KR102398032B1

KR102398032B1 - 암 치료를 위한 5''-뉴클레오티다아제 변이체

Info

Publication number: KR102398032B1
Application number: KR1020200122164A
Authority: KR
Inventors: 이현철; 구봉성; 서형종; 김진숙
Original assignee: 비피진 주식회사
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2022-05-19
Also published as: KR102398032B9; JP2023542142A; US20230293571A1; CN116194117A; KR20220039256A; EP4183877A1; WO2022065725A1

Abstract

신규 암 치료를 위한 변이체로서, CD47에 결합하는 바인더와 복합체를 형성하는 리포좀형 나노입자에 포집된 형태로 폴리뉴클레오티드가 사용되어 암세포의 대사취약성(metabolic vulnerability)을 극대화시켜 암세포를 사멸시키는 기작을 가지도록 하는 암 치료를 위한 변이체가 개시된다. 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체를 제공한다.

Description

암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제 변이체{5'-nucleotidas variants for treatment cancer}

본 발명은 암 치료를 위한 변이체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제 변이체에 관한 것이다.

암세포는 면역세포가 CD47과 같은 다른 세포를 파괴하는 것을 막기 위해 일반 포유류 생화학에서 사용되는 신호를 남용한다. 이러한 "나를 먹지 말라(don’t eat me)"는 신호를 방해하는 것은 여러 종류의 암을 표적으로 삼을 수 있는 효과적인 암 치료법의 개발에 상당한 이득을 가져왔다.

일반적으로 대식세포라 불리는 면역세포들은 암세포를 감지한 다음 이들을 삼켜 먹어 치운다. 연구자들은 최근 몇 년 사이에 세포 표면의 단백질이 대식세포에게 자신을 먹거나 파괴하지 말라는 신호를 보낸다는 사실을 발견했다. 이는 면역 시스템이 정상적인 세포들을 공격하지 않도록 보호하는 데 유용하나, 암세포가 이를 이용해 면역 시스템을 회피하기 위해 이러한 "나를 먹지 말라"는 신호를 사용한다. 연구자들은 이전에 단백질 PD-L1과 주요 조직적합성 1급 복합체의 베타-2-마이크로글로불린 서브유닛이 암세포가 면역세포로부터 자신을 보호하기 위해 활용하고 있다는 사실을 밝혀낸 바 있다. CD47을 차단하는 항체는 현재 임상시험 중이며, PD-L1 또는 PDL1 수용체를 타겟으로 하는 암 치료법이 환자 치료에 활용되고 있다.

이 연구는 많은 암들이 정상 세포와 주변 조직에 비해 CD47을 풍부하게 생산한다는 것을 보여주었다. 최근 연구에서는 연구자들은 종양에 침투하는 대식세포가 Sirpα라는 수용체를 통해 CD47 신호를 감지할 수 있다는 사실을 밝혀냈다. 이들은 또한 접시에 환자의 암세포와 대식세포를 섞고 CD47과 Sirpα의 상호작용을 차단하면, 대식세포가 암세포를 먹어치우기 시작한다는 사실도 보여주었다. 마지막으로, 이들은 마우스에게 인간 유방암 세포를 이식하였다. CD47 신호가 차단되자 마우스 면역계의 대식세포가 암을 공격하였다. 특히 주목할 것은 CD47 신호를 차단해 혈액암과 삼중음성 유방암에 큰 영향을 미친다는 발견이었다.

[선행 특허문헌]

- 한국 공개특허 제2006-0121150호(2006.11.28.)

본 발명은 암 치료를 위한 신규 변이체로서, CD47에 결합하는 바인더와 복합체를 형성하는 리포좀형 나노입자에 포집된 형태로 폴리뉴클레오티드가 사용되어 암세포의 대사취약성(metabolic vulnerability)을 극대화시켜 암세포를 사멸시키는 기작을 가지도록 발현된 암 치료를 위한 변이체를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체를 제공한다.

삭제

또한 상기 변이체는 암세포에서 핵산대사를 저해하는 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체를 제공한다.

또한 상기 핵산대사는 dTTP 생합성 대사인 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체를 제공한다.

삭제

상기 암은 대장암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체를 제공한다.

본 발명은 CD47에 결합하는 바인더와 복합체를 형성하는 리포좀형 나노입자에 포집된 형태로 폴리뉴클레오티드가 사용되어 암세포의 대사취약성(metabolic vulnerability)을 극대화시켜 암세포를 사멸시키는 기작을 가지도록 발현된 암 치료를 위한 변이체로서, 인간세포 내에 전달되었을 때 비특이적 마이크로RNA(microRNA)로서 작용하는 부위를 최소화하고 발현을 최대화할 수 있도록 유전자 서열이 최적화된 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체를 제공할 수 있다.

도 1은 Sirpα, SV1 및 SV4의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 도면이다. 진한 글자는 부분적으로 보존되지 않은 잔기를 나타낸다. 시퀀스 정렬은 ClustalW로 이루어졌고, 이미지는 BioEdit 시퀀스 정렬 편집 프로그램으로 생성되었다.
도 2는 올바른 방향성을 위한 SV1의 돌연변이를 설명하는 도면이다. 도 2A에서는 SV 도메인(녹색 리본)이 CD47(빨간색 구면) 도메인과 결합되어 있고, 도 2A의 모델에서는 SV 도메인(빨간색 구면으로 표시)은 라이신 잔기가 올바른 방향성에 영향을 미치고 CD47에 대한 올바른 결합을 위해 변이됨을 보여준다. 도 2B는 DSPE-컨쥬게이트된 SV1 및 SV4의 질량분석법(Mass spectrometry analysis)을 이용한 분석 결과를 나타내고 있다.
도 3은 T001 및 인간 NT5M의 보존성 모티브를 나타낸 도면이다. T001 및 인간 NT5M의 시퀀스 정렬로서, 인간 NT5M 및 T001의 서열상 유사성을 확인하기 위해 ClustalW를 통해 배열하였다. 정렬에 사용된 시퀀스의 Swiss-Prot/TrEMBL 어세션 번호는 인간 NT5M 및 T001이다. 빨간색 필드는 완전히 보존된 아미노산 잔기를 나타내고, 흰색 필드의 빨간색 문자는 유사한 생화학적 기능을 가지는 부분적으로 보존된 아미노산 잔기를 나타낸다. 시퀀스 정렬은 ClustalW로 이루어졌고, 이미지는 ESPript 서버로 생성되었다.
도 4는 T001 및 NT5M의 구조를 비교하여 나타낸 모델이다. 세포질 T001(CT)과 dTMP-결합 인간 NT5M(노란색)을 중첩하여 나타내고 있으며, 질소는 흰색으로, 산소는 빨간색으로 나타내었다.
도 5는 T001의 최적 발현을 위한 UTR 스크리닝의 후보 구조를 나타낸 모식도이다.
도 6은 T001의 최적 발현을 위한 UTR 스크리닝에서 FACS 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. 분석 조건은 다음과 같다: GFP fluorescence, HCT-116, 6well (5x105 cell/well), 24h mRNA transfection, 10% FBS, 2mM Gln MEM media.
도 7은 mStrawberry의 N-말단 및 C-말단의 시퀀스를 나타낸 모식도이다. 추정되는 임포트 신호(import signal)는 도 7에 나타낸 바와 같이 위치한다.
도 8은 형광 현미경으로 드러난 mStrawberry-NLS 및 mStrawberry-MLS의 세포내 작용 위치를 나타낸 사진이다. 흰색 화살표는 핵의 위치를 나타내고, 검은색 화살표는 미토콘드리아의 위치를 나타낸다.
도 9는 암세포에서 타겟 대사의 작용모드(MOA) 및 경로를 나타낸 도면이다.
도 10은 MCF7 세포주에서 mRNA 트랜스펙션 후 생존검사(live and dead assay) 결과를 나타낸 사진이다. 형광 현미경을 사용하여 5μg/well의 mRNA 처리 후 MCF7 세포의 세포 생존성을 관찰하였다. 트랜스펙션 후 24시간에서 세포 생존성은 효과적으로 감소되었고, 이 효과는 시간 의존적이거나 용량 의존적이었다.
도 11은 MCF7 세포주에서 mRNA 트랜스펙션 후 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 MCF7 세포주에서 mRNA 트랜스펙션 후 Annexin V 염색에 따른 세포사멸 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 초기 사멸 부분(오른쪽 아래 사분면)은 mRNA 트랜스펙션 후 지속적으로 증가하였고, 후기 사멸 부분(오른쪽 위 사분면)도 증가하였다.
도 13은 T001과 NT5M 트랜스펙션에 따른 세포독성 및 세포 성장 억제 비교 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 CT 및 NT5M 트랜스펙션으로 유도된 세포사멸 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 T001 트랜스펙션에 의한 세포주기 정지를 나타낸 그래프이다.
도 16은 대장암 세포주 HCT-116에서 농도에 따른 세포사멸 유발 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 17은 T001의 siRNA 처리에 의한 T001 상쇄 효과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 삼중음성 유방암(TNBC)에서 농도에 따른 세포사멸 유발 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 19는 삼중음성 유방암에 대하여 CT 처리 후 DNA 손상 마커의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 20은 SV4 바인더 및 T001 약물을 이용한 항암제를 나타낸 모식도이다.
도 21은 T001 mRNA의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 22는 NLS-mStrawberry mRNA를 포함하는 면역-리포좀(iLP)으로 복합된 카복시 플루오르세인-DSPE(carboxy fluorescein-DSPE)에 대한 체외(in vitro) 분석 결과를 설명하는 모식도 및 사진이다. MCF7 세포주에서 형광 감지를 통해 핵 트랜스펙션에 의해 각 번역된 mStrawberry 단백질 위치와 mRNA 위치를 확인하였다. A는 2.5 ㎍의 NLS-mStrawberry mRNA이고, B는 5 ㎍의 NLS-mStrawberry mRNA이다.
도 23은 체외(in vitro) 및 체내(in vivo)에서 CD47 마스킹 분석(masking assay) 결과를 나타낸 사진이다.
도 24는 SV4-컨쥬게이트 iLP-NIR RFP mRNA의 정맥주사(IV) 후 MCF7 이종이식 마우스 분포를 나타낸 사진이다. A는 이종이식 마우스, B는 주사 후 1시간, C는 주사 후 3시간, D는 주사 후 6시간, E는 절단된 암조직을 나타낸다.
도 25는 체내(in vivo)에서 iLPD 정맥주사 후 기간별 종양 부피를 나타낸 그래프 및 종양 사진이다.
도 26은 iLPD 처리에 의한 마우스 장기의 독성검사 결과를 나타낸 그래프이다.
도 27은 본 발명에 따른 SV4 바인더를 이용한 항암제의 기전을 나타낸 모식도이다.
도 28은 SIRPα 및 SV1의 DNA 서열을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 29는 DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS와 SV4 단백질의 컨쥬게이션 과정을 설명하는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본원에 사용된 용어는 다음과 같이 이해될 수 있다.

본원에서 용어 “CD47”은 특별히 제한되지 않고, 임의의 동물, 바람직하게는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간 CD47 일 수 있다. 인간 CD47의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 이미 공지되어 있다(J. Cell. Biol., 123, 485-496, (1993), Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, (1995), GenBank: Z25521).

본원에서 용어 “바인더”는 수용체, 특히, CD47에 결합하는 단백질로서,　바인더는 특히 암세포에서 CD47과 결합하여, 세포-전달물질의 인식 및/또는 상호작용을 가능하게 한다.

본원에서 용어 "컨쥬게이트된" 또는 "컨쥬게이트"는 둘 또는 그 이상의 화합물이 하나 또는 그 이상의 화학 결합 또는 링커와 결합하여 형성되는 화학적 화합물을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에서, 바인더와 리포좀은 컨쥬게이트를 형성한다.

본원에서 용어 “페길화(PEGylation)”는 대상물질에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 접합시켜 안정성을 높이기 위한 기술로서, 본 발명에서 페길화된 인지질이 사용될 수 있으며, 예컨대, DSPE-PEG₂₀₀₀ 등이 사용될 수 있다. DSPE-PEG₂₀₀₀은 약 2000의 수평균분자량을 가지는 PEG가 부착된 DSPE를 의미한다.

본원에서 용어　“폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 일반적으로 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는, 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 본 발명의 일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 합성된 단쇄　mRNA이다.

본원에서 용어 “5'-UTR(5'-Untransrated Region)”은 통상적으로 mRNA의 특정 부분으로 이해되고, mRNA의 단백질 암호화 영역(즉, 개방 해독 틀(ORF))의 5'에 위치한다. 통상적으로, 5'-UTR은 전사 시작 영역에서 시작하여 개방 해독 틀의 개시 코돈에서 한 뉴클레오티드 전에 종결한다.

본원에서 용어 “3'-UTR(3'-Untransrated Region)”은 통상 mRNA의 개방 해독 틀(ORF)과 폴리A 서열 사이에 위치하는 mRNA의 일부이다. mRNA의 3'-UTR은 아미노산 서열로 번역되지 않는다. 3'-UTR　서열은 보통 유전자 발현 과정에서 각각의 mRNA로 전사되는 유전자에 의해 암호화된다.

본원에서 용어 “NLS(nuclear localization signal, 핵 위치 신호)” 및 “MLS(mitochondrial localization signal, 미토콘드리아 위치 신호)”는 각각 단백질이나 핵산과 같은 특정 물질을 세포 핵 및 미토콘드리아 내로 운반하는 역할을 하는 아미노산 서열을 의미한다.

본원에서 용어 “트랜스펙션”은 세포 외부의 폴리뉴클레오티드가 수반 물질이 있는 또는 없는 상태로 숙주 세포, 특히, 암세포로 들어가는 과정을 의미한다. “트랜스펙션된 세포"는 예컨대, 세포 외부의 mRNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 mRNA를 가지고 있는 세포를 의미할 수 있다.

본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체를 개시한다.

본 발명에 따른 암 치료를 위한 변이체는 일 구현예에 따르면, CD47에 결합하는 바인더와 복합체를 형성하는 리포좀형 나노입자에 포집된 형태로 폴리뉴클레오티드가 사용되어 암세포의 대사취약성(metabolic vulnerability)을 극대화시켜 암세포를 사멸시키는 기작을 가지도록 발현된 암 치료를 위한 변이체로서, 인간세포 내에 전달되었을 때 비특이적 마이크로RNA(microRNA)로서 작용하는 부위를 최소화하고 발현을 최대화할 수 있도록 유전자 서열이 최적화되어 있다.

본 발명의 일 구현예에서 상기 바인더는 암세포에서 과발현하는 CD47에 결합하는 바인더로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 바인더는 'SV1'로 명명하였으며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 바인더는 'SV4'로 명명하였다.

먼저, SV1(Sirpα-variant-version1)은 본래(original) CD47 리간드의 수용성 도메인인 순수 Sirpα(아미노산 서열(서열번호 25) 참조)에서 유래된 돌연변이 라이브러리에서 선별되었다. SV1 돌연변이의 선별과정은 다음과 같다.

CD47과 결합하는 SIRPα의 결합력이 개선된 단백질을 Weiskopf K et al.(Weiskopf, K., et al. (2013). "Engineered SIRPalpha variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies." Science (New York, N.Y.) 341(6141): 88-91.)을 참조하여 인간 SIRPa의 단일 14-kD 결합 도메인을 합성하여 유전자를 확보하였다. Wild-type SIRPα로부터 변경된 아미노산은 각각 다음과 같다. 6번째에 위치하는 발린(valine)을 이소류신(isoleucine)으로, 27번째에 위치하는 발린(valine)을 이소류신(isoleucine)으로, 31번째에 위치하는 이소류신(isoleucine)을 페닐알라닌(phenylalanine)으로, 47번째 위치하는 글루탐산(glutamate)을 발린(valine)으로, 53번째에 위치하는 라이신(lysine)을 아르기닌(arginine)으로, 54번째에 위치하는 글루탐산(glutamate)을 글루타민(glutamine)으로, 56번째에 위치하는 히스타민(histidine)을 프롤린(proline)으로, 66번째에 위치하는 세린(serine)을 트레오닌(Threonine)으로, 92번째에 위치하는 발린(valine)을 이소류신(isoleucine)으로 치환하였다. 단백질의 대장균에서의 발현을 위해 기존 핵산 서열을 코돈 최적화를 통해 변형하여 SV1을 제조하였으며 도 28에 SIRPα 서열(서열번호 26) 및 SV1의 DNA 서열(서열번호 27)을 비교하여 나타내었다.

한편, SV1의 C-말단에 CRM197 단백질을 첨가한 단백질인 SV1-(C)CRM197, N-말단에 CRM197 단백질을 첨가한 CRM197(N)-SV1, 그리고 SV1 단백질을 제작하여 SV1 N-말단과 C-말단의 단백질의 첨가의 영향을 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석을 통해 확인하였다. 각 시료는 Biacore X100 기기를 이용하여 SPR의 binding kinetics를 통해 분석하였다. 이때 분석을 위한 Chip으로서 Recombinant CD47 단백질을 500 RU이 되도록 Protein G 표면에 접합한 Chip을 사용하였고, HBS-P는 5 ㎕/min의 유속으로 분석하였다. 각 센소그램(sensogram) 결과는 1 : 1 바인딩 모델 및 글로벌 피팅을 사용하여 BiaEvaluation 소프트웨어로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나태내었다.

Analyte	K_D(nM)
SV1 protein	0.877
SV1-CRM197 protein	0.894
CRM197-SV1 protein	19.9

표 1을 참조하면, SPR 분석 결과에서 C-말단에 CRM197이 삽입된 SV1-CRM197은 SV1에 비해 K_D값이 크게 달라지지 않았으나, N-말단에 CRM197이 삽입된 CRM197-SV1 같은 경우에 affinity가 K_D값이 19.9 nM까지 약 2배 가량 상승하여 친화력이 감소한 것을 확인하였다. 따라서 SV1의 N-말단에서 단백질을 첨가하는 경우, SV가 CD47에 올바르게 결합하는 것을 방해하여 발생되는 입체장애(steric hindrance)로 인해 CD47에 대한 친화도가 SV1에 비해 감소하는 것으로 확인되었다.

이하, 본 발명에 관련된 SV4 바인더, 상기 바인더와 컨쥬게이트되는 리포좀에 관한 구체적인 실시예를 상세히 설명한 후, 본 발명에 따른 바인더-컨쥬케이트 리포좀에 포집되는 T001 약물과, SV4 바인더 및 T001 약물을 이용한 항암제에 관한 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다.

SV4-컨쥬케이트 리포좀

지질 나노입자(lipid nanoparticle)를 기반으로 한 약물전달 시스템은 상당한 장점을 가져 보편적으로 사용되어 왔다. 지질 나노입자는 높은 약 용량(drug capacity), 높은 안정성(stability), 높은 특이성(specificity)을 지니고 있으며, 방출 시점(release point)을 제어할 수 있다. 약물로 사용되는 유전 물질 때문에, 양이온성 리포좀은 표적 암에 약물을 전달하는 데 사용되었다. 양전하로 하전된 리포좀은 유전적 약물(genetic drug)을 끌어당겨 약물이 표적을 만날 때까지 보호를 위해 약물을 덮는 구형 콤플렉스(spherical complex)를 형성한다.

본 발명에서 양이온성 리포좀을 형성하기 위해 프로-리포좀(Pro-liposome)은 양이온성 인지질, DOTAP 및 콜레스테롤 중 하나를 사용하여 준비되었다. 또한 혈관을 통해 타겟에 약물을 전달하는 동안 혈청 안정성을 높이고자 페길화 리포좀을 준비하기 위해 프로-리포좀에 PEG₁₀₀₀-DSPE를 추가로 첨가하였다. 페길화 리포좀 외에도, NHS 활성화 DSPE-PEG₂₀₀₀과 SV4 단백질을 컨쥬게이트하여 DSPE-PEG₂₀₀₀-SV4를 준비하였다. SV4 컨쥬게이트 리포좀을 준비하기 위한 마지막 단계로, mRNA 캡슐화 프로-리포좀과 DSPE-PEG₂₀₀₀-SV4를 혼합하였다. 구체적인 SV4-컨쥬케이트 리포좀 제조과정은 다음과 같다.

리포좀은 드라이-필름 방식으로 준비되었다. DOTAP(Avanti Polar Lipids)과 콜레스테롤(Sigma)(1:1 몰비, 10 mM)로 구성된 양이온성 리포좀과 PEG-DSPE1000(1 mM; Avanti Polar Lipids)이 첨가되었다. 양이온성 리포좀은 둥근바닥 유리 플라스크에서 클로로포름과 메탄올(2:1 (v/v))에 용해되었다. 지질 건조는 50℃에서 회전 증발기로 진공 상태에서 수행되었다. 클로로포름과 메탄올을 완전히 제거하기 위해 지질막을 하룻밤 냉동 건조시켰다. 증발 후 지질막은 50℃에서 최대 1시간까지 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)로 재수화(rehydrated)되었다. 수화된 지질막을 음파 처리하여 단일층 소포(unilamellar vesicle)를 형성하였다. 마지막으로 100 nm 공극을 가진 막을 이용하여 미니 압출기(Avanti Polar Lipids)로 지질을 압출하였다.

DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS와 SV4 단백질의 컨쥬게이션은 다음과 같이 준비되었다(도 29 참조). DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS는 드라이-필름 방식으로 준비하였다. 클로로포름에 용해된 DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS는 둥근 바닥 유리 플라스크에서 증발되었다. 30℃에서 진공 상태로 1시간 동안 회전 증발기에 의해 지질 건조를 수행하였다. 증발 후 지질막은 30℃에서 1시간까지 뉴클레아제 프리 워터에 용해된 SV4 단백질로 재수화되었다. 컨쥬게이트되지 않은 잔여 DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS를 제거하기 위해 pH 6.8의 PBS에서 투석 카세트 10,000 MWCO(Thermo Scientific)를 하룻밤 수행하였다.

캡슐화된 약물과 결합 리간드를 함유한 리포좀을 전술한 바와 같이 준비하였다. 양이온성 리포좀 3 mg, 프로타민(protamine) 25 ㎍ 및 디에틸피로카보네이트수(diethylpyrocarbonate water)를 혼합하여 용액 A로, mRNA 50 ㎍ 및 디에틸피로카보네이트수를 혼합하여 용액 B로 하였다. 용액 A와 B는 디에틸피로카보네이트수로 부피를 같게 하여 30분간 배양되었다. 이후, 30분 동안 혼합 및 배양하여 캡슐화된 약물로 리포좀을 형성하였다. DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS 컨쥬게이트 SV4 리간드의 결합을 위해 캡슐화된 약물을 함유한 리포좀(1:100 몰비)을 50℃에서 15분간 혼합하였다.

컨쥬게이션 타겟으로서 SV1

자연계에 존재하는 Sirpα의 서열을 변형하여 CD47과의 결합력이 향상된 SV1을 돌연변이를 통해 선정하고, 이에 대해 리포좀 제형을 제작할 때 올바른 방향으로 삽입되어 반응할 수 있는 SV4를 돌연변이를 통해 확보하였다(도 1 참조). SV4 돌연변이 제작은 다음의 방법으로 수행되었다. 상기 확보된 SV1 서열에서 CD47과의 올바른 방향 결합을 위해 11번째와 104번째 라이신(Lysine)을 류신(leucine)으로 치환하였다. 치환을 위해 SV1 유전자를 pET28a 벡터에 삽입한 플라스미드를 이용하여 11번째와 104번째에 해당되는 서열로 점돌연변이(point-mutation)될 수 있도록 프라이머(하기 표 2 참조)를 제작하여 Quickchange Ⅱ site-directed mutagenesis kit(Agilent)의 방법대로 각각 혹은 동시에 치환시킨 돌연변이 유전자를 제작하였다.

구분		서열	서열번호
Leu 11 mutagenesis	(KKtoLL11_F1) Forward	GAT TAT TCA GCC GGA CCT GTC CGT AAG CGT TGC	28
Leu 11 mutagenesis	(KKtoLL11_R1) Reverse	GCA ACG CTT ACG GAC AGG TCC GGC TGA ATA ATC	29
Leu 104 mutagenesis	(KKtoLL104_F2) Forward	CTG ACA CGG AGT TTC TGT CTG GCG CAG	30
Leu 104 mutagenesis	(KKtoLL104_R2) Reverse	CTG CGC CAG ACA GAA ACT CCG TGT CAG	31

SV1 단백질은 N-말단 아미노기 외에 6개의 라이신(Lysine) 잔기를 가지고 있다(도 2A 참조). SV1을 리포좀과 컨쥬게이션을 통해 연결하여 CD47과의 결합을 통해 약물을 전달하기 위해서는 결합력의 향상이 필요하다. NHS 컨쥬게이션을 통해 DSPE를 연결하는 화학반응에서 작용할 수 있는 잔기 중 CD47과의 결합을 방해하지 않으면서 올바른 방향(correct orientation)으로 작용할 수 있는 잔기를 선정하고 이들 잔기 이외의 잔기를 류신(Leucine)으로 치환함으로써 결합 활성의 손실 없이 변형할 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 치환을 통해 DSPE에 결합하는 잔기의 경우의 수를 줄여 단순한 결합을 통해 DSPE-컨쥬게이트된 SV4를 제조하였다.

한편, SV4의 올바른 방향(correct orientation)을 위한 라이신(Lysine) 치환 효과를 확인하기 위하여 SV1과의 비교를 위해 DSPE-컨쥬게이션 형태 및 리포좀에 삽입된 형태를 각각 제조하여 CD47과의 친화력을 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 통해 분석하였다. 분석을 위하여 CM5 Chip을 이용하여 CD47을 접합한 후 SV1, DSPE-SV1, LPD-SV1, SV4, DSPE-SV4 및 LPD-SV4의 회합(association)과 해리(dissociation)를 측정하여 K_D 값을 비교하였다. 구체적으로 재조합(recombinant) CD47 단백질을 EDC-NHS 반응을 통해 250 RU의 표적 SPR 반응으로 CM5 칩의 표면에 접합시켜 사용하였으며 HBS-P는 30 ㎕/min의 유속으로 3분 회합 및 10분 해리 과정을 통해 확보한 센소그램(sensogram)을 1:1 바인딩 모델 및 글로벌 피팅을 사용하여 BiaEvaluation 소프트웨어로 분석하였다. 분석 시료의 특성에 따라 해리 버퍼(dissociation buffer)로, SV1 및 SV4 단백질에 대하여 10 mM 글리신(glycine) pH 2.0을, 지방산이 부착된 시료에 대해서는 2.0 M MgCl₂을 사용하였다.

SPR 분석 결과에서 SV1은 Sirpα(wt)에 비해 K_D값이 280 nM에서 0.87 nM으로 크게 향상되었다(표 1 참조). SV1의 친화력(affinity)은 크게 향상되었지만 NHS 컨쥬게이션 반응을 통해 SV1-DSPE를 제조하였을 경우에 0.87 nM에서 2.67 nM로 K_D값 상승으로 인해 친화력은 감소하였다. 또한 리포좀에 삽입한 SV1-iLP의 경우에는 더욱 친화력이 감소하여 K_D값이 10.9 nM까지 상승하였다. 그에 비해 NHS 반응 잔기인 2군데의 라이신을 류신으로 치환한 SV4의 경우 단백질 자체의 친화력은 다소 감소하였으나, 올바른 방향성으로 인해 DSPE와 컨쥬게이션했을 경우와 리포좀에 삽입되었을 때조차도 큰 감소 없이 오차 범위에서 결합 활성이 유지되는 것을 확인하였다(표 3 참조).

Analyte	k _a (M^-1s^-1)	k _d (s^-1)	K_D (nM)
Sirpα	6.10×10⁵	3.70×10^-1	290.0
SV1	3.53×10⁵	3.08×10^-4	0.87
SV1-DSPE	7.34×10⁴	1.96×10^-4	2.67
SV1-iLP	1.73×10⁴	1.89×10^-4	10.9
SV4	1.64×10⁵	2.75×10^-4	1.67
SV4-DSPE	2.27E×10⁵	2.56×10^-4	1.13
SV4-iLP	3.12E×10⁵	3.95×10^-4	1.27

바인더-컨쥬케이트 리포좀 포집 약물

이하, 전술한 바인더(SV4)-컨쥬케이트 리포좀에 포집되는 약물의 구현예에 관하여 설명한다.

인간 5'-뉴클레오티다아제(Human 5'-nucleotidase)와 유사한 활성을 가지나 이례적으로 다른 핵산에 대해서는 특이성이 없으면서 dTMP, dUMP에 대해서만 높은 특이성을 가지는 PBS2 파지(Bacteriophage PBS2) 유래 티미딜레이트 5'-포스포하이드롤라아제(Thymidylate 5'-phosphohydrolase)를 암세포의 대사취약성(metabolic vulnerability)을 극대화시켜 암세포를 사멸시키는 기작을 가지는 약물후보물질로 선정하고, 인간세포 내에 전달되었을 때 비특이적 마이크로RNA(microRNA)로서 작용하는 부위를 최소화하고 발현을 최대화할 수 있도록 유전자 서열을 최적화하여 'T001'(서열번호 3)로 명명하였다. T001의 서열 최적화 과정은 다음과 같다.

DNA 서열을 포유류 세포 발현(mammalian cell expression)을 위한 코돈 최적화하고자 자연 코돈(natural codon)을 다음의 최적 코돈으로 대체하였다: alanine (GCC), arginine (CGC), asparagine (AAC), aspartic acid (GAC), cysteine (TGC), glutamic acid (GAG), glutamine (CAG), glycine (GGC), histidine (CAC), isoleucine (ATC), leucine (CTG), lysine (AAG), methionine (ATG), phenylalanine (TTC), proline (CCC), serine (TCC), threonine (ACC), tryptophan (TGG), tyrosine (TAC), and valine (GTG). Runs of Cs and Gs를 회피하여 PCR 조건뿐 아니라 올리고뉴클레오티드 합성을 간략화하였다.

T001과 유사한 인간 세포 내 핵산 대사에 관여하는 효소는 5'-뉴클레오티다아제로, 작용 위치에 따라 3가지, 즉, NT5C(cytoplasm), NT5M(mitochondria), NT5E(extracellular membrane)가 알려져 있다. 이 3가지 효소는 작용 위치 뿐 아니라 NMP 또는 dNMP의 인산기를 가수분해시키는 활성 및 구조적 차이로 인해 선호하는 기질 핵산종이 다르며 대부분 NMP 또는 dNMP에 대한 광범위한 특이성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이 가운데 NT5M은 T001과 아미노산 서열의 낮은 유사성에 비해 단백질의 구조에 있어 대체적으로 유사한 것으로 추정되었다(도 3 참조). 특히 서열의 차이에도 불구하고 작용 부위에 대한 서열은 보존되어 있었고 HAD 수퍼패밀리(haloalkanoic acid dehalogenase superfamily)에 속하는 것으로 확인되었다.

구조적 상동성에도 불구하고 NT5M과 T001의 구조적 차이는 T001은 NT5M에 존재하지 않는 특이한 바인딩 루프(binding loop) 구조를 가지고 있다는 점이고, 이 점이 가장 큰 특징적 차이이다(도 4 참조).

상기 바인딩 루프는 NT5M과 T001의 기질결합 부위와 밀접한 관계가 있으며, 기질의 특이성에 관련되어 있을 것으로 추정된다. 현재까지 상기 바인딩 루프의 기능에 대해서는 거의 알려져 있지 않지만 본 발명에서 상기 바인딩 루프로 인해 NT5M에 비해 dTMP에 대해 더 높은 친화도를 가지며 높은 dTMP 분해능을 가지는 것을 일부 확인할 수 있었다(표 4 참조).

5' NT	Alias	Preferred substrate (Km)	References
PBS2 TMP phosphohydrolase	T001	dTMP (0.01 mM) dGMP (0.7 mM) dUMP (0.8 mM)	Methods Enzymol. 51:285-290 (1978), Also In house data
Human mitochondrial 5'doxyribonucleotidase	NT5M (hdNT-2)	dGMP (0.09 mM) dUMP (0.16 mM) dTMP (0.3 mM)	Biochem. 46:13809-13818 (2007) Biochemical Pharmacol. 66: 471-479 (2003)
Human cytosolic 5'deoxyribonucleotidase	hdNT-1	dUMP (1.5 mM) dTMP (1.5 mM) dAMP (3.0 mM) dGMP (3.3 mM)	J. Biol. Chem. 265:6589-6595 (1990) Biochemical Pharmacol. 66: 471-479 (2003)
Murine cytosolic 5'deoxyribnucleotidase	mdNT-1	dUMP (0.8 mM) dAMP (1.0mM) dGMP (1.2mM) dTMP (1.4 mM)	J. Biol. Chem. 275:5409-5415 (1990) Biochemical Pharmacol. 66: 471-479 (2003)

표 4에 나타낸 바와 같이, 현재까지 알려진 다른 5'-deoxyribonucleotidase 가운데 가장 dTMP에 대한 친화도가 높은 것으로 알려져 있다. 현재까지 보고된 바에 따르면, 다른 효소의 경우 본 발명에서 제시한 T001에 비해 dTMP에 대한 친화도가 낮을 뿐 아니라 상대적으로 광범위한 기질 특이성을 보이는 것을 알 수 있다. 특히, 구조적으로 유사한 human NT5M과 비교할 경우에도 기질에 대한 스펙트럼이 다르며 dTMP에 대한 친화도 역시 표 4에 따르면 30배 정도 낮은 것을 볼 수 있다. 이와 같은 차이는 NT5M에는 존재하지 않는 결합 루프가 T001에 존재하기 때문인 것으로 추정된다.

T001 mRNA 약물 - 로칼리제이션(localization) 및 mRNA 구조

T001의 최종 약물의 형태는 mRNA 형태로서 발현에 필요한 각 구성요소를 최적화하여 UTR(untranslated region) 및 Kozak 서열을 최적화하였다. 이를 위하여 리포터(reporter) 유전자로 GFP(Green Fluorescent Protein)를 사용하여 발현 효율을 도 5와 같은 후보 구조를 선정하여 결정하였다. 각 사용한 UTR의 서열 정보는 하기 표 5와 같다.

No	5'-UTR	5'-UTR source	3'-UTR	3'-UTR source	Ref
1	ttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaatta (서열번호 4)	Chimeric intron	GAATTCACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCG (서열번호 5)	IRES	-
2	ttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaatta(서열번호 6)	Chimeric intron	-		-
3	ttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaatta(서열번호 7)	Chimeric intron	GACTAGTGCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCAGAATT (서열번호 8)	Albumin	Andreas Thess(2015)
4	ttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaatta(서열번호 9)	Chimeric intron	GACTAGTGCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCAGAATT (서열번호 10)	Albumin	Andreas Thess(2015)
5	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCAAGCTTGAGG(서열번호 11)	Andreas Thess(2015)	GACTAGTGCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCAGAATT (서열번호 12)	Albumin	Andreas Thess(2015)
6	CTTCCTACTCAGGCTTTATACAAAGACCAAGAGGTACAGGTGCAAGGGAGAGAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(서열번호 13)	Mus musculus_alpha-globin (Hbat1)	TTAATTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG (서열번호 14)	Mus musculus hemoglobin alpha(Hba-a1)	UTRdb
7	AGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(서열번호 15)	Rhinatrema bivittatum thiamin pyrophosphokinase 1	TTAATTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG (서열번호 16)	Mus musculus hemoglobin alpha(Hba-a1)	UTRdb
8	gggagactgccacc(서열번호 17)	??eljka Trepotec(2019)	TTAATTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG (서열번호 18)	Mus musculus hemoglobin alpha(Hba-a1)	UTRdb
9	gggagactgccaag(서열번호 19)	??eljka Trepotec(2019)	TTAATTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG (서열번호 20)	Mus musculus hemoglobin alpha(Hba-a1)	UTRdb
10	GCTAGC(서열번호 21)	NheI	TTAATTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG (서열번호 22)	Mus musculus hemoglobin alpha(Hba-a1)	UTRdb

각 UTR에 대한 발현 효율을 GFP 형광 정도를 통해 FACS로 분석하였다. FACS 분석방법은 다음과 같다.

6구 세포 배양 플레이트의 각 구당 5×10⁵ 개의 세포를 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 24시간 배양하여 플레이트 바닥에 부착시킨 후, 각 UTR 구조를 가지는 녹색 형광을 발현하는 EGFP mRNA를 lipofectamine messengerMAX 시약을 사용하여 트랜스펙션 하였다. 먼저 미세 시험관에 125 ㎕의 OPTI-MEM 배지와 3.5 ㎕의 시약을 섞고 상온에서 10분간 배양 후, 다른 미세 시험관에서 125 ㎕ 배지와 각 UTR 구조를 가지는 mRNA 1.25 ㎍을 넣고 섞은 mRNA 희석 배지를 위 시약에 넣어 섞고 5분간 추가 배양 후, 각 구의 세포에 투여하였다. 4시간 뒤, 각 구의 세포를 인산 완충 생리식염수로 가볍게 세척하고 세포배양 배지로 교체한 뒤 20시간 추가 배양 후 형광 현미경 및 유 세포 분석기로 각 UTR 의 EGFP mRNA의 녹색 형광 단백질 발현 정도를 비교 분석하였다. 대조군으로는 트리링크 바이오 테크놀러지스에서 구매한 EGFP mRNA를 사용하였다. 먼저 배양이 끝난 세포의 녹색 형광의 강도를 형광 현미경을 통해 이미지로 비교 분석한 다음 대조군 포함 각각의 UTR을 가진 EGFP mRNA를 처리한 세포를 트립신 효소로 플레이트 바닥에서 떼어 내고 미세원침관에 모은 뒤 인산 완충 생리식염수에 희석하였다. 이렇게 회수한 세포 유세포 분석기를 통해 대조군 대비 녹색 형광을 발현하는 세포군의 분포를 강도에 따라 강, 중, 약 세 단계로 비교하였다.

FACS 분석 결과, UTR의 길이를 줄인 형태로 최종 발현형태를 UTR 9번 형태로 확정하였다(도 6 참조).

UTR 9번을 토대로 세포내 작용 위치를 다양화하기 위해 핵산합성경로가 존재하는 핵, 세포질 및 미토콘드리아에 위치시키기 위하여 도 7과 같은 위치 신호 서열(NLS: 서열번호 23, MLS: 서열번호 24)을 첨가하여 리포터 유전자 mStrawberry를 위치 신호 서열에 따라 발현시킨 후 형광으로 단백질의 위치를 확인하였다(도 8 참조). 위치 신호서열에 따른 형광 위치 확인 시험(mRNA transfection : lipofectamine)의 구체적인 과정은 다음과 같다.

6구 세포 배양 플레이트의 각 구에 공초점 현미경 관찰용 커버글라스를 하나 넣고 5×10⁵ 개의 세포를 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 24시간 배양하여 커버글라스 위에 부착시킨다. 각각의 위치 신호 서열과 빨간 형광 단백질을 발현하는 mStrawberry 리포터 유전자 서열이 연결된 mRNA를 lipofectamine messengerMAX 시약을 사용하여 트랜스펙션 한다. 먼저 미세 시험관에 125 ㎕의 OPTI-MEM 배지와 3.5 ㎕의 시약을 섞고 상온에서 10분간 배양 후, 다른 미세 시험관에서 125 ㎕ 배지와 각 위치신호 서열을 가진 리포터 mRNA 1.25 ㎍을 넣고 섞은 mRNA 희석 배지를 위 시약에 넣어 섞고 5분간 추가 배양 후, 각 구의 세포에 투여하였다. 4시간 뒤, 각 구의 세포를 인산 완충 생리식염수로 가볍게 세척하고 세포배양 배지로 교체 한 뒤 20시간 추가 배양 후 공초점 현미경 관찰을 위한 시료를 제작하였다. 시료제작을 위해 4 % paraformaldehyde 시약을 첨가하고 10분간 배양하여 세를 고정한 뒤 인산 완충 생리식염수로 세척한 다음 슬라이드글라스 위에 보존 액 20 ㎕를 넣고 그 위에 고정 및 세척이 끝난 커버글라스를 올리고 마르지 않게 주변을 마감 후 공초점 현미경의 빨간 형광으로 위치 신호 서열이 잘 작동하여 mStrawberry 단백질이 세포 핵 및 미토콘드리아에 위치하였는지 확인하였다.

T001 mRNA 합성은 다음과 같이 수행되었다.

주형 DNA 준비 : IVT(In Vitro Transcribed) mRNA 합성을 위한 벡터는 pIRES 벡터에서 수정되었다. 간략히, 5'UTR-T001-3'UTR cassette는 pIRES 벡터의 MCS에 클로닝하였다. IVT 템플릿(template)을 생성하기 위해 플라스미드를 SacI/HpaI 효소로 처리하여 선형 가닥을 형성하고 T7 프로모터와 T001 카세트(cassette)가 포함된 1.5kb의 선형 가닥을 순수하게 컬럼 정제하여 PCR을 위한 템플릿으로 사용하였다. 정방향 프라이머(gtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagc; 서열번호 37)와 역방향 프라이머(gaaGCGGCCGCCTTCCTACTCAGGCTTTATTC; 서열번호 38)를 PCR 반응에 사용하였으며, 모든 PCR 반응은 Pfu 중합 효소를 사용하여 1분 동안 95℃에서, 1분 동안 61℃; 72℃에서 3분, 총 30주기 동안 PCR 하였다. PCR 산물은 아가로스 겔에서 실행되었고, 추가 처리 전에 Qiagen 클린업 키트를 사용하여 추출되었다.

IVT mNRA 합성 : PCR 후, 유전자 정보는 HiScribe ™ T7 ARCA mRNA 키트(New England Biolabs, Cot. #. E2065)를 사용하여 DNA에서 mRNA로 시험관 내 전사된다. 반응액은 10 ㎕ NTP / 캡 아날로그 혼합물, 1 ㎍ Template DNA, 2 ㎕ 1× T7 RNA 중합 효소 혼합물을 첨가하여 20 ㎕의 IVT 반응 혼합물을 조제하였다. IVT 반응 혼합물은 30분 동안 37℃에서 배양되었다. 주형 DNA를 제거하기 위해 1 ㎕ DNase를 IVT 반응 혼합물에 첨가하고 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 폴리 (A) 테일링을 위해, 5 ㎕ 10× 폴리 (A) 폴리머라제 반응 완충액, 5 ㎕ 폴리 (A) 폴리머라제 및 20 ㎕ 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 20 ㎕의 IVT 반응 혼합물을 제조하여 40분간 37℃에서 배양되었다. 이후, RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제한 후 89 ㎕ 뉴클레아제가 없는 물로 스핀 컬럼 막에서 용출하여 합성된 mRNA를 정제하였다. 이어서 남극 포스파타제 1 ㎕를 30분 동안 37℃에서 처리하여 5'-phosphate를 제거한 후, 다시 한 번 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제한 후 50 ㎕ 뉴클레아제가 없는 물로 스핀 컬럼 막에서 용출하여 합성된 mRNA를 회수하였다. 다음 실험을 위하여 최종 농도가 500 ng/㎕가 되도록 맞춘 후 분주하여 -80℃에서 보관하였다.

암세포에서의 타겟 대사

TS(Thymidylate synthase)는 DNA 합성 및 복구를 위한 티미딜레이트(dTMP)의 유일한 드 노보(de novo) 원천(source)이다. TS 단백질을 타겟으로 하는 약물은 암 치료의 주종이지만 표적외 효과와 독성 때문에 사용이 제한된다. TK1(cytosolic thymidine kinase)과 TK2(mitochondrial thymidine kinase)는 종양 환경으로부터 티미딘을 회복시킴으로써 대체 dTMP 생성 경로에 기여하며, TS 타겟팅 약물에 대한 저항을 조절할 수 있다. siRNA를 가진 TKs의 하향조절(downregulation)로 종양세포를 감지하는 TS siRNA의 용량을 기존 TS 단백질 타겟팅 약물(5FUdR 및 pemetrexed)에 비해 증가시켰다는 보고가 있었기 때문에 본 발명에서는 dTTP 생합성 대사에 초점을 맞췄다.

이러한 효소의 복합 하향조절은 TS 타겟 항암 치료를 강화하기 위한 매력적인 전략이지만, 정상세포 독성과 암 약물에 대한 내성이 문제될 수 있다. 이러한 결함을 피할 수 있는 대안은 높은 dTMP 특이적 가수분해효소를 얻는 것으로, 바로 T001이다. T001은 다른 dNMP(deoxynucleotide mono phosphate)를 가수분해하지 않고 dTMP를 티미딘으로 가수분해할 수 있다. 세포의 불균형한 뉴클레오티드 풀은 dTTP 결핍에 의해 야기될 수 있으며, 세포의 성장과 증식에 심각한 손상을 초래할 수 있다. 기질 선택성과 T001의 활성을 고려하여, 다음과 같은 가설을 세웠다: (1) 불균형 뉴클레오티드 풀은 인간 종양 세포를 유도하여 손상을 누적시키고, (2) T001의 과발현은 불균형 뉴클레오티드 풀을 야기할 수 있으며, (3) 불균형 뉴클레오티드 풀은 과도한 복구 주기(repair frequency)에 의한 세포사멸을 초래할 수 있다.

암세포에 T001 mRNAs 트랜스펙션(transfection)을 통한 생존 세포수 감소

먼저, 각 T001 mRNA를 트랜스펙션한 후 종양 세포 성장을 평가하기 위해 각 그룹의 세포 수를 추정하고, 생존검사(live and dead assay)로 배양 세포 성장을 분석하였다(도 10 참조). 생존검사(live and dead assay)는 다음과 같이 수행되었다.

6구 세포 배양 플레이트의 한 구 마다 5×10⁵ 개의 세포를 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 24 시간 배양하여 바닥에 부착시킨다. 24시간 뒤 각각의 mRNA 버전별로 리포펙타민(lipofectamine)을 사용하여 트랜스펙션하고 추가로 24시간 배양하였다. 실험군 각각의 세포를 회수하고 생존검사분석 시약인 2 μM calcein AM, 4 μM EthD-1 을 회수한 세포에 처리하여 30분간 반응한 후 세포를 형광현미경을 통해 확인하였다. Calcein AM은 세포내로 들어가서 살아있는 세포의 효소에 의해 분해된 후 녹색 형광을 나타내고, EthD-1는 죽은 세포의 세포내로 들어간 뒤 핵을 염색하여 빨간 형광을 나타낸다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 트랜스펙션 후 24시간에서의 생존 세포는 대조군과 비교하여 현저하게 감소하였고, mRNA 버전(NT, MT 및 CT) 사이에는 차이가 없었다.

암세포에 T001 mRNAs 트랜스펙션(transfection)을 통한 생존 세포 증식 억제

세포 생존능을 정량화하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. MTT 분석 방법은 다음과 같다.

96구 세포 배양 플레이트에 한 구당 10,000개의 세포를 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 24시간 배양하여 바닥에 부착시킨다. 24시간 뒤 각 mRNA 버전 별, 농도 별로 lipofectamine reagent를 만들어서 트랜스펙션하고 추가로 24시간, 48시간, 72시간 배양 후 각각 시간별로 세포 활성 분석 실험을 수행하였다. 각 시간 별 샘플에 세포 활성 분석 시약인 EZ-Cytox를 세포 배양한 각 구 당 10 ㎕를 투여하고 2시간 반응 후, 플레이트 리더기를 사용하여 450 nm 파장의 흡광값을 측정한다. 대조군 대비 각 버전 별 mRNA 처리군의 값을 비교하여 처리 시간과 농도별 세포 생존성을 분석하였다.

MTT 분석 결과, 대조군과 비교하여 T001 mRNA에 트랜스펙션한 세포의 증식은 트랜스펙션 후 24시간에서 현저히 억제되었으며, 억제 효과는 최대 72시간까지 유지되어, 각 세포의 생존성이 지속적으로 감소되는 것으로 나타났다. 세포 생존성은 용량에 따라 다르게 나타났다(도 11 참조).

암세포에 T001 mRNAs 트랜스펙션(transfection)을 통한 세포사멸(apoptosis) 유도

상기 실험결과에 따라 Annexin V 염색 후 유세포 분석(Flow cytometric analysis)을 수행하여 T001이 세포사멸을 유도하여 세포수 감소 또는 세포 증식 억제를 유발하는지를 조사하였다. 구체적인 분석 방법은 다음과 같다.

6구 세포 배양 플레이트의 각 구당 5×10⁵ 개의 세포를 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 24시간 배양하여 플레이트 바닥에 부착시킨 후, 각 버전별 mRNA를 lipofectamine messengerMAX 시약을 사용하여 트랜스펙션 하였다. 먼저 미세 시험관에 125 ㎕의 OPTI-MEM 배지와 3.5 ㎕의 시약을 섞고 상온에서 10분간 배양 후, 다른 미세 시험관에서 125 ㎕ 배지와 각 UTR 구조를 가지는 mRNA 1.25 ㎍을 넣고 섞은 mRNA 희석 배지를 위 시약에 넣어 섞고 5분간 추가 배양 후, 각 구의 세포에 투여하였다. 4시간 뒤, 각 구의 세포를 인산 완충 생리식염수로 가볍게 세척하고 세포배양 배지로 교체 한 뒤 20시간 추가 배양 후, 트립신 효소로 플레이트 바닥에서 떼어 내고 미세원침관에 모은 뒤 인산 완충 생리식염수에 희석하였다. 각 미세원침관 마다 3 ㎕의 Annexin V 염색 시약과 Propidium Iodide 염색 시약을 넣고 15분간 상온에서 반응 후 유세포 분석기를 통해 T001의 버전별 세포사멸이 유도된 세포군의 정도를 비교하였다. 대조군으로는 mRNA가 없는 lipofectamine messengerMAX 시약을 사용하였다. Annexin V 시약은 세포사멸이 진행되는 세포의 세포막을 염색하고 Propidium Iodide는 죽은 세포의 세포내 핵을 염색한다. 따라서 유세포 분석 그래프 상에서 세포사멸이 진행되지 않는 세포는 3사분면에 분포하며, 세포 사멸 진행 정도에 따라 세포군의 위치는 4사분면에서 1사분면으로 이동한다.

분석 결과, 모든 버전에서 세포사멸률은 서로 비슷하였다. 대조군의 세포사멸률은 3.75%이고, NT, MT 및 CT로 트랜스펙션한 세포의 조기사멸률은 각각 21.59%, 25.11% 및 24.65%로 나타났다. NT, MT 및 CT와 함께 전이된 세포의 사멸률은 각각 9.85%, 8.42%, 11.47%로 나타났다(도 12 참조). 세포사멸률은 용량 의존적으로 증가하였고, 각각의 T001 버전 사이에 약간의 차이를 보였다.

대장암 세포(HCT-116)에 대한 T001과 NT5M의 세포독성 비교

T001은 NT5M과는 다른 구조적 차이로 인해 핵산 T에 더욱 특이적이다. 따라서 전반적인 핵산의손실보다 dTTP의 손실로 인한 핵산의 불균형은 암세포 대사에 큰 영향을 미칠 수 있고 그로 인해 암세포의 성장을 저해할 수 있다. 이를 증명하기 위하여 인간 NT5M의 성숙형(mature form)과 인트론(intron)이 포함된 비성숙형(non-mature form)을 세포질 T001(CT)와 세포 생존능 및 세포 성장 억제 효과를 비교하여 각 효소간 기질특이성에 따라 세포에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 각 mRNA를 대장암 세포주 HCT-116에 트랜스펙션하고 24시간 후에 트라이판 블루 분석(Trypan blue assay)을 진행하여 HCT-116 세포 생존능과 세포 성장 억제 결과 도 13에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

HCT-116 세포에 비성숙형(non-mature form) NT5M과 성숙형(mature form) NT5M, CT mRNA를 각각 1.25 ㎍씩 트랜스펙션한다. 24시간 후 트립신(trypsin)을 처리하고 원심분리기를 이용해 세포를 수집(harvest)하였다. 수집한 세포를 1× DPBS로 재부유(resuspension)한 뒤, 일정량의 세포를 트리판 블루(trypan blue) 시약과 1:1로 섞었다. 실온(RT)에서 2분 인큐베이션(incubation)한 뒤, 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포의 수를 계수하였다. 트리판 블루 시약에 염색된 세포와 염색되지 않은 세포의 수를 구하여 생존 세포(viable cell)와 비생존 세포(non-viable cell)의 수를 구한 후, 총 세포 수로 나누어 생존도(viability)를 구하였다. 각 실험은 세 번 이상 반복하여 유의성을 평가하였다.

도 13에서와 같이, dTMP에 대한 친화도와 활성이 높은 T001의 경우 비슷한 활성을 가진 인간 NT5M에 비해 세포에 미치는 영향이 크게 나타났다.

특히 세포에 나타난 독성은 주로 세포사멸(apoptosis) 유도에 의해 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 14 참조). HCT-116 세포에 비성숙형 NT5M, 성숙형 NT5M 및 CT mRNA를 각각 1.25 ㎍씩 트랜스펙션한 세포를 24시간 배양 후 세포사멸 정도를 측정하여 분석한 결과, 두 종류의 NT5M mRNA는 대조군(control)에 비하여 Sub G1기가 약 12% 증가한 것에 비하여, CT mRNA는 대조군에 비하여 약 25%가 증가한 것을 확인할 수 있었다. T001 발현을 통해 야기되는 세포사멸은 세포내 핵산 결핍에 의한 세포주기의 변화에서 유래한 것으로 판단되며, 기질 가운데 특정 핵산 및 dTTP의 선택적 결핍이 세포주기의 정지(arrest)를 초래하여 이 과정이 심화될 경우 결국 세포사멸이 유발될 것으로 추정된다(도 15 참조).

상기 결과에서 나타난 세포사멸 유발 효과는 대장암 세포주에서 CT의 처리 농도에 따라 농도의존적인 경향이 나타난 것으로 미루어 CT의 활성이 직접적으로 세포사멸에 관여했다는 사실을 보여준다(도 16 참조).

이러한 암세포의 사멸이 T001의 효과인지 확인하기 위해 CT에 대한 siRNA를 사용하여 T001을 녹다운(knock down)시킨 후 세포사멸의 정도의 변화를 확인하였다. T001을 타겟으로 하는 두 가지 종류의 siRNA를 제작하여 HCT-116 세포에 트랜스펙션한 후 이어서 CT mRNA를 트랜스펙션하고 24시간 후에 Annexin V/PI 염색을 통해 세포사멸 정도를 확인하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

T001을 타겟으로 하는 siRNA를 2가지 종류로 제작하여 RNAiMAX reagent를 사용하여 트랜스펙션하였고, 1시간 뒤 CT mRNA를 트랜스펙션하였다. 24시간 뒤, 세포를 수집하여, FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I를 사용하여 염색하였다. 20분간 실온에서 인큐베이션한 후, 유세포분석기(flow cytometry)를 사용하여 형광의 정도를 분석하였다. 각 샘플당 10,000개의 세포를 분석하였다. 사용된 siRNA의 서열은 다음과 같다.

[siT001-1]

sense(서열번호 33) : CGAGAAGAAGUCAGAUUACAUCAAG

antisense(서열번호 33) : CUUGAUGUAAUCUGACUUCUUCUCG

[siT001-2]

sense(서열번호 35) : CGCAAAUUCAUUGAAACCUUCCUGA

antisense(서열번호 36) : UCAGGAAGGUUUCAAUGAAUUUGCG

분석 결과, CT mRNA 단독으로 트랜스펙션한 그룹에 비하여 siRNA를 트랜스펙션한 후 CT mRNA를 트랜스펙션한 그룹에서 세포사멸이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 17 참조).

삼중음성 유발 암종에서 T001의 농도의존적 저해 효과

T001 작용기전상 대장암 이외의 암종에서도 암세포 사멸을 유도할 수 있을 것으로 사료되어 삼중음성 유방암(TNBC)에 대하여 동일한 시험을 수행하여 세포사멸 유발능을 확인하였다. 구체적인 시험방법은 다음과 같다.

MDA-MB-231, MDA-MB-468 cell을 각각 5×10⁵ cells/well로 분주(seeding)한 뒤, CT mRNA를 각각 0, 0.625, 1.25, 2.5 ㎍씩 트랜스펙션하였다. 24시간 뒤, 세포를 수집하여, FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I를 사용하여 염색하였다. 20분간 실온에서 인큐베이션한 후, 유세포분석기를 사용하여 형광의 정도를 분석하였다. 각 샘플당 10,000개의 세포를 분석하였다. 세 번의 반복 실험을 통하여 유의성을 평가하였다.

세포질 T001(CT) mRNA를 농도별로 삼중음성 유방암종 2종에 대하여 처리한 후에 24시간 배양 세포를 Annexin V/PI 염색을 통해 FACS 분석을 수행한 결과, CT mRNA의 농도에 비례하여 시험한 암종에서도 역시 세포사멸 세포의 비율이 증가함을 확인하였다(도 18 참조).

세포사멸의 원인에 대한 단백질 수준의 분석을 위하여 CT mRNA를 TNBC 세포주인 MDA-MB-231 및 MDA-MB-468에 1.25 ㎍을 트랜스펙션한 후 18시간 후 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다. 구체적인 분석방법은 다음과 같다.

CT mRNA를 트랜스펙션한 후, 18시간 뒤 세포를 수집하였다. RIPA buffer(+protease inhibitor, phosphatase inhibitor)를 사용하여 아이스에서 세포를 30분간 용균(lysis)한 후 4℃ 원심분리기를 15분간 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 정량하여 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)에 10 내지 20 ㎍의 단백질을 로딩하였다. 겔을 PVDF 막에 전이(transfer)한 후 5% 탈지분유(skim milk)로 RT에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 각 1' 항체(antibody)를 넣고 4℃에서 하룻밤 보관하였다. 0.1% TBST로 세척(wash) 후, 2' 항체를 넣어 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.1% TBST로 세척 후, ECL 용액을 이용하여 단백질을 검출하였다. ChemiDoc XRS+를 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.

분석 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 세포사멸 마커인 PARP의 절단(cleavage)과 DNA 손상(damage) 마커인 gamma-H2AX의 발현 증가를 확인할 수 있었다. CT mRNA 처리 시 dTTP의 결핍으로 인해 DNA 손상이 발생하는 것을 확인할 수 있었으며 이를 통해 세포사멸이 유발된다는 사실을 확인할 수 있었다.

SV4 바인더 및 T001 약물을 이용한 항암제

이하, SV4 바인더 및 T001 약물을 이용한 항암제의 구현예에 관하여 설명한다.

SV4 바인더 및 T001 약물을 이용한 항암제는 암세포 표면에서 과발현되는 CD47을 1차적으로 탐지하여 결합하고, 2차적으로 암세포에 진입한 mRNA형 핵산대사저해 약물이 암세포의 과도한 핵산합성대사를 감지하여 저해함으로써 암세포의 면역회피 및 대사취약성을 표적하여 정상세포의 부작용을 혁신적으로 줄인 4세대 타겟형 대사항암제이다. 일반적으로 암세포 특이적 표면 단백질의 경우 정상세포에도 분포하는 경우가 많아 특이적 표면 단백질을 인식하는 표적 단백질과 독성물질을 결합할 경우 정상세포의 피해는 불가피하다. 그러나 인식만으로는 독성을 주지 않고 과도하게 핵산합성을 시도하는 암세포의 대사를 표적할 경우 암세포에 대한 인식률이 높아 정상세포의 피해를 줄일 수 있다. 즉, CD47을 인식하여 T001 mRNA가 세포내로 유입되더라도 성장을 위해 핵산을 증폭하지 않는 대부분의 정상세포는 핵산에 대한 요구가 적기 때문에 피해가 거의 없으나 과도한 핵산을 합성해야만 성장할 수 있는 암세포의 경우 dTMP의 결핍으로 인한 핵산의 불균형으로 인해 큰 피해를 입는다. 따라서 암세포의 고발현 CD47을 인식하는 과정에서 일부 정상세포중 비교적 높은 CD47 수준을 갖는 세포를 표적하더라도 내부로 유입된 핵산 대사 표적을 통해 암세포에 더욱 큰 피해를 줌으로써 암세포의 인식률을 높여 정상세포의 피해를 줄일 수 있다.

도 20에 나타낸 바와 같이, SV4 바인더를 이용한 항암제의 구성은 외부에 CD47 인식 단백질을 갖고 내부에 mRNA형 핵산대사저해 약물에 암종에 따라 위치 신호(핵내, 세포질내 또는 미토콘드리아내)를 다르게 조합한 mRNA를 포집한 리포좀형 나노입자 형태로 되어 있다. 도 27에는 본 발명에 따른 SV4 바인더를 이용한 항암제의 기전을 모식적으로 나타내었다.

항암제 구성요소

(1) CD47 바인더(SV4)

Sirpα 유래의 단백질을 변형한 고친화성 CD47 결합체와 이에 DSPE와의 컨쥬게이션 시 올바른 방향으로 리포좀 외부에 위치할 수 있도록 변형한 SV4를 CD47 바인더(binder)로 사용하였고, SV4의 추정 구조를 도 1A에 나타내었다. DSPE와 결합한 시료, 이를 리포좀에 삽입한 시료 각각의 K_D값을 비교한 결과 서열변이에 의해 리포좀 형태에서 개선되었음을 알 수 있다(상기 표 1 참조).

(2) 리포좀 기반 약물전달체 구성물질

리포좀을 양전하로 하전시켜 표적까지 원활한 약물전달을 실행하기 위해 사용된 물질로서, 양이온성 인지질(DSPE-PEG₁₀₀₀), DOTAP 및 콜레스테롤 구조를 각각 하기 화학식 1 내지 3에 나타내었다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

(3) 약물

전술한 바와 같이, 핵내, 세포질내 및 미토콘드리아내 발현이 가능한 mRNA로서 도 21에 T001 mRNA의 구성을 개략적으로 나타내었다.

위치 신호로 융합된 mStrrawberry mRNA에 의해 번역된 단백질의 포지셔닝

위치 신호가 잘 작동했는지 확인하기 위해 mRNA를 핵 및 미토콘드리아 위치 신호로 MCF7에 트랜스펙션하였다. mStrawberry 형광을 검출하여 각 mRNA의 성공적인 트랜스펙션과 위치를 확인하였다(도 22 참조). 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

6구 세포 배양 플레이트의 각 구당 5×10⁵ 개의 세포를 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 24시간 배양하여 플레이트 바닥에 부착시킨다. 카복시플루오레신 컨쥬게이트(carboxyfluorescein conjugated) DSPE를 사용하여 구축한 리포좀에 실험실에서 합성한 세포내 세포질 위치 신호가 연결된 빨간색 형광 단백질을 생성하는 mStrawberry mRNA를 포집하고 24시간 배양이 끝난 MCF-7 세포에 처리하여 트랜스펙션하였다. 24시간 추가 배양 뒤 공초점 레이저 형광 현미경 녹색 파장으로 리포좀의 카복시플루오레신이 발생하는 녹색 형광의 세포 상에서 위치를 확인하였고, 빨간색 파장으로 트랜스펙션된 mRNA가 mStawberry 단백질을 생성하고 세포질에 위치함을 확인하였다.

CD47 매개 약물전달 확인

약물의 전달이 CD47을 매개로 일어나는지 확인하기 위하여 MCF-7 세포에 에피루비신(epirubicin) 약물이 포집된 SV4가 결합된 iLP를 처리하였다. 이때 CD47 매개여부 확인을 위하여 CD47 항체(polyclonal)를 처리한 실험군과 처리하지 않은 실험군을 비교하였다. 구체적인 CD47 masking assay 방법은 다음과 같다.

6구 세포 배양 플레이트의 각 구 당 5×10⁵ 개의 세포를 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 24시간 배양하여 바닥에 부착시킨 뒤, 한 세포 샘플에만 최종 농도 5 ㎍/㎖의 CD47 항체를 넣고 4시간 반응하여 세포 표면의 CD47을 차단한다. 여기에 에피루비신을 포집하고 SV4가 결합된 리포좀(iLP)을 각 세포마다 에피루비신 최종 농도가 10 μM이 되도록 iLP 처리하고 24시간 배양하였다. 24시간 뒤 형광 현미경을 통해 세포내로 도입되어 세포 핵에서 빨간 형광을 나타내는 에피루비신의 형광 정도를 비교 분석하였다. 이때 대조군으로는 에피루비신을 직접 처리한 세포 샘플을 사용하였다(도 23A 참조). MCF7-이종 이식 마우스에 100 ㎍의 SV4 단백질을 먼저 투여하고 포화시켜서 마우스 체내 암세포의 CD47을 차단한 상태와 동일 부피의 인산 완충 생리식염수를 투여하여 암세포의 CD47을 차단하지 않은 상태로 만든다. 여기에 SV4-DSPE와 근적외선 영역의 빨간 형광을 나타내는 Cyanine 5.5-DSPE가 동시에 삽입되어 있는 T001 mRNA를 포집시킨 리포좀을 혈관 주사를 통해 마우스 체내 100 ㎕(mRNA 5 ㎍/Liposome 0.5 mg)를 투여하여 CD47을 매개로 한 타겟에 대한 접근성을 확인하였다.

실험 결과, 도 23A에 나타낸 바와 같이, CD47을 차단(blocking)한 처리군에서는 에피루비신의 형광이 나타나지 않았지만 차단하지 않은 실험군에서는 에피루비신의 형광이 나타났다.

또한 체내(in vivo)에서 CD47 매개 약물전달능을 확인하기 위한 MCF7-이종이식 마우스 모델 실험에서, 혈액세포에 존재하는 CD47로 인해 전반적인 노이즈가 관찰되었으나 SV4로 차단한 마우스에서보다 차단하지 않은 마우스의 암세포에서 더 강한 약물의 전달이 확인되었다(도 23B 참조).

MCF7 이종이식(xenograft) 마우스 모델에서 근적외선 형광 단백질(Near Infrared Red Fluorescence Protein, NIR RFP)의 mRNA를 포함한 SV4-컨쥬게이트 iLP를 정맥주사를 통해 주입한 후 시간별로 형광 이미지를 분석하였고, 그 결과를 도 24에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

인간 유방암 세포주인 MCF7을 배양하여 누드 마우스에 이종이식하였다. NIR-RFP(Near Infrared-Red Fluorescence Protein) mRNA가 포집된 SV4-iLP를 정맥주사를 통해 25 g 마우스당 5 ㎍ mRNA가 투여될 수 있도록 조절하여 투여한 후 in vivo optical imaging system을 사용하여 주사한 시료의 형광 정도를 추적하였다.

도 24를 참조하면, mRNA의 전달이 일부 혈액세포의 CD47을 통해 일어나지만 비교적 높은 수준으로 암세포에 발현이 축적되는 현상을 관찰하였다.

MCF7 이종이식 마우스 IV 암성장 제어 효능 시험(28일)을 수행하였으며, 구체적으로 MCF7을 배양하여 누드 마우스에 피하주사(subcutaneous injection)하였다. 종양(tumor)이 자란 누드 마우스를 랜덤하게 분류한 뒤, 정맥(intravenous, IV)으로 각각 PBS, Liposome, Liposome-NT, Liposome-MT(Lipsome 20 mpk, 10 ㎍ mRNA/mg liposome)를 처리하였다. 각 mRNA는 5 ㎍을 처리하였으며, 3일 간격으로 28일 동안 총 5번을 처리하였다. 3일 간격으로 종양의 체적(volume)을 조사하여 그래프로 나타냈다. 28일째 누드 마우스를 희생시켜 종양을 분리하여 체적을 측정하였고, 그 결과를 도 25에 나타내었다.

도 25를 참조하면, iLPD-NT 및 iLPD-MT 그룹에서 종양 성장률이 2개의 대조군 그룹(P = 0.03)과 비교하여 현저하게 감소하였다. 또한 PBS와 Void Liposome 주입 시료 사이에는 약간의 차이가 있었다.

체내(in vivo)에서 mRNA의 독성 효과를 평가하기 위해 실험 기간 동안 마우의 체중을 측정하였으며, 모든 그룹에서 마우스의 체중은 전체 실험 기간에 걸쳐 약간 증가하였고, 대조군에 비해 시료 주입 후 체중의 변화는 크지 않은 것으로 나타났다. 도 25에서와 같이, 실험 완료 후 희생된 마우스에서 채취한 종양 조직의 최종 크기를 비교하여 나타내었다.

실험 완료 후 희생된 마우스에서 채취한 혈액과 조직으로 혈액학적 및 조직학적 검사를 실시하였고, 그 결과를 도 26에 나타내었다. 도 26을 참조하면, 대조군 대비 시료를 처리한 마우의 혈액과 간에서 WBC 수를 제외하면 유의미한 독성 효과를 거의 보이지 않았다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

<110> ForBioKorea Co., Ltd. <120> Polynucleotide for treatment cancer encoding 5'-nucleotidase modified protein <130> NP20-08070 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD47 binder SV1 <400> 1 Met Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe 20 25 30 Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val 50 55 60 Ser Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser 65 70 75 80 Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg 85 90 95 Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD47 binder SV4 <400> 2 Met Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Leu Ser Val Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe 20 25 30 Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val 50 55 60 Ser Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser 65 70 75 80 Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg 85 90 95 Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Leu Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 3 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T001 <400> 3 Met Val Phe Ser Ile Lys Glu Pro Phe Ser Ile Val Thr Asp Cys Asp 1 5 10 15 Glu Val Leu Thr Asp Ile Ser Pro Leu Trp Val His Lys Ile Gln Gln 20 25 30 Asn Ala Asp Tyr Phe Gly Lys Tyr Phe Asp Leu Ser Lys Leu Glu Gly 35 40 45 Leu Glu Phe Gly Thr Phe Glu His Tyr Gln Thr Val Leu Ser Arg Pro 50 55 60 Glu Phe His Leu Asn Lys Trp Leu Arg Lys Glu Asn Leu Val Leu Ser 65 70 75 80 Asp Glu Glu Glu Lys Glu Leu Phe Glu Arg Phe Tyr Ser Leu Tyr Asp 85 90 95 Asn Asp Glu Phe Tyr Glu Asp Cys Met Pro Thr Lys Met Cys Glu Gly 100 105 110 Ile Tyr Lys Leu Ser Leu Gln Lys Phe Val Asp Lys Ile Tyr Val Val 115 120 125 Thr Arg Thr Ser Glu Gly Thr Lys Glu Gly Lys Arg Lys Phe Ile Glu 130 135 140 Thr Phe Leu Asn Ser Asn Lys Val Glu Ile Ile Phe Val Gly Lys Asn 145 150 155 160 Glu Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Lys Asn Val Lys Met Ile 165 170 175 Val Glu Asp Glu Leu Ser Asn Ile Asn Asp Ile Val Glu Asn Cys Asn 180 185 190 Asp Gly Phe Glu Glu Val Asp Thr Tyr Ile Pro Ser Thr Gly Tyr Asn 195 200 205 Asn Lys Asp Ile Asp Gly Phe Asn Glu Asn Leu Met Lys Lys Gly Phe 210 215 220 Asn Ala Val Pro Tyr Val Ile Ile Glu Arg Pro Glu Thr Glu Glu Lys 225 230 235 240 Ala Val <210> 4 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 4 ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 60 atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 120 tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaatta 177 <210> 5 <211> 259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 5 gaattcacgc gtcgagcatg catctagggc ggccaattcc gcccctctcc cccccccccc 60 tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg 120 tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa 180 cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg 240 caaggtctgt tgaatgtcg 259 <210> 6 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 6 ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 60 atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 120 tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaatta 177 <210> 7 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 7 ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 60 atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 120 tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaatta 177 <210> 8 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 8 gactagtgca tcacatttaa aagcatctca gcctaccatg agaataagag aaagaaaatg 60 aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg tgtaaagcca acaccctgtc 120 taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct ctgtgcttca attaataaaa 180 aatggaaaga acctagatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgcatc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 300 aaaggctctt ttcagagcca ccagaatt 328 <210> 9 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 9 ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 60 atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 120 tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaatta 177 <210> 10 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 10 gactagtgca tcacatttaa aagcatctca gcctaccatg agaataagag aaagaaaatg 60 aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg tgtaaagcca acaccctgtc 120 taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct ctgtgcttca attaataaaa 180 aatggaaaga acctagatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgcatc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 300 aaaggctctt ttcagagcca ccagaatt 328 <210> 11 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 11 gggtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60 attcaagctt gagg 74 <210> 12 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 12 gactagtgca tcacatttaa aagcatctca gcctaccatg agaataagag aaagaaaatg 60 aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg tgtaaagcca acaccctgtc 120 taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct ctgtgcttca attaataaaa 180 aatggaaaga acctagatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgcatc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 300 aaaggctctt ttcagagcca ccagaatt 328 <210> 13 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 13 cttcctactc aggctttata caaagaccaa gaggtacagg tgcaagggag agaagaagag 60 taagaagaaa tataagagcc acc 83 <210> 14 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 14 ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60 acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 15 agtaagaaga aatataagag ccacc 25 <210> 16 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 16 ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60 acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101 <210> 17 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 17 gggagactgc cacc 14 <210> 18 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 18 ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60 acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101 <210> 19 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 19 gggagactgc caag 14 <210> 20 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 20 ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60 acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101 <210> 21 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR sequence <400> 21 gctagc 6 <210> 22 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence <400> 22 ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60 acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101 <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleoplasmin NLS sequence <400> 23 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 Leu Asp <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Poxvirus MLS sequence <400> 24 Lys Ile Ser Val Tyr Leu Thr Ala Ala Val Val Gly Phe Val Ala Tyr 1 5 10 15 Gly Ile Leu Lys Trp Tyr Arg Gly Thr 20 25 <210> 25 <211> 503 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Human Sirpa <400> 25 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly 35 40 45 Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser 85 90 95 Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg 130 135 140 Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr 145 150 155 160 Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro 165 170 175 Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp 180 185 190 Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile 195 200 205 His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln 210 215 220 Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg 225 230 235 240 Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu 245 250 255 Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys 260 265 270 Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu 275 280 285 Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn 290 295 300 Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser 305 310 315 320 Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly 325 330 335 Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro 340 345 350 Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu 355 360 365 Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala 370 375 380 Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys Ala 385 390 395 400 Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala 405 410 415 Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn 420 425 430 Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn Asn 435 440 445 His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser Glu 450 455 460 Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg Thr 465 470 475 480 Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala 485 490 495 Ser Val Gln Val Pro Arg Lys 500 <210> 26 <211> 357 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Human Sirpa DNA sequence <400> 26 ggtgaggagg agctgcaggt gattcagcct gacaagtccg tatcagttgc agctggagag 60 tcggccattc tgcactgcac tgtgacctcc ctgatccctg tggggcccat ccagtggttc 120 agaggagctg gaccagcccg ggaattaatc tacaatcaaa aagaaggcca cttcccccgg 180 gtaacaactg tttcagagtc cacaaagaga gaaaacatgg acttttccat cagcatcagt 240 aacatcaccc cagcagatgc cggcacctac tactgtgtga agttccggaa agggagccct 300 gacacggagt ttaagtctgg agcaggcact gagctgtctg tgcgtgccaa accctct 357 <210> 27 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV1 DNA sequence <400> 27 gaagaggaac tgcagattat tcagccggac aagtccgtaa gcgttgcagc tggcgagagc 60 gccattctgc actgcactat tacctccctg tttccggtgg gcccgatcca gtggttccgt 120 ggcgctggcc cagcccgtgt gctgatctac aatcaacgtc agggcccgtt cccgcgtgta 180 accactgtta gcgagaccac caagcgtgaa aacatggact tttccatcag catcagcaac 240 atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtattaagt tccgtaaagg cagccctgac 300 acggagttta agtctggcgc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc gtct 354 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KKtoLL11_F1 Primer <400> 28 gattattcag ccggacctgt ccgtaagcgt tgc 33 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KKtoLL11_R1 Primer <400> 29 gcaacgctta cggacaggtc cggctgaata atc 33 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KKtoLL104_F2 Primer <400> 30 ctgacacgga gtttctgtct ggcgcag 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KKtoLL104_R2 Primer <400> 31 ctgcgccaga cagaaactcc gtgtcag 27 <210> 32 <211> 198 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> NT5M <400> 32 Met Gly Gly Arg Ala Leu Arg Val Leu Val Asp Met Asp Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Asp Phe Glu Gly Gly Phe Leu Arg Lys Phe Arg Ala Arg Phe Pro 20 25 30 Asp Gln Pro Phe Ile Ala Leu Glu Asp Arg Arg Gly Phe Trp Val Ser 35 40 45 Glu Gln Tyr Gly Arg Leu Arg Pro Gly Leu Ser Glu Lys Ala Ile Ser 50 55 60 Ile Trp Glu Ser Lys Asn Phe Phe Phe Glu Leu Glu Pro Leu Pro Gly 65 70 75 80 Ala Val Glu Ala Val Lys Glu Met Ala Ser Leu Gln Asn Thr Asp Val 85 90 95 Phe Ile Cys Thr Ser Pro Ile Lys Met Phe Lys Tyr Cys Pro Tyr Glu 100 105 110 Lys Tyr Ala Trp Val Glu Lys Tyr Phe Gly Pro Asp Phe Leu Glu Gln 115 120 125 Ile Val Leu Thr Arg Asp Lys Thr Val Val Ser Ala Asp Leu Leu Ile 130 135 140 Asp Asp Arg Pro Asp Ile Thr Gly Ala Glu Pro Thr Pro Ser Trp Glu 145 150 155 160 His Val Leu Phe Thr Ala Cys His Asn Gln His Leu Gln Leu Gln Pro 165 170 175 Pro Arg Arg Arg Leu His Ser Trp Ala Asp Asp Trp Lys Ala Ile Leu 180 185 190 Asp Ser Lys Arg Pro Cys 195 <210> 33 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siT001-1 sense <400> 33 cgagaagaag ucagauuaca ucaag 25 <210> 34 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siT001-1 antisense <400> 34 cuugauguaa ucugacuucu ucucg 25 <210> 35 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siT001-2 sense <400> 35 cgcaaauuca uugaaaccuu ccuga 25 <210> 36 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siT001-2 antisense <400> 36 ucaggaaggu uucaaugaau uugcg 25 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for PCR <400> 37 gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gc 32 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR <400> 38 gaagcggccg ccttcctact caggctttat tc 32

Claims

서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체.
삭제
제1항에 있어서,
상기 변이체는 암세포에서 핵산대사를 저해하는 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체.
제3항에 있어서,
상기 핵산대사는 dTTP 생합성 대사인 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 암은 대장암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase) 변이체.