CN100386431C - 人趋化因子的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人CKLF1的单克隆抗体及其杂交瘤细胞系，杂交瘤细胞系的保藏号为CGMCC No.1335。本发明的单克隆抗体可以用来检测各种病变组织中的CKLF1蛋白的表达；该单克隆抗体还可作为探针，利用直接免疫荧光试验检测各种疾病如哮喘、系统性红瘢狼苍等自身免疫性疾病外周血淋巴细胞CKLF1的表达水平，作为临床诊断或辅助诊断的一个标志。

Description

人趋化因子的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其杂交瘤细胞系，尤其是人趋化因子CKLF1的单克隆抗体以及生成该抗体的杂交瘤细胞系。

背景技术

人趋化因子CKLF1(Chemokine-like factor 1)是由北京大学人类疾病基因研究中心在国际上首次克隆的一个细胞因子，它具有CC家族趋化因子的结构特征和趋化功能(中国专利申请号：99107284.7)。体内外的功能试验表明，CKLF1具有广谱的趋化活性，不仅对造血干细胞有特殊的促增殖效应，且对骨骼肌增殖也具有显著的促进作用。通过对CKLF1转基因小鼠的研究发现，转基因小鼠的肺组织病变明显，表现为肺组织内炎症细胞聚集，肺泡隔增厚、充血、水肿，与哮喘发病后期的病理改变相似，这提示CKLF1在呼吸系统炎症性疾病的发病过程中起重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供能与人趋化因子CKLF1特异性结合的单克隆抗体。

本发明还提供了生产上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系，它已于2005年3月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No 1335。

本发明还进一步确认了所述的单克隆抗体在体外用于检测体液或病变组织中的CKLF1蛋白的表达。例如用于检测各种体液如血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊液中的CKLF1的水平；还可以测定各种疾病如哮喘、系统性红瘢狼苍等自身免疫性疾病外周血淋巴细胞CKLF1的表达水平，作为临床诊断或辅助诊断的一个标志。

本发明制得的人CKLF1单克隆抗体，为CKLF1的基础研究和临床应用研究提供了有利的工具。

本文利用趋化因子CKLF1的真核表达质粒为免疫原，经过肌肉免疫、常规细胞融合、筛选及克隆化，建立了稳定分泌抗CKLF1单克隆抗体的杂交瘤细胞株(M4克隆株)。经ELISA、免疫印迹等方法的鉴定，杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异地识别大肠杆菌表达的重组CKLF1和CKLF1的活性片断C27和C19，且具有中和活性。进一步的研究发现，CKLF1蛋白主要表达在活化的外周血单个核细胞上，且有分泌形式的存在。临床研究资料表明，哮喘病人外周血的淋巴细胞表达高水平的CKLF1蛋白，本研究结果对于哮喘病人的诊断或辅助诊断、特异性治疗以及发病机理的研究提供了新的思路。

抗人CKLF1单克隆抗体的成功制备，为深入研究CKLF1蛋白的生物学效应、以及在人体内各组织器官的分布、生理和病理情况下的变化、疾病的诊断和治疗奠定了基础。

CKLF1单克隆抗体的应用：

(1)FITC标记的CKLF1单克隆抗体为探针，利用直接免疫荧光试验检测各种疾病如哮喘、系统性红瘢狼苍等自身免疫性疾病外周血淋巴细胞CKLF1的表达水平，作为临床诊断或辅助诊断的一个标志。

(2)利用该抗体和免疫组化检测各种病变组织中的CKLF1蛋白的表达。

(3)该抗体作为试剂盒可以测定各种体液如血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊液中的CKLF1的水平。

(4)利用该抗体制备免疫亲和层析柱，来分离纯化CKLF1蛋白。

(5)利用该单抗进行动物试验研究。

(6)该单抗作为CKLF1的拮抗剂，可以进行药理学研究，用于治疗以CKLF1高表达而引起的各种疾病，如哮喘，系统性红斑狼疮和SARS等。

附图说明

图1为图1Western Blot检测M4单克隆抗体与重组CKLF1的特异性反应其中泳道1为大肠杆菌的裂解物+CKLF1多克隆抗体

泳道2为重组CKLF1+CKLF1多克隆抗体

泳道3为大肠杆菌的裂解物+CKLF1单克隆抗体(M4)

泳道4为重组CKLF1+CKLF1单克隆抗体(M4)

图2A趋化试验检测M4单克隆抗体中和CKLF1-C19的趋化活性

图2B趋化试验检测M4单克隆抗体中和CKLF1-C27的趋化活性

图3免疫组化实验检测CKLF1蛋白在PHA刺激的外周血单个核细胞的表达

图4流式细胞术分析哮喘病人和正常人外周血淋巴细胞表面CKLF1的表达。

具体实施方式

实施例1.真核表达质粒的构建

利用PCR技术从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中扩增得到CKLF1基因的完整开放读码框架序列，并将其克隆到pGEM-T easy(购自Promega公司)载体中，经序列测定获得序列正确的克隆。用限制性内切酶EcoR I酶切后，将插入片断CKLF1释放出来，克隆到真核表达载体pcDI的EcoR I位点中，筛选正向插入克隆，经内切酶鉴定正确，命名为pcDI-CKLF1质粒(Biochem J.2001，357，127-135)。质粒的大量提取、纯化以及内毒素的处理方法和步骤严格按照EndoFree^TM plasmid Giga Kits(Qiagen-tip 10000，Hilden，Germany)使用说明书操作。

实施例2.杂交瘤细胞系的建立

步骤1、动物免疫

将纯化的真核表达质粒pcDI-CKLF1于BALB/C小鼠(北京大学医学部动物研究中心提供)胫前肌沿肌纤维走向注射100ul/只(100ug)，注射后即行电针脉冲刺激(80mV，100mA)，3周后同剂量质粒再次注射，10天后以间接ELISA(波长为490nm)检测小鼠血清中CKLF1蛋白多抗的效价，效价高者进行下一步的细胞融合。

步骤2、细胞融合

无菌制备pcDI-CKLF1免疫的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(来源于ATCC)以5∶1的比例在PEG1500(为Fluka产品)作用下融合，融合按常规法(Kohler G.and Milstein C：Continuous culture of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature.1975；256：495-497)，PEG用1ml，1分钟内缓慢加完，反应时间为90秒，无血清的RPMI 1640(为GibcoBRL产品)培养基终止反应，1000rpm离心10min，HAT(H次黄嘌呤、A氨基蝶呤、T胸腺嘧啶核苷，为Gibco BRL产品)完全1640培养基调细胞浓度至1×10⁶/ml，加入已预先铺有饲养细胞(Balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞)的96孔平底板，100μl/孔，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔3天观察并换液，10天后以HT1640(为Gibco BRL产品)培养基换液，1周后换完全1640培养基。

步骤3、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞

(1)CKLF1多肽的合成与偶联：CKLF1的两个活性片断的合成由深圳翰宇(Hybio Engineering)中国有限公司按照标准方法化学合成。它们的序列分别是ALIYRKL LFNPSGPYQKKPVHEKKEVL(C27)和FNPSGPYQKKPVHEKKEVL(C19)。冻干的多肽，溶于磷酸盐缓冲液中，浓度为1mg/ml于-80℃保存。用于多肽偶联的载体蛋白MaleimideActivated Bovine Serum Albumin(BSA)购自PIERCE公司，C27和C19多肽与BSA的连接按照公司提供的说明书操作，最后产生C27-BSA和C19-BSA的偶联蛋白。

(2)ELISA试验：以C27-BAS和C19-BSA的偶联蛋白(1μg/ml)包被酶标96孔板，37℃反应2小时或4℃过夜；3％牛血清白蛋白(BSA)封闭，4℃过夜，加入待检杂交瘤细胞(上述步骤2制得的细胞)培养上清，37℃孵育1小时，SP2/0细胞培养上清为阴性对照；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(为Promega产品)37℃孵育1小时；邻苯二胺(OPD)底物液显色10-15min，2M H₂SO₄终止反应。每步完成均用含0.05％Tween 20的PBS充分洗涤，ELISA Reader(Bio-Tek Instruments公司产品)测OD₄₉₀值。所测的OD₄₉₀值比阴性对照高10倍的克隆，进行亚克隆化，并进行扩增冻存。

步骤4、阳性杂交瘤细胞的克隆化-采用有限稀释法

将上述步骤3筛选得到的细胞以含白细胞介素6(IL-6)(300U/ml)的HT1640培养基稀释至每孔1个细胞，铺于U型96孔细胞培养板，4小时内镜下观察每孔实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆且ELISA鉴定抗体分泌呈阳性，即获得单抗分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定之，从而获得了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株M4。杂交瘤细胞株M4于2005年3月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1335。

实施例3.体外培养法制备单抗

将已经建立的阳性杂交瘤细胞M4扩大培养，待细胞浓度达10⁵/ml时停止换液，持续培养直至细胞全部死亡。收集培养上清，1500rpm，离心10分钟，上清含有高水平的单克隆抗体，-20℃保存备用。

实施例4.体内诱生腹水法制备单抗

挑选经产Balb/c小鼠，腹腔内注射0.5ml不完全弗氏佐剂(为Gibco BRL产品)，7天后每只小鼠腹腔内注射0.5ml含2×10⁶的M4杂交瘤细胞，7-10天后视小鼠腹部膨胀程度收集腹水，4℃离心，2500rpm离心20min，收集上清，分装并放置-30℃保存备用。

实施例5单抗的特性鉴定

步骤1、滴度测定

取小鼠腹水做等比稀释，以CKLF多肽C27-BSA为检测抗原，间接ELISA法(同实施例2步骤3)测定实施例4制备的抗体滴度，并以SP2/0诱生的小鼠腹水为阴性对照，ELISA检测的结果是：1∶10⁵。

步骤2、单克隆抗体IgG亚类鉴定

取M4杂交瘤细胞培养上清，用SIGMA公司提供的小鼠单克隆抗体同型试剂进行。具体方法如下：

(1)在已包被C27-BSA蛋白的ELISA板中分别加入M4杂交瘤细胞培养上清，室温孵育2小时。

(2)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次。分别加入羊抗鼠的IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3(SIGMA公司产品)(用PBS1∶1000稀释)各100ul/孔，每个样品设3个重复孔。室温孵育30分钟。

(3)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次。加入HRP偶联的兔抗羊IgG(SIGMA公司产品)(用PBST做1∶5000稀释)，100ul/孔，室温孵育15分钟。

(4)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次，邻苯二胺(OPD)底物液显色10～15min。

(5)2M H₂SO₄终止反应。

(6)ELISA Reader测OD490值，判断单抗IgG亚类。

结果表明，M4杂交瘤分泌的单抗为IgG1亚类免疫球蛋白。

步骤3、单抗的纯化

将CKLF 1单抗腹水用0.01mol/L，pH7.4的PBS对倍稀释。在搅拌的条件下逐滴加入饱和硫酸铵至饱和度为50％，4C°静置过夜。次日12000rpm，离心15分钟，弃上清，沉淀溶于PBS中透析2天(期间换4次液)。利用HiTrap^TMProtein G(为Amersham Pharmacia Biotech公司产品)亲和层析的方法(按说明书操作)纯化CKLF1蛋白的单克隆抗体。将纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，按常规方法进行(分离胶为12.5％，浓缩胶为4.5％)。纯化的抗体放-30℃保存备用

步骤4、单抗稳定性的测定

复苏杂交瘤细胞，收集不同传代次数的细胞上清，并用ELISA方法检测其效价。结果表明M4细胞株能够稳定的产生单克隆抗体。

步骤5、单克隆抗体的反应特异性

(1)间接ELISA方法(同实施例2步骤3)检测所得的单克隆抗体与CKLF1多肽反应特点

实验结果见表1。结果表明，M4单抗能与C27和C19发生特异性反应，而与载体蛋白鸡卵清蛋白(OVA)无交叉反应。

表1ELISA检测M4单抗与C27和C19的特异性反应

上述CKLF1多克隆抗体的制备请参见文献：中国医学科学院学报，200426(5)：496-469。

(2)Western Blot免疫印迹实验检测M4单抗与CKLF1蛋白结合反应：将大肠杆菌体外翻译系统合成重组CKLF1蛋白(Yanan Liu，DalongMa.Expression of Recombinant Chemokine-Like Factor 1 with a Cell-FreeProtein Biosynthesis system.Cell-Free Protein Expression.Editor：Dr.James R.Swartz，2^nd ed，2003，ISBN 3-540-05041-8，Springer，Chapter 20，pp165-177)和大肠杆菌裂解物进行15％SDS-PAGE电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher&Schuell公司产品)，用5％脱脂奶粉在4℃封闭过夜，加入由实施例4制备的CKLF1单抗，阳性对照加入兔抗人CKLF1多克隆抗体(该多克隆抗体的制备请参见文献：中国医学科学院学报，200426(5)：496-469)，室温反应1h，洗涤三次。随后加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG，(为Promega产品)室温反应1h，洗涤三次。最后加NBT/BCIP(Promega产品)底物显色。洗涤均用TBS-T(pH7.5，0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween-20)，每次10min。结果如图1所示，M4单抗与重组CKLF1蛋白有较强的特异性反应；而与宿主菌裂解物无交叉反应。

ELISA和Western Blot的结果都证明M4细胞株产生的单抗能与CKLF1分子发生强烈的结合反应，因此可以应用到CKLF1的基础研究和临床应用研究。

实施例6.异硫氰酸荧光素(FITC)标记CKLF1单抗的制备

将通过实施例5步骤3纯化的CKLF1单克隆抗体(2mg/ml)在FITC标记缓冲液(0.05Mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.5)中透析，然后与0.1mg FITC(SIGMA公司产品)混合，4℃反应16小时，过Sephadex G-50柱(AmershamBiosciences公司产品)，收集标记蛋白，标记物加1％牛血清白蛋白和0.1％NaN₃，4℃避光保存备用。

实施例7单克隆抗体对CKLF1活性片断的中和活性作用

表2.CKLF1单抗对C27和C19中和活性的试验设计

将上述各组分混合，4℃孵育30分钟后，放在37℃预温，接着进行趋化试验(Han wl，et al.Biochem J.2001，357，127-135)，该试验用的靶细胞是人T细胞白血病细胞Hut102细胞系(北京大学人类疾病基因研究中心保存)。CKLF1的趋化活性用趋化指数(Chemotactic Index，CI)来表示，趋化指数高表明趋化活性强，反之则趋化活性弱。趋化试验的结果见图2A和2B，图中显示CKLF1的活性片断C27和C19具有趋化人白血病细胞系Hut102的能力，而我们筛选的M4单克隆抗体分别与浓度为100ng/ml和1000ng/ml的C19多肽和C27多肽孵育一定的时间后，这两个活性片断的趋化指数明显下降，说明M4单抗具有明显的中和活性。

实施例8单克隆抗体用于检测外周血单核细胞的CKLF1表达免疫荧光实验

(1)CKLF1在PHA刺激的外周血单个核细胞上的表达

A外周血单个核细胞的分离和培养：将肝素抗凝的20ml正常人外周血，用人淋巴细胞分层液(比重d＝1.077±0.001，购自上海华精生物高科技有限公司)分离单个核细胞，然后加入终浓度为50ug/ml的植物血凝素(PHA，购自Sigma公司产品)在37℃，5％的CO2孵箱中培养，取不同时间(0、8、24、48、72小时)培养的细胞进行下面的直接免疫荧光试验和免疫组化试验。

B直接免疫荧光试验：将PHA刺激不同时间的单个核细胞用PBS洗两次，加入FITC标记的CKLF1单抗(由实施例6制备)，4℃孵育30分钟，用PBS(含0.1％的BSA和0.1％的叠氮钠)洗2次，流式细胞仪(FACSCAlibur，美国BD公司生产)分析CKLF1在细胞膜上的表达。为了检测细胞内的CKLF1的表达水平，我们将PHA刺激的细胞用3％的多聚甲醛冰浴10分钟，然后用含0.1％TritonX-100和1％BSA的PBS室温反应30分钟，1500rpm离心10分钟，最后加入FITC标记的CKLF1单抗，4℃孵育30分钟，用PBS(含0.1％的BSA和0.1％的叠氮钠)洗2次，流式细胞仪FACSCalibur(BDBioscience公司产品)分析CKLF1在细胞内的表达密度。结果证明：正常人外周血单个核细胞的表面以及胞内均能表达低水平的CKLF1分子，经PHA活化后，细胞膜表面表达的CKLF1明显上调，随着时间的延长逐渐升高；而细胞内CKLF1的表达与膜表达则相反，胞内CKLF1的表达在活化24小时最高，随着时间的延长，表达逐渐下降(见表3)。

表3.CKLF1在PHA刺激的人外周血单个核细胞上的表达密度

C免疫组化试验：将上述培养的细胞悬液滴在洁净的载波片上，离心甩片，PBS洗2次，每次3分钟，加3％过氧化氢室温避光反应8～10分钟，以便去除内源性过氧化物酶；PBS洗2次，加羊血清室温孵育20分钟；加入1：100稀释的M4单抗，室温反应40～60分钟；PBS洗3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(为Promega产品)，室温反应40～45分钟；PBS洗3次，加入DAB(SIGMA公司产品)显色液，避光观察。免疫组化的结果(见图3)表明，PHA刺激0小时和8小时，基本上没有检测到CKLF1的表达，而在24小时和48小时，CKLF1的表达明显上调，72小时表达下降，实验表明活化的人外周血单个核细胞表达高水平的CKLF1蛋白，且存在分泌形式。

直接免疫荧光和免疫组化的结果证明，制备的单克隆抗体能够动态观察细胞中的CKLF1的表达，为深入研究CKLF1蛋白的生物学效应、以及在人体内各组织器官的分布、生理和病理情况下的变化、疾病的诊断和治疗奠定了基础。

实施例9单克隆抗体用于检测哮喘病人外周血淋巴细胞膜表面CKLF1的表达

取哮喘病人的肝素抗凝血0.1ml，加入FITC标记的抗人CKLF1单克隆抗体(由实施例6制备)，轻轻混匀，4℃避光反应30分钟。加入2ml冷的PBS(含0.1％BSA和0.1％NaN3)，2000rpm 4℃离心5分钟，弃上清。加入溶人红细胞溶解液1ml(用前37℃预热)，充分混匀，37℃孵育5分钟，立刻加入上述的PBS 2ml终止反应。2000rpm 4℃离心5分钟，弃上清，加入0.5ml冷的PBS悬浮细胞，流式细胞仪FACSCalibur(BD Bioscience公司产品)进行检测。结果证明，急性发作期的哮喘病人外周血淋巴细胞中，CKLF1阳性细胞数和表达密度显著高于正常人(表4，图4)。因此可以将FITC标记的CKLF1单克隆抗体为探针，利用直接免疫荧光试验检测诸如哮喘病人外周血淋巴细胞CKLF1的表达水平，作为临床诊断或辅助诊断的一个标志。表4流式细胞计分析CKLF1在哮喘病人和正常人外周血淋巴细胞表面的表达密度

N1-N3表示第1-第3个正常人

P1-P4表示第1-第4个病人。

Claims (2)

1.一种杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No.1335。

2.一种抗人CKLF1的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞系产生。

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