HU220130B - Új oszteoblasztnövekedést stimuláló protein és eljárások a protein előállítására - Google Patents
Új oszteoblasztnövekedést stimuláló protein és eljárások a protein előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU220130B HU220130B HU9600395A HU9600395A HU220130B HU 220130 B HU220130 B HU 220130B HU 9600395 A HU9600395 A HU 9600395A HU 9600395 A HU9600395 A HU 9600395A HU 220130 B HU220130 B HU 220130B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- acid sequence
- seq
- osteoblast
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims description 19
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 13
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 27
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 102400000988 Met-enkephalin Human genes 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 4
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 4
- QNTJIDXQHWUBKC-BZSNNMDCSA-N Leu-Lys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QNTJIDXQHWUBKC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 4
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 4
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- COEXAQSTZUWMRI-STQMWFEESA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 COEXAQSTZUWMRI-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N Alumina Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- QCMVGXDELYMZET-GLLZPBPUSA-N Glu-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QCMVGXDELYMZET-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VRJZMZGGAKVSIQ-SRVKXCTJSA-N Cys-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VRJZMZGGAKVSIQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XHBYEMIUENPZLY-GMOBBJLQSA-N Ile-Pro-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XHBYEMIUENPZLY-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- HNURHHFOINNTPL-IHPCNDPISA-N Phe-Cys-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N HNURHHFOINNTPL-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N Pro-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000000540 fraction c Anatomy 0.000 description 2
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 102220059798 rs56203955 Human genes 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 1,25-dihydroxy vitamin D3 Chemical compound C1([C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=CC=C1C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ATABBWFGOHKROJ-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ATABBWFGOHKROJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- TWXZVVXRRRRSLT-IMJSIDKUSA-N Asn-Cys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TWXZVVXRRRRSLT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- NVFSJIXJZCDICF-SRVKXCTJSA-N Asp-Lys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NVFSJIXJZCDICF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RXBGWGRSWXOBGK-KKUMJFAQSA-N Asp-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RXBGWGRSWXOBGK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- XQFLFQWOBXPMHW-NHCYSSNCSA-N Asp-Val-His Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)O XQFLFQWOBXPMHW-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101100228200 Caenorhabditis elegans gly-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- UKVGHFORADMBEN-GUBZILKMSA-N Cys-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UKVGHFORADMBEN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YMBAVNPKBWHDAW-CIUDSAMLSA-N Cys-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N YMBAVNPKBWHDAW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N Glu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- KFMBRBPXHVMDFN-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCNC(N)=N KFMBRBPXHVMDFN-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N Gly-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108700012441 IGF2 Proteins 0.000 description 1
- SFBODOKJTYAUCM-UHFFFAOYSA-N Ipriflavone Chemical compound C=1C(OC(C)C)=CC=C(C2=O)C=1OC=C2C1=CC=CC=C1 SFBODOKJTYAUCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N Lys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000011720 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 1
- MTBVQFFQMXHCPC-CIUDSAMLSA-N Met-Glu-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MTBVQFFQMXHCPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N Thr-Glu-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- JLNMFGCJODTXDH-WEDXCCLWSA-N Thr-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O JLNMFGCJODTXDH-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ZOBLBMGJKVJVEV-BZSNNMDCSA-N Tyr-Lys-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O ZOBLBMGJKVJVEV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VBNWKIADIBAREY-UHFFFAOYSA-N acetic acid nickel Chemical compound [Ni].CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O VBNWKIADIBAREY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 108010003914 endoproteinase Asp-N Proteins 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 230000006203 ethylation Effects 0.000 description 1
- 238000006200 ethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960005431 ipriflavone Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány egy új proteinre, a bázikus oszteoblasztnövekedési faktor ΙΙ-re [basic osteoblast growth factor II bOGF-II] - ez a faktor az oszteoblaszt-növekedést stimulálja -, továbbá a protein termelésére alkalmas módszerekre vonatkozik.
Az emberi csontok a reszorpció (felszívódás) és rekonstitúció (helyreállítás) ismétlődő folyamata révén mindig újjáalakulnak. A folyamatban az oszteoblasztokat és oszteoklasztokat olyan sejteknek tekintjük, amelyek főként a csontképződésért, illetve csontfelszívódásért felelősek. A csontsejtekben végbemenő rendellenes csontanyagcsere által okozott betegségek jellemző példája az osteoporosis (csontritkulás). Ismert, hogy ezt a betegséget egy olyan állapot váltja ki, amelyben az oszteoklasztok által végzett csontfelszívódás túlhaladja az oszteoblasztok által végzett csontképzést, azonban az osteoporosis mechanizmusa még nem teljesen felderített. Az osteoporosis fájdalmat okoz a csontokban, a csontokat törékennyé teszi, amely töréshez vezet. Minthogy az osteoporosis növeli az ágyhoz kötött öreg emberek számát, ez a betegség szociális kérdéssé vált az öreg emberek növekvő számával. Ezért valószínű, hogy a betegség kezelésére hatékony gyógyszerek kifejlesztésére kerül sor. Azt gondoljuk, hogy a rendellenes csontanyagcsere által okozott csonttömegcsökkenést azzal kezelhetjük, ha gátoljuk a csontfelszívódást és javítjuk a csontképződést vagy javítjuk a kiegyensúlyozott anyagcserét.
A csontképzést valószínűleg a növekedés és differenciálódás stimulálásával, vagy az oszteoblasztok aktiválásával segíthetjük elő. Legújabban a citokinek - amelyek stimulálják az oszteoblasztok növekedését és differenciálódását - keltettek általános figyelmet, és behatóan tanulmányozták ezeket a sejteket. Számos citokinről megállapították, hogy stimulálják az oszteoblasztok növekedését, ilyenek például a fibroblaszt növekedési faktor [FGF=fibroblast growth factor; S. B. Rodan et al., Endocrinology, 121, 1917 (1987)], az inzulinszerű növekedési faktor I [IGF-I=insulin-like growth factor; J. M. Hock et al., Endocrinology, 122, 254 (1988)], az inzulinszerű növekedési faktor II [IGFII =insulin-like growth factor-II; T. McCarthy et al., Endocrinology, 124, 301 (1989)] és a csont morfogenetikus protein (BMP=bone morphogenetic protein; T. K. Sampath et al., J. Bioi. Chem., 267, 20532 (1992); R. Knutsen et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 194, 1352 (1993); Akira Yamaguchi et al., Zikken Ikagy, 10, 2003 (1992)]. Több citokinről közölték, hogy stimulálják az oszteoblasztok differenciálódását, ilyenek például a transzformáló növekedési faktor-β [TGF-P=trans forming growth factor-β; M. Cantrella et al., J. Bioi. Chem., 262, 2869 (1987)], inzulinszerű növekedési faktor (IGF=insulin-like growth factor) és a csont morfogenetikus protein [Y. Takuwa et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 174,96 (1991); R. Knutsen et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 194, 1352 (1993)]. Ezek a citokinek a csontképzés stimulálása révén valószínűleg hatásos gyógyszerek lehetnek a csonttömeg javítása terén: néhány citokin, így például a csont morfogenetikus proteinek jelenleg klinikai kipróbálás alatt vannak, és vizsgálják a csontbetegségekben szenvedő betegek gondozásában kifejtett hatásukat.
A csontbetegségek kezelésére és a kezelés időtartamának lerövidítésére jelenleg klinikailag használt gyógyszerek közül megemlítjük például a dihidroxi-D3 vitamint, a kalcitonint és származékait, a hormonokat, ilyenek az ösztradiol, az ipriflavont és a kalcium készítményeket. Ezek a gyógyszerek azonban nem adnak kielégítő terápiás hatást, s ezért újabb, gyógyszerként alkalmazható anyagok kifejlesztése kívánatos. Mint említettük, a csontmetabolizmust a csontfelszivódás és csontképzés egyensúlya szabályozza. Számítani lehet ezért a citokineknek - amelyek az oszteoblaszt-növekedést és az oszteogenezist stimulálják - gyógyszerré való kifejlesztésére a csontbetegségek, így az osteoporosis kezelése céljára.
Az előbbiek alapján behatóan kutattuk az oszteoblaszt-növekedési faktorokat, és egy új oszteoblasztnövekedési faktort találtunk. Eljárást dolgoztunk ki a protein nagy koncentrációban való feldúsítására, és hatékony tisztítására.
Izoláltunk egy cDNS-klónt, amely ezt a proteint kódolja, felhasználva a natív bOGF-II protein részleges aminosavszekvenciáit. Ezenfelül géntechnológiai technikákkal, ennek a cDNS-nek a segítségével állítottunk elő bOGF-II-t. A találmány tárgyát egy új oszteoblasztnövekedési faktor (protein) és a protein hatékony előállítási eljárásai képezik.
Állati sejtekkel kondicionált táptalajokat szűrtünk, és megtaláltuk az oszteoblaszt-növekedési faktort az IMR-90 humán fibroblaszttal (ATCC-CCL 186) kondicionált táptalajban. Vizsgáltuk az IMR-90 sejtek tenyésztési feltételeit, és kidolgoztuk a sejtek tenyésztési módszerét timföldkerámia törmeléken, amikor is a táptalajban nagy koncentrációban dúsul fel az oszteoblaszt-növekedési faktor. Kidolgoztuk a bOGF-II hatékony tisztítási módszerét ioncserélő oszlop és/vagy heparinoszlop kombinációjával.
Meghatároztuk a bOGF-II protein aminosavszekvenciáit, ezen aminosavszekvenciák alapján megterveztük a primereket és bOGF-II cDNS-fragmentumokat kaptunk IMR-90 sejtek egy cDNS-tárából.
Egy találmány szerinti teljes hosszúságú proteint kódoló cDNS-klónt az IMR-90 sejtek cDNS-tárából hibridizálással izoláltunk, szondaként használva a cDNSfragmentumot. Ezenkívül módszert dolgoztunk ki a rekombináns bOGF-II termelésére a cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral transzformált sejtek táptalajban való tenyésztésével.
A találmány a következő tulajdonságokkal jellemzett proteinre vonatkozik: 1. humán fibroblaszt sejtekből származik, 2. molekulatömege körülbelül 15 kD nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE), redukáló és nem redukáló feltételek mellett meghatározva, 3. kationcserélővei és heparinnal szemben nagy affinitással rendelkezik, 4. 10 percen át 70 °C-on melegítve csökken oszteoblaszt-növekedésre gyakorolt aktivitása, 5. 10 percen át 90 °C-on hevítve inaktívvá válik. A találmány szerinti bOGF-II nyilvánvalóan különbözik az ismert oszteoblaszt-növekedési faktoroktól N-terminális aminosavszekvenciájában. A bOGF2
HU 220 130 Β
II N-terminális aminosavszekvenciáját az 1. és 2. számú szekvencia írja le.
A találmány a bOGF-II termelésére szolgáló eljárásra is vonatkozik, amely a következő lépésekből áll: 1. humán fibroblasztokat tenyésztünk, 2. a táptalajt heparinoszlopon engedjük át, 3. kioldunk egy adszorbeálódó frakciót, 4. az eluátumot anioncserélő oszlopon engedjük át és így egy nemadszorbeálódó frakciót kapunk, 5. a frakciót kationcserélő oszlopra visszük, és 6. a célproteint heparinoszlopon tisztítjuk.
A találmány szerinti tisztítási eljárásnak megfelel minden olyan metodika, amelynek ugyanaz a hatása, mint amit akkor kapunk, ha a táptalajt heparin-Sepharose-zal stb. keverjük össze tételenkénti (batchwise) műveletekben, vagy ha oszlopon kezeljük egyszerű módon, amikor is a táptalajt heparin-Sepharose oszlopon stb. folyatjuk keresztül.
A bOGF-II a találmány szerint eredményesen, nagy kitermeléssel izolálható humán fíbroblaszt tenyészet táptalajából. A bOGF-II izolálása a proteinek biológiai anyagokból való tisztításának általános eszközein alapul, felhasználva a bOGF-II célprotein fizikai és kémiai tulajdonságait. Például a koncentrálási eljárás általános biokémiai technikákat tartalmaz, például ultraszűrést, liofilizálást és dializálást. A tisztítási eljárás a proteinek tisztítására alkalmas számos technika kombinációját tartalmazza, így az ioncserés kromatográfiát, affinitáskromatográfiát, gélszűréses kromatográfiát, hidrofób kromatográfiát, reverz fázisos kromatográfiát és a preparatív gélelektroforézist. Előnyős az IMR-90 humán fíbroblaszt. Az IMR-90 humán fíbroblaszt tenyésztő táptalajt úgy kapjuk, hogy az IMR-90 humán fibroblaszt sejteket kerámiára abszorbeáljuk, majd 5% fetális borjúszérummal kiegészített DMEM táptalajban, hengeres palackokban tenyésztjük stacionárius állapotban, körülbelül egy hétig. A tisztításnál előnyös, ha 0,1% CHAPS (3-[3-kolamido-propil)-dimetil-ammónium]-l-propán-szulfonát) mint felületaktív anyag van a pufferben.
A találmány szerinti proteint úgy tisztítjuk, hogy a tenyésztő táptalajt heparinoszlopra (heparin-Sepharose CL6Bi Pharmacia) visszük, 2 M nátrium-klorid tartalmú 10 mM trisz.HCl pufferrel (pH 7,5) eluáljuk, a kioldott frakciót Q anioncserélő oszlopra (HiLoad-Q/FF, Pharmacia) visszük, leszedünk egy nem adszorbeálódó frakciót és a kapott frakciót S kationcserélő oszlopra (HiLoad-S/HP, Pharmacia) visszük. Itt három csúcs válik szét, bOGF-I (0,15 M NaCl), bOGF-II (0,35 M NaCl) és bOGF-III (0,55 M NaCl) olyan sorrendben, hogy az aktivitás az alacsonyabb nátrium-klorid-koncentrációknál oldódik le. A bOGF-II ezt követően ismételt heparinoszlop-kromatográfiával (heparin-5PW, Toso Co.) izolálható, és az előzőekben leírt tulajdonságok alapján azonosítható. Valószínű, hogy a bOGF-III protein bázikus fíbroblaszt növekedési faktor a következő vizsgálati eredmények alapján 70 °C-on 10 percig melegítve inaktiválódik, körülbelül 1,8 M nátriumklorid mellett oldódik le heparin 5PW-oszlopról, és bázikus fibroblaszt-növekedési faktor elleni antitest inaktiválja.
Módszert fejlesztettünk ki a rekombináns bOGF-II termelésére. A módszer a következő három lépésből áll. Először bOGF-II aminosavszekvenciákat használunk oligonukleotid primerek tervezéséhez. Másodszor, PCR sokszorozással, a primereket használva, egy bOGF-II cDNS-fragmentumhoz jutunk. Végül a teljes hosszúságú bOGF-II-t kódoló cDNS-klónt izoláljuk IMR-90 sejtek cDNS-tárából hibridizálás révén, a cDNS-fragmentumot szondaként használva. Ezután a bOGF-II-t izoláljuk és a sejtek tenyészlevéből tisztítjuk. Úgy járunk el, hogy olyan vektorral transzfektált gazdasejteket tenyésztünk, amely expressziós promotert tartalmaz és a teljes hosszúságú bOGF-II-t kódoló cDNS-t. A gazdasejteket eukarióta sejtek közül - ilyenek az emlőssejtek (például a kínai hörcsög petefészek sejt) - vagy prokarióta sejtek közül - ilyenek a baktériumok (például E. coli) - választjuk ki.
A találmány olyan proteinekre vonatkozik, amelyeknek az aktivitása az oszteoblasztok növekedését stimulálja. Ezek a proteinek a leírt aminosavszekvenciát mint részt tartalmazzák. A találmány a protein cDNS-ére is vonatkozik.
Az OGF-aktivitást úgy határozhatjuk meg, hogy oszteoblasztos sejtvonalakat vagy normál oszteoblasztokat használunk célsejtekként, és méijük a 3H-timidin sejtekbe való beépülésének megnövekedését. Előnyös, ha a célsejt a MC3T3-E1 egér oszteoblasztos sejtvonal [J. Órai. Bioi., 23, 899 (1981); J. Cell. Bioi., 96, 191 (1983)]. Közölték, hogy a sejt D3-vitaminra és parathyreoid hormonra reagál és in vitro ugyanúgy elmeszesedik, mint in vivő. Az OBF-aktivitást előnyösen szérummentes táptalajban mérjük, és pontosan, nagy érzékenységgel értékelhető a 3H-timidin beépülés mérésével.
A bOGF-II gyógyszerkészítményként használható csökkent csonttömeg kezelésére és javítására osteoporosis esetén és más olyan betegségekben, amelyekben rendellenes a csontmetabolizmus. Használható antigénként is a betegség immunológiai diagnózisára.
A bOGF-II gyógyszerkészítmény előállításához formulálható és orálisan vagy parenterálisan alkalmazható. A készítmény a bOGF-II-t mint hatóanyagot tartalmazza, és biztonságosan alkalmazható emberekben. Gyógyszerkészítmények lehetnek például injekciós készítmények vagy intravénás cseppinfúziók, kúpok, nazális készítmények, szublinguális készítmények és tapaszok perkután abszorpcióhoz. Az injekciós készítmény a bOGF-II farmakológiailag hatékony mennyiségének és egy gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyagnak a keverékét tartalmazza. A vivőanyag olyan hordozó/aktivátor lehet, amelyet általában injekciós készítményekhez adagolnak, ilyenek például az aminosavak, cukrok, cellulózszármazékok és más szerves/szervetlen vegyületek. Amikor elegyítjük a bOBG-II-t a hordozóval/aktivátorral injekció készítéséhez, szükség szerint hozzáadhatunk pH-beállító anyagot, puffért, stabilizáló, szolubilizáló szert stb.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik.
Az 1. ábrán a bOGF-II-frakció kationcserélő oszlopon (HiLoad-S/HPM, 2,6x10 cm, Pharmacia Co.) kapott elúciós képe látható. Az 1-es csúcs a bOGF-I-nek,
HU 220 130 Β a 2-es csúcs a bOGF-II-nek és a 3-as csúcs a bOGF-IIInak felel meg.
A 2. ábra a bOGF-II-frakció affinitásoszlopon (Heparin 5PWM, 0,8 χ 7,5 cm, Toso Co.) kapott elúciós képét mutatja.
A 3. ábrán a bOBG-II nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE), nem redukáló körülmények mellett kapott képe látható.
Az 1-es nyomsáv molekulatömeg-markereket tartalmaz, a 2-es nyomsáv mutatja az A frakciót, a 3-as nyomsáv mutatja a B frakciót, a 4-es nyomsáv mutatja a C frakciót, az 5-ös nyomsáv mutatja a D frakciót, és a 6-os nyomsáv mutatja az E frakciót.
Az A-E frakciók vonatkozásában lásd a 2. ábrát.
A 4. ábra a redukált PE bOGF-II-ből, Asp-N endoproteináz (Bayringer Co.) emésztéssel kapott peptidek reverz fázisú oszlopon (OD-300, Cl8, 2,1x200 mm, Applied Biosystems Co.) kapott elúciós képét mutatja be.
Az 5. ábra a MC3T3-El-gyel tesztelt bOGF-II aktivitását mutatja be.
A 6. ábrán a pQE30-OGF-II plazmid szerkezete látható. A 6His jelentése hisztidincsoport; T5 fág promoter jelentése T5 fág promoter; bla jelentése ampicillinrezisztencia gén; Őri jelentése E. coli replikációs origo; bOGF-II jelentése bOGF-Π cDNS.
A 7. ábra az MC3T3-El-gyel tesztelt His6-bOGF-II aktivitását mutatja be.
A találmány részletes leírására a következő példákban kerül sor. Meg kell jegyezzük azonban, hogy a példák csupán a szemléltetést szolgálják és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
1. példa
A természetes bOGF-II típus termelése (1) IMR-90 humán fibroblaszttal kondicionált táptalaj előállítása
IMR-90 humán fetális tüdőfibroblaszt (ATCC-CCL 186) sejteket tenyésztettünk timföldkerámia szemcséken (80 g) (timföld: 99,5%; gyártja Tosiba Ceramic K. K.) DMEM táptalajban (Gibco Co.), kiegészítve 5% FCS-sel és 10 mM HEPES pufferrel (500 ml/hengeres palack), stacionárius fázisban, 37 °C-on 5% szén-dioxid jelenlétében, 7-10 napon át. A tenyésztést 60 darab hengeres palackban (490 cm2, 110x171 mm; Coning Co.) végeztük.
A kondicionált táptalajt learattuk, és friss táptalajt adagoltunk úgy, hogy 30 liter IMR-90 kondicionált táptalajt kapjunk egy tétel tenyészetben. A kapott kondicionált táptalaj minta 1 elnevezést kapott.
(2) Módszer oszteoblaszt növekedés aktivitás vizsgálatára
Az oszteoblaszt növekedési faktor aktivitását úgy határoztuk meg, hogy mértük a DNS beépülését MC3T3E1 egér oszteoblasztokba (dr. Masayoshi Kumegawa, a Meikai Egyetem Fogászati Fakultásának professzora bocsátotta rendelkezésünkre). Pontosabban, a nukleinsavmentes, 0,2% marha-szérumalbuminnal (BSA) kiegészített α-MEM táptalajjal (Gibco Co.) hígított mintaoldatot (50 μΐ) 96 tartályos mikrotitráló lemezre mértük. Ezután
MCMT3-E1 sejtekkel oltottuk be a lemezre vitt aMEM táptalajt (2 χ 103 sejt/50 μΐ), és a sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid-tartalmú légtérben tenyésztettük 15-20 órán át. Tenyésztés után foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal 0,1 mCi/ml-re hígított 10 μΐ 3H-timidint (TRK686; Amersham Co.) mértünk minden tartályba. Két óra múlva a sejtekbe beépült 3H-timidin radioaktivitását Mátrix β counter készülékkel (Packard Co.) mértük.
(3) A bOGF-II tisztítása
i) Tisztítás heparin-Sepharose CL-6B oszlopon
Az IMR-90-nel kondicionált táptalajt (körülbelül 90 liter; minta 1) 0,22 pm-es membránszűrőn (hidrofil Milidisk, 2000 cm1 2; Millipare Co.) szűrtük, és három részre osztottuk. Az egyes részleteket 10 mM trisz.HCl 0,3 M NaCl (pH 7,5) oldattal egyensúlyba hozott heparin-Sepharose CL-6B oszlopra (5x4,1 cm; 80 ml) vittük fel. A mosást 10 mM trisz-HCl (pH 7,5) oldattal végeztük 500 ml/óra átfolyási sebesség mellett. Egy heparin-Sepharose CL-6B-re adszorbeálódó proteinfrakció oldódott ki 10 mM trisz-HCl-2 M NaCl (pH 7,5) mellett. Ez a frakció minta 2 elnevezést kapott.
ii) Tisztítás HiLoad-QFF oszlopon
A heparin-Sepharose-ra adszorbeálódó frakciót (minta 2) 0,1% végső koncentrációig CHAPS hozzáadásával kiegészített 10 mM trisz.HCl (pH 7,5) oldattal szemben dializáltuk, majd egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. A kapott oldatot két részre osztottuk. Az egyes részeket ezután anioncserélő oszlopra (HiLoad-QFF, 2,6 χ 10 cm; Pharmacia Co.) vittük fel, amelyet előzőleg 0,1% CHAPS-tartalmú 50 mM trisz.HCl oldattal (pH 7,5) hoztunk egyensúlyba, és egy nem adszorbeálódó frakciót (1000 ml) kaptunk. Ez a frakció minta 3 elnevezést kapott.
iii) Tisztítás HiLoad-S/HP oszlopon
A HiLoad-Q nem adszorbeálódó frakciót (minta 3) kationcserélő oszlopra (HiLoad-S/HP, 2,6 χ 10 cm, Pharmacia Co.) vittük, amelyet előzőleg CHAPS-tartalmú 50 mM trisz.HCl oldattal (pH 7,5) hoztunk egyensúlyba. A mosást 0,1% CHAPS-tartalmú 50 mM trisz.HCl oldattal (pH 7,5) végeztük, majd az adszorbeált proteint 0-1 M nátrium-klorid lineáris gradiensével eluáltuk 100 percen át 8 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Az eluátumot 12 ml-es frakciókként szedtük. Minden frakció (10 μΐ) OGF-aktivitását a (2) alatt leírt módszer szerint határoztuk meg. Három csúcsban találtunk OGFaktivitást (1-es csúcs: bOGF-I, 2-es csúcs: bOGF-II, 3as csúcs; bOGF-III). Az eredményt az 1. ábra mutatja.
Feltételeztük, hogy a 3-as csúcs bFGF, mivel a 3-as csúcsban az OGF-aktivitás 70 °C-on 10 percig melegítve inaktiválódik, körülbelül 1,8 M nátrium-kloridnál oldódik le a heparinoszlopról és antihumán bFGF-antitest neutralizálja.
iv) Tisztítás affinitásoszlopon (heparin-SPW)
A 2-es csúcsfrakciót (bOGF-II; 120 ml) 240 ml-re hígítottuk 50 mM trisz.HCl - 0,1% CHAPS (pH 7,5) oldattal, majd 50 mM trisz.HCl - CHAPS (pH 7,5) oldattal kiegyensúlyozott affmitásoszlopra (heparin-5PW, 0,8 χ 7,5 cm; Toso Co.) vittük fel. Az adszorbeált proteint 0-2 M nátrium-klorid lineáris gradiensében 60 perc alatt eluáltuk 0,5 ml/perc átfolyási sebesség
HU 220 130 Β mellett. Az eluátumot 0,5 ml-es frakciókként szedtük. Minden frakciót (2 μΐ) OGF-aktivitásra vizsgáltuk. Egy OGF-aktivitású frakció (5 ml) körülbelül 1,0-1,2 M nátrium-kloridnál oldódott le, s ez a frakció minta 4 elnevezést kapott.
A minta 4-et (5 ml) 10 ml 50 mM trisz.HCl-CHAPS (pH 7,5) oldattal hígítottuk és 50 mM trisz.HCl-CHAPS (pH 7,5) oldattal kiegyensúlyozott affinitásoszlopra (heparin-5 PW, 0,8 χ 7,5 cm; Toso Co.) vittük fel. A mosást 50 mM trisz.HCl-CHAPS (pH 7,5) oldattal végeztük, s az adszorbeált protein 0-2 M nátrium-klorid lineáris gradiensével, 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáltuk. Az eluátumot 0,5 ml-es frakciónként szedtük. Minden frakciót (2 μΐ) OGF-aktivitásra vizsgáltunk. Megállapítottuk, hogy egy körülbelül 1,0-1,2 M nátrium-kloridnál leoldódó frakciónak OGF-aktivitása van, ez a frakció minta 5 elnevezést kapott.
A minta 5-öt (5 ml) 10 ml 50 mM trisz.HCl-CHAPS (pH 7,5) oldattal hígítottuk, és 50 mM trisz.HCl-CHAPS (pH 7,5) oldattal kiegyensúlyozott affinitásoszlopra (heparin-5PW, 0,5 χ 7,5 cm; Toso Co.) vittük fel. A mosást 0,2 M nátrium-klorid és 0,1% CHAPS-tartalmú 50 mM trisz.HCl (pH 7,5) oldattal végeztük. Az adszorbeált proteint 0,2-0,8 M nátrium-klorid lineáris gradiensében oldottuk le 60 perc alatt, 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Az eluátumot 0,5 ml-es frakciókként szedtük. Minden frakciót (4 μΐ) OGF-aktivitásra vizsgáltunk. Az eredményt a 2. ábrán mutatjuk be.
(4) A bOGF-II molekulatömege
A kapott OGF-frakciót öt frakcióra osztottuk, frakciónként 2 ml-re (2. ábra, A-E frakciók). Minden frakciót (100 μΐ) SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáltunk, nem redukáló körülmények mellett. Pontosabban, az A-E frakciók mindegyikét (100 μΐ) vízzel szemben dializáltuk, ezután liofilizáltuk. A kapott anyagot 1,5 μΐ 10 mM trisz.HCl (pH 8), 1 mM EDTA, 2,5% SDS, 0,01 brómfenolkék elegyében oldottuk fel, és 37 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. A minta 1 μΐ-ét SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, 8-25% akrilamid gradiens gélben, (Pharmacia Co.) analizáltuk. Az elektroforézishez használt készüléket (Fást System) a Pharmacia cég gyártja. A következő molekulatömegmarkereket használtuk: foszfolipáz b (94 kD), szérumalbumin (67 kD), ovalbumin (43 kD), szénsavhidráz (30 kD), tripszin inhibitor (20,1 kD), a-laktalbumin (14,4 kD). Elektroforézis után ezüstfestéssel tettük láthatóvá a proteinsávokat a Pharmacia Co. technológiai előirata szerint. Az eredmény a 3. ábrán látható.
A 15 kD molekulatömegnél kimutatott proteinsáv arányos volt az OGF-aktivitással. Csak a D és E frakciók tartalmaztak 15 kD proteinsávot. Ha ezt a proteint SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel, redukáló körülmények között analizáltuk, majdnem ugyanolyan molekulatömegű egyetlen proteinsávot kaptunk, mint amilyet a nem redukáló körülmények között végzett vizsgálatban.
(5) N-terminális aminosavszekvencia meghatározása
A kapott D frakciót (500 μΐ) reverz fázisú oszlopra (BV-300, C4, 2,1 χ 220 mm; Applied Biosystems Co.) vittük, amelyet előzőleg 0,1% trifluor-ecetsav (TFA), 10% acetonitril elegyével hoztunk egyensúlyba, majd
10-60% acetonitril lineáris gradiensével eluáltuk 50 percen át, 0,2 ml/perc átfolyási sebesség mellett, s így kaptuk a sótlanított, koncentrált mintát. Ezt a mintát proteinszekvenátorral (477A-120A; Applied Biosystems Co.) analizáltuk, hogy meghatározzuk az N-terminális aminosavszekvenciát. A kapott peptid aminosavszekvenciáját az 1. számú szekvencia mutatja. A szekvenciában az - Xaa - jel a még nem azonosított aminosavat jelenti.
(6) A protein aminosavszekvenciájának a meghatározása
A C frakciót (2000 μΐ) bekoncentráltuk, feloldottuk 300 μΐ 10 mM EDTA, 7 M guanidin-hidroklorid és 1 mg ditiotreitol tartalmú 0,5 M trisz.HCl (pH 8,5) oldatban, szobahőmérsékleten 4 órán át inkubáltuk, ekkor 2 μΐ 4-vinil-piridint adtunk hozzá kiegészítésképpen, majd sötét helyen, szobahőmérsékleten, egy éjszakán át állni hagytuk piridil-etilezés (PE) végett. A mintához 3 μΐ 25%-os TFA-t adtunk. Az elegyet reverz fázisú oszlopra (BU-300, C4, 4,6x30 mm, Applied Biosystems Co.) vittük, amelyet előzőleg 0,1% TFA-tartalmú 10%-os acetonitrillel hoztunk egyensúlyba. Az eluálást 10-50% acetonitril lineáris gradiensével végeztük 50 percen át, 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett, s ekkor redukált PE bOGF-II-t kaptunk. A redukált PE bOGF-II negyedrészét protein szekvencia analizátorral (477A-120A, Applied Biosystems Co.) analizáltuk Nterminális aminosavszekvencia meghatározás végett. A pepiidre kapott aminosavszekvenciát a 2. számú szekvencia írja le.
A redukált PE bOGF-II fennmaradt háromnegyed részét 0,5 μΐ AspN endoproteinázzal (Boehringer-Mannheim Co.) emésztettük 1 M karbamidtartalmú 50 mM foszfátpufferben (pH 8,5; 50 μΐ) 15 órán át, majd 0,1% TFA-val kiegyensúlyozott reverz fázisú oszlopra (OD300, C18, 2,1 x220 mm; Applied Biosystems Co.) vittük, ahonnan 0-40% acetonitril lineáris gradiensével eluáltuk 80 percen át, 0,2 ml/perc átfolyási sebességgel. Az elúciós képet a 4. ábra mutatja be. Az észlelt 5 csúcsot proteinszekvenátorral (477A-120A, Applied Biosystems Co.) analizáltuk N-terminális aminosavszekvenciára. A kapott öt peptid aminosavszekvenciáját a 3-7. számú szekvenciák írják le.
(7) A bOGF-II hatása a MC3T3-E1 sejtek proliferációjára
A D frakció protein koncentrációját Lowry módszerével határoztuk meg, standardként BSA-t (bovin szérumalbumin) használva. A mintát 100 mg/ml-re hígítottuk és meghatároztuk. OGF-aktivitását a (2) pont alatt leírt módszer szerint határoztuk meg, a szomszédos dózisok között kétszeres különbséggel. Az eredményt az 5. ábra mutatja be.
2. példa
A bOGF-II előállítása géntechnológiával (1) A bOGF-II gén klónozása
1. A bOGF-II gén cDNS-ének klónozása PCR-rel
A cDNS sokszorozásához egy primer készletet állítottunk elő az OGF-II-re meghatározott aminosavszekvencia alapján. Azaz a Glu-Thr-Glu-Tyr-Gly-Pro5
HU 220 130 Β
Cys N-terminális aminosavszekvenciát kódoló DNS levezetését követően egy következő szekvenciákat tartalmazó primerkeveréket szintetizáltunk: 5’GA(A/G)ACNGA(A/G)TA(T/C)GGNCCNTG-3 ’. A szekvenciában az A/G A-t vagy G-t jelent, a T/C T vagy C-t jelent, és az N A-t, G-t, C-t vagy T-t jelent. Egy belső aminosavszekvenciából az Asp-Lys-LysGly-Phe-Tyr-Lys szekvenciát kódoló DNS-t vezettük le és primerkeveréket szintetizáltunk, amely a következő komplementer szekvencialáncot tartalmazta: 5’TT(A/G)TA(A/G)AANCC(C/T)TT(T/C)TT(A/G)TC3’. A primerek szintetizálásához a Perkin Elmer-féle DNA Synthesizer 394 készüléket használtuk. A polimeráz láncreakcióhoz (PCR) a kétféle prímért (200-200 pmol) és templát DNS-ként az IMR-90 humán fetális tüdőfibroblaszt poliA RNS-t (1 pg) használtuk. A használt enzim a Takara Shuzo Co., Ltd. által gyártott Ex Taq volt. A reakcióelegy 5 pl ΙΟχΕχ Taq puffért, 4 pl 2,5 mM dNTP-t, 1 pl cDNS-oldatot, 0,25 pl Ex Taq enzimet, 29,75 pl desztillált vizet és az egyes primerekből 5 pl-t (40 pl) tartalmazott 50 pl össztérfogatban. A reakció körülményei a következők voltak: a reakcióelegyet 3 percig 95 °C-on tartottuk, majd 30 ciklusban háromlépéses inkubálást végeztünk, mégpedig 95 °C-on 3 percig, 50 °C-on 30 másodpercig és 70 °C-on 2 percig. E reakciók után a reakcióelegyet 5 percig 70 °C-on tartottuk. Miután a reakció teljesen végbement, az elegyből 8 pl-t 4%-os agarózgélben elektroforetizáltunk; számos sávot kaptunk, köztük egy 120 bp méretű fragmentumot észleltünk. Ezután 4,5 pl reakcióelegyet, pCRII (eredeti TA klónozó kit; Invitrogen Co.) klónozóvektort 0,5 pl-ben és DNS ligáié kitet (2-es változat; liquid 1; Takara Shuzo Co., Ltd.) 5 pl-ben kevertünk össze, és az elegyet 16 °C-on tartottuk egy éjszakán át. E ligáló reakcióelegy 5 pl-ét használtuk DH5a E. coli (BRL Co.) transzformálásához. A kapott ampicillinrezisztens baktériumokba beépített plazmidban lévő fragmentumok hosszát PCR-re határoztuk meg, és négy olyan törzset izoláltunk, amelyek körülbelül 120 bp méretű beépített fragmentumot tartalmaztak. A reakcióban az említett két prímért használtuk. A négy izolált törzsből tisztítottuk a plazmid DNSt, és meghatároztuk a beépített fragmentumok DNSszekvenciáját. A nukleotidszekvenciából kikövetkeztetett aminosavszekvencia analízisekor mindegyik klón leolvasási kerete egybeesett az OGF-II proteinre meghatározott aminosavszekvenciával. Az egyik klónnal (1. számú klón) a következő kísérletet végeztük.
2. A teljes hosszúságú OGF-II cDNS klónozása Az 1. számú klón plazmidját tisztítottuk, EcoRI restrikciós enzimmel (Takara Shuzo Co., Ltd.) emésztettük és agarózgélben elektroforetizáltuk, majd a körülbelül 120 bp méretű OGF-II cDNS-t izoláltuk. A fragmentumot 32P-vel jeleztük, Megaprime kit (Amersham Co.) és a32P-dCTP használatával. A jelzett fragmentum szondaként szolgált a következő kísérletben. Az IMR90 humán fetális tüdőfibroblaszt poliA+ RNS-ből (5 pg) kettős szálú cDNS-t szintetizáltunk a Great Lengths cDNS Synthesis kit-hez (Clontech Co.) mellékelt használati utasítás szerint. The poliA+ RNS-t Fást
Track (Stratagene Co.) segítségével készítettük. A kettős szálú cDNS szintetizálásához használt módszert az alábbiakban röviden leírjuk. A poliA+ RNS-t (5 pg) és az oligo(dt)25(dN) prímért összekevertük, és desztillált víz hozzáadásával 12,5 pl végtérfogatra egészítettük ki az oldatot, amelyet 70 °C-on tartottunk 3 percig, majd 2 percig jégen hűtöttük le. Ehhez az oldathoz hozzáadtunk 3,2 pl desztillált vizet, 5 pl 5 χ Elsőszál puffért, 0,5 pl DTT-t (ditiotreitol), 1,3 pl dNTP-t (20-20 mM) és 2,5 pl (500 egység) MMLV-t (RNázH~), és az elegyet 42 °C-on tartottuk. Ezután hozzáadtunk 123,5 pl desztillált vizet, 40 pl 5 χ Másodikszál puffért, 1,5 pl dNTP-t (20-20 mM), és 10 pl Másodikszál enzimkoktélt, majd az elegyet 16 °C-on tartottuk 2 órán át. Ehhez a reakcióelegyhez 15 egység T4 polimerázt adtunk; az elegyet ezután 16 °C-on tartottuk 30 percig, és a reakciót 10 pl 0,2 M EDTA hozzáadásával állítottuk le. Ezután kloroformos és izo-amil-alkoholos kezelés és etanolos kicsapás következett. A kétszálú cDNS végéhez EcoRI-Sall-NotI linkért (Elantech Co.) kapcsoltunk. Ez után a kapott anyagot ZAP Express fág DNS-be (Stratagene Co.) építettük be, amelyet előzőleg EcoRI restrikciós enzimmel hasítottunk és CIAP (bovin here alkalikus foszfatáz) hozzáadásával kezeltünk. A kapott rekombináns DNS-t pakoltuk be, és ezzel fertőztünk XLl-Blue MRF’ E. coli sejteket (Stratagene Co.); NZY agar táptalajon (0,5% nátrium-klorid, 0,2% magnézium-klorid-víz (17), 0,5% élesztőkivonat, 1% NZ amin, pH 7,5, 1,5% agar) plakkok képződtek. A pakoláshoz Gigapack II Gold packaging extraktumot (Stratagene) használtunk. Az agar táptalajon kapott fágot nejlonmembránra (Hybond-N; Amersham Co.) vittük át, és a fág DNS-t fixáltuk. A kapott membránt 100 pg/ml lazacsperma DNS-t (Amersham Co.) tartalmazó hibridizációs pufferbe merítettük, és 4 órán át 65 °C-on tartottuk, ezután ugyanezen pufferbe merítettük, amely a hővel denaturált fent említett 32P-jelzett DNS-szondát (2,5xlO5 cpm/ml) tartalmazta, ezután egy éjszakán át 65 °C-on hagytuk, hogy végbemenjen a hibridizáció. Miután a membránt mostuk, körülbelül egymillió fág közül 3 olyan kiónt tudtunk szelektálni, amelyek OGF-II cDNS-t tartalmaztak. A 3 kiónt két további szűréssel tisztítottuk. Ezután XLl-Blue MRF’ E. coli törzsbéli sejteket fertőztünk a tisztított fággal, majd a fertőzött sejteket az ExAssist helper fággal (Stratagene Co.) is megfertőztük. A tenyészet-felülúszót használtuk az XLOLR E. coli (Stratagene Co.) megfertőzéséhez, s így kanamicinrezisztenssé váltak az E. coli sejtek. Az egyik ilyen E. coli klón plazmid DNS-ének szerkezetét analizáltuk, és meghatároztuk beépített fragmentumának nukleotidszekvenciáját. A szekvenciát a
8. számú szekvencia írja le. A 8. számú OGF-II szekvenciából levezetett aminosavszekvenciát a 9. számú szekvencia írja le. Összehasonlítottuk ezt az aminosavszekvenciát a vad típusú OGF-II aminosavszekvenciával, és megállapítottuk, hogy az előbbiben egy Lys aminosavval több van a C-terminális végen (a 85. aminosav). Ezért az IMR-90 sejtekkel kondicionált táptalajból tisztított C-terminális lizint lehasíthatjuk karboxipeptidázzal (karboxipeptidázokkal). Ez azt jelenti,
HU 220 130 Β hogy mind a három klón tartalmazta azt a DNS-t, amely az OGF-1I N-terminális Glu-Thr-Glu-Tyr szekvenciától 85 aminosavból álló nyílt leolvasási keretet kódol. Meghatároztuk a nyílt leolvasási keretet az első terminátor kodon helyzetétől és az OGF-II proteinből az aminosavszekvenciát. A kapott plazmidok közül egyet pBK-CMV OGF-II elnevezéssel láttuk el (3).
(2) OGF-II cDNS kifejezése E. coliban
A teljes hosszúságú OGF-II cDNS-t PCR-rel sokszoroztuk, majd izoláltuk. A használt primerek a következők voltak: Q30F ’-GGGG ATCCG AG AC AG AATATGGTC-3 ’ és Q30R 5’-CCAAGCTTCTACTTGCTCTGCATACT3’. Ezeket a primereket úgy terveztük, hogy a sokszorozott terméket BamHI és Hindin restrikciós enzimekkel megemészthessük. A pBK-CMV OGF-II (3) mint templát 20 ng-jával és a két príménél (Q30F és Q30R) elvégeztük a PCR-t. A reakcióelegy a következő összetételű volt: 10 μΐ 10 χ ExTaq puffer, 8 μΐ 2,5 mM dNTP, 0,5 μΐ ExTaq, 9,5 μΐ DNS-oldat, 70 μΐ desztillált víz és 1 μΐ primer (100-100 μΜ) 100 μΐ végső térfogatban. Miután a reakcióelegyet 3 percig 95 °C-on tartottuk, 25 ciklusban háromlépéses inkubálást végeztünk a következőképpen: 95 °C-on 3 perc, 50 °C-on 30 másodperc és 70 °C-on 2 perc. A reakciók után a reakcióelegyet 5 percig 70 °C-on tartottuk. A sokszorozás után a primereket Microson 100 készülékkel (Amicon Co.) távolítottuk el, és a PCR-terméket BamHI és HindlII restrikciós endonukleázokkal emésztettük; ezután a terméket 20 ng, előzőleg BamHI-gyel és HindlIImal hasított pQE30 plazmiddal (QIAGEN Co.) kevertük össze, és a ligáláshoz használtuk fel. A ligáló oldattal E. coli XL2-Blue (Stratagene Co.) sejteket transzformáltunk. A kapott ampicillinrezisztens telepek közül egy kiónt - amely a célinszertumot tartalmazta - választottunk el, a DNS-fragmentumok restrikciós enzimes emésztéssel és szekvenálással való analízise révén. A kiónban lévő plazmidnak pQE30-OGF-II nevet adtunk. A plazmidot tartalmazó E. coli XL2-Blue (pQEOGF-II) törzset a NIBH-nél - Agency of Industrial Science and Technology - helyeztük letétbe, „FERM BP-5139” letéti számon. A letétbe helyezett E. coliban lévő plazmid szerkezete a 6. ábrán látható. A törzset rázott super táptalajban (2,5% Bacto-tryptone, 1,5% Bacto élesztőkivonat, 0,5% nátrium-klorid, 50 pg/ml ampicillin) tenyésztettük; amikor a sűrűség elérte a 0,8 OD600 nm értéket, izopropil-p-D-tiogalaktopiranozid-ot (IPTG) adtunk a tenyészethez 0,5 mM végső koncentrációig, és a rázott tenyésztést további 20 órán át folytattuk, hogy az E. coli megtermelje az OGF-II-t. Miután a tenyésztést befejeztük, a törzset összegyűjtöttük; a 15 kD körüli molekulatömegnek megfelelő fő sávot SDS poliakrilamid gélelektroforézissel ellenőriztük. Ez a molekulatömeg jó egyezést mutatott az IMR-90 tenyészet-felülúszóban kapott OGF-II molekulatömegével.
(3) A His6-bOGF-II tisztítása
A bOGF-II gén transzlációjával kapott protein oszteoblaszt-növekedési aktivitásának tesztelésére a gén expresszióját QIA express kit-ek (QIAGEN Co.) használatával végeztük. Ebben a rendszerben egy hisztidinhexamer toldalékot tartalmazó protein képződik, és a tisztítást nitril-triecetsav-nikkel kelátgyanta oszlopon végezzük, amelynek erős az affinitása a hisztidin-hexamer toldalékhoz. Ezt a rendszert általánosan használják a kifejezett proteinek eredményes tisztítására. Ennek a rendszernek a használatakor a bOGF-II olyan formában képződik, hogy N-terminális végén hat hisztidinból álló csoportot tartalmaz (Bis6-bOGF-II). Az IPTG-vel kezelt E. coli 0,35 g-jához 8 M karbamidot és 0,1 M nátrium-foszfátot tartalmazó 1,75 ml 10 mM trisz.HCl-t (pH 8,0) adtunk, és egy órán át szobahőmérsékleten ráztuk. Rázatás után a mintát 12 000 fordulat/perc mellett 15 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk, és a felülúszót leszedtük. A felülúszót hozzáadtuk 8 ml nitriltriecetsav-nikkel kelát gyanta 50%-os szuszpenziójához (QIAGEN Co.), amelyet előzőleg 10 mM trisz.HCl, 8 M karbamid, 0,1 M nátrium-foszfát (pH 8,0) tartalmú oldattal hoztunk egyensúlyba, majd a keveréket 45 percig szobahőmérsékleten ráztuk. A gyantát egy 1,6 cm belső átmérőjű oszlopba töltöttük, és 20 ml 10 mM trisz.HCl, 8 M karbamid és 0,1 M nátrium-foszfát (pH 8,0) tartalmú oldattal mostuk, 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel. Ezután az oszlopot tovább mostuk 10 mM trisz.HCl, 8 M karbamid és 0,1 M nátrium-foszfát (pH 6,3) tartalmú oldattal körülbelül 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel. Végül a cél-His6-bOGF-II-t 10 mM trisz.HCl, 250 mM imidazol, 8 M karbamid és 0,1 M nátrium-foszfát (pH 6,3) tartalmú oldattal eluáltuk, körülbelül 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A tisztított His6-bOGF-II frakciót foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal szemben dializáltuk.
(4) A His6-bOGF-II oszteoblaszt-növekedés aktivitása
A Bis6-bOGF-II oszteoblaszt-növekedési aktivitást úgy teszteltük, ahogyan az 1. példában leírtuk: (2) módszer oszteoblaszt-növekedés aktivitás vizsgálatára. Vagyis a fent leírt tisztított His6-bOGF-II frakciót hozzáadtuk a vizsgálati táptalajhoz, és mértük a 3H-timidin beépülését egér MC3T3-E1 oszteoblaszt sejtekbe. Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be. Ezekből az eredményekből megállapítottuk, hogy a bOGF-II gén transzlációja révén termelt protein ugyanolyan oszteoblaszt-növekedés aktivitással rendelkezik, mint a vad típusú bOGF-II.
Lehetőség ipari felhasználásra
A találmány szerint egy új, oszteoblaszt-növekedési aktivitást kifejtő proteint bocsátunk rendelkezésre és módszereket a protein termelésére. Mivel a találmány szerinti protein oszteoblaszt-növekedési aktivitást fejt ki, gyógyszerként hasznosítható csonttömegcsökkenés - ilyen az osteoporosis - kezelésére, és antigénként használható a betegség immunológiai diagnosztizálásában.
Tájékoztatás a letétbe helyezett mikroorganizmusokról
A mikroorganizmusok letétbe helyezésének helye és címe:
National Institute of Bioscience and Human-Technology
Agency of Industrial Science and Technology
HU 220 130 Β
Ministry of International Trade and Industry 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaragi Prefecture A letétbe helyezés dátuma: 1995. június 19.
A letéti szám: FERM BP-5139
Ezt a letétet az állami letétből (lajstromszám FERM P-14942 1995. május 26.) helyeztük át 1995. június 19-én.
Szekvenciajegyzék 1. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai (A) hosszúság: 25 (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása:
| Glu 1 | Thr | Glu | Tyr | Gly 5 | Pro | Xaa | Arg | Arg | Glu Met Glu Asp Thr Leu 10 15 |
| Asn | Hi s | Leu | Lys | Phe | Leu | Asn | Va 1 | Leu | Ser |
| 20 | 25 |
2. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai (A) hosszúság: 40 (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid
| Glu | Thr | Glu | Tyr | Gly | Pro | Cy s | Arg | Arg | Glu | Me t | Glu | Asp | Thr | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Asn | Hi s | Leu | Lys | Phe | Leu | Asn | Val | Leu | Ser | Pro | Arg | Gly | Va 1 | Xaa |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Ile | Pro | Asn | Cys | Xaa | Lys | Ly s | Gly | Phe | Tyr | |||||
| 35 | 40 |
3. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai (A) hosszúság: 9 (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása:
Asp Val His Cys Tyr Ser 1 5
Me t Gin
Ser
4. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai
| (A) hosszúság: | 12 |
| (B) típus: | aminosav |
| (C) száltípus: | egyszálú |
| (D) topológia: | lineáris |
| (ii) A molekula típusa: | peptid |
| (xi) A szekvencia leírása: | |
| Glu Thr Glu Tyr Gly | Pro Cys Arg Arg Glu Met |
| 1 5 | 10 |
Glu
HU 220 130 Β
5. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai (A) hosszúság:
(B) típus:
(C) száltípus:
(D) topológia:
(ii) A molekula típusa:
(xi) A szekvencia leírása:
Asp Lys Tyr Gly Gin 1 5
Glu
6. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai (A) hosszúság:
(B) típus:
(C) száltípus:
(D) topológia:
(ii) A molekula típusa :
(xi) A szekvencia leírása:
Asp Lys Lys Gly Phe 1 5
Gly Arg Lys Arg Gly 20
7. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai (A) hosszúság:
(B) típus:
(C) száltípus:
(D) topológia:
(ii) A molekula típusa:
(xi) A szekvencia leírása:
Asp Thr Leu Asn His 1 5
Gly Val His lle Pro 20
8. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai (A) hosszúság:
(B) típus:
(C) száltípus:
(D) topológia:
(ii) A molekula típusa:
(vi) Eredeti származás:
(ix) Sajátosság:
(A) Helyzet:
(B) Meghatározási mód:
(xi) A szekvencia leírása:
GAG ACA GAA TAT GGT I CTG AAT CAC CTG AAG ' GTA CAC ATT CCC AAC ' AAG CAG TGT CGC CCT ’ TGG TGT GTG GAT AAG ' aminosav egyszálú lineáris peptid
Pro Leu Pro Gly Tyr 10 aminosav egyszálú lineáris peptid
| Tyr | Lys | Lys | Ly s | Gin 10 |
| Phe | Cys | Trp | Cy s | Va 1 25 |
Cy s aminosav egyszálú lineáris peptid
Leu Lys Phe Leu Asn 10
Asn Cys
258 nukleinsav kettős szálú lineáris cDNS mRNS-hez humán
1...258
E
CCC TGC CGT AGA GAA TTC CTC AAT GTG CTG TGT GAC AAG AAG GGA TCC AAA GGC AGG AAG TAT GGG CAG CCT CTC
Thr
Va 1
ATG
AGT
TTT
CGG
CCA
Thr Lys
Gly Lys 15
Arg Pro
Leu Ser
GAA GAC CCC AGG TAT AAG GGC TTC GGC TAC
Ser Lys 15
Pro Arg 15
ACA 42 GGT 84 AAA 126 TGC 168 ACC 210
HU 220 130 Β
ACC AAG GGG AAG GAG GAC GTG CAC TGC TAC AGC ATG AAG TAG
CAG AGC
252
258
9. számú szekvencia (i) A szekvencia jellemző adatai (A) hosszúság: 85 (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: protein (xi) A szekvencia leírása:
| Glu | Thr | Glu | Tyr | Gly | Pro | Cy s | Arg | Arg | Glu | Me t | Glu | As p | Thr | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Asn | Hi s | Leu | Lys | Phe | Leu | Asn | Val | Leu | Ser | Pro | Arg | Gly | Va 1 | Hi s |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Ile | Pro | Asn | Cys | Asp | Lys | Ly s | Gly | Phe | Tyr | Ly s | Ly s | Lys | Gin | Cys |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Arg | Pro | Ser | Lys | Gly | Arg | Lys | Arg | Gly | Phe | Cys | Trp | Cys | Va 1 | Asp |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Ly s | Tyr | Gly | Gin | Pro | Leu | Pro | Gly | Tyr | Thr | Thr | Lys | Gly | Lys | Glu |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Asp | Val | Hi s | Cys | Tyr | Ser | Me t | Gin | Ser | Ly s | * * * | ||||
| 80 | 85 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (15)
1. Izolált protein, amelynek jellemzői az alábbiak:
(a) molekulatömege körülbelül 15 kD nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDSPAGE) redukáló és nem redukáló körülmények között - végzett meghatározás szerint, (b) erős affinitást mutat kationcserélőkhöz és heparinhoz, (c) oszteoblaszt-növekedést stimuláló aktivitást fejt ki és (d) 70 °C-on 10 percig melegítve aktivitása csökken, 90 °C-on 10 percig melegítve inaktiválódik.
2. Az 1. igénypont szerinti protein, amely humán fibroblaszt sejtekből származik.
3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy N-terminális aminosavszekvenciáját az 1. számú szekvencia írja le.
4. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy N-terminális aminosavszekvenciáját a 2. számú szekvencia írja le.
5. cDNS, amely a 9. számú szekvencia által meghatározott aminosavszekvenciát kódolja.
6. Oszteoblaszt sejt növekedést stimuláló aktivitással rendelkező izolált protein, azzal jellemezve, hogy teljes aminosavszekvenciáját a 9. számú szekvencia írja le.
7. Oszteoblaszt sejt növekedést stimuláló aktivitással rendelkező izolált protein, azzal jellemezve, hogy részként a protein a 9. számú szekvencia által meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazza.
8. Az oszteoblaszt sejt növekedést stimuláló aktivitást kifejtő protein aminosavszekvenciáját kódoló cDNS, ahol a protein tartalmazza a 9. számú szekvencia által meghatározott aminosavszekvenciát.
9. Eljárás oszteoblaszt-növekedést stimuláló protein termelésére, azzal jellemezve, hogy humán fibroblasztokat tenyésztünk; a kondicionált táptalajt heparinoszlopon kezeljük, az adszorbeált frakciót eluáljuk; az eluátumot anioncserélő oszlopon kezeljük, ahol nem adszorbeálódó frakciót kapunk; a frakciót kationcserélő oszlopon kezeljük, majd heparinoszlopon tisztítjuk, ahonnan az alábbiakkal jellemzett proteint nyerjük:
(a) molekulatömege körülbelül 15 kD nátrium-dodecil-szulfátpoliakrilamid gélelektroforézissel (SDSPAGE) - redukáló és nem redukáló körülmények között - végzett meghatározás szerint, (b) erős affinitást mutat kationcserélőkhöz és heparinhoz, (c) oszteoblaszt-növekedést stimuláló aktivitást fejt ki és (d) 70 °C-on 10 percig melegítve aktivitása csökken, 90 °C-on 10 percig hevítve inaktiválódik.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott protein egy részét a 9. számú szekvencia által meghatározott aminosavszekvencia képezi és oszteoblaszt sejt növekedést stimuláló aktivitással rendelkezik.
11. Gazdasejt, amelyet olyan cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral transzformálunk, amely a 9. számú szekvenciának megfelelő aminosavszekvenciát kódolja.
12. A 11. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a sejt emlős, baktérium, élesztő vagy rovar eredetű.
HU 220 130 Β
13. A 12. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli eredetű.
14. A 13. igénypont szerinti gazdasejt, amely Escherichia coli pQE30-OGFII (FERM BP-5139).
15. Eljárás az 1., 3., 4., 6. vagy 7. igénypont szerinti 5 protein előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral transzformált gazdasejtet tenyésztünk, amely a 9. számú szekvenciának megfelelő aminosavszekvenciát kódolja, és a kapott proteint a tenyészetből izoláljuk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16898494 | 1994-06-27 | ||
| PCT/JP1995/001270 WO1996000240A1 (fr) | 1994-06-27 | 1995-06-26 | Nouvelle proteine et procede pour sa fabrication |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9600395D0 HU9600395D0 (en) | 1996-04-29 |
| HUT76748A HUT76748A (en) | 1997-11-28 |
| HU220130B true HU220130B (hu) | 2001-11-28 |
Family
ID=15878202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9600395A HU220130B (hu) | 1994-06-27 | 1995-06-26 | Új oszteoblasztnövekedést stimuláló protein és eljárások a protein előállítására |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6046033A (hu) |
| EP (1) | EP0725080A1 (hu) |
| KR (1) | KR960703943A (hu) |
| CN (1) | CN1129944A (hu) |
| AU (1) | AU2753595A (hu) |
| CA (1) | CA2169953A1 (hu) |
| FI (1) | FI960706A (hu) |
| HU (1) | HU220130B (hu) |
| IL (1) | IL114356A0 (hu) |
| NO (1) | NO960766L (hu) |
| NZ (1) | NZ288352A (hu) |
| WO (1) | WO1996000240A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA955319B (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL117175A (en) * | 1995-02-20 | 2005-11-20 | Sankyo Co | Osteoclastogenesis inhibitory factor protein |
| JP3895792B2 (ja) * | 1995-12-08 | 2007-03-22 | プロスケリア・エス・ア・エス | 骨形成促進剤 |
| ATE328281T1 (de) | 1997-09-24 | 2006-06-15 | Sankyo Co | Methode zur diagnose von abnormalem knochenstoffwechsel |
| DE19757250A1 (de) * | 1997-12-22 | 1999-07-01 | Forssmann Wolf Georg Prof Dr | Insulin-like growth factor binding protein und seine Verwendung |
| CA2422625A1 (en) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Bioexpertise, Llc | Method for use of igf-binding protein for selective sensitization of target cells in vivo |
| US20050107350A1 (en) * | 2003-08-22 | 2005-05-19 | Pharmacia Corporation | Method for the treatment or prevention of bone disorders with a cyclooxygenase-2 inhibitor alone and in combination with a bone disorder treatment agent and compositions therewith |
| US20220259265A1 (en) * | 2019-07-30 | 2022-08-18 | The University Of Sydney | Inhibitors and Use Thereof in Cancer Treatment |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200509A (en) * | 1987-04-06 | 1993-04-06 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Human somatomedin carrier protein subunits and process for producing them; recombinant DNA molecules, hosts, processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides |
| US5258287A (en) * | 1988-03-22 | 1993-11-02 | Genentech, Inc. | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 |
-
1995
- 1995-06-26 EP EP95922759A patent/EP0725080A1/en not_active Withdrawn
- 1995-06-26 HU HU9600395A patent/HU220130B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-26 CN CN95190587A patent/CN1129944A/zh active Pending
- 1995-06-26 AU AU27535/95A patent/AU2753595A/en not_active Abandoned
- 1995-06-26 NZ NZ288352A patent/NZ288352A/en unknown
- 1995-06-26 CA CA002169953A patent/CA2169953A1/en not_active Abandoned
- 1995-06-26 US US08/604,965 patent/US6046033A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-26 WO PCT/JP1995/001270 patent/WO1996000240A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1995-06-26 KR KR1019960700946A patent/KR960703943A/ko not_active Application Discontinuation
- 1995-06-27 ZA ZA955319A patent/ZA955319B/xx unknown
- 1995-06-27 IL IL11435695A patent/IL114356A0/xx unknown
-
1996
- 1996-02-16 FI FI960706A patent/FI960706A/fi unknown
- 1996-02-26 NO NO960766A patent/NO960766L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1996000240A1 (fr) | 1996-01-04 |
| EP0725080A1 (en) | 1996-08-07 |
| AU2753595A (en) | 1996-01-19 |
| FI960706A (fi) | 1996-04-12 |
| KR960703943A (ko) | 1996-08-31 |
| FI960706A0 (fi) | 1996-02-16 |
| MX9600765A (es) | 1997-07-31 |
| CN1129944A (zh) | 1996-08-28 |
| NO960766L (no) | 1996-04-24 |
| HUT76748A (en) | 1997-11-28 |
| ZA955319B (en) | 1996-12-27 |
| HU9600395D0 (en) | 1996-04-29 |
| IL114356A0 (en) | 1995-10-31 |
| NZ288352A (en) | 1997-12-19 |
| US6046033A (en) | 2000-04-04 |
| CA2169953A1 (en) | 1996-01-04 |
| NO960766D0 (no) | 1996-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3045398B2 (ja) | 蛋白質、ｄｎａおよびその用途 | |
| IE881146L (en) | Bifunctional proteins | |
| US20050136058A1 (en) | Insulin-like growth factor binding protein (IGFBP-5) | |
| US6180602B1 (en) | Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent | |
| JPH06253850A (ja) | ヘパリン結合性神経栄養因子遺伝子配列 | |
| HU220130B (hu) | Új oszteoblasztnövekedést stimuláló protein és eljárások a protein előállítására | |
| CA2090705A1 (en) | Genetic material encoding igfbp-5 | |
| JPH08509595A (ja) | 細胞分裂促進活性を有する短縮型インスリン様成長因子結合タンパク質 | |
| CN1323167C (zh) | 1型胎盘生长因子的突变蛋白及其制备方法和应用 | |
| US6660499B1 (en) | DCR5, a BMP-binding protein, and applications thereof | |
| EP0832221A1 (en) | Bone stimulating factor | |
| WO2001032197A2 (en) | Methods of using lp8, a pdgf-related protein, to treat musculoskeletal disorders | |
| US7252973B1 (en) | Protein and processes for producing the same | |
| WO1999033967A2 (en) | Novel nucleic acid and polypeptide with homology to the tnf-receptors | |
| MXPA96000765A (en) | Protein and methods to produce prote | |
| EP0535337A2 (en) | Cell growth inhibiting activities of heparin binding neurite-outgrowth promoting factor | |
| AU2003200912B2 (en) | Novel protein and processes for producing the same | |
| EP0535336A2 (en) | MK protein as cell growth inhibitor | |
| US20020146801A1 (en) | RNA polymerase I transcription factor TIF-IA | |
| CN117940447A (zh) | 嵌合克雷伯菌素 | |
| Congote | Increased heparin binding by site directed mutagenesis of a recombinant chimera of bombyxin and insulin-like growth factor II | |
| WO1996011259A1 (en) | TGF-β1, ACTIVIN RECEPTORS 1 AND 3 | |
| JP2000239299A (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 | |
| JP2001078777A (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 | |
| JP2000312591A (ja) | ベータセルリン改変体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |