos estándar. Para el péptido que se presenta como SEQ ID NO: 3, tiene las mismas modificaciones descritas en la secuencia SEQ ID NO: 2, y adicionalmente se ha sustituido la Leu 5 por Tyr, y Asn 8 por Ala.
Así mismo, los residuos C-terminal de cada uno de los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, no están amidados como en la conantokina-G.
Para determinar el efecto que pudiera tener este nuevo péptido (SEQ ID NO: 2), sobre la actividad del receptor NMDA, se realizó una evaluación electrofisiológica para analizar los cambios de corrientes evocadas por el agonista NMDA y el coagonista Glicina en el receptor NMDA, en ausencia y presencia de los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, cada uno por separado.
La actividad de los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 sobre corrientes evocadas del receptor NMDA fue evaluada mediante la técnica electrofisiológica ¨Patch Clamp¨ (Hamill et al., 1981) y en configuración de célula completa (Whole Cell), fijando el voltaje a -70 mV (Voltage Clamp) en un cultivo primario de neuronas hipocampales de embriones E18 de rata Sprague Dawley. Se evaluaron corrientes evocadas del receptor NMDA por aplicación de 100 µM de NMDA y 10 µM Glicina, en ausencia y presencia de los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 a concentraciones de 10, 100 y 500 µM.
El péptido presentado en la secuencia (SEQ ID NO: 2) mostró una reducción de la actividad a nivel de influjo iónico del receptor NMDA de forma dependiente de concentración en cultivos de neuronas hipocampales, así mismo, el efecto del péptido (SEQ ID NO: 2) no alteró la recuperación de la actividad del receptor por nuevas aplicaciones de NMDA/Glicina, estos datos indican un efecto antagonista del péptido (SEQ ID NO: 2) sobre el receptor NMDA. Para determinar la selectividad del péptido (SEQ ID NO: 2) hacia los principales subtipos de subunidades GluN2 del receptor NMDA, se expresó en células HEK293 las subunidades recombinantes del receptor NMDA, GluN1-a/GluN2A y GluN1-a/GluN2B independientemente y se evaluó el efecto de la corriente de entrada de la misma forma que se ha descrito para las neuronas. El péptido (SEQ ID NO: 2) presento selectividad hacia el complejo GluN1-a/GluN2B sobre GluN1-a/GluN2A, indicando que el péptido de esta invención es selectivo y genera antagonismo hacia la subunidad GluN2B del receptor NMDA, de forma análoga al antagonismo conocido por la Conantokina-G.
En cuanto al péptido presentado como SEQ ID NO: 3, mostró un antagonismo pero con menor potencia hacia el receptor NMDA de forma dependiente de concentración en cultivos de neuronas hipocampales que el péptido SEQ ID NO: 2. En relación a la selectividad del péptido SEQ ID NO: 3 hacia las subunidades recombinantes del receptor NMDA, se encontró que éste péptido genera antagonismo hacia ambos tipos de subunidades GluN2A y GluN2B, indicando que la Leu 5 y Asn 8, son residuos importantes para discriminar entre subunidades.
Debido a la baja afinidad de los péptidos (SEQ ID NO: 2, IC50 113 µM) y (SEQ ID NO: 3, IC50 181,3 µM) en cultivos neuronales, para generar antagonismo del receptor NMDA, comparado con los reportes de afinidad de los antagonistas clásicos del receptor NMDA (Ogden y Traynelis., 2011), incluido la Conantokina-G (IC50 0,1 µM, Teichert et al., 2007), los péptidos (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3) pueden representar un interesante potencial farmacológico debido a una alta disociación del receptor NMDA, y evitar los efectos adversos presentados por los antagonistas clásicos del receptor NMDA.
En esta invención también se presenta un tercer péptido con la secuencia SEQ ID NO: 4. Éste péptido tiene un peso molecular de 1948,08 g/Mol, es principalmente de naturaleza hidrofílica y de carácter acido.
De la evaluación electrofisiológica realizada en cultivos neuronales, el péptido presentado como SEQ ID NO: 4, por si solo mostró actividad agonista hacia el receptor NMDA. Este péptido SEQ ID NO: 4, generó corrientes de entrada vía receptor NMDA a una concentración de 500 µM. Éste péptido se presenta también como un agente farmacológico interesante para procesos como memoria y aprendizaje donde se requiere potenciar la actividad del receptor NMDA.
 Fig.1
Corrientes evocadas del receptor NMDA. (A) Corrientes de entrada (Whole cell) debido a la aplicación de 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina. Las corrientes de izquierda a derecha fueron obtenidas de la misma neurona. El último grafico de corriente corresponde al solapamiento (Merge) entre la primera estimulación (negro) y la última (gris). Se observa que la magnitud de la corriente se mantiene a medida que se realizan estimulaciones y no se ven cambios significativos en la cinética de desactivación de cada corriente. (B) Inhibición de corrientes evocadas del receptor NMDA usando el antagonista (+)-MK801 en neuronas hipocampales. Los registros de corrientes inducidos por la aplicación de 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina fueron significativamente bloqueados debido a la ocupación y permanencia a nivel del poro del canal por parte de (+)-MK801, indicando que efectivamente las corrientes obtenidas son vía receptor NMDA. (C) Inhibición de las respuestas del receptor NMDA con presencia de la subunidad GluN2B usando 1µM de Ro 25-968 durante 10 segundos. Las respuestas fueron evocadas usando 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina durante 5 segundos. Entre 3-6 neuronas dueorn evaluadas. DIV 7-14.
Fig.2
Los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 tienen efecto antagonista sobre corrientes evocadas del receptor NMDA en neuronas hipocampales. Efecto de 10, 100 y 500 µM del péptido SEQ ID NO: 2 (A) y del péptido SEQ ID NO: 3 (B). Las corrientes evocadas (whole cell) del receptor NMDA se obtuvieron con aplicaciones de 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina, se realizaron dos aplicaciones iniciales (1-2, en el eje de las abscisas) de agonista, seguido de cuatro aplicaciones (3-6) del péptido y finalmente dos aplicaciones de NMDA (7-8, washout) para evaluar la recuperación después del bloqueo, cada aplicación se realizó después de 4 minutos. Las corrientes fueron normalizadas respecto a la mayor aplicación con 100 µM NMDA y se tomó como corriente máxima (max=-1). El control corresponde a aplicaciones de 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina. Entre 4-7 neuronas fueron evaluadas por concentración.
Fig.3
Efecto de los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 sobre corrientes evocadas del receptor NMDA en neuronas hipocampales. (A) 10 µM de péptido “SEQ ID NO: 2”. (B) 100 µM de péptido “SEQ ID NO: 2”. (C) 500 µM de péptido “SEQ ID NO: 2”. En todos los casos se aplicó 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina. Después de cada aplicación del péptido se realizó lavado por perfusión (washout) para remover los remantes de péptido y agonistas y se realizó de nuevo estimulación con NMDA/Glicina. Los trazos en rojo corresponden al bloqueo por el péptido “SEQ ID NO: 2”. La imagen al final de cada panel corresponde al solapamiento (Merge) de las corrientes. (D) Curva dosis-respuesta del péptido “SEQ ID NO: 2” sobre las corrientes evocadas del receptor NMDA. (E) 10 µM de péptido “SEQ ID NO: 3”. (F) 100 µM de péptido “SEQ ID NO: 3”. (G) 500 µM de péptido “SEQ ID NO: 3”. (H) Curva dosis-respuesta del péptido “SEQ ID NO: 3” sobre las corrientes evocadas del receptor NMDA. Los trazos en verde corresponden al bloqueo por el péptido “SEQ ID NO: 3”. Para este último péptido se muestran corrientes de células mantenidas con suero fetal bovino al 2%. 4-7 células fueron evaluadas por cada concentración. Los péptidos fueron evaluados independientemente.
Fig.4
El péptido SEQ ID NO: 2 es selectivo hacia la subunidad GluN2B del receptor NMDA. Inhibición de las corrientes evocadas por 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina en células HEK293 expresando las subunidades NR1a/NR2B (A) y NR1a/NR2A (B) aplicando 500 µM del péptido SEQ ID NO: 2. Los trazos rojos representan el bloqueo producido por el péptido. Los registros electrofisiológicos se realizaron 24 horas después de la transfección. 3-4 células se evaluaron en cada caso.
Fig.5
Selectividad del péptido SEQ ID NO: 3 hacia subunidades recombinantes del receptor NMDA. Inhibición de las corrientes evocadas por 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina en células HEK293 expresando las subunidades NR1a/NR2B (A) y NR1a/NR2A (B) aplicando 500 µM del péptido SEQ ID NO: 3. Los trazos verdes representan el bloqueo producido por el péptido. Los registros electrofisiológicos se realizaron 24 horas después de la transfección. 3-4 células se evaluaron en cada caso.
Fig.6
Efecto agonista del péptido SEQ ID NO: 4 sobre el receptor NMDA. (A) Estimulación con 500 µM del péptido SEQ ID NO: 4 durante 10 segundos en corrientes evocadas (Whole Cell) del receptor NMDA por 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina. (B). La Estimulación con 500 µM del péptido SEQ ID NO: 4 durante 10 segundos produce una corriente de entrada que es bloqueada por 10 µM de (+)-MK-801.
Para evaluar el efecto que pudieran tener los péptidos sintéticos presentados en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, sobre la actividad del receptor NMDA, en cultivos de neuronas hipocampales (DIV7-14), se realizó una evaluación electrofisiológica de las corrientes de entrada macroscópicas (corrientes evocadas) del receptor NMDA. Para aislar las corrientes del receptor NMDA se aplicó un tratamiento farmacológico para bloquear la actividad de los receptores AMPA y Kainato, los receptores GABAA, canales de glicina y canales de sodio dependientes de voltaje, como se explica en el apartado de metodología.
Las corrientes evocadas del receptor NMDA se consiguieron mediante la aplicación de 100 µM de NMDA (Sigma) y 10 µM de Glicina (Sigma) durante 5 segundos, luego se realizó lavado de los agonistas mediante perfusión con la solución de baño. Dada la desensibilización de corrientes macroscópicas que ocurre en este tipo de canales (Nahum-Levy et al., 2001) se realizaron estimulaciones sucesivas en intervalos de 4 minutos, tiempo necesario para permitir la recuperación de la actividad del canal, lo que permitió registrar corrientes de entrada estables a un potencial fijo de -60 mV que fueron tomadas como control (Fig.1, A).
Para comprobar que las respuestas obtenidas eran producto de la estimulación del receptor NMDA, se usó el antagonista selectivo y no competitivo del receptor NMDA, (+)-MK-801 (Dizocilpina, Tocris), éste actúa uniéndose a nivel del poro del canal lo que previene el influjo de Ca2+ (Wong et al., 1986). La aplicación de 10 µM de (+)-MK-801 provocó una disminución de más del 50% de la respuesta obtenida por la estimulación de 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina (Figura 1, B). Una segunda aplicación de (+)-MK-801 generó un bloqueo casi total de la respuesta, que en la mayoría de los casos no se observó recuperación de la corriente después del lavado. Estos resultados indican la presencia de corrientes del receptor NMDA.
Debido a que los péptidos presentados en esta invención corresponden a análogos de Conantokina-G, y el blanco molecular de esta es la subunidad GluN2B del receptor NMDA, fue necesario determinar electrofisiológicamente la presencia de la subunidad GluN2B a diferentes días in vitro, para esto se usó el compuesto Ro 25-9681, el cual es un bloqueador altamente selectivo dependiente de actividad hacia esa subunidad (Fischer et al., 1997). Sin embargo, para conseguir un bloqueo menor al 50% de la respuesta evocada usando 100 µM de NMDA y 10 µM de Glicina fue necesario hacer estímulos consecutivos usando 1µM de Ro 25-9681 (Fig.1, C). El compuesto Ro 25-9681 presenta bloqueo dependiente de actividad y no permite recuperación de la actividad del receptor después del bloqueo. Estas respuestas fueron evaluadas entre DIV 7-14 encontrándose un bloqueo significativo de las respuestas evocadas indicando que hay presencia de la subunidad GluN2B en cultivos in vitro tanto jóvenes como maduros (Waxman y Linch, 2005).
Teniendo en mente que hay presencia de la subunidad GluN2B en las neuronas en los días in vitro mencionados se inició a evaluar los péptidos diseñados. Los cambios en la magnitud de las corrientes evocadas por el agonista NMDA y el coagonista Glicina en presencia de los péptidos, indicarían un efecto de los péptidos evaluados.
- Evaluación electrofisiológica de los péptidos.
Para evaluar funcionalmente los péptidos de esta invención mediante Patch Clamp (whole cell), se realizó estimulación de las neuronas con NMDA y Glicina para obtener corrientes de entrada como se mostró en un apartado anterior, seguido de la aplicación de los péptidos a diferentes concentraciones. Se realizaron dos aplicaciones con NMDA/Glicina, y luego cuatro aplicaciones con el péptido en intervalos de 4 minutos y posteriormente otras dos aplicaciones con NMDA/Glicina para ver la recuperación. Los péptidos fueron evaluados por separado.
El péptido SEQ ID NO: 2 es un péptido de 17 aminoácidos principalmente hidrofílico y de carácter ácido. Los stocks del péptido fueron preparados en solución acuosa. El péptido fue adicionado a la solución extracelular o solución de baño usando las mismas condiciones de perfusión que se realizó para las aplicaciones de NMDA. Se probaron diferentes dosis del péptido 10, 100 y 500 µM y para evaluar si era dependiente de actividad del receptor NMDA, se ajustaron también dosis de 50 y 100 µM de NMDA.
A una dosis de 10 µM de péptido SEQ ID NO: 2 no se observó una disminución significativa de la corriente debida a estímulos por 50 µM de NMDA y en algunos casos los resultados indican que presenta una potenciación de la respuesta algo parecido como sucede con el compuesto Ro 25-9681 a muy bajas dosis (Fischer et al., 1997).
Al aumentar la concentración de NMDA a 100 µM para ver si había algún cambio en el efecto del péptido SEQ ID NO: 2 a una concentración de 10 µM, se encontró una reducción en la corriente cerca del 40%, indicando que el péptido SEQ ID NO: 2 podría estar actuando de forma dependiente de la actividad del receptor NMDA. También se observó que al parecer el péptido SEQ ID NO: 2 a estas condiciones no está alterando significativamente la recuperación del receptor después del lavado. Teniendo en cuenta lo anterior todas las demás respuestas se realizaron usando 100 µM de NMDA.
Cuando se aumentó la dosis del péptido SEQ ID NO: 2 de 10 µM a 100 y 500 µM se observó una reducción en la corriente del receptor NMDA (Fig.2, A), de cerca del 50% tanto en aplicaciones seguidas de lavado y nueva estimulación por NMDA como por aplicaciones sucesivas del péptido, siguiendo la dinámica que se usó con el bloqueador para la subunidad GluN2B. De la Fig.2, A, se ha seleccionado la aplicación de péptido número 5, que corresponde al máximo bloqueo de la corriente en cada concentración, para mostrar los registros de corriente de la Fig.3. Para 500 µM de péptido SEQ ID NO: 2 se observa un cambio en la cinética de cierre del receptor (Fig.3, C) respecto a las concentraciones más bajas, al parecer hay competencia entre el agonista NMDA y el péptido, esto podría indicar que el péptido SEQ ID NO: 2 podría corresponder a un antagonista competitivo.
Tomando juntos estos datos se puede decir que al aumentar la concentración del péptido SEQ ID NO: 2 se está logrando inhibición de la corriente del receptor NMDA, y que esa inhibición es dependiente de concentración, sin embargo y de acuerdo a los valores de la curva de dosis-respuesta (Fig.3, D) IC50 113 µM, se puede decir que la afinidad del péptido SEQ ID NO: 2 no es alta por la subunidad GluN2B comparado con los antagonistas selectivos para esa subunidad Ro25-6981, IC50 0.0090 µM, (Fischer et al., 1997) y Conantokina G, IC50 0,1 µM, Teichert et al., 2007). Indicando que los residuos γ-carboxiglutamato son importantes para la potencia del bloqueo, pero no necesarios, dado que el péptido SEQ ID NO: 2 al carecer de esos residuos, tiene efecto como agente inhibitorio de la actividad del receptor NMDA en neuronas hipocampales y algo también importante que se observa en la mayoría de las aplicaciones del péptido SEQ ID NO: 2 es que al parecer no está alterando la recuperación del receptor después del lavado (Fig.3), algo que sucede con la mayoría de agentes bloqueadores contra esta subunidad, y que por tal razón no han tenido el éxito farmacológico en el tratamiento de las enfermedades asociadas al funcionamiento del receptor NMDA (Odgen y Traynelis., 2011).
Para el otro péptido SEQ ID NO: 3 propuesto en esta invención, se usó la misma metodología que para el péptido SEQ ID NO: 2 y se evaluaron las mismas concentraciones 10, 100 y 500 µM (Fig.2, B). Este péptido SEQ ID NO: 3 que presenta dos mutaciones en su contenido aminoacidico respecto al péptido SEQ ID NO: 2, muestra inhibición de más del 50% de las corrientes evocadas a una concentración de (500 µM), cerca del 40% a una concentración de 100 µM y a bajas concentraciones 10 µM no parece presentar bloqueo o inhibición de la corriente (Fig.3, E, F y G, respectivamente). Al igual que para el péptido SEQ ID NO: 2, este péptido SEQ ID NO: 3 presenta mayor grado de recuperación después de la estimulación a alta concentración (Fig.2, B). Como se puede apreciar en la Fig.3, H, un estimado del IC50 para este péptido SEQ ID NO: 3 es de 181,3 µM, indicando que tiene menor afinidad hacia el receptor NMDA que el péptido SEQ ID NO: 2. Esto indicaría que los residuos o aminoácidos que fueron mutados en el péptido SEQ ID NO: 2, Leu 5 y Asn 8 son importantes para la interacción e inhibición de las corrientes evocadas del receptor NMDA.
Expresión de subunidades recombinantes del receptor NMDA
Dado que los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 presentaron un efecto inhibitorio sobre corrientes evocadas del receptor NMDA en cultivos primarios de neuronas hipocampales, fue necesario determinar si los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 eran selectivos entre los principales subtipos de la subunidad GluN2 del receptor NMDA. Por tanto, se realizó la expresión de las subunidades GluN2B (NR1a/NR2B) y GluN2A (NR1a/NR2A) acopladas a la proteína verde fluorescente en células no neuronales HEK293 y se realizó la evaluación funcional electrofisiológica siguiendo la misma metodología descrita que para las neuronas hipocampales.
Se realizaron aplicaciones de los péptidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 a la máxima concentración probada en los cultivos neuronales, 500 µM. Al realizar una aplicación con 500 µM de péptido SEQ ID NO: 2 sobre las corrientes evocadas de células expresando los receptores recombinantes NR1a/NR2B, se observó un bloqueo casi total de la corriente (Fig.4, A), en relación a la corriente control. Cuando se evaluó la misma concentración para el recombinante NR1a/NR2A se observó una ligera disminución de la corriente (Fig.4, B) respecto a lo observado en la inhibición del recombinante NR1a/NR2B. Estos resultados indican una selectividad del péptido SEQ ID NO: 2 hacia la subunidad GluN2B sobre GluN2A.
En cuanto a la selectividad del SEQ ID NO: 3 hacia las subunidades del receptor NMDA, como se observa en la Figura 5, este péptido a una concentración de 500 µM está inhibiendo las dos subunidades por más del 50% de la corriente máxima, pero no bloquea con la misma potencia la subunidad GluN2B como el péptido SEQ ID NO: 2, esto indica que la afinidad y selectividad hacia esa subunidad es menor. Las subunidades GluN2B y GluN2A presentan alto grado de similaridad en su secuencia y dada la selectividad del SEQ ID NO: 3 hacia GluN2A, se puede pensar que los aminoácidos mutados están jugando un papel importante en la interacción hacia GluN2A. Sheng et al., 2010, presentó una serie análogos de Conantokinas, donde uno de los péptidos preserva los residuos γ-carboxiglutamato con las mutaciones presentes en el péptido SEQ ID NO: 3, Leu5Tyr y Asn8Ala; Con-G[L5Y/N8A], este péptido presentó inhibición solo por los subtipos de subunidades GluN2B (1a/2B y 1b/2B), en nuestros resultados en contraposición a eso encontramos que el péptido SEQ ID NO: 3 que posee las mutaciones L5Y/N8A, está generando antagonismo tanto para GluN2B como GluN2A, indicando que los residuos de Asp presente en ese péptido le permiten un mayor rango de selectividad.
El otro péptido que se presenta en esta invención en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 4, igualmente corresponde a un péptido de 17 aminoácidos, que contiene un 90% del contenido de aminoácidos de los péptidos presentados anteriormente como, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, pero con la secuencia en orden aleatorio. De la evaluación funcional de este péptido SEQ ID NO: 4 sobre las corrientes evocadas del receptor NMDA en neuronas hipocampales, se encontró que el péptido estaba generando una corriente de entrada inmediata a la aplicación del mismo, adicional a la corriente obtenida debida a la estimulación con NMDA (Fig.6, A). Para evaluar si por sí mismo el péptido SEQ ID NO: 4 en ausencia del agonista NMDA producía alguna corriente, se generó un pulso de 500 µM de ese péptido durante 10 segundos, interesantemente se encontró una corriente de entrada con una cinética de cierre mucho mayor a los que se había visto en este trabajo para corrientes de la subunidad GluN2B del receptor NMDA (Fig.6, B). Dado el tratamiento farmacológico que se usó en la solución de baño o extracelular para poder registrar solo corrientes del receptor NMDA, la corriente que se obtuvo con el péptido SEQ ID NO: 4 debía corresponder a una corriente del receptor NMDA. Para comprobar esto se usó el antagonista selectivo para el receptor NMDA, (+)-MK-801. Se encontró un bloqueo de más del 90% de la corriente de entrada debida a la estimulación por el péptido SEQ ID NO: 4 (Fig.6, B). Esto indica que el péptido SEQ ID NO: 4 probablemente se está comportando como un agonista del receptor NMDA.
La mayoría del desarrollo farmacéutico en relación al receptor NMDA se ha centrado en antagonistas. Sin embargo, hay potencial terapéutico importante en el aumento de la actividad del receptor NMDA (Lisman et al., 2008). Algunos modelos de estudio han mostrado que la sobreexpresión de algunas subunidades del receptor NMDA, principalmente (GluN2B) pueden mejorar el aprendizaje y la memoria (Tang et al, 1999, 2001; Cao et al, 2007). Ensayos clínicos de agonistas dirigidos al sitio de unión de la glicina en el receptor NMDA, han conducido a la idea de que la potenciación del receptor puede tener un beneficio terapéutico (Heresco-Levy, 2000; Coyle y Tsai, 2004; Shim et al, 2008; Labrie y Roder, 2010).
Por tanto, el péptido que en esta invención se presenta como SEQ ID NO: 4, y que tiene efecto agonista puede ser de importancia farmacología para regular la actividad del receptor NMDA en procesos como memoria y aprendizaje.
Ejemplo 1. Cultivo primario de Neuronas Hipocampales a partir de embriones de rata Sprague Dawley de 18 días de gestación E18.
Se realizaron cultivos primarios de neuronas hipocampales que fueron preparados a partir de embriones de 18 días de rata Sprague Dawley (250-300 g). Todos los animales fueron usados de acuerdo a los lineamientos y en correspondencia con el aval del comité de ética de New York University Langone Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. El procedimiento de extracción y el cultivo se basaron de acuerdo a lo reportado por Longart et al., 2004 y Beaudoin III et al., 2012.
Extracción de hipocampos
Las ratas fueron sacrificadas mediante inhalación en cámara de CO2 (~10 min, 15 psi) y posterior dislocación cervical. Se realizó una cesárea para extraer los embriones, que fueron colocados en medio de disección frio (DPBS, 1X, (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium, Gibco) más 1% de Penicilina/Estreptomicina (Gibco)). Se removió el saco embrionario a cada embrión individual y se ubicaron los embriones en una caja de Petri con medio de disección frío. Con ayuda de pinzas se removió la piel que recubre la cabeza y el cráneo, seguidamente, se despejó el cerebro y se extrajo el conjunto cerebro-cerebelo. Cuidadosamente se removió el cerebelo y se colectaron en promedio 10-12 cerebros en medio de disección frío. Posteriormente, se separaron los hemisferios cerebrales y se retiraron las meninges. Una vez retiradas las meninges se pudo apreciar el hipocampo. Usando las pinzas cuidadosamente se removieron los hipocampos de cada hemisferio y se transfirieron a un tubo Falcon de 15 mL con 2 mL de medio de disección frío.
Disociación y cultivo de las células hipocampales
Los hipocampos se lavaron dos veces con 2 mL de medio de disección frío. Para disociar el tejido, se adicionó 300 µL de tripsina 0,25% (Gibco) al Falcon con los 2 mL de medio de disección con los hipocampos y se llevó a incubadora a 37°C durante 20 minutos con rotación constante. Después de esto se inhibió la tripsina adicionando 5 mL de medio Neurobasal completo (Medio Neurobasal (Gibco) suplementado con 2% de B27 (Gibco), 1% de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) y 0.5 mM de Glutamax (Gibco)). Se descartó la solución anterior y se realizaron dos lavados, primero con 5 mL y después con 10 mL de medio neurobasal completo. Los hipocampos se disociaron mecánicamente en este volumen final, usando pipetas Pasteur de vidrio cuyas puntas fueron previamente pulidas al fuego para tener 3 tamaños (grande, mediana y pequeña). La disociación consistió en pasar los hipocampos por las puntas de las pipetas Pasteur 10 veces por punta, usando primero la de punta grande, luego la mediana y finalmente con la punta pequeña, hasta que se obtuvo una suspensión celular. Esta suspensión celular se pasó por un filtro (Cell Srainer, 70µM, BD Falcon) para separar el tejido no disociado. Se realizó conteo celular y viabilidad usando el método de azul de tripano en un hemocitómetro o cámara de Neubauer, las células se sembraron a una densidad de 60.000-80.000 células por pozo en laminillas circulares de 12 mm para electrofisiología, previo recubrimiento con una mezcla de Poli-D-lisina (37.5 µg/ml, Sigma-Aldrich) y Laminina (2.5 µg/ml, Invitrogen) en placas de 24 pozos. Algunos cultivos de neuronas fueron mantenidos en 500 µL de medio Neurobasal (Gibco) suplementado con 2% de B27 (Gibco), 1% Penicilina/Estreptomicina y 0.5 mM de Glutamax (Gibco) y en otros cultivos fue reemplazado el B27 por 2% de Suero Fetal Bovino. Los cultivos fueron mantenidos a 37°C, 95% de humedad, 5% de CO2 y se realizaron cambios de la mitad del medio cada 3-4 días. Se realizaron registros electrofisiológicos en configuración Whole Cell, Voltage Clamp, como se describe en el apartado de electrofisiología para neuronas mantenidas en B27 entre DIV (días in vitro) 7-20, y para neuronas en suero fetal bovino entre DIV5-15. Entre 4-7 células fueron evaluadas por cada péptido.
Ejemplo 2. Expresión de subunidades recombinantes del receptor NMDA
cDNAs codificantes de las subunidades del receptor NMDA de rata GluN1 (NR1a), GluN2A (NR2A) y GluN2B (NR2B), cado uno acoplado a la proteína verde fluorescente GFP y contenidos en los vectores de expresión pcDNA3.1, pcDNA1.1 y pRK5 respectivamente fueron comprados a Addgene (Cambridge, MA). Células HEK293 (Human Embryonic Kidney) fueron obtenidas de ATCC (Manassas, VA) y crecidas en frascos de 25 cm2 en medio DMEM high glucose (Invitrogen) suplementado con suero fetal bovino (Heat Inactivated Fetal Bovine Serum, HI FBS, Invitrogen) y mantenidas a 37°C, 5% CO2 y 95% de humedad. Una vez alcanzado el 100% de confluencia, 24 horas antes de la transfección, las células fueron sembradas en laminillas circulares para placas de 24 pozos previo recubrimiento con Poli-D-Lisina (50 ug/ml). Las células fueron transfectadas con los cDNAs codificantes de las subunidades del receptor NMDA cada uno por separado, usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) en medio Opti-MEM. La relación de transfección fue, NR1a/NR2A 1:3, NR1a/NR2B 1:3. Tres horas después de la transfección se removió la mitad del medio por DMEM completo y las células se mantuvieron en presencia de 500 µM de Ketamina para prevenir la excitotoxicidad vía receptor NMDA después de la transfección. 24 horas después de la transfección se realizaron registros electrofisiológicos en configuración Whole Cell, Voltage Clamp, como se describe en el apartado siguiente. Se escogieron las células GFP positivas, con un microscopio Olympus acoplado a un sistema de fluorescencia. Entre 3-5 células fueron evaluadas por cada péptido.
Ejemplo 3. Registros Electrofisiológicos.
Se obtuvieron registros electrofisiológicos (Corrientes evocadas del receptor NMDA) de las neuronas hipocampales (diferentes DIV) usando la técnica de Parche de membrana (Pach Clamp) en la configuración de célula completa (whole cell) (Hamill et al., 1981; Sackmann y Neher., 1983), con un amplificador Axopatch 200B (Axon Instruments, Unión City, CA) y analizados usando el programa Clampfit 10.4 (Axon Instruments, Unión City, CA), manteniendo el potencial de membrana a -60 mV (Voltage clamp) y temperatura ambiente. Las neuronas fueron colocadas en medio extracelular (solución de baño) conteniendo; 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.0 mM CaCl2, 10 mM Hepes, 10 mM D-glucosa, pH 7.4 (Huang et al., 2010).
El magnesio fue omitido para prevenir el bloqueo voltaje dependiente del canal del receptor NMDA (Mayer et al., 1984; Nowak et al., 1984). Igualmente se adicionó a la solución extracelular, 1 µM Tetrodotoxina (Sigma) para bloquear la actividad de canales de Na+ depe ndientes de voltaje; 20 µM CNQX (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione, Sigma) fue adicionado para eliminar la actividad de los receptores glutamatérgicos AMPA y Kainato; así mismo, se adicionó 50 µM Bicuculina (Sigma) junto con 100 µM Picrotoxina (Sigma) para eliminar las corrientes inhibitorias de los receptores GABAA. Y 1 µM Estricnina para inhibir la actividad de los canales de glicina.
La solución intracelular (micropipeta) contenía; 110 mM Cs-gluconato, 20 mM CsCl, 10 mM Hepes, 10 mM EGTA, 4 mM Mg-ATP, 0.4 mM Na-GTP, pH 7.3 (ajustado con CsOH). Las micropipetas de borosilicato fueron preparadas en un puller P-97 model (Sutter Instruments) y en una micro-forja MF-90 (Narishige), y tuvieron resistencias en la solución extracelular de 1-3 MΩ. Se utilizaron electrodos de Cloruro de plata (AgCl) previamente clorinados. Para llevar a cabo los registros mediante Whole Cell primero fue necesario lograr la configuración Cell attached. Para ello se realizó un acercamiento de la pipeta a la célula escogida para realizar el registro con ayuda de un micromanipulador. Se mantuvo una presión positiva en el interior de la micropipeta mientras se acercaba a la célula. Al hacer contacto con la membrana, se aplicó una suave succión negativa para permitir que parte de la membrana se invaginara en la pipeta provocando una firme unión entre la membrana y el vidrio. Junto con lo anterior, fue necesario también generar una pequeña depresión en la membrana al empujar la micropipeta ligeramente contra la membrana para lograr eficiencia en el sello del orden de giga ohms (>1GΩ). La ruptura de la membrana para lograr el contacto eléctrico entre la solución de registro ubicada en el interior de la micropipeta con el medio interno de la célula se logró haciendo succión usando una jeringa de 1 mL.
Para obtener respuestas evocadas de los receptores NMDA, estos fueron activados aplicando a las neuronas el agonista NMDA (Sigma) y el coagonista Glicina (Sigma) durante 5 segundos y a diferentes concentraciones mediante un sistema bombas de perfusión (perfusión pencil). Para comprobar corrientes del receptor NMDA se utilizó el bloqueador MK-801 (Sigma) y para determinar corrientes de la subunidad GluN2B del receptor NMDA, se utilizó el bloqueador específico para esa subunidad, Ro 25-9681 (Sigma).
Ejemplo 4. Aplicación de los péptidos
Se evaluaron los péptidos que se presentan en esta invención como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, cada uno por separado utilizando el sistema de perfusión mencionado anteriormente y liberados al medio extracelular o solución de baño.
Para cada registro electrofisiológico el tiempo de grabación fue 4 minutos. A los 30 segundos de iniciado el registro, se comenzó la aplicación de los péptidos y los agonistas y coagonistas dependiendo el caso. El tiempo de aplicación de cada péptido fue de 10 segundos, iniciando 5 segundos antes de estimular durante 5 segundos con el agonista NMDA y coagonista Glicina. Inmediatamente después se realizó lavado o perfusión con la solución de baño o solución extracelular para remover los péptidos y agonistas. En la mayoría de los casos se colectaron 8 registros por célula, dos registros iniciales como control estimulando con NMDA/Glicina, a continuación 4 registros con la aplicación de los péptidos más NMDA/Glicina y dos registros finales solo con NMDA/Glicina para evaluar la recuperación del canal. Cada registro se realizó a 4 minutos uno del otro.
Todas las respuestas fueron normalizadas de acuerdo a la máxima corriente evocada en ausencia de péptido. El análisis de la amplitud y cinética de las corrientes fue realizado mediante el programa ClampFit (pClamp10.4), en algunos casos se evaluó los 5 o 7 primeros segundos después de la estimulación.
Para la representación del curso temporal de las respuestas a lo largo del experimento y el ajuste de las curvas de concentración-respuesta (dose-response) de los péptidos se usó el programa GraphPad Prism V. 5, calculándose la concentración inhibidora 50 (IC50), que representa la concentración de péptido necesaria para inhibir el 50% de la respuesta máxima causada por el agonista. Los resultados están presentados como el mean ± S.E.M. La significancia estadística fue determinada por una prueba no pareada t-test cuando se comparó dos grupos. ANOVA de una vía se usó cuando se compararon tres o más grupos usando el programa GraphPad Prism V.5. P < 0.008, < 0.001, < 0.0001.
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Claims (12)

  1. Un péptido de 17 aminoácidos, caracterizado por tener la secuencia SEQ ID NO: 2.
  2. El péptido de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado por ser antagonista del receptor NMDA.
  3. El péptido de acuerdo a la reivindicación 2, donde el antagonismo es selectivo hacia la subunidad GluN2B del receptor NMDA.
  4. Un péptido de 17 aminoácidos, caracterizado por tener la secuencia SEQ ID NO: 3.
  5. El péptido de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado por ser antagonista del receptor NMDA.
  6. El péptido de acuerdo a la reivindicación 5, donde el antagonismo es selectivo hacia la subunidad GluN2B y GluN2A del receptor NMDA.
  7. Un péptido de 17 aminoácidos, caracterizado por tener la secuencia SEQ ID NO: 4.
  8. El péptido de acuerdo a la reivindicación 7, caracterizado por ser agonista del receptor NMDA.
  9. Tres péptidos de acuerdo a las reivindicaciones 1, 4 y 7 dónde el C-terminal de cada péptido no está amidado.
  10. Tres péptidos de acuerdo a las reivindicaciones 1, 4 y 7 dónde el C-terminal de cada péptido está amidado.
  11. Tres péptidos de acuerdo a las reivindicaciones 1, 4 y 7 dónde los aminoácidos que los conforman presentan configuración tipo L.
  12. Tres péptidos de acuerdo a las reivindicaciones 1, 4 y 7 dónde los aminoácidos que los conforman presentan configuración tipo D.
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