JP2002300882A - ＢａｂｅｓｉａｇｉｂｓｏｎｉＰ５０抗原をコードする核酸分子とその発現産物の利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、バベシアギブソニ（ B.gibsoni )
原虫の新規遺伝子とその発現産物を用いた犬の本原虫感
染症の診断と予防方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、B.gibsoniの新規主要抗原タ
ンパク質P50タンパク質および本タンパク質をコードす
る遺伝子を提供する。かかるタンパク質はイヌに対して
抗原性を有することから、抗B.gibsoniワクチンとして
有用である。また、本発明の遺伝子のフラグメントをプ
ローブとして用いることによって、従来近縁種との区別
が困難であったB.gibsoni 原虫感染の診断がより特異的
に実施し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バベシアギブソニ
（Babesia gibsoni、以下B. gibsoniと省略する）原虫
由来の新規蛋白質及び該蛋白質をコードする遺伝子に関
する。

【０００２】

【従来の技術】B.gibsoniはダニにより媒介される赤血
球内寄生原虫であり、本原虫によるイヌの感染症（B.gi
bsoni感染症）は、アジア、アフリカ、ヨーロッパ及び
北アメリカなど世界に広く認められている。日本におい
ても九州から北海道まで全国的にほとんどの地域で発生
例が報告されており、特に西日本においてその被害が深
刻である。

【０００３】B.gibsoni に感染したイヌは、食欲不振、
嗜眠傾向、元気消失、発熱、貧血、嘔吐、血尿、血色素
尿、脾腫、黄疸、ヘモグロビン血症、血小板減少症、全
身性リンパ節腫大などの症状を示す。発熱は溶血時や単
球食細胞と原虫寄生赤血球との応答時に放出される発熱
物質によって惹起される。血小板の減少は骨髄での産生
抑制、肝臓や脾臓での血小板隔離、血小板の消費増大及
び免疫介在性の血小板破壊などに起因すると考えられて
いる。また、B.gibsoniに感染したイヌは手術や免疫抑
制療法実施中に進行性の貧血を発症して原疾患の回復や
円滑な治療を妨げたりもする。

【０００４】B.gibsoni感染症の治療は、主としてジミ
ナゼン製剤により行われているが、本製剤は小脳出血に
起因する神経症状や肝障害、腎障害などを惹起するなど
副作用があるため、その使用が制限されている。

【０００５】本原虫感染症の診断は、現在主に血液塗沫
標本による原虫の確認により行われているが、この方法
は慢性期の感染犬において検出感度が低いという問題を
有している。また蛍光抗体法による血清学的診断法も用
いられているが、他の赤血球寄生原虫、バベシアキャニ
ス（ Babesia canis )との交差反応が認められ、その特
異性に問題がある。

【０００６】B.gibsoni感染症の有効なワクチンは未だ
開発されていない。その大きな要因として、B.gibsoni
の大量培養が困難であること及び感染防御に関わる有効
抗原の検索が遅れていることが挙げられる。このような
背景から、B.gibsoniの主要抗原の検索、組換えタンパ
ク質を抗原とした感度及び特異性の高い診断法の確立な
らびに有効な組換えワクチンの開発が望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、B.gibsoni
感染症の診断及び感染予防用ワクチンの製造に使用し得
るB.gibsoniの主要抗原及び該抗原をコードする遺伝子
を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、B.gibson
iのcDNA ライブラリーを構築し、B.gibsoni感染犬血清
を用いたイムノスクリーニングにより、主要抗原をコー
ドする遺伝子（以下P50遺伝子と称する）を同定、クロ
ーニングした。さらに、P50遺伝子にコードされるタン
パク質(以下P50タンパク質と称する)を発現させた結
果、その発現産物が抗原性、免疫原性を有することを確
認した。従って、本発明は、B.gibsoni感染症の診断及
び感染予防用ワクチンの製造に使用し得るB.gibsoniの
主要抗原及び該抗原をコードする遺伝子を提供する。

【０００９】P50遺伝子 本発明は、B.gibsoniの主要抗原タンパク質をコードす
る遺伝子を提供する。本遺伝子は上記の様にcDNAライブ
ラリーから単離同定することもできるが、本明細書に開
示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション
などの遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホ
アミダイト法などの化学合成的手法により調製されるDN
Aであってもよい。その形態としてはcDNA、ゲノムDNAの
ほか、化学合成DNAなどが含まれるが、特に制限はな
い。

【００１０】本発明のDNAは一本鎖であっても、それに
相補的な配列を有するDNAやRNAと結合して二重鎖を形成
していてもよい。また、当該DNAは、ホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ等の酵素や放射性同位体、蛍光物
質、化学発光物質等で標識されていてもよい。

【００１１】また、P50遺伝子の塩基配列が提供されれ
ば、これより導かれるRNAの配列や、相補的なDNAおよび
RNAの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、
本発明のDNAに対応するRNAあるいは本発明のDNAと相補
的な配列を有するDNAおよびRNAもまた提供するものと理
解すべきである。

【００１２】さらに、本発明のDNAには、配列番号１に
記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件
でハイブリダイズするDNAをも包含するものである。配
列番号１に記載の塩基配列からなるDNAに対しては、こ
れとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ
該DNAにコードされるタンパク質が抗B.gibsoni抗体と反
応性を有する範囲において、塩基配列のバリエーション
が許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一
アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々
の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理に
よるランダム変異、制限酵素切断によるDNA断片の変異・
欠失・連結等により、部分的にDNA配列が変化したもので
あっても、これらDNA変異体が配列番号１に記載のDNAと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ抗
B.gibsoni抗体と反応性を有するタンパク質をコードす
るDNAであれば、配列番号１に示したDNA配列との相違に
関わらず、本発明の範囲内のものである。

【００１３】上記の変異の程度は、配列番号１に記載の
DNA配列と70％以上、好ましくは80％以上、更に好まし
くは90％以上の相同性を有するものであれば許容範囲内
である。また、ハイブリダイズする程度としては、通常
の条件化、例えばDIG DNA Labeling kit (ベーリンガー
・マンハイム社製Cat No.1175033)でプローブをラベルし
た場合に、32℃のDIG Easy Hyb溶液（ベーリンガー・マ
ンハイム社製Cat No.1603558）中でハイブリダイズさ
せ、50℃の0.5×SSC溶液（0.1％（w/v）SDSを含む）中
でメンブレンを洗浄する条件（1×SSCは0.15 M NaCl、
0.015 Mクエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブ
リダイゼーションで、配列番号１に記載の核酸にハブリ
ダイズする程度であればよい。

【００１４】本発明のDNAは、形質転換細胞の調製、さ
らには該形質転換細胞を用いた組換えタンパク質の産生
方法において有用である。

【００１５】本発明における形質転換細胞は当業者に公
知の技術を適用して調製することが可能であり、例え
ば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々な
ベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本願発明のDNA
を組み入れることが可能である。

【００１６】また、本発明のDNAを組込んだ組換えウイ
ルスを含むワクチン製剤を調製することも可能である。
このような組換えウイルスも同業者に公知の技術を適用
して調整することが可能である。

【００１７】P50タンパク質 本発明は、P50遺伝子にコードされるB.gibsoniの主要抗
原であるP50タンパク質を提供する。P50タンパク質の推
定アミノ酸配列は配列番号２に示すとおりである。この
タンパク質は約50 ｋDaの分子量を有する新規なタンパ
ク質であり、B.gibsoni感染犬血清と特異的に反応す
る。更に、推定アミノ酸配列は既に報告されている原虫
及び他の生物種のいずれの遺伝子とも有意な相同性が認
められない。したがって、P50タンパク質を用いること
によって、他の赤血球内寄生原虫と交差反応を示さない
血清学的診断を行うことが可能である。また、P50タン
パク質を抗原として使用することにより抗B.gibsoni抗
体を作製し使用することが可能である。更に、P50タン
パク質を免疫原とするワクチンの製造に使用することも
可能である。

【００１８】蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
が、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言
う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つか
の関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換に
ついては、グリシン（Gly）とプロリン（Pro）、Glyと
アラニン（Ala）またはバリン（Val）、ロイシン（Le
u）とイソロイシン（Ile）、グルタミン酸（Glu）とグ
ルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）とアスパラギ
ン（Asn）、システイン（Cys）とスレオニン（Thr）、T
hrとセリン（Ser）またはAla、リジン（Lys）とアルギ
ニン（Arg）、等が挙げられる。また、上述の意味の保
存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能
を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、
異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかの
アミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入され
ていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認め
られている。

【００１９】従って、本発明のタンパク質には、配列番
号２のアミノ酸配列を有するタンパク質の類似体であっ
て、抗B.gibsoni抗体と反応性を保持しているタンパク
質が包含される。即ち、配列番号２のアミノ酸配列にお
いてアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を有するタンパク質であっても、抗B.gibsoni
抗体と反応性を保持している限りにおいて、本願発明の
タンパク質に包含される。ここで、「抗B.gibsoni抗体と
反応性を保持している」とは、モノクローナル若しくは
ポリクローナル抗B.gibsoni抗体と特異的に抗原抗体反
応を起こし得ることを意味する。

【００２０】このようなアミノ酸の変化は、異なる生物
種間に認められる配列の多様性あるいはいわゆる遺伝子
多型などの様に自然界において認められる他、当業者に
公知の方法、例えばNTGなどの変異誘発剤を用いた突然
変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的
変異法を利用して、人為的に発生させることができる。
アミノ酸の変異部位および個数は、抗B.gibsoni抗体と
反応性を保持している限り特に制限はないが、変異個数
は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内
である。

【００２１】抗体 本発明は、P50タンパク質に結合する抗体を提供する。
本発明の抗体は、P50タンパク質全体あるいはその部分
ペプチドを特異的に認識する抗体であり、モノクローナ
ル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。また、免
疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質と
して分類される５つのクラス（IgG、IgA、IgM、IgD、Ig
E）、あるいはH鎖のタイプによるサブクラスのいずれに
属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを
例えばペプシンで分解したときのF(ab')2、パパインで
分解したときのFabなどのフラグメントであっても、ま
たキメラ抗体であってもよい。これらの抗体は、後述す
るDNAライブラリーのイムノスクリーニングにおいてP50
遺伝子クローンを同定するために使用し得る。また、P5
0タンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作
製、精製時の各分画中のP50タンパク質を検出するため
に使用することができる。

【００２２】

【本発明の実施の形態】核酸 本発明のDNAをDNAライブラリーから得る例としては、適
当なゲノムライブラリーやcDNAライブラリーを、ハイブ
リダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用
いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目
的のDNAを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵
素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーシ
ョン法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩
基配列もしくはその一部を有するDNAを32P等でラベルし
てプローブとし、cDNAライブラリーに対して、公知の方
法（例えば、Maniatis T.等, Molecular Cloning, a La
boratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, Ne
w York, 1982年）で行うことができる。イムノスクリー
ニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用
することができる。本発明の新規DNAはまた、ゲノムDNA
ライブラリーもしくはcDNAライブラリーを鋳型とするPC
R（Polymerase Chain Reaction）によっても得る事がで
きる。PCRは、配列番号１に記載の塩基配列をもとに、
センスプライマー、アンチセンスプライマーを作製し、
DNAライブラリーに対し、公知の方法（例えばMichael
A.I. 等，PCR Protocols, a Guide to Methods and Ap
plications, Academic Press, 1990年参照）等を行って
本発明のDNAを得ることもできる。上記各種方法で使用
するDNAライブラリーは、B.gibsoni感染細胞を用い公知
の方法（J.Sambrook等、Molecular Cloning, a Labora
tory Manual 2nd ed.,Cold Spring harbor Laborator
y, New York, 1989年参照）に従って、cDNAライブラリ
ーを作製し、利用することができる。

【００２３】本発明のDNAを有する組換えベクターは、
環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。か
かる組換えベクターは、本発明のDNAに加え、必要なら
ば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列と
は、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボソ
ーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される
塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他
のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリA付加配
列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーと
なる遺伝子の塩基配列等のことである。

【００２４】遺伝子組換えに際しては、適当な合成DNA
アダプターを用いて翻訳開始コドンや終止コドンを本発
明のDNAに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制
限酵素切断配列を新たに発生させるあるいは消失させる
ことも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範
囲内であり、本発明のDNAを基に任意かつ容易に加工す
ることができる。

【００２５】また、本発明のDNAを保持するベクター
は、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使
用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、
バキュロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイル
ス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に
制限はない。

【００２６】本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有の
プロモーター配列の制御下に発現させることができる。
あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロ
モーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に直接ある
いは置き換えて使用することもできる。この場合に使用
するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜
選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはT7
プロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、λ
PLプロモーター等が、宿主が酵母である場合にはPHO5プ
ロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が、
宿主が動物細胞である場合にはSV40由来プロモーター、
レトロウイルスプロモーター等を例示できるが、これら
には限定されない。

【００２７】DNAをベクターに導入する方法は公知であ
る（J.Sambrook等、Molecular Cloning, a Laboratory
Manual 2nd ed., Cold Spring harbor Laboratory, N
ew York, 1989年参照）。即ち、DNAとベクターをそれぞ
れ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を
DNAリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。

【００２８】本発明の核酸分子を組込んだ組換えウイル
スは、ワクチン形態で動物に投与することが可能であ
り、かかる組換えウイルスは動物体内において発現さ
れ、B.gibsoniに対する免疫応答を惹起し得る。

【００２９】好適なウイルスベクターには、アルファウ
イルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペス
ウイルス、およびレトロウイルスに基づくものがある
が、これらに限定されない。

【００３０】タンパク質 本発明のタンパク質は、原核生物あるいは真核生物から
選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によって
調製することができる。

【００３１】前項の組換えベクターを用いて形質転換さ
せる宿主細胞には特に制限はなく、E.Coli、B.subtils
あるいはS.cerevisiaeに代表される遺伝子工学手法にお
いて利用可能な下等細胞、昆虫細胞、COS7細胞、CHO細
胞、Hela細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、
本発明に対しても利用可能である。

【００３２】組換えベクターを宿主細胞に導入する方法
としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト
法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈殿法、DEAEデ
キストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス
粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺
伝子工学ハンドブック1991年3月20日発行、羊土社参
照）があるが、いずれの方法を用いてもよい。

【００３３】当該タンパク質を遺伝子工学的に生産する
には、上述の形質転換体を培養して培養混合物を回収
し、当該タンパク質を精製する。形質転換体の培養は、
一般的な方法で行うことができる。形質転換体の培養に
ついては各種の成書（たとえば、「微生物実験法」社団法
人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、1992年を参
照）があるので、それらを参考にして行うことができ
る。

【００３４】培養混合物から本発明のタンパク質を精製
する方法としては、タンパク質の精製に通常使用されて
いる方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことが
できる。即ち、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、ゲ
ル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィ
ー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマ
トフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆
相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中か
ら適切な方法を適宜選択し、必要に応じてHPLCシステム
等を使用して適当な順序で精製を行えばよい。

【００３５】また、本発明のタンパク質を他のタンパク
質やタグ（例えば、グルタチオンSトランスフェラー
ゼ、プロテインA、ヘキサヒスチジンタグ、FLAGタグそ
の他）との融合タンパク質として発現させることも可能
である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例
えばトロンビン等）を用いて切り出すことが可能であ
り、ときとしてタンパク質の調製をより有利に行うこと
が可能となる。本発明のタンパク質の精製は当業者に一
般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合タ
ンパク質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的
な精製法を採用することが好ましい。

【００３６】また、組換えDNA分子を利用して無細胞系
の合成方法（J.Sambrook等、Molecular Cloning, a La
boratory Manual 2nd ed., Cold Spring harbor Labor
atory, New York, 1989年参照）で得る方法も、遺伝子
工学的に生産する方法の１つである。

【００３７】この様に本発明のタンパク質は、その単独
の形態でも別種のタンパク質との融合タンパク質の形態
でも調製することができるが、これらのみに制限される
ものではなく、本願発明のタンパク質を更に種々の形態
へと変換させることも可能である。例えば、タンパク質
に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の
高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知
られている多種の手法による加工が考えられる。また、
用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程
度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、P50
タンパク質と同等の免疫原性を有するタンパク質である
限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべき
である。

【００３８】抗体 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる
（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫
学会発行参照）。以下に簡単に説明する。

【００３９】当該新規抗体を得るには、まず動物に、免
疫原として本発明のタンパク質を必要に応じてフロイン
トの完全アジュバント（FCA）や不完全アジュバント（F
IA）等の適当なアジュバントとともに投与し、必要があ
れば2〜4週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血
を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明のタンパ
ク質は、抗体の作製に使用し得る精製度のものであれば
いかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の
タンパク質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に
使用し得る。免疫抗原として使用するポリペプチドが、
低分子のポリペプチド、すなわち約10〜20アミノ酸から
なるポリペプチドである場合には、それをキーホールリ
ンペットヘモシアニン（KLH）等のキャリアと結合させ
て抗原として使用すればよい。免疫する動物は目的の抗
体を産生し得るいずれの動物種を選択して使用すること
も可能である。

【００４０】ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を
精製することによって得ることができる。精製は、塩
析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行え
ばよい。

【００４１】モノクローナル抗体を得るには以下のよう
に行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリ
ンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコ
ール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方
法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリド
ーマを作製する。その後、本発明のタンパク質に結合す
る抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その
選択されたクローンの培養上清を精製することによって
得ることができる。精製は塩析、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知
方法を適宜組み合わせて行う。

【００４２】また、遺伝子工学的な方法を用いても当該
新規抗体から得られる。例えば、本発明タンパク質また
はその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リン
パ球あるいは、本発明タンパク質またはその部分ポリペ
プチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマからmRNAを採取し、これをもとにcDNAライブラリ
ーを作製する。抗原と反応する抗体を産生しているクロ
ーンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、
培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせ
て精製することができる。

【００４３】ワクチン 免疫学的に有効な量のP50タンパク質または該タンパク
質を生体内で発現するように該タンパク質の遺伝子を組
込んだ組換えウイルスをアジュバントその他の薬学的に
許容可能なキャリアを組み合わせて、B.gibsoni感染の
治療または予防用ワクチン製剤を調製することが可能で
ある。「免疫学的に有効な量」は、単回投与または連続投
与の一部として投与される量がB.gibsoni感染の治療又
は予防に有効である量を意味するが、この量は、個体の
健康状態、ワクチン処方等に応じて調整し得る。

【００４４】アジュバントとしては、例えば水酸化アル
ミニウム、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合
物、フロイントアジュバント、ムラミルペプチドなどが
用いられる。

【００４５】ワクチン製剤には、更に、リン酸ナトリウ
ム塩、リン酸カリウム塩、水酸化ナトリウム、塩酸等の
ｐH調節剤、硫酸カナマイシン、エリスロマイシン等の
抗生物質、乳糖、グルタミン酸カリウム、D-ソルビトー
ル、アミノ酢酸等の安定剤、塩化ナトリウム等の等張化
剤などを加えることが可能である。抗B.gibsoni抗体検出法 B.gibsoniに感染した個体は、P50タンパク質に特異的な
抗体を産生することから、該抗体の検査を行うことによ
りB.gibsoni感染犬を高い信頼性をもって同定すること
が可能である。

【００４６】抗B.gibsoni抗体検出方法は、被検個体か
ら得られた血液その他の生体サンプルと上記精製P50タ
ンパク質を接触させ、抗原抗体反応を指標として陽性個
体を同定する。かかる検査は、間接蛍光抗体法（IF
A）、受身凝集法（PA）等の公知の免疫学的試験法によ
って実施することが可能である。

【００４７】PCR法によるB.gibsoni感染症のDNA診断法 B.gibsoni感染症の診断は、主に血液塗沫標本を顕微鏡
で調べる方法（塗沫鏡検法）によって行われているが、
慢性期の感染犬において検出感度が低いという欠点があ
る。

【００４８】PCRによるDNA診断は極微量の原虫DNAをも
検出できる。従って、B.gibsoni遺伝子の一部であるプ
ライマーを使用してPCRを実施することにより、塗沫検
鏡法によっては偽陰性となるB.gibsoni感染犬の診断が
可能となる。即ち、被検個体から得られた血液その他の
サンプル由来のDNAを、配列番号１に示す塩基配列の一
部であるプライマーを使用するPCRによって増幅した
後、電気泳動を行い、P50遺伝子由来のバンドが確認さ
れた個体は、B.gibsoniに感染していると診断すること
が可能である。

【００４９】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００５０】実施例１ B.gibsoni p50遺伝子の同定、
クローニング及び塩基配列の決定 B.gibsoni NRCPD 株[Fukumoto et al., J Parasitol 8
4:954-959(2000)]感染犬赤血球よりAcid Guanidinium-P
henol-Chloroform 法[Chromczynski et al., Anal Bioc
hem 162:156-159(1987)]にてTotal RNAを抽出した。Tot
al RNAよりmRNAIsolation Kit (Oligotex-dT30, Takara
社)を用い、メーカーの推奨する方法に従いpoly A + RN
Aを精製した。以下に述べるcDNAライブラリーの構築と
イムノスクリーニング及びcDNAクローンのプラスミド化
（in vivo Excision）は全てStratagene社の試薬キット
を用い、メーカーの推奨する方法に従って実施した。約
５μgのB.gibsoni mRNAを鋳型として、ZAP−cDNA synth
esis kitを用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをSeph
adex CL-2Bゲルカラムにてサイズ分画した後に、Uni-ZA
P XR Vector armsに挿入し、GigapackIII Gold packagi
ng extractにてパッケージングを行った。パッケージン
グ産物をE.Coli XL1-Blue MRF株に感染させ、約50万個
のcDNAクローンを含むライブラリーを得た。

【００５１】B.gibsoni感染犬血清を用いて、cDNAライ
ブラリーをイムノスクリーニングし、２つのオーバーラ
ップする陽性クローンを得た。これらの陽性クローンを
invivo Excision法にてプラスミド化（pBluescript SK
(+)へ変換）した。cDNA断片を含むプラスミドをプラス
ミド精製キット（Qiagen社）にて精製した後に、DyePri
mer Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer社)を用い、
メーカーの推奨する方法に従いPCRを行った。ABI PRISM
377 DNA sequencer (Perkin Elmer社)を用いてPCR産物
を解析し、cDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、
２つのクローンが同一遺伝子であることが判明した。そ
の中で長い断片を持つクローンを以後の解析に供した。
cDNAの全長は1924 bpであり、1401 bpのOpen Reading F
rame (ORF)を有していることが確認された（配列番号
１）。推定されるタンパク質は466 基のアミノ酸からな
り、推定分子量は50 kDaであった（配列番号２）。以
下、この遺伝子をP50遺伝子と称する。P50遺伝子より予
想されるアミノ酸配列をNational Center for Biotechn
ology Information のBLAST法にて相同性検索を行った
結果、これまでに報告されている原虫その他いずれの生
物種のいかなる遺伝子とも有意な相同性を示さなかっ
た。

【００５２】実施例２ B.gibsoni P50タンパク質を大
腸菌で発現させるための組換えベクタープラスミドの構
築 B.gibsoni P50 cDNA 断片が挿入されているpBluescript
プラスミドを制限酵素EcoRI とXhoIで消化することによ
りP50 cDNA断片を切り出し、大腸菌発現用ベクターpGEM
EX-2(Promega社)のEcoRIとXhoIサイトに挿入した。プラ
スミド精製キット（Qiagen社）にて組換えプラスミドpG
EMEX-2/P50を精製した。プラスミドpGEMEX-2/P50は、独
立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センター
に受託番号FERM BP-7533として寄託されている。

【００５３】実施例３ 大腸菌におけるB.gibsoni P50
タンパク質の発現 実施例２で得られた組換えプラスミドにて大腸菌JM109
（DE3）株（Promega社）を形質転換させた後、37℃でア
ンピシリンを含んだLB培地で培養し、培養液のOD値（60
0 nm）が0.3〜0.5に達した時点でIPTGを最終濃度0.5 mM
になるように添加し、さらに37℃で4時間培養を続け
た。組換えタンパク質の発現は10％SDS-ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動[Laemmli et al., Nature 227:680-
685(1970)]を実施した後、クマーシー染色で確認した。
その結果、約85 kDaの組換えタンパク質の発現が認めら
れ、gene10リーダータンパク質（35 kDa）とB.gibsoni
P50タンパク質（50 kDa）の融合タンパク質であること
が確認された（図１）。

【００５４】実施例４ 大腸菌において発現された組換
えP50タンパク質の精製及び該精製タンパク質に対する
抗体の作製 実施例３で記述した方法により大腸菌で発現させた組換
えP50タンパク質をPromega社の推奨する方法に従い精製
した。精製後の組換えP50タンパク質の電気泳動像を図
１に示す。次に精製組換えP50タンパク質に対する抗体
を作製するために、100 μgの組換えP50タンパク質を含
む溶液200 μLとフロイントの完全アジュバント（FCA；
Difco社）200 μLを混合し乳化したものをBALB/cマウス
（8週齢、雌）に腹腔内接種した。接種後2週目及び4週
目にそれぞれ100 μgの組換えP50タンパク質をFCAと混
合し乳化したものを追加接種した。最終接種後2週目に
採血を行い、血清を-20℃に保存した。

【００５５】実施例５ イムノブロット法によるネイテ
ィブ（天然型）P50タンパク質の同定 実施例４で得た抗組換えP50タンパク質マウス血清を用
い、イムノブロット法[Towbin et al., Proc Natl Acad
Sci USA 76:4350-4354(1979)]にて天然物P50タンパク
質の同定を行った。図２に示すようにB.gibsoni感染赤
血球ライセートにおいて50 kDaの特異的バンドが検出さ
れた。天然型P50タンパク質の分子量は推定理論値（50
kDa）と同様であった。

【００５６】実施例６ 組換えP50タンパク質に対する
免疫血清の反応性 イムノブロット法を用いて組換えP50タンパク質に対す
るB.gibsoni感染犬血清の反応性を検討した。図３に示
すように、組換えP50タンパク質はB.gibsoni感染犬血清
と強く反応することが確認された。これに対し、正常犬
血清と組換えP50タンパク質との反応は認められなかっ
た。

【００５７】このことから、組換えP50タンパク質はB.g
ibsoni感染症の診断用抗原として有用であることが示さ
れた。また、P50を免疫原とするワクチンとして有用で
あることが示された。

【００５８】実施例７ 組換えP50蛋白質のイヌに対す
る抗原性 実施例４に示した組換えP50タンパク質のイヌに対する
抗体産生誘導について検討した。精製組換えP50タンパ
ク単独または本タンパク質にアジュバントとしてアルミ
ニウムゲルを加えた混合物を３ヶ月齢のビーグル犬に皮
下または筋肉内接種し、初回接種４週目に追加接種し
た。追加接種後４週目に採血を行った。P50遺伝子を発
現させる組換えバキュロウイルスAcP50を作製し、AcP50
感染Sf9細胞をTriton X-100で処理した。その可溶性画
分を抗原として用いて上記血清と反応させ、本抗原に結
合した抗体を酵素抗体法（ELISA法）により検出した。
その結果、表１に示すように組換えP50タンパク質に対
する抗体が免疫群全頭の血清中において認められたが、
抗原非接種対照群のイヌの血清中には抗体は認められな
かった。

【００５９】この結果から、組換えP50タンパク質をイ
ヌに接種することによって本タンパク質に対する抗体産
生の誘導が確認され、組換えP50タンパク質の抗B.gibso
niワクチンとしての有用性が示された。

【００６０】

【表１】

【００６１】

【発明の効果】当該遺伝子はB.gibsoniの新規主要抗原
タンパク質P50タンパク質をコードする遺伝子であり、
当該タンパク質はイヌに対して抗原性を有することか
ら、抗B.gibsoniワクチンとして使用し得る。また、本
タンパク質もしくはそのフラグメントあるいは本タンパ
ク質をコードする塩基配列をプローブとして用いること
によって、従来近縁種との区別が困難であったB.gibson
i 原虫感染の診断がより特異的に実施し得る。

【００６２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SUZUKI NAOYOSHI and INTERVET <120> Uses of a nucleic acid moulecule encoding Babesia gibsoni P50 anti gen and an expression product thereof. <130> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1922 <212> DNA <213> Babesia gibsoni <400> 1 tttaaagcac tccatctaaa cactaatatg aatgtcgttc gttcattcct gtttttccca 60 atcgccttct ccctggtaag ggcaaatggt gaggggaaga cggcagaggc cacccctgca 120 ggaacatcga cacccactga acctaaggca gctgaggctg ctcccaaagc agtagacgca 180 gctgctgtta cctttaaaca gtatctggac tttgcaatga agttaaacga ggccgtgaca 240 ctccgtgagg aagacactag gaaaaagctt ttggttaact tccctctttt cggagctccc 300 ccgttcgatg gtgcatgggg ggatttgaaa gacttattga agaaagttac tgagcttcgg 360 gcacttctac ttaagggtca cacattcggt ttaccagcgg caaccacaac agacaaacag 420 caacaggatg ctaaccaaac tgtcggtgct ttatttgatt tcattgtcgg agtagcaact 480 gatgcagtca ccgttgctga taaggctact agggctgtta ctggaatgga ccccgataaa 540 gccgtgggat tccacgtcac accagcaacg gctgatgccc tatttgagtt tgttccagat 600 ctctatgaaa agttgaagga tttgcatagt aaggttggag agtgggttga aattaagtcc 660 acctttgatg acacgaaatt ggtaacccaa gctggtgatc acaggccgaa acactggtta 720 aggcagggtg ggtttactga ccaggaggtt aaaggtgata ccaccttgga aactttgaaa 780 actaaactgg gtgagctcgt tggtcctact aagccttgtg agaaggtttt gtgtaccctt 840 gcttcatatg cgcttatgaa gacccctcaa gatgcagctg gcaagcaggc atggatcttt 900 ttattggcaa gtgcaatgaa taacaatgct atgaaagcta agcttgaggt agcagtaaac 960 gcggttactc ccggtaaggg agaaaccttt gtcaaccaac taaaggaggt tggcaaatca 1020 ctccagcttc ccaaggaaca agttcctaag caatatcgtt tccctggtgt ctatgcaaac 1080 ctcgatgtgc aacacttttg gactgtgtta accggcgtct ttggcactat actgactgac 1140 cttgaggttg acgaaaagga tgctcagggt aaagcaggac aggttgctac tagagttgcg 1200 gagcttgtca aggtggaagg tccacttcac agcctcactg tgcaagtagc tgagatgact 1260 aaggctggag cgggtgctgg tggtgaagct cctgctcagg cagctgctgg gacagcagga 1320 gcacgtgcag aagctccagc caaggaaggc caaggtgagg atggtgcgca cttttgtggc 1380 atcggaatga cagttttctt tgtttctgtg gttatcgctg tcttttaagc ttagtcaatg 1440 cgggaaatgc cgcttgtatt tgtacaaaat atgtgacggc aaggacatcc aggaggaact 1500 catttgattc actctgaaag cccaataagt tttaatgttt tggtgtctcg taatctgtct 1560 aggactttct gggtctcttt tgttttcttc catttgaaga taatgcttct atcaacgaaa 1620 atgcggagga aggcctatat tgaaaatgtt gtggcgtata ttgtaatgta aatggataat 1680 ctcttaatac atcactctat aagaggtgat atctaaatgg tattttaact gtgggacgcc 1740 actggaatgg gtatgataat gaatctgaat gcatggattg ccactgactg gatgattacg 1800 gcttcttaat ctatagggct atgtatcatc cgagcagttt taaatgtaga ctgtaacgca 1860 ggaaaccccg ttgtaatgtg cttaacatag ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aa 1922 <210> 2 <211> 466 <212> PRT <400> 1 Met Asn Val Val Arg Ser Phe Leu Phe Phe Pro Ile Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Val Arg Ala Asn Gly Glu Gly Lys Thr Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly 20 25 30 Thr Ser Thr Pro Thr Glu Pro Lys Ala Ala Glu Ala Ala Pro Lys Ala 35 40 45 Val Asp Ala Ala Ala Val Thr Phe Lys Gln Tyr Leu Asp Phe Ala Met 50 55 60 Lys Leu Asn Glu Ala Val Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Arg Lys Lys 65 70 75 80 Leu Leu Val Asn Phe Pro Leu Phe Gly Ala Pro Pro Phe Asp Gly Ala 85 90 95 Trp Gly Asp Leu Lys Asp Leu Leu Lys Lys Val Thr Glu Leu Arg Ala 100 105 110 Leu Leu Leu Lys Gly His Thr Phe Gly Leu Pro Ala Ala Thr Thr Thr 115 120 125 Asp Lys Gln Gln Gln Asp Ala Asn Gln Thr Val Gly Ala Leu Phe Asp 130 135 140 Phe Ile Val Gly Val Ala Thr Asp Ala Val Thr Val Ala Asp Lys Ala 145 150 155 160 Thr Arg Ala Val Thr Gly Met Asp Pro Asp Lys Ala Val Gly Phe His 165 170 175 Val Thr Pro Ala Thr Ala Asp Ala Leu Phe Glu Phe Val Pro Asp Leu 180 185 190 Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu His Ser Lys Val Gly Glu Trp Val Glu 195 200 205 Ile Lys Ser Thr Phe Asp Asp Thr Lys Leu Val Thr Gln Ala Gly Asp 210 215 220 His Arg Pro Lys His Trp Leu Arg Gln Gly Gly Phe Thr Asp Gln Glu 225 230 235 240 Val Lys Gly Asp Thr Thr Leu Glu Thr Leu Lys Thr Lys Leu Gly Glu 245 250 255 Leu Val Gly Pro Thr Lys Pro Cys Glu Lys Val Leu Cys Thr Leu Ala 260 265 270 Ser Tyr Ala Leu Met Lys Thr Pro Gln Asp Ala Ala Gly Lys Gln Ala 275 280 285 Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ser Ala Met Asn Asn Asn Ala Met Lys Ala 290 295 300 Lys Leu Glu Val Ala Val Asn Ala Val Thr Pro Gly Lys Gly Glu Thr 305 310 315 320 Phe Val Asn Gln Leu Lys Glu Val Gly Lys Ser Leu Gln Leu Pro Lys 325 330 335 Glu Gln Val Pro Lys Gln Tyr Arg Phe Pro Gly Val Tyr Ala Asn Leu 340 345 350 Asp Val Gln His Phe Trp Thr Val Leu Thr Gly Val Phe Gly Thr Ile 355 360 365 Leu Thr Asp Leu Glu Val Asp Glu Lys Asp Ala Gln Gly Lys Ala Gly 370 375 380 Gln Val Ala Thr Arg Val Ala Glu Leu Val Lys Val Glu Gly Pro Leu 385 390 395 400 His Ser Leu Thr Val Gln Val Ala Glu Met Thr Lys Ala Gly Ala Gly 405 410 415 Ala Gly Gly Glu Ala Pro Ala Gln Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Ala 420 425 430 Arg Ala Glu Ala Pro Ala Lys Glu Gly Gln Gly Glu Asp Gly Ala His 435 440 445 Phe Cys Gly Ile Gly Met Thr Val Phe Phe Val Ser Val Val Ile Ala 450 455 460 Val Phe 465

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の発現産物である組換えP50タンパク質
を示す電気泳動図を示す。レーン１：分子量マーカー、
レーン２：精製組換えP50タンパク質、レーン３：精製g
ene 10タンパク質

【図２】組換えP50タンパク質免疫血清による天然型P50
タンパク質の検出を示すイムノブロット像を示す。レー
ン１：B.gibsoni感染赤血球、レーン２：正常犬赤血球

【図３】組換えP50タンパク質とB.gibsoni感染犬血清と
の反応性を示すイムノブロット像を示す。レーン１：精
製組換えP50タンパク質、レーン２：精製gene 10タンパ
ク質

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 7/00 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 5/00 Ａ (72)発明者 福本 晋也 北海道帯広市西10条南39丁目３ ノースハ イムＢ201 (72)発明者 玄 学南 北海道帯広市稲田町西２線15 畜大宿舎76 (72)発明者 五十嵐 郁男 北海道帯広市西22条南４丁目８−23 (72)発明者 長澤 秀行 北海道帯広市空港南町296−12 (72)発明者 見上 彪 北海道帯広市大空町12−４−３ 大空町住 宅302−301 (72)発明者 種子野 章 茨城県つくば市上ノ室1045−９ (72)発明者 野中 富士男 茨城県土浦市木田余東台３−11−33 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB04 4B024 AA01 AA13 BA31 BA43 CA01 EA02 GA11 HA12 4B063 QA19 QQ02 QQ42 QQ46 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS33 QS34 QX01 4B065 AA86Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA43 4C085 AA03 BA02 BB11 CC07 CC08 DD62 DD63 4H045 AA10 AA11 BA10 CA20 DA75 DA86 EA31 EA52 FA74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質若
   しくはペプチドフラグメント； （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク
   質（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において1個又
   は数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列を有し抗バベシアギブソニ（ B.gibsoni
   ）抗体と反応性を有するタンパク質若しくはそのペプ
   チドフラグメント。
2. 【請求項２】 B.gibsoniに対する感染防御免疫誘導活
   性を有する請求項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のタンパク質又
   はポリペプチドをコードする核酸分子またはその相補塩
   基配列を有する核酸分子。
4. 【請求項４】 配列番号１に示す塩基配列またはその相
   補塩基配列を有する請求項３に記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項３または４に記載の核酸分子を含
   む組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項３または４に記載の核酸分子を組
   込んだ組換えウイルス。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の組換えベクターにより
   形質転換された形質転換細胞。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のタンパク質若しくはポ
   リペプチドに対する抗体。
9. 【請求項９】 請求項２に記載のタンパク質を含むB．g
   ibsoni感染症の治療用又は予防用のワクチン。
10. 【請求項１０】 請求項６に記載の組換えウイルスを含
    むB.gibsoni感染症の治療または予防用のワクチン。
11. 【請求項１１】 P50をコードする核酸をマーカーとす
    るB.gibsoni感染の診断方法。