CN102838659A - 间日疟原虫抗原的多肽、IgY抗体及其在疟疾诊断上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及间日疟原虫抗原的多肽、IgY抗体及其在疟疾诊断上的应用。具体而言，本发明涉及一种如SEQ ID No：1所示的间日疟原虫抗原多肽、IgY抗体及在疟疾诊断方面的应用。该抗原多肽与KLH偶联后免疫产蛋鸡获得IgY抗体，制备该多肽的特异性IgY抗体。本发明的多肽免疫产蛋鸡后可获得高滴度的特异性IgY抗体，该IgY抗体能够特异性识别间日疟病人血样。

Description

间日疟原虫抗原的多肽、IgY抗体及其在疟疾诊断上的应用

技术领域

本发明涉及一种新的间日疟原虫抗原多肽。具体而言，本发明涉及一种新的间日疟原虫抗原的多肽，通过该多肽与KLH偶联后免疫鸡获得特异性IgY抗体，用于间日疟原虫感染的诊断。

背景技术

疟疾是全球最严重的三大传染性疾病之一，威胁26亿居住在热带及亚热带地区人口的健康，每年约有2亿人被感染，一百万人死亡。在我国主要有恶性疟和间日疟两种，其中恶性疟发病比较凶险，严重的可导致死亡；间日疟在我国分布最广，感染的人数最多。近年来，部分地区也发现了感染的抗药株和致死株的病例，这要求人们继续增大对其的防控力度。疟疾的早期诊断和早期正规治疗不仅能够降低重症病人和死亡的发生，还能防止其传播，延缓疟原虫对抗疟药产生抗性。精确快速的早期诊断也是对疟疾进行实时流行病学监测和控制的必要手段。目前诊断疟疾的经典方法仍为血涂片显微镜检法，该方法对检验者的技能和经验要求很高，远远无法满足绝大多数生活在偏远地区患者的需要，造成大量患者因延误诊治而死亡。随着分子生物学的发展，出现的基因诊断技术、套式PCR、荧光定量PCR等，显示了较高的敏感性和特异性，可以对疟原虫的感染作出早期快速诊断，但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持，不适合作为疟疾流行区常规的检测手段，难以在基层推广应用。近年来以检测疟原虫的可溶性特异性抗原为基础的免疫学方法，由于其操作简便、快速，结果易于判定，已成为疟疾诊断研究的发展方向。

目前用于疟疾快速诊断的抗原主要有三种：1，富组氨酸蛋白II(HRPII)；2，乳酸脱氢酶(pLDH)；3，醛缩酶(Aldolase)。但是由于其敏感性低于镜检法、特异性差、价格高等原因，还远不能满足实际应用的需要。因此，随着疟疾发病形势的日趋恶化，WHO紧急呼吁全球疟疾研究机构尽快研制出更加敏感、特异、稳定且价格低廉的快速诊断疟疾方法。而要达到以上标准的产品必须具备几个关键条件：1)有高特异性的诊断候选抗原；2)能诱导出高灵敏度的特异性抗体；3)采用低成本、高效益的基质材料和制备技术。

鸡卵黄免疫球蛋白即IgY抗体，是由母鸡产生的主要抗体，先分泌到血清中，然后转移到卵黄储存起来。与哺乳动物的抗体相比，在免疫诊断和免疫治疗方面，IgY抗体存在很多优点，被越来越多的应用在疾病诊断、预防、治疗，食品科学和兽医科学等领域。

由于禽类与哺乳动物远源，因此不仅可针对许多哺乳动物中高度保守的抗原产生免疫反应，而且能针对更多的表位产生抗体。

现有技术证实IgY抗体不与类风湿因子和其它IgG分子反应，可降低实验背景和避免假阳性结果。IgY抗体对酸、碱、热、蛋白酶的耐受性很高，适合疟疾疫区的环境特点。

经收集鸡蛋生产IgY的方法既方便又快捷，并且目前已建立了高效、经济、可自动化控制的IgY纯化技术，适合大规模生产应用。这些优点均可成为提高检测灵敏性、降低成本、解决上述疟疾诊断问题的关键因素。

现有技术中未有在间日疟疾免疫诊断中使用IgY的报道，尤其是使用本发明的抗原获得的特异性IgY抗体在间日疟疾免疫诊断中应用未见报道。

术语说明：除非另有说明，本发明中使用的术语具有本领域公知的含义。

抗原：是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本能力是免疫原性和反应原性。最常见的抗原分子是大分子蛋白质。

表位：免疫细胞通常难以识别整个抗原分子，而仅识别抗原大分子上的一个特定的部分。称为表位(epitope)或抗原决定簇(antigenicdeterminant)。因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与免疫细胞表面的抗原受体或游离的抗体分子相结合。严格说来，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子。

抗体：抗体是免疫系统用来鉴别和抑制外源物质(例如细菌和病毒)的一种蛋白质复合体。每种抗体只识别特定的目标抗原。

IgY抗体：IgY普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类，在功能上等价于哺乳动物IgG，但其许多生物学性质仍未被发现。近来许多研究者分析了IgY的基因组成和生物学功能，而且证实其为哺乳动物IgG和IgE的直接起源。现有数据表明IgY的用途是非常广泛、多样的。其中最重要的功能是由母体传递IgY给新生儿提供被动地免疫保护力。产生IgY的动物基本是卵生的，通过卵黄把IgY传递给胚胎和新生动物。

发明内容

本发明根据PlasmoDB表达蛋白数据库中mRNA的表达水平，和相关文献的报道挑选出间日疟原虫的丝氨酸重复抗原5(SERA5)作为诊断间日疟原虫感染的抗原。通过生物信息学的方法预测抗原表位，该抗原表位具有较高的亲水性、抗原性并且位于SERA5晶体结构的表面，与人和恶性疟原虫的相应抗原无同源性，避免了交叉反应。采用现有技术的方法，人工合成该抗原表位多肽，即间日疟原虫抗原多肽，该多肽具有以下氨基酸序列(SEQ ID No：1：KAVNNACPEPKS)，采用抗原表位多肽与载体蛋白KLH偶联后免疫产蛋鸡，从免疫鸡卵黄中制备能够识别该抗原表位的特异性IgY抗体。该抗体能够特异性识别间日疟病人血样。

具体而言，本发明的目的在于提供了一种间日疟原虫抗原表位多肽，其具有SEQ ID No：1：KAVNNACPEPKS所示的氨基酸序列。

本发明的目的还在于提供具有SEQ ID No：1：KAVNNACPEPKS所示的氨基酸序列的合成肽偶联KLH后免疫鸡获得的特异性IgY抗体。

本发明的目的还在于提供本发明特异性IgY抗体在制备检测间日疟原虫感染制剂中的用途。

本发明的目的还在于进一步提供一种制备本发明特异性IgY抗体的方法，所述的方法包括：

1)使用本发明设计的间日疟原虫抗原表位多肽免疫鸡，多肽具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列；

2)收取步骤1)中免疫后的鸡所产的卵，并从卵黄中提取获得特异性的IgY抗体。

本发明还提供一种经上述制备本发明特异性IgY抗体的方法获得的IgY抗体。

本发明所述的鸡优选为莱航鸡，特别是莱航产蛋鸡，所述的产蛋鸡通过少量的本发明抗原表位免疫3周后，即可持续不断的产生高特异性的、性质均一的抗体。

本发明的目的还在于提供一种含有本发明所述抗原多肽免疫鸡获得的IgY抗体的制剂，该制剂包含药学上可接受的载体。

本发明进一步目的在于提供一种检测间日疟原虫感染的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有具有SEQ ID No：1：KAVNNACPEPKS所示的氨基酸序列的合成肽偶联KLH后免疫鸡获得的特异性IgY抗体和使用说明书。

具体而言，所述试剂盒还可以是包括至少含有本发明所述抗原多肽免疫鸡获得的IgY抗体的制剂，或者含有该制剂的试纸，以及使用说明书。

附图说明

图1：合成肽HPLC分析结果。

图2：合成肽MS specrum鉴定结果。

图3：亲和纯化后IgY抗体12％还原性SDS-PAGE图谱；M：低分子量蛋白标准；1和2：不同的IgY抗体纯化洗脱峰。

图4：莱航鸡卵中IgY抗体的动力曲线。

图5：Western-blot：一抗：特异性纯化IgY 5ug/ml；二抗：1：20000(HRP标记)；抗原为不同的间日疟病人或正常人血样；图中50KD处条带为目的蛋白SERA5。

具体实施方式

实施例一、间日疟原虫候选抗原表位的预测

根据PlasmoDB表达蛋白数据库中mRNA的表达水平，和相关文献挑选出丝氨酸重复抗原5(SERA5)作为疟疾诊断的抗原。SERA5是一种可溶的分泌性循环抗原，在间日疟的红内期表达量高，主要存在于纳虫空泡中，参与入侵红细胞的过程。

将间日疟SERA5的氨基酸序列分别与人cathepsin L1和恶性疟SERA5做序列比对，同源性分别为7.42％和31.9％。由于间日疟SERA5氨基酸序列从第509位到第780位为保守区域，因此在这个区域内预测抗原表位。通过BCEPRED网络资源，预测所选抗原的亲水性，可及性、极性、β转角、表面暴露程度及抗原性，ABCpred服务器预测B细胞表位，得到具有较高抗原性和亲水性的多肽序列，结果为具有SEQID No：1：KAVNNACPEPKS所示的氨基酸序列。恶性疟SERA5晶体结构分析显示，预测的抗原多肽位于晶体结构的表面，有利于抗该表位的抗体的结合SERA5抗原，结果见图1。在NCBI中，对所选预测表位进行blast分析，与人和其它病原生物无交叉反应。

实施例二、人工合成抗原肽

委托北京奥维亚生物技术有限公司合成预测的具有SSSCIAKIEAG所示的氨基酸序列的多肽，采用公知的合成方法共合成12mg多肽，其中2mg与KLH偶联，用与免疫产蛋鸡。MASS和HPLC检测纯度为90％以上。

实施例三、抗间日疟SERA5合成肽IgY抗体的制备

(1)抗原多肽免疫莱航鸡

取300μl KLH偶联合成肽(0.4mg/ml)与等体积福氏佐剂充分混合，免疫来航鸡(Leghorn)(购于中国农业大学动物医学院)。第0周采用福氏完全佐剂初次免疫，鸡颈部皮下多点注射；分别在第3、5、11周采用福氏不完全佐剂在腿部和翅部肌肉进行多点加强免疫。每日收取鸡卵，标记后4℃保存备用。

(2)IgY粗纯化

取步骤(1)中获得的新鲜的莱航鸡蛋用蒸馏水洗净。将鸡蛋打破，去掉蛋壳后放入打蛋器中，去掉蛋清。用消毒牙签在蛋黄的下面刺破卵膜，收集卵黄液。称量卵黄的重量(g)，用0.2M NaAc稀释卵黄，按每克卵黄加入5ml NaAc的量稀释，搅拌均匀。12,000rpm，4℃离心20min，获得去脂的卵黄水溶提取物。加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的25％，冰浴放置30min，12,000rpm，4℃离心10min，沉淀用PBS溶解，-40℃冰箱可长期保存。

(3)纯化特异性IgY抗体

溶液配制：

Coupling buffer：0.2M NaHCO₃；0.5M NaCl；pH 8.3

BufferA：0.5M氨基乙醇；0.5M NaCl；pH 8.3

Buffer B：0.1M醋酸钠；0.5M NaCl；pH 4

Binding buffer：20mM Na₃PO₄；150mM NaCl；pH 7.4

Elution buffer：0.1M Gly-HCl；150mM NaCl；pH2.7

中和液：1M Tris pH 9.0

1)将合成肽偶联到HiTrap NHS-activated HP 1ml柱上：取5mg合成肽用1ml Coupling buffer溶解，将6ml预冷的1mM HCl注入柱子中(流速不超过1ml/min)，然后迅速注入1ml Coupling buffer溶解的合成肽，封闭柱子，室温放置30min。再依次注入6ml Buffer A，6ml Buffer B，6ml BufferA(流速不超过1ml/min)，封闭柱子，室温放置30min。再依次注入6ml Buffer B，6ml Buffer A，6ml Buffer B，2ml Binding buffer(流速不超过1ml/min)，4℃保存备用。

2)亲和层析纯化IgY粗提液：打开合成肽偶联HiTrap NHS-activated HP柱子(注意，去顶帽时避免进气泡)，注入Binding buffer，用5-10个柱体积的Binding buffer平衡柱子；泵上样20ml IgY粗提液；上样结束后，用30倍柱体积的Binding buffer洗涤柱子，至洗涤液的紫外吸光值低至20mAU以下；用15倍柱体积的Elution buffer洗脱，分管收集洗脱液，立即用中和液将蛋白洗脱液的pH值调至7左右(1ml样品加150μl中和液)；SDS-PAGE电泳鉴定IgY洗脱液，纯度在95％以上，结果见图2；IgY洗脱液透析、浓缩、测蛋白浓度，-80℃冰箱保存。

实施例四、IgY抗体的活性鉴定

(1)免疫莱航鸡卵中IgY抗体的滴度测定：

应用间接酶联免疫实验(ELISA)测定免疫产蛋鸡的抗体水平，用包被液稀释SERA5合成肽，以0.1ug/孔加入ELISA板，4℃包被过夜；倒掉包被液用PBST洗5次，然后用吸水纸吸干；用含3％羊血清的PBS封闭板子，每孔150ul，37℃孵育1小时后同前洗涤；封闭液2倍梯度稀释待测IgY抗体，每孔加入抗体稀释液100ul，37℃孵育2小时后同前洗涤；每孔加入100ul II抗HRP标记的羊抗鸡IgG以1∶20000稀释(购于Promega公司，G1351)，37℃孵育1小时后同前洗涤；然后每孔加100ul显色液，室温显色10分钟后，每孔加50ul1M硫酸H₂SO₄终止反应；酶标仪测定OD450nm；以免疫前的IgY抗体为阴性对照，按照阴性对照OD450nm±3SD为临界值，判定实验结果。显示在初次免疫后卵黄抗体的滴度在第五周达到最高(稀释度为1∶2x10⁵)。较高滴度的抗体水平可维持5周，此时再加强免疫一次后，卵黄中的抗体在两周后即可回复到原来的较高滴度，并能够维持5周以上，结果见图3。

(2)纯化后IgY抗体的滴度测定：

包被SERA5合成肽，应用间接酶联免疫实验测定(具体实验方法同上)显示纯化后的特异性IgY抗体较粗纯化的IgY抗体识别力明显提高由1∶2x10⁵升至1∶2x10⁷。

实施例五、Western-blot检测特异性IgY抗体对间日疟和恶性疟病人中疟原虫的识别

(1)疟原虫全虫蛋白的制备

取疟疾病人的全血8ml，4℃，2000rpm，5min离心去掉上清，收集红细胞约3ml；加入含0.15％皂素的12ml PBS-Proteininhibitor(PBS-PI)，冰浴8min；转入1.5ml EP管中共10管，4℃，13000rpm，2min离心，弃掉上清和脂层；加入1ml PBS-PI于离心管中，将所有沉淀转入一管，4℃，13000rpm，2min离心，弃掉上清和脂层；加入1ml PBS-PI于离心管中，4℃，13000rpm，2min离心，弃掉上清，重复此步骤直至为无色；沉淀用60μl PBS-PI重悬，-80℃冰箱反复冻融三次，每次-80℃1h；4℃，13000rpm，10min离心，上清为疟原虫全虫蛋白，-80℃冰箱保存。

(2)Western-blot

进行SDS-PAGE电泳，蛋白Marker为预染Marker；在电泳间隙，剪4张3mm厚的滤纸和1张PVDF膜，滤纸的大小应与所要转膜的凝胶的大小吻合，而PVDF膜应稍大于所要转膜的凝胶的大小；将剪好的PVDF膜浸泡于甲醇中，5min；将滤纸、PVDF膜和转印垫浸泡在转膜缓冲液中15min以上，以排除凝胶和滤纸间的气泡；电泳完成后，折卸凝胶夹层，去除积层胶及不需要转膜的分离胶，以适量的转膜缓冲液平衡凝胶10min；将2张浸泡过转膜缓冲液滤纸与凝胶精确对齐，然后将两者转移到一片转印垫上；把PVDF膜精确对齐平铺在凝胶的上面，把余下的2张滤纸放在PVDF膜上，最后把另一片转印垫放在最上层，与底下的转印垫对齐；将凝胶/膜/滤纸/转印垫组装体转移至转印夹，并夹紧，注意正反方向；将转印夹插入处于冰浴的转印槽中，注意正反方向；向转印槽中加入转膜缓冲液，接通电源，注意正负极方向，先100V恒压电转移10min，改成100mA恒流电转移3h；折卸转印装置，取出转印膜；将膜放入1×TBS中洗几分钟，以去除转膜缓冲液；将膜放入含有5％脱脂奶粉的TBST中封闭，室温小摇床慢速摇匀1h；将膜从封闭液中取出，用1×TBS洗两次；用封闭液配制一定浓度的I抗溶液(5μg/ml)，将膜放入直径10cm玻璃平皿中，加入I抗溶液，4℃摇匀过夜；将膜从I抗溶液中取出，放入直径10cm玻璃平皿中，用大体积的TBST冲一遍后，再用TBST溶液洗5遍(玻璃平皿置于脱色摇床上，速度为70rpm左右，膜的正面向下)，每次10min；用封闭液配制1∶20000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG，配好后倒入直径10cm玻璃平皿中，将膜转移到此平皿，室温脱色摇床慢速摇匀1h；将膜从II抗溶液中取出，放入直径10cm玻璃平皿中，用大体积的TBST冲一遍后，再用TBST溶液洗5遍(玻璃平皿置于脱色摇床上，速度为70rpm左右，膜的正面向下)，每次10min；等量混合ECL检测试剂A、B液(有毒)，用量需按照膜的面积计算(需要的终体积为0.125ml/cm2)，混匀，避光；将膜从TBST溶液中取出，将洗液用滤纸吸干；将膜放在一干净的塑料盒上，正面朝上，在避光条件下(在暗室中，开红灯)加ECL检测试剂混合物，室温孵育1min，用滤纸吸干多余的ECL检测试剂；将膜放入夹盒里的保鲜膜中，正面朝上，去除气泡，将X光胶片压于其上，并盖上夹盒；显影时间视荧光亮度而定，一般压3-4张，第一张为1min，第二张为2-3min，第三张为10min；将X光胶片放在显影液中，显影2-3min，边显影边观察，直到显影效果合适为止；将X光胶片转移到定影液中定影1min；开灯，冲洗掉X光胶片上的定影液，观察结果。本研究共检测了9例间日疟病人血样，有8例病人检出，检出率为89％；正常人血样共检测5例，均未检出。图4中给出了9例间日疟病人和1例正常人血样的Western-blot结果。

实施例六、试剂盒的制备

取实施例三得到的合成肽IgY抗体，按照本领域技术人员公知的方法和步骤制备试剂盒。该试剂盒中最终包括至少一种试剂或者含有该试剂的试纸，该试剂中含有如实施例三中所述的合成肽IgY抗体，以及如何使用该试剂或者试纸的说明书。

Claims (9)

1.一种间日疟原虫抗原的多肽，其具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。

2.一种通过如权利要求1所述的间日疟原虫抗原的多肽免疫鸡获得的IgY抗体。

3.一种制备如权利要求2所述的IgY抗体的方法，包括：

1)使用间日疟原虫抗原多肽免疫鸡，该多肽具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列；

2)收取步骤1)中免疫后的鸡所产的卵，并从卵黄中提取获得特异性的IgY抗体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的鸡为莱航鸡。

5.一种经权利要求3的方法获得的IgY抗体。

6.如权利要求2中所述的IgY抗体在制备检测间日疟的制剂中的用途。

7.一种含有如权利要求1所述的间日疟原虫抗原的多肽免疫鸡获得的IgY抗体的制剂，该制剂包含药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的制剂，其中所述的鸡为莱航鸡。

9.一种检测间日疟原虫感染的试剂盒，其特征在于所述试剂盒至少含有如权利要求7所述的制剂或者含有该制剂的试纸，以及使用说明书。

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