JP2021521818A

JP2021521818A - 有効な免疫療法のための抗原−サイトカイン複合体に用いた免疫エフェクター細胞及び分子アダプター

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Publication number: JP2021521818A
Application number: JP2020559370A
Authority: JP
Inventors: メテリツァ、レオニド、エス．; リウ、ピン; リウ、タオフォン; チンリン、チン
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2019-04-24
Publication date: 2021-08-30
Also published as: WO2019209991A1; AU2019261617A1; CA3098171A1; SG11202010570VA; EP3561053A1; KR20210005695A; EP3784775A1; US20210252056A1; CN112218944A

Abstract

【課題】免疫療法を提供する。
【解決手段】本開示の実施形態は、養子免疫療法としての特定の免疫エフェクター細胞及び／又は免疫エフェクター細胞が結合可能である可溶性タンパク質を用いた癌の処置に関連する方法及び組成物を包含する。一部の例では、この可溶性タンパク質は、養子免疫療法が向けられている腫瘍抗原の発現を欠く癌細胞の標的化を可能にする分子アダプターである。いくつかの実施形態では、この可溶性タンパク質は、養子免疫療法を改善するサイトカイン−サイトカイン受容体ペアとして外因的に提供される。
【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる、２０１８年４月２６日提出のＥＰ特許出願公開第１８１６９６００．６号明細書に対する優先権を主張する。
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学及び医学の分野に関する。

ＣＤ１９特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ１９）を発現するＴ細胞でのＢ細胞悪性腫瘍の免疫療法は高い完全寛解率を生み出してきたが、他の抗原を認識するＣＡＲ又は改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による固形腫瘍の免疫療法により恩恵を受けたのは僅かな患者に過ぎない（１、２）。ＣＡＲ１９及び／又はＣＤ１９抗原とのその相互作用がＢ細胞悪性腫瘍に対してＣＡＲＴ細胞療法の有効性に寄与するユニークな特性を有するか否かは未だ不明である。

ＣＡＲ及びＴＣＲリダイレクト免疫療法を含め、養子免疫療法に対する固形腫瘍の感受性に好ましくない影響を与える主要な既知の因子の中でも、とりわけ、腫瘍部位及び免疫抑制的な腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に対する治療用エフェクター細胞の局在化（３）が不十分であることが挙げられる。神経芽細胞腫（ＮＢ）は、ＣＤ１９を発現せず、高い免疫抑制ＴＭＥを有する典型的な固形腫瘍である。ＮＢ患者においてＣＡＲでリダイレクトされたＴ細胞を用いた初期臨床研究は、ＮＢ細胞において過剰発現されるＧＤ２ガングリオシドを標的としてきた（４、５）。ＮＢ患者におけるＣＡＲＧＤ２Ｔ細胞での免疫療法は耐容性良好であり、多くの客観的臨床応答を生み出したが、このような奏効率はＢ細胞悪性腫瘍におけるＣＡＲ１９Ｔ細胞での免疫療法と比較してはるかに低かった（６）。

Ｖａ２４−インバリアントＮＫＴ及びＣＡＲＧＤ２ＮＫＴ細胞は、Ｔ及びＣＡＲＧＤ２Ｔ細胞と比較して、マウスにおいて神経芽細胞腫異種移植片に対してより良好に局在する（７）。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、免疫抑制腫瘍随伴マクロファージを死滅させ得るか又はリプログラミングし得る（８）。従って、腫瘍部位に対するより良好な局在化及び抑制ＴＡＭの中和は、固形腫瘍のＣＡＲ−リダイレクト免疫療法に対するエフェクター集団としてＴ細胞を凌ぐ利益をＮＫＴに与える。

腫瘍部位に対する有効な局在化にもかかわらず、ＮＫＴ細胞の機能性及び治療有効性は低酸素ＴＭＥにより阻害される。ＮＫＴ細胞は、ＩＬ１５を発現するように改変されたＮＫＴ細胞がマウスのＮＢモデルで抗腫瘍活性の上昇を示すように、ＩＬ−１５によって、低酸素が介在する抑制からレスキューされ得る（９）。さらに、同じコンストラクト中でＣＡＲＧＤ２及びＩＬ１５を同時発現するＮＫＴ細胞（ＣＡＲＧＤ２．ＩＬ１５）は、ＮＢ担持マウスにおいてインビボ増殖を起こし、ＣＡＲＧＤ２又はＩＬ１５の何れかを単独で発現するＮＫＴと比較してより高い抗腫瘍活性を有する。さらに、ＮＫ細胞増殖、生存及び抗体介在性細胞傷害性は、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ１５及びアポリポタンパク質のｓｕｓｈｉドメインのキメラタンパク質の存在下で増大させられ得る（１０）。

本開示は、癌の処置のための養子免疫療法の技術分野での長年にわたるニーズに対する解決策を提供する。

ＫａｌｏｓＭ，ＪｕｎｅＣＨ．ＡｄｏｐｔｉｖｅＴｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｅｒｆｏｒｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｉｎｔｈｅｅｒａｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０１３；３９（１）：４９−６０ＤｏｔｔｉＧ，ＧｏｔｔｓｃｈａｌｋＳ，ＳａｖｏｌｄｏＢ，ＢｒｅｎｎｅｒＭＫ．Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒａｐｉｅｓｕｓｉｎｇｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＴｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０１４；２５７（１）：１０７−１２６ＳｃａｒｆｏＩ，ＭａｕｓＭＶ．ＣｕｒｒｅｎｔａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｉｎｃｒｅａｓｅＣＡＲＴｃｅｌｌｐｏｔｅｎｃｙｉｎｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅｔｕｍｏｒｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＣａｎｃｅｒ２０１７；５：２８ＰｕｌｅＭＡ，ｅｔａｌ．Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＴｃｅｌｌｓｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｔｏｃｏｅｘｐｒｅｓｓｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅａｎｄａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｗｉｔｈｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００８；１４（１１）：１２６４−１２７０ＬｏｕｉｓＣＵ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｆａｔｅｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｓｉｔｉｖｅＴｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ２０１１；１１８（２３）：６０５０−６０５６ＰｅｇｒａｍＨＪ，ＳｍｉｔｈＥＬ，ＲａｆｉｑＳ，ＢｒｅｎｔｊｅｎｓＲＪ．ＣＡＲｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｃａｎｃｅｒｓ：ｃａｎｓｕｃｃｅｓｓｓｅｅｎｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＢ−ｃｅｌｌａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａｂｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｏｔｈｅｒｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ？Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；７（５）：５４５−５６１ＨｅｃｚｅｙＡ，ｅｔａｌ．ＩｎｖａｒｉａｎｔＮＫＴｃｅｌｌｓｗｉｔｈｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｖｉｄｅａｎｏｖｅｌｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｓａｆｅａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ２０１４；１２４（１８）：２８２４−２８３３ＳｏｎｇＬ，ｅｔａｌ．Ｖａｌｐｈａ２４−ｉｎｖａｒｉａｎｔＮＫＴｃｅｌｌｓｍｅｄｉａｔｅａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙｖｉａｋｉｌｌｉｎｇｏｆｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ２００９；１１９（６）：１５２４−１５３６ＬｉｕＤ，ｅｔａｌ．ＩＬ−１５ｐｒｏｔｅｃｔｓＮＫＴｃｅｌｌｓｆｒｏｍｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓａｎｔｉｍｅｔａｓｔａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ２０１２；１２２：２２２１−２２３３ＯｃｈｏａＭＣ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｃｅｔｕｘｉｍａｂｂｙａｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｍｐａｓｓｉｎｇｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０１７；７（２）：ｅｐｒｉｎｔ

本開示は、抗原を標的とする受容体を有する改変免疫細胞の使用を拡大する系、組成物及び方法を対象とする。特定の実施形態では、本開示は、癌免疫療法及び処置しようとする癌及び腫瘍抗原のその特定の発現により互換的な使用を可能にするモジュラー分子アダプターを用いた免疫療法を形成することに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも一部の例では第２の（又はそれを超える）抗原も標的とするために第１の抗原を標的とする既存の免疫エフェクター細胞を利用することを可能にする、癌免疫療法及び分子アダプターに関する。

本開示の実施形態は、有効な癌免疫療法のために、改変抗原受容体を発現させるための、及び抗原−サイトカイン複合体とともに分子アダプターを分泌させるための、免疫エフェクター細胞の改変を含む。特定の実施形態では、サイトカインドメイン（サイトカイン、サイトカイン受容体及び／又はサイトカイン及びその受容体）を含む分子アダプターによって、固形腫瘍の抑制性微小環境における免疫療法の使用が可能になる。

ある一定の実施形態では、免疫エフェクター細胞があり、この細胞は、（ａ）腫瘍細胞結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインと、を含み；（ｃ）任意選択により、抗原受容体標的ドメインをさらに含む、分子アダプターを産生し；任意選択により、この細胞は、１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体を含む。従って、免疫エフェクター細胞は改変され、従って非天然である。

ある一定の実施形態では、免疫エフェクター細胞があり、この細胞は、（ａ）標的細胞結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインと、を含み；（ｃ）任意選択により、抗原受容体標的ドメインをさらに含む、分子アダプターを産生し；任意選択により、この細胞は、１つ以上の標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体を含む。従って、免疫エフェクター細胞は改変され、従って非天然である。

一実施形態では、ａ）腫瘍細胞結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインと、任意選択により、（ｃ）抗原受容体標的ドメインと、を含む分子アダプターが提供される。このような分子アダプターは、免疫療法の有効性を改善するために、１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体を含む改変免疫エフェクター細胞と組み合わせて提供され得る。

本開示の実施形態は免疫エフェクター細胞を含み、この細胞は、（ａ）腫瘍細胞結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインと、を含み；（ｃ）任意選択により（又は非任意選択により）、抗原受容体標的ドメインをさらに含む、分子アダプターを産生し；任意選択により（又は非任意選択により）、この細胞は、１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体を含む。具体的な実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、抗体、抗体断片又は非抗体足場を含む。腫瘍細胞結合ドメインはｓｃＦｖを含み得る。腫瘍細胞結合ドメインは、ＧＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ２４、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤＬ−２など、腫瘍細胞の表面上で発現される抗原を標的とし得る。一部の例では、サイトカインは、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ２１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。具体的な事例では、サイトカインはＩＬ１５であり、及び／又はサイトカイン受容体はＩＬ１５Ｒ又はそのアルファサブユニット（ＩＬ１５ＲＡ）である。本抗原受容体標的ドメインは、腫瘍抗原若しくはそれらの機能断片を含み得るか、又は本抗原受容体標的ドメインは、腫瘍抗原とみなされない抗原（若しくはそれらの機能断片）でもあり得る。

特定の実施形態では、本分子アダプターは、腫瘍細胞上の第１の抗原を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、第２の腫瘍抗原又はそれらの機能断片を含む抗原受容体標的ドメインと、を含む。具体的な実施形態では、本抗原受容体標的ドメインはＣＤ１９を含む。本開示の何れの細胞も、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である１つ以上の改変抗原受容体を含み得る。この細胞は、天然由来のＴＣＲをコードすることを含め、ＴＣＲをコードするベクターでの伝達により改変ＴＣＲを含み得る。

特定の実施形態では、本開示の細胞は、第１の腫瘍抗原を標的とする分子アダプターを産生し、第１の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体を含むか；第２の腫瘍抗原を標的とする分子アダプターを産生し、第１の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体を含むか；又は第１の腫瘍抗原を標的とする分子アダプターを産生し、この分子アダプターは、細胞表面上で発現される抗原受容体により標的とされる抗原受容体標的ドメインを含む。具体的な実施形態では、腫瘍細胞結合ドメイン及び抗原受容体標的ドメインは、ヒンジ領域及び／又はリンカーにより連結される。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＣＤ８由来であり得る。具体的な実施形態では、この細胞は、この分子アダプター及び、任意選択により、この改変抗原受容体をコードする発現ベクター（ウイルスベクター又は非ウイルスベクター）又はＲＮＡを含む。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターの例としては、プラスミド及びトランスポゾンが挙げられる。具体的な実施形態では、この細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、γδＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、自然リンパ球（ＩＬ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、マクロファージ、幹細胞又はそれらの混合物である。

ある実施形態では、（ａ）腫瘍細胞結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインと、（ｃ）抗原受容体標的ドメインと、を含む、改変抗原受容体を発現する細胞をリダイレクトするための分子アダプターがある。具体的な実施形態では、分子アダプター中のサイトカインドメインは、腫瘍細胞結合ドメインと抗原受容体ドメインとの間に位置する。

一実施形態では、（ａ）標的細胞結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインと、（ｃ）抗原受容体標的ドメインと、を含む、改変抗原受容体を発現する細胞をリダイレクトするための分子アダプターがある。具体的な実施形態では、分子アダプター中のサイトカインドメインは、標的細胞結合ドメインと抗原受容体ドメインとの間に配置される。

本開示の実施形態は、本開示により包含される分子アダプターに対して向けられる非天然抗原受容体を含む。

一実施形態では、本開示の分子アダプターをコードする発現ベクターがある。一部の例では、本発現ベクターは、抗原受容体をコードする配列を含む。特定の実施形態は、（ｉ）腫瘍細胞結合ドメイン及び（ｉｉ）サイトカインドメインを含む分子アダプターと；（ｂ）抗原受容体と、をコードする発現ベクターを含む。具体的な実施形態では、ＩＲＥＳエレメント又は２Ａ配列は分子アダプターと抗原受容体との間に配置される。このような発現ベクターは、ウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクター）又は非ウイルスベクターであり得る。

一実施形態では、本開示の分子アダプターをコードする発現ベクターがある。一部の例では、本発現ベクターは、抗原受容体をコードする配列を含む。特定の実施形態は、（ｉ）標的細胞結合ドメイン及び（ｉｉ）サイトカインドメインを含む分子アダプターと；（ｂ）抗原受容体と、をコードする発現ベクターを含む。具体的な実施形態では、ＩＲＥＳエレメント又は２Ａ配列は分子アダプターと抗原受容体との間に配置される。このような発現ベクターは、ウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクター）又は非ウイルスベクターであり得る。

本開示の実施形態は、本開示により包含される発現ベクターを含む細胞を包含する。

一実施形態では、治療的有効量の本開示の細胞を個体に投与する工程を含む、個体において癌又は他の疾患（例えば自己免疫疾患）を処置する方法がある。疾患が癌ではない場合、疾患は、疾患に関連する１つ以上の抗原を通じて標的とされ得る細胞の集団を死滅させることが所望される状態を有し得る。

特定の実施形態では、本開示の治療的有効量の分子アダプター及び／又は本開示の抗原受容体を発現する治療的有効量の細胞を投与することを含む、個体において癌又は他の疾患を処置する方法がある。

ある一定の実施形態では、腫瘍細胞上の第１又は第２の抗原を標的とする腫瘍細胞結合ドメイン及びサイトカインドメインを含む治療的有効量の分子アダプター及び腫瘍細胞上の第１の抗原に対する抗原受容体を発現する細胞を個体に投与することを含む、個体において癌を処置する方法がある。具体的な実施形態では、本分子アダプター及び／又は細胞は、腹腔内又は静脈内注射により個体に投与される。一部の例では、分子アダプターの２回目の投与が初回投与後に行われる。個体は、さらなる癌治療を受け得る、受けている及び／又は受けるであろう。さらなる癌治療は、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法又はそれらの組み合わせであり得る。

ある一定の実施形態では、標的細胞上の第１又は第２の抗原を標的とする標的細胞結合ドメイン及びサイトカインドメイン及び標的細胞上の第１の抗原に対する抗原受容体を発現する細胞を含む治療的有効量の分子アダプターを個体に投与することを含む、個体において疾患を処置する方法がある。具体的な実施形態では、本分子アダプター及び／又は細胞は、腹腔内又は静脈内注射により個体に投与される。一部の例では、分子アダプターの２回目の投与が初回投与後に行われる。個体は、疾患に対するさらなる治療を受け得る、受けた、及び／又は受けるであろう。

いくつかの実施形態では、本明細書中に包含される免疫エフェクター細胞及び／又は本明細書中に包含される分子アダプターを含む医薬組成物がある。

一実施形態では、（ａ）第２の腫瘍抗原を標的とする非天然抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞又はその複数を提供又は入手する工程と；（ｂ）第１の腫瘍抗原に結合する腫瘍細胞結合ドメイン及び第２の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体に結合する抗原受容体標的ドメインを含む分子アダプターを提供又は入手する工程と、を含み、任意選択により（又は非任意選択により）、分子アダプターが（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含み、工程（ｂ）の分子アダプターを提供又は入手することが、処置されている癌の癌細胞における第１の抗原の発現の存在により決定される工程を含む、第１の腫瘍抗原を発現する癌に癌治療を適応させる方法がある。

ある一定の実施形態では、（ａ）第２の腫瘍抗原を標的とする非天然抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞又はその複数を提供又は入手する工程と；（ｂ）（１）第１の抗原を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと（２）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインとを含む分子アダプターをコードするポリヌクレオチドを用いてこの細胞に対してトランスフェクションを行う工程と、を含む、第１の腫瘍抗原を発現する癌に癌治療を適応させる方法がある。

一実施形態では、（ａ）第２の抗原を標的とする非天然抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞又はその複数を提供又は入手する工程と；（ｂ）第１の抗原に結合する標的細胞結合ドメイン及び第２の抗原を標的とする抗原受容体に結合する抗原受容体標的ドメインを含む分子アダプターを提供又は入手する工程と、を含み、任意選択により（又は非任意選択により）、分子アダプターが（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含み、工程（ｂ）の分子アダプターの提供又は入手が、処置されている疾患の標的細胞における第１の抗原の発現の存在により決定される、（疾患細胞抗原でもあり得る）第１の標的細胞抗原を発現する疾患細胞に疾患療法を適応させる方法がある。

ある一定の実施形態では、（ａ）第２の抗原を標的とする非天然抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞又はその複数を提供又は入手する工程と；（ｂ）（１）第１の抗原を標的とする標的細胞結合ドメインと（２）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインとを含む分子アダプターをコードするポリヌクレオチドを用いてこの細胞に対してトランスフェクションを行う工程と、を含む、第１の抗原を発現する癌に疾患療法を適応させる方法がある。

本開示の実施形態は、免疫エフェクター細胞及びその使用方法を含み、この細胞は、組み換えサイトカイン、サイトカイン受容体又は１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体又はこれらの何れかの組み合わせを個別に産生するか又は発現する。これらの細胞では、産生されるサイトカイン及びサイトカイン受容体は、個別のタンパク質又はタンパク質断片として、又は単一のタンパク質として発現され得る。このような細胞は、腫瘍標的抗原を発現する細胞を伴う癌を含め、癌に対して個体を処置する方法において使用され得る。

続く発明を実施するための形態がより良好に理解され得るように、前述の説明で本発明の特性及び技術的な長所をかなり広く概説してきた。本発明のさらなる特性及び長所を本明細書中で以後記載するが、これは本発明の特許請求の範囲の主題を形成する。当業者により当然認識されるはずであるが、開示される概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を遂行するための他の構造を修飾又は設計するための基礎として、容易に利用され得る。当業者によりまた理解されるはずであるが、このような同等の構築は、添付される特許請求の範囲に記載のような本発明の精神及び範囲から逸脱しない。添付の図面と関連付けて考える場合、次の記載から、さらなる目的及び長所と一緒に、操作のその機構及び方法の両方に関して本発明の特徴であると考えられる新規特性がより良好に理解されるであろう。しかし、例示及び記載の目的でのみ、図面のそれぞれが提供され、本発明の制限の定義として意図するものではないことが明らかに理解されるはずである。

本開示のより完全な理解のために、ここで、添付の図面と組み合わせて解釈される次の記載を参照する：

分子アダプターコンストラクトの例の模式図：「ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ」は抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメインであり、「ＣＤ８Ｈ−ＴＭ」はヒトＣＤ８ヒンジ領域及びＣＤ８膜貫通ドメインであり、「ＣＤ２８」はＣＤ２８からの同時刺激ドメインであり、「ＣＤ３ζ」はＣＤ３ζＴ細胞活性化ドメインであり、「１４ｇ２ａｓｃＦｖ」は抗ＧＤ２ｓｃＦｖドメインであり、「ＩｇＧ４Ｈ」はヒトＩｇＧ４由来のヒンジ領域であり、「Ｐ２Ａ」は自己切断ウイルスＰ２Ａ配列であり、「ＣＡＲ１９」は、この図の上部で示される全長ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトであり、「ＣＤ１９細胞外」はヒトＣＤ１９細胞外ドメイン又はＣＡＲ１９に対する抗原であり、「リンカー１」は２０アミノ酸リンカーであり、「ＩＬ１５」はヒトＩＬ１５であり、「リンカー２」は２６アミノ酸リンカーであり、「ＩＬ１５Ｒａ」はヒトＩＬ１５受容体アルファサブユニットであり、「Ｔ２Ａ」は自己切断ウイルスＴ２Ａ配列であり、「５’ＬＴＲ」は５’長末端反復であり；「３’ＬＴＲ」は３’長末端反復である。

サイトカイン複合体あり又はなしの抗ＧＤ２−ＣＤ１９分子アダプターの発現及び特異性：（図２Ａ）抗ＣＡＲ１９抗体で染色するフローサイトメトリーによって形質導入ＮＫＴ細胞によるＣＡＲ１９の発現を決定した。そこにおいて、（１）は非形質導入を指し；（２）はＣＡＲ１９．抗ＧＤ２を指し；（３）はＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９を指し；（４）はＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９−ＩＬ１５を指し；（５）はＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを指し；（６）はＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９．ＩＬ１５を指し；（７）はＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９．ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを指し；パーセンテージはＣＡＲ１９を発現するＮＫＴ細胞のパーセンテージを表す。（図２Ｂ）分子アダプターの特異性は、ＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９又はＣＡＲ１９．抗ＧＤ２形質導入ＮＫＴ細胞からの上清をＣＤ１９−陰性／ＧＤ２−陽性ＣＨＬＡ−２５５又はＣＤ１９−陰性／ＧＤ２−陰性ＬＡ−Ｎ−６神経芽細胞腫細胞とともに温置することによって決定した。神経芽細胞腫細胞への抗ＧＤ２−ＣＤ１９の結合は、抗ＣＤ１９抗体での染色後にフローサイトメトリーにより分析した。３回の実験の代表からの結果。

分子アダプターはインビトロでＮＢ細胞の有効な死滅を媒介する：指定のコンストラクトを形質導入したエフェクターＮＫＴ細胞及びルシフェラーゼを安定して発現する標的ＣＨＬＡ２５５ＮＢ細胞を温置した後、細胞介在性細胞傷害性を分析した。様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間にわたり同時培養した後、ルシフェラーゼ活性（生細胞）を測定した。４回の実験の代表からのパーセンテージ細胞傷害性として結果をプロットする。

ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒ複合体を伴う分子アダプターはＮＳＧマウスにおけるＮＢ腫瘍異種移植片に対する強力な抗腫瘍活性に介在する。転移性神経芽細胞腫モデルにおいて、指定のコンストラクトが形質導入されたＮＫＴ細胞の抗腫瘍活性を測定した。１０^６個のＣＨＬＡ２５５／ＬｕｃＮＢ細胞をＮＳＧマウスに注射し、それに続いて１週間後に１０^７個の形質導入ＮＫＴ細胞の注射を行った。生物発光イメージングを使用して、腫瘍注射後第４週から毎週、腫瘍成長を監視した。カプランマイヤー法を使用して生存確率を分析した。２回の実験の代表からの結果。

さらなる分子アダプター及びサイトカインコンストラクトの模式図：「１４ｇ２ａｓｃＦｖ」は、抗ＧＤ２ｓｃＦｖドメインであり、「ＩｇＧ４Ｈ」はＩｇＧ４からのヒンジ領域であり、「Ｐ２Ａ」は自己切断ウイルスＰ２Ａ配列であり、「ＣＡＲ１９」は、図１の上部で示される全長抗ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトであり、「ＣＤ１９細胞外」は、ヒトＣＤ１９細胞外ドメイン又は抗ＣＤ１９ＣＡＲに対する抗原であり、「リンカー１」は２０アミノ酸リンカーであり、「ＩＬ１５」はヒトＩＬ１５であり、「リンカー２」は２６アミノ酸リンカーであり、「ＩＬ１５Ｒａ」はヒトＩＬ１５Ｒａであり、「Ｔ２Ａ」は自己切断ウイルスＴ２Ａ配列であり、「５’ＬＴＲ」は５’長末端反復であり、「３’ＬＴＲ」は３’長末端反復である。

さらなるＧＤ２分子アダプターの発現及びそれが介在するインビトロ細胞傷害性：（図６Ａ）指定の分子アダプターコンストラクトを用いてインビトロ刺激したＮＫＴ細胞に対して形質導入を行った。抗ＣＤ１９ＣＡＲ抗体での染色後にフローサイトメトリーによってＣＡＲ発現を分析した。パーセンテージはＣＡＲ１９を発現するＮＫＴ細胞を表す。（図６Ｂ）様々なエフェクター対標的細胞比で標的神経芽細胞腫細胞とともに指定のコンストラクトで形質導入したエフェクターＮＫＴ細胞を温置することによって、細胞介在性の細胞傷害性を分析した。２回の実験の代表からの結果；

定められるＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒ複合体配向を伴う分子アダプターはＮＳＧマウスにおいてＮＢ腫瘍異種移植片に対する強力な抗腫瘍活性に介在する。図４に記載のように転移性神経芽細胞腫モデルにおいて指定のコンストラクトにより形質導入したＮＫＴ細胞の抗腫瘍活性を測定した。２回の実験の代表からの結果；

神経芽細胞腫細胞表面上でＧＤ２、ＣＤ２４又はＣＤ５６に対するｓｃＦｖに連結されるＩＬ１５／ＩＬ１５ＲａのＣＡＲＧＤ２及び抗原−サイトカイン複合体をコードするレトロウイルスコンストラクトの略図。ＧＤ２、ＣＤ２４又はＣＤ５６での標的化を通じて神経芽細胞腫上でＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａを提示するために設計されたコンストラクトを図式化して説明する。ＩＬ１５のトランスジェニック発現あり又はなしのＣＡＲＧＤ２発現細胞、ＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒａ又は両方に融合される抗ＧＤ２（ａ−ＧＤ２ｓｃＦｖ）、抗ＣＤ２４（ａ−ＣＤ２４ｓｃＦｖ）又は抗ＣＤ５６（ａ−ＣＤ５６ｓｃＦｖ）とともに分子アダプターを同時発現するもの。２つの対照には、ｉ）神経芽細胞腫で発現されないＣＤ１９Ａｇを標的とするＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ複合体を伴うＣＡＲＧＤ２；ｉｉ）ＣＤ１９を標的とするＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ複合体を伴いＣＡＲなしが含まれ；「Ｅ２Ａ」は自己切断ウイルスＥ２Ａ配列であり；他の標識は図１及び図５に記載のとおりである。

ＮＫＴ純度チェック。インバリアントｉＮＫＴＴＣＲＶα２４Ｊα１８に特異的なＢＶ４２１マウス抗ヒトインバリアントＮＫＴ細胞抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン６Ｂ１１）及びＢＶ４２１マウスＩｇＧ１、ｋアイソタイプ対照抗体（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＸ４０）を個別に使用して細胞を染色したフローサイトメトリーによってＮＫＴ細胞純度を測定した。

ＣＡＲＧＤ２及び異なる抗原−サイトカイン複合体をコードするコンストラクトはＮＫＴ細胞において効率的なＣＡＲ発現を可能にした。フローサイトメトリー（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的、カタログ番号１１５−６０６−００６）を使用して、抗マウスＦ（ａｂ’）_２抗体によって、形質導入ＮＫＴ細胞におけるＣＡＲ発現レベルを決定した。図１０において、（１）は非形質導入ＮＫＴ細胞を指し；（２）はＣＡＲＧＤ２を指し；（３）はＣＡＲＧＤ２．ＩＬ１５を指し；（４）はＣＡＲＧＤ２．ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを指し；（５）はＣＡＲＧＤ２．抗ＧＤ２−ＩＬ１５を指し；（６）はＣＡＲＧＤ２．抗ＧＤ２−ＩＬ１５Ｒａを指し；（７）はＣＡＲＧＤ２．抗ＧＤ２−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを指し；（８）はＣＡＲＧＤ２．ａ−ＣＤ２４−ＩＬ１５を指し；（９）はＣＡＲＧＤ２．ａ−ＣＤ２４−ＩＬ１５Ｒａを指し；（１０）はＣＡＲＧＤ２．ａ−ＣＤ２４−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを指し；（１１）はＣＡＲＧＤ２．ａ−ＣＤ５６−ＩＬ１５を指し；（１２）はＣＡＲＧＤ２．ａ−ＣＤ５６−ＩＬ１５Ｒａを指し；（１３）はＣＡＲＧＤ２．ａ−ＣＤ５６−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを指し；（１４）はＣＡＲＧＤ２．ＩＬ１５．抗ＧＤ２−ＩＬ１５Ｒａを指し；（１５）はＣＡＲＧＤ２．ＩＬ１５．ａ−ＣＤ２４−ＩＬ１５Ｒａを指し；（１６）はＣＡＲＧＤ２．ＩＬ１５．ａ−ＣＤ５６−ＩＬ１５Ｒａを指す。

ＩＬ１５分泌ＣＡＲＧＤ２−細胞と比較した、ＩＬ１５Ｒａ又はＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ分子アダプターを通じて顕著に促進された抗腫瘍活性を示すログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定。様々なアダプターを発現するＣＡＲＧＤ２ｉＮＫＴ細胞で処置した群における日数に対するマウスの生存パーセンテージを使用して生存プロットを作成する。カプランマイヤー法によってデータを分析した。次に、ログランク検定を使用して生存率の差を比較した。Ｐ値は、群Ｄと比較した、群Ａ、Ｂ又はＣである。

抗原−サイトカイン複合体を伴うＣＡＲ分子アダプターのモデルの例。ある代表的な分子アダプターは、ＧＤ２（抗ＧＤ２−ＣＤ１９）に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来のＣＤ１９細胞外ドメイン及びｓｃＦｖの融合物を含む。ＣＡＲ１９及び抗ＧＤ２−ＣＤ１９アダプターを含有するコンストラクトで形質導入したＮＫＴ細胞は、細胞表面上でＣＡＲ１９を発現し、このような分子アダプターを分泌する。本分子アダプターの抗原部分（例えばＣＤ１９細胞外）を活性化サイトカインドメイン（例えばＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ）と融合させ、それにより腫瘍細胞表面上で抗原−サイトカイン複合体を形成させ、これはＣＡＲ及び免疫エフェクター細胞により発現される個々のサイトカイン受容体により同時に認識される。図１２において、（１）はＧＤ２を指し；（２）は抗ＧＤ２ｓｃＦｖ（抗ＧＤ２）を指し；（３）はＣＤ１９細胞外ドメインを指し；（４）はＣＡＲ１９を指し；（５）はＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを指し；（６）はＩＬ−２Ｒβ／γを指す。（２）、（３）及び（５）がアミノ酸リンカー（青線）により連結されることに注意。

免疫エフェクター細胞修飾及び腫瘍細胞との相互作用の実施形態。（図１３Ａ）免疫エフェクター細胞は、第１の腫瘍抗原を標的とする分子アダプター（Ａｇ１）を産生、分泌し、第１の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体を含む。（図１３Ｂ）免疫エフェクター細胞は、第２の腫瘍（Ａｇ２）抗原を標的とする分子アダプターを産生し、第１の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体を含む。（図１３Ｃ）免疫エフェクター細胞は、第１の腫瘍抗原を標的とする分子アダプターを産生し、この分子アダプターは、細胞表面上で発現される抗原受容体により標的とされる抗原受容体標的ドメインを有する。図１３Ａ〜Ｃにおいて、（１）は、第１の腫瘍標的抗原に対する抗原受容体（ＴＣＲ、ＣＡＲなど）を指し；（２）は腫瘍細胞結合ドメインを指し；（３）はサイトカインドメインを指し；（４）はサイトカイン受容体を指し；（５）は抗原受容体標的ドメインを指し；（６）は第２の腫瘍標的抗原に対する抗原受容体を指す。具体的な事例では、図１３Ｃで例示されるように、抗原が可溶性なのでエレメント（６）はＴＣＲではない。

ＩＬ１５又は／及びＩＬ１５Ｒａあり又はなしのキメラ抗原受容体コンストラクトＣＡＲ．ＧＤ２の例の模式図：「５’ＬＴＲ」は５’長末端反復であり、「１４Ｇ２ａ」は抗ＧＤ２ｓｃＦｖドメインであり、「ＣＤ８Ｈ−ＴＭ」はヒトＣＤ８ヒンジ領域及びＣＤ８膜貫通ドメインであり、「ＣＤ２８」及び「４−１ＢＢ」は同時刺激ドメインであり、「ＣＤ３ζ」はＣＤ３ζＴ細胞活性化ドメインであり、「２Ａ」は自己切断ウイルスＴ２Ａ配列であり、「ＩＬ１５」はヒトＩＬ１５であり、「ＩＬ１５Ｒａ」はヒトＩＬ１５受容体アルファサブユニットであり、「３’ＬＴＲ」は３’長末端反復である。図１５Ａ及び図１５Ｂに対するレジェンドに記載のように異なるコンストラクトに付番する。

ＩＬ１５又は／及びＩＬ１５Ｒａあり又はなしのＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトを用いて形質導入が行われたＮＫＴ細胞によるＣＡＲ．ＧＤ２又はＩＬ１５の細胞表面発現：（図１５Ａ）抗ＣＡＲ．ＧＤ２抗体で染色するフローサイトメトリーによってＮＫＴ細胞によるＣＡＲ．ＧＤ２の発現を決定した。そこにおいて、（１）は非形質導入を指し；（２）はＣＡＲ．ＧＤ２．２８ｚを指し；（３）はＣＡＲ．ＧＤ２．２８ｚ．１５を指し；（４）はＣＡＲ．ＧＤ２．２８ｚ．１５．１５Ｒａを指し；（５）はＣＡＲ．ＧＤ２．ＢＢｚを指し；（６）はＣＡＲ．ＧＤ２．ＢＢｚ．１５を指し；（７）はＣＡＲ．ＧＤ２．ＢＢｚ．１５．１５Ｒａを指す。パーセンテージは、ＮＫＴ細胞集団の中でもＣＡＲ．ＧＤ２を発現するＮＫＴ細胞のパーセンテージを表す。（図１５Ｂ）抗ＩＬ１５抗体で染色するフローサイトメトリーによってＮＫＴ細胞の表面上でのＩＬ１５の発現を決定した。図１５Ａに記載のものと同じコンストラクトでＮＫＴ細胞に対して形質導入を行った。パーセンテージは、細胞表面上でＩＬ１５を発現するＮＫＴ細胞のパーセンテージを表す。

ＣＡＲ．ＧＤ２ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａコンストラクトは、ＮＢ細胞に対する形質導入ＮＫＴ細胞の効果的で特異的なインビトロ細胞傷害性を媒介する：指定のコンストラクトを用いて形質導入されたエフェクターＮＫＴ細胞及びルシフェラーゼを安定して発現する標的ＣＨＬＡ２５５（ＧＤ２−陽性）、ＬＡ−Ｎ−１（ＧＤ２−陽性）又はＬＡ−Ｎ−６（ＧＤ２−陰性）ＮＢ細胞を温置した後、細胞介在性細胞傷害を分析した。様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で６時間にわたり同時培養した後、ルシフェラーゼ活性（生細胞）を測定した。３回の実験の代表からのパーセント細胞傷害性として結果をプロットする。

低用量（４ｘ１０^６個ＣＡＲ＋ＮＫＴ／マウス）で、ＣＡＲ．ＧＤ２．ＢＢｚ．１５．１５ＲａＮＫＴ細胞はＮＳＧマウスでのＮＢ腫瘍異種移植片に対する優れた抗腫瘍活性に介在する：転移性神経芽細胞腫モデルにおいて指定のコンストラクトで形質導入したＮＫＴ細胞の抗腫瘍活性を測定した。１０^６個のＣＨＬＡ２５５／ＬｕｃＮＢ細胞をＮＳＧマウスに注射し、続いて１週間後に形質導入ＮＫＴ細胞の低用量（４ｘ１０^６個）を注射した。マウスには２０００ＵＩＬ２を２週間にわたり１日おきに与えた（ＮＳＧマウスにおけるヒトＮＫＴ細胞生着に対する標準的手順として）。（図１７Ａ）生物発光イメージングを使用した腫瘍注射後第４週から毎週、腫瘍成長を監視した。（図１７Ｂ）カプランマイヤー法を使用して生存確率を分析した。

ＣＡＲ．ＧＤ２．２８ｚ．１５．１５ＲａＮＫＴ細胞が毒性である一方、高用量（１２ｘ１０^６個ＮＫＴ／マウス）で、ＣＡＲ．ＧＤ２．ＢＢｚ．１５．１５ＲａＮＫＴ細胞は、毒性なく、ＮＳＧマウスにおけるＮＢ腫瘍異種移植片に対する治癒的抗腫瘍活性に介在する：転移性神経芽細胞腫モデルにおいて、指定のコンストラクトにより形質導入したＮＫＴ細胞の抗腫瘍活性を測定した。１０^６個のＣＨＬＡ２５５／ＬｕｃＮＢ細胞をＮＳＧマウスに注射し、続いて１週間後に形質導入ＮＫＴ細胞の高用量（１２×１０^６）を注射した。マウスには２週間にわたり１日おきに２０００ＵＩＬ２を与えた。（図１８Ａ）生物発光イメージングを用いて腫瘍注射後第４週から毎週、腫瘍成長を監視した。（図１８Ｂ）カプランマイヤー法を使用して生存確率を分析した。

免疫エフェクター細胞表面でのＣＡＲ．ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａ介在性シグナル伝達のモデル。ＣＡＲ．ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａコンストラクトで形質導入した免疫エフェクター細胞は個別にＣＡＲコンストラクト、分泌されるＩＬ１５及び膜結合ＩＬ１５Ｒａを発現する。ＣＡＲコンストラクトのｓｃＦｖは、関心のある腫瘍抗原に結合し、エフェクター細胞内部で活性化及び同時刺激シグナルを伝播させる。膜結合ＩＬ１５Ｒａは、分泌されたＩＬ１５を免疫エフェクター細胞表面で捕捉し、ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａ複合体と一緒にＩＬ２Ｒβ／γサイトカインシグナル伝達複合体を結合させる。（１）関心のある腫瘍抗原、（２）ＣＡＲの腫瘍抗原特異的なｓｃＦＶ部分、（３）ＣＡＲの膜貫通ドメイン、（４）ＣＡＲの少なくとも１つの同時刺激ドメイン、（５）ＣＡＲのＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、（６）ＩＬ２Ｒβ／γ、（７）ＩＬ１５及び（８）ＩＬ１５Ｒａ。

本明細書中で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」という特定は１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合、「を含む」という語と組み合わせて使用するとき、「ａ」又は「ａｎ」という語は１つ又は複数を意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の」は少なくとも第２又はそれを超える意味であり得る。具体的な実施形態では、本発明の態様は、例えば本発明の１つ以上の配列「から本質的になり」得るか又はそれら「からなり」得る。本発明の一部の実施形態は、本発明の１つ以上のエレメント、方法工程及び／又は方法からなり得るか又はそれらから本質的になり得る。本明細書中に記載のあらゆる方法又は組成物が本明細書中に記載の何らかの他の方法又は組成物に関して実行され得ることが企図される。本願の範囲は、本明細書中に記載の工程、機構、製造、組成物、手段、方法及び工程の特定の実施形態に限定されるものではない。

ある一定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載のある一定の分子アダプターアプローチを使用して第２の抗原を発現する腫瘍細胞に対して効果的にリダイレクトされ得る第１の腫瘍抗原に対する、ＣＡＲなどの抗原受容体を発現するように改変された、免疫エフェクター細胞、好ましくはＮＫＴ細胞に関する。少なくとも具体的な事例では、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒ複合体又は同様の生存促進性サイトカイン−サイトカイン受容体複合体が、腫瘍細胞表面上で分子アダプター送達標的抗原とともに同時に提示される。これにより、抗原受容体発現免疫エフェクター細胞が、腫瘍細胞表面上で分子的に近接近して（ｃｌｏｓｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）標的抗原及びサイトカインを認識することが可能になる。

他の実施形態では、本開示は、好ましくはＮＫＴ細胞において、第１の腫瘍抗原に対するＣＡＲなどの抗原受容体を発現するように改変された免疫エフェクター細胞に関し、この細胞は、腫瘍細胞結合ドメイン及びサイトカインドメインを含む分子アダプターを同時発現する。腫瘍細胞結合ドメインを介して、分子アダプターは、腫瘍細胞に結合し得、免疫エフェクター細胞は次に例えばサイトカイン受容体を介して分子アダプターに結合し得、それによりその抗腫瘍活性を最大化する同じ免疫エフェクター細胞における活性化及び生存シグナルを組み合わせる。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書中に記載のある特定の分子アダプターアプローチを使用して第２の抗原を発現する標的細胞に対して効果的にリダイレクトされ得る第１の抗原に対するＣＡＲなどの抗原受容体を発現させるように改変された、免疫エフェクター細胞、好ましくはＮＫＴ細胞に関する。少なくとも具体的な事例では、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒ複合体又は同様の生存促進性サイトカイン−サイトカイン受容体複合体が、細胞表面上で分子アダプター送達標的抗原とともに同時に提示される。これにより、抗原受容体発現免疫エフェクター細胞が、標的細胞表面上で分子的に近接近して（ｃｌｏｓｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）標的抗原及びサイトカインを認識することが可能になる。

本明細書中で示されるように、腫瘍特異的な抗原受容体を発現させるために、及び融合サイトカインとともに標的腫瘍抗原を送達するために免疫エフェクター細胞を改変するという概念は新規であり、神経芽細胞腫のインビボモデルにおいて有効であり、全ての癌の免疫療法に広く適用可能である。
Ｉ．

細胞及び関連構成成分及び組成物

本開示の実施形態は、天然で見られず、人為的に操作される細胞を包含する。従って、この細胞は改変（又は合成）され、従って非天然である。この細胞は単離細胞であり得る。この細胞は、外因的に細胞に提供される組み換え体である核酸実体又はタンパク質性実体、合成及び／又はトランスジェニックなどの少なくとも１つの実体を含む。

本明細書中で包含される細胞は、何らかの種類の免疫エフェクター細胞を含む。このような細胞はある一定の実施形態では、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、γδＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、自然リンパ球（ＩＬ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、マクロファージ、幹細胞、それらの混合物などであり得る。ＮＫＴ細胞は、好ましい実施形態では、ＣＤ１ｄ拘束性及び好ましくはインバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ；１型ＮＫＴとも呼ばれる）（１１）、例えばＶα２４ｉＮＫＴ又はＶα２４−Ｊα１８ＮＫＴなど）である。免疫エフェクター細胞は、特定の実施形態では、細胞にとって非天然である１つ以上の組成物を、少なくとも一部の例では分泌することを含め、産生するように改変される。さらなる、又は代替的な実施形態では、細胞は、細胞から分泌されない１つ以上の組成物を発現するように改変される。好ましくは免疫エフェクター細胞はヒトである。

特定の実施形態は、本明細書中で「分子アダプター」と呼ばれる１つ以上の可溶性融合タンパク質を産生する免疫エフェクター細胞を含む（図１３参照）。このような分子アダプターは、特定の実施形態では、（ａ）腫瘍細胞結合ドメインと；（ｂ）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインと、を含み；（ｃ）任意選択により、抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

特定の実施形態では、本分子アダプターは、腫瘍細胞（又は血液悪性腫瘍の癌細胞などの非固形癌細胞）の表面上で発現される抗原を標的とする少なくとも１つの腫瘍細胞結合ドメインを含む。免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞結合ドメインを含む分子アダプターを産生する場合、腫瘍細胞結合ドメインは何らかの適切な種類であり得る。特定の実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、何らかの種類の抗体（その機能断片を含む）及び／又は非抗体足場を含む。抗体を含む腫瘍細胞結合ドメインは、全長抗体を含み得る。一部の例では、本抗体はキメラ抗体である。腫瘍細胞結合ドメインが機能抗体断片である場合、抗体断片は、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆ（ａｂ）’_２；ｓｃＦｖ；Ｆｖ断片；ｓｃＦａｂ；ナノボディ；ＶＨＨ又は最小認識単位；二特異性又は多特異性分子、例えば二重特異性抗体、一本鎖二重特異性抗体、ＤＡＲＴ、ＢｉＴＥ、タンデムｓｃＦｖ；又はそれらの組み合わせであり得る。腫瘍細胞結合ドメインが非抗体足場を含む場合、非抗体足場は、アフィボディ、アフィリン分子、ＡｄＮｅｃｔｉｎ、リポカインムテイン、ＤＡＲＰｉｎ、Ｋｎｏｔｔｉｎ、クニッツ型ドメイン、Ａｖｉｍｅｒ、テトラネクチン、トランスボディ、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、腫瘍上で標的である分子に対する可溶性受容体若しくはリガンド又はそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ｓｃＦｖである抗体断片である。このようなｓｃＦｖは何らかの腫瘍細胞抗原に対して標的とされ得る。ｓｃＦｖが向けられ得る腫瘍細胞抗原の例としては、少なくとも５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体−ａ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｋａｐｐａ、ＫＤＲ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、メラノーマの優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、癌胎児抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＡＦＰ、ＣＡ−１２５、ＥＴＡ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ラミニン受容体、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＡＭＥ、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＧＰ１００／ｐｍｅｌ１７、ＴＲＰ−１／−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ＴＧＦ−βＲＩＩ又はＶＥＧＦ受容体（例えばＶＥＧＦＲ２）が挙げられる。標的にしようとする腫瘍細胞抗原は、一部の例では正常細胞上で発現されるとしても、標的化のために選択され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、腫瘍細胞の複数の抗原を標的とする。

特定の実施形態では、分子アダプターは抗原受容体標的ドメインを含む。このようなコンストラクトは、ある一定の実施形態では、異なる腫瘍標的抗原に対して免疫エフェクター細胞をリダイレクトすることを可能にする（図１３Ｃ）。分子アダプターの抗原受容体標的ドメインは、１つ以上の腫瘍抗原又はその機能断片を含み得る。腫瘍細胞抗原の例としては、少なくとも５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体−ａ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児性ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、Ｈｅｒ２、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｋａｐｐａ、ＫＤＲ、ＭＡＧＥ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、癌胎児抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＡＦＰ、ＣＡ−１２５、ＥＴＡ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ラミニン受容体、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＡＭＥ、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＧＰ１００／ｐｍｅｌ１７、ＴＲＰ−１／−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ＴＧＦ−βＲＩＩ又はＶＥＧＦ受容体（例えばＶＥＧＦＲ２）が挙げられる。ある一定の実施形態では、抗原受容体標的ドメインは、例えばタンパク質又はフルオレセインイソチイオシアネートと複合化された葉酸（葉酸−ＦＩＴＣ；例えばＭ．Ｓ．Ｋｉｍｅｔａｌ．，ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ．２０１５Ｍａｒ４；１３７（８）：２８３２−５参照）などの非天然標的又は、抗体（国際公開第２０１６１６８７６６号パンフレット及び同第２０１６／１６８７６９Ａ１号パンフレットも参照）などのタンパク質へのｎｅｏ−エピトープの導入を含み、免疫細胞の抗原受容体が非天然標的に向けられる。それにより、免疫エフェクター細胞は非天然標的に結合し、内因性組織又は抗原に結合せず、従って活性化のための分子アダプターの存在に厳密に依存し、故にオフターゲット効果が減少する。

本分子アダプターはサイトカインドメインを含み、特定の実施形態では、サイトカインドメインは、（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含む。特定の態様では、サイトカインは生存促進性サイトカインである。特定のサイトカインの例としては、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２７及びそれらの混合物からなる群から選択されるサイトカインが挙げられる。特定の実施形態では、サイトカインはＩＬ−１５であり、及び／又はサイトカイン受容体はＩＬ１５Ｒ又はそのアルファサブユニット（ＩＬ１５Ｒａ）である。特定の実施形態では、ＩＬ１５Ｒａのｓｕｓｈｉドメインを使用する。少なくとも一部の例では、サイトカインはＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０及び／又はＩＬ１３ではない。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインはＩＬ−２Ｒβ／γを含む。従って、その具体的な実施形態では、サイトカインドメインはＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒａ及びＩＬ−２Ｒβ／γを含む。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体を含む。具体的な実施形態では、１つ以上の腫瘍標的抗原に対する抗原受容体は、分子アダプターの一部ではないが、細胞により個別の分子として発現される。本抗原受容体は、何らかの種類の改変受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラサイトカイン受容体、アルファベータ受容体、ガンマデルタ受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などであり得る。好ましい実施形態では、本抗原受容体はＴＣＲ又はＣＡＲである。抗原受容体が向けられ得る腫瘍標的抗原の例としては、少なくとも５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、葉酸受容体−ａ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、Ｏ−アセチル−ＧＤ２、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｋａｐｐａ、ＫＤＲ、ＭＡＧＥ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、癌胎児抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＡＦＰ、ＣＡ−１２５、ＥＴＡ、チロシナーゼ、ラミニン受容体、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＡＭＥ、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＧＰ１００／ｐｍｅｌ１７、ＴＲＰ−１／−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ＴＧＦ−βＲＩＩ又はＶＥＧＦ受容体（例えばＶＥＧＦＲ又はＶＥＧＦＲ２が挙げられる。

特定の実施形態では、本分子アダプターは、腫瘍細胞上の第１の抗原を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、第２の腫瘍抗原又はそれらの機能断片を含む抗原受容体標的ドメインと、を含む。

具体的な実施形態では、抗原受容体標的ドメインの抗原は、１つ以上の腫瘍標的抗原に対する抗原受容体が向けられる抗原と同じであり得る。抗原受容体標的ドメインの抗原が、抗原受容体が向けられる抗原とは異なる抗原である場合、抗原のうち１つは第１の抗原と呼ばれ得、他の抗原は第２の抗原と呼ばれ得る。

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の抗原受容体を発現する。具体的な実施形態では、受容体は細胞にとって非ネイティブである。抗原受容体は、少なくともＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、何らかの種類のものであり得る。受容体がＣＡＲであるとき、ＣＡＲは、第一世代、第二世代又は第三世代以上の世代であり得る。従って、ＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメインを含んでもよいし、又は含まなくてもよい。単一のＣＡＲは１、２、３個又はそれを超える腫瘍標的抗原を標的とし得る。特定の事例では、改変ＣＡＲは、１、２、３、４個又はそれを超える構成成分を有し、いくつかの実施形態では１つ以上の構成成分は、癌抗原を含む癌細胞への細胞の標的化又は結合を促進する。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、癌抗原に対する抗体、細胞質シグナル伝達ドメインの一部若しくは全て及び／又は１つ以上の同時刺激分子の一部若しくは全て、例えば同時刺激分子の内部ドメインを含む。具体的な実施形態では、本抗体は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ある一定の態様では、本抗体は、例えば関心のある抗原を発現する癌細胞の細胞表面上の癌抗原に向けられる。ある一定の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメイン、例えばＴ細胞受容体ζ鎖由来のものなどは、標的抗原とのキメラ受容体の結合後、免疫エフェクター細胞増殖及びエフェクター機能に対して刺激シグナルを生成させるためにキメラ受容体の少なくとも一部として使用される。例としては、同時刺激分子、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ及び／又はＯＸ４０又はサイトカイン受容体のシグナル伝達構成成分、例えばＩＬ７及びＩＬ１５などからの内部ドメインが挙げられるが限定されない。特定の実施形態では、抗原結合後にＣＡＲにより生じるＮＫＴ細胞の活性化、増殖及び細胞傷害性を促進するために同時刺激分子を使用する。具体的な実施形態では、同時刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０及び４−１ＢＢである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３−ゼータは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ及び／又はＯＸ４０と組み合わせて使用される。一般に、ＣＡＲの外部ドメインは、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン及び抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサーを包含する。抗原認識ドメインは、特定の癌抗原に特異的なｓｃＦｖを含み得る。しかし、同じ細胞において２つ以上のＣＡＲがある場合、第２のＣＡＲは、別の特定の抗原に特異的なｓｃＦｖを含み得る。外部ドメインに対するヒンジ領域の例としては、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、ＩｇＧ１からのヒンジ領域及びＣＤ８の一部が挙げられる。膜貫通領域は、あらゆる種類のものであり得るが、一部の例ではこれはＣＤ４又はＣＤ２８である。一般に、抗原認識及び受容体のクラスター後の細胞におけるシグナル伝達のために本開示のＣＡＲの内部ドメインを利用する。最も一般的に使用される内部ドメイン構成成分はＣＤ３−ゼータである。ＣＤ３−ゼータは、抗原が結合された後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する３個のＩＴＡＭを含有する。

次に図１２において、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞（（１）、この例においてＧＤ２を指す）と免疫エフェクター細胞との間の特異的な相互作用が示される。具体的な実施形態では、代表的な分子アダプターは、ＣＤ１９細胞外ドメイン（エレメント（３）又は図１２）及びＧＤ２に特異的なｍＡｂ由来ｓｃＦｖ（図１２のエレメント（２））、抗ＧＤ２ＣＤ１９）の融合を含む。ＣＡＲ１９及び抗ＧＤ２ＣＤ１９アダプターを含有するコンストラクトで形質導入された免疫エフェクター細胞は、細胞表面上でＣＡＲ１９（エレメント（４））を発現し、分子アダプターを分泌する。この特定の例では、分子アダプターの抗原構成成分を活性化サイトカインドメイン（例えばＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ、エレメント（５））と融合させる。これは、ＣＡＲ及び免疫エフェクター細胞により発現される個々のサイトカイン受容体により同時に認識される腫瘍細胞表面上で抗原−サイトカイン複合体を形成する。この特定の例では、図１２のエレメント（６）はＩＬ−２Ｒβ／γを示す。

図１３を参照して、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞及び腫瘍細胞とのその相互作用は、様々な構成のうち１つを有し得る。図１３Ａでは、免疫エフェクター細胞は、第１の腫瘍抗原を標的とする、及び第１の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体も有する分子アダプターと呼ばれる可溶性融合タンパク質を産生する。本分子アダプターは、サイトカインドメインに融合される腫瘍細胞結合ドメイン（サイトカイン及び／又はサイトカイン受容体を含む）を含む。この構成は、最大抗腫瘍有効性に対する同じ標的細胞上で免疫エフェクター細胞が活性化及び生存シグナルを受け取ることを確実にする。図１３Ｂでは、免疫エフェクター細胞は、第２の腫瘍抗原を標的とする分子アダプターと呼ばれる可溶性融合タンパク質を産生し、この細胞は、第１の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体を含む。本分子アダプターは、サイトカインドメイン（サイトカイン及び／又はサイトカイン受容体）に融合される腫瘍細胞結合ドメインを含む。この構成において、免疫エフェクター細胞は、両腫瘍抗原を同時発現する腫瘍細胞から活性化及び生存シグナルを依然として受け取る。第１及び第２の抗原の両方を発現する細胞のみが免疫エフェクター細胞を完全に活性化するので、この構成により特異性が向上し得る。図１３Ｃでは、免疫エフェクター細胞は、第１の腫瘍抗原を標的とする分子アダプターを産生し、この細胞は抗原受容体も有する。本分子アダプターの抗原受容体標的ドメインは、細胞の表面上で発現される抗原受容体により標的とされる。本分子アダプターは、腫瘍細胞の第１の抗原を標的とする腫瘍細胞結合ドメイン、抗原受容体標的ドメイン及びサイトカインドメインを含む。この構成により、標的細胞表面から活性化及び生存シグナルの両方を依然として受け取りながら、複数のタイプの癌を標的とするために、免疫エフェクター細胞で発現される１つの抗原受容体の使用が可能になる。

分子アダプターに関して、その構成成分は、特定の構成であってもよいし又はなくてもよい。例えば、Ｎ末端からＣ末端への方向で、本分子アダプターの構成成分のうち１つは、別のものに対してＮ末端又はＣ末端に配置され得る。本分子アダプターに対する具体的な実施形態では、腫瘍細胞結合ドメイン及び抗原受容体標的ドメインは、ヒンジ領域及び／又は（ＧＧＧＧＳ）_１（ＧＧＧＧＳ）_２（ＧＧＧＧＳ）_３又は（ＧＧＧＧＳ）_４リンカーによって連結され得る。具体的な実施形態では、ヒンジ領域は、例えば、ＣＤ８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。ある一定の実施形態では、ヒンジ領域はＩｇＧ４に由来する。

ある一定の非天然タンパク質を産生する改変免疫エフェクター細胞は、本開示により包含される。具体的な事例では、（１）第１の腫瘍抗原又は第２の腫瘍抗原を標的とする抗体又はその機能断片を産生する免疫エフェクター細胞であり、この抗体は、（ａ）サイトカイン、（ｂ）サイトカイン受容体又は（ｃ）その受容体に連結されるサイトカインに連結される。他の事例では、免疫エフェクター細胞は、第１の腫瘍抗原を標的とする抗体又はその機能断片を産生し、この抗体は、第２の腫瘍抗原に連結され、次にこれが、（ａ）サイトカイン、（ｂ）サイトカイン受容体又は（ｃ）その受容体に連結されるサイトカインに連結される。本明細書中に包含される免疫エフェクター細胞に対して何れの場合でも、この細胞は、第１の腫瘍抗原又は第２の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲ又は改変ＴＣＲ（又は天然ＴＣＲ）を含み得る。

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１つ以上の遺伝子産物をコードするように改変される１つ以上の非天然（組み換えであり得る）核酸を保有する。特定の実施形態では、細胞は、１つ以上の非天然（組み換えであり得る）発現ベクターを含み、このベクターは、１つ以上の特定の遺伝子産物をコードする１つ以上の発現コンストラクトを含み得る。この発現ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり得る。このベクターがウイルスベクターである場合、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。このベクターが非ウイルスベクターである場合、ベクターは、プラスミド、単離ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、トランスポゾン又は他の可動遺伝因子であり得る。特定の態様では、免疫エフェクター細胞中の１つのベクターは、分子アダプター及び抗原受容体をコードするが、他の事例では、分子アダプター及び抗原受容体は、異なるベクターから発現される。分子アダプター及び抗原受容体が異なるベクターから発現される場合、ベクターは同じタイプであってもよいし、又は同じでなくてもよい。

一実施形態では、（ａ）腫瘍細胞結合ドメインと、（ｂ）（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含むサイトカインドメインと、（ｃ）抗原受容体標的ドメインと、を含む抗原受容体を発現する細胞をリダイレクトするための分子アダプターがある。具体的な構成では、分子アダプター中のサイトカインドメインは、腫瘍細胞結合ドメインと抗原受容体ドメインとの間に位置する。上記のように、腫瘍細胞結合ドメインは、例えば、抗体、抗体断片又は非抗体足場及び、好ましい実施形態では、ｓｃＦｖである抗体断片を含み得る。具体的な事例では、腫瘍細胞結合ドメインは、あらゆる種類の腫瘍細胞の表面上で発現される抗原を標的とする。上記のように、サイトカインドメインは、例えば、ＩＬ７、ＩＬ１５又はＩＬ２１などの生存促進性サイトカインを含む、何らかのサイトカインを含み得る。分子アダプターに対する具体例では、サイトカインはＩＬ１５であり、及び／又はサイトカイン受容体はＩＬ１５Ｒ又はそのアルファサブユニット（ＩＬ１５Ｒａ）である。可溶性タンパク質の抗原受容体標的ドメインは、例えばＣＤ１９などの腫瘍抗原又はその機能断片を含み得る。具体的な実施形態では、本分子アダプターは、腫瘍細胞上の第１の抗原を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、第２の腫瘍抗原又はそれらの機能断片を含む抗原受容体標的ドメインと、を含む。本分子アダプターの腫瘍細胞結合ドメイン及び抗原受容体標的ドメインは、ヒンジ領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するものなど、好ましくはＩｇＧ４に由来するものにより連結され得る。

一実施形態では、本開示により包含される分子アダプターに対して向けられる抗原受容体がある。特定の事例では、抗原受容体は、例えばＴＣＲ（例えば細胞表面上のＭＨＣ抗原に関連する分子の場合）又はＣＡＲであり、分子アダプターの構成成分に結合する部分を含む。具体的な事例では、前記抗原受容体は、腫瘍抗原又はその機能断片などの分子アダプターの抗原受容体標的ドメインに結合する。代替的な事例では、抗原受容体は、抗原受容体標的ドメインではない分子アダプターの構成成分に結合する。

本開示の実施形態は、本開示により包含される分子アダプターをコードする発現ベクターを含み、これには、（ａ）腫瘍細胞結合ドメインと；（ｂ）サイトカインドメインと；（ｃ）抗原受容体標的ドメインと、を含む分子アダプターが含まれる。発現ベクターは、ウイルス性又は非ウイルス性であり得る。可溶性タンパク質をコードする発現ベクターがウイルス性である場合、それらは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴であり得る。この発現ベクターが非ウイルス性である場合、発現ベクターは、プラスミド、単離ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、トランスポゾン又は他の可動遺伝因子であり得る。特定の実施形態では、（ｉ）腫瘍細胞結合ドメインと、（ｉｉ）サイトカインドメインと、を含む分子アダプターをコードする発現ベクターがあり；この発現ベクターは（ｂ）抗原受容体をコードする。一部の例では、発現ベクターは、分子アダプターをコードし、同じベクター上の抗原受容体もコードする。このような場合、分子アダプターの発現及び抗原受容体の発現は、同じ調節領域（プロモーターなど）によって支配されてもよいし又は支配されなくてもよい。分子アダプター及び抗原受容体の発現が異なる調節領域によって調節される場合、それらの発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａ配列によって制御され得る。特定の事例では、ＩＲＥＳエレメント又は２Ａ配列は、分子アダプターと抗原受容体との間に位置する。少なくとも一部の事例では、ＣＡＲ（及び／又は改変ＴＣＲ）及び分子アダプター分子の両方が、レトロウイルスベクターなどのバイシストロン性又はトリシストロン性ベクターを使用して免疫エフェクター細胞において効果的に発現され得る。

特定の実施形態では、本開示で提供されるコンストラクトにおいて遺伝子の連結発現又は同時発現を生じさせるために、ある一定の２Ａ配列エレメントを使用し得る。例えば、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成させることにより、遺伝子を同時発現させるために、開裂配列を使用し得る。例示的な開裂配列は、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）又はＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）又は「２Ａ様」配列（例えばトーセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）又はブタテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）である。具体的な実施形態では、単一のベクターにおいて、複数の２Ａ配列は同一ではないが、代替的な実施形態では、同じベクターが２つ以上の同じ２Ａ配列を利用する。２Ａ配列の例は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許出願第２０１１／００６５７７９号明細書で提供される。

本開示の実施形態はまた、１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体を個別に発現する免疫エフェクター細胞；１つ以上の組み換えサイトカイン（ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２７、ＩＬ３３及び／又はＩＬ２１）又はその機能断片；及び（ｃ）１つ以上の組み換えサイトカイン受容体又はその機能断片も含む。本明細書中で使用される場合、「組み換え」という用語は、内因性ではなく、自然界で見られる細胞にとって天然ではない分子を指し；特に事例では（ｉｎｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｃａｓｅｓ）、それらは細胞に関してトランスジェニックであり、それらは、細胞中で一過性に発現されてもよいし、又はされなくてもよい。このような細胞は、組み換えサイトカインとサイトカイン受容体の間にリンカーなどの物理的接続を欠く個別の分子として、組み換えサイトカイン及びサイトカイン受容体を産生する。具体的な実施形態では、細胞中の１つ以上の改変抗原受容体は、非天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、これらの何れかが、何らかの腫瘍標的抗原、例えばＧＤ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ５６、ＣＤ２４、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＬ−２又はそれらの組み合わせなどを標的とし得る。ＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ及び／又はＯＸ４０同時刺激ドメインを含んでもよいし、又は含まなくてもよい。具体的な事例では、サイトカインはＩＬ１５であり、及び／又はサイトカイン受容体はＩＬ１５Ｒ又はそのアルファサブユニット（ＩＬ１５ＲＡ）である。

１つ以上の組み換えサイトカイン及び１つ以上の組み換えサイトカイン受容体を個別に産生又は発現するこれらのタイプの細胞では、１つ以上の構成成分が、同じ若しくは異なるベクター又はＲＮＡを含め、発現ベクター又はＲＮＡ上にあり得る。これらが同じベクター上にある場合、これらは２Ａ自己切断部位又はＩＲＥＳエレメントによって分離され得る。細胞とともに利用される何れのベクターも、ウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクター）又は非ウイルスベクター（プラスミド、トランスポゾンなど）であり得る。

接続されていない１つ以上の組み換えサイトカイン及び１つ以上の組み換えサイトカイン受容体を発現する免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、γδＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、マクロファージ、自然リンパ球（ＩＬ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞又はそれらの混合物を含む、何れかのタイプの免疫エフェクター細胞であり得る。

個体において癌を処置する方法は、サイトカイン及びサイトカイン受容体が個別に産生又は発現される免疫エフェクター細胞を利用し得、この方法において個体に治療的有効量のこの細胞が投与される。送達は何らかの方法によるものであり得るが、具体的な事例では、それは、腹腔内又は静脈内注射を含め、注射による。個体は、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法又はそれらの組み合わせなどのさらなる癌治療を受けている、受けた、及び／又は受けるものであり得る。

特定の実施形態では、発現ベクターを含む細胞、又は発現ベクターを含む複数の細胞がある。上記のように、細胞はあらゆる種類であり得るが、特定の実施形態では、細胞は免疫エフェクター細胞、好ましくはＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞又はそれらの混合物である。特定の個体に関する細胞は、自家又は同種であり得る。

本開示の実施形態は、本開示の１つ以上の組成物を含む１つ以上の医薬組成物を含む。特定の実施形態では、本医薬組成物は、本開示により包含される免疫エフェクター細胞（又はその複数）を含む。特定の実施形態では、本医薬組成物は、本開示により包含される分子アダプターを含む。いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、免疫エフェクター細胞及び分子アダプターを含む。少なくとも１つの事例では、分子アダプター及び／又は標的抗原に対する抗原受容体をコードする発現ベクターを含む免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物がある。医薬組成物が本明細書中に記載のような複数の免疫エフェクター細胞を含む場合、この医薬組成物は、１×１０^７／ｍ^２〜１×１０^９／ｍ^２などの一定量の免疫エフェクター細胞を含み得る。本医薬組成物が分子アダプターを含む場合、本組成物は、例えば、１０ｐｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬなどの一定量の分子アダプターを含むように処方され得る。

一実施形態では、免疫エフェクター細胞があり、この細胞は、（１）第１の腫瘍抗原又は第２の腫瘍抗原を標的とする抗体（ｓｃＦｖなど）又はそれらの機能断片であり、この抗体が（ａ）１つ以上のサイトカイン又は（ｂ）１つ以上のサイトカイン受容体又は（ｃ）その受容体に連結されるサイトカインに連結されるもの；又は（２）第１の腫瘍抗原を標的とする抗体又はそれらの機能断片であり、抗体−第２の腫瘍抗原複合体として第２の腫瘍抗原に連結され、この複合体が（ａ）サイトカイン又は（ｂ）サイトカイン受容体又は（ｃ）その受容体に連結されるサイトカインに連結されるものを産生する。少なくとも一部の例では、細胞は、第１の腫瘍抗原又は第２の腫瘍抗原を標的とするＴＣＲ及び／又はＣＡＲを含む。具体的な実施形態では、（１）又は（２）は、そこにおいて発現ベクターから産生される。発現ベクターは、ウイルスベクター（少なくともレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターを含む）又は一部の例では非ウイルスベクターである。免疫エフェクター細胞がＣＡＲを発現する場合、ＣＡＲは１個、２個、３個又はそれを超える同時刺激ドメインを含み得る。（２）の実施形態に対する一部の例では、第２の腫瘍抗原の全て又は機能的な部分は、第２の腫瘍抗原の細胞外ドメインを含む。（２）の実施形態に対する一部の例では、第１の腫瘍抗原及び第２の腫瘍抗原を標的とする抗体又はその機能断片は、ヒンジ領域（ＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４など）によって連結される。特定の免疫エフェクター細胞の実施形態の一部の例では、サイトカインは、ＩＬ１５、ＩＬ７又はＩＬ２１などの生存促進性サイトカインである。

ある実施形態では、免疫エフェクター細胞があり、この細胞は、（ａ）１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体；（ｂ）１つ以上の組み換えサイトカイン又はそれらの機能断片；及び（ｃ）１つ以上の組み換えサイトカイン受容体又はそれらの機能断片を個別に産生する。本明細書中で定義されるように、「個別に産生する」とは、例として、（１）個別の転写産物として（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のそれぞれをコードし、次にそれらが個別に翻訳されること；（２）例として、単一の転写産物として（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）をコードし、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を互いから分離する単一転写産物上のＩＲＥＳエレメントにより、そこから（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質が個別のタンパク質として産生されること；又は（３）例として、単一の転写産物として（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）をコードし、それが単一タンパク質に翻訳されるが、個別のタンパク質として（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を産生するために切断が生じる２Ａ自己切断ペプチドにより（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）がそれぞれ分離されることのうち１つを指す。例えば（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のうち２つのみが同じベクター上にある場合、同じ機序を利用し得る。具体的な実施形態では、免疫エフェクター細胞に対する組み換えサイトカインは、細胞から分泌されるようになる。ある一定の実施形態では、組み換えサイトカイン受容体は、細胞上で膜結合型になる。一部の例では、ＣＡＲ、分泌可能なサイトカイン及び対応する膜結合サイトカイン受容体を個別に発現するコンストラクトを用いてこの細胞に対して形質導入が行われる。ＣＡＲコンストラクトのｓｃＦｖは、関心のある腫瘍抗原に結合し得、免疫エフェクター細胞内部で活性化及び同時刺激シグナルを伝播させる。膜結合型サイトカイン受容体は、免疫エフェクター細胞表面で分泌されたサイトカインを捕捉し得、サイトカイン−サイトカイン受容体複合体が一緒になって、ＩＬ２Ｒβ／γサイトカインシグナル伝達複合体に結合するなどの作用を生み出す。ＩＬ２Ｒβ／γを介したシグナル伝達の活性化は、ＩＬ−１５が単独で提示される場合よりもＩＬ−１５Ｒａとの複合体においてＩＬ−１５が提示される場合の方がはるかに効率的である。

ある実施形態では、（１）第１の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲをコードする第１の配列と；（２）１つ以上の生存促進性サイトカイン（例えばＩＬ１５、ＩＬ７又はＩＬ２１）、生存促進性サイトカイン受容体、１つ以上の生存促進性サイトカインと生存促進性サイトカインに対する受容体との間の融合物又はこれらの組み合わせ及び次のうち１つ：（ａ）第１又は第２の腫瘍抗原を標的とする抗体又はそれらの機能断片（ｓｃＦｖなど）；又は（ｂ）第２の腫瘍抗原を標的とする抗体又は機能断片に融合される第１の腫瘍抗原の全て又は機能的部分をコードする第２の配列と、を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含む系がある。実施形態（２）の分子アダプターでは、エレメント（ｂ）は、エレメント（ｃ）の融合に対して近位であり得る。実施形態（２）の分子アダプターでは、エレメント（ｂ）は、融合エレメント（ｃ）に隣接している。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクター）又は非ウイルスベクターを含む発現ベクターとしてさらに定義される。ＣＡＲは、１、２若しくは３個又はそれを超える同時刺激ドメインを含み得る。一部の例では、第１の腫瘍抗原の全て又は機能的な部分は、第１の腫瘍抗原の細胞外ドメインを含む。一部の例では、（ａ）第２の腫瘍抗原を標的とする抗体又はその機能断片及び（ｂ）第１の腫瘍抗原の全て又は機能的部分はヒンジ領域（ＣＤ８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来など）によって連結される。一部の例では、このポリヌクレオチドは、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はＴ細胞などの免疫エフェクター細胞で発現される。

ある一定の実施形態では、（１）１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体をコードする第１の配列と；（２）１つ以上の組み換えサイトカイン又はそれらの機能断片をコードする第２の配列と；（３）１つ以上の組み換えサイトカイン受容体又はそれらの機能断片をコードする第３の配列と、を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む系がある。このような系では、第１、第２及び第３の配列が同じポリヌクレオチド分子上にある場合、それらの発現が個別に調節されるとき、互いに対するそれらの配置はあらゆる構成であり得る。第１、第２及び第３の配列が同じポリヌクレオチド分子上にあり、それらのうち２つ以上の発現が同じエレメントによって調節される場合、互いに対するそれらの配置は特異的な構成であり得る。例えば、同じポリヌクレオチドベクター上にある場合、少なくとも第２及び第３の配列の発現は、生成される分子の実質的に均一な比率が存在する可能性を高めるために、同じ調節エレメントによって調節され得る。この系の特定の実施形態では、第１、第２及び第３の配列が同じポリヌクレオチド分子上にあるか否かにかかわらず、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクター）又は非ウイルスベクターを含む発現ベクターとしてさらに定義される。改変抗原受容体がＣＡＲである場合、ＣＡＲは、１個、２個若しくは３個又はそれを超える同時刺激ドメインを含み得る。何れの同時刺激ドメインも有用であるが、具体的な事例では、同時刺激ドメインは４−１ＢＢである。特定の事例では、この系のポリヌクレオチドは、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はＴ細胞などの免疫エフェクター細胞において発現される。

例示的な実施形態として、細胞表面上でＣＡＲ１９を発現し、ＧＤ２．ＣＤ１９アダプターを分泌するコンストラクトを用いてＮＫＴ細胞に対して形質導入を行う。分泌される分子アダプターは、ＣＤ１９陰性でＧＤ２陽性であるがＧＤ２陰性ではない腫瘍細胞をＣＤ１９陽性腫瘍細胞に変換するのに十分である。ＣＡＲ１９は抗ＧＤ２．ＣＤ１９アダプターに結合し、次に腫瘍細胞上で発現されるＧＤ２に結合する。そうすることにおいて、ＣＡＲ１９及び抗ＧＤ２．ＣＤ１９アダプターを発現するＮＫＴ細胞は、インビトロ又はインビボでＧＤ２陽性腫瘍細胞を効果的かつ特異的に死滅させる。一部の例では、ＣＡＲ１９及び抗ＧＤ２．ＣＤ１９アダプターを発現するＮＫＴ細胞によるＧＤ２陽性腫瘍細胞のインビトロでの死滅に対してＩＬ１５もＩＬ１５Ｒも必要ではないが、他の事例では、ＩＬ１５及び／又はＩＬ１５Ｒが利用される。しかし、特定の実施形態では、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒ融合を伴い、ＣＡＲ１９及び抗ＧＤ２．ＣＤ１９アダプターを発現するＮＫＴ細胞は、例として、マウスにおけるＧＤ２陽性神経芽細胞腫を含むＧＤ２陽性癌に対して強力な治療活性を有する。少なくとも一部の例では、ＩＬ１５及び／又はＩＬ１５Ｒのない分子アダプターはインビボで効果がない。

他の例示的な実施形態では、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒは、定められる配向でリンカーを介して接続され、分子アダプターコンストラクトにおいて標的抗原（例えばＣＤ１９）に融合され、ＣＡＲ１９ＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞表面上で分子的に近接近して（ｃｌｏｓｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）、ＣＡＲを介してＣＤ１９を認識し、共通のＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβγ受容体を介してＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ複合体を認識する。同様に、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒは個別の分子として発現され得る。

一例として、細胞表面上でＣＡＲＧＤ２及びＩＬ１５Ｒａを発現させ、ＩＬ１５を分泌するコンストラクトを用いてＮＫＴ細胞に対して形質導入を行う。ＣＡＲのｓｃＦｖ（特定の事例では同時刺激ドメインとして４−１ＢＢを有する）はＧＤ２に結合し、それによってＮＫＴ細胞内部で活性化及び同時刺激シグナルを伝播させ、その結果、ＧＤ２陽性癌細胞が死滅する。膜結合ＩＬ１５Ｒａは可溶性ＩＬ１５に結合し、複合体としてそれらがＩＬ２Ｒβ／γサイトカインシグナル伝達複合体と結合する。他の実施形態では、他のサイトカイン−サイトカイン受容体が利用され、他の癌抗原は、ＣＡＲにより標的化される。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ１９を標的とする腫瘍細胞結合ドメイン及びサイトカインドメインとしてＩＬ１５を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ１９を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａと、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ１９を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしての、ＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａ、に連結されるＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ２４を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ２４を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ２４を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａと、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ２４を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ２４を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしての、ＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａ、に連結されるＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ２４を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ５６を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ５６を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ５６を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａと、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ５６を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ５６を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしての、ＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａ、に連結されるＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ５６を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ２２を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ２２を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ２２を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａと、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ２２を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＣＤ２２を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしての、ＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａ、に連結されるＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＣＤ２２を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＢＣＭＡを標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＢＣＭＡを標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａと、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＢＣＭＡを標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしての、ＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａ、に連結されるＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＧＤ２を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＧＤ２を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＧＤ２を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしてのＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａと、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＧＤ２を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本分子アダプターは、ＧＤ２を標的とする腫瘍細胞結合ドメインと、サイトカインドメインとしての、ＩＬ１５Ｒ、より好ましくはＩＬ１５Ｒａ、に連結されるＩＬ１５と、を含む。その好ましい実施形態では、腫瘍細胞結合ドメインは、ＧＤ２を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、このような分子アダプターは、本明細書中に記載のような抗原受容体標的ドメインをさらに含む。

一般的な実施形態
本明細書中では、分子アダプターアプローチを使用して、ある腫瘍抗原、ＣＤ１９に対する有効なＣＡＲを発現するように改変された免疫エフェクター細胞（例としてＮＫＴ細胞）が別の抗原、ＧＤ２を発現する腫瘍細胞に対して効果的にリダイレクトされ得ることを示す。分子アダプターは、ＧＤ２（抗ＧＤ２．ＣＤ１９）に特異的なｍＡｂ由来のＣＤ１９細胞外ドメイン及びｓｃＦｖの融合物を含む。ＣＡＲ１９及び抗ＧＤ２．ＣＤ１９アダプターを含有するコンストラクトで形質導入したＮＫＴ細胞は、細胞表面上でＣＡＲ１９を発現し、分子アダプターを分泌する。分泌される分子アダプターは、ＣＤ１９陰性でＧＤ２陽性であるがＧＤ２陰性ではない神経芽細胞腫細胞をＣＤ１９陽性細胞に変換し、ＧＤ２陽性腫瘍細胞に対するＣＡＲ１９ＮＫＴ細胞のインビトロ細胞傷害性を可能にするのに十分である。分子アダプター（ＣＤ１９）の抗原部分をＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒａと融合させ、リンカーを介して定められる配向で接続し、抗原−サイトカイン複合体を形成させることを介して、インビボでのさらにより強力な抗腫瘍活性が達成された。さらに、抗ＧＤ２．ＣＤ１９アダプターとは別に、ＣＡＲ１９ＮＫＴ細胞によるＩＬ−１５又はＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ複合体の分泌は、分子アダプター単独と比較して、インビボでの抗腫瘍活性を顕著に促進しなかった。従って、分子アダプターがインビボで有効であるためには、少なくともいくつかの実施形態におけるＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒａ又はＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ複合体又は同様の生存促進性サイトカイン（分子）が抗原結合ドメインに連結されなければならず、それによって腫瘍細胞表面上の標的抗原と同時に提示され得るようになる。これにより、ＣＡＲ発現エフェクター細胞が、腫瘍細胞表面上の分子的近接近において標的抗原及びサイトカインを認識することが可能になる。腫瘍特異的ＣＡＲを発現させるために、及び融合サイトカインとともに標的腫瘍抗原を送達するために免疫エフェクター細胞を改変するというこの実施形態は新規であり、神経芽細胞腫のインビボモデルにおいて有効であり、固形腫瘍及び他の癌並びに非癌性疾患を含む疾患の免疫療法に広く適用可能である。

これらの結果は、本明細書に記載の分子アダプターアプローチを使用して、ＣＤ１９などの１つの抗原に対するＣＡＲなどの抗原受容体を発現するように改変されたＮＫＴ細胞などの免疫エフェクター細胞が、例えばＧＤ２などの腫瘍抗原といった別の抗原に対して効果的にリダイレクトされ得ることを裏付ける。

この証拠により、エフェクター細胞に対する、ＣＡＲ認識のための標的抗原（シグナル−１及び−２を提供する）及び生存促進性サイトカイン（シグナル−３）の同時提示が、同じ腫瘍細胞表面から提示が起こり得る場合、固形腫瘍の効果的なＣＡＲ介在免疫療法を可能にするのに有用であることが示される。発明者らは、送達ビヒクルとして特異的な抗ＧＤ２．ＣＤ１９アダプター及びサイトカインとしてのＩＬ−１５．ＩＬ１５Ｒを使用して腫瘍細胞表面上でこのような提示を達成したが、一方で、同様に又はさらにより効果的な結果が次の方法で達成され得ると考えられた：

１）送達ビヒクルとしての抗ＧＤ２．ＣＤ１９アダプターは、一部の正常組織でも発現される場合でも、腫瘍細胞上で高度に発現している抗原を直接標的とするｓｃＦｖで置き換え得る（ＣＡＲ／ＴＣＲ標的のないサイトカインの認識は細胞傷害性を引き起こすとは予想されない）。神経芽細胞腫の場合、このような抗原としては、例えばＣＤ５６、ＣＤ２４、ＣＤ１７１及び／又はＨ７−Ｂ３が挙げられる。このようなｓｃＦｖは、ＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒａ又はＩＬ１５．ＩＬ−１５Ｒａ（例として）、又はこれらの組み合わせに融合され、同じ腫瘍細胞上のＣＡＲ（例えばＣＡＲＧＤ２）リダイレクト免疫細胞によって認識される同様の分子アダプターを達成する。ＮＫＴ細胞における発現のためのこのようなコンストラクトは、例えば、神経芽細胞腫モデルにおいて利用され得る。

２）ＩＬ１５又はＩＬ１５Ｒａは、例えば、他の生存促進性サイトカイン又はサイトカイン受容体、例えばＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３又はＩＬ−２１など、並びにそれらの個々の受容体で置き換え得る。

３）いくつかの実施形態では、抗原受容体発現免疫エフェクター細胞によって発現させ、分泌させようとする分子アダプターを改変する代わりに、このような分子アダプターは、何らかのＣＡＲ／ＴＣＲ細胞療法と組み合わせて全身送達のための融合タンパク質として予め作製され得る。例えば、上記の項目１に記載のものと同じ抗原を標的とするｍＡｂを、ＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒａ又はＩＬ１５−ＩＬ１５−Ｒａ（又は項目２のような別のサイトカイン）と融合させ得、固形腫瘍を含む癌の何らかの養子免疫療法と組み合わせて既製の治療法として使用され得る。

ＩＩ．免疫エフェクター細胞を産生し、癌治療を適応させる方法

本明細書中に包含される免疫エフェクター細胞は、少なくとも、特定の抗原を標的とする改変抗原受容体（ＴＣＲ又はＣＡＲなど）を発現するようにそれらが改変されるので、及び／又は上記のような分子アダプターを作製するためにそれらが改変されるので、非天然である。免疫エフェクター細胞は、少なくとも一部の例では、標準的な組み換え技術によって改変され得る。

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、それを必要とする個体に送達する前に遺伝子修飾され得る。免疫エフェクター細胞は、ＴＣＲ刺激及び同時刺激後に修飾され得；特定の実施形態では、遺伝子修飾は、刺激後１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２日又はそれ以上の日数以内に起こる（及びこれは、形質導入のタイプ及び使用されるエフェクター細胞のタイプに依存し得；例えば、レトロウイルスベクターを用いると、Ｔ細胞の場合は２日以内、ＮＫＴ細胞の場合は７〜９日以内であり得る）。

免疫エフェクター細胞の遺伝子修飾は、人為的に行われ得、特定の実施形態では、遺伝子修飾によって、その細胞が、例えば、特定の抗原を発現する癌細胞などの１つ以上の癌細胞を特異的に標的とすることが可能になる。具体的な実施形態では、修飾によって、ある一定の癌抗原に対する特定の非天然受容体とともに免疫エフェクター細胞が提供される。

特定の事例では、免疫エフェクター細胞は、キメラ及び／又は非天然であり、少なくとも部分的に人為的に改変され、関心のある特定の癌抗原に向けられるＣＡＲ又はＴＣＲを含む。

本開示のあらゆる治療方法では、癌の細胞は、免疫エフェクター細胞上のある一定の抗原受容体が向けられ得る抗原の発現の欠如など、特定の腫瘍抗原の発現を欠き得る。このような場合、分子アダプターは、腫瘍細胞に結合し得る構成成分及び免疫エフェクター細胞に結合し得る構成成分を含むので、腫瘍細胞を免疫エフェクター細胞と架橋する。従って、本分子アダプターは、分子アダプターがある一定の免疫エフェクター細胞に結合する構成成分を有するという点である一定の免疫エフェクター細胞に対応する限り、ある一定の免疫エフェクター細胞を広く使用することを可能にし得る。一例では、第１の腫瘍抗原に結合する抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞の抗原受容体に結合する少なくとも１つの構成成分を有する様々な交換可能な分子アダプターとともにそれらが使用されるので、あらゆるタイプの癌とともに広く産生され、使用され得；このよう場合、本分子アダプターは、関心のある癌の第２の抗原に結合する第２の構成成分を有する。

本開示は、意図されるレシピエント癌細胞上で発現される抗原のタイプに関係なく、ありとあらゆるタイプの癌に広く適用しようとする、あるタイプの養子免疫療法を適応させるための方法を包含する。このような方法は、特定の抗原を標的とし、これらの細胞を修飾して、その特定の抗原以外の抗原を発現する癌に対する免疫エフェクター細胞の使用を可能にする分子アダプターを作製する、上記のような人工抗原受容体を発現する、既存の、調製された免疫エフェクター細胞を利用する。実際には、第１の抗原を標的化するように改変された細胞を、第２の非同一抗原を発現する腫瘍細胞と架橋するために、免疫エフェクター細胞によって産生され、二特異性標的化部分を有する分子アダプターを使用する。代替的な事例では、第１の抗原を標的とする人工抗原受容体（例えばＣＡＲ又はＴＣＲ）を発現する調製された免疫エフェクター細胞が、組み換え型であり（即ち免疫エフェクター細胞それ自体により産生されない）、第２の非同一抗原を発現する腫瘍細胞と第１の抗原を標的とするように改変された免疫エフェクター細胞を架橋する２特異性標的化部分を有するタンパク質と組み合わせて使用される。

従って、本開示の実施形態は、（ａ）第２の腫瘍抗原を標的とする非天然抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞又はその複数を提供又は入手する工程と；（ｂ）第１の腫瘍抗原に結合する腫瘍細胞結合ドメイン及び第２の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体に結合する抗原受容体標的ドメインを含む分子アダプターを提供又は入手する工程と、を含み、任意選択により、本分子アダプターが（ｉ）サイトカイン若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉ）サイトカイン受容体若しくはそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含み、工程（ｂ）での分子アダプターを提供又は入手することが、処置されている癌の癌細胞における第１の抗原の発現の存在により決定される、第１の腫瘍抗原を発現する癌に癌治療を適応させる方法を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、上記のような精製分子アダプターを個体に投与する工程を含む。

本開示の実施形態は、（ａ）第２の腫瘍抗原を標的とする非天然抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞又はその複数を提供又は入手する工程と；（ｂ）（１）第１の抗原を標的とする１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインと（２）（ｉ）１つ以上のサイトカイン又はそれらの機能断片；又は（ｉｉ）１つ以上のサイトカイン受容体又はそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含む１つ以上のサイトカインドメインとを含む分子アダプターをコードするポリヌクレオチドを用いてこの細胞に対してトランスフェクションを行う工程と、を含む、第１の腫瘍抗原を発現する癌に癌治療を適応させる方法を含む。

ＩＩＩ．免疫エフェクター細胞の使用方法

実例として、癌を有する個体又は癌に罹患し易いか若しくは癌を有する疑いのある個体並びに癌以外の疾患を有する個体又は癌以外の疾患に罹患し易いか若しくは癌以外の疾患を有する疑いのある個体を本明細書に記載のように処置し得る。本明細書中に記載のように修飾された免疫エフェクター細胞が個体に投与され、長期間保持され得る。個体は、細胞の１回以上の投与を受け得る。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、免疫認識を阻害するために封入され、腫瘍部位又は患部に配置される。

様々な実施形態では、発現コンストラクト、核酸配列、ベクター、宿主細胞及び／又はそれらを含む医薬組成物は、腫瘍性疾患などの癌性疾患を含む疾患の予防、処置又は改善のために使用される。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、癌など、及び固形腫瘍を有する癌を含め、疾患を予防、改善及び／又は処置するのに特に有用であり得る。

本明細書中で使用される場合、「処置」又は「処置すること」は、疾患又は病的状態の症状又は病態に対する何らかの有益又は所望の効果を含み、例えば癌など、処置されている疾患又は状態の１つ以上の測定可能なマーカーの僅かな低下さえ含み得る。処置は、任意選択により、疾患若しくは状態の症状の軽減若しくは改善、又は疾患若しくは状態の進行の遅延の何れかを含み得る。「処置」は、疾患若しくは状態又はそれらの付随症状の完全な根治又は治癒を必ずしも示さない。

本明細書中で使用される場合、「予防する」及び、「予防される」、「予防すること」などの同様の語は、疾患又は状態、例えば癌の発生又は再発の可能性を阻止する、阻害する、又は低下させるためのアプローチを示す。それはまた、疾患若しくは状態の発症若しくは再発を遅らせること、又は疾患若しくは状態の症状の発生若しくは再発を遅らせることも指す。本明細書中で使用される場合、「予防」及び同様の語はまた、疾患又は状態の発症又は再発の前に、疾患又は状態の強度、影響、症状及び／又は負担を軽減することも含む。

特定の実施形態では、本開示は、部分的に、単独で又は別の治療との何らかの組み合わせの何れかで、及び少なくともいくつかの態様では、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と一緒に投与され得る、発現コンストラクト、核酸分子及び／又はベクター及び／又は精製分子アダプターを保有する細胞を企図する。特定の実施形態では、細胞の投与の前に、前記核酸分子、ベクターを細胞のゲノムに安定して組み込み得る（例えばＣＲＩＳＰＲ法を使用）。具体的な実施形態では、ある一定の細胞又は組織に特異的であり、その細胞内で存続するウイルスベクターを使用し得る。適切な医薬担体及び賦形剤は当技術分野で周知である。本開示に従って調製した組成物は、上記で特定される疾患の予防又は処置又は遅延のために使用され得る。

さらに、本開示は、それを必要とする対象に、抗原受容体を保有する改変細胞の有効量を投与する工程を含む、疾患、例えば癌性（腫瘍性を含む）疾患などの予防、処置又は改善のための方法に関し、任意選択により、分子アダプターは、本明細書中に記載されており、本明細書中で企図されるような、及び／又は本明細書中で企図されるような工程により作製される、化学療法耐性分子、それらをコードする核酸配列、それらをコードするベクターである。

例示的な修飾免疫細胞の組成物の投与についての可能な適応症は、腫瘍性疾患を含む癌性疾患などの疾患である。具体例は、神経芽細胞腫、髄芽腫、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、メラノーマ、膀胱癌、肺癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、リンパ系の造血器腫瘍、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、甲状腺癌、甲状腺濾胞性癌、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉起源の腫瘍、線維肉腫、横紋筋肉腫、メラノーマ、ブドウ膜メラノーマ、奇形腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、皮膚の良性腫瘍、腎臓癌、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮癌、肝細胞癌、濾胞性樹状細胞癌、胆管癌、胆嚢癌、腸癌、筋肉浸潤癌、精嚢腫瘍、表皮癌、脾臓癌、膀胱癌、頭頸部癌、生殖器尿路の癌、腎臓癌、胃癌、小腸の癌、胃癌、肝臓癌、骨癌、脳癌、網膜癌、胆道癌、小腸癌、唾液腺癌、子宮癌、睾丸癌、結合組織癌、前立腺肥大、骨髄異形成、ワルデンストレームマクログロビナエミア（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓｍａｃｒｏｇｌｏｂｉｎａｅｍｉａ）、鼻咽頭、神経内分泌癌骨髄異形成症候群、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃、卵管癌、腹膜癌、乳頭状漿液性ミュラー管癌、悪性腹水、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）及びリー・フラウメニ症候群及びフォンヒッペル・リンドウ症候群（ＶＨＬ）から選択される遺伝性癌症候群であるが限定されない。

細胞の組成物の投与に対する例示的な適応症は、例えば、特定の抗原を発現する何らかの悪性腫瘍を含む、癌性疾患などの何らかの疾患である。さらに、他の腫瘍抗原を異常に発現する悪性腫瘍も含まれ、それらも標的となり得る。本開示の組成物の投与は、例えば、最小残存疾患、早期癌、進行癌及び／又は転移性癌及び／又は難治性癌を含む、全てのステージ及びタイプの癌に有用である。

本開示は、他の化合物、例えば、免疫細胞を介して作用する、二特異性抗体コンストラクト、標的化される毒素又は他の化合物との同時投与プロトコールをさらに包含する。本発明の化合物の同時投与のための臨床レジメンは、他の構成成分の投与と同時の、その前及び／又は後での、同時投与を包含し得る。特定の併用療法としては、化学療法、放射線照射、外科手術、ホルモン療法又は他のタイプの免疫療法が挙げられる。

実施形態は、本明細書中に記載のような１つ以上の免疫エフェクター細胞、本明細書に記載のような核酸配列、本明細書に記載のようなベクター、本明細書に記載のような精製分子アダプター及び／又は本明細書に記載のような宿主を含むキットに関する。本開示のキットは、単独で、又は医学的処置若しくは介入を必要とする個体に投与しようとするさらなる薬剤と組み合わせて、本明細書中で上に記載のような医薬組成物を含むことも企図される。

コンストラクトで修飾されている免疫エフェクター細胞を選択的条件下において培養中で増殖させ得、次にコンストラクトを有するものとして選択される細胞を増殖させ、例えば宿主細胞におけるコンストラクトの存在を判定するためにポリメラーゼ連鎖反応又はフローサイトメトリーを使用してさらに分析し得る。修飾宿主細胞を同定したら、次にそれらを計画どおりに使用し得、例えば、培養において増殖させ得るか、又は宿主生物に導入し得る。

細胞の性質に応じて、細胞は、多岐にわたる方法で、宿主生物、例えば哺乳動物に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は腫瘍の部位に導入され得るが、代替的な実施形態では、細胞は癌に向かって進むか又は癌に向かって進むように修飾される。使用される細胞の数は、多くの状況、導入目的、細胞の寿命、使用しようとするプロトコール、例えば多くの投与、細胞の増殖能、組み換えコンストラクトの安定性などに依存する。細胞は分散液として適用され、一般に関心のある部位又はその近くに注射されるか、又はそれらは、血流に、又は腹腔に（例として）、又は何らかの他の適切な部位に注射又は注入され得る。この細胞は、生理学的に許容可能な培地中にあり得る。

ＤＮＡ導入は、全ての場合において組み込みをもたらす必要はない。いくつかの状況では、導入されるＤＮＡを一時的に維持するだけで十分であり得る。このようにして、細胞が宿主に導入され、次に例えば、細胞が特定の部位に向かって進むことができた後、所定の時間後にオンになり得るという、短期的効果を有し得る。

必要に応じてこの細胞を投与し得る。所望の応答、投与方法、細胞の寿命、存在する細胞数に応じて、様々なプロトコールを使用し得る。投与回数は、少なくとも部分的には上記の要因に依存する。

本開示の実施形態は、本開示により包含される何らかの１つ以上の組成物の有効量を個体に提供することによって、個体においてあらゆる種類、ステージ及びタイプの癌を処置する方法を包含する。癌は、原発性、転移性、難治性、再発性などであり得る。具体的な実施形態では、癌は、乳房、脳、肺、結腸、皮膚、肝臓、腎臓、胃、脾臓、膵臓、前立腺、卵巣、子宮内膜、精巣、血液、骨などの癌である。本明細書中に包含される１つ以上の組成物で処置される個体は、本開示の治療への曝露の前に１つ以上の治療を受けていてもよいし、又は受けていなくてもよい。特定の実施形態では、治療的有効量の免疫エフェクター細胞が、癌を有する個体に提供される。個体は、細胞学的、組織学的など、何らかの適切なタイプの方法によって癌を有すると診断されている者であり得、個体の１つ以上の試料からのＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の分析を含み得る。具体的な事例では、診断としては、体液又は組織中（例えば血液、尿、精液及び／又は脳脊髄液中）の１つ以上の特定の化合物に対する１つ以上のアッセイ、画像検査、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン及び／又は具体的な事例では骨髄穿刺を含む生検が挙げられ得る。

本開示の一部の例では、免疫エフェクター細胞の投与は全身性であり、一部の例では、投与は非経口であり得る。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は腫瘍に局所的に投与される。

本開示の実施形態は、抗原の細胞外ドメインと腫瘍細胞によって発現される抗原に特異的なｓｃＦｖとの融合を含む分子アダプターを介して抗原リダイレクト免疫エフェクター細胞に対して感受性にされる抗原陰性腫瘍を含む。

固形腫瘍の抑制性微小環境に対抗するための一実施形態では、腫瘍組織における免疫エフェクター細胞の生存及び機能を支持するために、分子アダプターは、ＩＬ１５単独及び／又はＩＬ１５Ｒａ（ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２７又はＩＬ３３も含むサイトカインの例として）と連結され得るか又は同時発現され得る。

一実施形態では、個体において癌を処置する方法があり、本開示の治療的有効量の免疫エフェクター細胞が、癌を有する個体に投与される。このような実施形態では、免疫エフェクター細胞は、本明細書中に記載のような分子アダプターを分泌する。免疫エフェクター細胞は、個体に１回又は２回以上投与し得る。免疫エフェクター細胞が個体に複数回投与される場合、投与間の時間間隔は、１〜２４時間、１〜７日、１〜４週間、１〜１２か月又は１年以上の桁を含む、何らかの適切な時間であり得る。一部の例では、同じ分子アダプター及び／又は抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞が、複数回の投与時に個体に投与される。他の事例では、第１の分子アダプター及び／又は第１の抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を１回の投与で投与し、第２の分子アダプター及び／又は第２の抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞をその後の細胞の投与で投与する。

一実施形態では、１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインと、１つ以上のサイトカインドメインと、１つ以上の抗原受容体標的ドメイン（抗原の一部又は全てなど）とを含む本明細書中に記載のような治療的有効量の分子アダプターを投与すること、及びまた本開示の抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞など、１つ以上の抗原受容体を発現する治療的有効量の細胞を投与することも含む、個体において癌を処置する方法がある。このような場合、分子アダプターは、分子アダプターのインビボ産生のために個体に投与される細胞によって産生されることなく、個体に提供される。このように、本開示の方法は、分子アダプターを含む医薬組成物の投与と組み合わせた養子免疫療法を包含する。一部の例では、分子アダプターの投与及び１つ以上の抗原受容体を発現する細胞の投与が同時に行われるが、他の事例では投与が異なる時間に行われる。分子アダプター及び１つ以上の抗原受容体を発現する細胞の投与が同時に行われる場合、投与は同じ投与経路であってもよいし、又は同じでなくてもよい。分子アダプター及び１つ以上の抗原受容体を発現する細胞の投与が異なる時間に行われる場合、投与は同じ投与経路であってもよいし、又はそうでなくてもよい。分子アダプター及び１つ以上の抗原受容体を発現する細胞の投与が異なる時間に行われる場合、それらの投与間の時間間隔は、１〜６０秒、１〜６０分、１〜２４時間、１〜７日、１〜４週間、１〜１２か月又は１年以上の桁であり得る。少なくとも一部の例では、１つ以上の抗原受容体が標的とされる抗原は、抗原受容体標的ドメインと同じ抗原である。特定の実施形態では、抗原受容体が標的とされる抗原は、処置しようとする腫瘍細胞上の抗原とは異なる抗原である。

いくつかの実施形態では、（ａ）腫瘍細胞上の第１又は第２の抗原を標的とする１つ以上の腫瘍細胞結合ドメイン（ｓｃＦｖを含め、抗体断片など）と（ｂ）１つ以上のサイトカインドメインとを含む治療的有効量の分子アダプターを投与すること及び腫瘍細胞上の少なくとも第１の抗原に対する１つ以上の抗原受容体を発現する治療的有効量の細胞を投与することを含む、個体において癌を処置する方法がある。このような場合、本開示の方法は、個体に提供される細胞によってインビボで産生されることなく、１つ以上の分子アダプターの投与と組み合わせた養子免疫療法を包含する。

分子アダプターが、個体中でインビボで産生されることなく、それを必要とする個体に投与される場合、分子アダプターは、例えば、皮下、腹腔内又は静脈内注射によって投与され得る。免疫エフェクター細胞が個体に提供される場合、この細胞は、例えば、腹腔内又は静脈内注射によって投与され得る。可溶性タンパク質は、個体に１回又は複数回送達され得る。個体への可溶性タンパク質の複数回投与を行う場合、その後の投与は、以前の投与と同じ可溶性タンパク質であってもよいし、又は同じでなくてもよい。

本開示の何らかの治療法では、治療を受ける個体は、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ホルモン療法又はそれらの組み合わせなどのさらなる癌治療を受けている、受けた、及び／又は受けるものであり得る。

ＩＶ．細胞全般的

上で概説したように、本開示の免疫エフェクター細胞としては、少なくともＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、γδＴ細胞、マクロファージ、幹細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、ＩＬ細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞又はそれらの混合物が挙げられる。一部の例では、本明細書中に記載の免疫エフェクター細胞は、１つ以上の同時刺激剤、並びにそれ自体が人工抗原提示細胞である特定の同時刺激剤（これは、抗原提示細胞活性を有する非天然細胞と呼ばれ得る）によって同時刺激されている。免疫エフェクター細胞は、個人でそれらを使用する前、及び分子アダプターを産生するか、又は１つ以上の改変抗原受容体を発現するようにそれらを改変する前にも、ＴＣＲ刺激及び同時刺激に供され得る。

本開示の特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、処置されている個体からの細胞に由来する（自己由来である）が、この細胞は別の１つ以上の個体に由来し得る（同種異系）。

異種核酸配列を発現する文脈において、「宿主細胞」は、原核細胞又は真核細胞を指し得、これは、ベクターを複製すること、及び／又はベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することが可能な何らかの形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして、使用され得、使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクション」、「形質導入」、「形質転換」、「エレクトロポレーション」され得るか、又は外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入される何らかの他の工程に供され得る。改変される細胞には、主要な対象細胞及びその子孫が含まれる。本明細書中で使用される場合、「改変」及び「組み換え」細胞又は宿主細胞という用語は、例えば、ベクターなどの外因性核酸配列が導入されている細胞を指すものとする。従って、組み換え細胞は、組み換え導入された核酸を含有しない天然の細胞と区別可能である。

特定の実施形態では、ＲＮＡ又はタンパク質性配列は、同じ宿主細胞において他の選択されたＲＮＡ又はタンパク質性配列と同時発現され得ることが企図される。同時発現は、２つ以上の異なる組み換えベクターを宿主細胞に導入することによって達成され得る。或いは、ＲＮＡに対する複数の異なるコード領域を含めるために単一の組み換えベクターを構築し得、次にこれを単一のベクターで修飾された宿主細胞において発現させ得る。

いくつかのベクターは、原核細胞及び真核細胞の両方で複製及び／又は発現することを可能にする制御配列を使用し得る。当業者は、上記の宿主細胞の全てを温置してそれらを維持し、ベクターの複製を可能にする条件をさらに理解するであろう。また、ベクターの大規模産生並びにベクターによってコードされる核酸及びそれらの同族のポリペプチド、タンパク質又はペプチドの産生を可能にする技術及び条件も理解され、既知である。

本開示で使用される免疫エフェクター細胞及び宿主細胞は、哺乳動物を含む真核生物であるが、原核細胞は、ベクター又はベクターに組み込むためのＤＮＡの組み換え改変における操作に使用され得る。本細胞は特にヒトであるが、例えば、関心のある何らかの動物、特に、それらの個々の動物での使用のために、ウマ、ウシ、マウス、ヒツジ、イヌ、ネコなどの家畜化動物と関連付けられ得る。他の実施形態では、細胞は、市販の細胞株などの細胞株である。

免疫エフェクター細胞は、自家細胞、同系細胞、同種細胞及び、一部の例では、細胞を受容している個体に関連するものなど、異種細胞でもあり得る。主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）プロファイルを変化させることによって、機能クラスＩＭＨＣ分子の形成を減少させるか又は防ぐためのβ_２−ミクログロブリンの不活性化、クラスＩＩ分子の不活性化、１つ以上のＭＨＣ分子の発現の提供、細胞傷害活性と関連する遺伝子の発現を促進若しくは阻害することによる細胞傷害能の促進若しくは不活性化などによって、細胞を修飾し得る。

ＣＡＲ及び／又は分子アダプターなどの抗原受容体をコードする発現ベクターは、１つ以上のＤＮＡ分子又はコンストラクトとして細胞に導入され得、そこには、コンストラクトを含有する宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つのマーカーがあり得る。このコンストラクトは従来の方法で調製され得、この方法において、この遺伝子及び調節領域が単離され、必要に応じて、連結され、適切なクローニング宿主にクローニングされ、制限若しくは配列決定、又は他の好都合な手段によって分析され得る。特に、ＰＣＲを使用して、機能単位の全部又は一部を含む個々の断片を単離し得、必要に応じて「プライマー修復」、ライゲーション、インビトロ突然変異誘発などを使用して、１つ以上の突然変異を導入し得る。完成し、適切な配列を有することが実証されたコンストラクトは、その後、何らかの好都合な手段によって細胞に導入され得る。このコンストラクトは、感染又は細胞への形質導入のために、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）又はレトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターを含む他のもののような非複製性の欠陥ウイルスゲノムに組み込まれ、パッケージ化され得る。このコンストラクトは、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。或いは、融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによってコンストラクトが導入され得る。宿主細胞は、コンストラクトの導入前に培養物中で増殖及び拡大され得、この後にコンストラクトの導入及びコンストラクトの組み込みのための適切な処理が続く。次に、細胞を増殖させ、コンストラクト中に存在するマーカーによってスクリーニングする。うまく使用され得る様々なマーカーとしては、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが挙げられる。

多くの状況において、例えば処置を終了したいとき、細胞が腫瘍性になる場合、細胞の存在後に細胞がなくなることに関心がある研究又は他の事象では、修飾細胞を死滅させることが可能であることが望まれ得る。この目的のために、制御された条件下で修飾された細胞を死滅させ得るある一定の遺伝子産物の発現を提供し得る。カスパーゼ９などの自殺遺伝子産物はこのような産物の例である。

実例として、癌患者又は癌に罹患し易い患者又は癌を有することが疑われる患者は、以下のように処置され得る。本明細書中に記載のように修飾された細胞が患者に投与され、長期間保持され得る。個体は、細胞の１回以上の投与を受け得る。細胞を修飾し、それを必要とする個体に提供する。

Ｖ．ポリヌクレオチド

本開示はまた、本明細書中で定義されるような分子アダプター及び抗原受容体をコードする核酸配列と、この核酸配列を保有する細胞と、を含む組成物も包含する。本核酸分子は、特定の態様において組み換え核酸分子であり、合成物であり得る。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ並びにＰＮＡ（ペプチド核酸）を含み得るか、又はそのハイブリッドであり得る。

さらに、さらなる目的のために、核酸分子が、例えば、チオエステル結合及び／又はヌクレオチド類似体を含有し得ることが想定される。修飾は、細胞中のエンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化に有用であり得る。本核酸分子は、細胞中での前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適切なベクターによって転写され得る。この点で、このようなポリヌクレオチドが、「遺伝子標的化」又は「遺伝子治療」アプローチに使用し得ることも理解されたい。別の実施形態では、核酸分子が標識される。核酸の検出のための方法は当技術分野で周知であり、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＰＣＲ又はプライマー伸長である。この実施形態は、遺伝子治療アプローチ中に上記の核酸分子の導入が成功したことを検証するためのスクリーニング方法に有用であり得る。

この核酸分子は、前述の核酸分子の何れかを単独で又は組み合わせての何れかで含む、組み換え産生されるキメラ核酸分子であり得る。特定の態様において、この核酸分子はベクターの一部である。

従って、本開示はまた、本開示に記載される核酸分子を含むベクターを含む組成物にも関する。

多くの適切なベクターが分子生物学の熟練者に知られており、その選択は所望の機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子工学で従来使用されている他のベクターを含む。様々なプラスミド及びベクターを構築するために、当業者にとって周知の方法を使用し得；例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）に記載の手法を参照のこと。或いは、本開示のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構成され得る。ＤＮＡの個々の配列を単離するためにクローニングベクターを使用し得る。関連する配列は、特定のポリペプチドの発現が必要とされる発現ベクターに移され得る。典型的なクローニングベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＧＢＴ９が挙げられる。典型的な発現ベクターとしては、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが挙げられる。

具体的な実施形態では、抗原受容体、好ましくはＣＡＲ又はＴＣＲ、及び／又は本明細書で定められる分子アダプターをコードする核酸配列に操作可能に連結された調節配列である核酸配列を含むベクターがある。このような調節配列（制御エレメント）は熟練者にとって公知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクターに挿入物を導入するための翻訳及び挿入部位を含み得る。具体的な実施形態では、この核酸分子は、真核細胞又は原核細胞での発現を可能にする前記発現制御配列に操作可能に連結される。

「調節配列」という用語は、それらが連結されるコード配列の発現をもたらすために必要であるＤＮＡ配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物では、制御配列には一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターが含まれる。真核生物では、一般に、制御配列には、プロモーター、ターミネーター及び、一部の例ではエンハンサー、トランス活性化因子又は転写因子が含まれる。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に必要であり、さらなる有利な構成成分も含み得る全ての構成成分を含むものとする。

「操作可能に連結される」という用語は、このように記載される構成成分が、それらの意図される方式でそれらが機能することを可能にする関係にある並置状態を指す。コード配列に「操作可能に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と互換性のある条件下で達成されるように連結される。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましく使用されることは当業者にとって明らかである。

本明細書中で使用される場合、「融合される」という用語又はその派生語は、単一の分子として接続される２つ以上の実体を指す。一例として、一部の例では、ＩＬ１５は、自然界で見られるような個別の分子ではなく、単一の分子としてＩＬ１５Ｒａに融合される。

ある一定の実施形態では、ベクターは、本明細書中で定められるような抗原受容体をコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが想定される。具体的な態様において、このベクターは、レンチウイルス又はレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。レンチウイルス及びレトロウイルスベクターは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）又はＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのものを含め、市販されている。

原核生物及び／又は真核細胞における発現を確実にする発現ベクターのための調節エレメントは、当業者にとって周知である。真核細胞の場合、それらは通常、転写の開始を確実にするプロモーター及び、任意選択により転写の終了及び転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞での発現を可能にする可能性のある調節エレメントは、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＰ_Ｌ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１若しくはＧＡＬ１プロモーター又は哺乳動物及び他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサー又はグロビンイントロンである。

転写開始に関与するエレメント以外に、このような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流の、例えばＳＶ４０−ポリ−Ａ部位又はｔｋ−ポリ−Ａ部位などの転写終結シグナルも含み得る。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞区画に向けることが可能である、又はそれを培地に分泌させることが可能であるリーダー配列を、列挙される核酸配列のコード配列に付加し得、これは当技術分野で周知である。リーダー配列は、翻訳、開始及び終結配列、及び好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部のペリプラズム空間又は細胞外培地への分泌を指示可能なリーダー配列とともに適切な相で組み立てられる。任意選択により、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現された組み換え産物を安定化させるか又は精製を単純化するＮ末端同定ペプチドを含む分子アダプターをコードし得る；上記参照。これに関連して、適切な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ−ＢｅｒｇｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＦ−Ｎｅｏ、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ及びｐＥＦ−ＡＤＡ（Ｒａｕｍｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１）５０（３），１４１−１５０）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）など、当技術分野で公知である。

いくつかの実施形態では、発現制御配列は、トランスフェクションする真核宿主細胞の形質転換が可能なベクター中の真核プロモーター系であるが、原核宿主に対する制御配列も使用し得る。ベクターが適切な宿主に組み込まれたら、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、必要に応じて、本開示のポリペプチドの回収及び精製が続いて行われ得る。特定の実施形態では、１つ以上のコード可能な配列は、低酸素環境に応答性である発現制御配列によって調節される。

さらなる調節エレメントには、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーが含まれ得る。有利には、本開示の上記のベクターは、選択可能及び／又はスコアリング可能なマーカーを含む。形質転換された細胞の選択に有用な選択可能マーカー遺伝子は、当業者にとって周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与する、ｄｈｆｒに対する選択の基礎としての代謝拮抗剤耐性（Ｒｅｉｓｓ，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ−Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４），１４３−１４９）；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシン及びパロマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯＪ．２（１９８３），９８７−９９５）及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ３２（１９８４），４８１−４８５）を含む。さらなる選択可能遺伝子が記載されており、即ち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５（１９８８），８０４７）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号パンフレット）及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７，ＣｕｒｒｅｎｔＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙｅｄ．）又はブラスチシジンＳに対する耐性を付与するアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５），２３３６−２３３８）である。

有用なスコアリング可能マーカーも当業者にとって公知であり、市販されている。有利に、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６（１９９６），５９−７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８（１９９６），１２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３８９（１９９６），４４−４７）又はβ−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯＪ．６（１９８７），３９０１−３９０７）をコードする遺伝子である。この実施形態は、列挙されたベクターを含有する細胞、組織及び生物の単純かつ迅速なスクリーニングに特に有用である。

上記のように、細胞中でコードされるポリペプチドを発現させるために、細胞中で、単独で、又はベクターの一部として、列挙される核酸分子を使用し得る。特異的な抗原受容体及び／又は分子アダプターコンストラクトの何れか１つをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含有する核酸分子又はベクターが細胞に導入され、次に関心のあるポリペプチドを産生させる。列挙される核酸分子及びベクターは、細胞への、直接導入のために又はリポソーム若しくはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のために設計され得る。

上記によれば、本開示は、本明細書中で定められるコンストラクトのポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む、ベクター、特に遺伝子工学で従来使用されるプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを導き出すための方法に関する。少なくとも一部の例では、このベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子移入又は標的化ベクターである。列挙されるポリヌクレオチド又はベクターを標的細胞集団に送達するために、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを使用し得る。組み換えベクターを構築するために当業者にとって周知である方法を使用し得；例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（ｌｏｃｃｉｔ．），Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９，ｌｏｃｃｉｔ．）又は他の標準的な教科書に記載される技術を参照のこと。或いは、列挙される核酸分子及びベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームへと再構成され得る。本開示の核酸分子を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変動する周知の方法によって宿主細胞に移入し得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に対して一般的に利用され、一方でリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは、他の細胞宿主に対して使用され得る；上出のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。

ＶＩ．医薬組成物

本開示によれば、「医薬組成物」という用語は、個体への投与のための組成物に関する。本開示の具体的な態様では、本医薬組成物は、本明細書中に記載のような複数の免疫エフェクター細胞を含む。本開示のある一定の態様では、本医薬組成物は、本明細書中に記載のような精製分子アダプターを含む。特定の実施形態では、本医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、髄腔内又は静脈内投与のための、又は癌への直接注射のための組成物を含む。特に、本医薬組成物は、注入又は注射を介して個体に投与されることが想定される。適切な組成物の投与は、異なる方法によって、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所及び／又は皮内投与によって実施され得る。免疫エフェクター細胞は、全身的又は局所的に個体に投与し得る。

本開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。適切な医薬担体の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液、凍結保存剤などが挙げられる。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって処方され得る。これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与され得る。

投与計画は主治医及び臨床的要因によって決定される。医学の技術分野で周知のように、何れか一人の患者に対する投与量は、患者の体格、身体の表面積、年齢、投与しようとする特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、総体的健康状態及び同時に投与される他の薬物を含め、多くの要因に依存する。定期的評価によって進行を監視し得る。本開示により包含される免疫エフェクター細胞は、静脈内注入を介して投与し得る。本明細書中に記載の免疫エフェクター細胞の用量は、１ｘ１０^６個／ｍ^２〜２ｘ１０^８個／ｍ^２の範囲であり得、具体的な実施形態では、最大１０^１０個の細胞が利用され得る。具体的な事例では、治療効果のための適切な用量は、１回の投与あたり細胞約１０^６〜約１０^９個であり、それらは一連の投与サイクルにあり得る。特定の投与計画は、第０日に細胞約１０^７個で開始して、第５日までに細胞約１０^８個の目標用量まで段階的に増加させる、漸増用量の４回の１週間投与サイクルを含む。適切な投与方式としては、単なる例として、静脈内、皮下、腔内（例えばリザーバーアクセスデバイスによる）、腹腔内注射及び腫瘍塊への直接注射が挙げられる。本明細書中に記載の組成物に含まれる各活性剤の量（例えば接触させようとする各細胞あたりの量又はある一定の体重あたりの量）は、異なる用途で変化し得る。一般に、形質導入された免疫エフェクター細胞の濃度は、望ましくは、処置される対象において、約１ｘ１０^７〜約５ｘ１０^８個の形質導入免疫エフェクター細胞を含め、少なくとも約１ｘ１０^６〜約１ｘ１０^９個の形質導入免疫エフェクター細胞を提供するのに十分であるべきであるが、上記の何れかのあらゆる適切な量、例えば細胞５ｘ１０^８個超、細胞１ｘ１０^７個を下回る、例えば１ｘ１０^７個未満など、を利用し得る。投薬スケジュールは、十分に確立された細胞ベースの治療に基づき得るか、又は代替的な連続注入ストラテジーを採用し得る。

本開示の組成物は、局所的又は全身的に投与され得る。投与は一般に非経口的であり、例えば静脈内投与であり；ＤＮＡはまた、例えば、内部又は外部の標的部位への微粒子銃送達によって、又は動脈内の部位へのカテーテルによって、標的部位に直接投与され得る。好ましい実施形態では、本医薬組成物は皮下投与され、さらにより好ましい実施形態では静脈内投与される。非経口投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルのデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓｄｅｘｔｒｏｓｅ）に基づくものなど）などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、凍結保存剤及び不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。さらに、本開示の医薬組成物は、好ましくはヒト由来の、例えば血清アルブミン又は免疫グロブリンのようなタンパク質性担体を含み得る。本開示の医薬組成物は、ＣＡＲコンストラクト又はそれをコードする核酸分子若しくはベクター（本開示に記載のようなもの）に加えて、医薬組成物の使用目的に応じて、さらなる生物学的活性物質を含み得ることが想定される。

ＶＩＩ．本開示のキット

本明細書中に記載の免疫エフェクター細胞組成物及び／又はそれを産生するための試薬の何れかがキットに含まれ得る。非限定例では、細胞又は細胞を操作するための試薬がキット中に含まれ得る。ある一定の実施形態では、ＮＫＴ細胞又はＮＫＴ細胞を含む細胞集団がキット中に含まれ得る。このようなキットは、細胞の操作のための１つ以上の試薬を有してもよいし、又は有していなくてもよい。このような試薬としては、例えば、低分子物、タンパク質、核酸、抗体、緩衝液、プライマー、ヌクレオチド、塩及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。１つ以上のサイトカインをコードする核酸又はサイトカイン自体がキット中に含まれ得る。アゴニスト性のモノクローナル抗体を含むサイトカイン又は抗体などのタンパク質がキット中に含まれ得る。抗体を含む基質、又は裸の基質自体がキット中に含まれ得、いくつかの実施形態では、抗体担持基質を作製するための試薬がキット中に含まれる。基質は、ビーズ又はプレートを含むあらゆる種類のものであり得る。抗原提示細胞活性又はそれを生成するための試薬を含む細胞がキット中に含まれ得る。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体をコードする核酸は、それを作製するための試薬を含め、キット中に含まれ得る。

特定の態様では、本キットは、本明細書中に記載のような免疫エフェクター細胞及び／又は精製分子アダプター並びにまた別の癌治療も含む。一部の例では、本キットは、細胞療法の実施形態に加えて、化学療法、ホルモン療法などの第２の癌治療及び／又は例えばチェックポイント阻害剤などの免疫療法も含む。本キットは、個体に対する特定の癌に合わせて調整され得、個体に対する個々の第２の癌治療を含み得る。

本キットは、本発明の適切に等分された組成物を含み得る。本キットの構成成分は、水性媒体又は凍結乾燥形態の何れかで包装され得る。本キットの容器手段は、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段を含み、その中に構成成分が入れられ得、好ましくは適切に等分され得る。本キットに複数の構成成分がある場合、本キットはまた、一般に、さらなる構成成分が個々に入れられ得る第２、第３又は他のさらなる容器も含有し得る。しかし、構成成分の様々な組み合わせが１本のバイアルに含まれ得る。本発明のキットはまた、典型的には、市販のために組成物及び何らかの他の試薬容器を緊密に閉じ込めて含有するための手段も含む。このような容器は、所望のバイアルが保持される射出又はブロー成形プラスチック容器を含み得る。

本キットの構成成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。その場合、容器手段はそれ自体がバッグ、シリンジ、ピペット及び／又は他のこのような同様の装置であり得、そこから処方物が身体の患部に適用され得、動物に注射され得、及び／又は本キットの他の構成成分にさえ適用され得、及び／又はそれと混合され得る。免疫エフェクター細胞が本キットの構成成分である場合、これらは、１つ以上の凍結保存剤が添加された冷凍形態で提供され得る。その場合、本キットは、細胞の生存率を維持する方法で凍結細胞を解凍するための構成成分を含み得る。しかし、本キットの構成成分又はその一部は、乾燥粉末として提供され得る。試薬及び／又は構成成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加により再構成され得る。溶媒はまた、別の容器手段でも提供され得ることが想定される。

ＶＩＩＩ．併用療法

本発明のある一定の実施形態では、臨床的態様に対する本開示の方法は、抗癌剤などの過剰増殖性疾患の処置に有効な他の薬剤と組み合わせられる。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させ、癌細胞においてアポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖速度を低下させ、転移の発生率又は数を低下させ、腫瘍サイズを縮小させ、腫瘍成長を阻害し、腫瘍又は癌細胞への血液供給を減少させ、癌細胞又は腫瘍に対する免疫反応を促進し、癌の進行を阻止若しくは阻害し、又は癌を有する対象の寿命を延長させることによって、対象において癌に負の影響を与えることが可能である。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞の死滅又はその増殖を阻害するのに有効な組み合わせ量で提供される。この工程は、癌細胞を発現コンストラクト及び薬剤又は複数の因子と同時に接触させることを含み得る。これは、単一の組成物又は両薬剤を含む医薬処方物と細胞を接触させることによって、又は２つの別個の組成物又は処方物と細胞を同時に接触させることによって達成され得、ある組成物は発現コンストラクトを含み、他のものは第２の薬剤を含む。

化学療法剤及び放射線療法剤に対する腫瘍細胞耐性は、臨床腫瘍学における主要な問題に相当する。現在の癌研究の１つの目標は、細胞療法とそれを組み合わせることにより、化学療法及び放射線療法の有効性を改善するための方法を発見することである。本発明の文脈では、細胞療法は、例えば、化学療法、放射線療法又は免疫療法の介入と組み合わせて同様に使用され得ることが企図される。

本開示の治療は、数分〜数週間の範囲の間隔で、他の薬剤処置の前又は後に行い得る。他の薬剤及び本方法が個別に個体に適用される実施形態では、一般に、薬剤及び本発明の治療が依然として細胞において有利に組み合わせられる効果を発揮可能であるように、各送達の時間の間に顕著な時間が終了しないことを確実にする。このような例では、互いに約１２〜２４時間以内に、及び少なくとも一部の例では、互いに約６〜１２時間以内に、両方のモダリティと細胞を接触させ得ることが企図される。一部の状況では、処置のための期間を大幅に延長することが所望され得るが、個々の投与間で数日（２、３、４、５、６又は７日）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８週間）経過する。必要に応じて処置サイクルを繰り返すことが予想される。本発明の細胞療法と組み合わせて様々な標準的な治療並びに外科的介入が適用され得ることもまた企図される。
Ａ．化学療法

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、化学療法とともに、化学療法の前又は後に使用される。化学療法はあらゆる種類のものであり得る。具体的な実施形態では、化学療法は、アドリアマイシンＰＦＳ（ドキソルビシン塩酸塩）；アドリアマイシンＲＤＦ（ドキソルビシン塩酸塩）；クラフェン（シクロホスファミド）；シクロホスファミド；サイトキサン（シクロホスファミド）；ドキソルビシン塩酸塩；ネオサール（シクロホスファミド）；ビンカサールＰＦＳ（ビンクリスチン硫酸塩）；及び／又はビンクリスチン硫酸塩を含む。癌治療には、化学療法及び放射線に基づく処置の両方とともに様々な併用療法も含まれる。併用化学療法としては、例えば、アブラキサン、アルトレタミン、ドセタキセル、ハーセプチン、メトトレキサート、ノバントロン、ゾラデクス、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート又は前述のものの何らかの類似体若しくは誘導体変異体が挙げられる。
Ｂ．放射線療法

ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されてきた他の要因としては、γ線、Ｘ線、陽子線、電子線及び／又は腫瘍細胞への放射性同位元素の指向送達として一般に知られているものが挙げられる。マイクロ波及びＵＶ照射など、他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの要因は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復並びに染色体の組み立て及び維持に対して広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。

細胞に適用される場合、「接触させられる」及び「曝露される」という用語は、治療用コンストラクト及び化学療法剤又は放射線治療剤が、標的細胞に送達されるか、又は標的細胞と直接並置される工程を説明するために本明細書中で使用される。細胞の死滅又は静止を達成するために、細胞を死滅させるか又は細胞が分裂するのを防ぐために有効な併用量で両薬剤を細胞に送達させる。
Ｃ．免疫療法

免疫療法は、一般に、癌細胞を標的にして破壊するための免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存し、この具体的な実施形態では、免疫療法は、本開示のもの以外である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体のみが治療のエフェクターとして機能し得るか、又は実際に細胞死滅を引き起こすために他の細胞を動員し得る。この抗体は、例えば、イピリムマブ、ニボルマブ又はペムブロリズマブなどのチェックポイント阻害剤であり得る。この抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と複合化され得、単に標的化するための物質として作用し得る。或いは、免疫系を調整するために非抗体分子を使用し得る。或いは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的又は間接的の何れかで相互作用する表面分子を保有するリンパ球であり得る。様々な免疫エフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫＴ細胞であるか、又はＮＫＴ細胞を含む。

従って、免疫療法は、現在の細胞療法と組み合わせて、併用療法の一部として使用し得る。併用療法に対する一般的なアプローチは、一般に、腫瘍細胞が、標的化に適したいくつかのマーカーを保有し、即ち他の細胞の一部又は大部分に存在しないようになる。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらの何れも本開示のものとともに使用しようとする免疫療法の文脈での標的化に適したものであり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、尿路腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ及びｐ１５５が挙げられる。
Ｄ．遺伝子

また別の実施形態では、二次的処置は、治療用ポリヌクレオチドが、本発明の臨床実施形態の前、後又はそれと同時に投与される遺伝子治療である。細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の阻害剤又はプログラム細胞死の調節因子を含め、様々な発現産物が本発明内に包含される。
Ｅ．外科的手術

癌患者のおよそ６０％は、予防的、診断的又は病期分類、治癒的及び姑息的手術を含む、あるタイプの外科的手術を受ける。治癒的手術は、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法及び／又は代替療法など、他の療法と組み合わせて使用され得る癌の処置である。

外科手術には、癌性組織の全部又は一部を物理的に除去、切除及び／又は破壊する摘出が含まれる。腫瘍摘出は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍摘出に加えて、外科手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術及び顕微鏡制御手術（モース術）が含まれる。本発明は、表在性癌、前癌又は偶発的な量の正常組織の除去と組み合わせて使用され得ることがさらに企図される。

癌性細胞、組織又は腫瘍の一部又は全部を切除すると、体内に空洞が形成され得る。処置は、かん流、直接注射又はさらなる抗癌治療を患部に局所適用することによって達成され得る。このような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６若しくは７日ごと、又は１、２、３、４及び５週間ごと、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２か月ごとに反復され得る。これらの処置は、投与量も様々であり得る。
Ｆ．他の薬剤

処置の治療効果を改善するために、他の薬剤を本発明の方法及び組成物と組み合わせて使用し得ることが企図される。これらのさらなる薬剤としては、免疫調節剤、細胞表面受容体及びＧＡＰ結合の上方制御に影響を与える薬剤、細胞分裂阻害剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤又はアポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を高める薬剤が挙げられる。免疫調節剤としては、腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、ベータ及びガンマ；ＩＬ−２及び他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋ及び他のサイトカイン類似体；又はＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ及び他のケモカインが挙げられる。細胞表面受容体又はそれらのリガンド、例えばＦａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４又はＤＲ５／ＴＲＡＩＬなど、の上方制御は、過剰増殖細胞に対する自己分泌又は傍分泌効果の確立によって、本開示の細胞又は組成物のアポトーシス誘導を増強することがさらに企図される。ＧＡＰ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を向上させ得る。他の実施形態では、処置の抗過剰増殖効果を改善するために、細胞分裂阻害剤又は分化剤が本発明と組み合わせて使用され得る。細胞接着の阻害剤は、本発明の有効性を改善させることが企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。処置効力を改善するために、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を向上させる他の薬剤、例えば抗体ｃ２２５を本発明と組み合わせて使用し得ることがさらに企図される。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するように発明者により発見された技術を表し、従ってその実施のための好ましい方式を構成すると考えられ得ることが当業者により理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更をなし得、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。
実施例１
分子アダプターの例の設計及び試験

本開示の特定の実施形態を試験するために、１）短いスペーサー及びヒトＣＤ８由来の膜貫通ドメインを介して連結されるマウスモノクローナル抗体ＦＭＣ−６３由来の抗ＣＤ１９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ２８同時刺激ドメイン及びＣＤ３ζＴ細胞活性化ドメインからなるＣＡＲ１９；２）ヒトＩＬ１５（ＩＬ１５）、ヒトＩＬ１５Ｒａ（ＩＬ１５Ｒａ）又はＩＬ１５ＲＡ−ＩＬ１５複合体あり又はなしでの、ＣＤ１９の短縮細胞外ドメイン（ＣＤ１９細胞外）、ＧＤ２ガングリオシドに特異的な１４ｇ２ａｍＡｂ（抗ＧＤ２）由来のｓｃＦｖをコードする分子アダプターコンストラクトを発現するレトロウイルスベクターを構築した。ＩＬ−１５又はＩＬ１５ＲＡ−ＩＬ１５は、ＣＤ１９細胞外との融合タンパク質（例えば抗ＧＤ２−ＣＤ１９−ＩＬ１５）又は個別に分泌されるタンパク質（例えば抗ＧＤ２−ＣＤ１９．ＩＬ１５）として発現された。１４ｇ２ａｓｃＦｖ、ＣＤ２８同時刺激ドメイン及びＣＤ３ζＴ細胞活性化ドメインを伴う抗ＧＤ２ＣＡＲ（ＣＡＲＧＤ２）を陽性対照とした（図１）。発現されたＣＡＲタンパク質が細胞膜に挿入され、発現された分子アダプタータンパク質が細胞から分泌されることを確実にするために、ＦＭＣ６３及び１４ｇ２ａｓｃＦｖの最初にヒトＩｇＧ重鎖に由来するシグナルペプチド配列が含まれた。当業者は、他のシグナルペプチド配列を使用し得ることを理解するであろう。
実施例２
ＮＫＴＳでの分子アダプターの発現及びインビトロでの機能的活性の試験

分子アダプターコンストラクトを用いたヒトＮＫＴ細胞のレトロウイルス形質導入の結果、細胞表面でのＣＡＲ１９の効果的な発現（図２Ａ）及びこのようなアダプターの分泌が起こった。ＣＤ１９陰性／ＧＤ２陽性ＣＨＬＡ−２５５神経芽細胞腫細胞は、フローサイトメトリーにより測定した場合、抗ＧＤ２−ＣＤ１９分子アダプターで形質導入されたリンパ球からの上清で処理した後、ＣＤ１９陽性になった。抗ＧＤ２のみ（ＣＤ１９細胞外なし）で形質導入されたリンパ球からの上清によって、ＣＨＬＡ−２５５細胞がＣＤ１９陽性になることはなかった。ＣＤ１９陰性／ＧＤ２陰性のＬＡＮ−６神経芽細胞腫細胞は、同じ処理後もＣＤ１９陰性のままであった（図２Ｂ）。ＣＤ１９細胞外を含む検査した全ての分子アダプターコンストラクトを発現するＣＡＲ１９ＮＫＴ細胞は、陽性対照としてＣＡＲＧＤ２を発現するＮＫＴ細胞が介在する細胞傷害性に匹敵したＣＨＬＡ−２５５神経芽細胞腫細胞に対する用量依存的なインビトロ細胞傷害性を示した。対照的に、ＣＤ１９ドメインのない分子アダプター陰性対照（ＣＡＲ１９．抗ＧＤ２）は、ＣＨＬＡ−２５５細胞に対するＣＡＲ１９ＮＫＴ細胞の細胞傷害性を誘導できなかった（図３）。
実施例３
分子アダプターコンストラクトを発現するＮＫＴ細胞のインビボ抗腫瘍活性の試験

分子アダプターコンストラクトを発現するＮＫＴ細胞のインビボ抗腫瘍活性を試験するために、発明者らは、以前に記載された、ＮＳＧマウスにおける転移性神経芽細胞腫のモデルを使用した（９）。マウスに１０^６個のＣＨＬＡ−２５５／ｌｕｃ細胞を注射し、７日後に図１に記載のコンストラクトを発現する１０^７個のＮＫＴ細胞で処理した。ＣＡＲ１９．抗ＧＤ２又はＣＡＲＧＤ２のみを発現するＮＫＴ細胞を、それぞれ陰性対照又は陽性対照として使用した。生物発光イメージングによって抗腫瘍活性を毎週監視した。図４は、ＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを発現するＮＫＴ細胞が、ＣＡＲＧＤ２陽性対照群のマウスの生存と同様に約８０日という生存期間の中央値を達成する強力な抗腫瘍活性を媒介したことを示す。対照的に、全ての他のコンストラクトが生じさせた抗腫瘍活性は最小限のものであり、陰性対照と比較して生存期間を１週間だけ延長させた。これらの結果は、図１２及び図１３Ｃに概略的に示されるような実施形態を例証する。
実施例４
リード候補の設計に基づくさらなる分子アダプターコンストラクトの作製

非活性類似体と比較した治療的活性コンストラクト（ＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ）の別個の特性は次のとおり：１）ＩＬ１５のみ又はＩＬ１５Ｒａのみの代わりにＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒａの両方が存在し；２）ＩＬ１５及びＩＬ１５ＲａがＣＤ１９に融合され、従って、可溶形態でＣＡＲ１９ＮＫＴに対して提示される代わりに、ＣＤ１９（標的抗原）に対して分子的近接近性（ｃｌｏｓｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）で腫瘍細胞表面上でＣＡＲ１９ＮＫＴに対して提示される。分子アダプター活性に対する決定的な要件をさらに探索するために、発明者らは、リードコンストラクトの活性が、１）ＩＬ１５Ｒ融合に対するＩＬ１５の方向の逆転；２）可溶性タンパク質としてＩＬ１５が分泌されるようになる一方でＩＬ１５ＲａをＣＤ１９と融合したままにすることによりどのように影響を受けるかについて問うた。これらに取り組むために、発明者らは次のコンストラクト：ＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９−ＩＬ１５Ｒａ、ＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９−ＩＬ１５ＲＡ．ＩＬ１５、ＣＡＲ１９．抗ＧＤ２−ＣＤ１９−ＩＬ１５Ｒａ−ＩＬ１５（図５）を設計した。
実施例５
リード分子アダプターの類似体を発現するＮＫＴ細胞の発現及びインビトロ機能活性

図５に記載のコンストラクトの作製後、それらの発現をＮＫＴ細胞で試験し、標的としてＧＤ２−陽性及びＧＤ２−陰性神経芽細胞腫細胞株を使用してインビトロ細胞傷害性試験を行った（図６）。新しいコンストラクトは、ＮＫＴにおいて効率的に発現され得（図６Ａ）、元のリードコンストラクトと同レベルのＧＤ２特異的な細胞傷害性を媒介する（図６Ｂ）。
実施例６
リード分子アダプターの類似体を発現するＮＫＴ細胞のインビボ抗腫瘍活性の試験

リード分子アダプター及び新しい類似体を発現するＮＫＴ細胞のインビボ抗腫瘍活性を試験するために、図４に記載されているのと同じモデルを使用するインビボ治療実験を行った。元のリードコンストラクトは、再現性よく強力な治療活性を媒介した（図７）。対照的に、新しい類似体はどれも顕著な抗腫瘍活性を示さなかった。これらの結果は、少なくともいくつかの実施形態では、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒａの両方を１つの定められる配向で融合させ、腫瘍細胞表面上で標的抗原と同時提示させることが好ましいことを示す。しかし、当業者は、構成成分の異なる配置が異なる分子アダプターに対して有用であり得ることを認識し、特定の配置が通常の実験を通じて決定され得ることを理解するであろう。
実施例７
ＩＬ１５の改変トランスプレゼンテーションは、神経芽細胞腫の異種モデルにおけるＧＤ２特異的なＣＡＲＮＫＴ細胞の治療効果を増強させる。

Ｖα２４インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）は、その天然の抗腫瘍特性及び神経芽細胞腫（ＮＢ）及び他の固形腫瘍において腫瘍部位に優先的に局在化する能力により、腫瘍特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現に対する魅力的なエフェクターである。ＧＤ２特異的ＣＡＲを発現する養子移入されたヒトＮＫＴは、Ｔ細胞よりも効果的に腫瘍部位に局在し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγ^ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスにおけるＮＢの異種モデルで抗腫瘍活性を媒介することが以前に示された。ＮＫＴは腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で阻害され得、ＩＬ１５を発現するようにそれらを改変することにより部分的に救済され得ることが確認された。これらの知見は、ＣＡＲＧＤ２及びＩＬ１５を同時発現する治療用ＮＫＴの開発につながり、これらは現在、第１相臨床試験（ＮＣＴ０３２９４９５４）で試験されている。次に、隣接する細胞上のＩＬ−１５Ｒａと複合体形成するＩＬ１５提示の生理学的方式を模倣して、ＩＬ１５がトランスで提示されるように改変されている場合、ＣＡＲＧＤ２及びＩＬ１５を発現するＮＫＴの治療効力をさらに増強し得ると考えられた。そのために、細胞表面発現のためにＣＡＲＧＤ２をコードするレトロウイルスコンストラクトを用いてＮＫＴに対して形質導入を行い、それらは、ＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合物の形態を分泌したか、又は個別に分泌されるタンパク質としてＩＬ１５とＩＬ１５Ｒａとを分泌した。コンストラクトの別のセットでは、ＩＬ−１５Ｒａ又はＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａは、全てＮＢ細胞で高度に発現される次の抗原：ＧＤ２、ＣＤ２４又はＣＤ５６のうち１つを標的とする一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に連結された。細胞表面ＣＡＲＧＤ２及び記載の分泌分子の同時発現は、ＮＫＴにおけるＣＡＲ発現（図１０）又はＧＤ２陽性ＮＢ細胞に対するそれらのインビトロ細胞傷害性に影響を与えなかった。しかし、ＣＡＲＧＤ２及び抗ＣＤ２４又は抗ＣＤ５６ｓｃＦｖとのＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ複合体の融合物を同時発現するＮＫＴは、ＣＡＲＧＤ２．ＩＬ１５ＮＫＴと比較して転移性ＮＢ異種移植片を有するＮＳＧマウスの長期生存を有意に延長させた（図１１）。これらの知見から、図１３Ｂで概略的に示されるように、１つの抗原に特異的なＣＡＲ及び別の抗原に特異的なＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ−ｓｃＦｖ複合体による腫瘍細胞の二重標的化が抑制的ＴＭＥを克服し、効果的な腫瘍除去のためにＮＫＴを活性化することが明らかになる。さらに、ＣＡＲＧＤ２、ＩＬ１５及び、ＧＤ２も標的とする分子アダプターを同時発現するＮＫＴも、ＣＡＲＧＤ２．ＩＬ１５ＮＫＴと比較して生存率が有意に上昇した（図１１）。これらの知見から、図１３Ａに概略的に示されるように、腫瘍細胞が、同じ抗原を認識するＣＡＲ及び分子アダプターで標的化され得ることが明らかになる。免疫工学のこれらの新規実施形態は、他の治療エフェクター細胞並びに他のタイプの固形腫瘍に広く適用可能である。
配列の例
CAR19:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQK
PDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFG
GGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPD
YGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTA
IYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA
GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGP
TRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGR
DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY
DALHMQALPPR (SEQ ID NO:1)

CARGD2:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLH
WYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHV
PPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKAS
GSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKS
LTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSTRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA
AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPG
PTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG
RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR (SEQ ID NO:2)

IgG4 ヒンジ:
ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:3)

CD19 細胞外:
PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWL
FIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSE
GPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGV
PPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCH
RGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK (SEQ ID NO:4)

T2A:
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO:5)

P2A:
ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:6)

リンカー 1:
GGGGSGGGGSGGGSLQGTTC (SEQ ID NO:7)

リンカー 2:
SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ (SEQ ID NO:8)

IL15:
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO:9)

IL15Ra 細胞外ドメイン:
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT (SEQ ID NO:10)

抗-CD24 scFv:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCDVHLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYTWHWIRQFPGNTVEWMetGYIQYTGSTRYNPALRGRLSISRDTSKNQFFLQLISVTTADTGTYFCARGTTASFDYWGQGTTLTVASAGSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMSQSPSSLNVSVGEKVTMRCRSSQSLLYSSDQKNYLTWYQQKPGQSPKLLISWASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLGVYYCQQYFIYPLTFGVGTKLGLKAAA (SEQ ID NO:11)

抗-CD56 scFv:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSFTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCARMRKGYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQIIIHSDGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPHTFGGGTKVEIKP (SEQ ID NO:12)

14g2a scFv:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLH
WYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHV
PPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPGSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKAS
GSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKS
LTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYGRVTVSSA (SEQ ID NO:13)

E2A:
QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:14)

実施例８
ＩＬ１５とＩＬ−１５ＲＡとの同時発現

本開示の特定の態様において、サイトカイン及びその受容体は単一の分子として連結されるが、本実施例はまた、サイトカイン及びその受容体が最終的に個別の分子として産生される実施形態も包含する。これには、（同じベクターからであるか否かにかかわらず）個別の転写産物としての発現、又は単一の転写産物として発現され、その後、介在する自己切断２Ａエレメントなどで分離されることが含まれる。

同時刺激ドメインのバリエーション（ＣＤ２８又は４１ＢＢ）があり、ＩＬ１５；ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒａ（個別のタンパク質又はタンパク質断片として同時発現）を含むか又はどちらも含まない、ＧＤ２ＣＡＲをコードするコンストラクトを作製した。図１４は、このようなコンストラクトの例を示す。ＮＫＴ細胞への形質導入後、抗ＣＡＲ．ＧＤ２抗体を用いたフローサイトメトリー染色によってそれらの発現を調べた。図１５Ａは、個々のコンストラクトについてのＣＡＲ．ＧＤ２の発現を示し、図１５Ｂは、両方とも対照としてのＣＡＲ．ＧＤ２．２８ｚ及び非形質導入細胞と比較した場合の、ＣＡＲ．ＧＤ２．２８ｚ．１５（３）についてのＩＬ１５の発現を示す。

ＩＬ１５Ｒａと同時発現されるとき、ＩＬ１５は溶液中ではなくＮＫＴ細胞表面上に蓄積し、これは、ＩＬ１５が腫瘍細胞表面に送達される本明細書中の分子アダプターの実施形態とは反対である（少なくとも図１２を参照）。ＩＬ１５．ＩＬ１５ＲａがＮＫＴ細胞表面上に保持される場合、その全てがＣＡＲＮＫＴ細胞にとって利用可能である。分泌されたアダプター内で発現される場合、ＩＬ１５又はＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａの一部のみが腫瘍細胞表面上で捕捉され、ＮＫＴ細胞に提示し戻された。

図１６は、ＧＤ２陽性（ＣＨＬＡ１２５５及びＬＡ−Ｎ−１）又はＧＤ２陰性（ＬＡ−Ｎ−６）を含む３つの異なる神経芽細胞腫に対する細胞介在性細胞傷害を提供する。グラフは、個々のコンストラクトによる形質導入ＮＫＴ細胞の効果的なインビトロ細胞傷害性を示す。全てのコンストラクトは、ＧＤ２陽性腫瘍細胞の特異的な用量依存的インビトロ死滅を同様の効力で媒介する。

転移性神経芽細胞腫のマウスモデルにおいてインビボで異なるコンストラクトも試験した。低用量の細胞（４×１０^６個ＣＡＲ＋ＮＫＴ／マウス）を用いてマウスに感染させ、腫瘍成長を数週間にわたって追跡した。図１７は、ＣＡＲ．ＧＤ２．ＢＢｚ．ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａコンストラクトが最も効果的であり、次にＣＡＲ．ＧＤ２．２８ｚ．ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａコンストラクトが続いたことを示す。高用量（ＮＫＴ１２×１０^６個／マウス）では、ＮＫＴにおけるＣＡＲ．ＧＤ２．ＢＢｚ．ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａコンストラクトは毒性なくマウスの腫瘍を完全に根絶するが、一方でＣＡＲ．ＧＤ２．２８ｚ．ＩＬ１５．ＩＬ１５Ｒａを発現するＮＫＴは高用量ではマウスにおいて中毒死を引き起こした。
参考文献

本明細書中で言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が属する熟練者のレベルを示す。全ての特許及び刊行物は、それぞれ個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。

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本発明及びその長所を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書中で様々な変更、置換及び変形をなし得ることを理解されたい。さらに、本願の範囲は、本願に記載の工程、機構、製造、組成物、手段、方法及び工程の特定の実施形態に限定されるものではない。当業者が本発明の開示から容易に認識するであろうように、本明細書中に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか又は実質的に同じ結果を実質的に達成する、現在存在するか、又は後に開発されるはずである、工程、機構、製造、組成物、手段、方法又は工程を本発明に従い利用し得る。従って、添付の特許請求の範囲は、このような工程、機構、製造、組成物、手段、方法又は工程をそれらの範囲内に含むものとする。

Claims

以下を含む組成物を産生する免疫エフェクター細胞：
（ａ）１つ以上の腫瘍細胞結合ドメイン又は標的細胞結合ドメイン；及び
（ｂ）（ｉ）１つ以上のサイトカイン又は１つ以上のそれらの機能断片；又は
（ｉｉ）１つ以上のサイトカイン受容体又は１つ以上のそれらの機能断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせ
を含む１つ以上のサイトカインドメイン；
（ｃ）任意選択により、１つ以上の抗原受容体標的ドメインをさらに含む；
ここで、該細胞は、任意選択により１つ以上の腫瘍標的抗原又は標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体を含む。
前記１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインが、抗体、抗体断片又は非抗体足場を含む、請求項１に記載の細胞。
前記１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインがｓｃＦｖを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
前記１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインが、ＧＤ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ５６、ＣＤ２４、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤＬ−２など、腫瘍細胞の表面上で発現される抗原を標的とする、請求項１、２又は３に記載の細胞。
前記１つ以上のサイトカインが、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ２１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞。
前記サイトカインがＩＬ１５であり、及び／又は前記サイトカイン受容体がＩＬ１５Ｒ又はそのアルファサブユニット（ＩＬ１５ＲＡ）である、請求項１〜５の何れか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の抗原受容体標的ドメインが、１つ以上の腫瘍抗原又はその１つ以上の機能断片を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞。
前記組成物が、
前記腫瘍細胞上の第１の抗原を標的とする１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインと、
第２の腫瘍抗原又はそれらの機能断片を含む１つ以上の抗原受容体標的ドメインと、
を含む、請求項７に記載の細胞。
前記１つ以上の抗原受容体標的ドメインがＣＤ１９を含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の改変抗原受容体が非天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１〜９の何れか１項に記載の細胞。
１つ以上の第１の腫瘍抗原を標的とする組成物を産生し、前記１つ以上の第１の腫瘍抗原を標的とする１つ以上の抗原受容体を含む；
１つ以上の第２の腫瘍抗原を標的とする組成物を産生し、前記１つ以上の第１の腫瘍抗原を標的とする１つ以上の抗原受容体を含む；又は
１つ以上の第１の腫瘍抗原を標的とする組成物を産生し、前記組成物が、前記細胞の表面上で発現される１つ以上の抗原受容体により標的とされる１つ以上の抗原受容体標的ドメインを含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の腫瘍細胞結合ドメイン及び前記１つ以上の抗原受容体標的ドメインが、ヒンジ領域及び／又はリンカーによって連結される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の細胞。
前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する、請求項１２に記載の細胞。
前記組成物及び任意選択により前記１つ以上の改変抗原受容体をコードする発現ベクター又はＲＮＡを含む、請求項１〜１３の何れか１項に記載の細胞。
前記発現ベクターがウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項１４に記載の細胞。
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１５に記載の細胞。
ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、γδＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、マクロファージ、自然リンパ球（ＩＬ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞又はそれらの混合物である、請求項１〜１６の何れか１項に記載の細胞。
（ａ）１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインと、
（ｂ）（ｉ）１つ以上のサイトカイン又は１つ以上のその機能断片；又は
（ｉｉ）１つ以上のサイトカイン受容体又は１つ以上のその機能断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせ
を含む１つ以上のサイトカインドメインと、
を含む、１つ以上の改変抗原受容体を発現する細胞をリダイレクトするための組成物。
（ｃ）１つ以上の抗原受容体標的ドメインをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
前記組成物中の前記１つ以上のサイトカインドメインが、前記１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインと前記１つ以上の抗原受容体ドメインとの間に配置される、請求項１８又は１９に記載の組成物。
請求項１８〜２０の何れか１項に記載の組成物に対して向けられる非天然抗原受容体。
請求項１８〜２０の何れか１項に記載の組成物をコードするポリヌクレオチド。
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１つ以上の抗原受容体をコードする配列をさらに含む、請求項２３に記載の発現ベクター。
（ａ）（ｉ）１つ以上の腫瘍細胞結合ドメイン及び
（ｉｉ）１つ以上のサイトカインドメイン
を含む組成物と；
（ｂ）１つ以上の抗原受容体と、
をコードする発現ベクター。
ＩＲＥＳエレメント又は２Ａ配列が、本組成物と前記１つ以上の抗原受容体との間に配置される、請求項２３〜２５の何れか１項に記載の発現ベクター。
前記発現ベクターがウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項２３〜２６の何れか１項に記載の発現ベクター。
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２７に記載の発現ベクター。
請求項２１〜２６の何れか１項に記載の発現ベクターを含む細胞。
個体において癌を処置する方法であって、請求項１〜１７の何れか１項に記載の治療的有効量の細胞を前記個体に投与する工程を含む、方法。
請求項１８〜２０の何れか１項に記載の治療的有効量の組成物及び／又は請求項２９に記載の１つ以上の抗原受容体を発現する治療的有効量の細胞を投与することを含む、個体において癌を処置する方法。
個体において癌を処置する方法であって、治療的有効量の以下：
腫瘍細胞上の第１の抗原又は第２の抗原を標的とする１つ以上の腫瘍細胞結合ドメイン及び１つ以上のサイトカインドメインを含む組成物及び
前記腫瘍細胞上の第１の抗原に対する１つ以上の抗原受容体を発現する細胞
を前記個体に投与することを含む、方法。
前記組成物及び／又は前記細胞が、腹腔内又は静脈内注射により前記個体に投与される、請求項３１〜３２の何れか１項に記載の方法。
前記組成物の２回目の投与が初回投与の後に行われる、請求項３１〜３３に記載の方法。
前記個体がさらなる癌治療を受けている、受けた、及び／又は受けるであろう、請求項３０〜３４の何れか１項に記載の方法。
前記さらなる癌治療が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ホルモン療法又はそれらの組み合わせである、請求項３５に記載の方法。
請求項１〜１７に記載の免疫エフェクター細胞又は請求項１８〜２０の何れか１項に記載の組成物を含む医薬組成物。
以下の工程を含む第１の腫瘍抗原を発現する癌に癌治療を適応させる方法：
（ａ）第２の腫瘍抗原を標的とする１つ以上の非天然抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞又はその複数を提供又は入手する工程；及び
（ｂ）前記第１の腫瘍抗原に結合する１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインと第２の腫瘍抗原を標的とする抗原受容体に結合する１つ以上の抗原受容体標的ドメインとを含む組成物を提供又は入手する工程、
任意選択により、前記組成物が（ｉ）１つ以上のサイトカイン又は１つ以上のそれらの機能断片；又は（ｉｉ）１つ以上のサイトカイン受容体又は１つ以上のそれらの機能断片；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせを含み、
工程（ｂ）の組成物を提供又は入手することが、処置されている癌の癌細胞における第１の抗原の発現の存在により決定される、方法。
以下の工程を含む、第１の腫瘍抗原を発現する癌に癌治療を適応させる方法：
（ａ）第２の腫瘍抗原を標的とする１つ以上の非天然抗原受容体を含む免疫エフェクター細胞又はその複数を提供又は入手する工程；及び
（ｂ）（１）前記第１の抗原を標的とする１つ以上の腫瘍細胞結合ドメインと
（２）（ｉ）１つ以上のサイトカイン又は１つ以上のそれらの機能断片；又は
（ｉｉ）１つ以上のサイトカイン受容体又は１つ以上のそれらの機能断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）両方の組み合わせ
を含む１つ以上のサイトカインドメインと
を含む組成物をコードするポリヌクレオチドを前記細胞にトランスフェクションする工程。
（ａ）１つ以上の腫瘍標的抗原に対する１つ以上の改変抗原受容体；
（ｂ）１つ以上の組み換えサイトカイン又は１つ以上のそれらの機能断片；
及び
（ｃ）１つ以上の組み換えサイトカイン受容体又は１つ以上のそれらの機能断片
を含むタンパク質を個別に産生する、免疫エフェクター細胞。
前記１つ以上の改変抗原受容体が非天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項４０に記載の細胞。
１つ以上の構成成分が発現ベクター又はＲＮＡ上にある、請求項４０又は４１に記載の細胞。
前記１つ以上の構成成分が同じ発現ベクター又はＲＮＡによって提供される、請求項４２に記載の細胞。
前記構成成分のうち少なくとも２つ以上が、同じベクターによって提供される場合、２Ａ自己切断部位又はＩＲＥＳエレメントによって分離可能である、請求項４３に記載の細胞。
前記１つ以上の構成成分が異なる発現ベクター又はＲＮＡによって提供される、請求項４２に記載の細胞。
２つ以上の構成成分が異なる発現ベクター又はＲＮＡ上で提供され、前記構成成分のうち少なくとも２つが異なるタイプのベクター上で提供される、請求項４５に記載の細胞。
前記発現ベクターがウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項４２〜４５の何れか１項に記載の細胞。
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４６に記載の細胞。
前記細胞が、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、γδＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、マクロファージ、自然リンパ球（ＩＬ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞又はそれらの混合物である、請求項４０〜４８の何れか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の腫瘍標的抗原が、ＧＤ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ５６、ＣＤ２４、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤＬ−２である、請求項４０〜４８の何れか１項に記載の細胞。
前記１つ以上のサイトカインが、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ２１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４０〜５０の何れか１項に記載の細胞。
前記サイトカインがＩＬ−１５であり、及び／又は前記サイトカイン受容体がＩＬ１５Ｒ又はそのアルファサブユニット（ＩＬ１５ＲＡ）である、請求項４０〜５１の何れか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の改変抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項４０〜５２の何れか１項に記載の細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の同時刺激ドメインを含む、請求項５３に記載の細胞。
前記ＣＡＲが４−１ＢＢ同時刺激ドメインを含む、請求項５４に記載の細胞。
個体において癌を処置する方法であって、治療的有効量の請求項４０〜５５の何れか１項に記載の細胞を前記個体に投与することを含む、方法。
前記細胞が、腹腔内又は静脈内注射により前記個体に投与される、請求項５６に記載の方法。
前記個体がさらなる癌治療を受けている、受けた、及び／又は受けるであろう、請求項５６又は５７に記載の方法。
前記さらなる癌治療が、外科手術、放射線照射、化学療法、免疫療法、ホルモン療法又はそれらの組み合わせである、請求項５８に記載の方法。