KR20180086183A - 유전자 조작 약물 내성 t 세포 및 이것의 사용 방법 - Google Patents

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KR20180086183A
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cell
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로렌스 에스 램브
에이치 트렌트 스펜서
지 얀시 길레스피
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더 유에이비 리서치 파운데이션
칠드런스 헬스케어 오브 애틀란타, 인크.
에모리 유니버시티
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Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체 및 생존 인자를 적어도 발현하도록 조작된 신규한 세포 조성물을 제공한다. 상기 세포 조성물의 사용 방법도 개시한다.

Description

유전자 조작 약물 내성 T 세포 및 이것의 사용 방법
암 치료를 위한 종래의 치료법은 많은 측면에서 유망하긴 하지만 여전히 개선될 필요가 있다. 예를 들어, 광범위한 노력에도 불구하고, 다형성 교아세포종(glioblastoma multiforme; GBM)과 같은 고등급의 일차 뇌 종양의 치료 요법은 중앙 생존 기간을 2년 넘게 유의적이고 지속적으로 연장시키지 못하였다.
조사되고 있는 연구 분야 중 하나는 면역요법이다. 이러한 치료법은 암과 같은 질환을 퇴치하기 위해 환자의 면역계의 능력을 이용하는 것이다. 특히, 입양 세포 이식(adoptive cell transfer)이 검토되고 있다. 입양 세포 이식의 여러 형태에서는, 환자의 면역 세포를 수집하고, 증식시키고, 더 효율적인 반응을 위해 변형시킨다. 이와 관련하여 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)가 사용되었다. CAR은, 면역 이펙터 세포에 임의적인 소정의 특이성을 이식하는, 공학적으로 만들어진 수용체이다. 전형적으로, CAR은 T 세포에 단클론 항체의 특이성을 이식하는 데 사용된다. 이러한 접근법에서, 환자 또는 적절한 도너로부터 T 세포를 분리하여, 이들을 특정 암 형태에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형시킨다. 암 세포를 인식하여 사멸시킬 수 있게 된 T 세포를 환자에게 재도입한다. 이러한 접근법의 초기 임상 시험은 효능을 입증하였다.
그러나, 입양 세포 이식에 있어서의 CAR의 사용은 여전히 몇 가지 단점을 갖고 있다. 본 발명은, 종양 항원에 특이적인 CAR, 및 환자에게 투여될 수 있는 부가적인 치료적 처치(예컨대, 화학요법 치료 레짐(regimen))에 대한 내성을 제공하는 생존 인자를 발현하도록 조작된 새로운 면역계 세포 조성물을 제공한다. 상기 세포 조성물은 자살 유전자와 부가적인 요소를 추가로 포함할 수 있다. 질환 치료를 위해 상기 세포 조성물을 사용하는 방법도 제공한다. 따라서, 본 발명은 면역요법을 이용한 치료의 문제점에 대한 새로운 필요한 해법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 제공된 상기 세포 조성물은 γδ T 세포이다.
도 1a는, 유세포 분석에 의해 세포 형질도입을 용이하게 추척하는 데 이용될 수 있는, eGFP를 동시 발현하는 EGFRvIII CAR 대조군 벡터를 도시한다.
도 1b는, 생체내에서의 세포 이동/귀소를 추적하는 데 이용될 수 있는, 반딧불이 루시퍼라제를 동시 발현하는 EGFRvIII CAR 대조군 벡터를 도시한다.
도 1c는, 생존 인자를 코딩하는 서열이 결여되어 있고 약물 내성을 부여할 수 없는, EGFRvIII CAR을 코딩하는 대조군 벡터를 도시한다. 이 대조군 구성체는 CAR 발현에 대해 양성 대조군으로서, 그리고 약물 내성에 대해 음성 대조군으로서 사용될 수 있다.
도 1d는, 테모졸로마이드(TZ)에 대한 내성을 부여하는 생존 인자(이 도면에서 MGMT)를 코딩하는 EGFRvIII CAR 동시 발현 서열을 도시한다. 이 구성체는 교아세포종의 생체내 치료에 최대 이익을 제공할 것으로 기대된다.
도 2는 치료에 대한 예시적인 실험 디자인을 도시한다.
도 3a는, 미처리 γδ T 세포를 이용하여 실시한 주사 48시간 후의, 4T1 유방 지방체 종양에서의 111[In] 표지 γδ T 세포의 분포를 보여주는 SPECT/CT 융합 이미지(축상)를 도시하고, 미처리 γδ T 세포가 종양에 결합된 것을 보여준다; 점선의 원은 종양 부위를 표시한다.
도 3b는, 주사 전에 항-γδ TCR 단클론 항체로 전처리한 γδ T 세포를 사용하여 행한, 도 3a에 도시된 것과 동일한 이미지를 도시하며, 처리된 γδ T 세포는 종양에 결합하지 않았음을 보여준다; 점선의 원은 종양 부위를 표시한다.
도 4a는, X12T 및 X22T 신경교종 이종이식편에 대한 스트레스 관련 NKG2DL를 도시한다. 두 세포 유형은 자발형광을 나타내었다. 흑색 = 이소타입 대조군, 청색 = 종양, 적색 = 400 μM의 TMZ에 4시간 동안 노출된 종양.
도 4b는, TMZ에 내성이 되도록 변형시킨 생체외 증식/활성화 γδ T 세포가, X12T 및 X22T의 이펙터:타겟(E:T) 비를 증가시키면서 시험관내에서 배양한 X12T 및 X22T 신경교종 이종이식편 유래의 세포에 대해 세포독성을 나타내었음을 보여주며, 용해율(%)은 유세포 분석에 의해 생존/사멸 비로서 나타내었다.
도 5a는, TMZ 단독(TMZ), TMZ와 TMZ 내성에 대한 생존 인자(DRI)를 발현하도록 변형시킨 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 조성물의 조합, 비변형 γδ T 세포 및 NK 세포(CT)로 치료한 후의 X12P 신경교종 보유 마우스와 치료를 받지 않은 대조군 마우스의 생존율을 도시한다.
도 5b는, TMZ 단독(TMZ), TMZ와 TMZ 내성에 대한 생존 인자(DRI)를 발현하도록 변형시킨 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 조성물의 조합, 비변형 γδ T 세포 및 NK 세포(CT)로 치료한 후의 X12T 신경교종 보유 마우스와 치료를 받지 않은 대조군 마우스의 생존율을 도시한다.
도 6은, 전이성 뇌 종양 조직에 인접한 정상 뇌 조직에서 스트레스 유도성 항원(stress-induced antigen) 발현이 증가하지 않는다는 것을 보여준다.
도 7은, 방사선 치료 후 정상 뇌 조직에서 스트레스 유도성 항원 발현이 증가하지 않는다는 것을 보여준다.
도 8a는, 선행 기술의 방법의 일 실시형태를 도시한다.
도 8b는, 본 발명의 방법의 일 실시형태를 도시한다.
종래의 암 치료 방법은 개선의 필요성이 있다. 본 발명은 선행 기술에서 직면하는 문제점들에 대한 새로운 해법을 제공하며, 신규한 세포 조성물과, GBM을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 암의 치료를 위한 상기 신규한 세포 조성물의 사용 방법을 개시한다. 본 발명은 γδ T 세포를 사용하는 세포 조성물의 예들을 제공하고, CAR 및 생존 인자의 구체적인 예를 제공한다. 그러나, 다른 면역계 세포, 다른 CAR 및 다른 생존 인자도 본 발명에 이용될 수 있다. 면역계 세포, CAR 및 생존 인자의 선택은, 치료되는 암의 유형과 환자에 치료에 이용되는 부가적인 요법에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받을 수 있다.
본 발명은 신규한 세포 조성물과 암 치료 방법에 있어서의 상기 세포 조성물의 용도를 제공한다.
제1 측면에서, 상기 세포 조성물은, 종양 항원에 지향된 CAR과, 면역계 세포가 부가적인 치료적 처치(예를 들어, 기재된 세포 조성물과 함께 이용되는 화학요법제(들)에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드)에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 생존 인자를 포함한다.
제2 측면에서, 상기 세포 조성물은, 종양 항원에 지향된 CAR과, γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치(예를 들어, 기재된 세포 조성물과 함께 이용되는 화학요법제(들)에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드)에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 생존 인자를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
제3 측면에서, 상기 세포 조성물은, 신경교종 특이적 종양 관련 항원(TAA)에 지향된 CAR과, γδ T 세포가, 예를 들어 테모졸로마이드(TMZ) 화학요법 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 생존 인자를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
제4 측면에서, 상기 세포 조성물은, 신경교종 특이적 TAA EGFRvIII과, γδ T 세포가, 예를 들어 테모졸로마이드(TMZ) 화학요법 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT)를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
제5 측면에서, 상기 세포 조성물은, 신경교종 특이적 TAA IL13Rα에 지향된 CAR과, γδ T 세포가, 예를 들어, TMZ 화학요법 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 MGMT를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
제6 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 세포 조성물을 대상에게 투여하고, 본 발명의 세포 조성물의 투여 전에, 후에, 또는 전과 후에 모두, 부가적인 치료적 처치를 제공하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 세포 조성물을 대상에게 투여하고, 본 발명의 세포 조성물의 투여 전에, 후에, 또는 전과 후에 모두, 부가적인 치료적 처치를 제공하는 것을 포함하는 신경교종 치료 방법을 제공한다.
제8 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 세포 조성물을 대상에게 투여하고, 본 발명의 세포 조성물의 투여 전에, 후에, 또는 전과 후에 모두, 부가적인 치료적 처치를 제공하는 것을 포함하는 GBM 치료 방법을 제공한다.
제9 측면에서, 본 발명은, 제4 또는 제5 측면의 세포 조성물을 대상에게 투여하고, 본 발명의 세포 조성물의 투여 전에, 후에, 또는 전과 후에 모두, 부가적인 치료적 처치를 제공하는 것을 포함하는 GBM 치료 방법을 제공한다.
제10 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 TMZ 화학요법제를 대상에게 투여하고, 제4 또는 제5 측면의 세포 조성물을 대상에게 투여하며, 경우에 따라, 부가적인 코스의, 예를 들어 TMZ 화학요법제 및/또는 본 발명의 부가적인 세포 조성물을 투여하는 것을 포함하는 GBM 치료 방법을 제공한다.
제11 측면에서, 본 발명은, 면역요법 치료와 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 암을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 종양 항원에 지향된 CAR, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 및 CAR 발현 면역계 세포가 부가적인 치료적 처치로부터 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 생존 인자를 발현하는 면역계 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 부가적인 치료적 처치는, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하기 전에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여한 후에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시되는 것인 방법을 제공한다.
제12 측면에서, 본 발명은, 면역요법 치료와 부가적인 치료적 처치를 이용하여 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 종양 항원에 지향된 CAR, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 및 CAR 발현 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 부가적인 치료적 처치는, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하기 전에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여한 후에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시되는 것인 방법을 제공한다.
제13 측면에서, 본 발명은, 면역요법 치료와, 예를 들어, TMZ 화학요법을 이용하는 부가적인 치료적 처치를 이용하여 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 신경교종 특이적 TAA에 지향된 CAR, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 및 CAR 발현 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 부가적인 치료적 처치는, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하기 전에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여한 후에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시되는 것인 방법을 제공한다.
제14 측면에 있어서, 본 발명은, 면역요법 치료와, 예를 들어, TMZ 화학요법을 이용하는 부가적인 치료적 처치를 이용하여 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 신경교종 특이적 TAA EGFRvIII에 지향된 CAR, NKGD2 수용체, 및 CAR 발현 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 제공하는 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 부가적인 치료적 처치는, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하기 전에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여한 후에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시되는 것인 방법을 제공한다.
제15 측면에서, 면역요법 치료와, 예를 들어, TMZ 화학요법을 이용하는 부가적인 치료적 처치를 이용하여 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 신경교종 특이적 TAA IL13Rα에 지향된 CAR, NKGD2 수용체, 및 CAR 발현 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 제공하는 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 부가적인 치료적 처치는, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하기 전에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여한 후에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시되는 것인 방법을 제공한다.
세포 조성물
일반적으로, 본 발명은 약물 내성 세포 면역요법(drug resistant cellular immunotherapy; DRI)을 제공하기 위해 생존 인자를 이용한다. 이 메카니즘을 통해, 본 발명의 세포 조성물에, 대상에게 투여된 후 치료 환경에서 생존하고 증식하여 항종양 활성을 발휘할 수 있는 능력이 제공된다. 성장 인자는 본 발명의 세포 조성물 및 방법과 함께 이용될 수 있는 부가적인 치료적 처치를 기초로 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 생존하는"이라는 어구는 "부가적인 치료적 처치의 존재하에 생존하는"이라는 어구와 서로 교환하여 사용될 수 있고, 각각의 어구는, 세포가, 부가적인 치료적 처치에 사용되는 작용제와 직접 접촉하여 생존할 수 있는 능력 또는 부가적인 치료제의 사용으로부터 발생하는 본 발명의 세포 조성물의 환경에서 세포 독성 존재하에 생존할 수 있는 능력을 의미한다. 부가적인 치료적 처치의 예로는 항암제, 대사 길항제, DAN 탈메틸화제, 식물 유래의 항종양제, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 화학요법제, 알킬화제, 대사길항물질, 항암 항생제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 분화 유도제, 호르몬 치료제 및 전술한 것들의 조합을 이용한 치료를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 다양한 특정 작용제가 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 부가적인 치료적 처치에 이용될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, 종양 항원에 지향된 CAR, 및 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 면역계 세포가 생존할 수 있도록 하는 생존 인자, 예를 들어, 기재된 세포 조성물과 함께 사용되는 화학요법제(들)에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 면역계 세포를 포함한다. 특정 화학요법제에 대한 약물 내성을 부여하는 그러한 폴리펩티드는 MGMT, 5' 뉴클레오티다제 II(NT5C2), 디하이드로폴레이트 리덕타제의 약물 내성 변이체(L22Y-DHFR), 티미딜레이트 신타제, 및 다제 내성-1 단백질(MDR1)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, 종양 항원에 지향된 CAR, 및 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는 생존 인자(기재된 세포 조성물과 함께 사용되는 화학요법제(들)에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드)를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, 신경교종 특이적 TAA에 지향된 CAR, 및 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는 생존 인자(기재된 세포 조성물과 함께 사용되는 화학요법제(들)에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드)를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, TAA에 지향된 CAR, 및 예를 들어, TMZ 화학요법 치료 환경에서 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 생존 인자를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, 신경교종 특이적 TAA EGFRvIII에 지향된 CAR, 및 예를 들어, TMZ 화학요법 치료 환경에서 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 MGMT를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, 신경교종 특이적 TAA IL13Rα에 지향된 CAR, 및 예를 들어, TMZ 화학요법 치료 환경에서 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 MGMT를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, 신경아세포종 특이적 TAA에 지향된 CAR, 및 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는 생존 인자(기재된 세포 조성물과 함께 사용되는 화학요법제(들)에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드)를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, 신경아세포종 특이적 TAA에 지향된 CAR, 및 예를 들어, TMZ 화학요법 치료 환경에서 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 생존 인자를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 조성물은, 적어도, 신경아세포종 특이적 TAA GD2에 지향된 CAR, 및 예를 들어, TMZ 화학요법 치료 환경에서 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 유전자를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 조성물은, 단지 종양 항원에 지향된 CAR 또는 신경교종 특이적 TAA 및 생존 인자, 예컨대 TMZ에 대한 내성을 위한 생존 인자를 발현하도록 조작된 면역계 세포 또는 γδ T 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은, 단지 종양 항원에 지향된 CAR, 신경교종 특이적 TAA 또는 신경아세포종 특이적 TAA, 자살 유전자 및 생존 인자, 예컨대, 예를 들어 TMZ에 대한 내성을 위한 생존 인자를 발현하도록 조작된 면역계 세포 또는 γδ T 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은, 단지 종양 항원에 지향된 CAR, 신경교종 특이적 TAA 또는 신경아세포종 특이적 TAA, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 및 예를 들어 TMZ에 대한 내성을 위한 생존 인자와 같은 생존 인자를 발현하도록 조작된 면역계 세포 또는 γδ T 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은, 단지 종양 항원에 지향된 CAR 종양 항원, 신경교종 특이적 TAA 또는 신경아세포종 특이적 TAA, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 자살 유전자, 및 예를 들어 TMZ에 대한 내성을 위한 생존 인자와 같은 생존 인자를 발현하도록 조작된 면역계 세포 또는 γδ T 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은, 단지 종양 항원에 지향된 CAR, 신경교종 특이적 TAA 또는 신경아세포종 특이적 TAA, NKG2D 수용체, 및 예를 들어 TMZ에 대한 내성을 위한 생존 인자와 같은 생존 인자를 발현하도록 조작된 면역계 세포 또는 γδ T 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은, 단지 종양 항원에 지향된 CAR, 신경교종 특이적 TAA 또는 신경아세포종 특이적 TAA, NKG2D 수용체, 자살 유전자, 및 TMZ에 대한 내성을 위한 생존 인자와 같은 생존 인자를 발현하도록 조작된 면역계 세포 또는 γδ T 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역계 세포 또는 γδ T 세포는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역계 세포 또는 γδ T 세포는 NKGD2 수용체를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체는 면역계 세포 또는 γδ T 세포 상에 본래 존재한다. 특정 실시형태에서, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체는 면역계 세포 또는 γδ T 세포에서 증가된 수준으로 유도된다. 따라서, 세포 조성물이 단지 종양 항원에 지향된 CAR, 신경교종 특이적 TAA 또는 신경아세포종 특이적 TAA, 생존 인자 및 임의적인 자살 유전자를 발현하도록 조작된 면역계 세포 또는 γδ T 세포를 포함하는 실시형태에서, 면역계 세포 또는 γδ T 세포는 스트레스 유도성 항원 또는 NKGD2 수용체를 여전히 발현할 수 있다.
특정 실시형태에서, 면역계 세포는 면역요법에 유용한 임의의 면역계 세포이다. 전술한 실시형태의 또 다른 측면에서, 면역계 세포는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체를 발현하는 임의의 세포이다. 특정 실시형태에서, 면역계 세포는 NKG2D 수용체를 발현하는 임의의 세포이다. 특정 실시형태에서, 면역계 세포는 NK 세포 또는 γδ T 세포이다. 특정 실시형태에서, 면역계 세포는 γδ T 세포이다. 특정 실시형태에서, 면역계 세포는 NK 세포와 γδ T 세포의 조합이다. 특정 실시형태에서, 면역계 세포는 NK 세포와 γδ T 세포의 조합이며, 여기서 NK 세포 및/또는 γδ T 세포의 적어도 일부는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체를 발현한다. 특정 실시형태에서, 면역계 세포는 NK 세포와 γδ T 세포의 조합이며, 여기서 NK 세포 및/또는 γδ T 세포의 적어도 일부는 NKGD2 수용체를 발현한다.
특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포 및 추가적인 면역계 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포 조성물은 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하거나 γδ T 세포, αβ T 세포 및 NK 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포 및 추가적인 면역계 세포를 포함하고, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하고, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하고, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재하고, NK 세포는 25% 이하로 존재한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포 및 αβ T 세포를 포함하고, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포 및 αβ T 세포를 포함하고, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재하고, 상기 αβ T 세포는 5% 이하로 존재한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포, αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하고, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포, αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하고, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재하고, 상기 αβ T 세포는 5% 이하로 존재하고, 상기 NK 세포는 25% 이하로 존재한다. 일 실시형태에서, 다양한 세포 유형의 비율(%)은 실시예 3에 기재된 바와 같이 유세포 분석으로 측정된다.
특정 실시형태에서, 세포 조성물을 구성하는 세포의 적어도 일부(예를 들어, 면역계 세포 또는 γδ T 세포)는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물을 구성하는 세포의 적어도 일부(예를 들어, 면역계 세포 또는 γδ T 세포)는 NKGD2 수용체를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체는 세포 조성물을 구성하는 세포의 적어도 일부(예를 들어, 면역계 세포 또는 γδ T 세포)에 본래 존재한다. 특정 실시형태에서, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체는, 세포 조성물을 구성하는 세포의 적어도 일부(예를 들어, 면역계 세포 또는 γδ T 세포)에서 증가된 수준으로 유도된다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물을 구성하는 세포의 적어도 일부(예를 들어, 면역계 세포 또는 γδ T 세포)는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체를 발현하도록 조작된다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포를 포함하고, γδ T 세포의 적어도 일부는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체를 발현한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포, αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하고, γδ T 세포의 적어도 일부는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체를 발현한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포, αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하고, γδ T 세포의 적어도 일부는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체를 발현하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재한다. 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 γδ T 세포, αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하고, γδ T 세포의 적어도 일부는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체를 발현하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상으로 존재하고, 상기 αβ T 세포는 5% 이하로 존재하고, NK 세포는 25% 이하로 존재한다. 특정 실시형태에서, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체는 γδ T 세포, αβ T 세포 및/또는 NK 세포 상에 본래 존재한다. 특정 실시형태에서, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체는 γδ T 세포, αβ T 세포 및/또는 NK 세포의 적어도 일부에서 증가된 수준으로 유도된다. 특정 실시형태에서, γδ T 세포, αβ T 세포 및/또는 NK 세포의 적어도 일부는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체 또는 NKGD2 수용체를 발현하도록 조작된다. 일 실시형태에서, 다양한 세포 유형의 비율(%)은 실시예 3에 기재된 바와 같이 유세포 분석에 의해 측정된다.
전술한 것의 한 측면에서, 종양 항원은 당업계에 공지된 임의의 종양 항원 이다. 특정 실시형태에서, 종양 항원은 하기 특성 중 적어도 하나가 존재하도록 선택된다: 항원이 가능한 한 많은 단계의 암에서 발현될 것, 항원이 종양의 표면 상에서 발현될 것, 항원이 종양 세포의 생존력에 있어서 중요할 것, 및 항원이 비종양 조직에서 발현되지 않거나 오프 타겟 효과(off target effet)가 임상적으로 허용될 수 있는 수준으로 발현될 것. 특정 실시형태에서, 종양 항원은 EphA2, B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD22, CD19, CD20, ROR1, 카파쇄 또는 경쇄, 암 배아성 항원, 알파 태아 단백질, CA-125, 글리피칸(Glypican)-3, 상피성 종양 항원, 흑색종 관련 항원, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, PAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 폴레이트 수용체 α, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2, ERBB2, HER3, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, 5T4, 8H9, GD2, CD123, CD23, CD33, CD30, CD38, CD56, c-Met, fap, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11Rα, IL-13Rα, CSPG4, 루이스(Lewis)-Y, MCSP, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, PRAME, PSCA, PSCl, PSMA, EGFR, Sp17, SURVIVIN, TAG72, TEM1, TEM8, EGFRvIII, 및 VEGFR2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
전술한 것의 한 측면에서, 신경교종 특이적 TAA는 당업계에 공지된 임의의 신경교종 특이적 TAA이다. 특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 하기 특성 중 적어도 하나가 존재하도록 선택된다: 신경교종 특이적 TAA가 가능한 한 많은 단계의 암에서 발현될 것, 신경교종 특이적 TAA가 종양의 표면 상에서 발현될 것, 신경교종 특이적 TAA가 종양 세포의 생존력에 있어서 중요할 것, 및 신경교종 특이적 TAA가 비종양 조직에서 발현되지 않거나 오프 타겟 효과가 임상적으로 허용될 수 있는 수준으로 발현될 것. 특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 NKG2D 리간드, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A, MIC-B, EGFRvIII 및 IL13Rα로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 EGFRvIII이다. 특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 IL13Rα이다.
전술한 것의 한 측면에서, 신경아세포종 특이적 TAA는 당업계에 공지된 임의의 신경교종 특이적 TAA이다. 특정 실시형태에서, 신경아세포종 특이적 TAA는 하기 특성 중 적어도 하나가 존재하도록 선택된다: 신경아세포종 특이적 TAA가 가능한 한 많은 단계의 암에서 발현될 것, 신경아세포종 특이적 TAA가 종양의 표면 상에서 발현될 것, 신경아세포종 특이적 TAA가 종양 세포의 생존력에 있어서 중요할 것, 및 신경아세포종 특이적 TAA가 비종양 조직에서 발현되지 않거나 오프 타겟 효과가 임상적으로 허용될 수 있는 수준으로 발현될 것. 특정 실시형태에서, 신경아세포종 특이적 TAA는 NKG2D 리간드, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A, MIC-B, 및 GD2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 신경아세포종 특이적 TAA는 GD2이다.
생존 인자는, 부가적인 치료적 처치에 대한 내성을 제공하고/하거나 세포 조성물을 구성하는 세포가 치료 환경(예컨대 화학요법 치료 환경)에서 생존할 수 있도록 하는, 당업계에 공지된 임의의 인자일 수 있다. 특정 실시형태에서, 부가적인 치료적 처치는 항암제, 대사 길항제, DNA 탈메틸화제, 식물 유래의 항종양제, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 화학요법제, 알킬화제, 대사길항물질, 항암 항생제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 분화 유도제, 호르몬 치료제 및 전술한 것의 조합을 사용한 치료이고, 생존 인자는 부가적인 치료적 처치에 대한 내성을 제공한다. 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 바와 같은 다양한 특정 작용제가 부가적인 치료적 처치에 사용될 수 있다. 대표적인 알킬화제로는 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드 및 멜팔란을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 대사 길항제로는 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이들의 유도체를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 DNA 탈메틸화제(대사길항물질로도 알려짐)로는 아자시티딘을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 화학요법제로는 치환된 뉴클레오티드 및 치환된 뉴클레오시드를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 항종양 항생제로는 미토마이신, 아드리아마이신 및 독소루비신을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 식물 유래의 항종양제로는 빈크리스틴, 빈데신, TAXOL®, 파클리탁셀, 아브락산; 시스플라틴; 카보플라틴; 에토포사이드 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 항암제로는 트리메토트렉세이트(TMTX), 테모졸로마이드(TMZ), 랄티트렉세드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR), 6-벤지구아니딘(6-BG), 니트로소우레아[예를 들어, 비스-클로로니트로소우레아(BCNU; 카무스틴), 로무스틴(CCNU) +/- 프로카바진 및 빈크리스틴(PCV 레짐), 독소루비신, 포테무스틴, 사이타라빈, 캄토테신 및 전술한 것 중 어느 하나의 치료적 유도체를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 부가적인 치료적 처치에 사용되는 작용제는 TMZ, 독소루비신, 멜팔란, 니트로소우레아 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 생존 인자는 MGMT, 다제 내성 단백질 1(MDR1), 또는 5' 뉴클레오티다제 II(NT5C2)이다. 다른 생존 인자는, 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제의 약물 내성 변이체(L22Y-DHFR) 및 티미딜레이트 신타제의 약무루 내성 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 생존 인자는 MGMT이다. 그러나, 다른 생존 인자는 치료 환경의 특성에 따라(즉, 본 발명의 세포 조성물과 함께 환자에게 제공되는 다른 부가적 치료적 처치가 무엇인지에 따라) 사용될 수 있다.
전술한 것의 한 측면에서, 조성물의 세포는 자살 유전자를 추가로 포함한다.
전술한 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 단일 유형의 면역계 세포를 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 포함한다. 전술한 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 γδ T 세포를 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 포함한다. 전술한 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 γδ T 세포를 60% 이상, αβ T 세포를 5% 이하, NK 세포를 25% 이하 포함한다. 일 실시형태에서, 존재하는 다양한 세포 유형의 비율(%)은 실시예 3에 기재된 바와 같이 유세포 분석에 의해 측정된다.
전술한 것의 또 다른 측면에서, γδ T 세포는 환자로부터 입수하고 생체외에서 증식/활성화시키며, 그 후 그 세포를 환자에게 재도입할 수 있다.
기재된 세포 조성물을 DRI-CAR T 세포로 칭할 수도 있다.
본원에 기재된 세포 조성물은, CAR 및 생존 인자와, 또한 다른 요소(예를 들어, 자살 유전자 및/또는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체)를 코딩하고 발현할 수 있는 핵산 구성체를 도입함으로써 제조할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단일 핵산 구성체가 CAR 및 생존 인자와, 또한 다른 요소(예를 들어, 자살 유전자 및/또는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체)를 코딩한다. 특정 실시형태에서, 별개의 핵산 구성체가 CAR 및 생존 인자와, 또한 다른 요소(예를 들어, 자살 유전자 및/또는 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체)를 코딩한다. 이러한 핵산 구성체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. CAR 및/또는 생존 인자를 코딩하는 대표적인 핵산 구성체가 도 1a∼1d에 도시되어 있다.
특정 실시형태에서, 핵산 구성체는 CAR 및 생존 인자를 코딩한다.
상기 실시형태에서, CAR은 본원에 기재된 도메인 및/또는 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산 구성체는 EGFRvIII 항원에 지향된 scFv를 포함하는 엑토도메인, 힌지 영역, 막관통 영역, 및 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 CAR을 코딩한다. 특정 실시형태에서, 핵산 구성체 IL13Rα 항원에 지향된 scFv를 포함하는 엑토도메인, 힌지 영역, 막관통 영역, 및 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 CAR을 코딩한다. 특정 실시형태에서, 핵산 구성체는 EGFRvIII 항원에 지향된 scFv를 포함하는 엑토도메인, IgG 유래의 힌지 영역, CD3-제타 유래의 막관통 영역, 및 CD28, Ox40 및 CD32 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 CAR을 코딩한다. 특정 실시형태에서, 핵산 구성체는 IL13Rα 항원에 지향된 scFv를 포함하는 엑토도메인, IgG 유래의 힌지 영역, CD3-제타 유래의 막관통 영역, 및 CD28, Ox40 및 CD32 신호전달 도메인을 포함하는 엑토도메인을 포함하는 CAR을 코딩한다.
핵산 구성체는 숙주 세포로 도입하기 전에 발현 벡터로 도입될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기에 기재한 바와 같이, 핵산 구성체의 특성에 따라 단일 발현 벡터가 사용될 수도 있고 복수의 발현 벡터가 사용될 수도 있다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 발현 벡터는 플라스미드이다. 특정 실시형태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 발현 벡터는 면역계 세포(숙주 세포라고도 칭함)의 내부에서 복제할 수도 있고, 또는 발현 벡터는 그 전체가 또는 일부가 면역계 세포의 게놈으로 통합되어, 핵산 구성체가 숙주 세포의 게놈과 함께 복제되게 할 수도 있다.
발현 벡터는 숙주 세포에서의 핵산 구성체의 발현에 적합한 형태로 핵산 구성체를 포함한다. 따라서, 발현 벡터는 숙주 세포에서의 핵산 구성체의 발현에 필요한 요소들을 포함한다. 그 요소들은 숙주 세포 및 벡터의 특성뿐만 아니라, 다른 요인들(예컨대 원하는 발현 수준)에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 벡터는 핵산 구성체의 발현을 허용하도록 핵산 구성체에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열(예컨대, 프로모터 서열, 인핸서 서열 및 그와 같은 다른 서열)을 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은, 핵산 구성체가 특정 세포 유형에서만 발현되도록 세포 특이적일 수도 있고, 또는 상기 조절 서열은, 핵산 구성체가 임의의 세포 유형에서 발현되도록 항상성일 수도 있다.
키메라 항원 수용체
본 발명의 세포 조성물을 구성하는 세포는 하나 이상의 CAR을 도입하고 있다. CAR의 특정 예를 GBM의 치료에 사용되는 것으로 제시하였지만, 추가적인 암의 치료를 위해 설계된 다른 CAR도 사용될 수 있다. 본 발명은 당업계에 공지된 임의의 CAR을 이용할 수 있다. 종양 관련 항원에 대한 원하는 특이성을 갖는 CAR의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. CAR은 본 발명의 면역계 세포가 MHC 제한적이지 않게 종양 항원을 인식할 수 있도록 한다. 또한, CAR은 단백질 유래가 아닌 항원을 인식하도록 조작될 수 있다.
CAR은 일반적으로 하기 구조를 갖는다: 항원 인식 도메인을 포함하는 엑토도메인, 막관통 도메인 및 엔도도메인. 특정 실시형태에서, 1 내지 15개의 아미노산을 갖는 펩티드 링커가 CAR의 다양한 도메인들을 분리하기 위해 CAR 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커가 항원 인식 도메인과 막관통 도메인 사이 또는 막관통 도메인과 엔도도메인 사이에 존재할 수 있다. 펩티드 링커가 모든 도메인들의 사이에 또는 단지 도메인의 일부 사이에 존재할 수 있다. 또한, 엔도도메인이 하나보다 많은 요소를 포함할 경우, 링커 펩티드는 엔도도메인 내 개개의 요소들의 일부 또는 전부 사이에 존재할 수 있다.
CAR은 (일반적으로 CAR의 프로세싱 과정에서 나중에 제거되는) 신호 서열을 초기에 도입함으로써 생성할 수 있다. 신호 펩티드는, 초기 단백질을, 발현되면 소포체로 유도하고, 소포체는 CAR이 세포막으로 삽입될 수 있도록 변형(예를 들어, 글리코실화)될 수 있게 한다. 임의의 진핵생물의 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 일반적으로, 가장 아미노 말단의 성분에 본래 부착된 신호 펩티드가 사용된다(예를 들어, 경쇄 - 링커 - 중쇄의 배향을 갖는 scFv에서, 경쇄의 네이티브(native) 신호가 사용된다).
항원 인식 도메인은 종양 항원을 인식하는 임의의 도메인일 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 신경교종 특이적 TAA에 지향된다. 특정 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 종양 항원에 지향된다. 특정 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 신경아세포종 특이적 TAA에 지향된다. 항원 인식 도메인의 의한 인식을 위한 특정 항원이 위에 제시되었다. 항원 인식 도메인에 많은 대안이 있다. 단순한 엑토도메인(예를 들어, HIV 감염 세포를 인식하기 위한 CD4 엑토도메인) 및 (사이토카인 수용체를 보유한 세포를 인식할 수 있게 하는) 연결된 사이토카인과 같은 인식 성분을 포함하는 더 특이한 엑토도메인을 갖는 것과 같이, 네이티브 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 단일쇄 유래의 항원 인식 도메인이 개시되었다. 실제로, 높은 친화성으로 특정 타겟에 결합하는 임의의 모이어티가 항원 인식 영역으로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항원 인식 영역은 scFV이다. 특정 실시형태에서, 링커 펩티드(즉, 스페이서 영역 또는 힌지 영역)는 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 연결한다.
특정 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 scFV이다. scFV는, 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역들이 짧은 링커 펩티드(일반적으로 약 10개 내지 약 25개 아미노산)에 의해 연결되어 VH-링커-VL 구조(항원 결합 도메인이라고도 함)를 형성한 융합 단백질을 말한다. 링커는 일반적으로 유연성을 위해 글리신이 풍부하고, 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N 말단을 VL의 C 말단에, 또는 그 반대로 연결할 수 있다. 이러한 scFV는, 불변 영역의 제거와 링커의 도입에도 불구하고, 최초의 면역글로불린의 특이성을 유지한다.
특정 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 다가 scFV이다. 다가 scFV는, 추가의 링커에 의해 연결된, 2개의 면역글로불린 유래의 항원 결합 도메인(예컨대 VH-링커-VL 쇄)을 포함하며, 상기 항원 결합 도메인은 상이한 항원 또는 동일한 항원의 상이한 부분을 인식한다. 특정 측면에서, 항원 결합 도메인 중 하나는 타겟 세포 상의 활성화 분자를 인식한다. 특정 측면에서, 항원 결합 도메인 중 하나는 부가적인 치료적 처치의 결과로 타겟 세포 상에서 발현이 증가하는 항원(예컨대, 스트레스 유도성 항원을 포함하나 이것에 한정되지 않음)을 인식한다.
특정 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 2가 scFV이다. 그러한 2가 scFV는 일례로서 구조 VH1-링커a-VL1-VH-링커b-VL-링커c-VH-링커d-VL을 가질 수 있다(VH 및 VL이 상기에 기재한 것과 상이한 배향으로 배열되어도 된다는 점을 포함함).
링커 펩티드는 항원 결합 도메인이 항원 인식 및 결합에 적합한 입체구조를 받아들일 수 있도록 충분히 유연해야 한다. 가장 간단한 형태는 IgG1 유래의 힌지 영역이다. 다양한 링커 펩티드가 본원에 기재된 CAR와 함께 이용될 수 있다.
막관통 도메인은 CAR이 도입되는 세포의 막에 걸쳐 있는 소수성 영역(예컨대 알파 나선)이다. 임의의 막에 매립된 단백질로부터의 막관통 도메인이 사용될 수 있다. 일반적으로, 엔도도메인의 막에 가장 인접한 성분으로부터의 막관통 도메인이, 예를 들어, 항원 인식 도메인으로부터 엔도도메인으로의 신호 전달을 용이하게 하기 위해 사용된다. 흥미로운 점은, CD3-제타 막관통 도메인을 사용하는 것은, 인공 TCR의 네이티브 TCR로의 도입을 유도할 수 있다는 것이며, 이것은 네이티브 CD3-제타 막관통 하전 아스파르트산 잔기의 존재에 의존적인 요인이다.
엔도도메인은 항원 결합 후 신호 전달을 가능하게 한다. 항원 인식 후, 수용체 클러스터 및 신호가 CAR을 포함하는 면역계 세포로 전달된다. 엔도도메인은 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 엔도도메인은 하나보다 많은 신호전달 도메인을 포함한다. 가장 흔히 사용되는 신호전달 도메인은 CD3-제타이며, 이것은 3개의 면역수용체 티로신에 기초한 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 신호전달 도메인은 하나 이상의 ITAM을 포함한다. 특정 실시형태에서, 엔도도메인은 CD3-제타를 포함한다. 특정 실시형태에서, 엔도도메인은 CD3-제타 및 하나 이상의 추가적인 신호전달 도메인을 포함한다. 엔도도메인은 항원이 결합되면 활성화 신호를 세포에 전달한다. "제1 세대" CAR은 전형적으로 내인성 TCR 유래의 1차 신호 전달체인 CD3-제타 유래의 엔도도메인을 포함한다. "제2 세대" CAR은 다양한 보조 자극 단백질 수용체로부터의 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD28, 41BB, DAP10, OX40 또는 ICOS)을 엔도도메인의 세포질 테일에 부가하여, T 세포에 추가적인 신호를 제공한다. 가장 최근의 "제3 세대" CAR은 효능을 추가로 증강시키기 위해 CD3-제타-CD28-41BB 또는 CD3-제타-CD28-OX40과 같이 복수의 신호전달 도메인을 통합한 엔도도메인을 갖는다. 특정 실시형태에서, 엔도도메인은 CD3-제타-CD28-OX40이다.
사용 방법
본 발명의 세포 조성물의 사용 방법도 기술한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 세포 조성물을 대상에게 투여하는 단계 및 본 발명의 세포 조성물의 투여 전, 후, 또는 투여 전과 후에 모두 부가적인 치료적 처치를 제공하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 세포 조성물을 대상에게 투여하는 단계 및 본 발명의 세포 조성물의 투여 전, 후, 또는 투여 전과 후에 모두 부가적인 치료적 처치를 제공하는 단계를 포함하는 신경교종 치료 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 세포 조성물을 대상에게 투여하는 단계 및 본 발명의 세포 조성물의 투여 전, 후, 또는 투여 전과 후에 모두 부가적인 치료적 처치를 제공하는 단계를 포함하는 GBM 치료 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 신경교종 특이적 TAA EGFRvIII 또는 IL13Rα에 지향된 CAR, 및 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 MGMT 유전자를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 대상에게 투여하는 단계, 및 본 발명의 세포 조성물의 투여 전, 후, 또는 투여 전과 후에 모두 부가적인 치료적 처치를 제공하는 단계를 포함하는 GBM 치료 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어 TMZ 화학요법을 대상에게 실시하는 단계, 신경교종 특이적 TAA EGFRvIII 또는 IL13Rα에 지향된 CAR, 및 예를 들어 TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 MGMT 유전자를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 투여하는 단계, 및 경우에 따라, 추가적인 코스의, 예를 들어 TMZ 화학요법 및/또는 본 발명의 부가적인 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 GBM 치료 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 면역요법 치료 및 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 암을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 종양 항원에 지향된 CAR, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 및 CAR을 발현하는 면역계 세포가 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 생존 인자를 발현하는 면역계 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계로서, 상기 부가적인 치료적 처치는 세포 조성물을 대상에게 투여하기 전에, 세포 조성물을 대상에게 투여한 후, 세포 조성물을 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 면역요법 치료 및 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 암을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 종양 항원에 지향된 CAR, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 및 부가적인 치료적 처치로부터 생성된 치료 환경에서 CAR 발현 γδ T 세포가 생존할 수 있도록 하는 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계로서, 상기 부가적인 치료적 처치는 세포 조성물을 대상에게 투여하기 전에, 세포 조성물을 대상에게 투여한 후, 세포 조성물을 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 면역요법 치료, 및 TMZ 또는 다른 적절한 화학요법을 이용하는 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 신경교종을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 신경교종 특이적 TAA에 지향된 CAR, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 및 CAR을 발현하는 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치로부터 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어, TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계로서, 상기 부가적인 치료적 처치는 세포 조성물을 대상에게 투여하기 전에, 세포 조성물을 대상에게 투여한 후, 세포 조성물을 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 면역요법 치료, 및 예를 들어 TMZ 화학요법을 이용하는 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 신경아세포종을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 신경아세포종 특이적 TAA에 지향된 CAR, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체, 및 CAR을 발현하는 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치로부터 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어, TMZ 화학요법에 대한 내성을 위한 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계로서, 상기 부가적인 치료적 처치는 세포 조성물을 대상에게 투여하기 전에, 세포 조성물을 대상에게 투여한 후, 세포 조성물을 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 면역요법 치료, 및 예를 들어 TMZ 화학요법을 이용하는 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 신경교종을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 신경교종 특이적 TAA EGFRvIII에 지향된 CAR, NKGD2 수용체, 및 CAR을 발현하는 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치로부터 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어, TMZ 화학요법에 대한 내성을 제공하는 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계로서, 상기 부가적인 치료적 처치는 세포 조성물을 대상에게 투여하기 전에, 세포 조성물을 대상에게 투여한 후, 세포 조성물을 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 면역요법 치료, 및 예를 들어 TMZ 화학요법을 이용하는 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 암을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 신경교종 특이적 TAA IL13Rα에 지향된 CAR, NKGD2 수용체, 및 CAR을 발현하는 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치로부터 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어, TMZ 화학요법에 대한 내성을 제공하는 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계로서, 상기 부가적인 치료적 처치는 세포 조성물을 대상에게 투여하기 전에, 세포 조성물을 대상에게 투여한 후, 세포 조성물을 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 면역요법 치료, 및 예를 들어 TMZ 화학요법을 이용하는 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 신경아세포종을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, (i) 신경아세포종 특이적 TAA GD2에 지향된 CAR, NKGD2 수용체, 및 CAR을 발현하는 γδ T 세포가 부가적인 치료적 처치로부터 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는, 예를 들어, TMZ 화학요법에 대한 내성을 제공하는 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계로서, 상기 부가적인 치료적 처치는 세포 조성물을 대상에게 투여하기 전에, 세포 조성물을 대상에게 투여한 후, 세포 조성물을 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 단계를 포함한다.
전술한 방법 중 어느 것의 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 본원에 기재된 임의의 세포 조성물이다. 전술한 방법 중 어느 것의 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 매회의 세포 조성물의 투여 전, 후, 또는 투여 전과 후에 모두 부가적인 치료적 처치를 실시하면서 대상에게 1회 초과로 투여될 수 있다. 전술한 방법 중 어느 것의 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 세포 조성물의 1차 투여 전, 후, 또는 전과 후에 모두, 그리고 경우에 따라, 매회의 세포 조성물의 추가 투여 전, 후, 또는 전과 후에 모두 부가적인 치료적 처치를 실시하면서 대상에게 1회 초과로 투여될 수 있다. 전술한 방법 중 어느 것의 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 대상에게 2주 동안, 3주 동안, 4주 동안, 또는 그 이상 동안, 주 1회 대상에게 투여될 수 있다.
전술한 방법 중 어느 것의 특정 실시형태에서, 부가적인 치료적 처치는 세포 조성물의 투여로부터 24 내지 48시간 전, 후, 또는 전과 후에 모두 대상에게 투여된다. 전술한 방법 중 어느 것의 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 X일에 대상에게 투여되고, 부가적인 치료적 처치는 X일보다 12 내지 72시간 전에, X일보다 12 내지 72시간 후에, 또는 X일보다 12 내지 72시간 전과 후에 모두 대상에게 투여된다. 전술한 방법 중 어느 것의 특정 실시형태에서, 세포 조성물은 X일에 대상에게 투여되고, 부가적인 치료적 처치는 X일보다 12 내지 72시간 전에, X일보다 12 내지 72시간 후에, 또는 X일보다 12 내지 72시간 전과 후에 모두 대상에게 실시되며, 그 후 Y일에 세포 조성물을 대상에게 추가로 투여하고, 경우에 따라, Y일보다 12 내지 72시간 전에, Y일보다 12 내지 72시간 후에, 또는 Y일보다 12 내지 72시간 전과 후에 모두 부가적인 치료적 처치를 대상에게 실시한다.
전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 세포 조성물의 CAR은 치료되는 암에 특이적이다. 전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 세포 조성물의 생존 인자는 치료적 처치/부가적인 치료적 처치에 대한 내성을 부여한다.
본 발명의 세포 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 투여될 수 있다. 전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 정맥내로 투여된다. 전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 두개내로 투여된다. 전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 동맥내로 투여된다. 전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 종양상(tumor bed) 내로 투여된다. 전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 종양 부근에 또는 종양에 인접하게 투여된다. 전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 세포 조성물은 전술한 것의 조합으로 투여된다.
전술한 방법 중 어느 것의 한 측면에서, 부가적인 치료적 처치(예를 들어 TMZ 화학요법)는 하기 이익 중 적어도 하나를 제공한다: 스트레스 유도성 항원의 유도를 통한 세포 조성물의 유효성 증가, 세포 조성물의 항상적 재구성 증가, 생체내 증식의 증가, 및 세포 조성물의 지속성 증가(전술한 것은 부가적인 치료적 처치가 생략될 때의 유사한 치료와 비교한 것임).
특정 실시형태에서, 암은 세포가 내성을 나타내도록 조작된 부가적인 치료적 처치에 민감하다. 암 세포가 민감성을 나타낼 수 있는 그러한 부가적인 치료적 처치로는 항암제, 대사 길항제, DNA 탈메틸화제, 식물 유래의 항종양제, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 화학요법제, 알킬화제, 대사길항물질, 항암 항생제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 분화 유도제, 호르몬 치료제 및 전술한 것의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 다양한 특정 작용제가 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 부가적인 치료적 처치에 이용될 수 있다. 대표적인 알킬화제로는 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드 및 멜팔란을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 대사 길항제로는 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이들의 유도체를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 DNA 탈메틸화제(대사길항물질로도 알려짐)로는 아자시티딘을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 화학요법제로는 치환된 뉴클레오티드 및 치환된 뉴클레오시드를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 항종양 항생제로는 미토마이신, 아드리아마이신 및 독소루비신을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 식물 유래의 항종양제로는 빈크리스틴, 빈데신, TAXOL®, 파클리탁셀, 아브락산; 시스플라틴; 카보플라틴; 에토포사이드 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 항암제로는 트리메토트렉세이트(TMTX), 테모졸로마이드(TMZ), 랄티트렉세드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR), 6-벤지구아니딘(6-BG), 니트로소우레아[예를 들어, 비스-클로로니트로소우레아(BCNU; 카무스틴), 로무스틴(CCNU) +/- 프로카바진 및 빈크리스틴(PCV 레짐), 독소루비신, 포테무스틴, 사이타라빈, 캄토테신 및 전술한 것 중 임의의 것의 치료적 유도체를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 암 세포가 민감성을 나타낼 수 있는 부가적인 치료적 처치는 TMZ, 독소루비신, 멜팔란, 니트로소우레아 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 암은 세포가 그에 대해 내성을 나타내도록 조작된 부가적인 치료적 처치에 대해 내성이다. 그러한 실시형태에서, 부가적인 치료적 처치는 상기에 기재한 이익 중 하나 이상을 제공한다. 일 실시형태에서, 부가적인 치료적 처치는 NKG2D 수용체에 대한 리간드인 스트레스 유도성 항원의 발현을 증가시킨다. 상향 조절되는 특정 스트레스 유도성 항원으로는 ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A 및 MIC-B를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
특정 실시형태에서, 암은 뇌암, 유방암, 전립선암, 폐암, 결장암, 상피암, 두경부암, 피부암, 비뇨생식관암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 소장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 식도암, 침샘암, 갑상선암, 및 혈액 악성종양, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 골수형성이상 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 암은 뇌암이다. 특정 실시형태에서, 암은 송과체 종양, 뇌하수체 종양, PNET, 신경초종, 림프종, 수아세포종, 뇌수막종, 전이성 뇌암, 신경섬유종, 신경원성 및 신경원-신경교 혼합 종양, 핍지성상세포종, 희소돌기신경교종, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양(ATRT), 연골육종, 맥락얼기 종양, 두개인두종, 상의세포종, 생식 세포 종양, 신경아세포종, 교아세포종(GBM) 및 신경교종이다. 특정 실시형태에서, 암은 교아세포종이다. 특정 실시형태에서, 암은 신경아세포종이다.
특정 실시형태에서, 종양 항원은 당업계에 공지된 임의의 종양 항원이다. 특정 실시형태에서, 종양 항원은 하기 특성 중 하나 이상이 존재하도록 선택된다: 항원이 가능한 한 많은 단계의 암에서 발현될 것, 항원이 종양의 표면 상에서 발현될 것, 항원이 종양 세포의 생존력에 중요할 것, 및 항원이 비종양 조직 상에서 발현되지 않거나 오프 타겟 효과가 임상적으로 허용될 수 있을 수준으로 발현될 것. 특정 실시형태에서, 종양 항원은 EphA2, B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD22, CD19, CD20, ROR1, 카파쇄 또는 경쇄, 암 배아성 항원, 알파 태아 단백질, CA-125, 글리피칸-3, 상피성 종양 항원, 흑색종 관련 항원, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, PAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 폴레이트 수용체 α, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2, ERBB2, HER3, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, 5T4, 8H9, GD2, CD123, CD23, CD33, CD30, CD38, CD56, c-Met, fap, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11Rα, IL-13Rα, CSPG4, 루이스-Y, MCSP, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, PRAME, PSCA, PSCl, PSMA, EGFR, Sp17, SURVIVIN, TAG72, TEM1, TEM8, EGFRvIII, 및 VEGFR2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 당업계에 공지된 임의의 신경교종 특이적 TAA이다. 특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 하기 특성 중 적어도 하나가 존재하도록 선택된다: 신경교종 특이적 TAA가 가능한 한 많은 단계의 암에서 발현될 것, 신경교종 특이적 TAA가 종양의 표면 상에서 발현될 것, 신경교종 특이적 TAA가 종양 세포의 생존력에 중요할 것, 및 신경교종 특이적 TAA가 비종양 조직 상에서 발현되지 않거나 오프 타겟 효과가 임상적으로 허용될 수 있을 수준으로 발현될 것. 특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 NKG2D 리간드, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A, MIC-B, GD2, EGFRvIII 및 IL13Rα로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 EGFRvIII이다. 특정 실시형태에서, 신경교종 특이적 TAA는 IL13Rα이다.
특정 실시형태에서, 신경아세포종 특이적 TAA는 당업계에 공지된 임의의 신경아세포종 특이적 TAA이다. 특정 실시형태에서, 신경아세포종 특이적 TAA는 하기 특성 중 적어도 하나가 존재하도록 선택된다: 신경아세포종 특이적 TAA가 가능한 한 많은 단계의 암에서 발현될 것, 신경아세포종 특이적 TAA가 종양의 표면 상에서 발현될 것, 신경아세포종 특이적 TAA가 종양 세포의 생존력에 중요할 것, 및 신경아세포종 특이적 TAA가 비종양 조직 상에서 발현되지 않거나 오프 타겟 효과가 임상적으로 허용될 수 있을 수준으로 발현될 것. 특정 실시형태에서, 신경아세포종 특이적 TAA는 NKG2D 리간드, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A, MIC-B, 및 GD2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 신경아세포종 특이적 TAA는 GD2이다.
DRI 유전 공학, 예를 들어 MGMT 유전자의 이용은, 본 발명의 세포 조성물이, 종양이 최대로 스트레스를 받을 가능성이 있는 시점에 화학요법제가 농후한 환경에서 기능을 할 수 있게 한다. 특정 실시형태에서, 종양에 대한 스트레스 효과는, γδ T 세포 상의 수용체, 예컨대 NKG2D 수용체에 의해 인식되는 스트레스 항원의 발현을 증가시킨다. 화학요법에 의해 스트레스 항원을 유도하고 조절 T 세포를 감소시키는 이중 효과는 각각의 레짐에 비해 종양 저감을 현저히 개선한다. 유전자 변형은 본 발명의 세포 조성물을 화학요법 레짐, 예를 들어 TMZ의 림프구 감소 효과로부터 보호하며, 본 발명의 세포 조성물이, 악성 세포가 화학요법에 의해 최대로 스트레스를 받은 시점에 비손상 T 세포 세포독성 기능과 함께 TAA를 통해 종양에 특이적으로 접근할 수 있게 한다. 본 발명의 세포 조성물의 사용(DRI-CAR T 세포 요법이라고 함)은 생존 기간을 유의적으로 연장시키고, 화학요법(예를 들어, TMZ) 치료 단독 또는 γδ T 세포 주입 단독에 비해 종양 부하를 감소시키며, 유의적인 불리한 전신적 또는 신경학적 영향 없이 그렇게 한다.
본 발명의 세포 조성물 및 방법의 논리적 근거는, (a) 인간 GBM 세포가 생체외에서 증식/활성화된 γδ T 세포에 의한 공격에 매우 취약하다는 것(1, 2); (b) 증식/활성화된 γδ T 세포의 두개내 국소 주사가 면역적격성 C56BL/6 마우스 모델에서 GBM 이종이식편(3) 및 GL261 유래의 종양의 진행을 늦춤으로써 종양 보유 마우스의 생존 기간을 연장시킨다는 것; 및 (c) 인간 SNB-19 및 U373 GBM 세포주의 TMZ 내성 클론이 TMZ 또는 γδ T 세포에 의한 것보다 TMZ 존재하에 MGMT 변형 γδ T 세포에 의해 유의적으로 더 큰 효능으로 사멸된다는 것(4); 및 가장 중요하게는, (d) 일차 인간 GBM 이종이식편의 비변형 또는 TMZ 내성 클론을 갖는 마우스를, 어느 하나의 치료 단독에 비해 유전자 변형 γδ T 세포의 두개내 주사로 치료할 때 개선된 생존 기간을 나타낸다는 것을 입증하는 이전의 연구 결과에 기초한 것이다. 따라서, 부가적인 치료적 처치(예를 들어, TMZ)에 대한 내성을 위해 변형된 γδ T 세포를 포함하는 본 발명의 세포 조성물은 어느 하나의 개별 치료와 비교할 때 생존 기간을 현저히 연장시키고 종양 부하를 현저히 감소시킬 것으로 예상되며, 유의적인 불리한 전신적 또는 신경학적 영향을 유발하지 않고 그렇게 한다.
최근의 여러 연구는, 두개외 고형 신생물에 대한 화학요법과 면역요법의 전략적 타이밍이, 화학요법에 의해 유발된, 종양 세포 상의 스트레스 관련 항원의 발현(8-10) 및 조절 T 세포의 고갈에 대한 선천적 반응에 영향을 준다는 것을 입증하였다. 스트레스 항원 유도와 조절 T 세포의 감소라는 이중 효과는 어느 하나의 개별 레짐에 비해 종양 저감을 현저히 개선시킬 수 있다(11-17). GBM을 포함하나 이들에 한정되지 않는 암에 대한 이러한 전략의 성공적인 이행은, 종양 관련 항원의 적응적 인식(18, 19), 신경교종 세포 MHC 클래스 I 발현(20, 21), 또는 림포카인 활성화 킬러(LAK) 세포 요법(22-26)에 의존한 전통적인 접근법으로부터 크게 벗어날 것이다.
본 출원인들은, 이전에, 종양에 의해 발현된 스트레스 유도성 항원(즉, NKG2D 리간드)을 통해 고등급 신경교종을 확실히 타겟으로 하는 증식/활성화된 γδ T 세포의 제조를 위한 견실한 시스템을 개발하였다(3, 27, 28). 시험관내 세포독성과 치료 조건을 재현하기 위해 설계된 특정 생체내 모델에서의 생존율 개선/진행까지의 시간 증가가 모두 입증되었다(1, 2). 본 출원인들은 TMZ가 신경교종 세포 표면 상의 NKG2D 리간드의 발현을 일시적으로 상향 조절하고, 종양이 γδ T 세포에 의한 인식에 더 영향을 받기 쉽게 하며(4, 8), TMZ 내성 신경교종 세포주의 사멸이, 치료 농도의 TMZ 존재하에 MGMT 유전자 변형 γδ T 세포에 의해 증가한다는 것을 보였다. 본 발명의 세포 조성물 및 방법을 이용함으로써, 세포 면역요법과 화학요법의 타이밍을 그 둘의 효과가 최대가 되도록 조정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기에 기재된 신규한 세포 조성물뿐만 아니라 신규한 교아세포종 억제 치료 전략을 제공하여, 종래에 알려지지 않았던, 고등급 신경교종의 치료를 위한 새로운 길을 제공한다.
본 발명의 세포 조성물은 수술에 의해 삽입한 카테터(예를 들어, 뇌실천자술 카테터)를 통해 종양상에 직접 투여하는 것이 가능하지만, 절재술과 TMZ 투여량 증대 사이의 시간 간격이 최대 8주에 이를 수 있어서, 환자를 잠재적 감염 위험에 노출시키거나 세포 치료제 투여 시간 가까이에 추가적인 카테터 설치 시술에 노출시킬 수 있다. 상기 세포 조성물에 도입된 CAR은, 다양한 투여 방법에 의해 환자에게 투여될 때 종양 내의 DRI-CAR T 세포가 농축되도록 종양 관련 항원(예를 들어, 신경교종 특이적 종양 관련 항원)을 타겟으로 하도록 설계되어, 다양한 투여 방법이 이용될 수 있도록 한다. 예를 들어, 세포 조성물이 정맥내 경로 또는 동맥내 경로에 의해 환자에게 투여될 경우, 상기 세포 조성물에 도입된 CAR은 종양상으로의 DRI-CAR T 세포의 침윤을 증가시키는 데 도움이 되고, 종양상에서의 DRI-CAR T 세포의 농도를 증가시킨다. 마찬가지로, 다른 수단에 의해(예를 들어, 리크함(Rickham) 카테터 또는 유사한 장치를 통해 종양상으로 직접 또는 심실내 투여로) 투여될 경우, 상기 세포 조성물에 도입된 CAR은 동일한 결과를 얻을 수 있게 한다. 활성화 및 세포독성은 CAR을 통해 및/또는 γδ T 세포에 의한 NKG2D 리간드의 인식에 의해 매개될 수 있으며, 이것은 CAR을 통해 T 세포를 활성화시키기 위한 충분한 농도의 TAA를 발현하지 않는 불균질 종양에 있어서 특히 중요한 전략이다. 중요한 것은, 이 요법이, 종양 세포가 크게 스트레스를 받을 때, 조절 T 세포가 고갈되고, 다른 종양 관련 면역 방어가 손상되고, 혈관상(vascular bed)이 더 투과성이 되었을 때, 고용량 화학요법 중에 일어난다는 것이다. TMZ 매개 림프구 감소 또한 DRI-CAR T 세포의 항상적 재구성, 생체내 증식 및 지속성을 촉진한다.
선행 기술의 면역치료 방법 및 본 발명의 개선된 방법의 개요가 각각 도 8a 및 8b에 도시된다. 선행 기술의 방법에서는, 면역적격성 세포가 사이토카인 치료 및 다른 방법에 의해 생성되었다. 따라서 면역적격성 세포는 종양 사멸 활성을 나타내었다. 부가적인 치료, 예를 들어 화학요법 레짐이 실시되었을 때, 면역적격성 세포는 고갈되었고, 치료 세포의 사멸로 인해 치료 유효성이 제한되었다. 본 발명의 방법은, 종양 특이적 CAR 및 생존 인자(DRI-CAR)를 포함하는, γδ T 세포를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 세포 조성물을 제공함으로써 상기 한계를 극복한다. 부가적인 치료적 처치, 예컨대 화학요법 레짐과 병용될 경우, DRI-CAR 세포는,치료 환경에서 살아 남으면서, 존재하는 CAR에 의해, 또한 스트레스 유도성 리간드의 인식을 통해 종양 세포를 공격할 수 있는 능력을 유지한다. 게다가, 조절 T 세포의 감소는 추가적인 치료적 이점을 제공한다. 더 나아가, 화학요법 레짐을 통한 림프구 저감은 DRI-CAR T 세포의 항상적 재구성, 생체내 증식 및 지속성을 촉진하여 치료 결과를 더욱 개선한다.
실시예
실시예 1 - 유전자 조작 γδ T 세포의 개발 및 시험관내 테스트
최적의 이식 유전자 발현을 제공하는 벡터 입체배치를 결정하고 유전자 조작 γδ T 세포를 제조하기 위한 최적의 형질도입 타이밍을 결정하기 위해, CAR 및 약물 내성을 부여하기 위한 생존 인자에 대한 cDNA 서열을 동시 발현하는 렌티바이러스 벡터를 제작한다. 최적 전달 및 지속성을 정량하기 위해, EGFRvIII 또는 IL13rα(DRI-CAR)을 보유하는 111[In] 표지 γδ T 세포를 이용한 조작된 γδ T 세포 면역요법을, 면역결핍 마우스에서 TMZ 화학요법을 실시하는 동안의 환자 유래의 신경교종 이종세포주(xenoline)에 대해, 두개내 투여 경로 대 정맥내 투여 경로의 효력, 지속성 및 효능을 비교함으로써 평가한다.
신경교종 세포를 인식하고 교아세포종(GBM)을 타겟으로 한다고 알려진 IL13Rα 및 EGFRvIII CAR을 코딩하는 벡터를 제작한다. 또한, TMZ에 대한 내성을 부여하는 MGMT를 코딩하는 cDNA를 상기 CAR과 동시 발현시킨다. 유전자 전달의 최적 분석과 유전적으로 변형된 세포의 추적을 위한 플로우(flow) 또는 이미징 마커를 코딩하는 대조군 벡터도 제작한다. EGFRvIII CAR을 코딩하는 예시적인 구성체가 도 1에 도시되어 있다.
본 발명자들은, 선행 연구를 통해, 단순한 SIV 코딩 p140K-MGMT 벡터의 삽입을 위한 최적의 형질도입 시기가 졸레드로네이트(Zoledronate)/IL2에 기초한 γδ T 세포 증식 배양 개시 후 3일 내지 7일이라는 것을 입증하였다. 이러한 조건 하에, 400 μM를 초과하는 농도의 TMZ에 대한 내성을 부여하기에 충분한 MGMT 카피수는 5만큼 낮은 MOI에서 생성되었다. 이러한 조건들은, 형질도입 시기 및 2 내지 7일에 이르는 MOI 및 1 내지 25의 MOI의 매트릭스를 이용하여 DRI-CAR 형질도입에 대해 검증되고 최적화된다.
실험 디자인
그룹 n 종양 치료(도 2 참조)
1 20 유 치료 안함
2 20 유 TMZ 60 mg/kg IP
3 20 유 IV 유전자 변형 γδ T 세포, (1.5 x 108/kg), TMZ 60 mg/kg IP
4 20 유 IC 유전자 변형 γδ T 세포, (1.5 x 106), TMZ 60 mg/kg IP
두개내 신경교종 이종이식편은, 일차 GBM으로부터의 GBM-X12(전형적), GBM-X22(간엽), GBM-X1066(신경), 및 GBM-XD456(전신경) 외식편의 모체 클론("P"로 표시함) 및 TMZ 내성 클론("T"로 표시함)으로 구성된다. 마우스에게, Beck(5)이 개발한 방법에 의해 111[In] 표지 DRI-CAR γδ T 세포를 이용하여 1.5 x 106개 세포/kg(두개내) 또는 5 x　108개 세포/kg(정맥내) 주사하고, 다양한 치료를 표 1 및 도 2에 나타낸 실험 디자인(IC = 두개내; IP = 복강내; IV = 정맥내)을 기초로 평가한다. 도 3에서 유방 종양에 대해 모델링된 바와 같이, 주사한 후 최소 3일 동안 24시간 간격으로 X-SPECT으로 영상화 연구를 수행한다. 또한, 5　x　108개 세포/kg 111[In] 표지 γδ T 세포/kg을 주사한 지 24시간 후 개별적으로 생체분포 연구를 행하고, 주요 장기 및 종양을 계측하여 그 결과를 % 111[In] 주사량(ID)/g으로 나타낸다. γδ T 세포의 종양 국재화는, 그 영상과 관련된 컬러 스케일로부터 도출되고 종양 1 그램당 확인된 주사된 방사선량의 퍼센트로서 나타낸(관행에 의해) 종양 내의 누적 방사능에 의해 정량된다. 두개내 주사뿐만 아니라 정맥내 주사도 유효할 것으로 예상된다.
각각의 DRI-CAR 생성물의 효력을 4종의 선택된 이종세포주에 대해 시험관내 세포독성 어세이로 측정한다. 효능은 표 1 및 도 2에 도시된 실험 디자인에 기초하여 처리된 종양 보유 마우스의 생존율을 미처리 대조군과 비교함으로써 평가한다. 종양 조직병리, 침습, 림프구 침윤 및 림프구 면역표현형을 비롯한 조직학적 및 기능적 평가를 위해 종양 및 정상 조직을 적출한다. 이동 및 분포 연구에 대한 비모수적 t-검정 및/또는 ANOVA와 생존 데이터의 비모수적 로그 순위 분석을 이용하여 통계 분석을 실시한다. 처리 그룹과 대조군 그룹 간의 차이를 0.15라고 어림잡을 때, 그룹당 20개의 레플리케이트는 p ≤ 0.05에서의 차이를 검출하기 위해 80%의 파워를 제공한다.
실시예 2 -　치료(예를 들어, 사전 방사선 요법, TMZ) 중에 만연해 있을 것 같은 조건 하에서의 DRI-CAR 요법의 안전성 평가
본 발명의 세포 조성물 및 방법에 대해, 배양된 인간 성상세포에 대한 DRI-CAR 시험관내 독성 어세이를 이용하여 국소적 오프 타겟 세포독성에 대한 잠재성을 테스트한다. 또한, 자살 유전자를 발현하는 γδ T 세포가 유익하다고 간주되는 안전성의 이점을 제공하는지 판단한다. 벡터 통합 위치 분석도 수행한다. Vγ9Vδ2 T 세포에 대한 견줄만한 동물 모델이 없기 때문에 시험관내 독성학적 분석을 수행한다. DRI-CAR T 세포(20회 반복)를, 250 cGy의 이온화 방사선 또는 200 μM TMZ에서의 4시간의 인큐베이션에 노출시킨 배양된 인간 성상세포에 대해 테스트하고, NKG2D 리간드 발현 및 DRI-CAR 세포 매개 세포독성의 평가에 의해 미처리 성상세포와 비교한다. 초기 연구에 따르면, MIC-A 및 ULBP2가 약간 상향 조절되어 있고, 배양된 성상세포에 대한 유의적인 γδ T 세포 세포독성이 없다.
단계적인 염증 반응 또는 오프 타겟 세포독성으로부터 보호하기 위해, 자살 유전자를 CAR 유전자 생성물로의 도입에 대해 평가한다. γ-레트로바이러스, SFG.iCaspase9.2A.DeltaCD19는 선택 마커로서의 역할을 하는 절단형 인간 CD19에 2A 유사 서열에 의해 연결된 iC9로 이루어진다. 카스파제 9 자살 유전자의 AP1903 유도성 활성화는 인간 FK506 결합 단백질(FKBP) 유래의 약물 결합 도메인에 융합된 키메라 단백질(iC9)을 발현함으로써 이루어진다. iC9는 AP1903에 노출될 때까지 휴지 상태로 있으며, AP1903은 FKBP 도메인을 가교결합시켜, iCasp9 신호전달을 개시시키고, 유전자 변형 세포의 아폽토시스를 유도한다. 유전자와 AP1903은 Bellicum Pharmaceuticals(미국 텍사스주 휴스턴 소재)에 의해 공급되며, 이 회사는 기능 연구에도 도움을 주었다. 이 구성체의 사용은 개시되어 있고(6, 7), 전신 및 두개내 DRI-CAT T 세포에서의 빠른 아폽토시스를 유도하기 위해 투여량을 최적화하기 위해 NSG 마우스에서의 기능 연구를 수행하는 데 이용된다.
렌티바이러스 위치 통합 분석은, Lenti-XTM System(Clontech)을 사용하고 GenomeWalker 기술을 이용하여 본 발명자들의 연구실에서 초기에 행한다.
실시예 3 -　 인간의 치료를 위한 DRI-CAR의 사용에 대한 세포 제조 및 출하 기준의 표준화
임상 시험으로의 이행을 가능하게 하는 세포독성(효력 및 독성) 어세이, 유세포 분석적 이식 조성물 분석, 및 cGMP 세포 제조를 위한 감염병 검사. 세포 및 유전자 치료 제품에 대해서는, 무균성(sterility), 순도(purity), 동일성(identity) 및 효력(역가)(potency)에 대해 21 CFR 211.165 및 610에서 FDA가 정한 출하 기준이 요구된다. FDA는 무균 시험을 위한 절차를 의무화하고 있다. 동일성 시험은 임상 HLA 타이핑에 의해 수행된다. 세포 제품의 순도/조성 및 역가 검사는 본 발명자들의 실험에서의 표준화를 필요로 한다. FDA 규정 21 CFR 600.3은, 제품이 표시된 대로 기능을 하는 특정 능력이 적절한 실험실 테스트에 의해 정의될 것을 요구하고, 21 CFR 610.10은, 효력 평가가 그 제품에 대해 특이적으로 고안된 시험관내 및/또는 생체내 검사로 구성되어야 한다고 명시하고 있다. 또한, FDA는 세포독성을 타겟 표현형과 서로 관련지을 것을 권고하며, 따라서, 실험실 개발 테스트에 대한 임상 실험실 개선법 1988(Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (CLIA) for Laboratory Developed Tests)에 정의된 바와 같은 임상 요건에 따라 DRI-CAR 그래프트 기능을 평가하기 위한 표준으로서 일관된 계대수의 소정의 타겟 신경교종 세포주를 이용하여 세포독성을 검증한다. 최적의 기능은 잠정적으로 20:1의 E:T(이펙터:타겟) 비에서 50% 사멸로서 정의된다. 배양된 성상세포는 음성 타겟으로서의 역할을 하고, K562 적백혈병 세포는 양성 타겟으로의 역할을 한다. % 총 T 세포(CD3), % γδ T 세포, % αβ T 세포(CD3+CD4+γδ- 및 %CD3+CD8+γδ-), % NK 세포(CD16/56), % B 세포(CD19) 및 % 단핵구(CD14)를 유세포 분석으로 측정하여 최종 순도 및 조성을 평가한다. 목표 출하 기준은 ≥ 60% γδ T 세포, ≤ 5% αβ T 세포, 및 ≤ 25% NK 세포이다. 통계 분석은 순도/조성 분석으로 개개의 세포 표현형에 대해, 그리고 최소 20회의 어세이의 기능 분석으로 각각의 E:T 비에 대해 각각의 사멸률(%)에 대해 평균, AD 및 95% CI를 확립하는 것으로 이루어진다. 그룹 간의 개개의 E:T 비에 있어서의 차이를 비교하기 위해 ANOVA를 이용한다. 시험관내 세포독성 기능과 동물 모델에서의 이동 연구 및 생존 결과를 포함시킨다.
실시예 4 - 0상 임상 시험에서 일차 교아세포종을 갖는 3명의 환자에서 절제술 후 세포 치료로서의 CAR-DRI 111 [In] 표지 γδ T 세포의 안전성, 독성, 트래픽킹 및 이동의 평가
임상 조건 하에서의 TMZ 내성 및 미시적 잔존 질환의 잠재적 부위로의 이동을 확인하기 위해 111[In]으로 표지된 DRI-CAR T 세포를 이용하여 소수의 초기 실험을 수행한다. 이 연구는, 독성이 주요 관심사의 종점인 0상 임상 시험으로서 수행된다. 적격 환자를 순차적으로 참여시켜 1회 주입을 실시한다. 부작용의 빈도는 빈도와 백분율을 이용하여 신체 시스템, 등급 및 인과 관계로 요약한다. 상기 정보와 함께 증상 개시 연구일 및 부작용의 기간을 포함하는 개개의 대상자 리스트를 제공한다. 통계 비교는 행하지 않는다. 2차 목적은, 임상 I상 및 II상의 설계와 가설 생성을 위한, 진행까지 걸리는 시간, 조기 및 후기의 전신 조혈모세포 키메리즘(hematopoietic chimerism)의 존재, 전신 면역 기능 및 전체 생존율의 모니터링을 포함한다. 조직학적으로 일차 GBM이 확인되어 절제술을 받고 있는 18세 이상의 성인 남자와 임신하지 않은 여성으로 이루어지는 최대 3명의 평가 가능한 환자를 참여시킨다. 환자들은 DRI-CAR 제조를 위해 절제술 후 RT(방사선 치료) + TMZ 치료 전에 1회의 백혈구분반술을 받는다. RT+TMZ 병용 투여 종반에 나머지 기간에 이어 고용량 TMZ 치료 동안 1 x 106/kg DRI-CAR T 세포의 단일 용량을 투여한다. 세포의 이동을 추적하기 위해 세포 제품의 일부를 111[In]으로 표지한다. 주입 후 12시간, 24시간 및 48시간에 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT)을 행한다. 1명의 숙련된 핵의학과 의사가감쇠(attenuation)를 보정한 111[In]-옥신으로 표지된 백혈구 평면 및 SPECT 영상을 모두 검토한다. 다음 환자를 참여시키기 전에, 개개의 환자들에 대해 적어도 30일 동안 독성을 추적한다. 부작용 등급화에 대한 암 치료 평가 프로그램 일반 독성 기준(Cancer Therapy Evaluation Program Common Toxicity Criteria)을 이용하여, 간, 폐, 및 심장에 관한 임의의 3급 또는 4급 독성, 또는 DRI-CAR T 세포와 관련되어 있을 가능성 또는 확률이 있다고 간주될 경우, 용량 제한 독성(DLT)으로서의 임의의 다른 4급 독성을 정의한다. 관련되어 있을 가능성 또는 확률이 있을 경우 DLT로 간주되는 중요한 다른 사건은 사망, 졸중, 수술을 요하는 혈종, 치료 불가능한 신경학적 악화, 무반응성 전신 감염, 및 이식편 대 숙주 질환을 포함한다. 염증 또는 백질뇌증 등의 추정상의 오프 타겟 독성 또는 두개내 사건은, iC9 자살 유전자를 통한 DRI-CAR T 세포의 아폽토시스를 활성화하기 위해 AP1903 투여를 유도한다.
실시예 5 - 스트레스 유도성 항원의 발현
신경교종 이종이식편에서의 선택된 스트레스 유도성 리간드(NKG2DL)는 TMZ에 노출되면 상향 조절된다(도 4a). 도 4는, X12T 및 X22T 신경교종 이종이식편에서의 NKG2DL MIC-A, MIC-B, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3 및 ULBP-4의 발현을 보여준다. X12T 신경교종 이종이식편은, 400 μM의 TMZ로 4시간 동안 처리한 후 MIC-A, ULBP-1 및 ULBP-4의 발현을 최소한의 상향 조절로 나타낸다. X22T 신경교종 이종이식편은, 400 μM의 TMZ로 4시간 동안 처리한 후 MIC-A, MIC-B, ULBP-1 및 ULBP-4의 발현을 보이며, MIC-A 및 ULBP-4의 발현은 상향 조절되어 있다. 생체외 증식/활성화 γδ T 세포는 도 4b에 도시된 바와 같이 X12T 및 X22T 신경교종 이종이식편 유래의 세포를 사멸시키는 데 효과적이었다. TMZ 내성을 위한 생존 인자를 발현하도록 조작된 γδ T 세포를 X12T 및 X22T 신경교종 이종이식편 유래의 세포와 함께 이펙터:타겟(E:T) 비를 증가시키면서 배양하였고, 용해율(%)(유세포 분석에 의해 측정된 생세포 대 사세포의 비로 결정됨)을 E:T 비의 함수로서 나타내었다. E:T 비가 10:1보다 클 때, γδ T 세포는 X12T 및 X22T 신경교종 이종이식편 유래의 세포에 대해 세포독성이었다. γδ T 세포는 E:T 비가 20:1일 때 배양된 인간 성상세포에 대해 독성의 징후를 나타내지 않았다.
실시예 6 - γδ T 세포 치료의 유효성은 스트레스 유도성 항원의 발현에 의해 증가한다
종양 세포에서의 NKG2DL의 발현은 γδ T 세포 치료의 전체 효력을 증가시킨다. 도 5a 및 5b는, 각각, 다양한 치료에 반응하는, X12P 및 X12T(TMZ 내성) 신경교종 보유 마우스의 생존율을 도시한다. 도 5a는, TMZ 단독(TMZ), TMZ 내성을 위한 생존 인자(DRI)를 발현하도록 변형된 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 조성물과 TMZ의 조합으로 치료한 X12P 신경교종 보유 마우스의 생존율, 비변형 γδ T 세포 및 NK 세포(CT)를 투여받은 마우스의 생존율, 및 치료를 받지 않은 대조군 마우스의 생존율을 도시한다. TMZ 치료 레짐(청색) 및 DRI 치료 레짐(적색)은, CT 치료 레짐(녹색) 및 비치료 마우스(흑색)에 비해 X12P 신경교종 보유 마우스의 생존율을 증가시켰다(p < 0.001). DRI 치료 레짐은 TMZ 치료 레짐에 비해 중앙 생존 기간을 57 내지 75일 연장시켰다. 도 5b는, 도 5a에 기재된 바와 같이 치료한 X12T 신경교종 보유 마우스의 생존율을 도시한다. DRI 치료 레짐(적색)은 비치료 마우스(흑색)에 비해 X12T 신경교종보유 마우스의 생존율을 증가시켰다(p = 0.0147). TMZ 치료 레짐은 예상대로 비치료 마우스에 비해 X12T 신경교종 보유 마우스의 생존율을 개선시키지 못했다. DRI 치료 레짐은 TMZ 치료 레짐에 비해 중앙 생존 기간을 22 내지 27일 연장시켰다. DRI 치료 레짐의 효과는, (도 2에 도시된 바와 같이) 주당 1회 투여로부터 주당 2회(데이터 도시되지 않음)로 γδ T 세포 및 NK 세포의 투여를 증강시킴으로써 증가시킬 수 있었다. 이러한 변형된 투여에 있어서, DRI 치료 레짐은 비치료 마우스에 비해 X12T 신경교종 보유 마우스의 생존율을 증가시켰고(p = 0.0004), TMZ 치료 레짐에 비해 중앙 생존 기간을 22 내지 38일 연장시켰다.
실시예 7 - 스트레스 유도성 항원은 정상 뇌 조직에서 상향 조절되지 않는다
방사선 조사된 전이성 뇌 종양 조직 및 인접한 정상 뇌 조직을 관찰한 결과, 스트레스 유도성 항원(NKG2D 리간드)이 정상(즉, 비종양) 뇌 주변 조직에서 실질적으로 발현되지 않으면서 종양 조직에서 발현된 것으로 나타난다(도 6). 도 6은, 방사선 조사된 전이성 뇌 종양 조직 및 인접한 정상 뇌 조직으로부터의 스트레스 유도성 항원 발현을 도시한다. 전이성 뇌 종양 조직은, ULBP-1의 강한 발현과 ULBP-2 및 ULBP-3의 약한 발현을 나타내었다. 인접한 정상 뇌 조직에서는 스트레스 유도성 항원 발현이 관찰되지 않았다. 따라서, 본원에 기재된 세포 조성물에 의한 오프 타겟 효과 및 그로 인한 정상 뇌 조직에의 손상은 있을 것 같지 않다.
실시예 8 - 스트레스 유도성 항원은 방사선 치료에 의해 상향 조절되지 않는다
유사하게, 스트레스 유도성 항원(NKG2D 리간드)은 방사선 조사된 마우스 뇌에서 상향 조절되지도 않고 가시적인 염증의 다른 징후도 없다(도 7). 도 7은, 17 Gy의 선량으로 160 kV X선빔을 전방-후방 및 후방-전방의 쌍으로 이용하여 방사선을 조사한 WT C56BL/6 마우스(패널 b, d)와 방사선을 투여받지 않은 대조군 마우스(패널 a, c)의 전체 뇌를 도시한다. 70일 째 마우스를 희생시키고 뇌를 적출하였다. 패널 a 및 b는 대조군 마우스와 방사선 조사 마우스 간의 스트레스 항원 MULT-1 염색을 비교한다. 패널 c 및 d는 대조군 마우스의 방사선 조사 마우스 간의 항-CD3에 의한 염색을 비교한다. 방사선 조사된 마우스는 MULT-1 및 항-CD3 둘 다에 대해 음성이었고, 이것은 스트레스 유도성 항원이 정상 뇌 조직에서 방사선 치료에 반응하여 상향 조절되지 않았으며, 림프구 침윤이 정상 뇌 조직에서 방사선 치료에 반응하여 유도되지 않았음을 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003

Claims (51)

  1. 면역요법 치료 및 부가적인 치료적 처치를 이용하여, 암을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서,
    a. γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계로서, 상기 γδ T 세포는, 종양 항원에 지향된 키메라 항원 수용체(CAR), 스트레스 유도성 항원(stress-induced antigen)에 대한 수용체, 및 CAR을 발현하는 상기 면역계 세포가 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 생존 인자를 적어도 발현하는 것인 단계; 및
    b. 상기 대상에게 부가적인 치료적 처치를 실시하는 단계로서, 상기 부가적인 치료적 처치는 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여하기 전에, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여한 후, 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 투여함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상에게 상기 세포 조성물을 1회 이상 추가 투여하는 것을 추가로 포함하는 치료 방법.
  3. 제1항에 있어서, 부가적인 치료적 처치를, 경우에 따라, 상기 대상에게 상기 세포 조성물의 1회 이상의 추가 투여를 실시하기 전에, 상기 대상에게 상기 세포 조성물의 1회 이상의 추가 투여를 실시한 후, 상기 대상에게 상기 세포 조성물의 1회 이상의 추가 투여를 실시함과 동시에, 또는 전술한 것의 임의의 조합으로 실시하는 것인 치료 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포 조성물을 X일에 상기 대상에게 투여하고, 상기 부가적인 치료적 처치를 상기 대상에게 X일보다 12 내지 72시간 전에, X일보다 12 내지 72시간 후에, 또는 X일보다 12 내지 72시간 전과 후에 모두 실시하는 것인 치료 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포 조성물을 X일에 상기 대상에게 투여하고, 상기 부가적인 치료적 처치를 상기 대상에게 X일보다 12 내지 72시간 전에, X일보다 12 내지 72시간 후에, 또는 X일보다 12 내지 72시간 전과 후에 모두 실시하고, 그 후 Y일에 상기 세포 조성물을 상기 대상에게 추가로 투여하며, 경우에 따라 상기 부가적인 치료적 처치를 상기 대상에게 Y일보다 12 내지 72시간 전에, Y일보다 12 내지 72시간 후에, 또는 Y일보다 12 내지 72시간 전과 후에 모두 실시하는 것인 치료 방법.
  6. 제1항에 있어서, 암이 뇌암, 유방암, 전립선암, 폐암, 결장암, 상피암, 두경부암, 피부암, 비뇨생식관암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 소장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 식도암, 침샘암, 갑상선암, 및 혈액 악성종양 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 골수형성이상 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  7. 제1항에 있어서, 암이 송과체 종양, 뇌하수체 종양, PNET, 신경초종, 림프종, 수아세포종, 뇌수막종, 전이성 뇌암, 신경섬유종, 신경원성 및 신경원-신경교 혼합 종양, 핍지성상세포종, 희소돌기신경교종, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양(ATRT), 연골육종, 맥락얼기 종양, 두개인두종, 상의세포종, 생식 세포 종양, 신경아세포종, 교아세포종 및 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  8. 제1항에 있어서, 암이 부가적인 치료적 처치에 민감한 것인 치료 방법.
  9. 제1항에 있어서, 암이 부가적인 치료적 처치에 내성인 것인 치료 방법.
  10. 제1항에 있어서, 종양 항원이 EphA2, B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD22, CD19, CD20, ROR1, 카파쇄 또는 경쇄, 암 배아성 항원, 알파 태아 단백질, CA-125, 글리피칸(Glypican)-3, 상피성 종양 항원, 흑색종 관련 항원, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, PAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 폴레이트 수용체 α, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2, ERBB2, HER3, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, 5T4, 8H9, GD2, CD123, CD23, CD33, CD30, CD38, CD56, c-Met, fap, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11Rα, IL-13Rα, CSPG4, 루이스(Lewis)-Y, MCSP, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, PRAME, PSCA, PSCl, PSMA, EGFR, Sp17, SURVIVIN, TAG72, TEM1, TEM8, EGFRvIII 및 VEGFR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  11. 제1항에 있어서, 암이 교아세포종이고, 종양 항원이 NKG2D 리간드, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A, MIC-B, EGFRvIII 및 IL13Rα로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  12. 제1항에 있어서, 암이 교아세포종이고, 종양 항원이 EGFRvIII 또는 IL13Rα인 치료 방법.
  13. 제1항에 있어서, 암이 신경아세포종이고, 종양 항원이 NKG2D 리간드, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A, MIC-B 및 GD2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  14. 제1항에 있어서, 암이 신경아세포종이고, 종양 항원이 GD2인 치료 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 세포 조성물이 γδ T 세포를 포함하고, αβ T 세포 및 NK 세포 중 하나 이상을 포함하는 것인 치료 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 세포 조성물이 γδ T 세포를 포함하고, 경우에 따라 αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 것인 치료 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 세포 조성물이 60% 이상의 γδ T 세포, 5% 이하의 αβ T 세포 및 25% 이하의 NK 세포를 포함하는 것인 치료 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체가 NKG2D 수용체인 치료 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 뉴클레오시드 유사체, 알킬화제, 대사길항물질, 항생제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 분화 유도제, 또는 호르몬 치료제를 사용한 치료이고, 상기 생존 인자가 상기 부가적인 치료적 처치에 대한 내성을 제공하는 것인 치료 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 다제 내성 단백질 1 또는 5' 뉴클레오티다제 II인 치료 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 알킬화제를 사용한 치료이고, 상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 테모졸로마이드인 치료 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 테모졸로마이드를 사용한 치료이고, 상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제인 치료 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 γδ T 세포가 종양 항원에 지향된 CAR을 발현하도록 조작된 것이고, 상기 생존 인자 및 상기 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체가 면역계 세포 상에 본래 존재하는 것인 치료 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 γδ T 세포가 종양 항원에 지향된 CAR, 상기 생존 인자 및 상기 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체를 발현하도록 조작된 것인 치료 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 γδ T 세포가 자살 유전자를 추가로 발현하는 것인 치료 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 하기 이익 중 하나 이상을 제공하는 것인 치료 방법:
    a. 스트레스 유도성 항원의 유도를 통한 세포 조성물의 유효성 증가;
    b. 세포 조성물의 항상적 재구성 증가;
    c. 세포 조성물의 생체내 증식 증가; 및
    d. 세포 조성물의 지속성 증가.
  27. 제1항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A 및 MIC-B로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트레스 유도성 항원의 발현을 증가시키는 것인 치료 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 γδ T 세포가 대상으로부터 입수한 것이고 경우에 따라 생체외에서 증식시킨 것인 치료 방법.
  29. γδ T 세포를 포함하는 세포 조성물로서, 상기 γδ T 세포는, 종양 항원에 지향된 키메라 항원 수용체(CAR), 및 상기 면역계 세포가 부가적인 치료적 처치에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 생존 인자를 적어도 발현하고, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체를 추가로 발현하는 것인 세포 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 암이 뇌암, 유방암, 전립선암, 폐암, 결장암, 상피암, 두경부암, 피부암, 비뇨생식관암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 소장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 식도암, 침샘암, 갑상선암, 및 혈액 악성종양 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 골수형성이상 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 암이 송과체 종양, 뇌하수체 종양, PNET, 신경초종, 림프종, 수아세포종, 뇌수막종, 전이성 뇌암, 신경섬유종, 신경원성 및 신경원-신경교 혼합 종양, 핍지성상세포종, 희소돌기신경교종, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양(ATRT), 연골육종, 맥락얼기 종양, 두개인두종, 상의세포종, 생식 세포 종양, 신경아세포종, 교아세포종 및 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 조성물.
  32. 제29항에 있어서, 암이 부가적인 치료적 처치에 민감한 것인 세포 조성물.
  33. 제29항에 있어서, 종양 항원이 EphA2, B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD22, CD19, CD20, ROR1, 카파쇄 또는 경쇄, 암 배아성 항원, 알파 태아 단백질, CA-125, 글리피칸-3, 상피성 종양 항원, 흑색종 관련 항원, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, PAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 폴레이트 수용체 α, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2, ERBB2, HER3, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp120, HIV-1 엔벨로프 당단백질 gp41, 5T4, 8H9, GD2, CD123, CD23, CD33, CD30, CD38, CD56, c-Met, fap, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11Rα, IL-13Rα, CSPG4, 루이스-Y, MCSP, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, PRAME, PSCA, PSCl, PSMA, EGFR, Sp17, SURVIVIN, TAG72, TEM1, TEM8, EGFRvIII 및 VEGFR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 조성물.
  34. 제29항에 있어서, 암이 교아세포종이고, 종양 항원이 NKG2D 리간드, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A, MIC-B, EGFRvIII 및 IL13Rα로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 조성물.
  35. 제29항에 있어서, 암이 교아세포종이고, 종양 항원이 EGFRvIII 또는 IL13Rα인 세포 조성물.
  36. 제29항에 있어서, 암이 신경아세포종이고, 종양 항원이 NKG2D 리간드, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A, MIC-B 및 GD2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 조성물.
  37. 제29항에 있어서, 암이 신경아세포종이고, 종양 항원이 GD2인 세포 조성물.
  38. 제29항에 있어서, γδ T 세포를 포함하고, αβ T 세포 및 NK 세포 중 하나 이상을 포함하는 세포 조성물.
  39. 제29항에 있어서, γδ T 세포를 포함하고, 경우에 따라 αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 세포 조성물.
  40. 제29항에 있어서, 60% 이상의 γδ T 세포, 5% 이하의 αβ T 세포 및 25% 이하의 NK 세포를 포함하는 세포 조성물.
  41. 제29항에 있어서, 상기 γδ T 세포가 CAR 및 생존 인자를 발현하도록 조작된 것이고, 경우에 따라, 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체를 추가로 발현하도록 조작된 것인 세포 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체가 NKG2D 수용체인 세포 조성물.
  43. 제29항에 있어서, 상기 γδ T 세포가 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체를 본래 발현하는 것인 세포 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 스트레스 유도성 항원에 대한 수용체가 NKG2D 수용체인 세포 조성물.
  45. 제29항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 뉴클레오시드 유사체, 알킬화제, 대사길항물질, 항생제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 분화 유도제, 또는 호르몬 치료제를 사용한 치료이고, 상기 생존 인자가 상기 부가적인 치료적 처치에 대한 내성을 제공하는 것인 세포 조성물.
  46. 제29항에 있어서, 상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 다제 내성 단백질 1 또는 5' 뉴클레오티다제 II인 세포 조성물.
  47. 제29항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 알킬화제를 사용한 치료이고, 상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제인 세포 조성물.
  48. 제29항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 테모졸로마이드를 사용한 치료이고, 상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제인 세포 조성물.
  49. 제29항에 있어서, 상기 γδ T 세포가 자살 유전자를 추가로 발현하도록 조작된 것인 세포 조성물.
  50. 제29항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 스트레스 유도성 항원의 발현을 증가시키는 것인 세포 조성물.
  51. 제29항에 있어서, 상기 부가적인 치료적 처치가 ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-5, ULBP-6, MIC-A 및 MIC-B로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트레스 유도성 항원의 발현을 증가시키는 것인 세포 조성물.
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