CN102439033A

CN102439033A - 编码衍生自间日疟虫的输出蛋白1的核苷酸和氨基酸序列及其用途

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Publication number: CN102439033A
Application number: CN2010800225715A
Authority: CN
Inventors: L.G.伯肯迈尔; R.E.科菲; G.J.道森; S.M.德塞; B.J.迪尔; A.S.米尔霍夫
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG; Abbott Laboratories
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2030-03-23
Also published as: MX2011010153A; BRPI1012637A2; CN102439033B; CA2755967C; AU2010228934B2; US8063193B2; AU2010228934A1; EP2430043A1; US20110311572A1; US20100247576A1; CA2755967A1; EP2430043B1; WO2010111220A1; ES2609586T3; US8318897B2

Abstract

本发明涉及针对间日疟虫的EXP1的新多核苷酸和多肽，和在受试者中的间日疟虫抗体或抗间日疟虫抗体的检测中使用这些多核苷酸和多肽的方法。本发明发现在鉴定近期暴露于间日疟虫中特别有用的应用。

Description

编码衍生自间日疟虫的输出蛋白1的核苷酸和氨基酸序列及其用途

领域

本发明涉及尤其在诊断应用中有用的，衍生自间日疟虫（Plasmodium vivax）的输出抗原-1（Exported Antigen-1）（EXP1）基因的核酸序列和由其编码的氨基酸序列。

背景

疟疾传播

疟疾是由寄生物引起的蚊媒疾病。至少4个疟原虫物种可以在自然条件下感染人：恶性疟虫（Plasmodium falciparum）、间日疟虫、卵形疟虫（P. ovale）和三日疟虫（P. malariae）。前2个物种引起全世界最多的感染。间日疟虫和卵形疟虫具有休眠肝阶段寄生物（休眠子），其可以在感染蚊叮咬后几月或几年再活化（或“复发”）且引起疟疾；因此，这些物种在受感染个体中可以难以检测。

在自然界中，疟原虫通过连续感染2类宿主传播：人和雌性按蚊属（Anopheles）蚊子。在人中，寄生物首先在肝细胞且随后在红细胞中生长且繁殖。在血液中，寄生物的同窝（broods）在红细胞内生长且破坏它们，从而释放子代寄生物（裂殖子），其通过侵袭其他红细胞继续该周期。

血液阶段寄生物引起疟疾的症状。当某些形式的血液阶段寄生物，配子母细胞，由雌性按蚊属蚊子在进食血液过程中吸收时，它们开始在蚊子中的另一个、不同的生长和增殖周期。在10-18天后，寄生物作为子孢子在蚊子的唾液腺中发现。当按蚊属蚊子从另一个人获得血餐时，子孢子由蚊子的唾液注射，并且当它们寄生肝细胞时，开始另一次人感染（Wyler，1992）。

疟疾症状和疾病

由疟原虫感染可以导致广泛多样的症状，范围从不存在或非常温和的症状到严重疾病和甚至死亡。疟疾疾病可以分类为非并发的或（并发的）严重的。一般而言，如果迅速诊断且治疗，那么疟疾是可治愈的。在感染性蚊叮咬后，在第一次症状出现前存在潜伏期。潜伏期通常从7到30天不等。对于恶性疟虫最频繁地观察到更短的时期，而对于间日疟虫观察到更长的时期。事实上，间日疟虫可以具有超过450天的延长的潜伏期（Lee等人，1998）。

诊断

疟疾必须迅速被识别以便及时治疗患者且防止感染在社区中的进一步传播。因为关于间日疟虫的长潜伏期，所以诊断通过常规血涂片法可以是困难的，从而耽搁治疗。诊断和治疗中的耽搁是疟疾患者中的死亡主因。疟疾可以基于患者的症状和检查时的身体发现受到怀疑。然而，对于确定诊断，实验室测试必须证实疟原虫的存在。用于疟疾的现有诊断“黄金标准”取决于在显微镜下检查的在血涂片上寄生物的证实。

疟虫属抗体的检测

针对无性疟原虫（即裂殖子）的抗体在寄生物侵入红细胞后数天到数周内出现，并且可以持续数月或甚至数年（Vinetz等人，1998）。然而，通常不推荐用于急性疟疾诊断的抗体检测，这是因为抗体的存在可以指示过去或近期感染。已开发了使用疟虫属（Plasmodium）衍生的抗原（Newmarket Laboratories，UK；Cellabs，澳大利亚）或恶性疟虫完整生物裂解物（DiaMed）的酶联免疫吸附测定（ELISA），以检测人血清或血浆中的免疫球蛋白（IgG和/或IgM）。这些测定比IFA更容易执行，显示更高的通量和更佳的灵敏度与特异性（Kitchen等人，2004；Seed等人，2005；Srivastava等人，1991）。目前的商业ELISA测定不足够灵敏，以检测针对4个疟虫属物种的每一个的抗体（She等人，2007）。

用于捕获抗体的抗原已包括疫苗候选物。这些抗原对于诊断应用是有吸引力的，这是因为这些抗原已知引发抗体应答，并且从而可能用于检测由受感染个体产生的抗体，所述受感染个体起因于寄生物感染。此种抗原的例子包括间日疟虫和恶性疟虫的环子孢子蛋白（CSP）、顶端膜抗原1（AMA-1）、裂殖子表面蛋白质（MSP）1和2（Kitchen等人，2004；Rodrigues等人，2003）。其他有价值的抗原是MSP-2、-3、-4、-5、-8 -9，富含谷氨酸的蛋白质，和丝氨酸重复抗原（Girard等人，2007）。

输出蛋白质-1（EXP1；也称为QF116，抗原5.1，和环子孢子相关抗原（Meraldi等人，2002））已在疟虫属物种中进行研究，尽管它在间日疟虫中的直向同源物仍未得到阐明，除通过序列注视（sequence gazing）外。在非间日疟虫物种中，多肽是被认为在寄生物蛋白质的细胞内转运中重要的小泡蛋白质（Simmons等人，1987）。在恶性疟虫中，EXP1作为23 kD蛋白质在寄生物的红细胞前和无性血液阶段中表达（Hope等人，1984）。作为整合膜蛋白质，它在寄生泡的膜（保护细胞内寄生物的内质和网掩盖的泡）和宿主细胞细胞质内的小泡中发现（Kara等人，1990；Sherman，1985；Tolle等人，1993）。使用EXP1鼠同源物的研究显示蛋白质在小鼠中可以诱导针对用约氏疟虫（P. yoelii）的致死攻击的保护性T细胞免疫（Charoenvit等人，1999）。针对恶性疟虫EXP1多肽产生的抗体已在检测疟疾感染中成功（Meraldi等人，2002）。一般地，C末端在人中是最抗原性的（Meraldi等人，2002）。

已存在使用间日疟虫EXP1序列作为诊断间日疟虫感染的工具的报道（Kim等人，2003；Son等人，2001）；然而，这些早期努力看起来基于不正确序列，并且所产生的诊断最可能检测恶性疟虫EXP1序列。在Kim等人（2003）和Son等人（2001）报道中，作者使用显然使用由Simmons等人公开的序列开发的引物序列（Simmons等人，1987）。Simmons等人（1987）报道了恶性疟虫EXP1序列，并且指出该序列在5个恶性疟虫系中是高度保守的；然而，Simmons等人（1987）未报道来自间日疟虫的任何EXP1序列。Kim等人（2003）和Son等人（2001）引用如来自间日疟虫的GenBank登记号X05074；然而，GenBank的条目指出这个登记是恶性疟虫的部分。为了回避这点，Kim等人（2003）和Son等人（2001）用来自间日疟疾患者的血液作为模板，但数据分析暗示他们使用的引物将不扩增间日疟虫多核苷酸序列，这是因为如现今理解的，正向引物的最后3个核苷酸（3’）和反向引物的最后6个核苷酸（3’）不与推定的间日疟虫EXP1序列退火。

在捐献的血清或血浆中抗体的检测可以用于鉴定个别供体，其已暴露于疟疾生物，并且可能是近期感染的，并且因此是潜在寄生的（parasitemic）。感染人的所有4个疟虫物种已经由输血传播，并且尽管输血后疟疾的发生率在美国是低的（Mungai等人，2001），但供血者的可用性可以通过疟虫抗体筛选测定的实现得到增加，从而使得仅疟疾生物暴露的个体而不是已在疟疾地方性区域中旅行或生活的所有供体从献血中延期，如目前实践的那样。此种测定在理论上将检测针对感染人且引起疟疾的疟虫物种（恶性疟虫、间日疟虫、卵形疟虫和三日疟虫）的抗体。商业抗体ELISAs目前在使用中（英国、澳大利亚、法国）或在其他国家中正考虑用于延期供体的恢复（Elghouzzi等人，2008；Kitchen等人，2004；Seed等人，2005）。在这些情况下，供体就在延期的几个月内针对疟虫衍生的抗原的抗体进行测试。

来自Cellabs Pty. Ltd.（Brookvale，NSW，澳大利亚）的商业测定（泛疟疾抗体（Pan Malaria Antibody）CELISA）要求检测针对所有4个疟虫物种的抗体，所述疟虫物种引起人中的疟疾，以及与免疫荧光测试（IFAT）（根据包装插页）比较94％的灵敏度。独立评价暗示当与IFAT相比较时，该测定对于恶性和非恶性疟疾抗体检测具有弱灵敏度（Mertens等人，1999）。利用培养的恶性疟虫和间日疟虫重组蛋白质（环子孢子蛋白）提取物的混合物的，来自DiaMed AG（瑞士）的另一种测定的独立评价，证实用于检测具有显微镜证实的间日疟虫（18/24）的有症状个体的弱灵敏度，但的确检测在受卵形疟虫（2/2）感染或三日疟虫（2/2）感染的患者中的抗体（Doderer等人，2007）。由Newmarket Laboratories Ltd（Kentford，UK）制造的疟疾抗体测定要求检测负责人疟疾的所有4个疟虫物种，尽管它仅包含恶性疟虫和间日疟虫衍生的重组抗原。包装插页指出对于卵形疟虫和三日疟虫抗体检测分别仅80％和67％的灵敏度。在受卵形疟虫或三日疟虫感染的个体中抗体的检测可以是由于受恶性疟虫或间日疟虫的过去感染，并且从而反应性是由于针对这些抗原的持续抗体的检测。该测定的独立评价证实检测由于卵形疟虫感染具有急性疟疾的仅9/14（64％）个患者和具有间日疟虫疟疾的85％（15/18）患者（Kitchen等人，2004）。因此，这些测定所要求的检测由感染引发的对于恶性疟虫以及卵形疟虫、间日疟虫和三日疟虫的人抗体的能力是有问题的。对于其固相抗原组成已知的那些测定（例如，Newmarket，DiaMed），卵形疟虫或三日疟虫特异性抗原的不存在暗示针对这些物种的抗体的检测可能是由于抗体交叉反应性，这产生关于测定特异性以及灵敏度的重要问题，或在卵形疟虫或三日疟虫样品中观察到的反应性是由于来自先前感染的恶性疟虫或间日疟虫抗体的存在。

因此，目前存在关于来自间日疟虫的疟虫抗体的可靠检测的显著需要。

本文提及的所有专利和公开物在此整体引入作为参考。

发明概述

在第一个方面，本发明涉及分离的核酸序列或其片段，其包括编码多肽的核酸序列或与编码多肽的核酸序列互补，其中所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列具有至少70％同一性。核酸序列可以是例如SEQ ID NO:1的那种，或从间日疟虫中分离。

在第二个方面，本发明涉及由核酸编码的纯化的蛋白质，所述核酸与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少70％序列同一性。

在第三个方面，本发明涉及包括氨基酸序列的纯化的蛋白质或其片段，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列具有至少70％同一性。

在第四个方面，本发明涉及产生蛋白质的方法，其中所述方法包括步骤：

（a）分离包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸序列；

（b）构建包括与调节序列可操作地连接的分离的核酸序列的载体；和

（c）在对于所述蛋白质表达足够的时间和条件下，将所述载体引入宿主细胞内。

宿主细胞可以是原核或真核细胞。

在第五个方面，本发明涉及包括与调节序列可操作地连接的、包含SEQ ID NO:1的核酸序列的载体，和包括此种载体的宿主细胞。

在第六个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在对于抗体/抗原复合物形成足够的时间和条件下，使测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50；和

（b）通过检测抗体/抗原复合物的存在，检测测试样品中存在的抗体的存在。

在第七个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50；

（b）在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；和

（c）通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中存在的抗体的存在。

在第八个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（b）在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的、包含氨基酸序列的抗原，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50；和

在第九个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测间日疟虫抗体的存在的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许抗抗体/间日疟虫抗体复合物形成的时间和条件下，使测试样品与抗抗体接触；

（b）在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体复合物中，其中所述抗原包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列；

（c）将缀合物添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括组合物，所述组合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的、针对间日疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体；和

（d）通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的抗体的存在。

在另外第十个方面，本发明涉及在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、恶性疟虫、间日疟虫和卵形疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在对于三日疟虫抗体/抗原复合物、恶性疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和卵形疟虫抗体/抗原复合物形成足够的时间和条件下，使测试样品与下述接触：（i）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，（ii）来自恶性疟虫的抗原，（iii）来自卵形疟虫的抗原，和（iv）来自三日疟虫的抗原；和

（b）通过检测一种或多种复合物的存在，检测测试样品中存在的抗体的存在。

在第十一个方面，本发明涉及在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许三日疟虫抗体/抗原复合物、卵形疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和恶性疟虫抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使测试样品与下述接触：（i）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，（ii）卵形疟虫抗原，（iii）三日疟虫抗原，和（iv）恶性疟虫抗原；

（b）在足以允许每种缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将4种缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中第一种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原；第二种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的卵形疟虫抗原；第三种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成信号附着的三日疟虫抗原，并且第四种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原；和

（c）通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在。

在第十二个方面，本发明涉及在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许三日疟虫抗体/抗原复合物、卵形疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和恶性疟虫抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使测试样品与下述接触：（i）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，（ii）三日疟虫抗原，（iii）间日疟虫抗原，和（iv）恶性疟虫抗原；

（b）在足以允许每种缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；和

（c）通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫抗体的抗体的存在。

在第十三个方面，本发明涉及用于在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许抗抗体/间日疟虫、抗抗体/三日疟虫、抗抗体/卵形疟虫、和抗抗体/恶性疟虫复合物形成的时间和条件下，使测试样品与抗抗体接触；

（b）在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种抗原、第二种抗原、第三种抗原和第四种抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫、抗抗体/三日疟虫、抗抗体/卵形疟虫、和抗抗体/恶性疟虫复合物中，其中（i）所述第一种抗原包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列；（ii）所述第二种抗原包括卵形疟虫抗原；（iii）所述第三种抗原包括三日疟虫抗原；和（iv）所述第四种抗原包括恶性疟虫抗原；

（c）在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种缀合物、第二种缀合物、第三种缀合物和第四种缀合物添加到所得到的抗抗体/抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物各与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着；并且（i）所述第一种缀合物包括包含针对间日疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；（ii）所述第二种缀合物包括包含针对卵形疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；（iii）所述第三种缀合物包括包含针对三日疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；（vi）所述第四种缀合物包括包含针对恶性疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；和

在第十四个方面，本发明涉及用于在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的方法，其包括步骤：

（a）使测试样品与抗抗体接触，以允许形成抗抗体/抗体复合物；

（b）在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种缀合物、第二种缀合物、第三种缀合物和第四种缀合物添加到所得到的抗抗体/抗体复合物中，其中所述第一种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，其中所述第二种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的卵形疟虫抗原，其中所述第三种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的间日疟虫抗原，并且其中所述第四种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原；和

（c）通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在。

在第十五个方面，本发明涉及包括下述的疫苗：（a）选自下述的至少一种抗原：（i）包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，或其表位。此种疫苗可以进一步包括选自恶性疟虫、卵形疟虫和三日疟虫的抗原；和药学可接受的佐剂。

在第十六个方面，本发明涉及用于测定测试样品中针对间日疟虫的抗体的存在的试剂盒，其包括：（a）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，和（b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。

在第十七个方面，本发明涉及用于测定测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的试剂盒，其包括：（a）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，卵形疟虫抗原，三日疟虫抗原和恶性疟虫抗原，和（b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。

在第十八个方面，本发明涉及用于检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的试剂盒，其包括：a）抗抗体和b）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，卵形疟虫抗原，三日疟虫抗原和恶性疟虫抗原，和b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。

在第十九个方面，本发明进一步涉及用于检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的试剂盒，其包括：（a）抗抗体和（b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原的第一种缀合物，包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的卵形疟虫抗原的第二种缀合物；包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的三日疟虫抗原的第三种缀合物，和包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原的第四种缀合物。

在第二十个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测间日疟虫抗体的存在的方法，其包括步骤：

（b）在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体复合物中，其中所述抗原包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列，其中所述抗原与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着；和

（c）通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的抗体的存在。

附图简述

图1A显示最佳化间日疟虫“输出蛋白1”（EXP1）基因（SEQ ID NO:1）的多核苷酸序列。图1B显示由图1A中所示的EXP1基因（SEQ ID NO:1）编码的EXP1蛋白质的氨基酸序列（SEQ ID NO:2）。图1C显示构成图1B中所示EXP1蛋白质（SEQ ID NO:2）的C末端部分的合成片段（SEQ ID NO:3）。

图2显示实施例9中所述的测定形式。

发明详述

本发明涉及由间日疟虫设计的新核酸和多肽序列。此种核酸序列和多肽可以用于诊断以及治疗目的。

多核苷酸序列和所编码的多肽

本发明人发现抗EXP1抗体在间日疟虫感染后数天或数周内存在。这些抗体看起来不持久，因为它们在得自数年前从疟疾恢复的个体的血清样品中难以检测到。因此，抗EXP1 IgG是近期感染的标记，这对于在近期到疟疾地方性地区旅行的供血者中的抗体鉴定是关键的。

本发明部分涉及例如对于检测受试者的间日疟虫感染有用的新多核苷酸和多肽。本发明的多核苷酸和多肽对于鉴定近期受间日疟虫感染的那些受试者特别有用。因此，本发明提供了诊断工具，以及筛选来自受试者的样品例如组织包括例如血液的工具。检测近期间日疟虫感染允许从血液供给中去除不适宜的采集的血液，从而保护接受受试者。

本发明具有下述优点：EXP1重组多肽可以用于在感染数天或数周内特异性检测受间日疟虫感染的个体的血清或血浆中的抗体。因此，作为早期（急性）期感染的标记，EXP1多肽具有鉴定近期暴露于间日疟虫的个体的能力。因为这些个体可能是供血者，所以在血清转变后不久的抗体检测减少了输血传播的疟疾的危险。

本发明人通过下述完成本发明：精确预测编码间日疟虫EXP1多肽的C末端部分的多核苷酸序列，且随后测试所编码的多肽结合抗EXP1抗体包括来自从受试者中收获的样品的那些抗体的能力。

在一个实施方案中，与氨基末端CKS序列融合且在间接ELISA中使用的重组EXP1多肽检测受间日疟虫感染的个体中的抗EXP1 IgG和IgM抗体。

在一个实施方案中，将本发明的重组EXP1多肽包被到固相支持体上且用于捕获血清或血浆中存在的抗体。抗免疫球蛋白缀合物用于检测结合的免疫球蛋白。

通过与恶性疟虫和约氏疟虫蛋白质的序列同源性，且通过鉴定来自间日疟虫基因组序列的潜在剪接位点，预测对于间日疟虫编码EXP1蛋白质的序列。关于间日疟虫EXP1合成基因的本发明多核苷酸序列显示于图1A（SEQ ID NO:1）中，并且所编码的氨基酸序列显示于图1B（SEQ ID NO:2）中；这些序列也显示于表A中，所述表A还指出特异性特征。该基因包含5’-EcoRI位点，随后为起始密码子（有下划线的），编码间日疟虫EXP1的预测的C末端氨基酸序列的基因主体，编码组氨酸标签的序列（斜体的），终止密码子（粗体）和BamHI位点。限制酶位点用于克隆到表达载体内，并且包括组氨酸标签以促进所表达蛋白质的后续纯化。本发明的组合物和方法包括其中去除组氨酸标签的未修饰的多核苷酸和多肽序列，以及缺乏起始甲硫氨酸和His标签的那些多肽，例如SEQ ID NO:3的那种。

本发明还涉及包括氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2的残基2-50至少约70％等同、优选至少约80％等同、且更优选至少约90％等同。

本发明包含本文描述的全长多肽的“片段”和“肽”。此种肽代表具有例如特异性免疫原性或结合特性的多肽部分。片段长度可以是3-10个氨基酸、10-20个氨基酸、20-40个氨基酸、40-56个氨基酸或甚至更长。与本文描述的片段具有至少70％氨基酸同一性、优选至少80％氨基酸同一性、且更优选至少90％同一性的氨基酸序列也包括在本发明的范围内。

“表位”是多肽的抗原决定簇。表位可以包括对于表位独特的在空间构象中的至少3个氨基酸。一般地，表位由至少5个此种氨基酸组成，并且更通常地，由至少8 – 10个氨基酸组成。

此外，本发明涵盖本发明的核酸序列的片段和衍生物，以及本发明的氨基酸序列的片段和部分。本发明还涵盖本发明的序列的功能等价物（即编码具有例如所编码蛋白质相同的结合亲和力、表位等的蛋白质的多核苷酸序列）。

本发明还涉及检测近期间日疟虫感染的方法，其中就抗间日疟虫EXP1抗体的存在分析来自受试者的测试样品。使用抗EXP1抗体检测近期间日疟虫感染是有效的，这是因为抗EXP1多肽抗体处于其最高滴度且在近期感染的受试者中最容易检测，但滴度随着时间过去降低至通常无法检测的水平。使测试样品与EXP1多肽接触，并且随后检测EXP1多肽通过测试样品中存在的抗体的结合。在一个实施方案中，EXP1多肽与底物连接。

定义

“特异性杂交”指核酸与第二种核酸可检测且特异性结合的能力。在使通过非特异性核酸的可检测结合的可估计量降到最低的杂交和洗涤条件下，多核苷酸与靶核酸链特异性杂交。

“靶序列”或“靶核酸序列”意指编码间日疟虫EXP1多肽的核酸序列或其互补体，其使用例如互补多核苷酸扩增、检测或两者。另外，虽然术语靶序列有时指双链核酸序列；但靶序列还可以是单链的。在其中靶是双链的情况下，本发明的多核苷酸引物序列优选扩增靶序列的2条链。

“测试样品”意指得自受试者的样品或生物学流体，其中样品可以包含间日疟虫多肽或抗间日疟虫多肽抗体。测试样品可以得自任何来源，例如组织、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道拭子、子宫颈拭子、泌尿生殖或肛门拭子、结膜拭子、眼睛晶状体流体、脑脊液等。测试样品可以（i）如得自来源那样直接使用；或（ii）在预处理后使用，以修饰样品的特征。因此，测试样品可以在使用前进行预处理，通过例如由血液制备血浆或血清，破裂细胞或病毒颗粒，由固体材料制备液体，稀释粘性流体，过滤液体，添加试剂，纯化核酸等。

“受试者”包括哺乳动物、鸟类或爬行动物。受试者可以是牛、马、犬、猫或灵长类动物。受试者还可以是人。受试者可以是活的或死的。

“多核苷酸”是核糖核酸（RNA）、脱氧核糖核酸（DNA）、修饰的RNA或DNA、或RNA或DNA模拟物（例如PNAs）及其衍生物和其同源物的核酸聚合物。因此，多核苷酸包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间（主链）键组成的聚合物，以及相似作用的具有非天然存在部分的聚合物。此种修饰或取代的核酸聚合物是本领域众所周知的且用于本发明的目的，被称为“类似物”。寡核苷酸一般是约10到最高达约160或200个核苷酸的短多核苷酸。

“变体多核苷酸”或“变体核酸序列”意指与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少约60％核酸序列同一性，更优选至少约61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％核酸序列同一性，且更加优选至少约99％核酸序列同一性的多核苷酸。变体不包含天然核苷酸序列。其他变体多核苷酸包括这样的，其与SEQ ID NO：1不同，但由于遗传密码的冗余，编码SEQ ID No：2或3、或SEQ ID No：2的氨基酸2-50的多肽，其变体的片段。

一般地，变体多核苷酸长度至少约8个核苷酸，经常长度至少约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 30、35、40、45、50、55、60个核苷酸，或甚至长度约75-200个核苷酸或更多。

就核酸序列而言的“百分比（％）核酸序列同一性”定义为，在比对序列和若需要则引入缺口，以达到最大限度的百分比序列同一性后候选序列中与目的序列中的核苷酸等同的核苷酸百分比。为了测定％核酸序列同一性目的的比对可以以在本领域技术内的各种方式达到，例如使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括达到在被比较的序列全长上的最大限度比对所需的任何算法。

当比对核苷酸序列时，对于、关于或针对给定核酸序列D的给定核酸序列C的％核酸序列同一性（其可以可替代地用短语表示为具有或包括对于、关于或针对给定核酸序列D的特定％核酸序列同一性的给定核酸序列C）可以如下计算：

％核酸序列同一性 = W/Z ^. 100

其中

W是通过序列比对程序或算法的C和D比对评分为等同匹配的核苷酸数目

和

Z是D中的核苷酸总数目。

当核酸序列C的长度不等同于核酸序列D的长度时，C与D的％核酸序列同一性将不等同于D与C的％核酸序列同一性。

“基本上由具有％序列同一性的多核苷酸组成”意指多核苷酸在长度中没有相当大不同，但在序列中可能相当大地不同。因此，基本上由与100个核苷酸的已知序列“B”具有至少80％序列同一性的多核苷酸组成的多核苷酸“A”意指多核苷酸“A”约100个nts长，但最高达20个nts可以与“B”序列不同。正被讨论的多核苷酸序列可以更长或更短，这是由于末端的修饰，例如1-15个核苷酸的添加，以产生特定类型的探针、引物和其他分子工具等，例如当添加基本上非等同的序列以产生预期二级结构时的情况。当序列通过“基本上由……组成”修饰时，此种非等同核苷酸在序列同一性计算中不予以考虑。

单链DNA与互补片段杂交的特异性由反应条件的严格性决定。杂交严格性随着形成DNA双链体的倾向降低而增加。在核酸杂交反应中，可以选择严格性以支持特异性杂交（高严格性）。较不特异的杂交（低严格性）可以用于鉴定相关但并非确切的DNA分子（同源但并非等同）或区段。

DNA双链体通过下述得到稳定：（1）互补碱基对数目，（2）碱基对类型，（3）反应混合物的盐浓度（离子强度），（4）反应温度，和（5）降低DNA双链体稳定性的特定有机溶剂例如甲酰胺的存在。通常方法是改变温度：更高的相对温度导致更严格的反应条件。（Ausubel等人，1987）提供杂交反应的严格性的极佳解释。

在“严格条件”下的杂交意指其中彼此至少60％同源的核苷酸序列保持杂交的杂交规程。

多核苷酸可以包括其他附加基团，例如肽（例如用于在体内靶向宿主细胞受体），或促进跨越细胞膜的转运的试剂。此外，寡核苷酸可以用杂交触发的切割试剂（van der Krol等人，1988）或嵌入剂（intercalating agents）（Zon，1988）进行修饰。寡核苷酸可以与另一种分子缀合，例如肽、杂交触发的交联剂、转运试剂、杂交触发的切割试剂等。

有用的多核苷酸类似物包括具有修饰的主链或非天然核苷间键的聚合物。修饰的主链包括保留主链中的磷原子的那些，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，以及不再具有磷原子的那些，例如通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。修饰的核酸聚合物（类似物）可以包含一种或多种修饰的糖部分。

其中核苷酸单位的糖和核苷间键由新基团替换的作为RNA或DNA模拟物的类似物也是有用的。在这些模拟物中，维持碱基单位用于与靶序列杂交。已显示具有极佳杂交性质的此种模拟物的例子是肽核酸（PNA）（Buchardt等人，1992；Nielsen等人，1991）。

核苷酸的范畴包括其中核酸分子已通过取代、化学、酶促或其他合适方法用除天然存在的核苷酸外的部分共价修饰的衍生物。

SEQ ID NO:1的多核苷酸可以通过常规技术进行制备，例如使用商购可得设备的固相合成，例如可从Applied Biosystems USA Inc.（Foster City，CA；USA）、DuPont（Wilmington，DE；USA）或Milligen（Bedford，MA；USA）获得的那种。修饰的多核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物还可以通过本领域已知的相似方法容易地制备（Fino，1995；Mattingly，1995；Ruth，1990）。

“2个氨基酸序列之间的同一性”定义为在2个序列中一系列确切相同或不变的氨基酸残基的存在（参见上文关于核酸序列之间的同一性的定义）。“互补性”和“同一性”的定义是本领域普通技术人员众所周知的。

“由……编码”指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含来自由核酸序列编码的多肽的至少3个氨基酸、更优选至少8个氨基酸、且甚至更加优选至少15个氨基酸的氨基酸序列。

本发明还涵盖分离的多核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID Nos:2和3的那种相似的功能活性的多肽，并且在中等严格条件下可与具有这样的核酸序列的多核苷酸杂交，所述核酸序列包括上文描述的核苷酸序列或与上文描述的核苷酸序列互补。

术语“其为功能上等价的片段或亚片段”和“功能上等价的片段或亚片段”在本文中可互换使用。这些术语指分离的核酸片段的部分或子序列，其中改变基因表达或产生某一表型的能力被保留，无论片段或亚片段是否编码活性酶。例如，片段或亚片段可以用于嵌合构建体的设计中，以在转化的植物中产生所需表型。通过在相对于启动子序列的合适方向中连接核酸片段或其亚片段，可以设计嵌合构建体用于在共抑制或反义中使用，无论它是否编码活性蛋白质。

术语“同源性”、“同源的”、“基本上相似的”和“基本上对应”在本文中可互换使用。它们指核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基中的改变不影响核酸片段介导基因表达或产生某一表型的能力。这些术语还指本发明的核酸片段的修饰，例如一个或多个核苷酸的缺失或插入，其基本上不改变所得到的核酸片段相对于最初的、未修饰的片段的功能特性。因此理解如本领域技术人员将认识到的，本发明涵盖超过本文描述的具体示例性序列。

“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列前（5'非编码序列）和后（3'非编码序列）的调节序列。

“天然基因”指如在自然界中与其自身调节序列一起发现的基因。相比之下，“嵌合构建体”指在自然界中正常未一起发现的核酸片段的组合。因此，嵌合构建体可以包括衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或衍生自相同来源但以与自然界中正常发现的那种不同的方式排列的调节序列和编码序列。（术语“分离的”意指序列从其天然环境中取出。）

“外来”基因指在宿主生物中正常未发现，但通过基因转移引入宿主生物内的基因。外来基因可以包含插入非天然生物内的天然基因，或嵌合构建体。“转基因”是已通过转化程序引入基因组内的基因。

如本文使用的，“探针”或“引物”是长度至少8个核苷酸且与靶序列形成杂交体结构的多核苷酸，这是由于探针或引物中的至少一个序列与靶区域中的序列的互补性。探针的多核苷酸区可以由DNA和/或RNA和/或合成核苷酸类似物组成。优选地，探针不包含与在聚合酶链反应过程中用于引发靶序列的一个或多个序列互补的序列。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调节序列”指定位于编码序列上游（5'非编码序列）、之内或下游（3'非编码序列），并且影响所结合的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。

“启动子”（或“调节序列”）指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。启动子序列例如由近侧和更远侧的上游元件组成，后面一种元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有元件或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。调节序列（例如启动子）还可以定位于基因的转录部分内，和/或转录的序列的下游。启动子可以整体衍生自天然基因，或可以由衍生自在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成DNA区段。本领域技术人员应当理解不同启动子可以指导在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或响应不同环境条件的基因表达。导致基因在大多数宿主细胞类型中、在大多数时间表达的启动子通常称为“组成型启动子”。在植物细胞中有用的各种类型的新启动子不断被发现；众多例子可以在Okamura等人（1989）（Okamura和Goldberg，1989）中的汇编中找到。进一步认识到因为在大多数情况下调节序列的确切边界仍未完全限定，所以具有一些变异的DNA片段可以具有等同的启动子活性。

“内含子”是在基因中不编码蛋白质序列的部分的间插序列。因此，此种序列转录成RNA但随后被切割且不翻译。该术语还用于切割的RNA序列。“外显子”是被转录且在衍生自基因的成熟信使RNA中发现的基因序列的部分，但不一定是编码最后基因产物的序列部分。

“翻译前导序列”指定位于基因的启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响初级转录物加工为mRNA， mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的例子已得到描述（Turner和Foster，1995）。

“3'非编码序列”指定位于编码序列下游的DNA序列，且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常通过影响聚腺苷酸区(tract)添加到mRNA前体的3'末端进行表征。不同3'非编码序列的使用由Ingelbrecht等人，（1989）Plant Cell 1:671-680例示。

“RNA转录物”指起因于RNA聚合酶催化的DNA序列转录的产物。当RNA转录物是DNA序列的绝对互补拷贝时，它称为初级转录物，或它可以是衍生自初级转录物的转录后加工的RNA序列且称为成熟RNA。“信使RNA（mRNA）”指不含内含子且可以通过细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补且使用酶逆转录酶由mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或使用DNA聚合酶I的克列诺（Klenow）片段转变成双链形式。“有义”RNA指包括mRNA且可以在细胞内或在体外翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补且阻断靶基因表达的RNA转录物（美国专利号5,107,065）。反义RNA的互补性可以是与特异性基因转录物的任何部分的，即在5'非编码序列、3'非编码序列、内含子或编码序列。“功能RNA”指反义RNA、核酶RNA或可以不被翻译但仍对细胞过程有作用的其他RNA。术语“互补体”和“反向互补体”就mRNA转录物而言在本文中可互换使用，并且意欲限定信息的反义RNA。

“内源RNA”指在用本发明的重组构建体转化，无论是天然存在还是非天然存在的，即通过重组方法、诱变等引入前，由宿主的基因组中存在的任何核酸序列编码的任何RNA。

“非天然存在的”意指人工的，与在自然界中正常发现的那种不一致。

“可操作地连接的”指在单个核酸片段上核酸序列的结合，从而使得一种的功能由另一种调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时，启动子与那种编码序列可操作地连接（即编码序列在启动子的转录控制下）。编码序列可以在有义或反义方向与调节序列可操作地连接。在另一个例子中，本发明的互补RNA区可以直接或间接地在靶mRNA 5'，或在靶mRNA 3'，或在靶mRNA内可操作地连接，或第一个互补区在靶mRNA 5'，并且它的互补体在靶mRNA 3'。

如本文使用的，“表达”指功能终产物的产生。基因的表达涉及基因的转录和mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。“反义抑制”指能够抑制靶蛋白质表达的反义RNA转录物的产生。“共抑制”指能够抑制等同或基本上相似的外来或内源基因表达的有义RNA转录物的产生（美国专利号5,231,020）。

“成熟”蛋白质指翻译后加工的多肽；即，初级翻译产物中存在的任何前肽或肽原已去除的那种。“前体”蛋白质指mRNA翻译的初级产物；即其中前肽和肽原仍存在。前肽和肽原可以是但不限于细胞内定位信号。

“稳定转化”指核酸片段转移到宿主生物的基因组内，从而导致遗传上稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”指核酸片段转移到宿主生物的核或含DNA细胞器内，从而导致无整合或稳定遗传的基因表达。包含转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。如本文使用的，术语“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，且在Sambrook等人（1989）（Sambrook，1989）（下文“Sambrook”）中更全面地描述。

“重组体”指2个否则分离的序列区段的人工组合，例如通过化学合成或通过经由基因工程技术操作核酸的分离的区段。

“PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量特定DNA区段的技术，由一系列重复的循环组成（Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT）。一般地，使双链DNA热变性，与靶区段的3'边界互补的2个引物在低温退火，并且随后在中间温度延伸。一组这3个连续步骤被称为循环。

PCR是通过模板的反复复制，在短时间段内用于将DNA扩增数百万倍的强大技术。（（Mullis等人， 1986）；Erlich等人，欧洲专利申请号50,424；欧洲专利申请号84,796；欧洲专利申请号258,017，欧洲专利申请号237,362；欧洲专利申请号201,184，美国专利号4,683,202；美国专利号4,582,788；和美国专利号4,683,194）。该方法利用特定体外合成的寡核苷酸组以引发DNA合成。引物的设计取决于待分析的DNA序列。该技术通过在高温使模板解链、允许引物与模板内的互补序列退火，并且随后用DNA聚合酶复制模板的许多循环（通常20-50个）执行。

PCR反应的产物通过在琼脂糖凝胶中分离随后为溴化乙锭染色和用UV透照显现进行分析。可替代地，放射性dNTPs可以添加到PCR中，以将标记掺入产物内。在这种情况下，PCR的产物通过使凝胶暴露于x射线片进行显现。放射性标记的PCR产物的添加的优点是可以定量个别扩增产物的水平。

“重组构建体”、“表达构建体”和“重组表达构建体”在本文中可互换使用。这些术语指可以使用本领域技术人员众所周知的标准方法插入细胞的基因组内的遗传材料的功能单位。此种构建体可以自身是载体或可以与载体结合使用。如果使用载体，那么载体的选择取决于将用于转化宿主植物的方法，如本领域技术人员众所周知的。例如，可以使用质粒。技术人员充分知道必须存在于载体上的遗传元件，以成功转化、选择且繁殖包括本发明的任何分离的核酸片段的宿主细胞。技术人员还将认识到不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达（Jones等人，1985）；De Almeida，1989 #475}），并且因此必须筛选多个事件，以获得展示所需表达水平和模式的系。此种筛选可以通过DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白质表达的Western分析、或表型分析完成。

多肽变体

一般而言，多肽变体保持抗原功能，且包括其中在序列中的特定位置上的残基已由其他氨基酸取代的任何变体，并且进一步包括将另外的一个或多个残基插入亲本多肽的2个残基之间的可能性，以及缺失来自亲本序列的一个或多个残基的可能性。

“多肽变体”意指与全长天然序列或全长多肽序列的片段具有至少约70％氨基酸序列同一性的，包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的残基2-50的氨基酸序列的多肽。例如，多肽变体包括其中一个或多个氨基酸残基在全长天然氨基酸序列的N或C末端上添加或缺失的那些。多肽变体将与全长序列具有至少约71％-75％氨基酸序列同一性；至少约76％-79％氨基酸序列同一性；至少约80％氨基酸序列同一性，至少约81％氨基酸序列同一性，至少约82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％氨基酸序列同一性和至少约99％氨基酸序列同一性。通常地，变体多肽长度为至少约10个氨基酸，经常长度至少约20个氨基酸，更经常长度至少约30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或300个氨基酸或更多。

“百分比（％）氨基酸序列同一性”定义为，当比对2个序列时，与候选序列中靶序列中的氨基酸残基等同的氨基酸残基百分比。为了测定％氨基酸序列同一性，比对序列和若需要则引入缺口，以达到最大限度的％序列同一性；保守取代不视为序列同一性的部分。测定百分比同一性的氨基酸序列比对程序是本领域技术人员众所周知的。可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign（DNASTAR）可以用于比对多肽序列。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括达到在被比较的序列全长上的最大限度比对所需的任何算法。

当比对氨基酸序列时，对于、关于或针对给定氨基酸序列B的给定氨基酸序列A的％氨基酸序列同一性（其可以可替代地用短语表示为具有或包括对于、关于或针对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）可以计算为：％氨基酸序列同一性 = X/Y100

其中

X是通过序列比对程序或算法的A和B比对评分为等同匹配的氨基酸残基数目

和

Y是B中的氨基酸残基总数目。

如果氨基酸序列A的长度不等同于氨基酸序列B的长度时，那么A与B的％氨基酸序列同一性将不等同于B与A的％氨基酸序列同一性。

有用的保守取代显示于表B，“示例性取代”中。由此一个类别的氨基酸由相同类型的另一个氨基酸替换的保守取代属于本发明的范围，只要取代不大大改变化合物的生物学活性。如果此种取代导致生物学活性中的改变，那么引入在表C中作为示例指出的更基本的改变，并且就靶序列生物学活性筛选产物。

影响（1）多肽主链的结构，例如β折叠或α螺旋构象、（2）电荷或（3）疏水性、或（4）靶位点侧链的体积的非保守取代可以修改多肽功能。残基基于如表B中指示的共同侧链特性分成组。非保守取代要求把这些类别之一的成员换成另一个类别。取代可以引入保守取代位点内或更通常引入非保守位点内。

使用例如寡核苷酸介导的（位点定向）诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变可以制备变体多肽。可以对克隆的DNA执行位点定向诱变（Carter，1986；Zoller和Smith，1987）、盒式诱变、限制性选择诱变（Wells等人，1985）或其他已知技术，以产生靶序列变体（Ausubel等人，1987；Sambrook，1989）。

分离的 / 纯化的多肽

“分离的”或“纯化的”多肽或生物学活性片段（例如Fab片段）从其环境的组分中分离和/或回收。污染物组分包括一般将干扰关于多肽的诊断用途的材料，且可以包括酶、激素和其他多肽性质(polypeptideaceous)或非多肽性质的材料。为了是基本上分离的，制剂具有小于30干重％污染物，通常小于20％、10％和更通常小于5％污染物。分离的、重组产生的靶序列或生物学活性部分理想地基本上不含培养基，即培养基代表小于20％、10％或5％的靶序列制剂体积。

本发明的多肽可以在体外合成或由多核苷酸序列重组表达。由于遗传密码中的冗余，序列无需是等同的以实践本发明。多核苷酸和多肽序列同一性可以是70％-100％，例如70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和当然100％。

本发明的多肽可以使用多肽化学在体外容易地合成。例如，多肽合成可以以逐步方式在固相支持体上执行，其中使用自动化多肽合成仪，例如Rainin Symphony Peptide Synthesizer、Advanced Chemtech Peptide Synthesizer、Argonaut Parallel Synthesis System或Applied Biosystems Peptide Synthesizer。肽合成仪仪器组合Fmoc化学与HOBt/HBTU/DIEA活化，以执行固相肽合成。

许多氨基酸的侧链包含化学上活性的基团，例如胺、醇或硫醇。这些侧链必须另外受保护，以阻止在偶联步骤过程中不需要的副反应。碱稳定更优选地碱稳定和酸不稳定的侧链保护基团是最有用的。

可替代地，通过载体或构建体的使用，目的多肽可以引入原核或真核宿主细胞内，以用于宿主细胞表达目的蛋白质。载体例如噬菌体、粘粒或质粒可以包括编码酶的核酸序列，以及在宿主细胞中起作用且能够引起由核酸序列编码的蛋白质表达的任何调节序列（例如，启动子）。调节序列（例如启动子）与核苷酸序列可操作地结合或可操作地连接。（如果调节序列影响编码序列的转录或表达，那么调节序列（例如启动子）被说成与编码序列“可操作地连接”。）合适启动子包括例如来自编码下述的基因的那些：醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、葡糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸激酶、酸性磷酸酶、T7、TPI、乳糖酶、金属硫蛋白、巨细胞病毒立即早期、乳清酸性蛋白、葡糖淀粉酶、在半乳糖的存在下激活的启动子例如GAL1和GAL10、以及与原核和真核表达系统有关的任何其他启动子。另外，在载体内还可以包括编码其他蛋白质的核酸序列以及其他非启动子调节序列，例如聚腺苷酸化信号（例如SV-40T-抗原、卵清蛋白或牛生长素的聚腺苷酸化信号）。构建体中存在的序列的选择取决于所需表达产物以及宿主细胞的性质。

如上所述，一旦载体已构建，它随后就可以通过本领域普通技术人员已知的方法引入选择的宿主细胞内，包括例如转染、转化和电穿孔（Sambrook，1989）。宿主细胞随后在允许所需蛋白质表达的合适条件下培养，所述蛋白质随后进行回收且纯化。

合适的原核宿主细胞的例子包括例如细菌例如大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、放线菌例如天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans）、以及蓝细菌例如螺旋蓝细菌属物种（Spirulina spp.）（即蓝绿藻）。合适真核宿主细胞的例子包括例如哺乳动物细胞，植物细胞，酵母细胞例如糖酵母属物种（Saccharomyces spp.）、油脂酵母属物种（Lipomyces spp.）、假丝酵母属物种（Candida spp.）例如耶氏酵母属（Yarrowia）（假丝酵母属）物种、克鲁维氏酵母属（Kluyveromyces spp.）、毕赤氏酵母属物种（Pichia spp.）、木霉属物种（Trichoderma spp.）或汉逊氏酵母属物种（Hansenula spp.），或真菌细胞例如丝状真菌细胞，例如曲霉属（Aspergillus）、链孢霉属（Neurospora）和青霉属（Penicillium）。昆虫细胞例如在杆状病毒系统中使用的那些（Luckow，1991），也用于具有真核修饰的多肽的体外产生。

在宿主细胞中的表达可以以瞬时或稳定方式完成。瞬时表达可以由引入的构建体发生，所述引入的构建体包含在宿主细胞中起作用的表达信号，但所述构建体在宿主细胞中不复制且很少整合，或其中宿主细胞不增殖。瞬时表达还可以通过诱导与目的基因可操作地连接的可调节启动子的活性来完成，尽管此种诱导型系统通常展示低基本水平的表达。稳定表达可以通过引入构建体来达到，所述构建体可以整合到宿主基因组内或在宿主细胞中自主复制。通过使用定位于表达构建体上的可选标记，或用表达构建体转染，随后为表达标记的细胞的选择，可以选择目的基因的稳定表达。当稳定表达起因于整合时，构建体的整合位点可以随机在宿主基因组内发生，或可以通过使用包含与宿主基因组具有足够同源性以靶向与宿主基因座重组的区域的构建体靶向。当构建体靶向内源基因座时，可以由内源基因座提供转录和翻译调节区的所有或一些。

还可以使用转基因哺乳动物，以表达由上述核酸序列中的一种或两种编码的目的蛋白质。更具体而言，一旦产生了上述构建体，它就可以插入胚胎的前核内。胚胎随后可以植入雌性接受者内。可替代地，还可以利用核转移法（Schnieke等人，1997）。随后允许妊娠和分娩发生（参见例如，美国专利号5,750,176和美国专利号5,700,671），并且来自后代的乳、组织或其他流体样品随后应包含目的蛋白质。作为宿主利用的哺乳动物可以选自小鼠、大鼠、兔、猪、山羊、绵羊、马和牛。然而，可以使用任何哺乳动物，条件是它具有将编码目的蛋白质的DNA引入其基因组内的能力。

本发明的多核苷酸和多肽的用途

分离的核酸序列和由其编码的相应蛋白质可以具有许多有利用途。本发明提供了免疫测定，和特别地精确地检测人血清中针对间日疟虫的抗体的存在的抗原。

此外，本发明还包括针对上述蛋白质产生的多克隆和单克隆抗体。此种抗体可以例如用于免疫测定、疫苗（用于被动免疫接种）、试剂盒或用于研究目的。

免疫测定

存在2种基本类型的测定，竞争和非竞争性的（例如分别地免疫度量(immunometric)和夹心）。在2种测定中，抗体或抗原试剂与固相共价或非共价附着（Wild，2001）。用于共价附着的连接试剂是已知的，并且可以是固相的部分或在包被前对其衍生化。在免疫测定中使用的固相的例子是有孔和无孔材料、胶乳颗粒、磁性颗粒、微粒、条、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。固相材料和标记抗原或抗体试剂的方法的选择基于所需测定形式性能特征决定。对于一些免疫测定，不需要标记。例如，如果抗原在可检测颗粒例如红细胞上，那么反应性可以基于凝集确立。可替代地，抗原-抗体反应可以导致可见变化（例如散射免疫扩散）。在大多数情况下，在免疫测定中使用的抗体或抗原试剂之一与信号生成化合物或“标记”附着。这种信号生成化合物或标记自身是可检测的，或可以与一种或多种另外化合物反应，以生成可检测产物（还参见美国专利号6,395,472 B1）。此种信号生成化合物的例子包括色原、放射性同位素（例如¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³H、³⁵S和¹⁴C）、荧光化合物（例如荧光素、罗丹明）、化学发光化合物、颗粒（可见或荧光的）、核酸、络合剂、或催化剂例如酶（例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶）。在酶使用的情况下，生色、荧光或发光(lumo-genic)底物的添加导致可检测信号的生成。其他检测系统例如时间分辨荧光、内部反射荧光、扩增（例如聚合酶链反应）和拉曼光谱也是有用的。

存在在人中常用于监控特异性抗体滴度和类型的2种一般形式：（1）抗原在固相上呈现，如上所述，允许包含特异性抗体的人生物学流体与抗原反应，并且随后用与信号生成化合物偶联的抗人抗体检测与抗原结合的抗体，和（2）抗人抗体与固相结合，允许包含特异性抗体的人生物学流体与结合的抗体反应，并且随后添加与信号生成化合物附着的抗原，以检测在流体样品中存在的特异性抗体。在2种形式中，抗人抗体试剂可以识别所有抗体类别，或可替代地，对于特定类别或亚类的抗体是特异性的，这取决于预期测定目的。这些测定形式以及其他已知形式预期在本发明的范围内，并且是本领域普通技术人员众所周知的。

本文的任何示例性形式和根据本发明的任何测定或试剂盒可以适应于或最佳化用于在自动化和半自动化系统中使用（包括其中存在包括微粒的固相的那些），如例如美国专利号5,089,424和5,006,309中所述的，并且如例如由Abbott Laboratories（Abbott Park，IL）商业销售的，包括但不限于Abbott’s ARCHITECT®、AxSYM、IMX、PRISM和Quantum II平台，以及其他平台。

本发明的测定和试剂盒可以适应于或最佳化用于及时现场护理（point-of-care）测定系统，包括Abbott’s Point of Care（i-STAT™）电化学免疫测定系统。在单用途（single-use）的测试设备中制造和操作其的免疫传感器和方法例如在美国专利号5,063,081和公开的美国专利申请号20030170881、20040018577、20050054078和20060160164（就其关于这点的教导引入本文作为参考）中描述。

本发明包括检测测试样品中针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤：（a）使怀疑包含抗体的测试样品与包括多肽的间日疟虫蛋白质或抗原接触，所述多肽与氨基酸序列具有至少70％序列同一性，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列；和（b）检测测试样品中存在的抗体的存在。更具体而言，本发明包括检测测试样品中针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤：（a）在足以允许抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使怀疑包含抗体的测试样品与包括多肽或其片段的间日疟虫蛋白质或抗原接触，所述多肽与氨基酸序列具有至少70％序列同一性，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列；（b）在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；（c）通过检测由信号生成化合物生成的信号，检测测试样品中可以存在的抗体的存在。可以使用与抗原结合的对照或校准物。间日疟虫抗原可以包括与氨基酸序列具有至少70％- 99％，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的多肽、或其片段，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列。这些多肽的片段可以是约8-56个氨基酸残基，例如8、9、10、20、30、40、50、51、52、53、54、55和56个残基。抗原可以包括基本上由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成的多肽。最后，抗原可以由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成。

除其中一种检测针对疟虫属的一个物种（例如三日疟虫或卵形疟虫）的抗体的存在的上述测定外，人们还可以执行检测测试样品中针对疟虫属的2个或更多个物种的抗体的测定。例如，人们可以希望执行其中可以检测感染人的疟虫属的所有已知物种的测定，从而消除用现有测定获得的假阴性结果的危险。因此，本发明包括检测测试样品中针对三日疟虫、恶性疟虫、间日疟虫和卵形疟虫的抗体的方法，其包括步骤：（a）使怀疑包含这4个类型抗体中的至少一个的测试样品与下述接触：（1）三日疟虫的抗原；（2）卵形疟虫的抗原；（3）恶性疟虫的抗原，和（4）间日疟虫的抗原，其包括多肽，所述多肽与氨基酸序列具有至少70％序列同一性，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列；和（b）例如通过检测复合物的存在，检测测试样品中存在的针对一种或多种所述抗原的抗体的存在。更具体而言，本发明包括检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤：（a）使测试样品与下述接触：（1）三日疟虫的抗原；（2）卵形疟虫的抗原；（3）恶性疟虫的抗原，和（4）间日疟虫的抗原，其包括多肽，所述多肽与氨基酸序列具有至少70％序列同一性，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列；（b）在足以允许每种缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；和（c）通过检测由信号生成化合物生成的信号，检测测试样品中可以存在的抗体的存在。可以使用与抗原结合的对照或校准物。（复合物的存在指出4个类型抗体中的至少一个存在于测试样品中。特别地，测定具有检测样品中所有4个类型抗体的存在的能力，从而致使样品是阳性的且预防假阴性。人们可能不希望确切知道哪一种或多种抗体类型存在（如当就捐献目的筛选合适的血液样品时）；然而，如本文描述的，如果需要的话，那么此种测定是可能的）。间日疟虫抗原可以包括与氨基酸序列具有至少70％- 99％，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的多肽、或其片段，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列。这些多肽的片段可以是约8-56个氨基酸残基，例如8、9、10、20、30、40、50、51、52、53、54、55和56个残基。抗原可以包括基本上由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成的多肽。最后，抗原可以由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成。

应当指出就本文描述的试剂盒、疫苗和测定而言，任何先前描述的恶性疟虫、间日疟虫、三日疟虫和卵形疟虫抗原都可以与本发明的任何一种或多种抗原（例如裂殖子表面蛋白质、环子孢子表面蛋白输出蛋白1、顶端膜抗原、细胞粘连连接的无性基因、富含组氨酸的蛋白质2、FeSOD、pLDH和红细胞结合抗原）组合利用。

疫苗

本发明还包括包含如本文描述的一种或多种多肽或其抗原的疫苗。此种疫苗用于哺乳动物的自动免疫接种，例如冒着暴露于一种或多种疟虫属抗原的危险中的人（例如，由于在其中疟疾流行的地区内旅行）。例如，疫苗可以包含选自下述的至少一种抗原：1）包括与氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽的间日疟虫抗原，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列。间日疟虫抗原可以包括与氨基酸序列具有至少70％- 99％，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的多肽或其片段，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列。这些多肽的片段可以是约8-56个氨基酸残基，例如8、9、10、20、30、40、50、51、52、53、54、55和56个残基。抗原可以包括基本上由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成的多肽。最后，抗原可以由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成。

可替代地，如果需要被动免疫接种，那么人们可以施用针对下述抗原的一种或多种抗体（作为接种疫苗）：与氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列。间日疟虫抗原可以包括与氨基酸序列具有至少70％- 99％，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的多肽或其片段，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列。这些多肽的片段可以是约8-56个氨基酸残基，例如8、9、10、20、30、40、50、51、52、53、54、55和56个残基。抗原可以包括基本上由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成的多肽。最后，抗原可以由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成。

诊断试剂盒

诊断试剂盒也包括在本发明的范围内。本发明包括用于测定测试样品中针对间日疟虫的抗体的存在的试剂盒。试剂盒可以包括：（a）包括与氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽的间日疟虫抗原，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列；和（b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。试剂盒还可以包含包括与抗原结合的试剂的对照或校准物。间日疟虫抗原可以包括与氨基酸序列具有至少70％- 99％，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的多肽或其片段，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列。这些多肽的片段可以是约8-56个氨基酸残基，例如8、9、10、20、30、40、50、51、52、53、54、55和56个残基。抗原可以包括基本上由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成的多肽。最后，抗原可以由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成。

本发明还包括用于测定测试样品中针对间日疟虫的抗体的存在的试剂盒。试剂盒可以包括：（a）包括与氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽的间日疟虫抗原，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列；和（b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。间日疟虫抗原可以包括与氨基酸序列具有至少70％- 99％，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的多肽或其片段，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列。这些多肽的片段可以是约8-56个氨基酸残基，例如8、9、10、20、30、40、50、51、52、53、54、55和56个残基。抗原可以包括基本上由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成的多肽。最后，抗原可以由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:2的氨基酸残基2-50的氨基酸序列组成。

另外，本发明包括用于测定针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的试剂盒。此种试剂盒可以包括：（1）三日疟虫抗原；（2）卵形疟虫抗原；（3）如先前描述的间日疟虫抗原；和（4）恶性疟虫抗原，和（5）包括与能够生成可检测信号的第一种信号生成化合物附着的抗体的缀合物。

Ab 产生

“抗体”（Ab）包括针对靶抗原的单个Abs（抗靶抗原Ab）、具有多表位特异性的抗靶抗原Ab组合物、单链抗靶抗原Abs、和抗靶抗原Abs的片段。“单克隆抗体”（mAb）得自基本上均质Abs的群体，即构成群体的个别Abs是等同的，除可以以小量存在的可能天然存在的突变外。示例性Abs包括多克隆（pAb）、单克隆（mAb）、人源化、双特异性（bsAb）和异缀合物(heteroconjugate)Abs。

通过免疫原和若需要时佐剂的一次或多次注射，可以在哺乳动物宿主中产生多克隆Abs。一般地，通过多次皮下或腹膜内注射在哺乳动物中注射免疫原（和佐剂）。免疫原可以包括靶抗原或靶抗原-融合多肽。佐剂的例子包括弗氏完全和单磷酰脂质A合成-海藻糖dicorynomycolate（MPL-TDM）。为了改善免疫应答，免疫原可以与多肽缀合，所述多肽在宿主中是免疫原性的，例如钥孔

血蓝蛋白（KLH）、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。用于抗体产生的规程是众所周知的（Ausubel等人，1987；Harlow和Lane，1988；Harlow和Lane，1999）。可替代地，pAbs可以在鸡中制备，从而产生IgY分子（Schade等人，1996）。

抗靶抗原mAbs可以使用杂交瘤法进行制备（Milstein和Cuello，1983）。杂交瘤法通常由至少4个步骤组成：（1）免疫接种宿主或来自宿主的淋巴细胞；（2）收获mAb分泌淋巴细胞，（3）使淋巴细胞与无限增殖化细胞融合，和（4）选择分泌所需（抗靶抗原）mAb的那些细胞。

小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或其他合适的宿主进行免疫接种，以引发产生或能够产生将与免疫原特异性结合的Abs的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可以在体外进行免疫接种。如果需要人细胞，那么可以使用外周血淋巴细胞（PBLs）。

随后使淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞，通过融合试剂例如聚乙二醇（PEG）促进（Galfre等人，1977；Goding，1996）。可以使用通过转化无限增殖化的啮齿类动物、牛或人骨髓瘤细胞，或大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。因为需要杂交瘤细胞和并非未融合的无限增殖化细胞的纯群体，所以在融合后的细胞在抑制未融合的、无限增殖化的细胞的生长或存活的合适培养基中生长。常见技术使用缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT或HPRT）的亲本细胞。在这种情况下，将次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷添加到培养基（HAT培养基）中，以阻止HGPRT缺陷细胞的生长，同时允许杂交瘤生长。

希望的无限增殖化细胞有效融合；可以通过在培养基例如HAT中选择从混合群体中分离；和在融合后支持抗体的稳定和高水平表达。有用的无限增殖化细胞系是鼠骨髓瘤系，可从美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA）获得。用于产生人mAbs的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系也已得到描述（Kozbor等人，1984；Schook，1987）。

因为杂交瘤细胞细胞外分泌抗体，所以培养基可以就针对靶抗原的mAbs的存在进行测定。免疫沉淀法或体外结合测定例如放射免疫测定（RIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA），包括Scatchard分析（Munson和Rodbard，1980），可以用于测量mAbs的结合特异性（Harlow和Lane，1988；Harlow和Lane，1999）。

抗靶抗原mAb分泌杂交瘤细胞可以通过有限稀释程序作为单一克隆分离且传代培养（Goding，1996）。合适的培养基包括Dulbecco氏改良Eagle氏培养基，RPMI-1640，或若需要时，无蛋白质、蛋白质减少的或无血清培养基（例如，Ultra DOMA PF或HL-1；Biowhittaker；Walkersville，MD）。杂交瘤细胞还可以在体内作为腹水生长。

mAbs可以通过常规Ig纯化程序从培养基或腹水中分离或纯化，例如多肽A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶分析、透析、硫酸铵沉淀或亲和层析（Harlow和Lane，1988；Harlow和Lane，1999）。

一旦已产生识别靶抗原的抗体，产生此种抗体的细胞例如杂交瘤就可以用作基础，以分离编码抗体的多核苷酸序列。一旦分离，这些序列就可以用于在体外产生抗体，或进行处理以制备例如嵌合抗体。

Abs还可以通过重组法进行制备。编码抗靶抗原mAbs的DNA可以使用常规程序容易地分离且测序，例如使用与鼠重和轻抗体链基因特异性结合的寡核苷酸探针，以探测从抗靶抗原mAb分泌杂交瘤细胞系中分离的DNA。一旦分离，分离的DNA片段就亚克隆到表达载体内，所述表达载体随后转染到否则不产生Ig多肽的宿主细胞内，例如猿猴COS-7细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞，以表达mAbs。分离的DNA片段可以通过下述进行修饰：用关于人重和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列（Morrison等人，1987），或使Ig编码序列与关于非Ig多肽的编码序列的所有或部分融合。此种非Ig多肽可以取代抗体的恒定结构域，或可以取代一个抗原组合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。

用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括CHO（CHO细胞）（包括与DHFR选择标记一起使用（Kaufman，1990）的dhfr- CHO细胞（Urlaub和Chasin，1980）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内的时间段产生抗体。使用标准蛋白质纯化法可以从培养基中回收抗体。

在用于抗体或其抗原结合部分的重组表达的一种系统中，编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体通过转染引入dhfr- CHO细胞内。重组表达载体携带DHFR基因，其允许选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化体宿主细胞，以允许抗体重和轻链表达，并且从培养基中回收完整抗体。

单价 Abs

单价Abs彼此不交联。一种方法涉及Ig轻链和修饰的重链的重组表达。一般在Fc区中的任何点上的重链平截阻止重链交联。可替代地，相关半胱氨酸残基由另一个氨基酸残基取代或缺失，从而阻止通过二硫键合的交联。体外方法也适合于制备单价Abs。可以消化Abs以产生片段，例如Fab（Harlow和Lane，1988；Harlow和Lane，1999）。

人源化和人 Abs

结合靶抗原的人源化形式的非人Abs是嵌合Igs、Ig链或包含衍生自非人Ig的最低限度序列的片段（例如Fv、Fab、Fab'、F（ab'）₂或Abs的其他抗原结合子序列）。

一般地，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称为“输入”残基，其一般得自“输入”可变结构域。人源化通过用啮齿类动物CDRs或CDR序列代替人抗体的相应序列来完成（Jones等人，1986；Riechmann等人，1988；Verhoeyen等人，1988）。此种“人源化”Abs是嵌合Abs，其中基本上小于完整的人可变结构域已通过来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化Abs一般是人Abs，其中一些CDR残基和可能地一些FR残基由来自啮齿类动物Abs中的类似位点的残基取代。人源化Abs包括人Igs（受体抗体），其中来自受体的互补决定区（CDR）的残基通过来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）的CDR的残基替换，所述非人物种例如小鼠、大鼠或兔。在一些情况下，相应非人残基替换人Ig的Fv构架残基。人源化Abs可以包括在受体抗体和输入CDR或构架序列中都没有发现的残基。一般而言，人源化抗体包含至少一个和一般地2个可变结构域的基本上全部，其中大多数（如果并非全部的话）CDR区对应于非人Ig的那些，并且大多数（如果并非全部的话）FR区是人Ig共有序列的那些。人源化抗体最佳地还包括至少部分的Ig恒定区（Fc），一般是人Ig的那种（Jones等人，1986；Riechmann等人，1988；Verhoeyen等人，1988）。

人Abs还可以使用各种技术产生，包括噬菌体展示文库（Hoogenboom等人，1991；Marks等人，1991）和人mAbs（Boerner等人，1991；Reisfeld和Sell，1985）。将人Ig基因引入其中内源Ig基因已部分或完全灭活的转基因动物内，可以用于合成人Abs。在攻击时，观察到人抗体产生，这在所有方面紧密类似于人中可见的那种，包括基因重排、装配和抗体谱（repertoire）（Fishwild等人，1996；Lonberg和Huszar，1995；Lonberg等人，1994；Marks等人，1992）。

双特异性 mAbs

双特异性mAbs结合至少2种不同抗原。例如，结合特异性是靶抗原；另一种是用于选择的任何抗原。

双特异性Abs的重组产生经常通过共表达各具有不同特异性的2个Ig重链/轻链对来达到（Milstein和Cuello，1983）。这些Ig重和轻链在所得到的杂交瘤（四源杂交瘤(quadroma)）中的随机分配产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有所需双特异性结构。所需抗体可以使用亲和层析或其他技术进行纯化（Traunecker等人，1991）。

为了制造双特异性抗体，具有所需抗体-抗原组合位点的可变结构域与Ig恒定结构域序列融合（Suresh等人，1986）。融合通常是与Ig重链恒定结构域的，包括至少部分铰链、CH2和CH3区。包含轻链结合所需的位点的第一个重链恒定区（CH1）在融合物的至少一个中。编码Ig重链融合物和若需要时Ig轻链的DNAs插入分开的表达载体内，并且共转染到合适的宿主生物内。

一对抗体分子之间的界面可以进行工程改造，以使从重组细胞培养中回收的异二聚体百分率达到最大（Carter，1986）。在这种方法中，来自第一种抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链由较大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）替换。通过用较小侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换大氨基酸侧链，在第二种抗体分子的界面上产生与一条或多条大侧链等同或相似大小的补偿“腔”。这种机制增加异二聚体的得率超过不需要的终产物，例如同二聚体。

双特异性Abs可以制备为全长Abs或抗体片段（例如Fab'₂双特异性Abs）。生成双特异性Abs的一种技术采用化学连接。完整Abs可以进行蛋白酶解切割，以生成Fab'₂片段（Brennan等人，1985）。用二硫醇络合剂例如亚砷酸钠还原片段，以稳定邻近的二硫醇且预防分子间二硫键形成。所生成的Fab'片段随后转变为硫代硝基苯甲酸酯（thionitrobenzoate）（TNB）衍生物。通过用巯基乙胺还原，Fab'-TNB衍生物之一随后再转变为Fab'-硫醇，且与等摩尔量的其他Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。

Fab'片段可以直接从大肠杆菌中回收且化学偶联，以形成双特异性Abs。例如，可以产生完全人源化的双特异性Fab'₂ Abs（Shalaby等人，1992）。每个Fab'片段从大肠杆菌中分别分泌且在体外直接化学偶联，从而形成双特异性抗体。

用于直接从重组细胞培养中制备且分离双特异性抗体片段的各种技术也已得到描述。例如，可以采用亮氨酸拉链基序（Kostelny等人，1992）。来自Fos和Jun多肽的肽通过基因融合与2种不同Abs的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，且随后再氧化以形成抗体异二聚体。这种方法还可以产生抗体同二聚体。“双抗体”技术提供了产生双特异性抗体片段的可替代方法（Holliger等人，1993）。片段由通过接头与轻链VL连接的重链VH组成，所述接头太短以致于不允许在相同链上的2个结构域之间的配对。一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配体，从而形成2个抗原结合部位。用于制备双特异性抗体片段的另一个策略是使用单链Fv（sFv）二聚体（Gruber等人，1994）。还可以制备具有超过2个效价的Abs，例如三特异性Abs（Tutt等人，1991）。示例性双特异性Abs可以与给定靶抗原上的2个不同表位结合。

作为例子且非限制性的，现在应给出本发明的实施例。

实施例1：间日疟虫EXP1基因的假定C末端结构域的设计、克隆和表达

间日疟虫 EXP1 基因设计。这个实施例描述了来自间日疟虫的合成Pv-EXP1基因的设计，其编码EXP1蛋白质的C末端部分，这对于在大肠杆菌中的表达最佳化。来自DNA 2.0，Inc.（Menlo Park，California）的Gene Designer软件用于设计下文讨论的基因序列。基于与恶性疟虫和约氏疟虫蛋白质的序列同源性，且通过鉴定来自间日疟虫基因组序列的潜在剪接位点，预测对于间日疟虫的编码的EXP1蛋白质的序列。关于最佳化的间日疟虫EXP1基因的核苷酸序列显示于图1A（SEQ ID NO:1）中，并且所编码的氨基酸序列显示于图1B（SEQ ID NO:2）。基因包含5’-EcoRI位点，随后为起始密码子，编码间日疟虫EXP1的预测的C末端氨基酸序列的基因主体，编码6-组氨酸标签的序列，终止密码子和BamHI位点。限制酶位点用于克隆到表达载体内，并且包括6-组氨酸标签以促进所表达蛋白质的后续纯化。

来自间日疟虫的合成 EXP1 基因的制备。生长包含间日疟虫合成EXP1基因（GenScript Corp.,（Piscataway，New Jersey））的质粒克隆的大肠杆菌细胞，并且根据包装插页使用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Kit（Promega，Madison，Wisconsin）纯化质粒。质粒在50 µl反应中在37℃在20单位限制酶EcoRI、20单位限制酶BamHI和1 x EcoRI缓冲液（New England Biolabs，Beverly，Massachusetts）的存在下消化2小时。消化液在1.0％琼脂糖TAE溴化乙锭凝胶上电泳，以使插入片段与载体分离。随后从琼脂糖凝胶中切割约185碱基对插入片段，并且根据包装插页使用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit（Qiagen，Valencia，California）从琼脂糖中提取DNA。

用于克隆的 CKS- 融合表达载体的制备。生长包含CKS-融合表达载体pJO200（Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois）的大肠杆菌细胞，并且根据包装插页使用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Kit（Promega，Madison，Wisconsin）纯化质粒。质粒（10 µg）在1500 µl反应中在37℃在200单位限制酶EcoRI、200单位限制酶BamHI和1 x EcoRI缓冲液（New England Biolabs，Beverly，Massachusetts）的存在下消化2.5小时。消化液在1.0％琼脂糖TAE溴化乙锭凝胶上电泳，以使插入片段与载体分离。随后从琼脂糖凝胶中切割线性化载体，并且根据包装插页使用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit（Qiagen，Valencia，California）从琼脂糖中提取DNA。

EXP1 插入片段克隆到 CKS- 融合表达载体内。将纯化的EcoRI/BamHI消化的EXP1插入片段（参见上文）的部分（2 µl）添加到包含EcoRI/BamHI消化的表达载体pJO200（~0.6 µg，参见上文）、1 x T4 DNA连接酶缓冲液和400单位T4 DNA 连接酶（New England Biolabs，Beverly，Massachusetts）的连接反应(10 μl)。连接反应在16℃温育过夜，随后根据包装插页转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞（Stratagene，La Jolla，California）内。质粒如上所述从TOP10克隆中纯化，且根据包装插页转化到蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株BL21（Novagen，Madison，Wisconsin）的感受态细胞内。

EXP1 重组蛋白质的表达和纯化。包含EXP1表达质粒的BL21细胞（参见上文说明书）在100 ml培养物中在37℃生长直至达到约0.8的OD₅₉₅，在这时添加IPTG至1 mM的终浓度以诱导表达。在37℃温育3小时后，通过离心收获细胞，并且根据包装插页用BugBuster Extraction Reagent（Novagen，Madison，Wisconsin）裂解沉淀的细胞。根据包装插页使用His·Bind Purification Kit（Novagen，Madison，Wisconsin）纯化裂解物的可溶性级分中存在的所表达的EXP1。在定量前，将纯化的重组蛋白质透析到包含0.15 M NaCl的0.01 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4（PBS）内。

实施例2：间日疟虫EXP1合成肽的设计

这个实施例描述了来自间日疟虫的，构成EXP1蛋白质的C末端部分的合成Pv-EXP1肽的设计。Pv-EXP1蛋白质的预测氨基酸序列基于与恶性疟虫和约氏疟虫蛋白质的序列同源性，且通过鉴定来自间日疟虫基因组序列的推定EXP1基因内的潜在剪接位点。通过GenScript Corp.（Piscataway，New Jersey）合成在N末端具有生物素标记的Pv-EXP1肽。Pv-EXP1肽序列（参见，图1C（SEQ ID NO:3））包括跨膜锚下游的EXP1的推定C末端结构域。

实施例3：使用聚苯乙烯珠的间日疟虫EXP1免疫测定

间日疟虫EXP1 CKS融合蛋白通过使用聚苯乙烯珠测定就其检测IgG和/或IgM抗体的能力进行测试。测试了人血清的几个实验对象组，包括实验上感染的黑猩猩、正常供血者和疟疾患者。

实验对象组代表其中病（即临床诊断）或感染的发作和样品收集之间的时间从数天或数周（实验上感染的黑猩猩、印度疟疾患者和美国疟疾患者）到数年（具有过去疟疾史的美国供血者）的群体。

数据暗示间日疟虫EXP1抗体在感染或疾病发作后早期（数天到数月）最频繁地检测到，但在疟疾病后一年或更多年是无法检测的。因此，间日疟虫EXP1看起来是近期而不是过去感染的标记。

聚苯乙烯珠的包被。一种四分之一英寸聚苯乙烯珠用作用于肽EIAs的固相。在包被前，珠用15％1-丙醇（在水中）在室温无搅动地洗涤20分钟。去除1-丙醇，并且珠用去离子水漂洗2次。洗涤的珠随后添加到包含在0.1 M磷酸钠，pH 7.0（0.233 ml/珠）中稀释至0.25-5 µg/mL的重组抗原的小瓶中。珠在40℃伴随轻轻混合温育2小时。珠随后用PBS洗涤3次，并且随后在包含0.1％Triton X-100的PBS中在40℃伴随轻轻混合温育1小时。它们再次在PBS中洗涤3次，并且随后在40℃在PBS中的5％BSA中伴随轻轻混合温育1小时。珠用PBS洗涤4次，并且随后在包含5％蔗糖的PBS中在室温无混合地温育20分钟。去除蔗糖缓冲液且使珠风干。包被的珠在4℃脱水贮存。

免疫测定法。血清和血迹就其与抗原包被的聚苯乙烯珠的免疫反应性进行测试。样品在稀释剂缓冲液（包括20％山羊血清、10％小牛血清、0.2％Triton X-100和叠氮化钠的Tris-磷酸盐缓冲液pH 7.8）中稀释1:16，并且将0.010 ml添加到塑料测试盘的孔中，并且随后与另外0.20 mL的相同稀释剂缓冲液组合用于1:336的最终样品稀度。重组蛋白质包被的珠添加到稀释的样品中，并且在37℃伴随混合温育90分钟。珠随后用11-14 mL去离子水洗涤，随后为0.2 ml过氧化物酶标记的山羊抗人IgG（0.02微克/mL）或抗人IgM的添加。珠在37℃伴随混合温育30分钟。珠用11-14 mL去离子水洗涤且随后转移到塑料管内，向其中添加0.3 ml OPD（在包含0.02％H₂O₂的柠檬酸盐缓冲液中的0.3％邻苯二胺-2-HCl）底物，并且在黑暗中在室温无混合地温育30分钟。反应通过添加1 ml 1N H₂SO₄得到猝灭，并且测定在492 nm的光密度（OD）。OD与和珠结合的抗体的量成正比。对于每种测试样品，通过将测试样品OD除以平均阴性对照OD计算信号与阴性（S/N）比。具有大于或等于5.00（暂定截断值）的S/N值的样品假定是免疫反应性的。

间日疟虫EXP1抗体测定最佳化。CKS-Pv-EXP1融合蛋白使用多种条件包被到聚苯乙烯珠上，以测定关于最佳测定灵敏度的条件。珠随后就免疫反应性进行测试，其中使用来自具有血涂片诊断的疟虫感染的个体的人血清。除其中指出的外，免疫测定条件如上所述。CKS-Pv-EXP1抗原的包被浓度是2.0 ug/mL。CKS-Pv-EXP1免疫反应性与CKS-Pv-MSP1-19的那种和使用商业疟虫抗体测定获得的测试结果比较。

测定条件对本底 OD₄₉₂ nm 值的作用。使用如下表1中所示的条件7和8获得最高OD值，而使用条件5观察到最低。DTT添加到包被缓冲液中不改善本底，且在一些情况下（具体与条件9 – 10比较）增加本底。在任何缓冲液中在56℃的包被增加本底读数。

测定条件对灵敏度的作用。从印度疟疾患者（通过血涂片显微术证实的疟虫感染）中收集的血清样品就CKS-Pv-EXP1 IgG的存在进行测试。样品还就CKS-Pv-MSP1-19 IgG进行测试。所有样品先前已通过使用检测针对间日疟虫和恶性疟虫抗原的IgG、IgM和/或IgA的商业测定就疟虫抗体进行测试。

下表2中所示的测定条件4和5提供了最高S/N比（和如上所示的最低本底读数）且检测最多Pv-MSP1-19 IgG阳性样品。使用条件4的S/N比具有比条件5略微更高的S/N比。

实施例4：在具有先前疟疾的供血者中的Pv-EXP1 IgG抗体

在美国中的供血者必须在捐献前完成问卷。已具有疟疾的供体在他们变得无症状后3年不允许捐献。到疟疾地方性区域的旅行者在离开地区后1年不允许献血，条件是他们尚未具有疟疾的症状。来自其中疟疾常见的国家的移民或居民在其从那个国家离开后3年不允许捐献。

血浆样品可从已公开先前疟疾病的几个供体中获得。这些供体样品就针对来自三日疟虫、卵形疟虫、恶性疟虫和间日疟虫的MSP1-19抗原的IgG抗体的存在进行测试，其中使用在四分之一英寸聚苯乙烯珠上包被的个别抗原。供体还就针对间日疟虫EXP1重组抗原的IgG抗体的存在进行测试。通过使用商业测定测试对于疟虫抗体阳性的所有样品，所述商业测定检测针对间日疟虫和恶性疟虫抗原的IgG、IgM和/或IgA。免疫测定结果显示于下表3中。在14个商业EIA抗体阳性供体中，9个对于Pv-MSP1-19抗体是阳性的，并且4个是Pf-MSP1-19 IgG反应性的。在Pv-MSP1-19免疫反应性的样品中，无一在Pv-EXP1 EIA中是反应性的。在群组内最近报道的疟疾病在2006年发生（样品在2007年收集），并且最老的疟疾病在1970年出现。因此，虽然Pv-MSP1-19检测其疟疾病早在1970年（在献血前37年）出现的供体中的抗体，而Pv-EXP1抗体即使在近在2006年具有疟疾的供体中也无法检测。

实施例5：在来自印度的疟疾患者中的Pv-EXP1 IgG抗体

疟疾在印度的大多数部分中是地方性的，其中约95％的群体处于通过引起疾病的疟虫物种的感染的危险中。在印度中，恶性疟虫和间日疟虫最常见，而三日疟虫代表少数病例，并且卵形疟虫事实上不存在。在该国家的大多数地区，疟疾的发生率是低的，但疟疾的危险取决于降雨而改变。在流行或爆发时期过程中，多个感染叮咬/人是可能的。

血清样品得自来自具有过去或近期疟疾的印度的疟虫感染的个体。感染疟虫物种通过在样品收集时血涂片的显微镜检查得到鉴定。一些个体通过显微术诊断为双重感染。样品通过使用检测针对间日疟虫和恶性疟虫抗原的IgG、IgM和/或IgA的商业测定就疟虫抗体的存在进行测试。结果显示于下表4中。Pv-MSP1-19 IgG抗体在所有27个（100％）个体中检测到，而13/27（48％）是Pv-EXP1抗体阳性的。在具有显微术证实的间日疟虫感染的19个个体中，19个（100％）是Pv-MSP1-19 IgG阳性的，而仅11/19（58％）是Pv-EXP1 IgG阳性的。

实施例6：在来自美国的疟疾患者中的Pv-EXP1 IgG抗体。

来自受间日疟虫感染的个体的人血清样品得自Marianna Wilson，Chief，Reference Immunodiagnostic Laboratory，Centers for Disease Control and Prevention，Atlanta，GA，USA（CDC）。提供了关于每种样品的关于每种人感染性疟虫物种的免疫荧光抗体滴度，如通过血涂片测定的疟虫物种鉴定那样。所有样品在1990年前收集，并且视为“匿名（anonymized）残留人样品”，这是因为关于供体/患者身份的原始记录不再存在。在感染或临床呈现和样品收集之间的时间是未知的。然而，可以假定样品在症状发作后不久收集，这是因为（a）样品提交给CDC Diagnostic Reference Laboratory用于测试/证实，并且（b）在血液中观察到疟虫寄生物。

来自具有间日疟虫感染的个体的血清就抗MSP1-19（所有物种）和抗Pv-EXP1反应性进行测试，其中使用珠EIAs（参见下表5）。间日疟虫MSP1-19 IgG在8/8个体中检测到，而间日疟虫EXP1 IgG在6/8（75％）中检测到。

实施例7：在实验上感染的黑猩猩中的间日疟虫EXP1和MSP1-19抗体

从实验上受间日疟虫感染的黑猩猩在感染后约3-4周收集血清样品。所有9只动物具有如通过IFA测定的可容易地检测的间日疟虫IgG。间日疟虫感染通过全血涂片的显微镜检查加以证实。这些样品使用珠EIAs就间日疟虫MSP1-19和EXP1 IgG和IgM抗体进行测试。结果显示于表6中，其中反应性表示为S/N比（关于阳性结果的暂时截断设为5.00的S/N）。

MSP1-19 IgG在9只动物中的7只中检测到，而MSP1-19 IgM在所有9只中检测到。使用基于重组体的EIA，EXP1 IgG在9只黑猩猩中的7只中检测到，而基于EXP1肽的测定检测9只的4只中的IgG。基于重组体的EXP1测定在9只动物中的8只中检测到IgM抗体。

实施例8：用于基于微粒的免疫测定的试剂

微粒的制备。微粒用从间日疟虫的EXP1区（Pv-EXP1）中克隆的重组抗原进行包被。关于重组蛋白质的制备参见实施例1。用重组PvEXP1蛋白质包被的微粒以下述方式进行制备。简言之，微粒的250 µl等分试样（4％重量/体积，3.2微米直径（Interfacial Dynamics Corp.，Portland，Oregon）与1.25 ml包被缓冲液（2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液，pH 6.0）混合，并且在微量离心机(microfuge)中以14,000 xg沉淀2分钟。使粒子重悬浮于0.5 ml MES包被缓冲液中，并且添加100 µg重组蛋白质。（在这个实施例中，PvEXP1溶液：关于0.20 mg/ml终浓度的9.1 µl）。使微粒/蛋白质溶液混合，并且在室温翻滚16小时。微粒以14,000 xg沉淀2分钟，并且去除溶液。使粒子重悬浮于1 ml磷酸缓冲盐水（pH 7.2）（PBS）中且重新沉淀。粒子用PBS再洗涤2次，随后重悬浮于1 ml微粒稀释剂（含11.5％蔗糖的磷酸缓冲盐水（pH 6.5））中。与由已知浓度的微粒制备的标准曲线比较，通过在700 nm的吸光度测定微粒浓度。微粒溶液在微粒稀释剂中稀释至0.05％的终浓度。

吖啶

（ Acridinium ）标记的缀合物的制备。对于抗体测定，用吖啶

直接标记的小鼠抗人IgG可以如下制备：包含磷酸钠、NaCl、3-（3-胆酰胺丙基）-二甲氨基-1-丙磺酸盐（CHAPS，Sigma Chemical Company，Saint Louis，Mo），pH 8.0和10-（3-磺丙基）-N-甲苯磺酰基-N-（2-羧乙基）-9-吖啶

羧酰胺（在二甲基甲酰胺中的4mg/ml）的7.2 µl N-羟基琥珀酰亚胺酯的53.6 µl缀合缓冲液（CB）在室温添加到131 µl小鼠抗人IgG（4.59 mg/ml）和601 µl PBS中。反应混合物用旋转器在室温混合20分钟。通过将反应混合物装载到HPLC上猝灭反应。将这应用于300 x 7.8 mm Bio-Sil SEC-250凝胶过滤柱（Bio-Rad，Richmond，California），所述柱已用包含CHAPS、NaCl和磷酸钠，pH 6.3的缓冲液平衡。柱以1.0 ml/分钟用相同缓冲液洗脱，其中使用配备型号114M泵的Beckman 421A控制器。收集1 ml的级分，且用Beckman DU-7分光光度计测定在280 nm和370 nm的吸光度。使用如美国专利号5,705,330中所述的方法计算吖啶掺入的程度。获得的吖啶与IgG比（摩尔/摩尔）是约2.5。缀合物贮存于4℃。

实施例9：PRISM抗Pv-EXP1测定

PRISM抗体测定在引入本文作为参考的美国专利号5,705,330中描述，并且PRISM抗原和抗体测定在也引入本文作为参考的Shah和Stewart，The Immunoassay Handbook，第二版，由David Wild编辑，第297-303页（2001）中描述。就本发明而言，利用下述程序。测定形式在图2中提供。一般地，在站点1，50 µl对照或样品、50 µl样品稀释剂缓冲液（SDB，包含Tween 20、Triton X-100、尿素、牛血清清蛋白、新生小牛血清、NaCl、大肠杆菌裂解物和叠氮化物的硼酸盐缓冲液，pH 7.5）、和50 µl重组抗原包被的微粒（如上文实施例7中所述制备）分配到每个温育孔内且开始测定计时。这些通过各自相互扩散到另一种而无外部搅动或振荡进行混合，以形成反应混合物。在站点4，将反应混合物转移到包含纤维性基质的检测孔，并且用300 µl转移洗涤（TW，包含硼酸盐缓冲液，pH 7.0，含NaCl、Tween–20、甘油、尿素和Proclin® 300）洗涤2次。在37℃温育18分钟后，在站点5，将50 µl吖啶

标记的小鼠抗人抗体分配到检测孔的基质内。在站点8，孔在37℃温育23分钟，并且包含反应混合物的纤维性基质用100 µl最后洗涤（FW）洗涤3次，所述最后洗涤包含tris缓冲液，pH 9.0，含LiCl、十二烷基硫酸锂、聚乙二醇1500和Proclin® 300。在站点9，通过添加碱性过氧化氢溶液生成化学发光（CL）信号，并且通过光电倍增管测量光子。所发出的光的量与样品中的抗体的量成比例。样品中抗体的存在或不存在通过比较从样品中收集的光子数目与阴性（S/N）值进行测定。对于来自急性和慢性感染的一组样品，结果表示为下表7中的S/N（信号与阴性）。具有大于5.0的S/N的样品视为对于抗原是反应性的。结果与得自商购可得的酶联免疫测定的结果进行比较。

总共18种样品与PvEXP1是反应的。样品M095和M108与PvEXP1是反应的，但与商业免疫测定不是反应的。

在下表8中，样品来自对于疟疾高度地方性的群体。29个样品中的28个与商业测定是反应的，并且29个中的19个在Prism测定中具有大于5.0的S/N值。

本领域技术人员将容易认识到本公开内容充分适合于执行所述目的且获得结果和优点，以及其中固有的那些。本文描述的分子复合物以及方法、程序、处理、分子、特异性化合物是优选实施方案的目前代表，是示例性的，并且不预期作为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的范围和精神的情况下对本文公开的本发明做出不同取代和修饰。

说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术水平。所有专利和出版物都引入本文作为参考，其程度与每个个别出版物特别且个别指出引入作为参考相同。

本文举例说明性描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下实践。因此，例如在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一种都可以由其他2个术语中的任一替换。已采用的术语和表达作为描述性而不是限制性术语使用，并且在此种术语和表达的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本公开内容已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化，并且此种修改和变化视为在如由附加权利要求限定的本发明的范围内。

另外的引用

序列表

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DAWSON, GEORGE J.

DESAI, SURESH M.

DILLE, BRUCE J.

MUERHOFF, ANTHONY SCOTT

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<130> 9698WOO1

<140>

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 184

<212> DNA

<213> 间日疟虫（Plasmodium vivax）

<220>

<221> CDS

<222> (8)..(175)

<400> 1

gaattcc atg aac gcc ggt aac ggt cgt cat cca ttt tct ctg ggt ggt 49

Met Asn Ala Gly Asn Gly Arg His Pro Phe Ser Leu Gly Gly

1 5 10

ggt aaa ggt ggc gac gcg gcg cct acg gag ccg acg ccg gca ccg acc 97

Gly Lys Gly Gly Asp Ala Ala Pro Thr Glu Pro Thr Pro Ala Pro Thr

15 20 25 30

gcg ccg agc gca act ggt ctg aac gat gac ggt tct tct tct ggc act 145

Ala Pro Ser Ala Thr Gly Leu Asn Asp Asp Gly Ser Ser Ser Gly Thr

35 40 45

gaa tct act tct cat cat cac cat cac cat tgaggatcc 184

Glu Ser Thr Ser His His His His His His

50 55

<210> 2

<211> 56

<212> PRT

<213> 间日疟虫（Plasmodium vivax）

<400> 2

Met Asn Ala Gly Asn Gly Arg His Pro Phe Ser Leu Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gly Gly Asp Ala Ala Pro Thr Glu Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ala Pro

20 25 30

Ser Ala Thr Gly Leu Asn Asp Asp Gly Ser Ser Ser Gly Thr Glu Ser

35 40 45

Thr Ser His His His His His His

50 55

<210> 3

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成的多肽

<400> 3

Asn Ala Gly Asn Gly Arg His Pro Phe Ser Leu Gly Gly Gly Lys Gly

1 5 10 15

Gly Asp Ala Ala Pro Thr Glu Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ala Pro Ser

20 25 30

Ala Thr Gly Leu Asn Asp Asp Gly Ser Ser Ser Gly Thr Glu Ser Thr

35 40 45

Ser

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成的6xHis标签

<400> 4

His His His His His His

1 5

Claims

1.一种分离的核酸序列或其片段，其包括编码多肽的核酸序列或与编码多肽的核酸序列互补，其中所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列具有至少70％同一性。

2.一种分离的核酸序列或其片段，其包括核酸序列或与核酸序列互补，所述核酸序列与包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸序列具有至少70％同一性。

3.权利要求1的分离的核酸序列，其中所述序列从间日疟虫中分离。

4.一种纯化的蛋白质，其通过权利要求1的核酸序列编码。

5.一种包括氨基酸序列的纯化的蛋白质或其片段，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列具有至少70％同一性。

6.一种产生蛋白质的方法，其包括步骤：

（a）分离包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸序列；

7.权利要求6的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。

8.一种载体，其包括与调节序列可操作地连接的、包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

9.一种宿主细胞，其包括权利要求8的载体。

10.一种在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在对于抗体/抗原复合物形成足够的时间和条件下，使所述测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50；和

（b）通过检测所述抗体/抗原复合物的存在，检测所述测试样品中存在的抗体的存在。

11.一种在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50；

（c）通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中存在的抗体的存在。

12.一种在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

13.一种在怀疑包含抗体的测试样品中检测间日疟虫抗体的存在的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许抗抗体/间日疟虫抗体复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与抗抗体接触；

（c）将缀合物添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括组合物，所述组合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的单克隆或多克隆抗体；和

（d）通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的抗体的存在。

14.一种在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、恶性疟虫、间日疟虫和卵形疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在对于三日疟虫抗体/抗原复合物、恶性疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和卵形疟虫抗体/抗原复合物形成足够的时间和条件下，使所述测试样品与下述接触：（i）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，（ii）来自恶性疟虫的抗原，（iii）来自卵形疟虫的抗原，和（iv）来自三日疟虫的抗原；和

（b）通过检测一种或多种复合物的存在，检测所述测试样品中存在的抗体的存在。

15.一种在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许三日疟虫抗体/抗原复合物、卵形疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和恶性疟虫抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与下述接触：（i）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，（ii）卵形疟虫抗原，（iii）三日疟虫抗原，和（iv）恶性疟虫抗原；

（b）在足以允许每种缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将4种缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中第一种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原；第二种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成信号附着的卵形疟虫抗原；第三种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成信号附着的三日疟虫抗原，并且第四种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原；和

（c）通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在。

16.一种在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许三日疟虫抗体/抗原复合物、卵形疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和恶性疟虫抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与下述接触：（i）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，（ii）三日疟虫抗原，（iii）间日疟虫抗原，和（iv）恶性疟虫抗原；

（c）通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫抗体的抗体的存在。

17.一种用于在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的方法，其包括步骤：

（a）在足以允许抗抗体/间日疟虫、抗抗体/三日疟虫、抗抗体/卵形疟虫、和抗抗体/恶性疟虫复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与抗抗体接触；

18.一种用于在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的方法，其包括步骤：

（a）使所述测试样品与抗抗体接触，以允许形成抗抗体/抗体复合物；

（c）通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在。

19.一种疫苗，其包括：选自包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原的至少一种抗原，或其表位。

20.权利要求19的疫苗，其进一步包括选自恶性疟虫、卵形疟虫和三日疟虫的至少一种另外的抗原；和药学可接受的佐剂。

21.一种用于测定测试样品中针对间日疟虫的抗体的存在的试剂盒，其包括：（a）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原；和

（b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。

22.一种用于测定测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的试剂盒，其包括：

（a）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，卵形疟虫抗原，三日疟虫抗原和恶性疟虫抗原；和

23.一种用于检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的试剂盒，其包括：

（a）抗抗体；和

（b）包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，卵形疟虫抗原，三日疟虫抗原和恶性疟虫抗原。

24.一种用于检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的试剂盒，其包括：

（a）抗抗体，和

（b）包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原的第一种缀合物，包括卵形疟虫抗原的第二种缀合物；包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的三日疟虫抗原的第三种缀合物，和包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原的第四种缀合物。

25.一种在怀疑包含抗体的测试样品中检测间日疟虫抗体的存在的方法，其包括步骤：

（c）通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的抗体的存在。