JP2000312591A

JP2000312591A - ベータセルリン改変体

Info

Publication number: JP2000312591A
Application number: JP11348531A
Authority: JP
Inventors: Takashi Ito; 隆司伊藤; Mitsuyo Kondo; 光代近藤; Yoko Tanaka; 葉子田中; Masayuki Kobayashi; 昌行小林; Koichi Igarashi; 貢一五十嵐; Reiko Sasada; 玲子佐々田; Tadashi Nishimura; 紀西村
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2000-11-14
Anticipated expiration: 2019-12-08
Also published as: JP4512222B2

Abstract

(57)【要約】【課題】優れた糖尿病治療薬の提供。【解決手段】膵臓β細胞の分化促進活性が保持され、上
皮細胞増殖促進活性が低減されたベータセルリンムテイ
ンまたはその塩。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はベータセルリン（Ｂ
ＴＣ）の膵臓β細胞への分化促進活性（ＢＴＣ活性）を
保持したまま平滑筋細胞等の上皮細胞の増殖促進活性
（ＥＧＦ活性）を低減させたムテイン（以下、改変体ま
たは改変分子と称することもある）及びその製造法など
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトベータセルリンは、１７８アミノ酸
からなる前駆体より切り出された８０アミノ酸からなる
蛋白性因子でその全アミノ酸配列が明らかにされている
〔Sasadaら；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Bioph
ys. Res. Commun.）,１９０：１１７３（１９９
３）〕。生体内に存在するベータセルリンは極めて微量
で、これを取得するのは困難であったが、遺伝子組換え
技術を用いた製造法が特開平６−８７８９４号公報など
に記載されている。ベータセルリンは当初マウス３Ｔ３
細胞に対する増殖促進活性を持つ因子として見出された
が、その後、血管平滑筋細胞、網膜色素上皮細胞に対し
ても増殖促進活性（ＥＧＦ活性）を有することが明らか
となった［Shingら；サイエンス（Science），２５９：
１６０４（１９９３）］。さらに、ベータセルリンは膵
臓未分化肝細胞に作用して、インシュリンを産生する膵
臓β細胞への分化を促進する作用（ＢＴＣ活性）を有す
る〔Mashimaら；ジャーナルオブクリニカルイン
ビスティゲーション（J. Clin. Invest.），９７：１６
４７（１９９６）〕ことより、糖尿病（例えば、インス
リン依存性糖尿病）、糖尿病における膵臓機能障害など
の予防・治療剤として有用であるものと考えられる［Mi
yagawaら、１９９７年日本糖尿病学会講演要旨集，１
２５］。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながらベータセ
ルリンは前述のような血管平滑筋細胞、網膜色素上皮細
胞に対する増殖促進活性を併せ持つため、糖尿病治療剤
として応用する場合にはこれらの増殖活性が問題であ
る。そのため膵臓β細胞への分化促進作用を維持したま
ま、血管平滑筋細胞等に対する増殖促進活性を低減する
ことが可能であるならば、より医薬品としての可能性を
高めることができるが、これまでそのようなベータセル
リン改変体については知られていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らはベータセル
リンの改変体について種々の検討を重ねた結果、ベータ
セルリンの改変により膵臓β細胞への分化促進活性を保
持したまま平滑筋細胞等の増殖促進活性を低減させるこ
とを可能たらしめるベータセルリン改変体であって、生
体内に投与した場合に抗原性の問題を生じない改変体を
初めて見出し、さらに研究を続けた結果、本発明を完成
させた。すなわち、本発明はベータセルリンの改変体及
びその改変体を取得する方法などに関する。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）膵臓β細胞の分化促進活性が保持され、上皮細胞
増殖促進活性が低減されたベータセルリンムテインまた
はその塩；（２）上皮細胞増殖促進活性に対する膵臓β細胞の分化
促進活性の比が、ベータセルリンのそれに比べて２倍以
上である前記（１）記載のベータセルリンムテインまた
はその塩；（３）ベータセルリンのＮ末端から１ないし４０個のア
ミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から１ないし
４番目のアミノ酸残基において、Ｃ末端から３番目のア
ミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸
残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失ま
たは他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換さ
れた前記（１）記載のベータセルリンムテインまたはそ
の塩；（４）Ｎ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失
した前記（３）記載のベータセルリンムテインまたはそ
の塩；（５）配列番号：１で表されるアミノ酸配列、配列
番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし
４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：２で表されるアミノ酸配列または配列番号：２で
表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個のア
ミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有する前記（３）記
載のベータセルリンムテインまたはその塩；（６）配列番号：１で表されるアミノ酸配列、配列
番号：２で表されるアミノ酸配列、配列番号：３で表
されるアミノ酸配列または配列番号：４で表されるア
ミノ酸配列を含有する前記（３）記載のベータセルリン
ムテインまたはその塩；（７）配列番号：３７で表されるアミノ酸配列または
配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有する前
記（３）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；（８）ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミ
ノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第２２番目
のアミノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基との間に１
ないし５個のアミノ酸残基が挿入された前記（１）記載
のベータセルリンムテインまたはその塩；（９）ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミ
ノ酸残基が欠失した前記（８）記載のベータセルリンム
テインまたはその塩；（１０）配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を有す
る前記（８）記載のベータセルリンムテインまたはその
塩；（１１）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有す
る前記（８）記載のベータセルリンムテインまたはその
塩；（１２）前記（１）記載のベータセルリンムテインをコ
ードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換さ
れた形質転換体を培養し、該ベータセルリンムテインを
生成せしめることを特徴とする前記（１）記載のベータ
セルリンムテインまたはその塩の製造法；（１３）前記（１）記載のベータセルリンムテインまた
はその塩を含有してなる医薬組成物；および（１４）組成物が糖尿病予防・治療薬である前記（９）
記載の医薬組成物などに関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のベータセルリン改変体
（ベータセルリンムテイン）は、上述のとおり、ＢＴＣ
活性が保持されたまま、ＥＧＦ活性が低減あるいは減弱
されている。ここで、ベータセルリンとは、Sasadaら；
バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Com
mun.）, １９０：１１７３（１９９３）に記載のとお
り、Asp Gly Asn Ser Thr ArgSer Pro Glu Thr Asn Gly
Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala AlaTh
r Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg
Cys Pro Lys Gln TyrLys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg
Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr ProSer Cys Va
l Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg
Val Asp LeuPhe Tyr（配列番号：３５）で表されるアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチドのことを意味する。Ｂ
ＴＣ活性が保持されたベータセルリンムテインとして
は、ベータセルリンのＢＴＣ活性の２０％以上、好まし
くは５０％以上の活性を有するベータセルリンムテイン
が挙げられる。ＥＧＦ活性が低減されたベータセルリン
ムテインとしては、ベータセルリンのＥＧＦ活性の約２
０％以下、好ましくは１５％以下の活性を有するベータ
セルリンムテインが挙げられる。

【０００７】ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が
低減された本発明のベータセルリンムテインとしては、
上皮細胞増殖促進活性に対する膵臓β細胞の分化促進活
性の比が、ベータセルリンのそれに比べて２倍以上であ
るベータセルリンムテインまたはその塩が好ましい。Ｂ
ＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が低減された本発
明のベータセルリンムテインとして具体的には、ベータ
セルリンのＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が
欠失していてもよく、Ｃ末端から１ないし４番目のアミ
ノ酸残基において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基Ｌ
ｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを
含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミ
ノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセ
ルリンムテインまたはその塩などがあげられ、さらに具
体的には、Ｎ末端から１ないし４０個または１ないし２
０個のアミノ酸残基が欠失した前述のベータセルリンム
テインなどがあげられる。

【０００８】上記の「他のアミノ酸残基もしくは他のペ
プチド鎖に置換されたベータセルリンムテイン」中の他
の「他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換」
とは、ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が減弱さ
れた本発明のベータセルリンムテインの「ＢＴＣ活性を
保持したまま、ＥＧＦが減弱される」という特徴を損な
わない範囲での置換であれば、特にアミノ酸残基または
ペプチド鎖の種類は問わない。上記の「他のアミノ酸」
の具体例として、非極性（疎水性）アミノ酸（例、アラ
ニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フ
ェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなど）、
極性（中性）アミノ酸（例、グリシン、セリン、スレオ
ニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミ
ンなど）、陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸（例、アル
ギニン、リジン、ヒスチジンなど）、負電荷をもつ（酸
性）アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸な
ど）などがあげられる。上記の「他のペプチド鎖」の具
体例としては、上記の「他のアミノ酸」が２個以上結合
してなるペプチド鎖のことをいい、好ましくは２ないし
４個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖などがあげられ
る。

【０００９】「ベータセルリンのＮ末端から１ないし４
０個のアミノ酸残基が欠失していてもよくＣ末端から１
ないし４番目のアミノ酸残基において、Ｃ末端から３番
目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のア
ミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が
欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に
置換されたベータセルリンムテイン」の具体的な例とし
ては、（１）ベータセルリンのＮ末端から７６番目までのアミ
ノ酸配列（Asp Gly AsnSer Thr Arg Ser Pro Glu Thr A
sn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu AsnCys Ala
Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Se
r Arg Cys ProLys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys G
ly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala GluGln Thr Pro Ser
Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Gl
u ArgVal）を保持し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミ
ノ酸残基（Asp Leu Phe Tyr）において、Ｃ末端から３
番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目の
アミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基
が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖
に置換されたベータセルリンムテイン、例えば、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gl
y Leu Leu Cys Gly AspPro Glu Glu Asn Cys Ala Ala T
hr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His PheSer Arg
Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Ar
g Cys Arg PheVal Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys V
al Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly AlaArg Cys Glu Arg
Val（配列番号：２）で表されるアミノ酸配列を含有す
るベータセルリンムテイン、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gl
y Leu Leu Cys Gly AspPro Glu Glu Asn Cys Ala Ala T
hr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His PheSer Arg
Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Ar
g Cys Arg PheVal Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys V
al Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly AlaArg Cys Glu Arg
Val Asp（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列を含
有するベータセルリンムテイン、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gl
y Leu Leu Cys Gly AspPro Glu Glu Asn Cys Ala Ala T
hr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His PheSer Arg
Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Ar
g Cys Arg PheVal Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys V
al Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly AlaArg Cys Glu Arg
Val Leu Phe Tyr（配列番号：５）で表されるアミノ酸
配列を含有するベータセルリンムテイン、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gl
y Leu Leu Cys Gly AspPro Glu Glu Asn Cys Ala Ala T
hr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His PheSer Arg
Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Ar
g Cys Arg PheVal Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys V
al Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly AlaArg Cys Glu Arg
Val Leu Phe （配列番号：６）で表されるアミノ酸配列
を含有するベータセルリンムテイン、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gl
y Leu Leu Cys Gly AspPro Glu Glu Asn Cys Ala Ala T
hr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His PheSer Arg
Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Ar
g Cys Arg PheVal Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys V
al Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly AlaArg Cys Glu Arg
Val Leu（配列番号：７）で表されるアミノ酸配列を含
有するベータセルリンムテイン、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gl
y Leu Leu Cys Gly AspPro Glu Glu Asn Cys Ala Ala T
hr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His PheSer Arg
Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Ar
g Cys Arg PheVal Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys V
al Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly AlaArg Cys Glu Arg
Val Asp Phe Tyr（配列番号：８）で表されるアミノ酸
配列を含有するベータセルリンムテイン、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gl
y Leu Leu Cys Gly AspPro Glu Glu Asn Cys Ala Ala T
hr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His PheSer Arg
Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Ar
g Cys Arg PheVal Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys V
al Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly AlaArg Cys Glu Arg
Val Asp Phe （配列番号：９）で表されるアミノ酸配列
を含有するベータセルリンムテイン、およびベータセルリンのＣ末端から３番目のアミノ酸残基
（Ｌｅｕ）が他のアミノ酸残基で置換されたベータセル
リンムテインなどがあげられる。なかでも、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有
するベータセルリンムテインまたは配列番号：２で表さ
れるベータセルリンムテインが特に好ましい例としてあ
げられる。

【００１０】（２）ベータセルリンのＮ末端から１ない
し４０番目までのアミノ酸残基（AspGly Asn Ser Thr A
rg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro
GluGlu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Ar
g Lys Gly His Phe Ser ArgCys Pro Lys）が欠失してい
てもよく、Ｎ末端から４１番目ないし７６番目のアミノ
酸配列（Gln Tyr Lys His Tyr CysIle Lys Gly Arg Cys
Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val C
ysAsp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Va
l）を保持し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残
基（Asp Leu Phe Tyr）において、Ｃ末端から３番目の
アミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ
酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失
または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換
されたベータセルリンムテイン、好ましくは、（i）ベ
ータセルリンのＮ末端から１ないし３７番目までのアミ
ノ酸残基（Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr
Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Al
a Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe
Ser Arg）が欠失していてもよく、Ｎ末端から３８番目
ないし７６番目のアミノ酸配列（Cys Pro Lys Gln Tyr
LysHis Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val
Ala Glu Gln Thr Pro SerCys Val Cys Asp Glu Gly Ty
r Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val）を保持し、Ｃ末
端から１ないし４番目のアミノ酸残基（Asp Leu Phe Ty
r）において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基Ｌｅｕ
もしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む
１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸
残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリ
ンムテイン、（ii）ベータセルリンのＮ末端から１番目
のアミノ酸残基（Asp）が欠失していてもよく、Ｎ末端
から２番目ないし７６番目のアミノ酸配列（Gly Asn Se
r Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly
Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Se
r Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln
Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Va
l Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu
Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val）を保持
し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基（Asp Le
u Phe Tyr）において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残
基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓ
ｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他の
アミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベー
タセルリンムテイン、（iii）ベータセルリンのＮ末端
から１ないし２３番目のアミノ酸残基（Asp GlyAsn Ser
Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly A
sp Pro Glu GluAsn Cys Ala）が欠失していてもよく、
Ｎ末端から２４番目ないし７６番目のアミノ酸配列（Al
a Thr Thr Thr Gln SerLys Arg Lys Gly His Phe Ser A
rg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys IleLys Gly
Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cy
s Val Cys AspGlu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu A
rg Val）を保持し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ
酸残基（Asp Leu Phe Tyr）において、Ｃ末端から３番
目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のア
ミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が
欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に
置換されたベータセルリンムテインなどが挙げられ、例
えば、

【００１１】(a) Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys P
ro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys IleLys Gly Arg Cys
Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cy
s AspGlu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val
（配列番号：４）で表されるアミノ酸配列を含有するベ
ータセルリンムテイン、(b) Arg Lys Gly His Phe Ser
Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys IleLys Gl
y Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser
Cys Val Cys AspGlu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu
Arg Val Asp（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列
を含有するベータセルリンムテイン、(c) Arg Lys Gly
His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr C
ys IleLys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln
Thr Pro Ser Cys Val Cys AspGlu Gly Tyr Ile Gly Ala
Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe Tyr（配列番号：１０）
で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテ
イン、(d) Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys
Gln Tyr Lys His Tyr Cys IleLys Gly Arg Cys Arg Ph
e Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys AspG
lu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe
（配列番号：１１）で表されるアミノ酸配列を含有す
るベータセルリンムテイン、(e) Arg Lys Gly His Phe
Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys IleLy
s Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro
Ser Cys Val Cys AspGlu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys
Glu Arg Val Leu（配列番号：１２）で表されるアミノ
酸配列を含有するベータセルリンムテイン、(f) Arg L
ys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His
Tyr Cys IleLys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Gl
u Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys AspGlu Gly Tyr Ile G
ly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe Tyr（配列番号：
１３）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリ
ンムテイン、(g) Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys P
ro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys IleLys Gly Arg Cys
Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cy
s AspGlu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val A
sp Phe（配列番号：１４）で表されるアミノ酸配列を含
有するベータセルリンムテイン、(h) ベータセルリン
のＮ末端から３１ないし８０番目のアミノ酸配列で表さ
れる部分ペプチドにおいて、Ｃ末端から３番目のアミノ
酸残基（Ｌｅｕ）が他のアミノ酸残基で置換されたベー
タセルリンムテイン、(i) Gly Asn Ser Thr Arg Ser P
to Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp ProGlu Glu
Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gl
y His Phe SerArg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr C
ys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe ValVal Ala Glu Gln
Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Al
a ArgCys Glu Arg Val（配列番号：３７）で表されるア
ミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、および
(j) Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His P
he Ser Arg Cys Pro LysGln Tyr Lys His Tyr Cys Ile
Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu GlnThr Pro
Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg C
ys Glu Arg Val（配列番号：３８）で表されるアミノ酸
配列を含有するベータセルリンムテインなどがあげられ
る。

【００１２】なかでも、配列番号：３、配列番号：４、
配列番号：３７または配列番号：３８で表されるアミノ
酸配列を含有するベータセルリンムテインが好ましく、
さらに好ましくは、配列番号：３７または配列番号：３
８で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンム
テインである。最も好ましくは配列番号：３８で表され
るアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインであ
る。上記（１）、（２）に記載の本発明のベータセルリ
ンムテインの好ましい例中、特に好ましいものとして
は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４
０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：
２で表されるアミノ酸配列、配列番号：２で表される
アミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸が
欠失したアミノ酸配列、配列番号：３７で表されるア
ミノ酸配列または配列番号：３８で表されるアミノ酸
配列を含有するベータセルリンムテインである。さらに
好ましくは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列、
配列番号：２で表されるアミノ酸配列、配列番号：
３で表されるアミノ酸配列、配列番号：４で表される
アミノ酸配列、配列番号：３７で表されるアミノ酸配
列または配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含
有するベータセルリンムテインがあげられる。特に好ま
しくは配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有す
るベータセルリンムテインである。

【００１３】ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が
低減された本発明のベータセルリンムテインとして具体
的には、（１）ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０
個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第
２２番目のアミノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基と
の間に１ないし５個のアミノ酸残基が挿入されたベータ
セルリンムテインまたはその塩、（２）配列番号：４５
で表されるアミノ酸配列を有するベータセルリンムテイ
ンまたはその塩なども挙げられる。上記「アミノ酸残基
が挿入されたベータセルリンムテイン（改変分子）」の
「アミノ酸」の具体例としては、非極性（疎水性）アミ
ノ酸（例、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メ
チオニンなど）、極性（中性）アミノ酸（例、グリシ
ン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギン、グルタミンなど）、陽電荷をもつ（塩基性）
アミノ酸（例、アルギニン、リジン、ヒスチジンな
ど）、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸（例、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸など）などがあげられる。アスパラ
ギン、プロリン、セリンが好ましい。該「ペプチド鎖」
としては、上記「アミノ酸」が２ないし５個結合してな
るペプチド鎖のことをいい、好ましくは２ないし４個の
アミノ酸残基からなるペプチド鎖などがあげられる。

【００１４】「Ｎ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基
が欠失していてもよいベータセルリン」としては、たと
えば（１）上記配列番号：３５で表されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド、（２）Ｎ末端の１ないし３０個
のアミノ酸残基が欠失したベータセルリン改変分子、
（３）ベータセルリンのＮ末端の第１番目から第３０番
目のアミノ酸配列中にアミノ酸残基（例、１ないし５個
のアミノ酸残基）が挿入されたベータセルリン改変分子
などが含まれる。該「Ｎ末端の１ないし３０個のアミノ
酸残基が欠失したベータセルリン改変分子」には、
（１）ベータセルリンのＮ末端側の１ないし３０個のア
ミノ酸残基が欠失したもの、（２）ベータセルリンのＮ
末端側の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失し、アミ
ノ酸残基（例、１ないし５個のアミノ酸残基）が付加し
たものなどが含まれる。

【００１５】「ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０
個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第
２２番目のアミノ酸残基（すなわち、配列番号：３５で
表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５８番目のアミノ
酸残基：Ｇｌｎ）と第２３番目のアミノ酸残基（すなわ
ち、配列番号：３５で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら第５９番目のアミノ酸残基：Ｔｈｒ）との間に１ない
し５個のアミノ酸残基が挿入されたベータセルリン改変
分子」は、ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個の
アミノ酸残基のどの部分のアミノ酸が欠失していてもよ
い、Ｃ末端から第２２番目のアミノ酸残基と第２３番目
のアミノ酸残基との間に１ないし５個のアミノ酸残基が
挿入されたベータセルリン改変分子であればよく、具体
例としては、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly
Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala T
hr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg
Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly A
rg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Asn Pro Ser Thr
Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala A
rg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr（配列番号：４
６）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリン
改変分子、ベータセルリンのＮ末端から１ないし３０番目まで
のアミノ酸残基（Asp GlyAsn Ser Thr Arg Ser Pro Glu
Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu GluAsn Cy
s Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys）が欠失してい
て、かつＣ末端から第２２番目のアミノ酸残基と第２３
番目のアミノ酸残基との間に１ないし５個のアミノ酸残
基が挿入されたベータセルリン改変分子、例えば、 Arg
Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys H
is Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala
Glu Gln Asn Pro Ser Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp G
lu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu
Phe Tyr （配列番号：４４）で表されるアミノ酸配列
を含有するベータセルリン改変分子などがあげられる。本発明の「ベータセルリン改変分子」として、好ましく
は、配列番号：４４または配列番号：４５で表されるア
ミノ酸配列を含有するベータセルリン改変分子などがあ
げられる。

【００１６】本明細書におけるベータセルリンムテイン
はペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末
端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。また
これらのベータセルリンムテインはＣ末端が通常カルボ
キシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−Ｃ
ＯＯ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）また
はエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。エステルの
Ｒとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イ
ソプロピルまたはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、
シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロア
ルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリー
ル基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフ
ェニル−Ｃ_1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチル
などのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラ
ルキル基、ピバロイルオキシメチル基などがあげられ
る。また、本発明のベータセルリンムテインにはＮ末端
にＭｅｔが付加したものも含まれる。

【００１７】本発明のベータセルリンムテインの塩とし
ては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属
など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、
とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。こ
のような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例え
ば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のベータセルリン
ムテインは、例えば、特開平６−８７８９４に記載の遺
伝子工学的又はベータ腫瘍細胞の培養により得られたベ
ータセルリンを自体公知のプロテアーゼ処理、好ましく
はカルボキシペプチダーゼ処理さらに好ましくはウシ膵
臓カルボキシペプチダーゼＡ処理することによっても調
製する事が可能である。また、後述のペプチド合成法に
準じて製造することもできる。また、後述するベータセ
ルリンムテインをコードするＤＮＡを含有する形質転換
体を培養することによっても製造することができる。ベ
ータセルリンをヒトや温血動物の組織または細胞から製
造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジ
ナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を、塩
析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることに
より精製単離することができる。

【００１８】ペプチドの合成法としては、例えば固相合
成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、
本発明のベータセルリンムテインを構成し得る部分ペプ
チドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物
が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目
的のベータセルリンムテインを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下
の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) Schroeder および Luebke、ザペプチド(The Peptid
e), Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タ
ンパク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合
成広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られるポリペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００１９】ベータセルリンムテインのアミド体は、ア
ミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いるこ
とができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメ
チル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミ
ン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジ
ルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニル
アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４
−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフ
ェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを
挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミ
ノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的と
するペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に
従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプ
チドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応
じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を
実施し、目的のアミド体を取得する。上記した保護され
たアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用でき
る各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カル
ボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣ
Ｃ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エ
チル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセ
ミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）
とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかま
たは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨ
ＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸
の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。
保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられ
る溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが
知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトア
ミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メ
チレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ト
リフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルス
ルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級
アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエー
テル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニト
リル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類ある
いはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度
はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られて
いる範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の
範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体
は通常１．５ないし４倍過剰で用いられる。ニンヒドリ
ン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には
保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことに
より十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返して
も十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはア
セチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル
化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることが
できる。

【００２０】原料アミノ酸のアミノ基の保護基として
は、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキ
シカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メ
トキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−
Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセ
チル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスル
フェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃな
どが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、た
とえばＲとして上記したＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロ
アルキル基、Ｃ_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチ
ル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−
クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカ
ルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。セ
リンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化
またはエーテル化によって保護することができる。この
エステル化に適する基としては例えばアセチル基などの
低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、
ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基な
どの炭素から誘導される基などが挙げられる。また、エ
ーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テ
トラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
たとえばＢｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジ
ル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、
４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホ
ニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏ
ｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。

【００２１】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］
などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ
黒あるいはＰｄ炭素などの触媒の存在下での水素気流中
での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホ
ン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢
酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソ
プロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジ
ン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニ
ア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処
理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行
われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、
チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジ
メチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２
−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有
効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基とし
て用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノ
ール処理により除去され、トリプトファンのインドール
保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エ
タンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在
下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、
希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去さ
れる。反応に関与すべきでない官能基への保護基の導入
法およびその保護基の脱離法、反応に関与する官能基の
活性化法などは、自体公知の方法またはそれに準じた方
法に従って行えばよい。

【００２２】また、ベータセルリンムテインのアミド体
を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基
側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチ
ド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプ
チドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペ
プチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチド
を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の
詳細については上記と同様である。縮合により得られた
保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保
護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができ
る。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使し
て精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペ
プチドのアミド体を得ることができる。ベータセルリン
ムテインのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ
酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合し
アミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と
同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ること
ができる。

【００２３】本発明のベータセルリンムテインをコード
するＤＮＡとしては、（１）ベータセルリンのＮ末端か
ら１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失していてもよ
く、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基におい
て、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ
末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４
個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしく
は他のペプチド鎖に置換されたベータセルリン、（２）
ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミノ酸残
基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第２２番目のアミ
ノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基との間に１ないし
５個のアミノ酸残基が挿入されたベータセルリンムテイ
ン、（３）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有
するベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有
するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。具体
的には、本発明の配列番号：１ないし配列番号：１４、
配列番号３７、配列番号３８、配列番号：４４、配列番
号：４５、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含
有するベータセルリンムテインをコードする塩基配列を
含有するものがあげられる。より具体的には、（１）配
列番号：１ないし配列番号：１４で表されるアミノ酸配
列を含有するベータセルリンムテインをコードするＤＮ
Ａとしては、配列番号：１５ないし配列番号：２８で表
される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（２）配列番号３７および配列番号３８で表されるアミ
ノ酸配列を含有するベータセルリンムテインをコードす
るＤＮＡとしては、配列番号：４２および配列番号：４
３で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ、（３）配列番号：４７ないし配列番号：４９で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（４）
ストリンジェントな条件下で上記（１）ないし（３）で
規定された配列とハイブリダイズする哺乳動物由来のＤ
ＮＡ、（５）遺伝コードの縮重のため上記（１）ないし
（４）に定められている配列とハイブリッド形成しない
が、同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする
ＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、
自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行う
ことができる。上記ストリンジェントな条件としては、
例えば４２℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＰＥ(１
×ＳＳＰＥ＝１５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＮａＨ
₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ，１ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．４）、５
×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳである。

【００２４】本発明のベータセルリンムテインを、ベー
タセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有する形質
転換体を培養することによって製造する場合に用いられ
る本発明のベータセルリンムテインの発現ベクターは、
例えば、（１）本発明のベータセルリンムテインをコー
ドするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、
（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモー
ターの下流に連結することにより製造することができ
る。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、
ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１
３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐ
ＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳ
Ｈ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオフ
ァージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュ
ロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。本発
明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に
用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいか
なるものでもよい。形質転換する際の宿主が動物細胞で
ある場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウ
イルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用でき
る。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロ
モーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒ
ｅｃＡプロモーター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロ
モーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、Ｓ
ＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰ
プロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５
プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモータ
ー、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが
好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリン
プロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

【００２５】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用
いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場
合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。ま
た、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ベー
タセルリンムテインのＮ端末側に付加する。宿主がエシ
ェリヒア属菌である場合は、ｐｈｏＡ・シグナル配列、
ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌で
ある場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリ
シン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、
メイテイングファクターα(ＭＦα)・シグナル配列、イ
ンベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞であ
る場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−
インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル
配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築さ
れたベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有
するベクターを用いて、形質転換体を製造することがで
きる。

【００２６】宿主としては、たとえばエシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細
胞などが用いられる。エシェリヒア属菌としては、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１
〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１
９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リ
サーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕，ＭＭ２
９４〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７３巻，４１７４
(１９７６)〕などが用いられる。バチルス属菌として
は、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus subtili
s）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８
３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７
(１９８４)〕などが用いられる。酵母としては、たとえ
ばサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cere
visiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，
ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。昆虫と
しては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮ
ＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera
frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni の中
腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia ni の卵由来の Hig
h Five^TM細胞、Mamestra brassicae 由来の細胞または
Estigmena acrea 由来の細胞などが用いられる。ウイ
ルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx m
ori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞と
しては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２
１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in V
itro），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕な
どが用いられる。

【００２７】動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−
７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞Ｃ
ＨＯ、ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、マウ
ス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９
３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、Ｂ
ＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられ
る。エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７
２)、ジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)など
に記載の方法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質
転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティックス（Molecular & General Geneti
cs），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に
従って行われる。酵母を形質転換するには、たとえばプ
ロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７
８)に記載の方法に従って行なわれる。昆虫細胞または
昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジ
ー（Bio/Technology）,６巻，４７−５５頁（１９８８
年）などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を
形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って
行なわれる。

【００２８】発現ベクターの細胞への導入方法として
は、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et a
l. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America），８４巻，７４１
３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham,
F. L. and van der Eb,A. J.ヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電
気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（E
MBO J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等
が挙げられる。このようにして、本発明のベータセルリ
ンムテインをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター
で形質転換された形質転換体が得られる。なお、動物細
胞を用いて、本発明のベータセルリンムテインを安定に
発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された
発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選
択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選
択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さら
に、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞
に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本
発明のベータセルリンムテイン等の高発現能を有する安
定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺
伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐
々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈ
ｆｒ遺伝子とともに、本発明のベータセルリンムテイン
をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発
現の動物細胞株を得ることもできる。

【００２９】上記の形質転換体を本発明のベータセルリ
ンムテインをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培
養し、本発明のベータセルリンムテインを生成、蓄積せ
しめることによって、本発明のベータセルリンムテイン
を製造することができる。宿主がエシェリヒア属菌、バ
チルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用
される培地としては液体培地が適当であり、その中には
該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物そ
の他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグ
ルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒
素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、
コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキ
ス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物
質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二
水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒ
ア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコー
ス、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Mo
lecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Ha
rbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに
必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、た
とえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加え
ることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養
は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要によ
り、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス
属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時
間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもでき
る。

【００３０】宿主が酵母である形質転換体を培養する
際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkho
lder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.
５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０
（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に
調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で
約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培
地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,
ネイチャー（Nature）,195,788(1962)に非動化した１０
％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられ
る。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ま
しい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に
応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質
転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２
０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Scie
nce），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地
〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５
９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ
・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Jo
urnal of the American Medical Association）１９９
巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング
・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカ
ル・メディスン（Proceeding ofthe Society for the B
iological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが
用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要
に応じて通気や撹拌を加える。特にＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして
用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ
胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。

【００３１】上記培養物から本発明のベータセルリンム
テインを分離精製するには、例えば下記の方法により行
なうことができる。本発明のベータセルリンムテインを
培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養
後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当
な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または
凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの
ち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得
る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グ
アニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１００
（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）など
の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にベータ
セルリンムテインが分泌される場合には、培養終了後、
自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、
上清を集める。このようにして得られた培養上清、ある
いは抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製
は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行な
うことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの
等電点の差を利用する方法などが用いられる。

【００３２】かくして得られる本発明のベータセルリン
ムテインが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法
あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することが
でき、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるい
はそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換
することができる。なお、組換え体が産生する本発明の
ベータセルリンムテインを、精製前または精製後に適当
な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を
加えたり、ベータセルリンムテインを部分的に除去する
こともできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。得られるベータセルリンムテインは、例えば、特
開平１０−１９１９８９号公報等に記載のリフォールデ
ィング工程に付してもよい。また、Ｎ末端にＭｅｔが付
加したベータセルリンムテインを特開平１０−１９１９
８９号公報等に記載のＮ末端のＭｅｔの除去反応に付す
ことにより、Ｎ末端のＭｅｔを除去することもでき
る。かくして生成する本発明のベータセルリンムテイン
の存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイな
どにより測定することができる。

【００３３】本発明のベータセルリンムテインをコード
するＤＮＡまたは本発明のベータセルリンムテインもし
くはその塩は、糖尿病（例えば、インシュリン依存性糖
尿病（Ｉ型糖尿病）など）、糖尿病における膵臓機能障
害、老人性のインシュリン分泌低下に伴う膵臓機能低下
症などの改善剤および未分化型膵臓ガンなど（特に糖尿
病（例えば、インシュリン依存性糖尿病など）の予防・
治療薬など）の医薬の開発に用いることができる。さら
に、本発明のベータセルリンムテインもしくはその塩ま
たはそれをコードするＤＮＡはＥＧＦ活性が減弱されて
いることおよび抗原性の問題がないことから、安全で低
毒性な医薬として有用である。本発明のベータセルリン
ムテインもしくはその塩またはそれをコードするＤＮＡ
は、糖尿病（例えば、インシュリン依存性糖尿病）、糖
尿病における膵臓機能障害、老人性のインシュリン分泌
低下に伴う膵臓機能低下症などの改善剤および未分化型
膵臓ガンなどの疾病の治療・予防剤として用いることが
できる。

【００３４】本発明のベータセルリンムテインもしくは
その塩またはそれをコードするＤＮＡを上述の医薬とし
て使用する場合、常套手段に従って実施することができ
る。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合
物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、
賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などととも
に一般に認められた製剤に要求される単位用量形態で混
和することによって製造することができる。これら製剤
における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得
られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに
混和することができる添加剤としては、例えばゼラチ
ン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムの
ような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コー
ンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化
剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ
糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミン
ト、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用
いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前
記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有す
ることができる。注射のための無菌組成物は注射用水の
ようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのよ
うな天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの
通常の製剤製造法にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ
糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビ
トール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）など
があげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール
（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプ
ロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イ
オン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（Ｔ
Ｍ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液と
してはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤とし
て安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用し
てもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢
酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザ
ルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、
ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、
保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールな
ど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注
射液は通常、適当なアンプルに充填される。

【００３５】このようにして得られる製剤は安全で低毒
性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウ
ス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーな
ど）に対して投与することができる。本発明のベータセ
ルリンムテインもしくはその塩の投与量は、症状などに
より差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の糖
尿病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につ
き約０.１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５
０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なる
が、たとえば注射剤として、成人の糖尿病患者（体重６
０ｋｇとして）に対し、一日につき約０．０１から３０
ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より
好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により
投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋ
ｇ当たりに換算した量を投与することができる。

【００３６】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
ＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ体を示すものとする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＡＰＭＳＦ：（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニ
ルフルオライド塩酸塩ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＴＦＡ：トリフルオロ酢酸Ｇｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン

【００３７】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。Ｍｅ：メチル基Ｅｔ：エチル基Ｂｕ：ブチル基Ｐｈ：フェニル基ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチルＰＡＭ：フェニルアセトアミドメチルＴｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３
−ジカルボキシイミドＢｚｌ：ベンジル基Ｚ：ベンジルオキシカルボニル基Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル基Ｃｌ−Ｚ：２−クロルベンジルオキシカルボニル基Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル基ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドＴＦＡ：トリフルオロ酢酸Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基ＤＮＰ：ジニトロフェニル基Ｂｕｍ：ターシャリーブトキシメチル基Ｔｒｔ：トリチル基

【００３８】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。〔配列番号：１〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ１−７７）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：２〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ１−７６）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：３〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ３１−７７）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：４〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ３１−７６）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：５〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ１−７６、７８−８０）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：６〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ１−７６、７８、７９）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：７〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ１−７６、７８）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：８〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ１−７７、７９、８０）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：９〕本発明のベータセルリンムテイン（Ｂ
ＴＣ１−７７、８０）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１０〕本発明のベータセルリンムテイン
（ＢＴＣ３１−７６、７８−８０）のアミノ酸配列を示
す。

【００３９】〔配列番号：１１〕本発明のベータセルリ
ンムテイン（ＢＴＣ３１−７６、７８、７９）のアミノ
酸配列を示す。〔配列番号：１２〕本発明のベータセルリンムテイン
（ＢＴＣ３１−７６、７８）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１３〕本発明のベータセルリンムテイン
（ＢＴＣ３１−７７、７９、８０）のアミノ酸配列を示
す。〔配列番号：１４〕本発明のベータセルリンムテイン
（ＢＴＣ３１−７７、７９）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：１５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配
列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１６〕配列番号：２で表されるアミノ酸配
列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１７〕配列番号：３で表されるアミノ酸配
列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１８〕配列番号：４で表されるアミノ酸配
列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１９〕配列番号：５で表されるアミノ酸配
列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２０〕配列番号：６で表されるアミノ酸配
列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列を示す。

【００４０】〔配列番号：２１〕配列番号：７で表され
るアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコ
ードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２２〕配列番号：８で表されるアミノ酸配
列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２３〕配列番号：９で表されるアミノ酸配
列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２４〕配列番号：１０で表されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２５〕配列番号：１１で表されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２６〕配列番号：１２で表されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２７〕配列番号：１３で表されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２８〕配列番号：１４で表されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：２９〕後述の実施例１および実施例４で用
いられたプライマー１の塩基配列を示す。〔配列番号：３０〕後述の実施例１および実施例４で用
いられたプライマー２の塩基配列を示す。

【００４１】〔配列番号：３１〕後述の実施例１０およ
び実施例２７で用いられたプライマーＲＩ−１の塩基配
列を示す。〔配列番号：３２〕後述の実施例１０および実施例２７
で用いられたプライマーＲＩ−３の塩基配列を示す。〔配列番号：３３〕後述の実施例１０および実施例２７
で用いられたプライマーＲＩ−１Ｃｌａの塩基配列を示
す。〔配列番号：３４〕後述の実施例１０および実施例２７
で用いられたプライマーＲＩ−３Ｘｈｏの塩基配列を示
す。〔配列番号：３５〕ベータセルリンのアミノ酸配列を示
す。〔配列番号：３６〕ベータセルリンをコードするｃＤＮ
Ａの塩基配列を示す。〔配列番号：３７〕本発明のベータセルリンムテイン
（ＢＴＣ２−７６）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：３８〕本発明のベータセルリンムテイン
（ＢＴＣ２４−７６）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：３９〕後述の実施例１３で用いられたプラ
イマー３の塩基配列を示す。〔配列番号：４０〕後述の実施例１３および実施例１６
で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。

【００４２】〔配列番号：４１〕後述の実施例１６で用
いられたプライマー５の塩基配列を示す。〔配列番号：４２〕配列番号：３７で表されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：４３〕配列番号：３８で表されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：４４〕本発明のベータセルリン改変分子
（ＢＴＣ３１−５８，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，５９−
８０）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：４５〕本発明のベータセルリン改変分子
（Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ，ＢＴＣ３
８−８０）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：４６〕本発明のベータセルリン改変分子
（ＢＴＣ１−５８，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，５９−８
０）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：４７〕配列番号：４６に示されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリン改変分子をコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：４８〕配列番号：４４に示されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリン改変分子をコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：４９〕配列番号：４５に示されるアミノ酸
配列で表されるベータセルリン改変分子をコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５０〕後述の参考例１および実施例２２で
用いられたプライマーＢＴ−９５ｈの塩基配列を示す。〔配列番号：５１〕後述の参考例１および実施例２３で
用いられたプライマーＢＴ−９４ｈの塩基配列を示す。〔配列番号：５２〕後述の実施例２２で用いられたプラ
イマーＰＥＴ−１の塩基配列を示す。〔配列番号：５３〕後述の実施例２２で用いられたプラ
イマーＢＴＣ−１の塩基配列を示す。〔配列番号：５４〕後述の実施例２２で用いられたプラ
イマーＢＴＣ−２の塩基配列を示す。〔配列番号：５５〕後述の実施例２２で用いられたプラ
イマーＢＴＣ−３の塩基配列を示す。〔配列番号：５６〕後述の実施例２３で用いられたプラ
イマーＢＴＣ−７の塩基配列を示す。

【００４３】後述の実施例１で得られた形質転換体大腸
菌［エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉ）］ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７
７は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６５８４として１９９
８年１１月２４日付で通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託されている。また１９９８
年１１月２日付で受託番号ＩＦＯ１６２１４として財
団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。後述の
実施例４で得られた形質転換体大腸菌［エシェリヒア
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）］ＭＭ２９
４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７６は、受託番号ＦＥ
ＲＭＢＰ−６５８３として１９９８年１１月２４日付
で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ている。また１９９８年１１月２日付で受託番号ＩＦＯ
１６２１３として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄
託されている。

【００４４】後述の実施例１３で得られた形質転換体大
腸菌［エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）］ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ
２−７６は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６９４８として
１９９９年１１月２４日付で通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されている。また１９９９年１１
月９日付で受託番号ＩＦＯ１６３３４として財団法人
発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。後述の実施例
１６で得られた形質転換体大腸菌［エシェリヒアコリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）］ＭＭ２９４
（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６は、受託番号
ＦＥＲＭＢＰ−６９４９として１９９９年１１月２４
日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されている。また１９９９年１１月９日付で受託番号Ｉ
ＦＯ１６３３５として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に寄託されている。後述の参考例１で用いられたプラス
ミドｐＴＢ１５１６を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ
１５１６は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）に１９９２年（平成４年）４月２１日
から受託番号ＦＥＲＭＢＰ−３８３６として寄託さ
れ、また財団法人発酵研究所に１９９２年（平成４年）
４月１６日から受託番号ＩＦＯ１５２８２として寄託さ
れている。

【００４５】

【実施例】以下に実施例および参考例を示し、本発明を
より詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定す
るものではない。

【００４６】実施例１７７残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現
株の構築７７残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現
プラスミドを、以下のように構築した〔図１〕。７７残
基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリンの構造遺伝
子を、ベータセルリン発現プラスミドｐＢＯ４１［Ｓｅ
ｎｏら；ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ，１３：１８
１（１９９６）］より、構造遺伝子の上流に隣接してＮ
ｄｅＩ切断部位及び開始コドンを持つプライマー１
（５'−ＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣ
ＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧ）、及び７７番目のアスパラギン
酸の後に終止コドン及びＢａｍＨＩ切断部位を持つプ
ライマー２（５'−ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＣＡＡＣＴ
ＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣ）を用いて、ＰＣ
Ｒで増幅した。ＰＣＲにより増幅した遺伝子を、ＴＡ
ｏｒｉｇｉｎａｌｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（インヴィト
ロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターに連結
し、ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７７を作製した。これを大腸
菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性とβ−ガラク
トシダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。ｐ
ＣＲ２．１／ＢＴＣ７７を有する形質転換体を培養し、
ＱＩＡｐｒｅｐ８Ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ（キアゲン
社製）を用いてｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７７を調製した。
ｐＢＲ３２２をＮｄｅＩで切断、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇｋｉｔ，宝酒造株式会
社製）で末端を平滑化し、再度連結する事によって、Ｎ
ｄｅＩ認識部位を欠損させたｐＢＲｄｅｓＮｄｅを作
製した。ｐＥＴ３ｃをＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶで切断
し、約０．２６ｋｂｐの断片を回収した後、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで末端を平滑化し、ｐＢＲｄｅｓＮｄｅ
のＳｃａＩ断片と連結して、ｐＢＲ／Ｔ７ｄｅｓＮｄ
ｅを作製した。また、部位特異的変異導入（Ｑｕｉｃｋ
Ｃｈａｎｇｅ，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ認識部位を欠損させたｐＢ
Ｒ３２２ｄｅｓＢａｍを作製した。ｐＢＲ３２２ｄｅｓ
ＢａｍのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＢＲ／Ｔ７
ｄｅｓＮｄｅのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＶ断片と連結し
て、テトラサイクリン耐性発現ベクターｐＴＣＩＩを作
製した。ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７７をＮｄｅＩ及びＢａ
ｍＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、約２４
０ｂｐの７７残基型ベータセルリン構造遺伝子をＱＩ
ＡｑｕｉｃｋＳｐｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫ
ｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。発現ベクター
ｐＴＣＩＩをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断してアガ
ロース電気泳動を行い、同様に約４．６ｋｂｐのバン
ドを回収した。７７残基型ベータセルリン構造遺伝子を
発現ベクターｐＴＣＩＩのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片
と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入してテトラサイ
クリン耐性で形質転換株を選択し、その株より再度プラ
スミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ７
７とした。このｐＴＣＩＩＢＴＣ７７を大腸菌ＭＭ２９
４（ＤＥ３）に導入して、テトラサイクリン耐性で形質
転換株を選択し、７７残基型ベータセルリン発現株ＭＭ
２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７７を取得した。

【００４７】実施例２７７残基型ベータセルリン発現株の培養７７残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）
／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７７を１０ｍｇ／Ｌのテトラサイク
リンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エ
キス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルで３０℃
１６時間培養した。得られた培養液１５０ｍＬを主発酵
用培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３
％リン酸二水素ナトリウム、０．１％塩化アンモニウ
ム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０２４％硫酸マ
グネシウム、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５、
０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、
１．０％カザミノ酸、１．０％イーストエキス）１．
５リットルを仕込んだ２Ｌ容ジャーファーメンターに移
植して、３７℃、通気量２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌回転数５
００ｒｐｍで通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が
約１２００クレット単位になった時点で、５．９５ｍｇ
／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧ添加時、添加後
１，２．５時間に０．７５％のグルコースを添加し培養
開始９時間後まで培養を行った。培養液を１００００ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離を行い、菌体を集めた。

【００４８】実施例３Ｍｅｔ−７７残基型ベータセルリンの精製実施例２で得られた菌体５ｇに１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
ＭＡＰＭＳＦ及び７Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．
１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＬを加
え、４℃で一晩攪拌し抽出を行った後、遠心分離（１０
０００ｒｐｍ、２０分間）を行った。得られた上清液１
０ｍＬに０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、１ｍＭ還元
型グルタチオン、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍアルギニ
ン塩酸塩及び２Ｍ尿素を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）２５０ｍＬを加え、４℃で一晩リフ
ォールディングを行った後。遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ、２０分間）を行い、遠心上清液２６０ｍＬを得た。
この遠心上清液をＹＭ３膜（分画分子量：３０００、ミ
リポア社）を用いて濃縮を行った。濃縮脱塩液８０ｍＬ
に２Ｍ尿素を１２０ｍＬ加えた後、塩酸でｐＨ５．０に
調整した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）を
行い、得られた遠心上清液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−トヨパール６５
０Ｍカラム（２．２ｃｍ×１２ｃｍ、東ソー社）に毎分
１０ｍＬの流速で吸着させ、平衡化に用いた緩衝液でよ
く洗浄した後、０Ｍから１．０Ｍの塩化ナトリウム直線
濃度勾配により溶出を行った。Ｍｅｔ−７７残基型ベー
タセルリンを含む画分を集め、その１／３量を０．１
％トリフルオロ酢酸で平衡化したＣ４Ｐ−５０カラム
（１．０ｃｍ×２５ｃｍ、昭和電工社）に吸着させ、１
３．５％から２１．２％のアセトニトリル直線濃度勾配
によりＭｅｔ−７７残基型ベータセルリンを溶出した。
同じ操作をさらに２回行い得られた溶出液を０．０２
％トリフルオロ酢酸で透析し、凍結乾燥を行った。凍結
乾燥粉末を蒸留水１０ｍＬで溶解し、酢酸型にしたＡＧ
１−Ｘ８カラム（１．０ｃｍ×１０ｃｍ、日本バイオラ
ッド社）を通過させた後、再度凍結乾燥を行いＭｅｔ−
７７残基型ベータセルリン８ｍｇを得た。

【００４９】実施例４７６残基型（Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリン発現
プラスミドの構築７６残基型（Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリンの発
現プラスミドは以下のように構築した〔図２〕。７６残
基型（Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリンの構造遺伝
子を、実施例１で構築したｐＴＣＩＩ／ＢＴＣ７７よ
り、構造遺伝子の上流に隣接してＮｄｅＩ切断部位及び
開始コドンを持つプライマー１（５'−ＣＡＴＡＴＧＧ
ＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧ）
及び７６番目のバリンの後に終止コドン及びＢａｍＨ
Ｉ切断部位を持つプライマー２（５'−ＧＧＡＴＣＣＣ
ＴＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡ
ＴＧ）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにより増幅
した遺伝子を、ＴＡｏｒｉｇｉｎａｌｃｌｏｎｉｎｇ
ｋｉｔ（インヴィトロジェン社製）を用いてｐＣＲ
２．１ベクターに連結し、ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７６を
作製した。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシ
リン耐性とβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として形質
転換体を選択した。ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７６を有す
る形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ８Ｍｉｎｉｐｒ
ｅｐｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＣＲ２．１／
ＢＴＣ７６を調製した。ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７６をＮ
ｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断してアガロース電気泳動
を行い、約２４０ｂｐの７６残基型ベータセルリン構
造遺伝子をＱＩＡｑｕｉｃｋＳｐｉｎＰｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎＫｉｔ（キアゲン社製）を用いてを回収し
た。実施例１で調製した発現ベクターｐＴＣＩＩをＮｄ
ｅＩ及びＢａｍＨＩで切断してアガロース電気泳動を
行い、同様に約４．６ｋｂｐのバンドを回収した。７６
残基型ベータセルリン構造遺伝子を発現ベクターｐＴＣ
ＩＩのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片と連結した後、大腸
菌ＪＭ１０９に導入してテトラサイクリン耐性で形質転
換株を選択し、その株より再度プラスミドを回収して、
発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ７６とした。このｐＴ
ＣＩＩＢＴＣ７６を大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）に導入
して、テトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、７
６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／
ｐＴＣＩＩＢＴＣ７６を取得した。

【００５０】実施例５７６残基型ベータセルリン発現株の培養７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）
／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７６を１０ｍｇ／Ｌのテトラサイク
リンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エ
キス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルで３０℃
１６時間培養した。得られた培養液を主発酵用培地
（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン
酸二水素ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、
０．０５％塩化ナトリウム、０．０２４％硫酸マグネ
シウム、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５、０．
０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．０
％カザミノ酸、１．０％イーストエキス）２０リット
ルを仕込んだ５０Ｌ容発酵槽に移植して、３７℃、通気
量２０Ｌ／ｍｉｎ、撹拌回転数２１０ｒｐｍで通気撹拌
培養を開始した。培養液の濁度が約１２００クレット単
位になった時点で、５．９５ｍｇ／Ｌのイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し
た。ＩＰＴＧ添加時、添加後２及び３．５時間にそれぞ
れ０．７５％のグルコースを添加し培養開始１１時間後
まで培養を行った。培養液を１００００ｒｐｍで３０分
間遠心分離を行い、菌体５４０ｇを集めた。

【００５１】実施例６Ｍｅｔ−７６残基型ベータセルリンの精製実施例５で得られた菌体３７５ｇに１ｍＭＥＤＴＡ、
１ｍＭＡＰＭＳＦ及び７Ｍグアニジン塩酸塩を含む
０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１．０Ｌを
加え、４℃で一晩攪拌し抽出を行った後、遠心分離（１
００００ｒｐｍ、２０分間）を行った。得られた上清液
１．０Ｌに０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、１ｍＭ還
元型グルタチオン、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍアルギ
ニン塩酸塩及び２Ｍ尿素を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）１９Ｌを加え、４℃で一晩リフォー
ルディングを行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、
２０分間）を行い、遠心上清液２０Ｌを得た。この遠心
上清液をペリコンカセットシステム（分画分子量：５０
００、ミリポア社）を用いて濃縮を行った。濃縮脱塩液
３．３Ｌに２Ｍ尿素を１３．２Ｌ加えた後、塩酸でｐ
Ｈ５．０に調整した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ５０ＨＳカラ
ム（２．２ｃｍ×１２ｃｍ、日本パーセプティブ社）に
毎分３０ｍＬの流速で吸着させ、平衡化に用いた緩衝液
でよく洗浄した後、０．３Ｍから１．３Ｍの塩化ナトリ
ウム直線濃度勾配により溶出を行った。７６残基型ベー
タセルリンを含む画分を集め、蒸留水で３倍に希釈した
後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で
平衡化したＴＳＫｇｅｌＣＭ−５ＰＷカラム（２．１
５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に添加した。Ｍｅｔ−
７６残基型ベータセルリンが吸着したＴＳＫｇｅｌＣ
Ｍ−５ＰＷカラムを、０．２４Ｍから０．４４Ｍの塩化
ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行った。Ｍｅｔ−
７６残基型ベータセルリンを含む画分を集め、０．１
％トリフルオロ酢酸で平衡化したＴＳＫｇｅｌＯＤＳ
−１２０Ｔカラム（２．１５ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー
社）に吸着させ、１７％から２４％のアセトニトリル直
線濃度勾配によりＭｅｔ−７６残基型ベータセルリンを
溶出した。溶出液を０．０２％トリフルオロ酢酸で透
析し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥粉末を蒸留水１０ｍ
Ｌで溶解し、酢酸型にしたＡＧ１−Ｘ８カラム（１．０
ｃｍ×１０ｃｍ、日本バイオラッド社）を通過させた
後、再度凍結乾燥を行いＭｅｔ−７６残基型ベータセル
リン９３ｍｇを得た。

【００５２】実施例７ベータセルリン改変体の特徴の決定実施例３で得られたＭｅｔ−７７残基型ベータセルリン
及び実施例６で得られたＭｅｔ−７６残基型ベータセル
リンの特徴を以下のように決定した。ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を用いた分析ベータセルリン改変体及び特開平１０−１９１９８９号
に記載の方法により調製したＭｅｔ−８０残基型ベータ
セルリンをサンプルバッファー（１２５ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１５％グリ
セロール、５％２−メルカプトエタノール、０．００
５％ブロムフェノールブルー）で懸濁し、マルチゲル
１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動
後のゲルをラピッドＣＢＢＫＡＮＴＯ（関東化学
社）で染色を行ったところ、いずれもほぼ単一バンドで
あった〔図３〕。ｂ）アミノ酸組成分析ベータセルリン改変体を４％チオグリコール酸を含む６
Ｎ塩酸で１１０℃、２４及び４８時間気相加水分解を行
い、アミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００ＡＡｍｉｎｏ
ＡｃｉｄＡｎａｌｙｚｅｒ）を用いてアミノ酸組成を
決定した。その結果、いずれの改変体も開始コドンＡＴ
Ｇに由来するメチオニンを含み、ｃＤＮＡ塩基配列から
予想されるアミノ酸組成と一致した〔表１，表２〕。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析Ｎ末端アミノ酸配列分析を気相プロテインシーケンサー
（アプライドバイオシステムズモデル４７７Ａ）を用
いて決定した。その結果、いずれの改変体もｃＤＮＡ塩
基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した。いずれ
の改変体も８０残基型と同様に開始コドンＡＴＧに由来
するメチオニンをＮ末端に有していた〔表３，表４〕。

【００５６】

【表３】

【００５７】

【表４】

【００５８】ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析気相ヒドラジン分解法（１００℃、６時間）により、Ｃ
末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００ＡＡ
ｍｉｎｏＡｃｉｄＡｎａｌｙｚｅｒ）を用いて決定
した。Ｍｅｔ−７７残基型ベータセルリンではアスパラ
ギン酸が、Ｍｅｔ−７６残基型ベータセルリンではバリ
ンが検出された〔表５，表６〕。

【表５】

【表６】

【００５９】実施例８３Ｔ３細胞を用いた増殖促進活性の測定モレキュラー・セル・バイオロジー、８巻、５８８（１
９８８）に記載のごとく、静止状態の３Ｔ３Ａ３１−
７１４クローン４（インターナショナル・ジャーナル・
オブ・キャンサー、１２巻、４６３（１９７３））中へ
の³Ｈ−チミジンの取り込みによって増殖促進活性を測
定した。すなわち、５％ウシ血清を含むダルベッコ改
変イーグルＭＥＭ培地を用いて、１０００細胞／ｍＬに
なるように懸濁した３Ｔ３Ａ３１−７１４クローン４
を９６ウェルプレートに１００μＬづつ播き、炭酸ガス
インキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％空気）にお
いて３７℃で１日培養した。上清７５μＬを抜き取り、
血清を含まないダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を１
００μＬ加える事により血清濃度を１％にした。さらに
２日間培養した後、種々の濃度の実施例３で調製したＭ
ｅｔ−７７残基型ベータセルリン、実施例６で調製した
Ｍｅｔ−７６残基型ベータセルリン及び特開平１０−１
９１９８９号に記載の方法により調製したＭｅｔ−８０
残基型ベータセルリンを添加した。添加１６時間後に³
Ｈ−チミジン［アマーシャム・ファルマシア・バイオテ
ク］を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ加え、その４時間後に
細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、５％ＳＤＳを１００
μＬ加え細胞を溶解した。細胞溶解液をシンチレーショ
ンバイアルに移し、シンチレーターＡ（和光純薬社）を
１ｍＬ加え、シンチレーションカウンターで³Ｈ−チミ
ジンの細胞への取り込みを測定した〔図４〕。

【００６０】実施例９ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化促進活性の測定化学発癌剤で誘発された膵臓癌由来細胞株ＡＲ４２Ｊ
［Ｃｈｉｒｉｓｔｏｐｈｅ；アメリカン・ジャーナル・
オブ・フィジオロギー（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．），２６６：Ｇ９６３（１９９４）］を、実施例３
で調製したＭｅｔ−７７残基型ベータセルリン、実施例
６で調製したＭｅｔ−７６残基型ベータセルリンまたは
特開平１０−１９１９８９号に記載の方法により調製し
たＭｅｔ−８０残基型ベータセルリン及び１０％ウシ胎
児血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用い
て１０⁵細胞／ｍＬになるように懸濁し、５００μＬを
チャンバースライドに播き、炭酸ガスインキュベーター
内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で５
日間培養した。５日後に細胞をＰＢＳで１回洗浄した後
に、１０％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％トラ
イトンＸ−１００で５分間処理した後に、ブロックエー
ス（雪印、日本）を添加し室温で４０分間ブロッキング
を行った。１０％ブロックエースで希釈した抗インス
リン抗体（アドバンスド・イムノ・ケミカル社）を添加
し室温、４０分間反応した。０．１％トライトンＸ−
１００を添加し室温５分間放置した後、ＰＢＳで３回洗
浄した。１０％ブロックエースで希釈したＦＩＴＣ（Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔ
ｅ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社）を添加し、
室温で４０分間反応した。０．１％トライトンＸ−１０
０を添加し室温５分間放置した後、ＰＢＳで３回洗浄
し、蛍光顕微鏡で観察した。いずれのベータセルリンを
添加した場合においても、蛍光染色された細胞、すなわ
ちインスリンを産生するβ細胞に分化した細胞が観察さ
れた〔図５〕。

【００６１】実施例１０ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ遺伝子発現ベクター
の構築 β細胞への分化促進活性はインスリンプロモーターの下
流にレポーターとしてアルカリフォスファターゼを連結
したものにより形質転換されたＡＲ４２Ｊ細胞を用いて
も実施した。すなわちベーターセルリンによりβ細胞へ
と分化した細胞はアルカリフォスファターゼを産生し、
このアルカリフォスファターゼの活性を測定することに
よりβ細胞への分化促進活性を定量的に測定することが
可能である。ラット尾から常法に従ってゲノムＤＮＡを
調製した。このＤＮＡをテンプレートとして、既報のラ
ットインスリンＩＩ遺伝子プロモーターの塩基配列（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ：ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｊ００７４
８）をもとに合成したプライマーＲＩ−１［５’−ＡＧ
ＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴ−
３’］およびＲＩ−３［５’−ＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴ
ＴＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧ−３’］を用いてＰＣＲ法によ
りインスリンプロモーター領域０．７５Ｋｂを増幅し
た。さらに、このＰＣＲ産物をテンプレートとしてプラ
イマーＲＩ−１Ｃｌａ［５’−ＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡ
ＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡ−３’］およびＲＩ−
３Ｘｈｏ［５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴ
ＴＡＧＧＧ−３’］を用いてＰＣＲを行った。増幅され
た０．７５ＫｂＤＮＡ断片を単離し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ
ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ６９８２０−１）に組み込
んで得られたプラスミドｐＴＢ１８８１を用いてクロー
ニングされた断片の塩基配列を決定し、ラットインスリ
ンプロモーターであることを確認した。プラスミドｐＴ
Ｂ１８８１をＸｈｏＩ−ＣｌａＩで切断してラットイ
ンスリンプロモーターである０．７３ｋｂＤＮＡ断片
を得た。次にヒト胎盤アルカリフォスファターゼ（ＰＬ
ＡＰ）をコードする２．０ｋｂｃＤＮＡ（Ｊ．Ｂｅ
ｒｇｅｒら、Ｇｅｎｅ６６，１（１９８８））の発現
プラスミドｐＴＢ１３３０をＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断して得られた２．７ｋｂＤＮＡ断片（ＰＬ
ＡＰｃＤＮＡ、ＳＶ４０由来スプライシング部位および
ポリＡ付加部位、ｐＢＲ３２２由来ｏｒｉおよびアンピ
シリン耐性遺伝子を含む）を単離し、前述のラットイン
シュリンプロモーター領域０．７３ｋｂＸｈｏＩ−Ｃ
ｌａＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応によって連結し
てプラスミドｐＴＢ１８９８を得た。

【００６２】実施例１１ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞の構築ＡＲ４２Ｊ細胞にＰＬＡＰ発現プラスミドｐＴＢ１８９
８とＴｎ５のｎｅｏ^r遺伝子を含むプラスミドｐＭＣｎ
ｅｏｐｏｌｙＡ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をトランス
フェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ^TM−ＬＴ１（Ｍｉｒｕ
ｓ、ＰｅｎＶｅｒａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い
て同時に導入した。導入後の細胞は１０％牛胎児血清を
加えたＤＭＥＭで２日間培養した後、Ｇ４１８（ゲネテ
シン、ＧＩＢＣＯＢＲＬ）８００ μｇ／ｍＬを添加
した選択培地に加えて培養を続けた。Ｇ４１８耐性とな
って生育した細胞を限界希釈法によりクローンを単離し
た。各クローンの細胞を２４穴プレートに播き、Ｍｅｔ
−８０残基型ベータセルリンを２０ｎｇ／ｍＬ添加お
よび無添加で４日間培養し、培養上清を集めて６５℃３
０分間熱処理を行った後、培地中のアルカリフォスファ
ターゼ活性を測定した。８０残基型ベータセルリン添加
時にアルカリフォスファターゼ活性の上昇が認められる
クローンを選択した。いくつかのクローンの結果を以下
の〔表７〕に示す。

【表７】

【００６３】実施例１２ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化促進活
性の測定実施例１１で構築したＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を、
各種濃度の実施例３で調製したＭｅｔ−７７残基型ベー
タセルリン、実施例６で調製したＭｅｔ−７６残基型ベ
ータセルリンまたは特開平１０−１９１９８９号に記載
の方法により調製したＭｅｔ−８０残基型ベータセルリ
ン及び１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグ
ルＭＥＭ培地を用いて１０⁵細胞／ｍＬになるように懸
濁し、１００μＬを９６ウェルプレートに播き、炭酸ガ
スインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％空気）
において３７℃で５日間培養した。５日後に培養上清を
サンプリングし、６５℃で３０分間処理した後、５０μ
Ｌをあらかじめ５０μＬの２ＸＳＥＡＰ（２Ｍジエタ
ノールアミン、１ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭホモアル
ギニン）を添加した９６ウェルマイクロプレートに加え
た。３７℃で１０分間保った後、２０ｍｇ／ｍＬのｐ−
ニトロフェニルリン酸（シグマ社）を１０μＬ添加し３
７℃で１６時間反応を行った〔図６〕。Ｍｅｔ−７７残
基型ベータセルリンおよびＭｅｔ−７６残基型ベータセ
ルリンはＭｅｔ−８０残基型ベータセルリンとほぼ同じ
分化誘導促進活性を示した。

【００６４】実施例１３２−７６残基型（Ｎ末端１残基、Ｃ末端３残基欠失型）
ベータセルリン発現株の構築２−７６残基型（Ｎ末端１残基、Ｃ末端３残基欠失型）
ベータセルリンの発現プラスミドは以下のように構築し
た〔図７〕。２−７６残基型（Ｎ末端１残基、Ｃ末端３
残基欠失型）ベータセルリンの構造遺伝子を、７６残基
型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現プラスミ
ドｐＴＣＩＩＢＴＣ７６［実施例４］より、２番目のグ
リシンの上流に隣接してＮｄｅＩ切断部位及び開始コ
ドンを持つプライマー３（５'−ＣＡＧＣＡＴＡＴＧＧ
ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴ）、および
Ｃ末端のバリンの後に終止コドン及びＢａｍＨＩ切断
部位を持つプライマー４（５' −ＧＧＡＴＣＣＣＴＡ
ＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴ
Ｇ）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにより増幅し
た遺伝子を、ＴＡｏｒｉｇｉｎａｌｃｌｏｎｉｎｇ
ｋｉｔ（インヴィトロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．
１ベクターに連結し、ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２−７６を作
製した。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリ
ン耐性を指標として形質転換体を選択した。ｐＣＲ２．
１ＢＴＣ２−７６を有する形質転換体を培養し、ＱＩＡ
ｐｒｅｐ８Ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ（キアゲン社製）
を用いてｐＣＲ２．１ＢＴＣ２−７６を調製した。ｐＣ
Ｒ２．１ＢＴＣ２−７６をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで
切断してアガロース電気泳動を行い、約２３０ｂｐの
２−７６残基型ベータセルリン構造遺伝子をＱＩＡＧＥ
Ｎｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（キアゲン社
製）を用いて回収した。発現ベクターｐＴＣＩＩ［実施
例１］をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断してアガロー
ス電気泳動を行い、同様に約４．６ｋｂｐのバンドを回
収した。２−７６残基型ベータセルリン構造遺伝子を発
現ベクターｐＴＣＩＩのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片と
連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入してテトラサイク
リン耐性で形質転換株を選択し、その株より再度プラス
ミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ２−
７６とした。このｐＴＣＩＩＢＴＣ２−７６を大腸菌Ｍ
Ｍ２９４（ＤＥ３）に導入して、テトラサイクリン耐性
で形質転換株を選択し、２−７６残基型ベータセルリン
発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２−７
６を取得した。

【００６５】実施例１４２−７６残基型ベータセルリン発現株の培養２−７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２−７６を１０ｍｇ／Ｌのテト
ラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５
％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）３０ｍＬで
３０℃、１６時間培養した。得られた培養液を主発酵用
培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％
リン酸二水素ナトリウム、０．１％塩化アンモニウ
ム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０１２％硫酸マ
グネシウム、０．０００７％塩酸チアミン、１．５％
ブドウ糖、１．５％ハイケース）２００ｍＬを入れた
１Ｌ容マイヤー６本に１０ｍｌずつ移植して、３７℃、
撹拌回転数２００ｒｐｍで撹拌培養を開始した。培養液
の濁度が約１６０クレット単位になった時点で、５．９
５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄーチオガラクト
ピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧ添加後４
時間後まで培養を行った。培養液を９０００ｒｐｍで３
０分間遠心分離を行い、菌体５．１ｇを集めた。

【００６６】実施例１５２−７６残基型ベータセルリンの精製実施例１４で得られた菌体５ｇに１ｍＭＥＤＴＡ、１
ｍＭＡＰＭＳＦ及び７Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．
１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５ｍＬを加
え、４℃で一晩撹拌し抽出を行った後、遠心分離（９０
００ｒｐｍ、１０分間）を行った。得られた上清液１５
ｍＬに０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、１ｍＭ還元型
グルタチオン、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍアルギニン
塩酸塩及び２Ｍ尿素を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）２５０ｍＬを加え、４℃で一晩リフォー
ルディングを行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、
１０分間）を行い、遠心上清液２６５ｍＬを得た。この
遠心上清液に２Ｍ尿素を１Ｌ加えた後、酢酸でｐＨ
５．０に調整し、４℃で一晩静置した。遠心分離（１０
０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、得られた遠心上清液
を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡
化したＰＯＲＯＳ５０ＨＳカラム（２．２ｃｍ×１２
ｃｍ、日本パーセプティブ社）に毎分３０ｍＬの流速で
吸着させ、平衡化に用いた緩衝液でよく洗浄した後、
０．３Ｍから１．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配に
より溶出を行った。２−７６残基型ベータセルリンを含
む画分を集め、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．５）で３倍に希釈した後、この緩衝液で平衡化した
ＴＳＫｇｅｌＣＭ−５ＰＷカラム（０．７５ｃｍ×
７．５ｃｍ、東ソー社）に添加した。２−７６残基型ベ
ータセルリンが吸着したＴＳＫｇｅｌＣＭ−５ＰＷカ
ラムを、０．３Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウム直線濃
度勾配により溶出を行った。２−７６残基型ベータセル
リンを含む画分を集め、０．１％トリフルオロ酢酸で
平衡化したＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔカラム
（２．１５ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２
０％から４４％のアセトニトリル直線濃度勾配により２
−７６残基型ベータセルリンを溶出した。溶出液を凍結
乾燥した後、蒸留水５ｍＬで溶解し、酢酸型にしたＡＧ
１−Ｘ８カラム（１．０ｃｍ×１０ｃｍ、日本バイオラ
ッド社）を通過させた後、再度凍結乾燥を行い２−７６
残基型ベータセルリン０．７ｍｇを得た。

【００６７】実施例１６２４−７６残基型（Ｎ末端２３残基、Ｃ末端３残基欠失
型）ベータセルリン発現株の構築２４−７６残基型（Ｎ末端２３残基、Ｃ末端３残基欠失
型）ベータセルリンの発現プラスミドは以下のように構
築した〔図８〕。２４−７６残基型（Ｎ末端２３残基、
Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリンの構造遺伝子を、
実施例４で調製した７６残基型（Ｃ末端３残基欠失型）
ベータセルリン発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ７６よ
り、２４番目のアラニンの上流に隣接してＮｄｅＩ切
断部位及び開始コドンを持つプライマー５（５’−ＣＡ
ＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＴＣＡ
ＡＡＧ）、およびＣ末端のバリンの後に終止コドン及び
ＢａｍＨＩ切断部位を持つプライマー４（５’−ＧＧ
ＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣ
ＴＣＣＡＡＴＧ）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ
により増幅した遺伝子を、ＴＡｏｒｉｇｉｎａｌｃｌ
ｏｎｉｎｇｋｉｔ（インヴィトロジェン社製）を用い
てｐＣＲ２．１ベクターに連結し、ｐＣＲ２．１ＢＴＣ
２４−７６を作製した。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入
し、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択し
た。ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２４−７６を有する形質転換体
を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ８Ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ
（キアゲン社製）を用いてｐＣＲ２．１ＢＴＣ２４−７
６を調製した。ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２４−７６をＮｄｅ
Ｉ及びＢａｍＨＩで切断してアガロース電気泳動を行
い、約１６０ｂｐの２４−７６残基型ベータセルリン構
造遺伝子をＱＩＡＧＥＮｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。実施例１
で調製した発現ベクターｐＴＣＩＩをＮｄｅＩ及びＢ
ａｍＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、同様
に約４．６ｋｂｐのバンドを回収した。２４−７６残基
型ベータセルリン構造遺伝子を発現ベクターｐＴＣＩＩ
のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片と連結した後、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に導入してテトラサイクリン耐性で形質転換株
を選択し、その株より再度プラスミドを回収して、発現
プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６とした。このｐ
ＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６を大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ
３）に導入して、テトラサイクリン耐性で形質転換株を
選択し、２４−７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２
９４（ＤＥ３）ｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６を取得し
た。

【００６８】実施例１７２４−７６残基型ベータセルリン発現株の培養２４−７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（Ｄ
Ｅ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６を１０ｍｇ／Ｌの
テトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）３０
ｍＬで３０℃、１６時間培養した。得られた培養液を主
発酵用培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、
０．３％リン酸二水素ナトリウム、０．１％塩化アン
モニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０１２％
硫酸マグネシウム、０．０００７％塩酸チアミン、１．
５％ブドウ糖、１．５％ハイケース）１５０ｍＬを入
れた１Ｌ容マイヤー５本に移植して、３７℃、撹拌回転
数２００ｒｐｍで撹拌培養を開始した。培養液の濁度が
約１６０クレット単位になった時点で、５．９５ｍｇ／
Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧ添加後４時間後まで
培養を行った。培養液を１００００ｒｐｍで３０分間遠
心分離を行い、菌体３．９ｇを集めた。

【００６９】実施例１８２４−７６残基型ベータセルリンの精製実施例５で得られた菌体３．９ｇに１ｍＭＥＤＴＡ、
１ｍＭＡＰＭＳＦ及び７Ｍグアニジン塩酸塩を含む
０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１２ｍＬを
加え、４℃で一晩撹拌し抽出を行った後、遠心分離（９
０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。得られた上清液１
２ｍＬに０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、１ｍＭ還元
型グルタチオン、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍアルギニ
ン塩酸塩及び２Ｍ尿素を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）２００ｍＬを加え、４℃で一晩リフォ
ールディングを行った後、遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ、１０分間）を行い、遠心上清液２１２ｍＬを得た。
この遠心上清液に２Ｍ尿素を０．８Ｌ加えた後、酢酸で
ｐＨ５．０に調整し、４℃で一晩静置した。遠心分離
（１００００ｒｐｍ、１０分間）を行い、得られた遠心
上清液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）
で平衡化したＰＯＲＯＳ５０ＨＳカラム（２．２ｃｍ
×１２ｃｍ、日本パーセプティブ社）に毎分３０ｍＬの
流速で吸着させ、平衡化に用いた緩衝液でよく洗浄した
後、０．３Ｍから１．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾
配により溶出を行った。２４−７６残基型ベータセルリ
ンを含む画分を集め、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４．５）で３倍に希釈した後、この緩衝液で平衡
化したＴＳＫｇｅｌＣＭ−５ＰＷカラム（０．７５ｃ
ｍ×７．５ｃｍ、東ソー社）に添加した。２４−７６残
基型ベータセルリンが吸着したＴＳＫｇｅｌＣＭ−５
ＰＷカラムを、０．３Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウム
直線濃度勾配により溶出を行った。２４−７６残基型ベ
ータセルリンを含む画分を集め、０．１％トリフルオ
ロ酢酸で平衡化したＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔカ
ラム（２．１５ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に吸着さ
せ、２０％から４４％のアセトニトリル直線濃度勾配に
より２４−７６残基型ベータセルリンを溶出した。溶出
液を凍結乾燥した後、蒸留水５ｍＬで溶解し、酢酸型に
したＡＧ１−Ｘ８カラム（１．０ｃｍ×１０ｃｍ、日本
バイオラッド社）を通過させた後、再度凍結乾燥を行い
２４−７６残基型ベータセルリン０．４ｍｇを得た。

【００７０】実施例１９ベータセルリン改変体の特徴の決定実施例３で得られた２−７６残基型ベータセルリン及び
実施例６で得られた２４−７６残基型ベータセルリンの
特徴を以下のように決定した。ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を用いた分析ベータセルリン改変体及び実施例６で調製した７６残基
型ベータセルリンをサンプルバッファー（１２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１
５％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール、
０．００５％ブロムフェノールブルー）で懸濁し、マ
ルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動を行っ
た。泳動後のゲルをラピッドＣＢＢＫＡＮＴＯ（関東
化学社）で染色を行ったところ、いずれもほぼ単一バン
ドであった〔図９〕。ｂ）アミノ酸組成分析ベータセルリン改変体を４％チオグリコール酸を含む６
Ｎ塩酸で１１０℃、２４及び４８時間気相加水分解を
行い、アミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００ＡＡｍｉｎｏ
ＡｃｉｄＡｎａｌｙｚｅｒ）を用いてアミノ酸組成
を決定した。その結果、いずれの改変体もｃＤＮＡ塩基
配列から予想されるアミノ酸組成と一致した〔表８，表
９〕。

【００７１】

【表８】

【００７２】

【表９】

【００７３】ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析Ｎ末端アミノ酸配列分析を気相プロテインシーケンサー
（アプライドバイオシステムズモデル４７７Ａ）を用
いて決定した。その結果、いずれの改変体もｃＤＮＡ塩
基配列から予想されるアミノ酸配列と一致した〔表１
０，表１１〕。

【００７４】

【表１０】

【００７５】

【表１１】

【００７６】ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析気相ヒドラジン分解法（１００℃、６時間）により、Ｃ
末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
ＡｍｉｎｏＡｃｉｄＡｎａｌｙｚｅｒ）を用いて決
定した。いずれの改変体もバリンが検出された〔表１
２，表１３〕。

【表１２】

【表１３】

【００７７】実施例２０１）Ａ４３１細胞を用いたＥＧＦバインディングアッセ
イＥＧＦレセプター高発現株であるヒト扁平上皮癌細胞Ａ
４３１細胞を用いた¹²⁵Ｉ−ＥＧＦに対する結合阻害活
性によって細胞増殖促進活性を測定した。すなわち、１
０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥ
Ｍ（ＤＭＥＭ）培地を用いて、１０⁵細胞／ｍＬになる
ように懸濁したＡ４３１細胞を９６ウェルプレートに１
００μＬずつ播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％
炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で２日間培養し
た。２日後に２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび０．１％ウシ
血清アルブミンを含む、ＤＭＥＭとＦ−１２を等量混合
した結合培地２００μＬ／ウェルで３回洗浄した後、各
種濃度の標識されていないＥＧＦ、実施例１５で調製し
た２−７６残基型ベータセルリン、実施例１８で調製し
た２４−７６残基型ベータセルリン、実施例６で調製し
たＭｅｔ−７６残基型ベータセルリン、または特開平１
０−１９１９８９号に記載の用法により調製したＭｅｔ
−８０残基型ベータセルリン及び０．２５ｎＭ ¹²⁵Ｉ
−ＥＧＦ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を
含む結合培地１００μＬを添加した。４℃、９０分静置
した後に結合培地２００μＬで３回洗浄し、１％ＳＤ
Ｓを含む０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２００μＬ
で細胞を溶解した。細胞溶解液をシンチレーションバイ
アルに移し、シンチレーターＡ（和光純薬社）を１ｍＬ
加え、シンチレーションカウンターで¹²⁵Ｉ−ＥＧＦに
対する結合阻害活性を測定した。２）ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ発現ＡＲ４２Ｊ
細胞を用いたβ細胞分化促進活性の測定ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を、各種濃度の実施例１５
で調製した２−７６残基型ベータセルリン、実施例１８
で調製した２４−７６残基型ベータセルリン、実施例６
で調製したＭｅｔ−７６残基型ベータセルリン、または
特開平１０−１９１９８９号に記載の用法により調製し
たＭｅｔ−８０残基型ベータセルリン及び１０％ウシ
胎児血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用
いて１０⁵細胞／ｍＬになるように懸濁し、１００μＬ
を９６ウェルプレートに播き、炭酸ガスインキュベータ
ー内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で
５日間培養した。５日後に培養上清をサンプリングし、
６５℃で３０分間処理した後、５０μＬをあらかじめ５
０μＬの２ｘＳＥＡＰ（２Ｍジエタノールアミン、１
ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭホモアルギニン）を添加し
た９６ウェルマイクロプレートに加えた。２０ｍｇ／ｍ
Ｌのｐ−ニトロフェニルリン酸（シグマ社）を１０μＬ
添加し３７℃で１６時間反応を行った。いずれの改変体
もＥＧＦ活性対ＢＴＣ活性の比がＭｅｔ−８０残基型ベ
ータセルリンの５％ほどに低下し、Ｍｅｔ−７６残基型
ベータセルリンと同程度でありＮ末欠失による影響は認
められなかった。３)上記１）および２）の結果を〔表１４〕にまとめ示
す。

【表１４】

【００７８】実施例２１Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ４間にヘレギュリン（Ｈｅｒ）に由来
する３残基が挿入されたｈＢＴＣ５０改変分子Ａ発現プ
ラスミドｐＴＢ１９８５の構築ｐＴＢ１９７６をテンプレートとして、（１）５'側プ
ライマーＰＥＴ−１：５'−ＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧ
ＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧ−３'および３'
側プライマーＢＴＣ−１：５'−ＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴ
ＣＧＡＧＧＧＧＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＡ−３'、
（２）５'側プライマーＢＴＣ−２：５'−ＴＧＧＣＣＧ
ＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＣＴ−
３'および３'側プライマーＢＴＣ−３：５'−ＴＣＴＡ
ＴＧＣＧＣＡＣＣＣＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴ
Ｃ−３'を用いて、それぞれＰＣＲを行った。次に
（１）と（２）のＰＣＲ産物の混合物をテンプレートと
して、５'側プライマーＢＴ−９５ｈ、３’側プライマ
ーＢＴ−９４ｈを用いてＰＣＲを行い、ｈＢＴＣ５０の
Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ４間にＨｅｒの配列中の３アミノ酸
（Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ）を挿入した改変分子Ａをコ
ードするＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩ
およびＢａｍＨＩで消化後、ｐＥＴ−３ｃのＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ部位に組み込み、ｐＴＢ１９８５を作製し
た。

【００７９】実施例２２Ｎ末７残基をその部位に相当する上皮成長因子（ＥＧ
Ｆ）の５残基で置換されたｈＢＴＣ５０改変分子Ｂ発現
プラスミドｐＴＢ１９８７の構築ｐＴＢ１９７６をテンプレートとして、５'側プライマ
ーＢＴＣ−７：５'−ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＧ
ＣＧＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣ−３'およ
び３'側プライマーＢＴ−９４ｈを用いてＰＣＲを行
い、ｈＢＴＣ５０のＮ末７残基を相当するＥＧＦの５残
基に置換した改変分子ＢをコードするＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化
後、ｐＥＴ３ｃのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込
み、ｐＴＢ１９８７を作製した。

【００８０】実施例２３大腸菌での発現Ｔ７ファージのΦ１０プロモーターの支配下に、後述の
参考例および上記の実施例で得られたプラスミドｐＴＢ
１９７６、プラスミドｐＴＢ１９８５およびプラスミド
ｐＴＢ１９８７を、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／
ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。それぞれの
大腸菌組換え体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび
１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地を
用いて３７℃で培養した。クレットユニット１６０の時
点でイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを
最終濃度０．４ｍＭになるように添加し、さらに３７℃
で４時間培養を継続した。培養後遠心により集菌し、抽
出操作まで−８０℃で保存した。

【００８１】実施例２４ｈＢＴＣ５０、改変分子Ａおよび改変分子Ｂの精製４−１）大腸菌封入体の調製４００ｍｌの培養液から集めた菌体を２０ｍｌの１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％ｓｕｃｒ
ｏｓｅ、１０ｍＭＥＤＴＡに懸濁して、凍結・融解し
た後、氷中に３０分間静置して完全に細胞を溶かした。
氷冷下で超音波破砕（１０ｓｅｃ，３回）後、遠心（９
０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，４℃：Ｂｅｃｋｍａｎ）し
て再度沈殿を集めた。この洗浄操作を３回繰り返して封
入体を調製した。４−２）タンパクの抽出およびリフォールデイング４−１）で得られた封入体を８ｍｌの７Ｍｇｕａｎｉ
ｄｉｎｅ−ＨＣｌ、０．１ＭＴｒｉｓ−ＣＨ₃ＣＯＯ
Ｈ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡに懸濁して４℃、
１時間スターラーで穏やかに撹拌し、組換えタンパクを
抽出した。次に還元型グルタチオンを０．１Ｍになるよ
うに添加して、ＮａＯＨ溶液でｐＨを８．４に合わせた
後、抽出液中に窒素ガスを吹き込み空気と置換した。室
温で２時間静置した後、２０倍容量の１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＣＨ₃ＣＯＯＨ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭフェニ
ルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭベンズアミジ
ンで稀釈した。遠心（９０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，２
５℃）して不溶物を除いた上清に、酸化型グルタチオン
を０．５ｍＭになるように添加し、室温で１６時間静置
した。次いで、遠心（９０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，２
５℃）上清を凍結乾燥して濃縮後、４℃で５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＣＨ₃ＣＯＯＨ（ｐＨ５．５）、１ｍＭＥＤＴ
Ａに透析（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ：ＭＷＣＯ１，０
００）した。透析後、遠心（９０００ｒｐｍ，１５ｍｉ
ｎ，４℃）上清を酢酸セルロース膜（ＭｉｌｌｅｘＧ
Ｖ，０．２２ｕｍ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し
て、不溶物を除いた。４−３）タンパクの精製リフォールデイングしたタンパクを含む溶液を５０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で平衡化した陽イオン
交換ＨＰＬＣカラム（２５０×４．１ｍｍＩ．ｄ．，
ＳｙｎｃｈｒｏｍＣＭ３００，Ｓｙｎｃｈｒｏｐａ
ｋ）にかけ、０−１ＭのＮａＣｌ濃度勾配でタンパクを
溶出、分画した。ＯＤ₂₈₀でモニターした溶出画分を、
０．１％ＨＣｌ、１％ＣＨ₃ＣＮで平衡化したＣ₄逆相
ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６ｍｍＩ．ｄ．，Ｕｌ
ｔｒｏｎ３００Ｃ₄：Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋｉ
ｎｇＣｅｎｔｅｒ）にかけて、１−４０％のＣＨ₃Ｃ
Ｎ濃度勾配で溶出した。次にカラムクロマトグラフィー
で得たピーク画分を凍結乾燥した。改変分子ＡおよびＢ
の収量は、各々７８．７μｇおよび１０３．１μｇであ
った。４−４）タンパクの純度検定精製標品の純度検定の目的で、Ｃ₁₈逆相ＨＰＬＣカラム
（１５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．，ＯＤＳ１２０Ｔ，Ｔｏ
ｓｏｈ）にかけて、１５〜３０％のＣＨ₃ＣＮ濃度勾配
で溶出し、改変分子ＡおよびＢのピークパターンの単一
性を確認した。両タンパクの純度は９４％以上であるこ
とが分かった。

【００８２】実施例２５３Ｔ３細胞を用いた細胞増殖促進活性の測定モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、8
巻、588頁、1988年に記載の方法に準じ、静止状態の３
Ｔ３Ａ３１−７１４クローン４（インターナショナル
・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２巻、４６３頁、
１９７３年）中への³Ｈ−チミジンの取り込みによって
細胞増殖促進活性を測定した。５％ウシ血清を含むダ
ルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用いて、１０００細
胞／ｍＬになるように懸濁した３Ｔ３Ａ３１−７１４
クローン４を９６ウェルプレートに１００μＬづつ播
き、炭酸ガスインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５
％空気）において３７℃で１日培養した。上清７５μＬ
を抜き取り、血清を含まないダルベッコ改変イーグルＭ
ＥＭ培地を１００μＬ加えることにより血清濃度を１％
にした。さらに２日間培養した後、種々の濃度の上記の
実施例で調製したｈＢＴＣ５０、改変分子Ａまたは改変
分子Ｂを添加した。添加１６時間後に³Ｈ−チミジン
［アマーシャム・ファルマシア・バイオテク］を０．２
５μＣｉ／ｗｅｌｌ加え、その４時間後に細胞をＰＢＳ
で３回洗浄した後、５％ＳＤＳを１００μＬ加え細胞
を溶解した。細胞溶解液をシンチレーションバイアルに
移し、シンチレーターＡ（和光純薬社）を１ｍＬ加え、
シンチレーションカウンターで³Ｈ−チミジンの細胞へ
の取り込みを測定した。この測定結果より、８０残基型
ベータセルリン（標準品）の最大取り込み値を１００％
として、５０％の活性を示した時のｈＢＴＣ５０および
改変分子の濃度（ＥＤ₅₀）を求めた結果を〔表１５〕に
示す。

【表１５】

【００８３】実施例２６ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化誘導活性の測定上記で調製したｈＢＴＣ５０、改変分子Ａ、改変分子Ｂ
および特開平１０−１９１９８９号に記載の方法により
調製した８０残基型ベータセルリン（ｈＢＴＣ８０）か
ら選ばれる１種と、１０％ウシ胎児血清とを含むダル
ベッコ改変イーグルＭＥＭ培地に、化学発癌剤で誘発さ
れた膵臓癌由来細胞株ＡＲ４２Ｊ［Chiristophe; アメ
リカン・ジャーナル・オブ・フィジオロギー(Am. J. Ph
ysiol.）,２６６巻、Ｇ９６３頁、１９９４年］を１０⁵
細胞／ｍＬになるように懸濁し、５００ μＬをチャン
バースライドに播き、炭酸ガスインキュベーター内（５
％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で５日間培
養した。５日後に細胞をＰＢＳで１回洗浄した後に、１
０％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ
−１００で５分間処理した後に、ブロックエース（雪
印、日本）を添加し、室温で４０分間ブロッキングを行
った。１０％ブロックエースで希釈した抗インスリン
抗体（アドバンスド・イムノ・ケミカル社）を添加し室
温、４０分間反応した。０．１％トリトンＸ−１００
を添加し室温５分間放置した後、ＰＢＳで３回洗浄し
た。１０％ブロックエースで希釈したＦＩＴＣ（Fluor
escein Isothiocyanate）標識抗マウスＩｇＧ抗体（カ
ッペル社）を添加し、室温で４０分間反応した。０．１
％トリトンＸ−１００を添加し室温５分間放置した後、
ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その結
果、ｈＢＴＣ８０を添加した場合と同様に、ｈＢＴＣ５
０、改変分子Ａおよび改変分子Ｂを添加した場合におい
ても、蛍光染色された細胞、すなわちインスリンを産生
するβ細胞に分化した細胞が観察された。また、インス
リン産生細胞の出現頻度は、ｈＢＴＣ８０、ｈＢＴＣ５
０、改変分子Ａおよび改変分子Ｂ間で差が見られなかっ
た。

【００８４】実施例２７ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化誘導活
性の測定３−１）ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ遺伝子発
現ベクターの構築 β細胞への分化促進活性はインスリンプロモーターの下
流にレポーターとしてアルカリフォスファターゼ遺伝子
を連結したものにより形質転換されたＡＲ４２Ｊ細胞を
用いても実施した。すなわちベーターセルリンによりβ
細胞へと分化した細胞はアルカリフォスファターゼを産
生し、このアルカリフォスファターゼの活性を測定する
ことによりβ細胞への分化促進活性を定量的に測定する
ことが可能である。ラット尾から常法に従ってゲノムＤ
ＮＡを調製した。このＤＮＡをテンプレートとして、既
報のラットインスリンＩＩ遺伝子プロモーターの塩基配
列（GenBank:Accession No. J00748）をもとに合成した
プライマーＲＩ−１：５'−ＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴ−３'およびプライマーＲＩ
−３：５'−ＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧ
ＧＧＧ−３'を用いてＰＣＲ法によりインスリンプロモ
ーター領域０．７５Ｋｂを増幅した。さらに、このＰ
ＣＲ産物をテンプレートとしてプライマーＲＩ−１Ｃｌ
ａ：５'−ＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＣＣＣＡ−３'およびプライマーＲＩ−３Ｘｈｏ：
５'−ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧ
−３'を用いてＰＣＲを行った。増幅された０．７５Ｋ
ｂＤＮＡ断片を単離し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Nov
agen 69820-1）に組み込んで得られたプラスミドｐＴＢ
１８８１を用いてクローニングされた断片の塩基配列を
決定し、ラットインスリンＩＩプロモーターであること
を確認した。プラスミドｐＴＢ１８８１をＸｈｏＩ−
ＣｌａＩで切断してラットインスリンプロモーターで
ある０．７３ｋｂＤＮＡ断片を得た。次にヒト胎盤ア
ルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）をコードする２．
０ｋｂｃＤＮＡ（J. Bergerら、Gene 66, 1(1988)）
の発現プラスミドｐＴＢ１３３０をＸｈｏＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで切断して得られた２．７ｋｂＤＮＡ断片
（ＰＬＡＰｃＤＮＡ、ＳＶ４０由来スプライシング部
位およびポリＡ付加部位、ｐＢＲ３２２由来ｏｒｉおよ
びアンピシリン耐性遺伝子を含む）を単離し、前述のラ
ットインシュリンプロモーター領域０．７３ｋｂＸｈ
ｏＩ−ＣｌａＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応によ
って連結してプラスミドｐＴＢ１８９８を得た。

【００８５】３−２）ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞の構
築ＡＲ４２Ｊ細胞にＰＬＡＰ発現プラスミドｐＴＢ１８９
８とＴｎ５のｎｅｏ^r遺伝子を含むプラスミドｐＭＣｎ
ｅｏｐｏｌｙＡ（STRATAGENE）をトランスフェクショ
ン試薬ＴｒａｎｓＩＴ^TM−ＬＴ１（Mirus、PenVera Cor
poration）を用いて同時に導入した。導入後の細胞は１
０％牛胎児血清を加えたＤＭＥＭで２日間培養した後、
Ｇ４１８（ゲネチシン、GIBCO BRL）８００μｇ／ｍＬ
を添加した選択培地にかえて培養を続けた。Ｇ４１８耐
性となって生育した細胞を限界希釈法によりクローンを
単離した。各クローンの細胞を２４穴プレートに播き、
８０残基型ＢＴＣを２０ｎｇ／ｍＬ添加および無添加で
４日間培養し、培養上清を集めて６５℃、３０分間熱処
理を行った後、培地中のアルカリフォスファターゼ活性
を測定した。８０残基型ベータセルリン添加時にアルカ
リフォスファターゼ活性の上昇が認められるクローンを
選択し、その中の1クローンＡＲ７１−１０４を以下の
検討に用いた。３−３）ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分
化誘導活性の測定各種濃度の上記で調製したｈＢＴＣ５０、改変型分子Ａ
および改変型分子Ｂから選ばれる１種と、１０％ウシ胎
児血清とを含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地に、
上記３−２）で構築したＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を
３×１０⁴細胞／ｍＬになるように懸濁し、１００μＬ
を９６ウェルプレートに播き、炭酸ガスインキュベータ
ー内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で
５日間培養した。５日後に培養上清をサンプリングし、
６５℃で３０分間処理した後、５０μＬをあらかじめ５
０μＬの２ＸＳＥＡＰ（２Ｍジエタノールアミン、１
ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭホモアルギニン）を添加
した９６ウェルマイクロプレートに加えた。３７℃で１
０分間保った後、２０ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニル
リン酸（シグマ社）を１０μＬ添加し３７℃で１６時間
反応を行い、４０５ｎｍの吸光度Ａ₄₀₅を測定した。ｈ
ＢＴＣ５０添加時の最大吸光度を１００％とした際の５
０％の活性を示すのに必要なタンパク濃度（ＥＤ₅₀）を
〔表１６〕に示す。

【表１６】

【００８６】参考例１５０残基型ヒトベータセルリン（ｈＢＴＣ５０）発現プ
ラスミドｐＴＢ１９７６の構築８０残基型ｈＢＴＣｃＤＮＡを組み込んだプラスミド
ｐＴＢ１５１６（特開平６−８７８９４号公報記載；受
託番号ＦＥＲＭＢＰ−３８３６，受託番号ＩＦＯ１５
２８２）をテンプレートとして、プライマーＢＴ−９５
ｈ：５'−ＡＧＣＡＴＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣ
ＴＴＣＴＣＴＡＧＧＴ−３'およびＢＴ−９４ｈ：５'−
ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣ
ＴＣＴＣＴ−３'を用いてＰＣＲを行った。ｈＢＴＣの
Ｃ末５０残基型の５'末端に翻訳開始コドンおよびＮｄ
ｅＩサイトを、３'末端に終止コドンおよびＢａｍＨＩ
サイトをそれぞれ挿入したＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよび
ＢａｍＨＩで消化し、Ｔ７ファージのΦ１０プロモータ
ーを保持する発現用プラスミドｐＥＴ−３ｃ（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にＤＮＡＬｉ
ｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を
用いて組み込み、ｈＢＴＣ５０の発現プラスミドｐＴＢ
１９７６を作製した。組み込んだｃＤＮＡの塩基配列は
ＡＢＩ社のＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３７７ＤＮＡ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）により確認した。プラスミドｐ
ＴＢ１９７６の構築の概略を〔図１０〕に示す。

【００８７】

【発明の効果】本発明のベータセルリンムテインまたは
その塩は、ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が減
弱されており、抗原性の問題もないことから、優れた糖
尿病治療薬として有用である。

【００８８】

【配列表】 <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Betacellulin Mutein <130> A99271 <150> JP 10-350377 <151> 1998-12-09 <150> JP 11-055326 <151> 1999-03-03 <160> 56 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp 65 70 75 <210> 2 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val 65 70 75 <210> 3 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys 20 25 30 Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp 35 40 45 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys 20 25 30 Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val 35 40 45 <210> 5 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 5 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe Tyr 65 70 75 <210> 6 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe 65 70 75 <210> 7 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 7 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu 65 70 75 <210> 8 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe Tyr 65 70 75 <210> 9 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 9 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe 65 70 75 <210> 10 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys 20 25 30 Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe 35 40 45 Tyr <210> 11 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 11 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys 20 25 30 Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe 35 40 45 <210> 12 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys 20 25 30 Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu 35 40 45 <210> 13 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 13 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys 20 25 30 Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe 35 40 45 Tyr <210> 14 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys 20 25 30 Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe 35 40 45 <210> 15 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180 TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTTGA C 231 <210> 16 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180 TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTT 228 <210> 17 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA 60 TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA 120 GCAAGGTGTG AGAGAGTTGA C 141 <210> 18 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA 60 TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA 120 GCAAGGTGTG AGAGAGTT 138 <210> 19 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180 TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTTTT GTTTTAC 237 <210> 20 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180 TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTTTT GTTT 234 <210> 21 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180 TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTTTT G 231 <210> 22 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180 TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTTGA CTTTTAC 237 <210> 23 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180 TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTTGA CTTT 234 <210> 24 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA 60 TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA 120 GCAAGGTGTG AGAGAGTTTT GTTTTAC 147 <210> 25 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA 60 TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA 120 GCAAGGTGTG AGAGAGTTTT GTTT 144 <210> 26 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 26 CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA 60 TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA 120 GCAAGGTGTG AGAGAGTTTT G 141 <210> 27 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 27 CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA 60 TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA 120 GCAAGGTGTG AGAGAGTTGA CTTTTAC 147 <210> 28 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 28 CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA 60 TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA 120 GCAAGGTGTG AGAGAGTTGA CTTT 144 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 29 CATATGGATG GGAATTCCAC CAGAAGTCCT G 31 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 30 GGATCCCTAG TCAACTCTCT CACACCTTGC TCC 33 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 31 AGAGTCAAGG ATCCCCCAAC CACT 24 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 32 AGCTGGTCAC TTAGGGCTGG GG 22 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 33 GAATCGATAG AGTCAAGGAT CCCCCA 26 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 34 GACTCGAGCT GGTCACTTAG GG 22 <210> 35 <211> 80 <212> PRT <213> Human <400> 35 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr 65 70 75 80 <210> 36 <211> 240 <212> DNA <213> Human <400> 36 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180 TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTTGA CTTGTTTTAC 240 <210> 37 <211> 75 <213> Artificial Sequence <400> 37 Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pto Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp 1 5 10 15 Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly 20 25 30 His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly 35 40 45 Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp 50 55 60 Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val 65 70 75 <210> 38 <211> 53 <213> Artificial Sequence <400> 38 Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro 1 5 10 15 Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val 20 25 30 Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala 35 40 45 Arg Cys Glu Arg Val 50 53 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 39 CAGCATATGG GGAATTCCAC CAGAAGTCCT 30 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 40 GGATCCCTAA ACTCTCTCAC ACCTTGCTCC AATG 34 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 41 CAGCATATGG CTACCACCAC ACAATCAAAG 30 <210> 42 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 42 GGGAATTCCA CCAGAAGTCC TGAAACTAAT GGCCTCCTCT GTGGAGACCC TGAGGAAAAC 60 TGTGCAGCTA CCACCACACA ATCAAAGCGG AAAGGCCACT TCTCTAGGTG CCCCAAGCAA 120 TACAAGCATT ACTGCATCAA AGGGAGATGC CGCTTCGTGG TGGCCGAGCA GACGCCCTCC 180 TGTGTCTGTG ATGAAGGCTA CATTGGAGCA AGGTGTGAGA GAGTT 225 <210> 43 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 43 GCTACCACCA CACAATCAAA GCGGAAAGGC CACTTCTCTA GGTGCCCCAA GCAATACAAG 60 CATTACTGCA TCAAAGGGAG ATGCCGCTTC GTGGTGGCCG AGCAGACGCC CTCCTGTGTC 120 TGTGATGAAG GCTACATTGG AGCAAGGTGT GAGAGAGTT 159 <210> 44 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 44 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Asn Pro Ser Thr 20 25 30 Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg 35 40 45 Val Asp Leu Phe Tyr 50 <210> 45 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 45 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 5 10 15 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 20 25 30 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr 35 40 45 <210> 46 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 46 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Asn Pro Ser Thr Pro Ser 50 55 60 Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp 65 70 75 80 Leu Phe Tyr <210> 47 <211> 249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 47 GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA 60 AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120 CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGAACCCC 180 TCGACGCCCT CCTGTGTCTG TGATGAAGGC TACATTGGAG CAAGGTGTGA GAGAGTTGAC 240 TTGTTTTAC 249 <210> 48 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 48 CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA 60 TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGAACCCC TCGACGCCCT CCTGTGTCTG TGATGAAGGC 120 TACATTGGAG CAAGGTGTGA GAGAGTTGAC TTGTTTTAC 159 <210> 49 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 49 AACAGCGACT CTGAGTGCCC CAAGCAATAC AAGCATTACT GCATCAAAGG GAGATGCCGC 60 TTCGTGGTGG CCGAGCAGAC GCCCTCCTGT GTCTGTGATG AAGGCTACAT TGGAGCAAGG 120 TGTGAGAGAG TTGACTTGTT TTAC 144 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 50 AGCATATGCG GAAAGGCCAC TTCTCTAGGT 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 51 CTGGATCCTA GTAAAACAAG TCAACTCTCT 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 52 GAAATAATTT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG 30 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 53 AGGAGGGCGT CGAGGGGTTC TGCTCGGCCA 30 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 54 TGGCCGAGCA GAACCCCTCG ACGCCCTCCT 30 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 55 TCTATGCGCA CCCGTTCTCG GAGCACTGTC 30 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 56 TATACATATG AACAGCGACT CTGAGTGCCC CAAGC 35

【００８９】

【図面の簡単な説明】

【図１】７７残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセル
リン発現プラスミドの構築図を示す。

【図２】７６残基型（Ｃ末端４残基欠失型）ベータセル
リン発現プラスミドの構築図を示す。

【図３】実施例７で行われたベータセルリンムテインの
電気泳動の結果を示す図を示す。

【図４】実施例８で行われた³Ｈ−チミジンの細胞への
取り込み結果を示す図を示す。

【図５】実施例９に記載のβ細胞に分化した細胞に関す
る蛍光顕微鏡写真図を示す。

【図６】実施例１２で行われたβ細胞分化促進活性の結
果を示す図を示す。

【図７】２−７６残基型（Ｎ末端１残基、Ｃ末端４残基
欠失型）ベータセルリンの発現プラスミドの構築図を示
す。

【図８】２４−７６残基型（Ｎ末端２３残基、Ｃ末端４
残基欠失型）ベータセルリンの発現プラスミドの構築図
を示す。

【図９】実施例１９で行われた泳動後のゲルの染色結果
を示す図を示す。

【図１０】参考例１記載のプラスミドｐＴＢ１９７６の
構築の概略を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者小林昌行兵庫県川辺郡猪名川町松尾台２丁目１番地 12 （Ｅ502) (72)発明者五十嵐貢一京都府京都市左京区下鴨宮崎町66番地の３ (72)発明者佐々田玲子京都府長岡京市天神４丁目６番８号 (72)発明者西村紀茨城県つくば市大字東平塚586番地２

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】膵臓β細胞の分化促進活性が保持され、上
皮細胞増殖促進活性が低減されたベータセルリンムテイ
ンまたはその塩。
【請求項２】上皮細胞増殖促進活性に対する膵臓β細胞
の分化促進活性の比が、ベータセルリンのそれに比べて
２倍以上である請求項１記載のベータセルリンムテイン
またはその塩。
【請求項３】ベータセルリンのＮ末端から１ないし４０
個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から１
ないし４番目のアミノ酸残基において、Ｃ末端から３番
目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のア
ミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が
欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に
置換された請求項１記載のベータセルリンムテインまた
はその塩。
【請求項４】Ｎ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基
が欠失した請求項３記載のベータセルリンムテインまた
はその塩。
【請求項５】配列番号：１で表されるアミノ酸配列、
配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１
ないし４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配
列番号：２で表されるアミノ酸配列または配列番号：
２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個
のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有する請求項３
記載のベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項６】配列番号：１で表されるアミノ酸配列、
配列番号：２で表されるアミノ酸配列、配列番号：
３で表されるアミノ酸配列または配列番号：４で表さ
れるアミノ酸配列を含有する請求項３記載のベータセル
リンムテインまたはその塩。
【請求項７】配列番号：３７で表されるアミノ酸配列
または配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有
する請求項３記載のベータセルリンムテインまたはその
塩。
【請求項８】ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個
のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第２
２番目のアミノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基との
間に１ないし５個のアミノ酸残基が挿入された請求項１
記載のベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項９】ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個
のアミノ酸残基が欠失した請求項８記載のベータセルリ
ンムテインまたはその塩。
【請求項１０】配列番号：４４で表されるアミノ酸配列
を有する請求項８記載のベータセルリンムテインまたは
その塩。
【請求項１１】配列番号：４５で表されるアミノ酸配列
を有する請求項８記載のベータセルリンムテインまたは
その塩。
【請求項１２】請求項１記載のベータセルリンムテイン
をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転
換された形質転換体を培養し、該ベータセルリンムテイ
ンを生成せしめることを特徴とする請求項１記載のベー
タセルリンムテインまたはその塩の製造法。
【請求項１３】請求項１記載のベータセルリンムテイン
またはその塩を含有してなる医薬組成物。
【請求項１４】組成物が糖尿病予防・治療薬である請求
項９記載の医薬組成物。