MX2011010153A

MX2011010153A - Secuencias de nucleotido y aminoacido que codifican una proteina 1 exportada derivada de plasmodium vivax y usos de las mismas.

Info

Publication number: MX2011010153A
Application number: MX2011010153A
Authority: MX
Inventors: Larry G Birkenmeyer; Ruthie E Coffey; George J Dawson; Suresh M Desai; Bruce J Dille; Anthony S Muerhoff
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2011-10-11
Also published as: US8318897B2; EP2430043B1; CA2755967A1; US20100247576A1; CN102439033B; EP2430043A1; AU2010228934A1; AU2010228934B2; CN102439033A; BRPI1012637A2; WO2010111220A1; US20110311572A1; ES2609586T3; US8063193B2; CA2755967C

Abstract

La presente invención se dirige a polinucleótidos polipéptidos novedosos dirigidos a EXP1 de Plasmodium vivax, y métodos de uso de estos polinucleótidos y polipéptidos en la detección de anticuerpos P. vivax o anticuerpos anti-P. vivax en un sujeto. La presente invención tiene aplicación útil particular en identificar exposición reciente a P. vivax.

Description

SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDO Y AMINOÁCIDO QUE CODIFICAN UNA PROTEÍNA 1 EXPORTADA DERIVADA DE PLASMODIUM VIVAX Y USOS DE LAS MISMAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico y a secuencias de aminoácido codificadas de esta manera, derivadas del gen de Antígeno-1 Exportado (EXP1) de Plasmodium vivax, útil en aplicaciones de diagnóstico, entre otros.

Antecedentes de la Invención Transmisión de malaria La malaria es una enfermedad llevada por los mosquitos originada por un parásito. Al menos cuatro especies de parásitos de malaria pueden infectar a humanos bajo condiciones naturales: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae. Las primeras dos especies originan la mayor parte de las infecciones a nivel mundial. P. vivax y P. ovale tienen parásitos de etapa inactiva en el hígado (hipnozoites) que se pueden reactivar (o "recurrir") y originar malaria después de varios meses o años de la infección por el piquete de mosquito; en consecuencia, estas especies pueden ser difíciles de detectar en individuos infectados.

En la naturaleza, los parásitos de malaria son dispersados mediante infección en forma sucesiva de dos tipos de receptores: humanos y mosquitos Anopheles hembra. En humanos, los parásitos crecen y se multiplican primero en las células del hígado, y posteriormente en los glóbulos rojos. En la sangre, las progenies sucesivas de parásitos crecen dentro de los glóbulos rojos y los destruyen, liberando parásitos hijas (merozoites) que continúan el ciclo invadiendo otros glóbulos rojos.

Los parásitos en la etapa de la sangre, originan los síntomas de malaria. Cuando ciertas formas de parásitos en la etapa en la sangre, gametocitos, son captados por un mosquito Anopheles hembra durante una picadura en la sangre, inician otros diferente ciclo de crecimiento y multiplicación en los mosquitos. Después de 10 a 18 días, los parásitos se encuentran como esporozoites en las glándulas salivales del mosquito. Cuando el mosquito Anopheles pica en la sangre de otro humano, los esporozoites se inyectan con la saliva del mosquito e se inicia otra infección humana cuando invaden con parásitos las células del hígado (Wyler, 1992).

Síntomas de Malaria y la Enfermedad La infección con parásitos de malaria puede dar como resultado una amplia variedad de síntomas, que fluctúan desde síntomas ausentes o muy leves hasta enfermedad severa e incluso la muerte. La enfermedad de malaria puede ser categorizada como no complicada o (complicada) severa. En general, la malaria es curable si se diagnostica y trata en forma temprana. Después de la picadura del mosquito infeccioso, existe un período de incubación antes de que aparezcan los primeros síntomas. El período de incubación normalmente varía de 7 a 30 días. Se observan períodos más cortos más frecuentemente con P. falciparum y más largos con P. vivax. De hecho, P. vivax puede tener períodos de incubación prolongados, de aproximadamente 450 días (Lee y asociados, 1998).

Diagnóstico La malaria debe ser reconocida en forma temprana con el objeto de tratar al paciente en forma oportuna y evitar una dispersión adicional de la infección en la comunidad. Debido al largo período de incubación de P. vivax, el diagnóstico puede ser difícil a través de métodos de embarrado de sangre tradicionales, retardando el tratamiento. El retraso en el diagnóstico y tratamiento es una causa que lleva a la muerte en pacientes con malaria. Se puede sospechar de la malaria con base en los síntomas del paciente y con descubrimientos físicos al momento de la revisión. Sin embargo, para un diagnóstico definitivo, las pruebas de laboratorio deben demostrar la presencia de parásitos de malaria. El "estándar de oro" de diagnóstico de la presente invención para malaria, depende de la demostración de los parásitos en un embarrado de sangre revisado bajo microscopio.

Detección de Anticuerpos Plasmodium Los anticuerpos para parásitos de malaria asexuales (por ejemplo merozoites) aparecen dentro de algunos días a semanas después de que los parásitos invaden los eritrocitos, y puede persistir durante meses o incluso años (Vinetz y asociados, 1998). La detección de anticuerpos para diagnóstico de malaria aguda normalmente no recomendada, sin embargo, debido a la presencia de anticuerpos, que puede indicar una infección pasada o reciente. Se han desarrollado ensayos inmunoabsorbentes enlazados por encima (ELISA) que utilizan antígenos derivados de Plasmodium (Newmarket Laboratories, UK; Cellabs, Australia) o lisados de organismo completes de P. falciparum (DiaMed) para detectar inmunoglobulinas (IgG y/o IgM) en suero o plasma humano. Estos ensayos son más fáciles de llevar a cabo, exhiben un mayor rendimiento y mejor sensibilidad y especificidad de IFA (Kitchen y asociados, 2004; Seed y asociados, 2005; Srivastava y asociados, 1991). Los ensayos ELISA comerciales actuales son insuficientemente sensibles para detectar anticuerpos dirigidos contra cada una de las cuatro especies de plasmodium (She y asociados, 2007).

Los antígenos utilizados para capturar anticuerpos han incluido candidatos de vacuna. Estos antígenos son atractivos para aplicaciones de diagnóstico debido a que estos antígenos se sabe que provocan respuestas de anticuerpo, y por lo tanto es probable que sean útiles para tratar anticuerpos producidos por individuos infectados, que resultan de la infección por parásitos. Los ejemplos de dichos antígenos incluyen proteína de circumsporozoite (CSP), antígeno de membrana apical 1 (AMA-1), proteína de superficie merozoite (MSP) uno y dos, ambos de P. vivax y P. falciparum (Kitchen y asociados, 2004; Rodrigues y asociados, 2003). Otros antígenos de interés so MSP-2, -3, -4, -5, -8 -9, proteína con alto contenido de glutamato y antígeno de repetición de serina (Girard y asociados, 2007).

La proteína-1 exportada (EXP1; también conocido como antígeno 5.1 QF116, y el antígeno relacionado con circumsporozoite (Meraldi y asociados, 2002)) han sido estudiados en Plasmodium sp., aunque su ortólogo en P. vivax no ha sido aclarado, excepto por una observación larga de secuencias. En una especie no P. vivax, el polipéptido es una proteína vesicular que se considera como importante en el transporte intracelular de las proteínas de parásito (Simmons y asociados, 1987). En P. falciparum, EXP1 se expresa como una proteína 23 kD en las etapas pre-eritrocíticas y de sangre asexual del parásito (Hope y asociados, 1984). Se encuentra una proteína de membrana integral en las membranas de vacuolos paracitoforos (vacuolos cubiertos por endoplásmico y retículo que protegen los parásitos intracelulares) y en vesículas dentro del citoplasma de la célula receptora (Kara y asociados, 1990; Sherman, 1985; Tolle y asociados, 1993). Los estudios utilizando un homólogo de múrido EXP1 mostraron que la proteína puede inducir inmunidad de célula-T protectora en ratones contra estímulos letales con P. yoelii (Charoénvit y asociados, 1999). Los anticuerpos elevados contra polipéptido EXP1 P. falciparum , han tenido éxito en detectar infecciones de malaria (Meraldi y asociados, 2002). Generalmente, el C-término es más antigénico en humanos (Meraldi y asociados, 2002).

Ha habido reportes del uso de secuencias EXP1 P. vivax como herramientas para el diagnóstico de infección por P. vivax (Kim y asociados, 2003; Son y asociados, 2001); sin embargo, estos esfuerzos tempranos parecen haber estado basados en secuencias incorrectas y los diagnósticos resultantes, detectaron más probablemente secuencias EXP1 P. falciparum. Tanto en los reportes de Kim y asociados (2003) como de Son y asociados (2001 ), los autores utilizaron secuencias de cebador desarrolladas aparentemente utilizando las secuencias descritas en la Publicación de Simmons y asociados (Simmons y asociados, 1987). Simmons y asociados (1987) reportó la secuencias EXP1 P. falciparum , y describió que la secuencia fue altamente conservada en cinco líneas P. falciparum; sin embargo, Simmons y asociados (1987) no reportó con respecto a algunas secuencias EXP1 de P. vivax. Kim y asociados (2003) y Son y asociados (2001) mencionan el número de Acceso GenBank No. X05074 como siendo de P. vivax; sin embargo, la entrada GenBank indica que este acceso es parte de P. falciparum. Para evadir esto, Kim y asociados (2003) y Son y asociados (2001 ) utilizaron la sangre de plantilla de un paciente con malaria vivax, no obstante el análisis de datos sugiere que los cebadores que utilizaron pueden no amplificar las secuencias de polinucleótido P. vivax, debido a que los 3 últimos nucleótidos (3') del cebador de avance, y los 6 últimos nucleótidos (3') del cebador de retroceso, no se endurecen en la secuencia EXP1 P. vivax putativa tal como se entiende el día de hoy.

La detección de anticuerpos en suero o plasma donado, puede ser utilizada para identificar donadores individuales quienes han sido expuestos a organismos de malaria, y quienes pueden haber sido infectados recientemente, y por consiguiente, son potencialmente parasitémicos. Las cuatro especies de Plasmodium que infectan a los humanos han sido transmitidas mediante transfusión sanguínea, y aunque es baja la incidencia de malaria post-transfusión en los Estados Unidos (Mungai y asociados, 2001 ), la disponibilidad de donadores de sangre puede incrementarse mediante la implementación de ensayos de clasificación de anticuerpo de plasmodium, de modo que únicamente los individuos expuestos al organismo de malaria sea rechazados de la donación de sangre en lugar de todos los donadores quienes hayan viajado o han vivido en regiones endémicas de malaria, tal como es la práctica actual.

Dichos ensayos teóricamente pueden detectar anticuerpos contra especies de plasmodium que infectan humanos y originan malaria (P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae). Los ensayos ELISAs de anticuerpo comercial actualmente están en uso (Reino Unido, Australia, Francia) o están siendo considerados en otros países para la restablecimiento de donadores rechazados (EIghouzzi y asociados, 2008; Kitchen y asociados, 2004; Seed y asociados, 2005). En estos casos, los donadores son probados con respecto a anticuerpos para antígenos derivados de plasmodium con varios meses de postergación .

Un ensayo comercial (Anticuerpo de Malaria Pan CELISA) de Cellabs Pty. Ltd. (Brookvale, NSW, Australia), reclama la detección de anticuerpos para las cuatro especies de plasmodium que originan malaria en humanos, y una sensibilidad de 94% versus la prueba de inmunofluorescencia (IFAT) (por inserto de paquete). La evaluación independiente sugiere que el ensayo tiene una sensibilidad deficiente para la detección de anticuerpo de malaria falciparum y no falciparum cuando se compara con IFAT (Mertens y asociados, 1999). La evaluación independiente de otro ensayo de DiaMed AG (Suiza) que utiliza una mezcla de extractos de proteína recombinante de P. falciparum y P. vivax cultivada (proteína de circumsporozoite) demostró una sensibilidad deficiente para detección de individuos sintomáticos con P. vivax confirmado en forma microscópica (18/24), pero no detectan anticuerpos en pacientes infectados con infección de P. ovale (2/2), o P. malariae (2/2) (Doderer y asociados, 2007). El ensayo de anticuerpo de malaria fabricado por Newmarket Laboratories Ltd (Kentford, Reino Unido) reclama la detección de las cuatro especies de plasmodium responsable de malaria humana, aunque contiene únicamente antígenos recombinantes derivados de P. falciparum y P. vivax. El inserto del paquete indica sensibilidad para la detección de anticuerpo P. ovale y P. malariae únicamente de 80% y 67%, respectivamente. La detección de anticuerpos entre individuos infectados con P. ovale o P. malariae puede ser debido a una infección en el pasado ya sea con P. falciparum o P. vivax, y por lo tanto la reactividad se debe a la detección de anticuerpos persistentes para estos agentes. La evaluación independiente del ensayo, demostró detección únicamente de 9/14 (64%) de pacientes con malaria aguda debido a infección P. ovale, y del 85% (15/18) de pacientes con malaria P. vivax (Kitchen y asociados, 2004). Por lo tanto, la capacidad reclamada de estos ensayos para detectar anticuerpos humanos provocados por infección de P. falciparum , así como P. ovale, P. vivax y P. malariae, es cuestionable. Para los ensayos cuya composición del antígeno de fase sólida es conocido (por ejemplo Newmarket, Dia ed), la ausencia de antígenos específicos de P. ovale o P. malariae sugieren que la detección de anticuerpos a estas especies puede ser debido a la reactividad cruzada del anticuerpo que da surgimiento a preguntas importantes con respecto a la especificidad de ensayo, así como sensibilidad, o a la reactividad observada en muestras de P. ovale o P. malariae se debe a la presencia de anticuerpos P. falciparum o P. vivax de infecciones anteriores.

Por lo tanto, actualmente existe una necesidad importante de una detección confiable de anticuerpos de plasmodium por P. vivax.

Todas las patentes y publicaciones aquí mencionadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia .

Breve Descripción de la Invención En un primer aspecto, la presente invención se dirige a secuencias de ácido nucleico aisladas o fragmentos de las mismas, que comprenden o son complementarias para una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácido del polipéptido en al menos el 70% de identidad con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3 y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2. La secuencia de ácido nucleico, puede ser por ejemplo la de la SEC ID NO : 1, o aislada de Plasmodium vivax.

En un segundo aspecto, la presente invención se dirige a proteínas purificadas codificadas por un ácido nucleico que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1.

En un tercer aspecto, la presente invención se dirige a proteínas purificadas o fragmentos de las mismas que comprenden una secuencia de aminoácido que tiene al menos el 70% de identidad con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2.

En un cuarto aspecto, la presente invención se dirige a métodos para producir una proteína, en donde el método comprende los pasos de: (a) aislar una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID NO:1; (b) construir un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico aislada enlazada en forma operable a una secuencia reguladora; y (c) introducir el vector en la célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión de dicha proteína.

La célula huésped puede ser una célula procariótica o eucariótica.

En un quinto aspecto, la presente invención se dirige a vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que comprenden la SEC ID NO:1, enlazada en forma operable a una secuencia reguladora, y a células huésped que comprenden dichos vectores.

En un sexto aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un antígeno que comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo/antígeno; y (b) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de los complejos de anticuerpo/antígeno.

En un séptimo aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un antígeno que comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo/antígeno; (b) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes, para permitir que el conjugado enlace al anticuerpo enlazado, en donde el conjugado comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada por el compuesto que genera la señal.

En un octavo aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un antígeno que comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo/antígeno; (b) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes, para permitir que el conjugado enlace al anticuerpo enlazado, en donde el conjugado comprende un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N0.2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2 adheridos a un compuesto que genera una señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada del compuesto que genera la señal.

En un noveno aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar la presencia de anticuerpo P. vivaxs en una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un anti-anticuerpo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes, para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo P. vivax; (b) agregar un antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo P. vivax resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el antígeno enlace al anticuerpo enlazado, en donde el antígeno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2; (c) agregar un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anf/c-verpo P. \//Vax/antígenos resultantes, en donde el conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevado contra complejos de anticuerpo P. i/ax/antígeno adheridos a un compuesto que genera la señal, con la capacidad de generar una señal detectable; y (d) detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en el compuesto de prueba detectando la presencia de la señal generada por el compuesto que genera la señal.

Aún en un noveno aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar anticuerpos para P. malariae, P. falciparum, P. vivax y P. ovale en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con: (i) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, (ii) un antígeno de P. falciparum; (iii) un antígeno de P. ovale, y (iv) un antígeno de P. malariae, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo P. ma/ar/ae/antígeno, complejos de anticuerpo P. falciparum/antigeno, complejos de anticuerpo P. v/Vax/antígeno, y complejos de anticuerpo P. ova/e/antígeno; y (b) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de uno o más de los complejos.

En un decimoprimero aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con: (i) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, (¡i) un antígeno P. ovale, (iii) un antígeno P. malariae y (¡v) un antígeno P. falciparum , durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anticuerpo P. ma/ar/ae/antígeno, complejos de anticuerpo P. ova/e/antígeno, complejos de anticuerpo P. i//vax/antígeno y complejos de anticuerpo P. falciparum/antigeno; (b) agregar cuatro conjugados a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que cada conjugado enlace al anticuerpo enlazado, en donde el primer conjugado comprende un antígeno que comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, adheridos a un compuesto que genera la señal, con la capacidad de generar una señal detectable; un segundo conjugado comprende un antígeno P. ovale adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; un tercerconjugado que comprende un antígeno P. malariae adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, y un cuarto conjugado que comprende un antígeno P. falciparum adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia del anticuerpo para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum , que puede estar presente en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada por el compuesto que genera la señal.

En un decimosegundo aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con: (i) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, (ii) un antígeno P. malariae, (iii) un antígeno P. vivax y (iv) un antígeno P. falciparum , durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anticuerpo P. ma/ar/ae/antígeno, complejos de anticuerpo P. ova/e/antígeno, complejos de anticuerpo P. v/Vax/antígeno y complejos de anticuerpo P. falciparum/antígeno; (b) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígenos resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que cada conjugado enlace al anticuerpo enlazado, en donde el conjugado comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia del anticuerpo para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum , que puede estar presente en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada por el compuesto que genera la señal.

En un decimotercer aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar la presencia de anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un anti-anticuerpo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anti-anticuerpo/P. vivax, anti-anticuerpo/P. malariae, anti-anticuerpo/P. ovale, y anti-anticuerpo/P. falciparum; (b) agregar un primer antígeno, un segundo antígeno, un tercer antígeno y un cuarto antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/P. vivax, anti-anticuerpo/P. malariae, anti-anticuerpo/P. ovale, y anti-anticuerpo/P. falciparum resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que los antígenos se enlacen al anticuerpo enlazado, en donde (i) el primer antígeno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2; (ii) el segundo antígeno comprende un antigeno P. ovale; (iii) el tercer antígeno comprende un antígeno P malariae; y (iv) el cuarto antígeno comprende un antígeno P. falciparum; (c) agregar un primer conjugado, un segundo conjugado, un tercer conjugado y un cuarto conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que los conjugados se enlacen al anticuerpo enlazado, en donde los conjugados cada uno se adhieren a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (i) el primer conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevado contra complejos de anticuerpo P vax/antígeno; (ii) el segundo conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevado contra complejos de anticuerpo P. ova/e/antígeno; (iii) el tercer conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevado contra complejos de anticuerpo P. ma/ar/ae/antígeno; (vi) el cuarto conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevados contra complejos de anticuerpo P. fa/c/parum/antígeno; y (d) detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada por los compuestos que generan la señal.

En un decimocuarto aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar la presencia de anticuerpos para P malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un anti-anticuerpo para permitir la formación de complejos de antianticuerpo/anticuerpo; (b) agregar un primer conjugado, un segundo conjugado, un tercer conjugado y un cuarto conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo resultantes, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que los conjugados enlacen al anticuerpo enlazado, en donde el primer conjugado comprende un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, adheridos a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, en donde el segundo conjugado comprende un antígeno P. ovale a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, en donde el tercer conjugado comprende un antígeno P. vivax adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, y en donde el cuarto conjugado comprende un antígeno P. falciparum adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada por el compuesto que genera la señal.

En un decimoquinto aspecto, la presente invención se dirige a vacunas que comprenden: (a) al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: (i) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, o un epítope del mismo. Dichas vacunas pueden comprender además un antígeno seleccionado del grupo que consiste en P. falciparum , P. ovale, y P. malariae; y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En un decimosexto aspecto, la presente invención se dirige a equipos para determinar la presencia de anticuerpo para P. vivax en una muestra de prueba, en donde los equipos comprenden: (a) un antígeno que comprende una secuencia de amino ácido seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los amino ácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2 y (b) un conjugado que comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable.

En un decimoséptimo aspecto, la presente invención se dirige a equipos para determinar la presencia de un anticuerpo para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba, en donde los equipos comprenden: (a) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, un antígeno P. ovale, un antígeno P. malariae y un antígeno P. falciparum y (b) un conjugado que comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable.

En un decimoctavo aspecto, la presente invención se dirige a equipos para detectar anticuerpos para P. malariae , P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba, en donde los equipos comprenden: a) un antianticuerpo y b) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, un antígeno P. ovale, un antígeno P. malariae y un antígeno P. falciparum y b) un conjugado que comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable.

En un decimonoveno aspecto, la presente invención se dirige en forma adicional a equipos para detectar anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba, en donde los equipos comprenden: (a) un anti-anticuerpo e (b) un primer conjugado que comprende un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, adheridos a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, un segundo conjugado que comprende un antígeno P. ovale adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; un tercer conjugado que comprende un antígeno P. malariae adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable y un cuarto conjugado que comprende un antígeno P. falciparum adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable.

En un vigésimo aspecto, la presente invención se dirige a métodos para detectar la presencia de anticuerpos P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos, en donde los métodos comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un anti-anticuerpo durante un período y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de los complejos de anti-anticuerpo/anf/'cuerpo P. vivax; (b) agregar antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/anf/ci/erpo P. vivax resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el antígeno enlace al anticuerpo enlazado, en donde el antígeno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID NO:2, en donde el antígeno se conjuga a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada por el compuesto que genera la señal.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1A, muestra la secuencia de polinucleótido del gen de "Proteína 1 Exportada" (EXP1) Plasmodium vivax optimizado (SEC ID NO:1). La figura 1B muestra la secuencia de aminoácido (SEC ID NO:2) de la proteína EXP1 codificada por el gen EXP1 mostrado en la figura 1A (SEC ID NO:1). La figura 1C muestra un fragmento sintético (SEC ID NO:3) que constituye la porción C-terminal de la proteína EXP1 mostrada en la figura 1B (SEC ID NO:2).

La figura 2 muestra el formato de ensayo descrito en el Ejemplo 9.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico y polipéptido novedosas diseñadas a partir de P. vivax. Dichas secuencias de ácido nucleico y polipéptidos se pueden utilizar para propósitos de diagnóstico, así como para propósitos terapéuticos.

Secuencia de Polinucleótido v Polipéptidos Codificados Los inventores descubrieron que los anticuerpos antí-EXP1 están presentes a los pocos días o semanas de infección con P. vivax. Estos anticuerpos no parecen persistir ya que son difíciles de detectar en muestras de suero tomadas de individuos quienes se recuperaron de malaria en años anteriores. Por lo tanto, el IgG EXP1 es un marcador de infección reciente, que puede ser importante para identificación de anticuerpos entre donadores de sangre quienes recientemente han viajado a áreas endémicas de malaria.

La presente invención se dirige en parte a polinucleotidos y polipéptidos novedosos que son útiles, por ejemplo, para detectar infección por P. vivax de un sujeto. Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención son particularmente útiles para identificar los sujetos que han sido infectados recientemente con P. vivax. Por lo tanto, la presente invención proporciona herramientas de diagnóstico, así como herramientas para clasificar muestras de sujetos, tales como tejidos, incluyendo, por ejemplo, sangre. La detección de infección por P. vivax reciente, permite eliminar del suministro de sangre la sangre recolectada no adecuada, protegiendo de esta forma a los sujetos receptores.

La presente invención tiene la ventaja de que los polipéptidos reconíbinantes EXP1 pueden utilizarse para detección específica de anticuerpos en suero o plasma de individuos infectados con P. vivax a los pocos días o semanas de la infección. Por lo tanto, un marcador de infección de fase temprana (aguda) de polipéptidos EXP1, tiene la capacidad de identificar individuos recientemente expuestos a P. vivax. Ya que estos individuos pueden ser donadores de sangre, la detección de anticuerpos en forma rápida después del la seroconversión, reduce el riesgo de malaria transmitida por transfusión.

Los inventores de la presente invención, lograron la misma anticipando en forma precisa la secuencia de polinucleótido que codifica la porción C-terminal del polipéptido EXP1 P. vivax, y posteriormente probando las capacidades de los polipéptidos codificados para enlazar anrticuerpo anti-EXP1, incluyendo los anticuerpos de muestras recolectadas de sujetos.

En una modalidad, un polipéptido EXP1 recombinante fusionado con una secuencia CKS terminal amino y utilizada en un ELISA indirecto, detecta anticuerpos IgG y IgM anti-EXP1 en individuos infectados con P. vivax.

En una modalidad, un polipéptido EXP1 recombinante de la presente invención se recubre en el soporte de fase sólida y se utiliza para capturar anticuerpos presentes en suero o plasma. Se utiliza el conjugado de anti-inmunoglobulina para detectar inmunoglobulina enlazada.

La secuencia de la proteína EXP1 codificada para P. vivax, fue anticipada mediante homología de secuencia con las proteínas P. falciparum y P. yoelii, e identificando los sitios de división potenciales de la secuencia genómica P. vivax. La secuencia de polinucleótido de la presente invención para el gen sintético EXP1 P. vivax se muestra en la figura 1A (SEC ID NO:1), y la secuencia de aminoácido codificada se muestra en la figura 1B (SEC ID NO:2); estas secuencias también se muestran en la tabla A, que también indica características específicas. El gen contiene un sitio 5'-EcoRI seguido de un codón de inicio (subrayado) codificando el cuerpo del gen la secuencia de aminoácido C-terminal anticipada de EXP1 P. vivax, una secuencia que codifica una etiqueta de histidina (en cursivas), un codón de detención (negritas) y un sitio BamHI. Los sitios de enzimas de restricción se utilizaron para clonarse en vectores de expresión, y la etiqueta de histidina se incluyó para facilitar la purificación subsecuente de la proteína expresada. Las composiciones y métodos de la presente invención comprenden las secuencias de polinucleótido y polipéptido no modificadas en donde la etiqueta de histidina es eliminada, así como los polipéptidos que carecen de la metionina inicial y la etiqueta His tal como la de la SEC ID NO:3.

TABLA A Polinucleótido EXP1 (SEC ID NO: 1) y polipéptido codificado (SEC ID NO: 2) gaattcc atg aac gcc ggt aac ggt cgt cat cea ttt tet ctg ggt ggt ggt aaa ggt ggc 61 Met Asn Ala Gly Asn Gly Arg His Pro Phe Ser Leu Gly Gly Gly Lys Gly Gly 18 gac gcg gcg cct acg gag ccg acg ccg gca ccg ace gcg ccg age gca act ggt ctg aac 121 Asp Ala Ala Pro Thr Glu Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ala Pro Ser Ala Thr Gly Leu Asn 38 gat gac ggt tet tet tet ggc act gaa tet act tet cat cat cae cat cae cat tga gga 181 Asp Asp Gly Ser Ser Ser Gly Thr Glu Ser Thr Ser His His His His His His 56 tec 184 La presente invención también se refiere a polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácido que son aproximadamente el 70% idénticas a, preferentemente al menos aproximadamente el 80% idénticas a, y más preferentemente al menos aproximadamente 90% idénticas a la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 o 3 o a los residuos 2 a 50 de la SEC ID NO: 2.

La presente invención comprende "fragmentos" y "péptidos" de los polipéptidos de longitud total aquí descritos. Dichos péptidos representan porciones del polipéptido que tienen, por ejemplo, propiedades inmunogénicas o de enlace específicas. Un fragmento puede tener de 3 a 10 aminoácidos, 10 a 20 aminoácidos, 20 a 40 aminoácidos, 40 a 56 aminoácidos de longitud o incluso más largo. Las secuencias de aminoácido que tiena al menos el 70% de identidad de aminoácido, preferentemente al menos el 80% de identidad de aminoácido, y más preferentemente al menos el 90% de identidad con los fragmentos aquí descritos, también están incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Un "epítope" es un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítope puede o comprender al menos tres aminoácidos en una formación de espacio que es única para el epítope. Generalmente, un epítope consiste en al menos cinco aminoácidos y más normalmente consiste en al menos ocho a diez aminoácidos.

Además, la presente invención comprende fragmentos y derivados de secuencias de ácido nucleico de la presente invención, así como a fragmentos y porciones de secuencias de aminoácido de la presente invención. La presente invención también comprende equivalentes funcionales de las secuencias de la presente invención (por ejemplo, secuencias de polinucleótido que codifican proteínas que tienen por ejemplo las mismas afinidades de enlace, epítopes, etc. de las proteínas codificadas).

La presente invención también se dirige a métodos para detectar infecciones P. vivax recientes, en donde la muestra de prueba del sujeto es analizada para la presencia de anticuerpos EXP1 anti-P. vivax. El uso de anticuerpos anti-EXP1 para detectar infecciones por P. vivax recientes es efectivo debido a que los anticuerpos de polipéptido anti-EXP1, están en sus tituladores más altos y son detectables en forma más fácil en sujetos quienes han sido infectados recientemente, aunque el titulador disminuye con el tiempo a niveles casi indetectables. La muestra de prueba se contacta con un polipéptido EXP1 y posteriormente el enlace del polipéptido EXP1 mediante anticuerpos presentes en la muestra de prueba es detectado. En una modalidad, los polipéptidos EXP1 se enlazan a un substrato.

DEFINICIONES El término "híbrida en forma específica" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para enlazar en forma detectable y específica a un segundo ácido nucleico. Los polinucleótidos hibrídan específicamente con hebras de ácido nucleico objetivo bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de enlace detectable medíante ácidos nucleicos no específicos.

La "secuencia objetivo" o "secuencia de ácido nucleico objetivo" significa una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido EXP1 P. vivax, o complementos del mismo, que se amplifica, detecta o ambos, utilizando por ejemplo, polinucleótidos complementarios. Además, aunque el término secuencias objetivo, algunas veces se refiere a una secuencia de ácido nucleico de hebra doble, una secuencia objetivo también puede ser de hebra simple. En casos en donde el objeto de hebra doble, la secuencia de cebador de polinucleótído de la presente invención amplifican preferentemente ambas ebras de la secuencia objetivo.

El término "muestra de prueba" significa una muestra tomada de un sujeto, o un fluido biológico, en donde la muestra puede contener polipéptido P. vivax o anticuerpo de polipéptido P. vivax. Una muestra de prueba puede tomarse de cualquier fuente, por ejemplo, tejido, sangre, saliva, esputo, mocos, sudor, orina, hisopos uretrales, hisopos cervicales, hisopos urogenitales o anales, hisopos conjuntivales, fluido de lente ocular, fluido cerebroespinal, etc. Se puede utilizar una muestra de prueba (i) directamente tal como se obtiene de la fuente; o (ii) después de un tratamiento previo para modificar el carácter de la muestra. Por lo tanto, una muestra de prueba puede ser tratada previamente antes de utilizarse, por ejemplo, preparando plasma o suero de la sangre, interrumpiendo partículas de célula o virales, preparando líquidos de materiales sólidos, diluyendo fluidos viscosos, o filtrando líquidos, agregando reactivos, purificando ácidos nucleicos, etc.

El término "sujeto" incluye un mamífero, un ave o un réptíl. El término sujeto puede ser una vaca, un caballo, un perro, un gato, o un primate. El sujeto también puede ser un humano. Los sujetos pueden estar vivos o muertos.

Un "polinucleótido" es un polímero de ácido nucleico de ácido ribonucleico (ARN), o ácido desoxirribonucleico (ADN), ARN o ADN modificado, o miméticos de ARN o ADN (tal como PNAs), y derivados de los mismos y homólogos de los mismos. Por lo tanto los polinucleótidos incluyen polímeros compuestos de nucleobases que ocurren naturalmente, azúcares y ligaduras de internucleósido covalentes (esqueletos), así como polímeros que tienen porciones que no ocurren naturalmente que funcionan de manera similar. Dichos polímeros de ácido nucleico modificados o sustituidos son conocidos en la técnica, y para los propósitos de la presente invención, son referidos como "análogos". Los oligonucleótidos generalmente son polinucleótidos cortos de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 160 ó 200 nucleótidos.

Un "polinucleótido variante'' o un "secuencia de ácido nucleico variante" significa un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente el 60% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferentemente al menos aproximadamente el 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico, y aún más preferentemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1. Las variantes no comprenden la secuencia de nucleótido nativa. Otros polinucleótidos variantes incluyen los que difieren de la SEC ID NO: 1, pero debido a la redundancia del código genético, codificando un polipéptido de la SEC ID No: 2 ó 3, o aminoácidos 2 a 50 de la SEC ID No: 2, fragmentos de los mismos.

Normalmente, los polinucleótidos variantes tienen al menos aproximadamente 8 nucleótidos de longitud, con frecuencia al menos aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 nucleótidos de longitud, o incluso aproximadamente 75 a 200 nucleótidos de longitud, o más.

El término "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencias de ácido nucleico se define como los porcentajes de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de interés, después de alinear las secuencias e introducir brechas, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con propósitos de determinar el porcentaje de la identidad de secuencia de ácido nucleico, se puede lograr en varias formas que están dentro de las habilidades en la técnica, por ejemplo, utilizando un software de computadora disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr una alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que están siendo comparadas.

Cuando las secuencias de nucleótido están alineadas, el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico determinada, C para, con, o contra una secuencia de ácido nucleico determinada D (la cual alternativamente puede ser mencionada como una secuencia de ácido nucleico C determinada que tiene o comprende cierto porcentaje de identidad de secuencia ácido nucleico para, con, o contra una secuencia de ácido nucleico D) determinada puede calcularse como se indica a continuación: porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico = W/Z 100 en donde W es el número nucleótidos en el centro como correspondencias idénticas a través de la alineación de C y D del programa o algoritmo de alineación de secuencia y Z es el número total de nucleótidos en D.

Cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de C o D no será igual al porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de D a C.

"Que consiste esencialmente de un polinucleótido que tiene un % de identidad de secuencia" significa que el polinucleótido no difiere sustancialmente en longitud, sino puede diferir sustancialmente en secuencia. Por lo tanto, un polinucleótido "A" que consiste esencialmente en un polinucleótido que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con una secuencia conocida "B" de 100 nucleótidos, significa que el polinucleótido "A" tiene aproximadamente 100 nts de longitud, pero hasta 20 pueden variar de la secuencia "B". La secuencia de polinucleótido en cuestión puede ser más larga o más corta debido a la modificación del término, tal como, por ejemplo, la adición de 1 a 15 nucleótidos para producir tipos específicos de sondas, cebadores y otras herramientas moleculares, etc., tal como el caso cuando se agregan secuencias sustancialmente no idénticas para crear estructuras secundarias proyectadas. Los nucleótido no idénticos no se consideran dentro del cálculo de la identidad de secuencia, cuando la secuencia es modificada mediante "consiste esencialmente en".

La especificidad del ADN de hebra simple para hibridar fragmentos complementarios, se determina mediante la rigurosidad de las condiciones de reacción. La rigurosidad de hibridación incrementa conforme disminuye la propensión de formar dúplex ADN. En reacciones de hibridación de ácido nucleico, la rigurosidad puede elegirse para favorecer hibridaciones específicas (alta rigurosidad). Se pueden utilizar hibridaciones menos específicos (baja rigurosidad) para identificar moléculas de ADN relacionadas, aunque no exactas (homologas, pero no idénticas) o segmentos.

Los dúplex de ADN son estabilizados mediante: (1) el número de pares base complementarios, (2) el tipo de pares base, (3) concentración de sal (fuerza iónica) de la mezcla de reacción, (4) la temperatura de la reacción y (5) la presencia de ciertos solventes orgánicos tal como formamida, que disminuye en la estabilidad dúplex de ADN. Un método común es variar la temperatura: temperaturas relativas más altas da como resultado condiciones de reacción más estrictas. (Ausubel y asociados, 1987) proporciona una excelente explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación.

La hibridación bajo "condiciones estrictas" significa protocolos de hibridación en los cuales las secuencias de nucleótido al menos 60% homologas entre sí, permanecen hibridadas.

Los polinucleótidos pueden incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos (por ejemplo dirección de receptores de célula huésped in vivo) o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular. Además, los oligonucléótidos pueden ser modificados con agentes de disociación activados mediante hibridación (van der Krol y asociados, 1988) o agentes de intercalado (Zon, 1988). El oligonucleótido puede ser conjugado a otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de reticulación activado por hibridación, un agente de transporte, un agente de disociación activado por hibridación y similares.

Los análogos de polinucleótido útiles incluyen polímeros que tienen esqueletos modificados o ligaduras inter-nucleósido no naturales. Los esqueletos modificados incluyen los que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto, tal como fosforotioatos, fosforotioatos quirálicos, fosforoditionatos, fosfotriésteress, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros fosfonatos de alquilo, así como aquellos que ya no tiene un átomo de fósforo, tal como esqueletos formados mediante ligaduras internucleósido de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, un heteroátomo mezclado y ligaduras de internucleósido de alquilo o cicloalquilo, o una o más ligaduras internucleósido heteroaromático o heterocíclico de cadena corta. Los polímeros de ácido nucleico modificados (análogos) pueden contener una o más porciones de azúcar modificada.

También son útiles análogos que son miméticos de ARN o ADN en los cuales el azúcar así como la ligadura internucleósido de las unidades de nucleótido son reemplazadas con grupos novedosos. En estos miméticos, las unidades base se mantienen para hibridación con la secuencia objetivo. Un ejemplo de dicho mimético, que ha mostrado tener excelentes propiedades de hibridación, es un ácido nucleico de péptido (PNA) (Buchardt y asociados, 1992; Nielsen y asociados, 1991).

El dominio de los nucleótidos incluye derivados en donde la molécula de ácido nucleico ha sido modificada en forma covalente mediante sustitución, medios químicos, enzimáticos u otros medios adecuados con una porción diferente a un nucleótido que ocurre naturalmente.

El polinucleótido de la SEC ID NO:1 se puede preparar mediante técnicas convencionales, tal como síntesis de fase sólida utilizando un equipo comercialmente disponible, tal como el disponible en Applied Biosystems USA Inc. (Foster City, CA; USA), DuPont, (Wilmington, DE; USA), o Milligen (Bedford, MA¡ USA). Los polinucleótidos modificados tales como fosforotioatos y derivados alquilados, también se pueden preparar fácilmente a través de métodos similares conocidos en la técnica (Fino, 1995; Mattingly, 1995; Ruth, 1990).

La "identidad entre dos secuencias de aminoácido" se definen como la presencia de una serie de residuos de aminoácido invariantes o exactamente comparables en ambas secuencias (ver definición anterior con respecto a identidad entre secuencias de ácido nucleico). Las definiciones de "complementariedad" y "identidad" son conocidas para los expertos en la técnica.

El término "codificado por" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido, en donde la secuencia de polipéptido o porción del mismo que contiene la secuencia de aminoácido de al menos 3 aminoácidos, más preferentemente al menos 8 aminoácidos, e incluso más preferentemente al menos 15 aminoácidos de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico.

La presente también comprende secuencias de polinucleótido aisladas que codifican un polipéptido que tiene actividad funcional similar a la de la SEC ID NOs: 2 y 3, y que son hibridizables, bajo condiciones moderadamente estrictas, a un polinucleótido que tiene una secuencia nucleica que comprende, o complementaria a, secuencias de nucleótido descritas anteriormente.

Los términos "fragmento o subfragmento que es funcionalmente equivalente" y "fragmento o subfragmento que es funcionalmente equivalente" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención. Estos términos se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en el cual la capacidad de alterar la expresión genética o producir cierto fenotipo se retiene ya sea que el fragmento o subfragmento codifique o no una enzima activa. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento puede utilizarse en el diseño de construcciones quiméricas para producir fenotipo deseado en una planta transformada. Las construcciones quiméricas pueden ser diseñadas para utilizarse en co-supresión o antisentido, ligando un fragmento de ácido nucleico o subfragmento del mismo, ya sea que codifique o no una proteína activa, en la orientación adecuada relativa a una secuencia promotora.

Los términos "homología", "homólogo", "substancialmente similar" y "que corresponde sustancialmente" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención. Se refiere a fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases de nucleótido no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para transmitir expresión genética producida en cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, tal como eliminación o inserción de uno o más nucleótidos, que no alteran substancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante relativas al fragmento inicial, no modificado. Por consiguiente queda entendido, tal como lo pueden apreciar los expertos en la técnica, que la presente invención comprende más de las secuencias de ejemplo específicas aquí descritas.

El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias de no codificación 5') y que son subsecuentes (secuencias de no codificación 3') a las secuencias de codificación.

El término "gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. En contraste, una "construcción quimérica" se refiere a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que normalmente no se encuentran juntos en la naturaleza. Por consiguiente, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que son derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero ajustadas en una forma diferente de la encontrada normalmente en la naturaleza. (El término "aislado" significa que la secuencia se elimina de su ambiente natural).

Un gen "extraño" se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo huésped, aunque se introduce en el organismo huésped mediante transferencia genética. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o construcciones quiméricas. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

Una "sonda" o "cebador" tal como se utiliza en la presente invención, es un polinucleótido que tiene al menos 8 nucleótidos de longitud, y forma una estructura híbrida con una secuencia objetivo, debido a la complementariedad de al menos una secuencia en la sonda o cebador con una secuencia en la región objetivo. Las regiones de polinucleótido de la sonda pueden estar compuestas de ADN y/o ARN y/o análogos de nucleótido sintético. Preferentemente, la sonda no contiene una secuencia que es complementaria a la secuencia o secuencias utilizadas para cebar una secuencia objetivo durante la reacción de cadena de polimerasa.

La "secuencia de codificación" se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácido específica.

Las "secuencias reguladoras" se refieren a secuencias de nucleótido localizadas en la corriente ascendente (secuencia de no codificación 5') dentro, o descendente (secuencias de no codificación 3') de una secuencia de codificación, y que influencia la transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, y secuencias de reconocimiento de poliadenilación .

El término "promotor" (o "secuencia reguladora") se refiere a una secuencia ADN con la capacidad de controla la expresión de una secuencia de codificación o ARN. La secuencia promotora, por ejemplo, consiste en los elementos de corriente ascendente próximos y más distales, siendo los últimos elementos con frecuencia referidos como aumentadores. Por consiguiente, un "aumentador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para aumentar el nivel de especificidad-tejido de un promotor. Las secuencias reguladoras (por ejemplo, un promotor) también se pueden localizar dentro de las porciones transcritas de los genes y/o la corriente descendente de las secuencias transcritas. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de elementos diferentes derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprenden segmentos de ADN sintético. Quedará entendido para los expertos en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos diferentes o tipos celulares, o en etapas de desarrollo diferentes, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que originan que un gen sea expresado en la mayor parte de los tipos de célula huésped, la mayor parte de las veces, son comúnmente referidos como "promotores constitutivos". Constantemente se están descubrimientos nuevos promotores de diversos tipos útiles en células de plantas; se pueden encontrar numerosos ejemplos en la compilación de la Publicación de Okamura y asociados (1989) (Okamura y Goldberg, 1989). Se reconoce en forma adicional que ya que como en la mayoría de los casos, no se han definido completamente los límites exactos de las secuencias reguladoras, los fragmentos de ADN de ciertas variaciones pueden tener actividad promotora idéntica.

El "intrón" es una secuencia de intervención en un gen que no codifica una porción de la secuencia de proteína. Por lo tanto, dichas secuencias son transcritas en ARN pero posteriormente son cortadas y no son traducidas. El término también se utiliza para las secuencias de ARN cortadas. Un "exón" es una porción de la secuencia de gen que se transcribe y se encuentra en el ARN mensajero maduro derivado del gen, pero no es necesariamente una parte de la secuencia que codifica el producto de gen final.

La "secuencia líder de traducción" se refiere a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia de codificación. La secuencia líder de traducción está presente en la corriente ascendente mARN completamente procesada de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria a mARN, la estabilidad de mARN o eficiencia de traducción. Los ejemplos de las secuencias líder de traducción han sido descritos (Turner y Foster, 1995).

Las "secuencias de no codificación 3' " se refiere a secuencias de ADN localizadas en la corriente descendente de una secuencia de codificación e incluye secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras con la capacidad de afectar el procesamiento de ARN o expresión genética. La señal de poliadenilación normalmente está caracterizada por afectar la adición de los tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor mARN. El uso de diferentes secuencias de no codificación 3', está ejemplificado por Ingelbrecht y asociados, (1989) Plant Cell 1: 671-680.

La "transcripción de ARN" se refiere a un producto que resulta de la transcripción catalizada por polimerasa ARN de una secuencia de ADN. Cuando la transcripción de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se refiere como la transcripción primaria o puede ser Una secuencia de ARN derivada del procesamiento posttranscripción de la transcripción primaria y se refiere como el ARN maduro. El "ARN mensajero (mARN)" se refiere al ARN que está sin intrones y que puede ser traducido en proteína a través de la célula. "cADN" se refiere a un ADN que es complementario y sintetizado de una plantilla de mARN utilizando la transcriptasa inversa de enzimas. El cADN puede ser de hebra simple o convertirse en la forma de hebra doble utilizando el fragmento de Klenow y la pólimerasa I de ADN. El ARN "de sentido" se refiere a la transcripción de ARN que incluye el mARN y puede ser traducido en proteína dentro de una célula o "¡n vitro". El "ARN antisentido" se refiere a una transcripción de ARN que es complementaria a toda o parte de una transcripción primaría objetivo o mARN y que bloquea la expresión del gen objetivo (Patente Norteamericana No. 5,107,065). La complementariedad del ARN antisentído puede estar con cualquier parte de la transcripción del gen específico, es decir, la secuencia de no codificación 5', la secuencia de no codificación 3', intrones o la secuencia de codificación. El "ARN funcional" se refiere al ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que puede no ser traducido pero que aún tiene un efecto en los procesos celulares. Los términos "complemento" y "complemento inverso" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención con respecto a transcripciones de mARN y significa que definen el ARN antisentido del mensaje.

El "ARN endógeno" se refiere a cualquier ARN que es codificado por cualquier secuencia de ácido nucleico presente en el genoma del receptor antes de la transformación con la construcción recombinante de la presente invención, ya sea que ocurre naturalmente o no ocurre naturalmente, por ejemplo, es introducida mediante medios recombinantes, mutagénesis, etc.

El término "que ocurre no naturalmente" significa artificial, no consistente con lo que normalmente se encuentra en la naturaleza .

El término "enlazado en forma operable" se refiere a la asociación de las secuencias de ácido nucleico en un fragmento de ácido nucleico simple, de modo que la función de uno sea regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor se enlaza en forma operable con una secuencia de codificación que tiene la capacidad de regular la expresión de dicha secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación esté bajo el control de transcripción del promotor). Las secuencias de codificación pueden ser enlazadas en forma operable a secuencias reguladoras en una orientación de sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementarias de la presente invención pueden ser enlazadas en forma operable, ya sea directa o indirectamente, 5' al mARN objetivo, o 3' al mARN objetivo, o dentro del mARN objetivo, o una primera región complementaria es 5' y su complemento es 3' para el mARN objetivo.

El término "expresión" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a la producción de un producto final funcional. La expresión de un gen implica transcripción del gen y traducción del mARN en una proteína precursora o madura. El término "inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcripciones de ARN antisentido con la capacidad de suprimir la expresión de la proteína objetivo. El término "co-supresión" se refiere a la producción de transcripciones de ARN de sentido con la capacidad de suprimir la expresión de genes endógenos o extraños idénticos o sustancialmente similares (Patente Norteamericana No. 5,231,020).

El término proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado en forma post-traducción, por ejemplo uno del cual se han eliminado cualesquiera pre o pro-péptidos presentes en el producto de traducción primario. El término proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción de mARN, es decir, con pre y pro péptido aún presentes. Los pre y pro-péptidos pueden ser pero no se limitan a las señales de localización intracelular.

La "transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo huésped, que da como resultado una herencia genéticamente estable. En contraste, el término "transformación temporal" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u organelo que contiene ADN, de un organismo huésped que da como resultado la expresión genética sin integración o herencia estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados son referidos como organismos "transgénicos". El término "transformación" tal como se utiliza en la presente invención se refiere tanto a transformación estable como a transformación temporal.

Las técnicas de clonación molecular y de ADN recombinante estándar, utilizadas en la presente invención son conocidas en la técnica y se transcriben en forma más completa en la publicación de Sambrook y asociados (1989) (Sambrook, 1989) (en lo sucesivo "Sambrook").

El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otra manera, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética.

El término "PCR" o "Reacción de Cadena de Polimerasa" es una técnica para la síntesis de grandes cantidades de segmentos de ADN específico, que consisten en una serie de ciclos de repetición (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Normalmente, el ADN de hebra doble es desnaturalizado con calor, los dos cebadores complementarios a los límites 3' del segmento objetivo son indurecidos a baja temperatura y posteriormente extendidos a una temperatura intermedia. Un conjunto de estos tres pasos consecutivos es referido como un ciclo.

PCR es una técnica poderosa utilizada para amplificar millones de veces el ADN, mediante réplica repetida en una plantilla, en un período de tiempo corto. ((Mullís y asociados, 1986); Erlich y asociados, Solicitud de Patente Europea No. 50,424; Solicitud de Patente Europea No. 84,796; Solicitud de Patente Europea No. 258,017, Solicitud de Patente Europea No. 237,362; Solicitud de Patente Europea No. 201,184, Patente Norteamericana No. 4,683,202; Patente Norteamericana No. 4,582,788; y Patente Norteamericana No. 4,683,194). El proceso utiliza conjuntos de oligonucleótidos sintetizados in vitro específicos para cebar síntesis de ADN. El diseño de cebadores depende de las secuencias de ADN que serán analizadas. La técnica se lleva a cabo a través de muchos ciclos (normalmente 20 a 50) de rendimiento de la plantilla a alta temperatura, permitiendo que los cebadores se endurezcan para secuencias complementarias dentro de la plantilla y posteriormente repliquen la plantilla con polimerasa de ADN.

Los productos de reacciones PCR son analizados mediante separación en geles de agarosa seguido de manchado con bromuro de etidio y visualización con transiluminación UV. Como alternativa, los dNTPs radioactivos pueden agregarse al PCR con el objeto de incorporar la etiqueta en los productos. En este caso los productos de PCR son visualizados mediante exposición del gel a película de rayos x. La ventaja agregada de los productos PCR de radioetiquetado es que los niveles de productos de amplificación individuales pueden ser cuantificados.

La "construcción recombinante", "construcción de expresión" y "construcción de expresión recombinante" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención. Estos términos se refieren a una unidad funcional de material genético que se puede insertar en el genoma de una célula utilizando metodología estándar bien conocida para los expertos en la técnica. Dicha construcción puede ser utilizada por si misma o junto con un vector. Si se utiliza un vector, entonces la elección del vector depende del método que será utilizado para transformar plantas huésped, tal como es conocido para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un plásmido. Los expertos en la técnica estarán atentos de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector, con el objeto de transformar con éxito, seleccionar y propagar células huésped que comprenden cualesquiera de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención. Los expertos en la técnica también reconocerán que los diferentes eventos de transformación independientes darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones y asociados, 1985); De Almeida, 1989 #475}), y por lo tanto que se pueden clasificar múltiples eventos con el objeto de obtener líneas que despliegan el nivel de expresión y patrón deseado. Dicha clasificación puede lograrse mediante análisis Southern de ADN, análisis Northern de la expresión mARN, análisis Western de la expresión de proteína o análisis fenotípico.

Variantes del Polipéptido En general, una variante de polipéptido conserva la función antigénica e incluye cualquier variante en la cual los residuos en una posición particular en la secuencia han sido sustituidos por otros aminoácidos, e incluye además la posibilidad de insertar un residuo o residuos adicionales entre dos residuos del polipéptido de origen, así como la posibilidad de eliminar uno o más residuos de la secuencia de origen.

Una "variante de polipéptido" significa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos 2 a 50 de la SEC ID NO:2 que tienen al menos aproximadamente el 70% de identidad de secuencia de aminoácido con la secuencia nativa de longitud total o un fragmento de la secuencia de polipéptido de longitud total. Por ejemplo, las variantes de polipéptido incluyen aquellas en donde se agregan o eliminan uno o más residuos de aminoácido en el N- o C-término de la secuencia de aminoácido nativa de longitud total. Una variante de variante de polipéptido tendrá al menos aproximadamente el 71% a 75% de identidad de secuencia de aminoácido; al menos aproximadamente el 76% a 79% de identidad de secuencia de aminoácido; al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de aminoácido, al menos aproximadamente el 81% de identidad de secuencia de aminoácido, al menos aproximadamente 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia de aminoácido y al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia de longitud total. En forma ordinaria, los polipéptidos variantes tienen al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, con frecuencia al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, con más frecuencia al menos aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, o 300 aminoácidos de longitud o más.

El término "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácido" se define como el porcentaje de residuos de aminoácido que son idénticos con los residuos de aminoácido en una secuencia objetivo en una secuencia candidata cuando se alinean las dos secuencias. Para determinar el porcentaje de identidad de aminoácido, se alinean las secuencias y si es necesario, se introducen brechas para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia; las sustituciones conservadores no se consideran como parte de la identidad de secuencia. Los procedimientos de alineación de secuencia de aminoácido para determinar el porcentaje de identidad son conocidos para los expertos en la técnica. Se puede utilizar el software de computadora públicamente disponible tal como BLAST, BLAST2, ALIGN2 o Megalign (DNASTAR) para alinear secuencias de polipéptido. Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima en la longitud total de las secuencias que están siendo comparadas.

Cuando se alinean secuencias de aminoácido, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácido de una secuencia de aminoácido determinada A para, con o contra una secuencia de aminoácido B determinada (que puede ser mencionada en forma alternativa como la secuencia de aminoácido A determinada que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácido para, con o contra una secuencia de aminoácido B determinada) se puede calcular como: porcentaje de identidad de secuencia de aminoácido = X/Y100 en donde X es el número de residuos de aminoácido calificados como correspondencias idénticas a través de la alineación de A o B del programa o algoritmo de alineación de secuencia. y Y es el número total de residuos de aminoácido en B.

Si la longitud de la secuencia de aminoácido A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácido B, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácido de A a B, no será igual al porcentaje de identidad de secuencia de aminoácido de A a B.

Las sustituciones conservadoras útiles se muestran en la tabla B, "Sustituciones de ejemplo". Las sustituciones conservadoras mediante las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo, están dentro del alcance de la presente invención, siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces los cambios más sustanciales, indicados en la tabla C como de ejemplo, son introducidos y los productos clasificados para la actividad biológica de secuencia objetivo.

TABLA B Sustituciones de Ejemplo Residuo original Sustituciones de ejemplo Sustituciones preferidas Ala (A) Val, Leu, He Val Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys Asn(N) Gin, His, Lys, Arg Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg lie (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu (L) Norleucina, He, Val, Met, Ala, Phe lie Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, He Leu Phe (F) Leu, Val, He, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val (V) He, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucina Leu Las sustituciones no conservadoras que afectan (1) la estructura del esqueleto de polipéptido, tal como una conformación de hoja beta o helicoidal-alfa, (2) la carga o (3) hidrofobicidad o (4) el volumen de la cadena lateral del sitio objetivo, pueden modificar la función del polipéptido. Los residuos se dividen en grupos con base en las propiedades de cadena lateral común tal como se denota en la tabla B. Las sustituciones no conservadoras comprenden intercambiar un miembro de una o más de estas clases por otra clase. Las sustituciones pueden ser introducidas en sitios de sustitución conservadora o más normalmente en sitios no conservados.

TABLA C Clases de Aminoácido Clase Aminoácidos hidrofóbica Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He hidrofílica neutral Cys, Ser, Thr ácida Asp, Glu básica Asn, Gln, His, Lys, Arg interrupción de formación de cadena Gly, Pro aromática Trp, Tyr, Phe Los polipéptidos variantes se pueden elaborar utilizando, por ejemplo, mutagénesis transmitida por oligonucleótido (dirigida al sitio), escaneo de alanina y mutagénesis PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Cárter, 1986; Zoller y Smith, 1987), mutagénesis de cartucho, mutagénesis de selección de restricción (Wells y asociados, 1985) u otras técnicas conocidas se pueden llevar a cabo en el ADN clonado para producir variantes de secuencia objetivo (Ausubel y asociados, 1987; Sambrook, 1989).

Polipéptidos aislados/ purificados Un polipéptido "aislado" o "purificado" o fragmento biológicamente activo (tal como un fragmento Fab) se separa y/o recupera de un componente de su ambiente. Los componentes contaminantes incluyen materiales que normalmente pueden interferir con usos de diagnóstico del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas u otros materiales polipeptideoaceos o no-polipeptideoaceos. Para ser sustancialmente aisladas, las preparaciones tienen menos del 30% en peso seco de contaminantes, normalmente menos del 20%, 10% y más frecuentemente menos del 5% de contaminantes. Una secuencia objetivo producida en forma recombinante, aislada o porción biológicamente activa está en forma deseable, sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos del 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de la secuencia objetivo.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser ya sea sintetizados in vitro o expresados en forma recombinante a partir de las secuencias de polinucleótido. Debido a la redundancia en el código genético, las secuencias no necesitan ser idénticas para la práctica de la presente invención. Las identidades de secuencia de polinucleótido y polipéptido pueden ser de 70% a 100%, tal como 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y por supuesto, 100%.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser sintetizados fácilmente in vitro utilizando química de polipéptido. Por ejemplo, la síntesis de polipéptido puede llevarse a cabo en una forma por etapas en un soporte de fase sólida utilizando un sintetizador de polipéptido automático, tal como un Sintetizador de Péptido de Sinfonía Rainin, Sintetizador de Péptido Chemtech Avanzado, Sistema de Síntesis Paralelo Argonauta o Sintetizador de Péptido de Applied Biosystems. El instrumento sintetizador de péptido combina la química Fmoc con la activación HOBt/HBTU/DIEA para llevar a cabo síntesis de péptido de fase sólida.

Las cadenas laterales de muchos aminoácidos contienen grupos químicamente reactivos tales como aminas, alcoholes o tioles. Estas cadenas laterales deben ser protegidas adicionalmente para prevenir reacciones laterales indeseadas durante el paso de acoplamiento. Los grupos de protección de cadena lateral que son estables-base, más preferentemente, tanto estables-base como lábiles-ácido, son los más útiles.

Como alternativa, un polipéptido de interés puede ser introducido ya sea en una célula huésped procariótica o eucariótica, a través del uso de un vector o construcción, con el objeto de que la célula huésped exprese la proteína de interés. El vector, por ejemplo, un bacteriófago, cósmido o plásmido, puede comprender la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima, así como cualquiera secuencia reguladora (por ejemplo, promotora) que sea funcional en la célula huésped y tenga la capacidad de provocar la expresión de la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico. La secuencia reguladora (por ejemplo, promotora) está en asociación operable con, o se enlaza en forma operable a, la secuencia de nucleótido. (Una secuencia reguladora (por ejemplo, promotora) se dice que está "enlazada en forma operable" con una secuencia de codificación si la secuencia reguladora afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación). Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los que proceden de genes que codifican la deshidrogenasa de alcohol, deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, fosfog lucoisomerasa, cinasa de fosfoglicerato, fosfatasa de ácido, T7, TPI, lactasa, metalotioneína, citomegalovirus temprano inmediato, proteína ácido de suero, glucoamilasa, promotores activados en la presencia de galactosa, por ejemplo, GAL1 y GAL10, así como cualesquiera promotores implicados en sistemas de expresión procariótico y eucariótico. Además, las secuencias de ácido nucleico que codifican otras proteínas también se pueden incluir dentro del vector, así como otras secuencias reguladoras no promotoras tales como por ejemplo, una señal de poliadenilación (por ejemplo, señal poli-A de SV-40T-antígeno, ovoalbúmina u hormona de crecimiento de bovino). La elección de secuencias presentes en la construcción depende de los productos de expresión deseados, así como en la naturaleza de la célula huésped.

Tal como se observó anteriormente, una vez que el vector ha sido construido, posteriormente puede ser introducido en la célula huésped de elección a través de métodos conocidos para los expertos en la técnica incluyendo, por ejemplo, transfección, transformación y electroporación (Sambrook, 1989). La célula huésped posteriormente se cultiva bajo condiciones adecuadas que permiten la expresión de la proteína deseada que posteriormente se recupera y purifica.

Los ejemplos de células huésped procarióticas adecuadas incluyen, por ejemplo, bacterias tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomicetos tales como Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, así como cianobacterias tales como especie Spirulina (por ejemplo, alga azul-verde). Los ejemplos de células huésped eucarióticas adecuadas incluyen, por ejemplo, células de mamífero, células de plantas, células de levadura tales como especie Saccharomyces, especie Lipomyces , especie Candida, tales como especie Yarrowia (Candida), especie Kluyveromyces, especie Pichia, especie Trichoderma o especie Hansenula , o células fúngicas tales como células fúngicas filamentosas, por ejemplo, Aspergillus, Neurospora y Penici'llium. Las células de insectos tales como las utilizadas en sistemas de Baculovirus (Luckow, 1991), también son útiles para la producción in vitro de polipéptidos con modificaciones eucarióticas.

La expresión en una célula huésped puede lograrse en una forma temporal o estable. La expresión temporal puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula huésped, pero en donde las construcciones no se replican y se integran raramente en la célula huésped, o cuando la célula huésped no se está proliferando. La expresión temporal también se puede lograr introduciendo la actividad de un promotor regulable enlazada en forma operable al gen de interés, aunque dichos sistemas inducibles con frecuencia exhiben un bajo nivel de expresión basal. La expresión estable se puede lograr mediante introducción de una construcción que puede integrarse en el genoma huésped o que se replica en forma autónoma en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés se puede seleccionar a través del uso de un marcador seleccionable localizado en, o transfectado con la construcción de expresión, seguido de la selección de células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable resulta de la integración, el sitio de la integración de la construcción puede ocurrir en forma aleatoria dentro del genoma huésped o puede dirigirse a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma huésped suficientes para dirigir la recombinación con el locus huésped. Cuando las construcciones se dirigen a un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de transcripción y traducción se pueden proporcionar a través del locus endógeno.

Se puede utilizar un mamífero transgénico con el objeto de expresar la proteína de interés codificada mediante una o ambas de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente. Más específicamente, una vez que se crea la construcción antes descrita, se puede insertar en el pronúcleo de un embrión. El embrión puede ser implantado posteriormente en un receptor hembra. Como alternativa, también se puede utilizar un método de transferencia nuclear (Schnieke y asociados, 1997). Posteriormente se deja ocurrir la gestación y nacimiento (ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 5,750,176 y Patente Norteamericana No. 5,700,671), y la leche, tejido u otras muestras de fluido de las crías deben contener posteriormente la proteína de interés. El mamífero utilizado como el huésped puede ser seleccionado del grupo que consiste en, por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, un cerdo, una cabra, una oveja, un caballo o una vaca. Sin embargo, cualquier mamífero puede ser utilizado siempre que tenga la capacidad de incorporar ADN que codifica la proteína de interés en su genoma .

Uso de polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención Las secuencias de ácido nucleico aisladas y las proteínas correspondientes codificadas de esta forma tienen muchos usos benéficos. La presente invención proporciona inmunoensayos, y en particular, antígenos que detectan en forma precisa la presencia de anticuerpos para P. vivax en suero humano.

Además, la presente invención también incluye anticuerpos policlonales y monoclonales elevados contra las proteínas antes descritas. Dicho anticuerpo se puede utilizar, por ejemplo, en un inmunoensayo, una vacuna (para inmunización pasiva), un equipo, o para propósitos de investigación.

Inmunoensayos Existen dos tipos básicos de ensayos, competitivos y no competitivos (por ejemplo, inmunométricos y de emparedado, respectivamente). En ambos ensayos, los reactivos de anticuerpo o antígeno son adheridos en forma covalente o no covalente a la fase sólida (Wild, 2001). Los agentes de ligadura para adhesión covalente son conocidos y pueden ser parte de la fase sólida o derivados antes del recubrimiento. Los ejemplos de fases sólidas utilizadas en inmunoensayos son materiales porosos y no porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas, tiras, cuentas, membranas, depósitos de microtitulación y tubos de plástico. La elección del material de fase sólida y método de etiquetado del reactivo de antígeno o anticuerpo, se determina con base en las características de desempeño del formato de ensayo deseado. Para algunos inmunoensayos no se requiere etiqueta. Por ejemplo, si el antígeno está en una partícula detectable tal como un glóbulo rojo, la reactividad puede ser establecida con base en la aglutinación. Como alternativa, una reacción de antígeno-anticuerpo puede dar como resultado un cambio visible (por ejemplo, inmunodifusión radial). En la mayoría de los casos, uno de los reactivos de anticuerpo o antígeno utilizados en un inmunoensayo, se adhiere a un compuesto que genera la señal o "etiqueta". El compuesto que genera la señal o etiqueta es en sí mismo detectable o puede hacerse reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable (ver también la Patente Norteamericana No. 6,395,472 B1). Los ejemplos de dichos compuestos de generación de señal incluyen cromógenos, radioisótopos (por ejemplo, 125l, 131l, 32P, 3H, 35S y C), compuestos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina), compuestos quimioluminiscentes, partículas (visibles o fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes de generación de complejos o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa de ácido, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa y ribonucleasa). En el caso del uso de enzimas, la adición de substratos cromo, fluoro o lumo-génicos da como resultado la generación de una señal detectable. Otros sistemas de detección, tales como fluorescencia resuelta con el tiempo, fluorescencia de reflexión interna, amplificación (por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa) espectroscopia de Raman también son útiles.

Existen dos formatos generales comúnmente detectados para monitorear el titulador de anticuerpo específico y tipo en humanos: (1) el antígeno se presenta en una fase sólida, tal como se describió anteriormente, conteniendo el fluido biológico humano los anticuerpos específicos que se permiten reaccionar con el antígeno, y posteriormente el anticuerpo enlazado al antígeno se detecta con un anticuerpo anti-humáno acoplado a un compuesto que genera la señal, y (2) un anticuerpo anti-humano se enlaza a la fase sólida, conteniendo el fluido biológico humano anticuerpos específicos que se dejan reaccionar con el anticuerpo enlazado, y posteriormente el antígeno adherido a un compuesto que genera la señal se agrega para detectar el anticuerpo específico presente en la muestra de fluido. En ambos formatos, el reactivo de anticuerpo anti-humano puede reconocer todas las clases de anticuerpo, o como alternativa, ser específico de una clase o subclase particular de anticuerpo, dependiendo del propósito proyectado del ensayo. Estos formatos de ensayo, así como otros formatos conocidos están proyectados para estar dentro del alcance de la presente invención, y son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Cualesquiera de los formatos de ejemplo de la presente invención y cualquier ensayo o equipo de acuerdo con la presente invención se pueden adaptar u optimizar para utilizarse en sistemas automáticos o semi-automáticos (incluyendo aquellos en donde existe una fase sólida que comprende una micropartícula), tal como se describe por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,089,424 y 5,006,309, y por ejemplo, tal como se comercializa a través de Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) incluyendo pero sin limitarse a plataformas Abbott's ARCHITECT®, AxSYM, IMX, PRISM, y Quantum II, así como otras plataformas.

Los ensayos y equipos de la presente invención se pueden adaptar u optimizar para un punto de atención de sistemas de ensayo, incluyendo el sistema de inmunoensayo electroquímico Abbott's Point of Care (i-STAT™). Los inmunosensores y métodos de fabricación y la operación de los mismos en dispositivos de prueba de un solo uso se describen, por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 5,063,081 y en las Solicitudes de Patente Norteamericana Nos. 20030170881, 20040018577, 20050054078, y 20060160164 (incorporadas como referencia a la presente invención por sus enseñanzas con respecto a este tema).

La presente invención incluye un método para detectar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba, en donde el método comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos con una proteína o antígeno P. vivax que comprende un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2; y (b) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba. Más específicamente, la presente invención incluye un método para detectar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba, en donde el método comprenden los pasos de: (a) contactar una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos con una proteína o antígeno P. vivaxque comprende un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2, o un fragmento de los mismos, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anticuerpo/antígeno; (b) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conjugado enlace al anticuerpo enlazado, comprendiendo el conjugado un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; (c) detectar la presencia del anticuerpo que puede estar presente en la muestra de prueba, detectando la señal generada por el compuesto que genera la señal. También se puede utilizar un control o calibrador que enlaza al antígeno. El antígeno P. vivax puede comprender un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2, o un fragmento del mismo. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8 a 56 residuos de aminoácido, tal como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, y 56 residuos. El antígeno puede comprender un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. Finalmente, el antígeno puede consistir en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2.

Además del ensayo descrito anteriormente en el cual se detecta la presencia de anticuerpos contra una especie de Plasmodium (por ejemplo, P. malariae o P. ovale), también se puede utilizar para llevar a cabo ensayos que detectan anticuerpos en una muestra de prueba contra dos o más especies de Plasmodium . Por ejemplo, se puede pretender llevar a cabo un ensayo en el cual se pueda detectar todas las especies conocidas de Plasmodium que infectan humanos, eliminando de esta forma el riesgo de resultados negativos falsos obtenidos con ensayos existentes. Por lo tanto, la presente invención incluye un método para detectar anticuerpos para P. malariae, P. falciparum , P. vivax y P. ovale en una muestra de prueba, en donde el método comprenden los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de estos cuatro tipos de anticuerpos con: (1) un antígeno de P. malariae; (2) un antígeno de P. ovale; (3) un antígeno de P. falciparum y (4) un antígeno de P. vivax que comprenden un polipéptido que tienen al menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2; y (b) detectar la presencia de anticuerpos, para uno o más de los antígenos, presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de complejos, por ejemplo. Más específicamente, la presente invención incluye un método para detectar anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba, en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con (1) un antígeno de P. malariae; (2) un antígeno de P. ovale; (3) un antígeno de P. falciparum y (4) un antígeno de P. vivax que comprenden un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2; (b) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que cada conjugado enlace al anticuerpo enlazado en donde el conjugado comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia del anticuerpo que puede estar presente en la muestra de prueba detectando la señal generada por el compuesto que genera la señal. También se puede utilizar un control o calibrador que enlaza a los antígenos. (La presencia de los complejos indica que al menos uno de los cuatro tipos de anticuerpos está presente en la muestra de prueba. En particular, los ensayos tienen la capacidad de detectar la presencia de los cuatro tipos de anticuerpos en una muestra, haciendo de esta forma la muestra positiva, y evitando negativos falsos. No se puede querer saber en forma precisa cual de uno o más de los tipos de anticuerpos está presente (como cuando se clasifica una muestra de sangre adecuada con propósitos de donación); sin embargo, tal como aquí se describe, dicha determinación es posible si se desea. El antígeno P. vivax antígeno puede comprender un polipéptido que tiene al menos el 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2, o fragmentos de la misma. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8 a 56 residuos de aminoácido, tal como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56 residuos. El antígeno puede comprender un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. Finalmente, el antígeno puede consistir en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. Se deberá observarque cualesquiera del antígeno o antígenos P. falciparum , P. vivax, P. malariae y P. ovale descritos anteriormente pueden ser utilizados en combinación con cualesquiera de uno o más de los antígenos de la presente invención (por ejemplo, Proteína de Superficie de Merozoite, Proteína Exportada 1 de Proteína de Superficie Circumsporozoite, Antígeno de embrna Apical, Gen Asexual Enlazado con Citoadherencia , Proteína 2 con alto contenido de Histidina, FeSOD, pLDH y Antígeno de Enlace con eritrocito) con respecto a los equipos, vacunas y ensayos aquí descritos. Vacunas La presente invención también incluye una vacuna que comprende uno o más de los polipéptidos, o antígenos de los mismos, tal como aquí se describe. Dicha vacuna se utiliza para inmunización activa de un mamífero, por ejemplo, un humano que está en riesgo de ser expuesto a uno o más antígenos Plasmodium (por ejemplo, debido a un viaje dentro de una región en la cual prevalece la malaria). Por ejemplo, la vacuna puede contener al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: 1) un antígeno P. vivax que comprende un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. El antígeno P. vivax puede comprender un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2, o fragmento de la misma. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8 a 56 residuos de aminoácido, tal como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, y 56 residuos. El antígeno puede comprender un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. Finalmente, el antígeno puede consistir en secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2.

Como alternativa, si se desea una inmunización pasiva, se puede administrar uno o más anticuerpos a los siguientes antígenos (en la forma de una vacunación): un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. El antígeno P. vivax puede comprender un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2, o fragmento de la misma. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8 a 56 residuos de aminoácido, tal como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, y 56 residuos. El antígeno puede comprender un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. Finalmente el antígeno puede consistir en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2.

Equipos de Diagnóstico Los equipos de diagnóstico también están incluidos dentro del alcance de la presente invención. La presente invención incluye equipos para determinar la presencia de anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba. Un equipo puede comprender: (a) un antígeno P. vivax que comprende un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2; y (b) un conjugado que comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable. El equipo también puede contener un control o calibrador que comprende un reactivo que enlaza al antígeno. El antígeno P. vivax puede comprender un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2, o fragmentos de la misma. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente 8 a 56 residuos de aminoácido, tal como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, y 56 residuos. El antígeno puede comprender un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. Finalmente, el antígeno puede consistir en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2.

La presente invención también incluye un equipo para determinar la presencia de anticuerpo para P. vivax en una muestra de prueba. Un equipo puede comprender: (a) un antígeno P. vivax que comprende un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2; y (b) un conjugado que comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable. El antígeno P. vivax puede comprender un polipéptido que tiene al menos 70% a 99%, tal como 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2, o un fragmento de la misma. Un fragmento de estos polipéptidos puede tener aproximadamente de 8 a 56 residuos de aminoácido, tal como 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, y 56 residuos. El antígeno puede comprender un polipéptido que consiste esencialmente en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2. Finalmente, el antígeno puede consistir en las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, o residuos de aminoácido 2 a 50 de la SEC ID NO:2.

Además, la presente invención incluye un equipo para determinar la presencia de anticuerpo para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum . Dicho equipo puede comprender: (1) un antígeno P. malariae; (2) un antígeno P. ovale; (3) un antígeno P. vivax tal como se describió anteriormente; y (4) un antígeno P. falciparum y (5) un conjugado que comprende un anticuerpo adherido a un primer compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable.

Producción Ab El "anticuerpo'' (Ab) comprende Abs simples dirigidos contra un antígeno objetivo (un anti-antígeno objetivo Ab), composiciones anti-antígeno objetivo Ab con especificidad de poli-epítope, anti-antígeno objetivo de cadena simple Abs, y fragmentos de anti-antígeno objetivo Abs. Un "anticuerpo monoclonal" (mAb) se obtiene de una población de Abs sustancialmente homogéneos, es decir los Abs individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los Abs de ejemplo incluyen Abs policlonales (pAb), monoclonales (mAb), humanizados, bi-específicos (bsAb), y de heteroconjugado.

Los Abs policlonales se pueden elevar en un huésped mamífero a través de una o más inyecciones de un inmunogen, y si se desea, un adyuvante. Normalmente, el inmonogen (y adyuvante) se inyecta en el mamífero a través de múltiples inyecciones subcutáneas e intraperitoneales. El inmunogen puede incluir un antígeno objetivo o un polipéptido de fusión de antígeno objetivo. Los ejemplos de adyuvantes incluyen adyuvante completo de Freund y dicorinomicolato de trehalosa-sintético de lípido A de monofosforilo (MPL-TDM). Para mejorar la respuesta inmune, se puede conjugar un inmunogen a un polipéptido que es inmunogénico en el huésped, tal como hemocianina de penetración magnética (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina de bovino e inhibidor de tripsina de frijol soya. Los protocolos para la producción de anticuerpo son bien conocidos (Ausubel y asociados, 1987; Harlow y Lañe, 1988; Harlow y Lañe, 1999). Como alternativa, los pAbs se pueden elaborar en pollos, produciendo moléculas IgY (Schade y asociados, 1996).

Los mAbs anti-antígeno objetivo se pueden preparar utilizando métodos de hibridoma (Milstein y Cuello, 1983). Los métodos de hibridoma consistenten en normalmente al menos cuatro pasos: (1) inmunización de un huésped o linfocitos de un huésped; (2) recolección de los linfocitos que secretan mAb, (3) fusión de linfocitos a células inmortalizadas y (4) selección de las células que secretan el mAb (anti-antígeno objetivo) deseado.

Se inmuniza un ratón, rata, cerdo de Guinea, hámster u otro huésped adecuado para provocar los linfocitos que producen o tienen la capacidad de producir Abs que enlazarán en forma específica al inmunogen. Como alternativa, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Si se desean células humanas, se pueden utilizar linfocitos de sangre periférica (PBLs).

Posteriormente los linfocitos se fusionan con una línea de célula inmortalizada para formar células de hibridoma, facilitadas a través de un agente de fusión tal como polietilenglicol (PEG) (Galfre y asociados, 1977; Goding, 1996). Se pueden utilizar células de mieloma de roedor, bovino o humano inmortalizadas mediante transformación, o líneas de célula de mieloma de rata o ratón. Debido a que se desean poblaciones puras de células de hibridoma y células inmortalizadas no fusionadas, las células después de fusión se crecen en un medio adecuado que inhibe el crecimiento o supervivencia de células inmortalizadas, no fusionadas. Una técnica común utiliza células parenterales que carecen de transferasa de fosforribosilo de guanina de hipoxantina de enzima (HGPRT o HPRT). En este caso se agregan hipoxantina, aminopterina y timidina al medio (medio HAT) para evitar el crecimiento de células con deficiencia de HGPRT-, permitiendo al mismo tiempo que crezcan los hibridomas.

Las células inmortalizadas deseables se fusionan en forma eficiente; se pueden aislar de poblaciones mezcladas seleccionando en un medio tal como HAT; y en una expresión de alto nivel y estable al soporte de anticuerpo después de la fusión. Las líneas de células inmortalizadas útiles con líneas de mieloma de múrido disponibles de la Recolección de Cultivo Tipo Americano (Manassas, VA). También se han descrito líneas de célula de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de mAbs humanos (Kozbor et q/., 1984; Schook, 1987).

Debido a que las células de hibridoma secretan en forma extracelular el anticuerpo, el medio de cultivo puede ser ensayado para la presencia de mAbs dirigidos contra un antígeno objetivo. Se pueden utilizar ensayos de inmunoprecipitación o de enlace in vitro tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA), para medir la especificidad de enlace de mAbs (Harlow y Lañe, 1988; Harlow y Lañe, 1999), incluyendo análisis de Scatchard (Munson y Rodbard, 1980).

Se pueden aislar células de hibridoma que secretan mAb anti-antígeno objetivo en la forma de clones simples, limitando procedimientos de dilución y sub-cultivados (Goding, 1996). Los medios de cultivos adecuados incluyen medio de Eagle modificado por Dulbecco, RPMI-1640, o si se desea, un medio libre de suero o libre de proteína o con proteína reducida (por ejemplo, Ultra DOMA PF o HL-1; Biowhittaker; Walkersville, MD). Las células de hibridoma también se pueden crecer in vivo como ascitos.

Los mAbs se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido de ascitos mediante procedimientos convencionales de purificación Ig, tal como A-Sefarosa de polipéptido, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, precipitación de sulfato de amonio o cromatografía por afinidad (Harlow y Lañe, 1988; Harlow y Lañe, 1999).

Una vez que los anticuerpos han sido producidos de modo que reconozcan un antígeno objetivo, las células que producen dichos anticuerpos, tales como hibridomas, se pueden utilizar como una base para aislar las secuencias de polinucleótido que codifican los anticuerpos. Una vez aisladas, estas secuencias se pueden utilizar para producir anticuerpos in vitro, o se pueden manipular para elaborar, por ejemplo, anticuerpos quiméricos.

Los Abs también se pueden elaborar a través de métodos recombinantes. El ADN que codifica mAbs anti-antígeno objetivo se puede aislar fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales, por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótido que enlazan específicamente a genes de cadena de anticuerpo pesada y ligera de múrido, para sondear el ADN aislado de líneas celulares de hibridoma que secretan mAb anti-antígeno objetivo. Una vez aislados, los fragmentos de ADN son subclonados en vectores de expresión que posteriormente se transfectan en células huésped tal como células COS-7 de simio, células CHO o célula de mieloma que no producen de otra manera el polipéptido Ig, para expresar mAbs. Los fragmentos de ADN aislados pueden ser modificados sustituyendo la secuencia de codificación por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias de múrido homologa (Morrison y asociados, 1987), o fusionando la secuencia de codificación Ig a toda o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido no Ig. Dicho polipéptido no Ig puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo, o se puede sustituir por los dominios variables del sitio que combina el antígeno para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Las células huésped de mamífero para expresar los anticuerpos recombinantes de la presente invención incluyen CHO (células CHO) (que incluyen células dhfr-C O (Urlaub y Chasin, 1980), utilizadas con un marcador seleccionable DHFR (Kaufman, 1990), células de mieloma NSO, células COS y células SP2.

Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en las células de huésped de mamífero, los anticuerpos son producidos cultivando las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se crecen las células huésped. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína estándar.

En un sistema de expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada de anticuerpo como la cadena ligera de anticuerpo en células dhfr-C O mediante transfección. El vector de expresión recombinante lleva un gen DHFR, el cual permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector. Las células huésped transformadoras seleccionadas son cultivadas para permitir la expresión de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo, y se recupera el anticuerpo intacto del medio de cultivo.

Abs monovalentes Los Abs monovalentes no se retícula entre sí. Un método implica expresión recombinante de la cadena ligera Ig y cadena pesada modificada. Los truncados de cadena pesada generalmente en cualquier punto en la región Fe, evitan la reticulación de cadena pesada. Como alternativa, se sustituyen residuos de cisteín relevantes con otros residuos de amoninoácido o se eliminan, evitando la reticulación mediante enlace de disulfuro. Los métodos in vitro también son adecuados para preparar Abs monovalentes. Los Abs pueden ser digeridos para producir fragmentos tal como Fab (Harlow y Lañe, 1988; Harlow y Lañe, 1999).

Abs humanizados y humanos Las formas humanizadas de Abs no humanos que enlazan a un antígeno objetivo son Igs quiméricos, cadenas Ig o fragmentos (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras su bsecuencias de enlace de antígenos de Abs) que contienen una secuencia mínima derivada de Ig no humano.

Generalmente, el anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos con frecuencia son referidos como residuos "de importación" que normalmente se toman de un domio variable de "importación". La humanización se logra sustituyendo los CDRs de roedor o las secuencias CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano (Jones y asociados, 1986; Riechmann y asociados, 1988; Verhoeyen y asociados, 1988). Dichos Abs "humanizados" son Abs quiméricos, en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los Abs humanizados normalmente son Abs humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos procedentes de sitios análogos en los Abs de roedor. Los Abs humanizados incluyen Igs humanos (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de un región de determinación de complementariedad (CDR) de receptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo de donador) tal com un ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos no humanos correspondientes reemplazan los residuos de estructura Fv en el Ig humano. Los Abs humanizados pueden incluir residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado contiene sustancialmente todo o al menos uno y normalmente dos dominios variables, en donde la mayor parte, si no es que todas las regiones CDR, corresponden a las de un Ig no humano y la mayor parte, si no es que todas las regiones FR, son aquellas de una secuencia de consenso Ig humana. El anticuerpo humanizado también comprende en forma óptica al menos una porción de una región constante Ig (Fe), normalmente de un Ig humano (Jones y asociados, 1986; Riechmann y asociados, 1988; Verhoeyen y asociados, 1988).

Los Abs humanos pueden ser producidos utilizando varias técnicas, incluyendo bibliotecas de despliegue de fago (Hoogenboom y asociados, 1991; Marks y asociados, 1991) y mAbs humanos (Boerner y asociados, 1991; Reisfeld y Sell, 1985). La introducción de genes Ig humanos en animales transgénicos en los cuales los genes Ig endógeno han sido parcial o completamente desactivados, se puede explotar para sintetizar Abs humanos. Al momento del estímulo, se observa la producción del anticuerpo humano, que se asemeja cercanamente a la observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo reajuste genético, ensamble y repertorio de anticuerpo (Fishwild y asociados, 1996; Lonberg y Huszar, 1995; Lonberg y asociados, 1994; Marks y asociados, 1992). mAbs Bi-Específicos Los mAbs bi-específicos enlazan al menos a dos diferentes antígenos. Por ejemplo, una especificidad de enlace es un antígeno objetivo; la otra es para cualquier antígeno de elección.

La producción recombinante de Abs bi-específicos con frecuencia se logra mediante expresión conjunta de dos pares de cadena pesada/cadena ligera Ig, teniendo cada uno diferentes especificidades (Milstein y Cuello, 1983). La clasificación aleatoria de estas cadenas pesadas y ligeras Ig en los híbridomas resultantes (quadromas), producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpo de las cuales únicamente una tiene la estructura bi-específica deseada. El anticuerpo deseado puede ser purificado utilizando cromatografía por afinidad u otras técnicas (Traunecker y asociados, 1991).

Para fabricar un anticuerpo bi-específico, los dominios variables con los sitios que combinan el anticuerpo-antígeno deseados, se fusionan a secuencias de dominio constante (Suresh y asociados, 1986). La fusión normalmente es con un dominio constante de cadena pesada Ig, que comprende al menos parte de las regiones de articulación, CH2 y CH3. La primer región constante de cadena pesada (CH1) que contiene los sitios necesarios para el enlace de cadena ligera está en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada Ig y si se desea, la cadena ligera Ig, se insertan en vectores de expresión separados y se transfectan en conjunto en un organismo huésped adecuado.

La interfase entre un par de moléculas de anticuerpo se puede construir para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo celular recombinante (Cárter, 1986). En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo, se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptófano). Las "cavidades" de compensación de tamaño idéntico o similar a la cadena(s) lateral grande, son creadas en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácido grandes con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Este mecanismo incrementa el rendimiento del heterodímero con respecto a productos finales no deseados tales como homodímeros.

Los Abs biespecíf icos se pueden preparar como Abs de longitud total o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Abs biespecíficos Fab'2). Una técnica para generar Abs bi-específico explota la ligadura química. Los Abs intactos pueden ser disociados en forma proteolítica para generar fragmentos Fab'2 (Brennan y asociados, 1985). Los fragmentos se reducen con un agente de complejo de ditiol tal como arsenita de sodio, para estabilizar los ditioles vicinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados posteriormente son convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB posteriormente se vuelve a convertir al Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab'-TNB para formar un anticuerpo bi-específico.

Los fragmentos Fab' pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar Abs biespecíficos. Por ejemplo, los Abs Fab'2 bi-específicos completamente humanizados pueden ser producidos (Shalaby y asociados, 1992). Cada fragmentos Fab' se secreta por separado de E. coli y se acopla directamente en forma química in vitro, formando el anticuerpo bi-específico.

Se han descrito varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpo bi-específico directamente de cultivo de célula recombinante. Por ejemplo, se pueden explotar motivos de cierre de leucina (Kostelny y asociados, 1992). Los péptidos de los polipéptidos Fos y Jun son enlazados a las porciones Fab' de dos diferentes Abs mediante fusión genética. Los homodímeros de anticuerpo se reducen en la región de articulación para formar monómeros y posteriormente volverse a oxidar para formar heterodímero de anticuerpo. Este método también puede producir homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" proporciona un método alternativo para generar fragmentos de anticuerpo bi-específico (Holliger y asociados, 1993). Los fragmentos consisten en una VH de cadena pesada conectada a una VL de cadena ligera a través de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo bi-específico es el uso de dímeros de cadena simple Fv (sFv) (Gruber y asociados, 1994).

También se pueden elaborar Abs con más de dos valencias, tal como Abs tri-específicos (Tutt y asociados, 1991). Los Abs biespecíf icos de ejemplo se pueden enlazar a dos diferentes epítopes en un antígeno objetivo determinado. - A manera de ejemplo, y no de limitación, a continuación se proporcionan de los ejemplos de la presente invención.

Ejemplo 1: Diseño, Clonación y Expresión del Dominio C-terminal presunto del gen EXP1 P. vivax Diseño de gen EXP1 Plasmodium vivax. Este ejemplo describe el diseño de gen Pv-EXP1 sintético, que codifica la porción C-terminal de la proteína EXP1, de P. vivax, que es optimizada mediante la expresión de £. coli. Se utilizó el software Gene Designer de ADN 2.0, Inc. (Menlo Park, California) para diseñar la secuencia de gen que se describe más adelante. La secuencia de la proteína EXP1 codificada para P. vivax fue anticipada con base en la homología de secuencia con las proteínas P. falciparum y P. yoelii, mediante identificación de sitios de división potenciales de la secuencia genómica P. vivax. La secuencia de nucleótido de gen EXP1 P. vivax optimizado se muestra en la figura 1A (SEC ID NO:1), y la secuencia de aminoácido codificada se muestra en la figura 1B (SEC ID NO:2). El gen contiene un sitio 5'-EcoRI seguido de un codón de inicio, el cuerpo del gen que codifica la secuencia de aminoácido C-terminal anticipada de EXP1 P. vivax, una secuencia que codifica una 6-histidina, un codón de detención y un sitio BamHI. Los sitios de la enzima de restricción fueron utilizados para clonarse en vectores de expresión, y la etiqueta 6-histidina fue incluida para facilitar la purificación subsecuente de la proteína expresada.

Preparación de Gen EXP1 sintético de P. vivax. Las células E. coli que contienen el clon de plásmido del gen EXP1 P. vivax sintético (GenScript Corp., (Piscataway, Nueva Jersey)) fueron crecidas y el plásmido purificado utilizando el Equipo de Purificación Wizard Plus SV Minipreps ADN t (Promega, Madison, Wisconsin) de acuerdo con el inserto del paquete. El plásmido fue digerido en una reacción 50 µ? durante 2 horas a una temperatura de 37°C en la presencia de 20 unidades de la enzima de restricción EcoRI, 20 unidades de la enzima de restricción BamHI y Amortiguador 1 x EcoRI (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts). Las digestiones fueron electroforadas en un gel de bromuro de etidio TAE de agarosa al 1.0% para separar el inserto del vector. El inserto aproximadamente 185 pares base fue cortado posteriormente del gel de agarosa, y el ADN se extractó de la agarosa utilizando el Equipo de Extracción de Gel de Agarosa QIAEX II (Qiagen, Valencia, California) de acuerdo con el inserto del paquete.

Preparación del Vector de expresión de fusión CKS para clonación. Se crecieron células E. coli que contienen el vector de expresión de fusión-CKS pJO200 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) y el plásmido fue purificado utilizando el Equipo de Purificación de ADN Wizard Plus SV Minipreps (Promega, Madison, Wisconsin) de acuerdo con el inserto del paquete. El plásmido (10 pg) fue digerido en una reacción de 1500 µ? durante 2.5 horas a una temperatura de 37°C en la presencia de 200 unidades de la enzima de restricción EcoRI, 200 unidades de la enzima de restricción BamHI y Amortiguador 1 x EcoRI (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts). Las digestiones se electroforaron en un gel de bromuro de etidio TAE de agarosa al 1.0% para separar el inserto del vector. Posteriormente el vector linealizado fue cortado del gel de agarosa, y el ADN se extractó de la agarosa utilizando el Equipo de Extracción de Gel de Agarosa QIAEX II (Qiagen, Valencia, California) de acuerdo con el inserto del paquete.

Clonación del inserto EXP1 en el vector de expresión de fusión-CKS.

Se agregó una porción (2 µ?) del inserto EXP1 digerido con EcoRI/BamHI purificado (ver anteriormente) a una reacción de ligadura (10 µ?) que contiene el vector de expresión digerido con pJO200EcoRI/BamHI (ver anteriormente -0.6 µg), amortiguador de Ligasa de ADN 1 x T4 y 400 unidades de Ligasa de ADN T4 (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts). Las reacciones de ligadura se incubaron durante la noche a una temperatura de 16°C posteriormente se transformaron en células competentes TOP10 E. coli (Stratagene, La J o 11 a , California) de acuerdo con el inserto del paquete. Los plásmidos fueron purificados de los clones TOP10 tal como se describió anteriormente y transformadas en células competentes de la cepa E. coli BL21 con deficiencia de proteasa (Novagen, Madison, Wisconsin) de acuerdo con el inserto del paquete.

Expresión v purificación de proteína recombinante EXP1. Las células BL21 que contienen el plásmido EXP1 (Ver descripción anterior) fueron crecidas en 100 mi de cultivo a una temperatura de 37°C hasta que se alcanzó un OD595 de aproximadamente 0.8, tiempo en el cual el IPTG fue agregado a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión. Después de 3 horas de inducción a una temperatura de 37°C, las células fueron recolectadas mediante centrifugación y las células peletizadas fueron Usadas con Reactivo de Extracción BugBuster (Novagen, Madison, Wisconsin) de acuerdo con el inserto del paquete. El EXP1 expresado presente en la fracción soluble de Usado fue purificado utilizando un Equipo de Purificación His (Novagen, Madison, Wisconsin) de acuerdo con el inserto del paquete. La proteína recombinante purificada fue dializada en amortiguador de fosfato 0.01 M, pH 7.4 que contiene NaCI 0.15 M (PBS) antes de la cuantificación.

Ejemplo 2: Diseño de péptido sintético EXP1 P. vivax Este ejemplo describe el diseño del péptido Pt/-EXP1 sintético que constituye la porción C-terminal de la proteína EXP1, de P. vivax. La secuencia de aminoácido anticipada dé la proteína Pv-EXP1 estuvo basada en la homología de secuencia con proteínas P. falciparum y P yoelii, e identificando sitios de división potenciales dentro del gen EXP1 putativo de la secuencia genómica P. vivax. El péptido Pv-EXP1 fue sintetizado a través de GenScript Corp. (Piscataway, Nueva Jersey) con una etiqueta de biotina en el N-término. La secuencia de péptido Pv-EXP1 (Ver, figura 1C (SEC ID NO:3)) comprende el dominio C-terminal putativo de la corriente descendente EXP1 del ancla de transmembrana.

Ejemplo 3: Inmunoensayo EXP1 P. vivax utilizando cuentas de poliestireno Se probó la proteína de fusión EXP1 CKS P. vivax con respecto a su capacidad de detector anticuerpos IgG y/o IgM, utilizando un ensayo de cuenta de poliestireno. Se probaron diversos paneles de suero humano incluyen chimpancés infectados en forma experimental, donadores de sangre normal y pacientes con malaria.

Los paneles representan poblaciones en donde el tiempo entre la generación de la enfermedad (es decir diagnóstico clínico) o infección y la recolección de muestra incrementa de días a semanas (chimpancés infectados en forma experimental, pacientes con malario de India y pacientes con malaria de América) hasta años (donadores de sangre Americanos con historial de malaria en el pasado).

Los datos sugieren que los anticuerpos EXP1 P. vivax son los detectados en forma temprana más frecuentemente después de infección o generación de la enfermedad (días hasta meses) pero no son detectados después de uno o más años después de enfermedad de malaria. Por lo tanto, EXP1 P vivax parece ser un marcador de infección reciente, en lugar de pasada.

Recubrimientos de cuentas de poliestireno. Se utilizaron cuentas de poliestireno de cuarto de pulgada (0.634 cm) como la fase sólida del péptido. Antes de recubrimiento, las cuentas fueron lavadas con 15% de 1-propanol (en agua) a temperatura ambiente durante 20 minutos sin agitación. Se eliminó 1-propanol, y las cuentas se enjuagaron dos veces con agua desionizada. Las cuentas lavadas posteriormente fueron agregadas a un frasco que contiene antígeno recombinante diluido en 0.25 a 5 pg/mL en fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.0 (0.233 mi por cuentas). Las cuentas fueron incubadas a una temperatura de 40°C durante 2 horas con mezclado suave. Posteriormente las cuentas fueron lavadas tres veces con PBS y posteriormente incubadas en PBS que contienen 0.1% Tritón X-100 a una temperatura de 40°C durante 1 hora con agitación suave. Posteriormente se volvieron a lavar tres veces en PBS y posteriormente se incubaron a una temperatura de 40°C en 5% BSA en PBS durante 1 hora con mezclado suave. Las cuentas fueron lavadas cuatro veces con PBS y posteriormente incubadas a temperatura ambiente en PBS que contienen 5% de sacarosa sin mezclado durante 20 minutos. Se eliminó el amortiguador de sacarosa y las cuentas se secaron con aire. Las cuentas recubiertas fueron almacenadas disecadas a una temperatura de 4°C.

Método de inmunoensavo. Se probó el suero y plasma con respecto a su inmunoreactividad para cuentas de poliestireno recubiertas con antígeno. Los especímenes fueron diluidos 1:16 en amortiguador diluyente (amortiguador Tris-fosfato pH 7.8 que comprende 20% suero de cabra, 10% de suero de becerro, 0.2% Tritón X-100 y azida de sodio), y se agregó 0.010 mi a un depósito de una charola de prueba de plástico y posteriormente se combinó con 0.20 ml_ adicionales del mismo amortiguador diluyente para una dilución de muestra final de 1:336. Se agregó la cuenta recubierta con proteína recombinante a la muestra diluida y se incubó a una temperatura de 37°C durante 90 minutos con mezclado. Posteriormente las cuentas se lavaron con 11 a 14 ml_ de agua desionizada seguido de la adición de 0.2 mi de anticuerpo IgG de cabra etiquetado con peroxidasa (0.02 microgramo por ml_) o IgM anti-humano. Las cuentas fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante 30 minutos con mezclado. Las cuentas fueron lavadas con 11 a 14 mL de agua desionizada y posteriormente transferidas en tubos de plástico a los cuales se les agregaron 0.3 mi de substrato OPD (0.3% O-fenilendiamina-2-HCI en amortiguador de citrato que contiene 0.02% de H202) y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos bien mezclado. Las reacciones se extinguieron mediante la adición de 1 mi de 1N H2S0 y se determinó la densidad óptica (OD) en 492 nm. La OD es directamente proporcionada a la cantidad de anticuerpo enlazada a la cuenta. Se calcularon proporciones de señal a negativas (S/N) para cada muestra de prueba dividiendo el OD de la muestra de prueba entre la OD de control negativo promedio. Se asumieron como inmunoreactivos los especímenes con valores S/N mayores o iguales a 5.00 (valor de corte provisional).

Optimización de ensayo de anticuerpo EXP1P. vivax. Se recubrió la proteína de fusión CKS-Pv-EXP1 sobre cuentas de poliestireno utilizando una variedad de condiciones con el objeto determinar condiciones para sensibilidad de ensayo óptimo. Posteriormente las cuentas se probaron para ¡nmunoreactividad utilizando suero humano de individuos con infección de Plasmodium diagnosticada mediante embarrado de sangre. Las condiciones de inmunoensayo fueron como se describieron anteriormente excepto en donde se hizo la aclaración. La concentración de recubrimiento del antígeno CKS-Pv-EXP1 fue de 2.0 ug/mL. Se comparó la inmunoreactividad CKS-Pv-EXP1 con la de CKS-Pv-MSP1 -19 y con los resultados de prueba obtenidos utilizando ensayo de anticuerpo de plasmodium comercial.

Condición de ensavo Condiciones de recubrimiento de cuenta Diluyentes de ensavo de Doliestireno 1 0.1 M NaP04 (pH 7.2), 40°C, X mM DTT HCV2.0EIA 2 0.1 M NaP04 (pH 7.2), 40° HCV 2.0 EIA 3 50 mM MES (pH 6.3), 40°C, X mM DTT HCV 2.0 EIA 4 50 mM MES (pH 6.3), 40°C HCV 2.0 EIA 5 50 mM MES (pH 6.3), 40°C HTLV EIA 7 0.1 M NaP04 (pH 7.2), 56°C, X mM DTT HCV 2.0 EIA 8 0.1 M NaP04 (pH 7.2), 56°C HCV 2.0 EIA 9 50 mM MES (pH 6.3), 56°C, X mM DTT HCV 2.0 EIA 10 50 mM MES (pH 6.3), 56°C HCV 2.0 EIA Efecto de condición de ensavo en valores ODaa?. nm de fondo. Los valores OD más altos fueron obtenidos utilizando la condición 7 y 8 tal como se muestra más adelante en la tabla 1, aunque los más bajos fueron observados utilizando la condición 5. La adición de DTT a los amortiguadores de recubrimiento no mejoró el fondo y en algunos casos (comparados específicamente con las condiciones 9 a 10) el fondo incrementado. El recubrimiento a una temperatura de 56°C en cualesquiera de los amortiguadores incrementó las lecturas de fondo.

Tabla 1 Condición de Ensayo en PD 492 nm Muestra 1 2 3 4 5 7 8 9 10 NHP 0.094 0.099 0.036 0.028 0.025 0.136 0.123 0.058 0.037 NHP 0.085 0.094 0.027 0.026 0.020 0.155 0.108 0.043 0,038 NHP 0.088 0.088 0.042 0.028 0.022 0.131 0.112 0.041 0.037 NHP 0.089 0.065 0.040 0.025 0.020 0.158 0.123 0.043 0.035 NHP: plasma humano normal Efecto de la condición de ensayo en la sensibilidad. Los especímenes de suero recolectados de pacientes con malaria de India (infección de Plasmodium confirmada mediante microscopio con embarrado de sangre) se probaron con respecto a la presencia de IgG CKS-Pv-EXP1. Los especímenes también se probaron para IgG CKS-Pv-MSPI-19. Todos los especímenes también fueron probados previamente para anticuerpos Plasmodium utilizando un ensayo comercial que detectó IgG, IgM y/o IgA dirigido contra antígenos P. vivax y P. falciparum .

Las condiciones de ensayo 4 y 5 mostrados en la tabla 2 que se encuentra a continuación proporcionaron las proporciones S/N más altas (y las lecturas de fondo más bajas tal como se mostró anteriormente) y detectaron la mayor parte de las muestras positivas IgG Pv-MSPI-19. Las proporciones S/N utilizando la condición 4 tuvieron proporciones S/N ligeramente mayores que la condición 5.

Tabla 2 nd: no realizado.

Ejemplo 4: Anticuerpos IgG Pv-EXP en donadores de sangre con malaria previa Los donadores de sangre en los Estados Unidos dieron completar un cuestionario antes de la donación. Los donadores que han tenido malaria no se les permite donar durante 3 años después de que quedaron libres de los síntomas. Los viajantes a regiones endémicas de malaria no se les permite donar sangre durante 1 año después de haber abandonado el área, siempre que no hayan tenido síntomas de malaria. Los inmigrantes de, o residentes de países en donde la malaria es común, no se les permite donar durante 3 años después de su salida de dicho país.

Estuvieron disponibles especímenes de plasma de diversos donadores quienes habían tenido enfermedad de malaria descrita anteriormente. Estos especímenes de donador fueron probados para la presencia de anticuerpos IgG dirigidos contra antígenos MSP1-19 de P. malariae, P. ovale, P. falciparum y P. vivax utilizando antígenos individuales recubiertos en las cuentas de poliestireno de un cuarto de pulgada (0.635 cm). Los donadores también se probaron con respecto a la presencia de anticuerpos IgG dirigidos a antígeno recombinante EXP1 P. vivax. Todos los especímenes probaron positivo para anticuerpos de Plasmodium , utilizando un ensayo comercial que detecta IgG, IgM y/o IgA dirigido contra antígenos P. vivax y P. falciparum . Los resultados de inmunoensayo se muestran en la tabla 3 que se encuentra a continuación. De los 14 donadores positivos de anticuerpo EIA comerciales, 9 fueron positivos para anticuerpo Pv-MSPI-19 y 4 fueron reactivos para IgG Pf-MSP 1-19. De los especímenes inmunoreactivos Pv-MSPI-19, ninguno fue reactivo en el EIA Pv- EXP1. La enfermedad de malaria reportada más recientemente dentro del cohorte ocurrió en el año de 2006 (las muestras fueron recolectadas en 2007) y la enfermedad de malaria más antigua ocurrió en el año de 1970. Por lo tanto, aunque Pv- SP1-19 detectó anticuerpos entre donadores cuya enfermedad de malaria había ocurrido hace mucho tiempo en el año de 1970 (37 años antes de la donación de sangre) los anticuerpos Pv-EXP1 no fueron detectados incluso en donadores con malaria reciente en el año de 2006.

Tabla 3 Ejemplo 5: Anticuerpos IgG Pv-EXP1 entre pacientes con malaria de India La malaria es endémica en la mayoría de las partes dé la India con aproximadamente el 95% de la población en riesgo de infección por especies Plasmodium que originan la enfermedad. En India, P. falciparum y P. vivax son más comunes, representando P. malaria un pequeño número de cátodos y siendo P. ovale virtualmente inexistente. En la mayoría de las áreas del país, es baja la incidencia de malaria, pero el riesgo de malaria varía dependiendo de la lluvia. Durante períodos de epidemia o desencadenamiento, son posibles múltiples picaduras infecciosas por persona.

Se obtuvieron especímenes de suero de individuos infectados con plasmodium de India con malaria en el pasado o reciente. Las especies plasmodium infecciosas fueron identificadas mediante revisión microscópica de embarrados de sangre al momento de la recolección de las muestras. Algunos individuos fueron diagnosticados mediante microscopio como infecciones duales. Los especímenes fueron probados para la presencia de anticuerpos plasmodium utilizando un ensayo comercial que detecta IgG, IgM y/o IgA dirigidos contra antígenos P. vivax y P. falciparum . Los resultados de muestran en la tabla 4 que se encuentra a continuación. Los anticuerpos IgG Pv-MSP 1-19 fueron detectados en los 27 individuos (100%) en tanto que 13/27 (48%) fueron positivos de anticuerpo Pv- EXP1. Entre los 19 individuos con infección P. vivax confirmada con microscopio, 19 (100%) fueron positivos IgG Pv-MSP 9, en tanto que únicamente 11/19 (58%) fueron positivos Pv-EXP1 IgG.

Ta b l a 4 ID de muestra Infección con Desencadenamiento para EIA comercial, Pv-MSP1-19, Pv-EXP1 , S/N Plasmodium Intervalo de Extracción S/CO S/N M034 Pv 30-60 24.5 196.7 1.5 041 Pv desconocido 17.1 196.7 17.1 043 Pv 10 24.5 196.7 71.1 M050 Pf, Pv 9 24.5 196.7 6.7 060 Pv 30-60 18.2 196.7 29.2 M102 Pv 3 18.9 196.7 38.3 107 Pv 3 19.2 196.7 78.3 022 Pv 30-60 24.5 196.1 0.8 109 Pf 4 18.9 170.5 0.5 M104 Pf 2 18.9 166.5 14.5 004 Pf desconocido 19.2 157.9 1.1 M085 Pv desconocido 19.2 157.9 49.1 146 Pv desconocido 19.2 157.9 67.2 029 Pf, Pv 30-60 24.5 124.5 6.4 M121 Pv desconocido 19.2 119.4 6.4 M048 Pf 10 24.5 99.4 8.5 M135 Pf, Pm desconocido 19.2 82.4 2.3 M039 Pv 6 24.5 72.1 1.6 044 Pv 11 24.5 65.3 6.0 M040 Pv 3 6.4 63.3 2.5 M106 Pf 3 18.9 48.2 1.4 001 Pv desconocido 19.2 38.3 2.2 M093 Pf desconocido 18.9 24.9 0.8 110 Pf 4 7.5 12.7 0.7 M101 Pf 3 17.5 11.9 2.1 M082 Pf desconocido 18.9 8.3 2.5 M036 Pv 30-60 24.5 6.7 0.9 045 Pv 10 24.5 6.1 1.1 047 Pv 8 24.5 5.9 1.0 Ejemplo 6: Anticuerpos con IgG Pv-EXP1 entre pacientes con malaria de USA.

Se obtuvieron muestras de suero humano de individuos infectados con P. vivax del laboratorio de inmunodiagnóstico de referencia, Marianna Wilson, Encargado, de los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (Chief, Reference I mmunodiagnostic Laboratory, Centers for Disease Control y Prevention), Atlanta, GA, USA (CDC). Se proporcionaron tituladores de anticuerpo inmunofluorescente para cada especie de Plasmodium infecciosa humana de cada muestra, ya que la identificación de las especies Plasmodium se determinó mediante embarrado de sangre. Todas las muestras fueron recolectadas antes de 1990 y se consideraron "especímenes humanos residuales anónimos" ya que los registros originales con respecto a la identidad del donador/pacientes ya o existen. El tiempo entre la infección o la presentación clínica o la recolección de muestras es reconocido. Sin embargo, se puede asumir que los especímenes fueron recolectados rápidamente después de la generación de los síntomas ya que (a) las muestras fueron referidas al Laboratorio de Referencia de Diagnóstico CDC para pruebas/confirmación y (b) se observaron en la sangre parásitos de Plasmodium .

Los sueros de individuos con infección P. vivax fueron probados para reactividad anti-MSPI-19 (todas las especies) y anti-Pv-EXP1 utilizando ElAs de cuentas (ver tabla 5 que se encuentra a continuación). Se detectó IgG MSP1-19 P. vivax en 8/8 individuos en tanto que se detectó IgG EXP1 P. vivax en 6/8 (75%).

Tabla 5 Ejemplo 7: Anticuerpos EXP1 y MSP1-19 Plasmodium vivax entre chimpancés infectados en forma experimental Se recolectaron especímenes de suero aproximadamente de 3 a 4 semanas posteriores a la infección de chimpancés infectados en forma experimental con Plasmodium vivax. Los nueve animales tuvieron un IgG P. vivax fácilmente detectable tal como se determina mediante IFA. Se confirmó la infección P. vivax mediante revisión microscópica de los embarrados de sangre completos. Estos especímenes fueron probados para anticuerpos IgG e IgM MSP1-19 y EXP1 P. vivax utilizando ElAs de cuentas. Los resultados se enlazan en la tabla 6 con la reactividad expresada como proporción S/N (corte provisional para resultado positivo ajustado en S/N de 5.00).

Se detectó IgG MSP1-19 en 7 de 9 animales mientras que se detectó IgM MSP1-19 en los 9. Utilizando un EIA con base recombinante, se detectó IgG EXP1 en 7 de 9 chimpancés en tanto que el ensayo a base de péptido EXP1 detectó IgG en 4 de 9. El ensayo EXP1 de rata recombinante detectó anticuerpos IgM en 8 de 9 animales.

Tabla 6 Ejemplo 8: Reactivos para inmunoensayo a base de micropartículas Preparación de micropartículas Se recubrieron micropartículas con antígenos recombinantes clonados de regiones EXP1 de Plasmodium vivax (Pv-EXPI). Ver el Ejemplo 1 para la preparación de proteína recombinante. Las micropartículas recubiertas con la proteína PvEXP recombinante fueron preparadas en la siguiente forma. En síntesis, se mezcló una alícuota de 250 µ? de micropartículas (4% peso/volumen, 3.2 mieras de diámetro (Interfacial Dynamics Corp., Portland, Oregon) con 1.25 mi de amortiguador de recubrimiento de ácido (2-(N- orfolino)etanosulfónico (MES), pH 6.0) y se peletizaron en una microfuga durante 2 minutos en 14,000 xg. Las partículas se volvieron a suspender en 0.5 mi de amortiguador de recubrimiento MES, y se agregaron 100 pg de proteína recombinante. (En este ejemplo, solución PvEXPI: 9.1 µ? para una concentración final de 0.20 mg/ml). Se mezcló la solución de micropartícula/proteína y se rebotó durante 16 horas a temperatura ambiente. Las micropartículas fueron peletizadas en 14,000 xg durante 2 minutos, y la solución fue eliminada. Las partículas se volvieron a suspender en 1 mi de solución salina amortiguada con fosfato (pH 7.2)(PBS) y se volvieron a peletizar. Las partículas se lavaron con PBS dos veces más, posteriormente se volvieron a suspender en 1 mi de Diluyente de Micropartícula (solución salina amortiguada con fosfato (pH 6.5) con sacarosa al 11.5%). Se determinó la concentración de micropartícula mediante absorbancia en 700 nm en comparación con una curva estándar preparada de concentraciones de micropartículas conocidas. La solución de micropartícula se diluyó a una concentración final de 0.05% en Diluyente de Micropartícula.

Preparación de Conjugados Etiquetados con Acridinio.

Para ensayar anticuerpos, se puede preparar IgG anti-humano de ratón etiquetado con acridinio tal como se indica a continuación: se agregaron 53.6 µ? de amortiguador de conjugación (CB) que contiene fosfato de sodio, NaCI, 3-(3-clolamidopropil)-dimetilamonio-1 -propan-sulfonato (CHAPS, Sigma Chemical Company, Saint Louis, Mo), pH 8.0 y 7.2 µ? de éster de N-hidroxisuccinimida de carboxamida de 10-(3-sulfopropil)-N-tosil-N-(2-carboxietil)-9-acridinium (4mg/ml en dimetilformamida) a 131 µ? de IgG anti-Humano de Ratón (4.59 mg/ml) y 601 µ? de PBS a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se mezcló con un rotator durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se extinguió cargando la mezcla de reacción en la HPLC. Esto se aplicó a una columna de filtración de gel 300 x 7.8 mm Bio-Sil SEC-250 (Bio-Rad, Richmond, California) que haya sido equilibrada con amortiguador que contiene CHAPS, NaCI y fosfato de sodio, pH 6.3. La columna se eluyó en 1.0 ml/minuto con el mismo amortiguador utilizando un controlador Beckman 421 A equipado con una bomba modelo 114M. Las fracciones de 1 mi fueron recolectadas y se determinó la absorbancia en 280 nm y 370 nm con un espectrofotómetro Beckman DU-7. El grado de incorporación de acridinio fue calculado utilizando los métodos tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,705,330. La proporción de acridinio a IgG (mol/mol) obtenida fue de aproximadamente 2.5. El conjugado se almacenó a una temperatura de 4°C.

Ejemplo 9: Ensayo Anti-Pv-EXP1 PRISM El ensayo de anticuerpo PRISM se describe en la Patente Norteamericana No. 5,705,330, incorporada a la presente invención como referencia, y los ensayos de antígeno y anticuerpo PRISM se describen en la Publicación de Shan y Stewart, Manual de Inmunoensayo, segunda edición, editado por David Wild, p 297-303 (2001 ), también incorporado a la presente invención como referencia. Con respecto a la presente invención, se utilizaron los siguientes procedimientos. El formato de ensayo se proporciona en la figura 2. Generalmente, en la estación 1, se suministraron 50 µ? de control o muestra, 50 µ? de amortiguador de diluyente de espécimen (SDB, amortiguador de borato, pH 7.5 que contiene Tween 20, Tritón X-100, urea, albúmina de suero de bobino, suero de becerro recién nacido, NaCI, lisado E. coli y azida), y 50 µ? de micropartículas recubiertas con antígeno recombinante (preparada tal como se describe en el Ejemplo 7 anterior), en cada depósito de incubación y se inicio el cronometraje del ensayo. Estos se mezclaron mediante difusión mutua de cada uno dentro del otro sin agitación externa o revoltura para formar una mezcla de reacción. En la estación 4, la mezcla de reacción fue transferida a un depósito de detección que contenía una matriz fibrosa y se lavó dos veces con 300 µ? de lavado de transferencia (TW, que contiene amortiguador de borato, pH 7.0, con NaCI, Tween-20, Glicerol, urea, y Proclin® 300). Después de 18 minutos de incubación a una temperatura de 37°C, se suministraron 50 µ? de anticuerpo anti-humano de ratón etiquetado con acridinio en la matriz del depósito de detección en la estación 5. El depósito se incubó durante 23 minutos a una temperatura de 37°C, y se lavó tres veces la matriz fibrosa que contiene la mezcla de reacción con 100 µ? de Lavado Final (FW), que contiene amortiguador tris, pH 9.0, con LiCI, sulfato dodecilo de litio, polietilenglicol 1500 y Proclin® 300 en la estación 8. En la estación 9, se generó una señal de quimioluminiscencia (CL) mediante la adición de una solución de peróxido de hidrógeno alcalino y los fotones se midieron a través de un tubo fotomultiplicador. La cantidad de luz emitida es proporcionada a la cantidad de anticuerpo en la muestra. La presencia o ausencia de anticuerpo en la muestra se determina comparando el número de fotones recolectados de la muestra con un valor negativo (S/N). Los resultados se expresan como S/N (señal a negativo) en la tabla 7 que se encuentra a continuación, para un conjunto de muestras de infecciones agudas y crónicas. Las muestras que tienen un S/N mayor a 5.0 se consideran como reactivas para el antígeno. Los resultados se comparan con los resultados obtenidos de un inmunoensayo enlazado por enzimas comercialmente disponible.

Tabla 7 Commercial PvEXPI Muestra ID ELISA S/N M001 Pos 4.17 M002 Pos 1.38 M003 Pos 2.87 M004 Pos 2.35 M005 Neg 0.92 M006 Pos 2.29 M021 Neg 2.08 022 Pos 1.74 M023 Neg 1.13 024 Neg 1.15 M025 Neg 1.57 M027 Neg 1.60 M028 Neg 2.97 M029 Pos 6.91 M030 Neg 1.55 M032 Neg 1.75 M033 Neg 1.85 M034 Pos 1.76 M035 Pos 5.69 M036 Pos 1.60 M037 Neg 1.08 M038 Pos 1.10 M039 Pos 4.37 M040 Pos 17.08 M041 Pos 17.98 M042 Pos 1.33 M043 Pos 57.40 M044 Pos 2.13 M045 Pos 3.72 M046 Pos 1.03 M047 Pos 1.65 M048 Pos 3.38 M049 Pos 1.27 M050 Pos 13.51 M060 Pos 21.1 1 M063 Pos 1.43 M065 Pos 1.38 10 M080 Pos 0.97 M082 Pos 1.80 M085 Pos 39.26 M093 Pos 23.92 M094 Neg 1.33 M095 Neg 21.62 M101 Pos 2.67 M102 Pos 45.31 M103 Pos 26.20 MI 04 Pos 29.81 M105 Pos 4.74 M106 Pos 28.46 M107 Pos 56.24 20 M108 Neg 6.72 M109 Pos 2.41 Ml lO Pos 1.52 Mi l i Pos 2.72 M1 12 Neg 0.53 M1 13 Pos 2.11 M115 Neg 0.95 M119 Pos 1.22 M120 Neg 0.57 M121 Pos 14.43 M122 Neg 1.61 M123 Neg 0.76 M126 Neg 0.67 M135 Pos 2.12 M146 Pos 48.40 Un total de 18 muestras fueron reactivas con PvEXPI. Las muestras M095 y M108 fueron reactivas con PvEXPI pero no fueron reactivas con el inmunoensayo comercial.

En la tabla 8 que se encuentra a continuación, las muestras fueron de una población altamente endémica para malaria. Veintiocho de veintinueve muestras fueron reactivas con el ensayo comercial, y diecinueve de veintinueve tuvieron valores S/N mayores a 5.0 en el ensayo Prism.

Tabla 8 5 15 20 25 193-15 Pos 5.79 783-51 Pos 4.08 612-2 Pos 3.88 ABB/CE/310/00 Pos 3.23 90-12 Pos 10.67 ABB866 Pos 1.24 K076 Pos 3.11 Un experto en la técnica podrá apreciar fácilmente que la presente descripción está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los inherentes a los mismos. Los complejos moleculares y los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas, compuestos específicos aquí descritos actualmente son representativos de modalidades preferidas, son de ejemplo y no pretenden ser limitaciones del alcance de la presente invención. Los expertos en la técnica podrán apreciar fácilmente que se pueden realizar diversas sustituciones y modificaciones a la presente invención aquí descrita, sin apartarse del alcance y espíritu de la misma.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación, indican los niveles de los expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Todas las patentes y publicaciones están incorporadas a la presente invención como referencia hasta el mismo grado como si cada publicación individual fuera indicada en forma específica e individual para estar incorporada, como referencia.

La presente invención descrita en forma ilustrativa en el presente documento, se puede practicar en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se han descrito específicamente en el presente documento. Por lo tanto, por ejemplo, en cada caso en la presente invención cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en", "que consiste en" se puede reemplazar con cualesquiera de otros dos términos. Los términos y expresiones que han sido empleados se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no existe intención de que en el uso de dichos términos y expresiones se excluyan cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de las mimas, si no que se reconozca que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, deberá quedar entendido que aunque la presente descripción ha sido descrita específicamente a través de modalidades preferidas y características opcionales, se puede recurrir a modificaciones y variaciones de los conceptos aquí descritos a través de los expertos en la técnica, y que dichas modificaciones y variaciones están consideradas para estar dentro del alcance de la presente invención, tal como se define a través de las reivindicaciones adjuntas.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una secuencia de ácido nucleico aislada o un fragmento de la misma, caracterizada porque comprende o es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácido del polipéptido tiene al menos el 70% de identidad con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3 y los aminoácidos 2 a 50 de SEC ID NO:2.

2. Una secuencia de ácido nucleico aislada o fragmento de la misma caracterizada porque comprende o es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 70% de identidad con una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido de la SEC ID NO: 1.

3. La secuencia de ácido nucleico asilada tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia es aislada de Plasmodium vivax.

4. Una proteína purificada codificada a través de la secuencia de ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 1.

5. Una proteína purificada o fragmento de la misma, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 70% de identidad con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 50 de SEC ID NO:2.

6. Un método para producir una proteína, en donde el método comprende los pasos de: (a) aislar una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO:1; (b) construir un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico aislada enlazada en forma operable a una secuencia reguladora; y (c) introducir el vector en una célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para expresión de la proteína.

7. El método tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque la célula huésped es una célula eucariótica o célula procariótica.

8. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO:1, enlazada en forma operable a una secuencia reguladora.

9. Una célula huésped que comprende el vector tal cómo se describe en la reivindicación 8.

10. Un método para tratar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos, en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y los aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo/antígeno; y (b) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de complejos de anticuerpo/antígeno.

11. Un método para detectar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos, en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo/antígeno; (b) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conjugado enlace al anticuerpo enlazado, en donde el conjugado comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada por el compuesto.

12. Un método para tratar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha que contiene los anticuerpos, en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo/antígeno; (b) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el conjugado enlace al anticuerpo enlazado, en donde el conjugado comprende un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, adheridos a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba detectando la presencia de la señal generada a través del compuesto.

13. Un método para tratar anticuerpos para P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha que contiene los anticuerpos en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un anti-anticuerpo durante un tiempo bajo condiciones suficientes para permitir la formación de los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo P. vivax; (b) agregar el antígeno a los complejos de antianticuerpo/anticuerpo P. vivax durante un tiempo y bajo condiciones suficientes, para permitir que el antígeno enlace al anticuerpo enlazado, en donde el antígeno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2; (c) agregar un conjugado a los complejos de ánti-anticuerpo/anticuerpo P. vax/antígeno resultantes, en donde el conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (d) detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada a través del compuesto.

14. Un método para detectar anticuerpos para P. malariae, P. falciparum, P. vivax y P. ovale en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con: (i) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, (ii) un antígeno de P. falciparum; (Mi) un antígeno de P. ovale, y (iv) un antígeno de P. malariae, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de anticuerpo P. ma/ar/ae/antígeno, complejos de anticuerpo/P. falciparum antígeno, complejos de anticuerpo/P. vivax antígeno y complejos de anticuerpo/P. ovale antígeno; y (b) detectar la presencia de anticuerpos presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de uno o más de los complejos.

15. Un método para detectar anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con: (i) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, (ii) un antígeno P. ovale, (iii) un antígeno P. malariae y (iv) un antígeno P. falciparum , durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de los complejos de anticuerpo P. ma/ar/ae/antígeno, complejos de anticuerpo P. ova/e/antígeno y complejos de anticuerpo P. v/vax/antígeno y complejos de anticuerpo P. falciparum/antígeno; (b) agregar cuatro conjugados a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que cada conjugado enlace al anticuerpo enlazado, en donde un primer conjugado comprende un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, adherida a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; un segundo conjugado que comprende un antígeno P. ovale adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; un tercer conjugado que comprende un antígeno P. malariae adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable y un cuarto conjugado que comprende un antígeno P. falciparum adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpo para P. malariae , P. ovale, P. vivax y P. falciparum que puede estar presenté en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada a través del compuesto.

16. Un método para detectar anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con (i) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, (ii) un antígeno de P. malariae, (iii) un antígeno de P. vivax y (iv) un antígeno P. falciparum , durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anticuerpo P. malaria/antigeno , complejos de anticuerpo P. o va/e/antígeno, complejos de anticuerpo P. v/Vax/antígeno y complejos de anticuerpo P. falciparumlanWgeno . (b) agregar un conjugado a los complejos de anticuerpo/antígeno resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que cada conjugado enlace al anticuerpo enlazado, en donde el conjugado comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de un anticuerpo para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum, que puede estar presente en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada a través del compuesto.

17. Un método para detectar la presencia de anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar la muestra de prueba con un anti-anticuerpo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/P. vivax, anti- anticuerpo/P. malariae, anti-anticuerpo/P. ovale, y anti-anticuerpo/P. falciparum , (b) agregar un primer antígeno, un segundo antígeno, un tercer antígeno, y un cuarto antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/P. vivax, anti-anticuerpo/P. malariae, anti-anticuerpo/P. ovale, y anti-anticuerpo P. falciparum resultantes durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que los antígenos enlacen al anticuerpo enlazado, en donde (i) el primer antígeno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2; (ii) el segundo antígeno comprende un antígeno P. ovale; (iii) el tercer antígeno comprende un antígeno P. malariae; y (iv) el cuarto antígeno comprende un antígeno P. falciparum; (c) agregar un primer conjugado, un segundo conjugado, un tercer conjugado y un cuarto conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo/antígeno resultantes, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que los conjugados se enlacen al anticuerpo enlazado, en donde los conjugados cada uno se adhieren a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (i) el primer conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevado contra los complejos de anticuerpo P. vax/antígeno; (ii) el segundo conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevado contra complejos de anticuerpo P. ova/e/antígeno; (iii) el tercer conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevado contra complejos de anticuerpo P. ma/ar/ae/antígeno; (vi) el cuarto conjugado comprende una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal elevado contra complejos de anticuerpo P. falciparuml antígeno; y (d) detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada a través de los compuestos.

18. Un método para detectar la presencia de anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba que se sospecha contiene al menos uno de los anticuerpos, en donde el método comprende los pasos dé: (a) contactar la muestra de prueba con anti-anticuerpo para permitir la formación de complejos de antianticuerpo/anticuerpo; (b) agregar un primer conjugado, un segundo conjugado, un tercer conjugado y un cuarto conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo resultantes, durante un período y bajo condiciones suficientes para permitir que los conjugados se enlacen a un anticuerpo enlazado, en donde el primer conjugado comprende un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, adherida a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, en donde el segundo conjugado comprende un antígeno P. ovale adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, en donde el tercer conjugado comprende un antígeno P. vivax adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, y en donde el cuarto conjugado comprende un antígeno P. falciparum adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada a través del compuesto.

19. Una vacuna que comprende: al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, o un epítope de la misma.

20. La vacuna tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizada porque además al menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste en P. falciparum , P. ovale, y P. malariae , y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

21. Un equipo para determinar la presencia de anticuerpo para P. vivax en una muestra de prueba, en donde el equipo comprende: (a) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2; y (b) un conjugado que comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable.

22. Un equipo para determinar la presencia de anticuerpo para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende: (a) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, un antígeno P. ovale, un antígeno P. malariae y un antígeno P. falciparum; y (b) un conjugado que comprende un anticuerpo adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable.

23. Un equipo para detectar anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba, en donde el equipo comprende: (a) un anti-anticuerpo; y (b) un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, un antígeno P. ovale, un antígeno P. malariae, y un antígeno P. falciparum .

24. Un equipo para detectar anticuerpos para P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. falciparum en una muestra de prueba, en donde el equipo comprende: (a) un anti-anticuerpo y (b) un primer conjugado que comprende un antígeno que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, adheridos a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable, un segundo conjugado que comprende un antígeno P. ovale; un tercer conjugado que comprende un antígeno P. malariae adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable y un cuarto conjugado que comprende un antígeno P. falciparum adherido a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable.

25. Un método para detectar la presencia de anticuerpos P. vivax en una muestra de prueba que se sospecha contiene los anticuerpos, en donde el método comprende los pasos de: (a) contactar al compuesto de muestra de prueba con antianticuerpo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la formación de los complejos de anti- anticuerpo/anticuerpo P. vivax; (b) agregar antígeno a los complejos de antianticuerpo/anticuerpo P. vivax resultantes, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que el antígeno enlace al anticuerpo enlazado, en donde el antígeno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, y aminoácidos 2 a 5 de SEC ID NO:2, en donde el antígeno es conjugado a un compuesto que genera la señal con la capacidad de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra de prueba, detectando la presencia de la señal generada por el compuesto.