CN117940447A - 嵌合克雷伯菌素 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过将来源于不同克雷伯菌素的易位结构域、受体结合结构域和杀细菌结构域组合以实现改善的靶细胞范围和杀细菌活性的嵌合克雷伯菌素。还提供了这些嵌合克雷伯菌素的相关组合物、药盒和使用方法。
Description
背景技术
作为由细菌产生以杀伤相关细菌物种的抗细菌蛋白，细菌素是细菌竞争环境资源的重要手段。细菌素包括数个不同的结构域，负责易位到其靶细菌中、与其受体结合以及发挥其杀细菌活性。受体结合结构域和易位结构域首先发挥作用，使得细菌素通过利用易位机制和靶细菌的细胞表面受体获得进入到易感细菌细胞中。在被运输穿过细胞膜后，然后细菌素的杀伤结构域发挥作用以导致靶细菌细胞的死亡。在另一方面，由于某些免疫蛋白的存在可以中和细菌素，产生细菌素的细菌自身受到保护免受这样的细菌素的杀伤作用。因此，靶细胞的易感性以这样的事实为依据：存在细胞表面受体和易位蛋白而不存在同源免疫蛋白。这些因素共同确定了天然存在的细菌素的有效性的窄范围。
克雷伯菌素(klebicin)是由克雷伯菌属(Klebsiella spp.)产生的细菌素，并且特异性地杀伤克雷伯菌属的另一些易感成员，例如肺炎克雷伯菌，即是已知会引起严重感染性疾病的药物抗性病原细菌物种并因此是这些疾病治疗中的治疗靶标。由于克雷伯菌素的治疗用途趋向于在克雷伯菌属内经受窄的靶标范围的缺点，因此迫切需要开发具有较宽靶细胞范围的新的和改进的克雷伯菌素，以便有效治疗克雷伯菌感染。本发明通过公开新的嵌合细菌素来解决这个和其他相关的需求，所述新的嵌合细菌素由以下来表征：包含来自多种原始克雷伯菌素的多种结构域，保留了两种单独克雷伯菌素的活性，并且能够利用多种受体进入。这些新的嵌合克雷伯菌素还具有降低的抗性频率(frequency ofresistance，FoR)，并且水平等于或优于单独的克雷伯菌素组合。最后，这些嵌合克雷伯菌素能够实现提高的有效范围——其杀细菌活性可以在单独克雷伯菌素的活性谱中发挥，克雷伯菌素的单独结构域来源于所述单独克雷伯菌素。
发明概述
考虑到开发具有改善的特性(例如广泛的靶细菌细胞范围和增强的抗细菌活性)的新的细菌素的目标，本发明人采用从不同天然存在的克雷伯菌素中得到的易位结构域、受体结合结构域和杀细菌结构域(或“杀伤结构域”)的不同组合改造了一组嵌合克雷伯菌素，以研究其针对克雷伯菌属的细菌，特别是肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的杀细菌效力。因此，在第一方面中，本发明提供了能够抑制克雷伯菌属细菌(例如，肺炎克雷伯菌)生长的新的嵌合克雷伯菌素多肽。嵌合多肽包含一个或更多个易位结构域、一个或更多个受体结合结构域和杀伤结构域，这些结构域中的每一个均从天然存在的克雷伯菌素中得到，并且所述杀伤结构域和至少一个受体结合结构域从两种不同的天然存在的克雷伯菌素中得到。在一些实施方案中，多肽从其N端到C端包含易位结构域、受体结合结构域和杀伤结构域。在一些实施方案中，在嵌合克雷伯菌素多肽中可以有两个受体结合结构域和两个易位结构域，并且所述两个受体结合结构域和易位结构域来自两种不同的天然存在的克雷伯菌素。在一些实施方案中，嵌合多肽还可包含位于受体结合结构域(例如，最靠近多肽C端的受体结合结构域)与杀伤结合结构域之间的肽接头，所述肽接头可以是柔性接头或刚性接头。在一些实施方案中，杀伤结构域包含全长天然存在的克雷伯菌素。在一些实施方案中，受体结合结构域之一和易位结构域来源于P628或P764。在一些实施方案中，杀伤结构域包含全长P764或P801。在一些实施方案中，两个不同的受体结合结构域从P764和P774中得到。在一些实施方案中，多肽由以下组成或基本上由以下组成：在本公开内容的表3中的特定组合中命名的组分(参见第3列“结构域细节”)。例如，嵌合克雷伯菌素可包含以下或由以下组成：表3中所示的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：7、33、45、47、51、57、59、61、65、67、69、71、73或75)之一。还提供了包含本发明嵌合多肽以及生理学上可接受的赋形剂的组合物。在一些情况下，组合物被配制成用于全身或局部施用，例如以适合用于注射或用于吸入或用于局部递送的形式。
本发明还提供了编码上述和本文中所述嵌合多肽的多核苷酸序列，其相应的表达盒、载体和宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含编码所述多肽的多核苷酸序列的核酸，其包含以下或者由以下组成：SEQ ID NO：8、34、46、48、52、58、60、62、66、68、70、72、74或76。在一些实施方案中，本发明提供了包含这样的多核苷酸序列的表达盒、或者包含所述表达盒的载体、或者包含上述或本文中所述表达盒或载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，提供了用于重组产生上述和本文中所述嵌合克雷伯菌素多肽的方法。该方法包括在允许表达由表达盒或载体编码的嵌合多肽的条件下培养包含编码这样的多肽的表达盒(例如载体的一部分)的宿主细胞。
在第二方面中，本发明提供了用于抑制肺炎克雷伯菌生长的方法，其通过将有效量的含有本发明的嵌合克雷伯菌素的组合物施加于其中存在肺炎克雷伯菌的位置。在一些实施方案中，通过以下将所述组合物施加于患有肺炎克雷伯菌感染的患者：通过注射，例如液体形式，如用于静脉内或肌内或皮下注射的溶液剂或乳剂或混悬剂；或者通过成雾状或雾化的喷雾(spray)或雾(mist)等的吸入；或者通过局部递送例如表面施加，例如，多肽以糊剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂、喷雾剂的形式，或者作为贴剂/绷带或伤口敷料的并入部分施加。
本发明的一个相关方面是本文中所述嵌合克雷伯菌素多肽用于抑制肺炎克雷伯菌生长或产生用于治疗肺炎克雷伯菌感染的药物的用途。在一些实施方案中，多肽存在于被配制成用于注射、或用于吸入、或用于局部施加的组合物中。在一些实施方案中，在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：7或由SEQ ID NO：7组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：33或由SEQ ID NO：33组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：45或由SEQ ID NO：45组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：47或由SEQ ID NO：47组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：51或由SEQ ID NO：51组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：57或由SEQ ID NO：57组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：59或由SEQ ID NO：59组成，或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：61或由SEQ ID NO：61组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQID NO：65或由SEQ ID NO：65组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ IDNO：67或由SEQ ID NO：67组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：69或由SEQ ID NO：69组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：71或由SEQ ID NO：71组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：73或由SEQ ID NO：73组成；或者在所要求保护的方法中使用的多肽可包含SEQ ID NO：75或由SEQID NO：75组成。
在第三方面中，本发明提供了用于抑制肺炎克雷伯菌生长的药盒，其包含含有组合物的第一容器，所述组合物包含有效量的本文中所述的嵌合克雷伯菌素多肽。在一些情况下，组合物被配制成用于注射。在一些情况下，组合物被配制成用于吸入。在一些情况下，组合物被配制成用于局部递送。在一些实施方案中，药盒还可包含为药盒使用者提供说明的手册。通常来说，所述药盒包含含有组合物的第一容器，所述组合物包含有效量的含有以下或由以下组成的多肽：SEQ ID NO：7、33、45、47、51、57、59、61、65、67、69、71、73或75的氨基酸序列。
附图简述
图1.细菌素中的结构域。
图2.针对产生嵌合克雷伯菌素的工作流程。
图3.具有结构域结构(domain architecture)的P775的详情(图3A)、蛋白质表达谱(图3B)、纯化的蛋白质谱(图3C)以及通过菌苔(lawn)抑制测定的对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC13883的活性(图3D)。
图4.克雷伯菌素的抗性频率(FoR)研究方案。
图5.P775对ATCC13883的P628抗性突变体的活性。对野生型(wild-type，WT)和抗性突变体(R)的菌苔抑制测定(图5A)和MIC(图5B)。
图6.具有结构域结构的P810的详情(图6A)、蛋白质表达谱(图6B)以及通过菌苔抑制测定的对肺炎克雷伯菌ATCC13883的活性(图6C)。
图7.具有结构域结构的P821的详情(图7A)、纯化的蛋白质谱(图7B)以及通过菌苔抑制测定的对肺炎克雷伯菌ATCC13883的活性(图7C)。
图8.P821对肺炎克雷伯菌菌株ATCC13883(图8A)和B2101(图8B)的杀细菌活性。
图9.具有结构域结构的P823的详情(图9A)、蛋白质表达谱(图9B)以及通过菌苔抑制测定的对肺炎克雷伯菌ATCC13883的活性(图9C)。
图10.具有结构域结构的P835、P836和P837的详情(图10A)、纯化的蛋白质谱(图10B)以及通过菌苔抑制测定的对肺炎克雷伯菌ATCC13883的活性(图10C)。通过CFU滴测定(CFU drop assay)的P836的杀菌活性(图10D)。
图11.具有结构域结构的P845和P862的详情(图11A)、纯化的蛋白质谱(图11B)以及通过菌苔抑制测定的对肺炎克雷伯菌ATCC13883的活性(图11C)。杂交活性的评估(图11D)。
图12.具有结构域结构的P863的详情(图12A)、纯化的蛋白质谱(图12B)、菌苔抑制测定和杂交活性的评估(图12C)。
图13.具有结构域结构的P867的详情(图13A)、纯化的蛋白质谱(图13B)。通过菌苔抑制测定的活性(图13C)。
图14.具有结构域结构的P870的详情(图14A)、纯化的蛋白质谱(图14B)。通过菌苔抑制测定的活性(图14C)。
图15.具有结构域结构的P875的详情(图15A)、纯化的蛋白质谱(图15B)。通过菌苔抑制测定的活性(图15C)。
图16.具有结构域结构的P889的详情(图16A)、纯化的蛋白质谱(图16B)。通过菌苔抑制测定的活性(图16C)。
图17.具有结构域结构的P891的详情(图17A)、纯化的蛋白质谱(图17B)。通过菌苔抑制测定的活性(图17C)。
图18.具有结构域结构的P892的详情(图18A)、纯化的蛋白质谱(图18B)。通过菌苔抑制测定的活性(图18C)。
定义
术语“核酸”或“多核苷酸”是指以单链或双链形式的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子替换可通过产生其中一个或更多个所选择(或全部)的密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列来实现(Batzer et al.，NucleicAcid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；以及Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA的区段。其可包含编码区之前和之后的区域(前导区和尾区)以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的化合物。
本领域中存在多种已知方法允许将非天然氨基酸衍生物或类似物以位点特异性的方式并入到多肽链中，参见例如WO 02/086075。
本文中氨基酸可通过公知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸可通过其通常接受的单字母代码来表示。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定的核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中密码子指定丙氨酸的每个位置处，该密码子可被改变为在不改变所编码多肽的情况下所描述的任何相应密码子。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是一种经保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了该核酸的每个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除AUG(其通常是针对甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG(其通常是针对色氨酸的唯一密码子)之外)可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个描述的序列中。
对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别替换、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小部分氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸替换。提供功能类似氨基酸的保守替换表是本领域公知的。这样的保守修饰的变体是对本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除它们。
以下八组每一组均包含彼此保守替换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参加例如，Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1984))。
本文中氨基酸可通过其通常公知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸可通过其通常接受的单字母代码来表示。
在本申请中，氨基酸残基根据其在未经修饰的野生型多肽序列中相对于最左边的残基(其编号为1)的相对位置进行编号。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指氨基酸残基的聚合物。所有三个术语均适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文中使用的术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“重组”当涉及例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者所述细胞来源于经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或者表达另外异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
“启动子”被定义为指导多核苷酸序列转录的核酸控制序列的阵列。本文中使用的，启动子包含转录起始位点附近的必要多核苷酸序列，例如，在聚合酶II型启动子(TATA元件)的情况下。启动子还任选地包含远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距离转录起始位点多达数千个碱基对的位置。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下都具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“可2作地连接”是指多核苷酸表达控制序列(例如启动子，或者转录因子结合位点的阵列)与第二多核苷酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导对应于第二序列的多核苷酸序列的转录。
“表达盒”是用允许特定多核苷酸序列在宿主细胞中转录的一系列特定多核苷酸元件重组或合成产生的核酸构建体。表达盒可以是质粒、病毒基因组或核酸片段的一部分。通常来说，表达盒包含与启动子可操作地连接的待转录的多核苷酸。
术语“易位结构域”在描述克雷伯菌素区段的上下文中使用是指负责介导其中蛋白质穿过细胞膜被引入到靶克雷伯菌属细菌细胞中或被靶克雷伯菌属细菌细胞摄取的过程的区段。
术语“受体结合结构域”在描述克雷伯菌素区段的上下文中使用是指具有结合存在于靶克雷伯菌属细菌细胞膜上的一种或更多种组分(例如，受体)的能力的区段。
术语“杀伤结构域”在描述克雷伯菌素区段的上下文中使用是指负责克雷伯菌素对靶克雷伯菌属细菌细胞的细胞毒性的区段。例如，这样的细胞毒性可以是细菌细胞膜中的成孔能力，或者可以是与大肠杆菌(E.coli)大肠杆菌素M的活性类似的脂质II切割活性(Gross and Braun，Mol.Gen.Genet.1996，251：388-396；Barreteauet al.，Microbial.Drug Resist.2012，18：222-229；和El Ghachiet al.，J.Biol.Chem.2006，281：22761-22772)或核酸酶活性(DNA酶或RNA酶)。当用于描述本发明的特定嵌合克雷伯菌素的结构时，术语“杀伤结构域”可以广泛地涵盖全长天然存在的克雷伯菌素或其经修饰形式(例如，全长野生型克雷伯菌素内一个或更多个位置处的一个或更多个氨基酸的缺失、插入和/或替换)，其保留了杀伤靶细菌细胞的能力。
术语“基本上由......组成”或其语法变体在描述本发明的嵌合克雷伯菌素的组分的上下文中使用时将嵌合克雷伯菌素描述为仅含有这些具体命名的组分(例如易位结构域、受体结合结构域和杀伤结构域，以及在本公开内容的表3中第3列“结构域细节”中鉴定的肽接头)，不包括相同或相似性质的其他组分，但允许在嵌合克雷伯菌素的任意两个特定组分之间的接合处任选地存在多达另外的1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个氨基酸，以及在N端和/或C端处存在多达另外的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
术语“异源”在描述两个元件的相对位置的上下文中使用是指未天然存在于同一相对位置中的两个元件，例如多核苷酸序列(例如，启动子或蛋白质/多肽编码序列)或多肽序列(例如，选自SEQ ID NO：7、33、45、47、51、57、59、61、65、67、69、71、73和75的嵌合克雷伯菌素序列或者用作与嵌合克雷伯菌素序列的融合配偶体的另一肽序列)。因此，基因的“异源启动子”是指不与该基因天然可操作地连接的启动子。类似地，针对嵌合克雷伯菌素或其编码序列的“异源多肽”或“异源多核苷酸”是来源于除贡献易位结构域、受体结合结构域和杀伤结构域中任一个的任何天然存在的克雷伯菌素之外的来源的异源多肽或异源多核苷酸，或者是来源于这样的天然存在的克雷伯菌素但未以与自然界中发现的相同方式与嵌合克雷伯菌素的任何部分天然地连接的异源多肽”或“异源多核苷酸。嵌合克雷伯菌素(或其编码序列)与异源多肽(或多核苷酸序列)的融合通常应产生更长的多肽(或多核苷酸序列)，保留相同的生物活性(例如，针对相同靶细菌物种的细胞毒性)。
本文中使用的术语“抑制”及其变化形式是指对靶生物过程(例如细菌细胞增殖或细菌细胞存在)的任何可检测的负面作用。通常来说，当与其中未施加抑制剂的对照相比时，在施加抑制性物质(例如，SEQ ID NO：7、33、45、47、51、57、59、61、65、67、69、71、73或75中所示的嵌合克雷伯菌素中的任一种)后，抑制表现在靶过程(例如，相关细菌(例如肺炎克雷伯菌)的生长速率或水平)至少10％、20％、30％、40％或50％的降低。
本申请中使用的术语“治疗”描述了导致消除、减轻、缓解、逆转相关病症的任何症状或者预防或延迟相关病症的发作或复发的行为。换言之，“治疗”病症涵盖针对该病症的治疗性干预和预防性干预二者。
本文中使用的术语“有效量”是指在数量上足以产生期望作用的给定物质的量。例如，用于抑制特定细菌物种(例如肺炎克雷伯菌)生长的嵌合克雷伯菌素的有效量是实现获自接受者的样品中肺炎克雷伯菌水平降低(包括不可检测的水平)的嵌合蛋白的量，所述接受者在涉及细菌存在的情况下被给予该嵌合酶，例如如在来自接受者的样品类型中所反映或测量的。在治疗背景下足以实现预期作用的量被定义为“治疗有效剂量”。剂量范围随所施用治疗剂的性质以及其他因素(例如施用途径和患者病症的严重程度)而变化。
本文中使用的“宿主细胞”是含有表达载体并支持表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或哺乳动物细胞(例如CHO、HeLa等))，例如，培养的细胞、外植体和体内细胞。
本文中使用的术语“约”表示涵盖预定值的+/-10％的范围。例如，“约10”意指9至11的范围。
发明详述
I.引言
先前，已经公开了具有通过裂解靶细菌细胞壁并因此杀伤细菌的方式来抑制细菌生长活性的细菌来源的多肽，特别是对于克雷伯菌属，参见例如WO2020/245376。这些天然存在的多肽通常包含易位结构域(translocation domain，TD)、受体结合结构域(receptor-binding domain，RD)和细胞毒性结构域(或杀伤结构域(killing domain)，KD)作为主要结构组分。
本发明人通过混合和匹配从不同的天然存在的克雷伯菌素中得到的易位结构域、受体结合结构域和细胞毒性结构域(或“杀伤结构域”)来构建并鉴定具有相同一般结构特征的嵌合多肽，所述嵌合多肽针对克雷伯菌属内某些靶细菌物种(特别是肺炎克雷伯菌)具有高度独特且非常有价值的杀细菌活性特征。本公开内容涉及基于这些新构建和鉴定的具有期望的抗细菌活性的嵌合多肽的组合物和使用方法。
II.嵌合多肽的产生
A.通用重组技术
公开重组遗传学领域中的通用方法和技术的基础文本包括Sambrook andRussell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(3rd ed.2001)；Kriegler，GeneTransfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
对于核酸，尺寸以千碱基(kilobase，kb)或碱基对(base pair，bp)给出。这些是来源于琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、经测序的核酸或已公开的DNA序列的估计。对于蛋白质，尺寸以千道尔顿(kilodalton，kDa)或氨基酸残基数给出。蛋白质尺寸根据凝胶电泳、经测序的蛋白质、所来源的氨基酸序列或已公开的蛋白质序列来估计。
使用自动合成仪，例如，根据Beaucage&Caruthers，Tetrahedron Lett.22：1859-1862(1981)首先描述的固相亚磷酰胺三酯方法，可以化学合成不可商购获得的寡核苷酸，如Van Devanter et.al.，Nucleic Acids Res.12：6159-6168(1984)中所述。寡核苷酸的纯化使用任何本领域公认的策略(例如，如Pearson&Reanier，J.Chrom.255：137-149(1983)中所述的天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC)进行。
编码嵌合多肽及其变体的多核苷酸的序列可以在克隆或亚克隆之后使用用于对例如Wallace et al.，Gene 16：21-26(1981)的双链模板测序的链终止方法进行验证。
B.针对嵌合多肽的编码序列的克隆和亚克隆
编码嵌合克雷伯菌素多肽的多核苷酸序列可基于其氨基酸序列(例如SEQ ID NO：7、33、45、47、51、57、59、61、65、67、69、71、73和75中的任一个)和来自更早公开(例如WO2020/245376)的可用信息来确定。
在获得编码嵌合多肽的多核苷酸序列之后，可以适当地修饰编码序列(例如，添加异源标签(例如亲和标签、例如6x His标签或GST标签)的编码序列；或进一步突变)，并随后将其亚克隆到载体(例如，表达载体)中，以便例如在允许由与编码序列可操作地连接的启动子指导的重组蛋白表达的条件下在转化和培养宿主细胞之后，可以从所得构建体中产生重组嵌合多肽。
C.针对宿主生物体中偏好密码子使用的核酸修饰
编码嵌合克雷伯菌素多肽的多核苷酸序列还可改变以符合特定宿主的偏好密码子使用。例如，一种细菌细胞菌株的偏好密码子使用可用于获得编码本发明嵌合克雷伯菌素并包括受到该菌株青睐的密码子的多核苷酸。由宿主细胞表现出的偏好密码子使用频率可通过对宿主细胞表达的大量基因中的偏好密码子使用频率进行平均来计算(例如，计算服务可从日本的Kazusa DNA研究所的网站获得)。这种分析优选限于由宿主细胞高度表达的基因。
在修饰完成时，将编码序列通过测序来验证，并随后亚克隆到合适的表达载体中以用于重组产生嵌合克雷伯菌素多肽。
IV.重组产生的多肽的表达和纯化
在验证编码序列之后，本发明的嵌合多肽可使用重组遗传学领域中的常规技术、依赖于编码本文中公开的多肽的多核苷酸序列来产生。
A.表达系统
为了获得编码本发明嵌合克雷伯菌素多肽的核酸的高水平表达，通常将编码该多肽的多核苷酸亚克隆到表达载体中，所述表达载体包含指导转录的强启动子，转录/翻译终止子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook and Russell，，and Ausubel et al.中。用于表达重组多肽的细菌表达系统可在例如大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、沙门氏菌属(Salmonella)和柄杆菌属(Caulobacter)中获得。用于这样的表达系统的药盒是可商购获得的。用于哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的真核表达系统是本领域公知的并且也可商购获得。在一个实施方案中，真核表达载体是腺病毒载体、腺相关载体或逆转录病毒载体。
用于指导异源核酸表达的启动子取决于具体应用。启动子任选地定位在距异源转录起始位点大约与所述启动子在其自然环境中距转录起始位点相同的距离处。然而，如本领域已知的，在不损失启动子功能的情况下，可以适应该距离的一些变化。
除启动子之外，表达载体通常还包括转录单元或表达盒，其包含嵌合多肽在宿主细胞中表达所需的所有另外的元件。因此，典型的表达盒包含与编码序列可操作地连接的启动子以及转录物、核糖体结合位点和翻译终止的有效多腺苷酸化所需的信号。编码嵌合多肽的核酸序列可以与可切割的信号肽序列连接以促进转化细胞对重组多肽的分泌。这样的信号肽尤其包括来自组织纤溶酶原激活剂、胰岛素和神经元生长因子，以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信号肽。盒的另外的元件可包含增强子以及具有功能性剪接供体和接受体位点的内含子(如果使用基因组DNA作为结构基因的话)。
除启动子序列之外，表达盒还可包含结构基因下游的转录终止区以提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。
用于将遗传信息转运到细胞中的特定表达载体并不是特别重要的。可使用用于在真核或原核细胞中表达的任何常规载体。标准细菌表达载体包括质粒(例如基于pBR322的质粒)、pSKF、pET23D和融合表达系统(例如GST和LacZ)。表位标签还可添加至重组蛋白以提供方便的分离方法，例如His或c-myc。
含有来自真核病毒的调节元件的表达载体通常用于真核表达载体，例如SV40载体、乳头瘤病毒载体和来源于Epstein-Barr病毒的载体。另外的示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及允许在以下启动子的指导下表达蛋白质的任何其他载体：SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子(Rous sarcoma virus promoter)、多角体蛋白启动子或显示在真核细胞中有效表达的另一些启动子。
一些表达系统具有提供基因扩增的标志物，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。或者，不涉及基因扩增的高产率表达系统也是合适的，例如昆虫细胞中的杆状病毒载体，其具有在多角体蛋白启动子或另一些强杆状病毒启动子的指导下编码嵌合多肽的多核苷酸序列。
表达载体中通常包含的元件还包含在大肠杆菌中发挥作用的复制子、编码抗生素抗性以允许选择含有重组质粒的细菌的基因、以及在质粒的非必需区域中以允许插入真核序列的独特限制性位点。选择的具体抗生素抗性基因并不重要，本领域已知的许多抗性基因中的任一种都是合适的。如果必要的话，则任选地选择原核序列，使得它们不干扰真核细胞中DNA的复制。与抗生素抗性选择标志物类似，基于已知代谢途径的代谢选择标志物还可用作用于选择转化的宿主细胞的手段。
当期望重组蛋白(例如，本发明的嵌合克雷伯菌素多肽)的周质表达时，表达载体还包含编码分泌信号(例如大肠杆菌OppA(周质寡肽结合蛋白)分泌信号)或其经修饰形式的序列，其直接与待表达蛋白质的编码序列的5’连接。该信号序列指导胞质中产生的重组蛋白穿过细胞膜进入周质空间中。表达载体还可包含信号肽酶1的编码序列，当重组蛋白进入周质空间时，所述信号肽酶1能够酶促切割信号序列。对于重组蛋白的周质产生的更详细的描述可见于例如Gray et al.，Gene 39：247-254(1985)，美国专利No.6,160,089和6,436,674中。
B.转染方法
使用标准转染方法以产生表达大量重组多肽的细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞系，然后使用标准技术将其纯化(参见例如Colley et al.，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)；Guide to Protein Purification，in Methods in Enzymology，vol.182(Deutscher，ed.，1990))。根据标准技术(参见例如Morrison，J.Bact.132：349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology 101：347-362(Wu et al.，eds，1983)进行真核细胞和原核细胞的转化。
可使用任何公知的将外源核苷酸序列引入到宿主细胞中的操作。这些包括使用氯化钙转化、磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体以及任何其他公知的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或另一些外源遗传物质引入到宿主细胞中的方法(参见例如Sambrook and Russell，同上)。仅需要所使用的特定遗传改造程序能够成功地将至少一种基因引入到能够表达重组多肽的宿主细胞中。
C.宿主细胞中嵌合克雷伯菌素的重组表达的检测
将表达载体引入到合适的宿主细胞中之后，在有利于嵌合克雷伯菌素多肽表达的条件下培养经转染的细胞。然后针对重组多肽的表达筛选细胞，随后使用标准技术将其从培养物中回收(参见例如Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(1982)；美国专利No.4,673,641；Ausubel et al.，同上；和Sambrook and Russell，同上)。
用于筛选基因表达的数种通用方法是本领域技术人员公知的。首先，可以在核酸水平上检测基因表达。通常使用利用核酸杂交技术的多种特定DNA和RNA测量方法(例如，Sambrook and Russell，同上)。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但DNA或RNA的检测也可以在没有电泳的情况下进行(例如通过斑点印迹)。还可使用序列特异性引物通过PCR或RT-PCR来检测经转染细胞中编码嵌合克雷伯菌素多肽的核酸的存在。
其次，可以在多肽水平上检测基因表达。本领域技术人员常规使用多种免疫学测定来测量基因产物的水平，特别是使用与本发明的嵌合克雷伯菌素特异性反应的多克隆或单克隆抗体(例如，Harlow and Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Chapter 14，Cold Spring Harbor，1988；Kohler and Milstein，Nature，256：495-497(1975))。这样的技术需要通过选择针对嵌合克雷伯菌素具有高特异性的抗体的抗体制备。产生多克隆和单克隆抗体的方法已被充分建立，并且其描述可见于文献(参见例如，Harlow and Lane，同上；Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.，6：511-519(1976))中。
D.重组产生的嵌合克雷伯菌素的纯化
一旦确认重组嵌合克雷伯菌素多肽在经转化或经转染的宿主细胞中的表达，则然后出于纯化重组多肽的目的以适当的规模培养宿主细胞。
1.来自细菌的重组产生的多肽的纯化
当本发明的嵌合克雷伯菌素多肽由经转化的细菌大量重组产生(通常在启动子诱导之后)时，虽然表达可以是组成型的，但多肽可形成不溶性聚集体。存在数种方案适用于蛋白质包涵体的纯化。例如，聚集体蛋白(下文中称为包涵体)的纯化通常涉及通过破坏细菌细胞(例如，通过在约100至150μg/ml溶菌酶和0.1％Nonidet P40(非离子洗涤剂)的缓冲液中孵育)来提取、分离和/或纯化包涵体。可使用Polytron研磨机(BrinkmanInstruments，Westbury，NY)将细胞悬液进行研磨。或者，可以在冰上对细胞进行声处理。裂解细菌的替代方法描述于Ausubel et al.和Sambrook and Russell(二者均同上)中，并且对于本领域技术人员来说将是明显的。
通常将细胞悬液离心，并将含有包涵体的沉淀物重悬于不溶解但洗涤包涵体的缓冲液(例如，20mM Tris-HCl(pH 7.2)、1mM EDTA、150mM NaCl和2％Triton-X 100(非离子洗涤剂))中。可需要重复洗涤步骤以尽可能多地去除细胞碎片。可将包涵体的剩余沉淀物重悬于适当的缓冲液(例如20mM磷酸钠，pH 6.8，150mM NaCl)中。另一些合适的缓冲液对于本领域技术人员来说将是明显的。
在洗涤步骤之后，通过添加强氢接受体和强氢供体二者的溶剂(或各自具有这些特性之一的溶剂的组合)来溶解包涵体。然后可通过用相容缓冲液稀释或透析使形成包涵体的蛋白质复性。合适的溶剂包括但不限于尿素(从约4M至约8M)、甲酰胺(至少约80％，基于体积/体积)和盐酸胍(从约4M至约8M)。一些能够溶解聚集体形成的蛋白质的溶剂(例如SDS(十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate))和70％甲酸)可能不适合在此程序中使用，因为可能的蛋白质不可逆变性，伴有缺乏免疫原性和/或活性。虽然盐酸胍和类似试剂是变性剂，但这种变性不是不可逆的，并且在去除(例如通过透析)或稀释变性剂后可发生复性，从而使得重新形成免疫学和/或生物活性的目的蛋白质。在溶解之后，可通过标准分离技术将蛋白质与其他细菌蛋白质分离。对于从细菌包涵体纯化重组多肽的进一步描述，参见例如Patra et al.，Protein Expression and Purification 18：182-190(2000)。
或者，可以从细菌周质纯化重组多肽，例如嵌合克雷伯菌素多肽。当重组蛋白被输出到细菌的周质中时，除本领域技术人员已知的其他方法之外，还可通过冷渗透休克来分离细菌的周质级分(参见例如Ausubel et al.，同上)。为了从周质分离重组蛋白，将细菌细胞离心以形成沉淀物。将沉淀物重悬于含有20％蔗糖的缓冲液中。为了裂解细胞，将细菌离心并将沉淀物重悬于冰冷的5mM MgSO4中，并在冰浴中保持约10分钟。将细胞悬液离心并倒出上清液并保存。存在于上清液中的重组蛋白可通过本领域技术人员公知的标准分离技术与宿主蛋白分离。
2.用于纯化的标准蛋白质分离技术
当重组多肽(例如本发明的嵌合多肽)以可溶形式在宿主细胞中表达时，其纯化可遵循以下描述的标准蛋白质纯化程序。
i.溶解度分级
通常作为初始步骤，并且如果蛋白质混合物是复杂的，初始盐分级可以将许多不期望的宿主细胞蛋白质(或来源于细胞培养基的蛋白质)与目的重组蛋白质分离。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效降低蛋白质混合物中的水量来沉淀蛋白质。然后基于蛋白质溶解度将其沉淀。蛋白质越疏水，在较低硫酸铵浓度下其更可能沉淀。典型的方案是将饱和硫酸铵添加至蛋白质溶液，使所得硫酸铵浓度为20％至30％。这将沉淀最疏水的蛋白质。将沉淀物丢弃(除非目的蛋白质是疏水性的)，并将硫酸铵添加至上清液，达到已知沉淀目的蛋白质的浓度。然后将沉淀物溶解在缓冲液中，并且如果有需要的话通过透析或渗滤将过量的盐除去。依赖于蛋白质溶解度的另一些方法(例如冷的乙醇沉淀)是本领域技术人员公知的，并且可用于分级复杂的蛋白质混合物。
ii尺寸差异过滤
基于计算的分子量，可使用超滤通过不同孔径的膜(例如，Amicon或Millipore膜)来分离较大和较小尺寸的蛋白质。作为第一步，通过具有比目的蛋白质(例如，本发明的嵌合多肽)的分子量更低的分子量截止的孔径的膜对蛋白质混合物进行超滤。然后将超滤的渗余物针对具有分子截止大于目的蛋白质分子量的膜进行超滤。重组蛋白将穿过膜进入到滤液中。然后可以如下所述对滤液进行色谱分析。
iii.柱色谱
目的蛋白质(例如本发明的嵌合多肽)还可以基于其尺寸、净表面电荷、疏水性或对配体的亲和力与其他蛋白质分离。另外，针对嵌合克雷伯菌素产生的抗体可以与柱基质缀合，并对嵌合克雷伯菌素多肽进行免疫纯化。所有这些方法都是本领域公知的。
对本领域技术人员来说将明显的是，色谱技术可以以任何规模并使用来自许多不同制造商(例如，Pharmacia Biotech)的设备进行。
V.制剂和施用
可以立即识别物种特异性酶活性的多种应用。一项重要的应用是对正常使用中可能被污染的物品进行抗细菌处理。可使用这样的实体来处理靶细菌可以危害公共健康的位置、设备、环境等。目的位置包括其中存在处理含有靶细菌的物质的目的或机会的公共健康设施。这些物质可包括废弃物产物，例如液体、固体或气体。水性废弃物处理厂(treatmentplant)可结合这样的实体以消除来自污水的靶标，无论是通过直接用酶实体处理还是通过释放产生这样的实体的细胞。固体废弃物处理场可引入这样的实体以使靶宿主爆发的可能性最小化。相反，食品制备区域或设备需要定期清洁，并且本发明提供了有效消除靶细菌的组合物和手段。受到污染的医疗和其他公共环境可需要类似的方法以使靶微生物的生长和传播最小化。该方法可用于其中期望灭菌消除靶细菌的环境，包括用于重症监护室的空气过滤系统。
替代应用包括在兽医或医疗背景中的使用。确定特定细菌的存在或鉴定特定靶标的手段可利用选择剂对群体或培养物的作用。可期望在清洁剂中包含细菌抑制或杀细菌活性，包括清洁动物和宠物。
本发明的嵌合克雷伯菌素多肽可用于在例如人或动物中治疗由特定、有害的细菌物种引起的感染，例如肺炎、菌血症或尿路感染的病症。这些嵌合多肽可以预防性地施用或者可施用于已患有细菌感染的对象。在一个实施方案中，嵌合多肽用于治疗由克雷伯菌属物种中的一种或更多种细菌(例如肺炎克雷伯菌)引起的感染(例如，呼吸系统感染)，并且在呼吸系统病毒感染的情况下，用于预防由克雷伯菌属引起的细菌继发性感染的发作。
在一个实施方案中，这些嵌合蛋白(例如，表3中那些(例如SEQ ID NO：7、33、45、47、51、57、59、61、65、67、69、71、73和75)中的任一种)用于治疗被肺炎克雷伯菌感染的人或另一些动物。
施用途径和剂量将随感染细菌菌株、感染部位和程度(例如，局部或全身)以及待治疗对象而变化。施用途径包括但不限于：经口、喷雾或用于递送至肺的其他装置、鼻喷雾、静脉内(intravenous，IV)、肌内、腹膜内、鞘内、眼内、皮下、经阴道、经直肠、表面、腰椎穿刺、鞘内以及直接施加至脑和/或脑膜。可用作递送治疗剂的载剂的赋形剂对于本领域技术人员来说将是明显的。例如，嵌合克雷伯菌素可以以冻干形式保存并在通过IV注射施用之前不久溶解。预期施用的剂量为约0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000、10000或更多个克雷伯菌素分子/宿主感染中的细菌。取决于克雷伯菌素的尺寸，其本身可以是串联缔合的，或者以多亚基形式(二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等)或者与一种或更多种另一些实体(例如，不同特异性的酶或片段)组合，剂量可以为约1百万至约10万亿/每kg/每天，并且优选约1万亿/每kg/每天。
通常施用包含至少一种本发明的嵌合克雷伯菌素的治疗组合物直至实现成功消除靶致病性细菌。因此，本发明考虑了本发明组合物的单剂型和多剂型，以及用于实现用于递送这样的单剂型和多剂型的持续释放手段的方法。
关于对肺或其他黏膜表面的气雾剂施用，将治疗组合物并入专门设计用于施用的气雾剂制剂中。许多这样的气雾剂是本领域已知的，并且本发明不限于任何特定的制剂。这样的气雾剂的一个实例是由Schering-Plough制造的Proventil吸入器，其抛射剂包含三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷和油酸。另一些实施方案包括设计用于向对象或患者的鼻道和窦道施用的吸入器。如果必要的话，基于治疗中使用的具体组合物来调整抛射剂成分和乳化剂的浓度。还可用的是被设计用于将含有克雷伯菌素的组合物直接沉积至细菌感染的解剖部位(例如，尿路)的栓剂。
评价本发明嵌合克雷伯菌素的杀伤能力的方法通常类似于评估完整复制型噬菌体的杀伤能力所使用的许多方法。将总细菌计数与活的菌落单位进行比较可以确定有多大部分的细菌实际上是活的，并且暗示，有多大部分已对杀伤构建体敏感。用于评价停滞活性(stasis activity)的另一些方法可包括释放胞内内容物(无论是天然的还是负载的)，或者对确定或制备的对应于天然细胞壁结构的底物的酶活性。
通常来说，当与未暴露于嵌合克雷伯菌素的对照相比时，杀伤将使细菌复制能力降低至约1/3或更低，并且可影响或降低其至约1/10、1/30、1/100、1/300等至许多数量级。然而，即使在不杀伤的情况下减慢细菌复制速度也可具有显著的治疗或商业价值。优选的遗传失活效率可以是0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4、5、6、7、8或更多log单位。
本发明还考虑了包含至少一种本文中所述的嵌合克雷伯菌素以及生理学上可接受的或可药用的赋形剂的药物组合物。因此，本发明的组合物包含含有特异性靶向一种或更多种细菌属(例如克雷伯菌属(例如肺炎克雷伯菌))的分离的嵌合多肽的制剂。在一些情况下，在不对可向患者提供潜在益处的其他非靶标细菌物种产生显著影响的情况下，可使用两种、三种或四种嵌合多肽的混合物以增强靶标特异性细菌杀伤。以这种方式，本发明的组合物可以根据患者的需要进行定制。化合物或组合物通常将是无菌或接近无菌的。
本文中的“治疗有效剂量”意指其中施用时产生抑制细菌或优选杀细菌作用的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知的技术来确定。参见例如Ansel，et al.Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery；Lieberman(1992)Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3)，Dekker，ISBN 0824770846，082476918X，0824712692，0824716981；Lloyd(1999)The Art，Science and Technology ofPharmaceutical Compounding；以及Pickar(1999)Dosage Calculations。如本领域已知的，对以下的调整可能是必要的，并且将由本领域技术人员用一些实验来确定：蛋白质降解、全身vs.局部递送、和新的蛋白酶合成速率，以及年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用、菌落中的细菌组分谱，以及病症的严重程度。
多种生理学上可接受的或可药用的赋形剂是本领域公知的。本文中使用的“生理学上可接受的或可药用的赋形剂”是指当与组合物的活性成分组合时允许该成分保留其生物活性并且不会在接受者中引起任何可检测的生理反应的物质。这样的赋形剂可包括稳定剂、防腐剂、盐、或糖复合物或者晶体等。
示例性的药物载体包括无菌水性或非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。一些实例包括但不限于标准药物赋形剂，例如磷酸缓冲盐水溶液剂、水、乳剂(例如油/水乳剂)以及多种类型的润湿剂。非水性溶剂的一些实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer’s dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格液或不挥发油。静脉内载剂包括液体剂和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的补充剂)等。在另一些实施方案中，组合物将被并入到固体基质，包括缓慢释放颗粒剂、玻璃珠、绷带、眼上的附着物(insert)和表面形式例如乳膏剂、糊剂、洗剂、软膏剂、液体剂或半液体剂(包括溶液剂或混悬剂)中，或者并入到贴剂、绷带或任何类型的伤口敷料中。
包含本发明嵌合酶的组合物还可使用本领域公知的手段进行冻干，例如用于根据本发明的后续重构和使用。
还感兴趣的是用于脂质体递送的制剂和包含微囊化酶(包括糖晶体)的制剂。包含这样的赋形剂的组合物通过公知的常规方法进行配制(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，Chapter 43，14th Ed.，Mack Publishing Col，Easton PA18042，USA)。
一般而言，药物组合物可以以多种形式进行制备，所述形式例如颗粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂(例如，适用于经口递送)、微珠、微球、脂质体、混悬剂、油膏剂、洗剂等。适用于经口和表面使用的药用级有机或无机载体和/或稀释剂可用于构成包含治疗活性化合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物和动物油以及脂肪。制剂中可以并入稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐或者用于确保适当的pH值的缓冲剂。
VI.药盒
本发明还提供了根据本发明方法的用于选择性抑制某些靶细菌物种生长的药盒，尤其是在存在可与靶细菌物种密切相关(例如属于同一属)的其他非靶细菌物种的情况下。药盒通常包含第一容器，其包含含有有效量的目的多肽的组合物，所述多肽例如表3中的多肽，例如包含选自以下的氨基酸序列或基本上由选自以下的氨基酸序列组成的多肽：SEQID NO：7、33、45、47、51、57、59、61、65、67、69、71、73和75。多肽通常存在于被配制成用于以下的组合物中，用于全身递送，例如以适用于通过静脉内、肌内或皮下手段注射的溶液剂(例如水溶液剂)或分散体的形式，或者以适用于经口摄取的丸剂、片剂、囊片剂或胶囊剂的形式；或者用于通过呼吸系统直接递送，例如以适用于吸入到呼吸道中的喷雾剂或雾化雾的形式；或者用于局部递送，例如以乳膏剂、糊剂、洗剂、软膏剂、喷雾剂等适用于表面施加至表面(例如皮肤)，或并入到皮肤贴剂、绷带或伤口敷料以在患者皮肤上使用的形式。
任选地，药盒还可包含信息材料，例如使用者如何使用药盒以用于抑制某些靶细菌物种的生长的说明。
实施例
仅通过举例说明的方式而不是通过限制的方式提供了以下实施例。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本上相同或类似的结果的多种非关键参数。
引言
细菌素是由细菌产生以杀伤类似或密切相关的物种的蛋白质抗细菌剂，作为竞争生态位(ecological niches)中的存活机制。细菌素寄生在参与运输必需营养素和矿物质(例如铁和维生素B12)以进入细胞的细菌机构的组件上。产生细菌素的细菌自身由于免疫蛋白的存在而免除致命活性，所述免疫蛋白与细菌素结合并在空间上阻止其活性。细菌素具有高度的属特异性，并且靶向与生产者生物体相同的属。大细菌素(＞30kDa)是模块化蛋白，并且其中许多是天然嵌合蛋白，由具有受体结合、易位和杀伤结构域的不同来源进化而来，作为单个单元发挥作用以杀伤易感细菌(图1)。使用受体结合结构域和易位结构域，在细菌素与其细胞表面处的同源受体结合之后，细菌素通过寄生在细胞表面受体进入细菌细胞，并通过使用Tol系统(组A)或Ton系统(组B)通过易感细菌的外膜来转运。在进入细胞之后，杀伤结构域可通过多种模式(例如通过膜损伤或者通过干扰代谢途径以及DNA酶或RNA酶活性)发挥杀细菌作用。
对细菌素的易感性主要由易感细菌表达的细胞表面受体和易位蛋白的存在驱动，并且在较小程度上由同源免疫蛋白的缺乏来驱动。因此，大多数细菌素表现出窄的覆盖范围。虽然即使在存在免疫力时，细菌仍可对给定的细菌素保持敏感，但缺乏其同源受体的细菌将对细菌素完全不敏感。细菌素仅利用单个细胞表面受体和单个易位系统以使细胞进入到易感细菌。与受体或易位机制有关的基因的任何突变将使细菌对添加有限覆盖范围的细菌素产生抗性。在实验室条件下，目前研究的许多细菌素均表现出10-6至10-7的体外抗性频率(FoR)。由于窄的覆盖范围和较高的FoR的双重原因，先前细菌素不被认为是用于治疗细菌感染的治疗选择。
克雷伯菌属的细菌素：克雷伯菌素
肺炎克雷伯菌是高度药物抗性的致病菌。在人中，其会引起严重的感染，包括肺炎、菌血症和尿路感染。由于抗微生物抗性的高负担，需要新的干预措施来用于治疗由这些细菌引起的感染。
克雷伯菌素是由克雷伯菌属产生的大分子量细菌素，并且特异性地杀伤克雷伯菌属的其他易感成员，包括可能用作治疗选择的致病性肺炎克雷伯菌。然而，正如已知的其他细菌素，克雷伯菌素也具有克雷伯菌内例如窄覆盖范围和高FoR的特性。由于克雷伯菌素的临床效用尚待探索，预前存在的抗性可能非常小并且抗性的出现将仅限于易感细菌。
改善克雷伯菌素的特性
1.混合物
窄覆盖范围，FoR的特性可使用克雷伯菌素的组合来克服，所述克雷伯菌素识别不同的细胞表面受体、不同的作用机制(mechanism of action，MoA)，并且包含组A和组B克雷伯菌素二者作为混合物中的单独组分。这将增强克雷伯菌素作为治疗实体的效用。克雷伯菌素及其受体结构域(RD)、易位结构域(TD)和杀伤结构域(KD)在表1中列出。
表1：天然克雷伯菌素
通过将高浓度(＞109个细胞)的肺炎克雷伯菌菌株ATCC 13383平板接种在含有8×MIC浓度的单独克雷伯菌素和含有两种克雷伯菌素的组合的琼脂板上来研究这些克雷伯菌素的FoR。对从这些板上回收的菌落进行计数(enumerate)，以确定对应于最高可能FoR的回收频率(表2)。对于单个克雷伯菌素，FoR在10-6至10-7范围内，表明治疗期间可能出现抗性。然而，当对两种克雷伯菌素的组合进行平板接种时，除P774与P801之外的所有组合都将FoR降低至＜10-9，表明适当的克雷伯菌素组合可以减轻抗性的出现。P774和P801的组合不会降低FoR，可能是由于相同的MoA-P774和MoA-P801二者识别相同的细胞表面受体并利用TonB途径进行易位。因此，将克雷伯菌素与不同MoA在混合物中的组合将有助于减轻FoR。
表2：单独和组合的天然克雷伯菌素的抗性频率(FoR)
| 克雷伯菌素及组合@8X | 回收频率 |
| P628 | 约1×10-7 |
| P764 | 约1×10-7 |
| P774 | 约1×10-6 |
| P801 | 约5×10-7 |
| P628+P764 | ＜10-9 |
| P628+P774 | ＜10-9 |
| P774+P764 | ＜10-9 |
| P801+P628 | ＜10-9 |
| P801+P764 | ＜10-9 |
| P801+P774 | 约5×10-7 |
虽然组合方法将不仅有助于减轻抗性问题，而且还提高了克雷伯菌素的整体覆盖范围，但对于混合物方法还存在一些限制。这包括由于多种蛋白质的产生和加工而提高的商品成本、寻找兼容的储存缓冲液和条件、制剂方面的挑战以及为多种蛋白质建立质量控制参数。
为了克服这些挑战，新的策略是通过蛋白质工程将多种克雷伯菌素的特性组合到单个克雷伯菌素中。这可通过融合或交换来自不同的克雷伯菌素的结构域以产生具有期望特性的嵌合融合体来实现。克雷伯菌素(与其他细菌素一样)是通过自然进化而进化成识别和杀伤易感细菌的多结构域蛋白质结构。这些是折叠成活性构象并作为单个单元发挥作用的多结构域蛋白质结构，不存在通用蛋白质改造策略(例如结构域交换或结构域添加)是否将产生活性蛋白质的可用信息。因此，将无法先验地预测有效的结构域或策略的组合。
2.嵌合融合体
凭经验将产生具有多种克雷伯菌素组合特性的嵌合克雷伯菌素。预期结果是将具有改善的覆盖范围和FoR的嵌合克雷伯菌素，如根据组合观察到的。由于天然细菌素的覆盖范围受到单细胞表面受体识别的限制，因此嵌合融合策略将是设计和改造能够识别多种细胞表面受体和/或者利用Tol和Ton两种途径进行易位的克雷伯菌素。
策略包括将一种克雷伯菌素的易位结构域(TD)和受体结合结构域(RD)单独或一起添加至另一种克雷伯菌素，将一种克雷伯菌素的RD插入到另一种克雷伯菌素中以产生成双RD(twin RD)，将一种克雷伯菌素的RD或KD用另一者代替，以及将两种克雷伯菌素融合在一起以形成单个蛋白质。嵌合融合工作流程在图2中示出。
用融合在一起的来自不同克雷伯菌素的结构域产生数种嵌合克雷伯菌素。一些嵌合融合体是活性的，并且对肺炎克雷伯菌菌株ATCC13883的菌苔显示出抗细菌活性(表3)。
表3：通过结构域混编(domain shuffling)/结构域添加产生的经改造克雷伯菌素；FL：全长，TD：易位结构域，RD：受体结合结构域，KD：杀伤结构域，CD：催化结构域
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注：表3中列出的构建体#1、2、3、6、8、12、15和16与P628的免疫蛋白一起表达。
38种经改造克雷伯菌素中有31种表现出抗细菌活性，表明了蛋白质改造策略可应用于产生活性嵌合克雷伯菌素。还值得注意的是，少数嵌合分子失去了活性，表明不是所有经改造的克雷伯菌素都保留活性。
实施例1：P775(P628 TD RD-刚性接头+P764 FL)
P775是通过借助于刚性接头将P628的TD和RD区与全长(FL)P764融合而产生的。该构建体将具有可识别两种不同的细胞表面受体和易位机制的两个易位和受体结合单元。将P628 TD RD区和P764分别进行PCR扩增，并通过由重叠延伸合成(synthesis by overlapextension，SOE)PCR融合在一起(图3A)。将融合基因克隆到pET26b表达载体中，进行序列确定，并在大肠杆菌表达菌株ER2566中进行蛋白质表达(图3B)。将表达的蛋白质通过两步离子交换色谱进行纯化以获得约90％的均质蛋白质(图3C)，并且2至5μg纯化的蛋白质对肺炎克雷伯菌ATCC13883菌苔具有活性(图3D)。在缺铁性Cas氨基酸生长培养基中，P775对ATCC13883的MIC为5μg/mL。
由于P775具有两种不同的克雷伯菌素的TD和RD，并且仍保持活性，因此P775可表现出两种蛋白质的特性。这是通过在图4中所述的FoR研究确定的。
虽然P628和P764的FoR在约10-7的预期范围内，但P775的FoR却低得多，为3×10-10(表4)。
表4：天然克雷伯菌素P628、P764和嵌合克雷伯菌素P775的FoR
| 蛋白质 | 回收频率 |
| P628 | 约6.4×10-7 |
| P764 | 约1×10-7 |
| P775 | 3.1×10-10 |
这些结果表明：(1)P775的FoR为约10-10，其显著低于单独的克雷伯菌素P628和P764。这可归因于P628和P764二者特性的组合。(2)P775在降低FoR方面表现得与两种克雷伯菌素的组合一样。
P775对ATCC13883的P628抗性突变体的活性
由于通过FoR研究，P775显示出P628和P764二者的特性，因此P775的活性在P628抗性突变体上进行确定。
先前通过将高细胞数目的该菌株平板接种在P628包埋的琼脂板上来分离对克雷伯菌素P628具有抗性的ATCC13883的自发突变体。通过MIC研究确定了这些突变体为P628抗性的。选择ATCC13883菌株的两个P628抗性突变体(P628R 32.1和P628R 32.3)，以用于测试P775及其野生型(WT)菌株的活性。为此进行了菌苔抑制测定和MIC。通过放置10μg的P775来进行菌苔抑制(图5A)，并根据CLSI方案用测试生长培养基酪蛋白氨基酸(casamino acid，CAA)进行MIC(图5B)。
这些结果表明P775对ATCC13883的P628抗性突变体具有抗细菌活性。综上所述，FoR研究和对P628抗性突变体的活性，P775表现出两种克雷伯菌素的特性。
实施例2：P810(P764 TD RD-P774 RD-P764 KD)
另一种策略是对克雷伯菌素进行改造以与多种细胞表面受体结合，其最终有助于改善覆盖范围以及降低FoR。设计了具有与两种不同的细胞表面受体结合的两种受体结合结构域的克雷伯菌素，其中P764作为骨架分子并入P774的受体结合结构域。为此，对来自克雷伯菌素P774的受体结合结构域的DNA序列进行PCR扩增并将其克隆到P764(其自身受体结合区的下游)中。被称为P810的融合蛋白在大肠杆菌蛋白表达菌株ER2566中表达(图6)，以及约50kDa的蛋白质在细胞的可溶级分中表达，并且通过菌苔抑制测定还发现对肺炎克雷伯菌菌株ATCC13883具有活性。
这些结果表明P810对肺炎克雷伯菌具有活性。
实施例3：P821(P628 TD RD-刚性接头+P801 FL)
P821是通过借助于刚性接头将P628的TD和RD区与全长(FL)P801融合而产生的。该构建体将具有可识别两种不同的细胞表面受体和易位机制的两个易位和受体结合单元。将P628 TD RD区和P801分别进行PCR扩增，并通过由重叠延伸合成(SOE)PCR融合在一起。被称为P810的融合蛋白在大肠杆菌蛋白表达菌株ER2566中表达(图7)，以及约78kDa的蛋白质在细胞的可溶级分中表达，并且通过菌苔抑制测定还发现对肺炎克雷伯菌菌株ATCC13883具有活性。
这些结果表明P821对肺炎克雷伯菌具有活性。
P821的MIC和杀细菌活性
P821的MIC根据改良的CLSI方案在生长培养基、酪蛋白氨基酸培养基(CAA)和胎牛血清(fetal calf serum，FCS)中确定。在CAA中，MIC为6μg/mL，并且在FCS中其为12μg/mL，表明P821在生长培养基和在存在血清二者中具有活性。
由于P821是两种不同克雷伯菌素(P628和P801)的嵌合融合体，为了确定该融合体是否具有两种蛋白质的特性，在具有不同敏感性模式的不同肺炎克雷伯菌菌株上确定P821的杀细菌活性。ATCC13883和B2101被选择用于第一组实验。虽然菌株ATCC13883对P628和P801二者都敏感，但菌株B2101仅对P801敏感。杀细菌活性通过细胞杀伤测定来确定，其中将约106CFU/mL的ATCC13883和B2101二者用在200μL体积中的10和100μg/mL的P821于37℃下处理2小时，并且细胞的剩余数目通过平板接种(plating out)在适当的稀释液中并将板在37℃下孵育18小时来确定。在相同实验中确定了P628和P801对B2101的杀细菌活性。使用100μg/mL的P628和P801二者。结果表明，即使用10μg/mL的纯化的蛋白，P821也会使ATCC13883的CFU降低约＞3log(图8A)。对于B2101，用100μg/mL的P821获得约2log CFU降低。虽然100μg/mL的P628不会杀伤B2101，但用100μg/mL的P801获得＞3log CFU降低(图8B)。P821杀伤肺炎克雷伯菌菌株并且活性与P801类似。
当用P628敏感-P801不敏感分离株-B2265进行类似实验时，没有观察到杀伤，表明该蛋白质未表现出P628活性。
实施例4：P823(P628 TD RD-柔性接头+P801 FL)
P823是通过借助于刚性接头将P628的TD和RD区与全长(FL)P801融合而产生的。该构建体将具有可以识别两种不同的细胞表面受体和易位机制的两个易位和受体结合单元。将P628 TD RD区和P801分别进行PCR扩增，并通过由重叠延伸合成(SOE)PCR融合在一起。该融合蛋白在大肠杆菌蛋白表达菌株ER2566中表达(图9)，以及约78kDa的蛋白质在细胞的可溶级分中表达，并且通过菌苔抑制测定还发现对肺炎克雷伯菌菌株ATCC13883具有活性。
这些结果表明P823对肺炎克雷伯菌具有活性。
实施例5：P835(P628 TD RD+P801 FL)；P836(P628 TD RD-4X刚性接头+P801 FL)；P837(P628 TD RD-2X柔性接头+P801 FL)
P835、P836和P837是通过将P628TDRD与全长P801的N端融合而产生的，在两者之间分别不具有接头、具有4X刚性接头和具有2X柔性接头。这些构建体具有可以识别两种不同的细胞表面受体和易位机制的两个易位和受体结合单元。将P628 TD RD区和P801使用适当的引物和接头分别进行PCR扩增，并通过由重叠延伸合成(SOE)PCR融合在一起(图10A)。蛋白质在大肠杆菌中表达并使用离子交换色谱进行纯化(图10B)。然后将纯化的蛋白质继续用于测试。
将10μg和1μg的纯化的蛋白质置于克雷伯菌分离株的菌苔上。将板在30℃下孵育16至18小时。融合蛋白在细菌菌苔上显示出抑制区，表明融合物具有活性(图10C)。P836在生理相关条件下(如血清)具有活性，并且在2小时CFU滴测定中即使使用0.25μg/ml也表现出迅速的杀伤(图10D)。
实施例6：P845(P628 FL-柔性接头+P801 FL)；P862(P628 FL-刚性接头+P801 FL)
P845和P862是通过将P628全长与全长P801的N端融合而产生的，在两者之间分别具有柔性接头和刚性接头(图11A)。P845和P862在大肠杆菌中表达并使用离子交换色谱进行纯化(图11B)。然后将纯化的蛋白质继续用于测试并相对于P836进行比较，以检查通过将P628延伸至P836中的全长是否在活性或覆盖范围中存在任何改善。
P845和P862通过菌苔抑制测定进行测试。将20μg纯化的P845和P862置于克雷伯菌分离株的菌苔上。将板在30℃下孵育16至18小时。P845和P862在细菌菌苔上显示出抑制区，表明融合物具有活性(图11C)。
针对ATCC13883，在CAA和10％FCS中测试了P836、P845和P862的MIC，并且与P836相比，P845和P862在CAA中的MIC得到改善，并且即使在存在血清的情况下也具有活性(表5)。
表5：P836、P845和P862在CAA和10％FCS中对菌株ATCC13883的MIC
通过测试P801不敏感-P628敏感分离株和P801敏感-P628不敏感分离株(S-敏感和IS-不敏感)的菌苔抑制活性来评估嵌合体的杂交特性。所选择的分离株为ATCC13883(参考标准)、B2272(P801S-P628IS)、B2265(P801IS-P628S)。另外，还包括大肠杆菌以用于测试，因为只有P628对其具有活性。P836的行为类似于P801，仅对P801敏感分离株表现出活性而对P801IS-P628S没有活性。然而，P845和P862对P801S-P628IS和P628P801IS-P628S分离株二者以及也对大肠杆菌具有活性，表明这些嵌合体在单个分子中具有P628和P801二者的特性，产生了相对于单独的单个克雷伯菌素改善的覆盖率(图11D)。
实施例7：P863(P764 FL-刚性接头+P801 FL)
P863是通过将P764全长与全长P801融合而产生的，在两者之间具有2X刚性接头(图12A)。P863在大肠杆菌中表达并使用离子交换色谱进行纯化(图12B)。然后将纯化的蛋白质继续用于测试。将20μg纯化的P863置于克雷伯菌分离株的菌苔上，并将板在30℃下孵育16至18小时。通过菌苔抑制测定，P863针对对P764敏感但对P801不敏感的菌株以及对P764不敏感和对P801敏感的菌株具有活性，表明P863在单个分子中具有P764和P801二者的杂交特性(图12C)。P863即使在血清的存在下也具有活性，并且对于ATCC 13883在CAA中得到MIC为4μg/ml，在含10％FCS(Fetal Calf Serum)下的MIC为1μg/ml。
实施例8：P867(经改造以改善效力)
P867是通过用P801的前第1至22位氨基酸(由TonB基序组成)代替P849(在CAA中没有得到MIC的P801同源物)的前53个氨基酸而产生的(图13A)。P867在大肠杆菌中表达并使用离子交换色谱进行纯化(图13B)。然后将纯化的蛋白质继续用于测试。将P867置于克雷伯菌分离株的菌苔上，并将板在30℃下孵育16至18小时。P867对测试的P801敏感分离株具有活性(图13C)。在MIC研究中发现P867是强效的，表明通过引入P801 TonB基序对P849进行改造增强了活性(表6)。对于肺炎克雷伯菌菌株ATCC13883，P867分别在50％FCS和50％人血清中以0.5和0.07μg/ml的MIC在不同血清基质中保留了活性。
表6
实施例9：P870(P764 FL-4X刚性接头+P801FL)
P870是通过将P764全长与全长P801的N端融合而产生的，在两者之间具有4X刚性接头(图14A)。P870在大肠杆菌中表达并使用离子交换色谱纯化至大于90％的同质性(图14B)。然后将纯化的蛋白质继续用于测试。将20μg纯化的P870置于肺炎克雷伯菌分离株的菌苔上，并将板在30℃下孵育16至18小时。通过菌苔抑制测定，P870具有活性，并且在P764IS和P801IS二者上均观察到斑点清除，表明了蛋白质的杂交活性(图14C)。在存在血清的情况下保留了活性(表7)。
表7：P870的MIC
实施例10：P875(P801FL-刚性接头+GP36 CD)
P875是通过将GP36 CD(P200)(来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)噬菌体P134的结构溶菌酶的催化结构域)与全长P801的C端融合而产生的(图15A)。仅当细胞缺乏外膜时，GP36 CD才具有溶壁活性(muralytic activity)并降解革兰氏阴性肽聚糖。P875在大肠杆菌中表达并使用离子交换色谱进行纯化(图15B)。通过将40μg纯化的P875置于肺炎克雷伯菌菌株的菌苔上并在30℃下孵育16至18小时来评价P875的抗细菌活性。P875在细菌菌苔上显示出抑制区，表明融合物具有活性(图15C)。P875在存在10％FCS的情况下高度强效，并且对肺炎克雷伯菌(KP)的许多临床分离株具有活性(表8)。
表8：P875对ATCC 13883和临床分离株的MIC
| SI.No. | KP分离株 | 在10％FCS中的MIC(μg/mL) |
| 1 | ATCC13883 | 0.125 |
| 2 | B2091 | ＞256 |
| 3 | B2101 | 4 |
| 4 | B2104 | 0.5 |
| 5 | B2113 | ＞256 |
| 6 | B2117 | ＞256 |
| 7 | B2123 | 8 |
| 8 | B2151 | 32 |
| 9 | B2253 | 4 |
| 10 | B2556 | 2/4 |
| 11 | B2560 | 8 |
| 12 | B2161 | ＞256 |
| 13 | B2170 | 0.25 |
| 14 | B2208 | 4/8 |
| 15 | B2261 | 8 |
| 16 | NDM1 KL6 | ＞256 |
| 17 | B2187 | 4 |
| 18 | B2221 | 4/8 |
| 19 | B2245 | 16 |
| 20 | B2267 | 0.5/1 |
| 21 | B2281 | 16 |
实施例11：P889(P764 FL+GP36 CD)；P891(P764FL-柔性接头+GP36 CD)；P892(P764-刚性接头+GP36 CD)
P889是通过将GP36 CD(P200)(来自铜绿假单胞菌噬菌体P134的结构溶菌酶的催化结构域)与全长P764的C端融合而产生的。P891和P892是通过将GP36 CD(P200)(来自铜绿假单胞菌噬菌体P134的结构溶菌酶的催化结构域)与全长P764的C端融合而产生的，在两者之间分别具有柔性接头和刚性接头(图16A、17A和18A)。仅当细胞缺乏外膜时，GP36 CD才具有溶壁活性并降解革兰氏阴性肽聚糖。P889、P891和P892在大肠杆菌中表达并通过离子交换色谱进行纯化(图16B、17B和18B)。通过将10μg纯化的蛋白质置于肺炎克雷伯菌菌株的菌苔上并在30℃下孵育16至18小时来评估抗细菌活性。P889、P891和P892在细菌菌苔上显示出抑制区，表明融合蛋白具有活性(图16C、17C、18C)。通过MIC测定，在存在FCS的情况下，P889、P891和P892对肺炎克雷伯菌临床分离株显示出强效的活性(表9)。
表9：在10％FCS中P889、P891和P892针对ATCC13883和临床分离株的MIC
本申请中引用的所有专利、专利申请和另一些公开(包括GenBank登录号)出于所有目的均通过引用整体并入。
非正式序列表
1.P771(P764 TD RD-P628全长)：
P771的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：
P771结构域边界：
氨基酸数目：720
分子量：75940
理论pI：9.11
P771的DNA序列(SEQ ID NO：2)：
2.P772(P764 TD RD-柔性接头-P628 FL)：
P772的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：
P772结构域边界：
氨基酸数目：727
分子量：76443
理论pI：9.11
P772的DNA序列(SEQ ID NO：4)：
3.P777(P764 TD RD-刚性接头-P628 FL)：
P777的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：
P777结构域边界：
氨基酸数目：730
分子量：76881
理论pI：9.10
P777的DNA序列(SEQ ID NO：6)：
4.P775(P628 TD和RD用刚性接头与P764全长融合)：
P775的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)：
P775结构域边界：
氨基酸数目：846
分子量：88454
理论pI：8.77
P775的DNA序列(SEQ ID NO：8)：
5.P776(P628 TD RD-柔性接头-P764 FL)：
P776的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：
P776结构域边界：
氨基酸数目：843
分子量：87990
理论pI：8.77
P776的DNA序列(SEQ ID NO：10)：
6.P780(P774 TD RD-刚性接头-P628 FL)：
P780的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)：
P780结构域边界：
氨基酸数目：697
分子量：73983
理论pI：9.01
P780的DNA序列(SEQ ID NO：12)：
7.P781(P628 TD RD-柔性接头-P774 FL)：
P781的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)：
/>
P781结构域边界：
氨基酸数目：744
分子量：78390
理论pI：6.31
P781的DNA序列(SEQ ID NO：14)：
8.P782(P774 TD RD-柔性接头-P628 FL)：
P782的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)：
P782结构域边界：
氨基酸数目：694
分子量：73546
理论pI：9.02
P782的DNA序列(SEQ ID NO：16)：
9.P784(P628 TD RD-刚性接头-P774 FL)：
P784的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)：
P784结构域边界：
氨基酸数目：747
分子量：78827
理论pI：6.31
P784的DNA序列(SEQ ID NO：18)：
10.P787(P764 TD RD-柔性接头-P774 FL)：
P789的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)：
P787结构域边界：
氨基酸数目：444
分子量：47574
理论pI：6.07
P787的DNA序列(SEQ ID NO：20)：
11.P789(P764 TD RD-刚性接头-P774 FL)：
氨基酸序列(SEQ ID NO：21)：
P789结构域边界：
/>
氨基酸数目：447
分子量：48012
理论pI：6.08
P789的DNA序列(SEQ ID NO：22)：
12.P788(P764 TD-刚性接头-P628 FL)：
P788的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)：
P788结构域边界：
氨基酸数目：608
分子量：63648
理论pI：9.09
P788的DNA序列(SEQ ID NO：24)：
13.P792(P764-刚性接头-P774 FL)：
P792的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)：
P792结构域边界：
氨基酸数目：664
分子量：70953
理论pI：7.08
P792的DNA序列(SEQ ID NO：26)：
14.P795(P764-柔性接头-P774 FL)：
P795的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)：
P795结构域边界：
氨基酸数目：661
分子量：70516
理论pI：7.08
P795的DNA序列(SEQ ID NO：28)：
/>
15.P805(P628Δ7)：
P805的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)：
P805结构域边界：
氨基酸数目：555
分子量：58707
理论pI：9.21
P805的DNA序列(SEQ ID NO：30)：
16.P806(P628Δ25)：
P806的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)：
P806结构域边界：
/>
氨基酸数目：537
分子量：57145
理论pI：9.21
P806的DNA序列(SEQ ID NO：32)：
17.P810(双受体结合结构域：764 TD RD-P774 RD-P764 KD)：
P810的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)：
P810结构域边界：
1-38：764 TD
39-160：764 RD
161-253：774 RD
254-470：764 KD
氨基酸数目：470
分子量：50452
理论pI：8.89
P810的DNA序列(SEQ ID NO：34)：
18.P812(P628 TD RD-刚性接头-P764 KD)：
P812的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)：
P812结构域边界：
氨基酸数目：687
分子量：71637
理论pI：8.77
P812的DNA序列(SEQ ID NO：36)：
19.P818(P764 TD-P774 RD-P764 KD)：
P818的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)：
P818结构域边界：
1-37：764 TD
38，39：Kpn I限制性位点
40-132：774 RD
133，134：Hind III限制性位点
135-348：764 KD
氨基酸数目：348
分子量：37028
理论pI：8.74
P818的DNA序列(SEQ ID NO：38)：
20.P819(P774 TD-P764 RD-P774 KD)：
P819的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)：
P819结构域边界：
1-30：774 TD
31，32：Kpn I限制性位点
33-154：764 RD
155，156：Hind III限制性位点
157-307：774 KD
氨基酸数目：307
分子量：33073
理论pI：5.96
P819的DNA序列(SEQ ID NO：40)：
21.P820(P764 TD RD-刚性接头-P628Δ25)：
P820的氨基酸序列(SEQ ID NO：41)：
P820结构域边界：
氨基酸数目：705
分子量：74790
理论pI：9.10
P820的DNA序列(SEQ ID NO：42)：
22.P822(P801 TD RD-刚性接头-P764 KD)：
P822的氨基酸序列(SEQ ID NO：43)：
P822结构域边界：
氨基酸数目：382
分子量：40558
理论pI：8.91
P822的DNA序列(SEQ ID NO：44)：
23.P821(P628 TD和RD用刚性接头与P801全长融合)：
P821的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)：
P821结构域边界：
/>
氨基酸数目：745
分子量：78379
理论pI：8.67
P821的DNA序列(SEQ ID NO：46)：
24.P823(P628 TD和RD用柔性接头与P801全长融合)：
P823的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)：
P823结构域边界：
氨基酸数目：742
分子量：77942
理论pI：8.68
P823的DNA序列(SEQ ID NO：48)：
25.P835：P628TDRD-P801 FL
P835的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)：
P835结构域边界：
1-460：P628 TDRD
461-735：P801全长
氨基酸数目：735
分子量：77438
理论pI：8.68
P835的DNA序列：(SEQ ID NO：50)
/>
26.P836(P628TDRD-4X刚性接头-P801)
P836的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)
P836结构域边界：
1-460：P628TDRD
461-480：4X刚性接头
481-755：P801全长
氨基酸数目：755
分子量：79320
理论pI：8.66
P836的DNA序列(SEQ ID NO：52)
27.P837：P628 TDRD-FL-P801FL
P837的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)
P837结构域边界：
1-460：P628 TDRD
461-467：柔性接头
468-742：P801全长
氨基酸数目：742
分子量：77942
理论pI：8.68
P837的DNA序列(SEQ ID NO：54)
28.P842：P628 FL-P801FL
P842的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)
P842结构域边界：
1-561：P628全长
562-836：P801全长
氨基酸数目：836
分子量：88920
理论pI：9.17
P842的DNA序列：(SEQ ID NO：56)
/>
29.P845：P628FL-FL-P801FL
P845的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)
P845结构域边界：
1-561：P628全长
562-568：柔性接头
569-843：P801全长
氨基酸数目：843
分子量：89424
理论pI：9.17
P845的DNA序列(SEQ ID NO：58)
30.P862(P628FL-刚性接头-P801FL)
P862的氨基酸序列(SEQ ID NO：59)
P862结构域边界：
氨基酸数目：846
分子量：89861
理论pI：9.16
P862的DNA序列(SEQ ID NO：60)
31.P863(P764FL-刚性接头-P801FL)
P862的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)
P863结构域边界：
1-377：P764全长
378-387：刚性接头
388-662：P801全长
氨基酸数目：662
分子量：70505
理论pI：8.99
P863的DNA序列(SEQ ID NO：62)
32.P864(P764 FL-FL-P801FL)
P864的氨基酸序列(SEQ ID NO：63)
P864结构域边界：
1-377：P764全长
378-384：柔性接头
385-659：P801全长
氨基酸数目：659
分子量：70068
理论pI：9.01
P864的DNA序列(SEQ ID NO：64)
33.P870(P764FL-4X刚性接头-P801FL)
P870的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)
P870结构域边界：
1-377：P764全长
378-397：4X刚性接头
398-672：P801全长
氨基酸数目：672
分子量：71446
理论pI：8.98
P870的DNA序列(SEQ ID NO：66)
34.P867：P849(来自类肺炎克雷伯菌(K.quasipneumoniae)的P801同源物)的第1至53位氨基酸被P801的第1至22位氨基酸替代P867的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)
P867结构域边界：
1-22：来自P801易位结构域的22个氨基酸
23-275：P849
氨基酸数目：275
分子量：29701
理论pI：7.72
P867的DNA序列(SEQ ID NO：68)
35.P875(P801-刚性接头-GP36)
P875的氨基酸序列(SEQ ID NO：69)
P875结构域边界：
1-276：P801全长
277-286：2X刚性接头
287-502：GP36催化结构域
氨基酸数目：502
分子量：54304
理论pI：8.53
P875的DNA序列(SEQ ID NO：70)
36.P889(P764-GP36CD)
P889的氨基酸序列(SEQ ID NO：71)
P889结构域边界：
1-377：P764全长
378-593：GP36催化结构域
氨基酸数目：593
分子量：63412
理论pI：8.73
P889DNA序列(SEQ ID NO：72)
37.P891(P764-FL-GP36CD)
P891的氨基酸序列(SEQ ID NO：73)
P891结构域边界：
1-377：P764全长
378-384：柔性接头
385-600：GP36催化结构域
氨基酸数目：600
分子量：63915
理论pI：8.73
P891的DNA序列(SEQ ID NO：74)
38.P892(P764-RL-GP36CD)
P891的氨基酸序列(SEQ ID NO：75)
P892结构域边界：
1-377：P764 TDRD
378-387：刚性接头
388-603：GP36 CD
氨基酸数目：603
分子量：64353
理论pI：8.72
P892的DNA序列(SEQ ID NO：76)
/>
Claims (28)
1.多肽，其包含一个或更多个易位结构域、一个或更多个受体结合结构域以及杀伤结构域，其中所述结构域中的每一个均来源于天然存在的克雷伯菌素，并且其中所述杀伤结构域和至少一个所述受体结合结构域来源于两种不同的天然存在的克雷伯菌素。
2.权利要求1所述的多肽，其从N端至C端包含所述易位结构域、所述受体结合结构域和所述杀伤结构域。
3.权利要求1所述的多肽，其包含来源于两种不同的天然存在的克雷伯菌素的两个受体结合结构域。
4.权利要求2或3所述的多肽，其还包含所述受体结合结构域与所述杀伤结构域之间的肽接头。
5.权利要求1所述的多肽，其中所述杀伤结构域包含全长天然存在的克雷伯菌素。
6.权利要求1所述的多肽，其中所述易位结构域之一和所述受体结合结构域之一来源于P628或P764。
7.权利要求1所述的多肽，其中所述杀伤结构域包含全长P764或P801。
8.权利要求3所述的多肽，其中所述两个受体结合结构域来源于P764和P774。
9.权利要求1所述的多肽，其包含SEQ ID NO：7、33、45、47、51、57、59、61、65、67、69、71、73或75的氨基酸序列。
10.权利要求1所述的多肽，其由SEQ ID NO：7、33、45或47的氨基酸序列组成。
11.核酸，其包含编码权利要求1至10中任一项所述多肽的多核苷酸序列。
12.表达盒，其包含编码权利要求1至10中任一项所述多肽的多核苷酸序列。
13.载体，其包含权利要求12所述的表达盒。
14.宿主细胞，其包含权利要求12所述的表达盒或权利要求13所述的载体。
15.重组产生权利要求1至10中任一项所述多肽的方法，其包括在允许表达由权利要求12所述的表达盒或权利要求13所述的载体编码的多肽的条件下培养权利要求14所述的宿主细胞。
16.组合物，其包含权利要求1至10中任一项所述的多肽以及生理学上可接受的赋形剂。
17.权利要求16所述的组合物，其被配制成用于通过注射或吸入来施用。
18.用于抑制肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)生长的方法，其包括将有效量的权利要求16所述的组合物施加于其中存在肺炎克雷伯菌的位置。
19.权利要求18所述的方法，其中通过注射将所述组合物施加于患有肺炎克雷伯菌感染的患者。
20.权利要求18所述的方法，其中通过吸入将所述组合物施加于患有肺炎克雷伯菌感染的患者。
21.权利要求1至10中任一项所述的多肽用于抑制肺炎克雷伯菌生长的用途。
22.权利要求1至10中任一项所述的多肽用于制备用于治疗肺炎克雷伯菌感染的药物的用途。
23.权利要求21或22所述的用途，其中所述多肽存在于被配制成用于注射的组合物中。
24.权利要求21或22所述的用途，其中所述多肽存在于被配制成用于吸入的组合物中。
25.用于抑制肺炎克雷伯菌生长的药盒，其包含含有组合物的第一容器，所述组合物包含有效量的权利要求1至10中任一项所述的多肽。
26.权利要求25所述的药盒，其中所述组合物被配制成用于注射。
27.权利要求25所述的药盒，其中所述组合物被配制成用于吸入。
28.权利要求25所述的药盒，其还包含说明手册。
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |