NO318898B1 - OCIF-proteiner, fremgangsmate for fremstilling av dem, cDNA som koder for dem, OCIF variant-, mutant- og trunkert OCIF-cDNA, OCIF-variant-, mutant-, og trunkert OCIF-protein, genomisk OCIF-DNA, farmasoytisk preparat omfattende OCIF-protein, variant, mutant og trunkert OCIF-protein, antistoff mot disse, anvendelse av disse for fremstilling av medikament, fremgangsmate for bestemmelse av konsentrasjon av OCIF, vektor med insatt OCIF-cDNA, vertscelle inneholdende vektoren og transformert E. coli-stamme. - Google Patents
OCIF-proteiner, fremgangsmate for fremstilling av dem, cDNA som koder for dem, OCIF variant-, mutant- og trunkert OCIF-cDNA, OCIF-variant-, mutant-, og trunkert OCIF-protein, genomisk OCIF-DNA, farmasoytisk preparat omfattende OCIF-protein, variant, mutant og trunkert OCIF-protein, antistoff mot disse, anvendelse av disse for fremstilling av medikament, fremgangsmate for bestemmelse av konsentrasjon av OCIF, vektor med insatt OCIF-cDNA, vertscelle inneholdende vektoren og transformert E. coli-stamme. Download PDFInfo
- Publication number
- NO318898B1 NO318898B1 NO19973801A NO973801A NO318898B1 NO 318898 B1 NO318898 B1 NO 318898B1 NO 19973801 A NO19973801 A NO 19973801A NO 973801 A NO973801 A NO 973801A NO 318898 B1 NO318898 B1 NO 318898B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- ocif
- seq
- protein
- cdna
- amino acid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 title claims description 365
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 title claims description 362
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title claims description 244
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 186
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 184
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 239
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 160
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 119
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 90
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 90
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 46
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 15
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 13
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 13
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 13
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 9
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 claims description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 5
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 239000011224 oxide ceramic Substances 0.000 claims description 3
- 229910052574 oxide ceramic Inorganic materials 0.000 claims description 3
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 57
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 144
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 113
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 80
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 65
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 55
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 45
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 45
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 39
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 37
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 34
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 31
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 27
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 23
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 22
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 21
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 20
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 18
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 14
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical class C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 9
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000007591 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108010032050 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 4
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 4
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 4
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 102220527619 Transmembrane protein with metallophosphoesterase domain_C22S_mutation Human genes 0.000 description 4
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 4
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 4
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 4
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 4
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N Alumina Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100100119 Homo sapiens TNFRSF10C gene Proteins 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102220483438 LIM domain-binding protein 1_C20S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 102220483439 LIM domain-binding protein 1_C23S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 101800004191 Peptide P2 Proteins 0.000 description 3
- 101800004193 Peptide P3 Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 101100121770 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GID8 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100009020 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) dcr1 gene Proteins 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220527615 Transmembrane protein with metallophosphoesterase domain_C21S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 2
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102220560970 Flotillin-2_C19S_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101000716068 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 description 2
- 101000597785 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Proteins 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- MDSUKZSLOATHMH-IUCAKERBSA-N Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C([O-])=O MDSUKZSLOATHMH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 description 2
- MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N N-L-leucyl-L-valine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100327347 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CDD1 gene Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 2
- 102100035284 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000002638 denervation Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- -1 pH adjusters Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-acetylsulfanylacetate Chemical compound CC(=O)SCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPWMTBZSRRLQNJ-VKHMYHEASA-N (3s)-3-aminopiperidine-2,6-dione Chemical compound N[C@H]1CCC(=O)NC1=O NPWMTBZSRRLQNJ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 244000250392 Cardamine diphylla Species 0.000 description 1
- 235000001250 Cardamine diphylla Nutrition 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000795350 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 59 Proteins 0.000 description 1
- WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine hydrochloride Chemical compound Cl.ON WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- SFBODOKJTYAUCM-UHFFFAOYSA-N Ipriflavone Chemical compound C=1C(OC(C)C)=CC=C(C2=O)C=1OC=C2C1=CC=CC=C1 SFBODOKJTYAUCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000043299 Parathyroid hormone-related Human genes 0.000 description 1
- 101710123753 Parathyroid hormone-related protein Proteins 0.000 description 1
- 101800004192 Peptide P1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100029717 Tripartite motif-containing protein 59 Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N Vitamin K2 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 1
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960005431 ipriflavone Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N menaquinone-4 Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004487 mononuclear osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037525 nasal preparations Drugs 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001599 osteoclastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005426 pharmaceutical component Substances 0.000 description 1
- 238000003616 phosphatase activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 238000013001 point bending Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Et protein som inhiberer osteoklastdifferensiering og/eller modning og en fremgangsmåte for fremstilling av proteinet. Proteinet fremstilles ved hjelp av humane, embryoniske lungefibroblaster og har en molekylvekt på ca. 60 kD og ca. 120 kD under ikke reduserende betingelser, ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese. Proteinet kan isoleres og renses fra kulturmediet fra fibroblastene. Proteinet kan dessuten fremstilles ved hjelp av genteknikk. DNA for fremstilling av proteinet ved hjelp av genteknikk, antistoffer med spesifikk affinitet for proteinet eller en fremgangsmåte for bestemmelse av proteinkonsentrasjonen ved anvendelse av antistoffene, er også beskrevet.
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse angår et nytt protein, osteoklastogeneseinhibitorisk faktor (OCIF) og fremgangsmåter for fremstilling av proteinet.
Oppfinnelsens bakgrunn
Humant benvev omdannes kontinuerlig ved den gjentatte prosess med resorpsjon og rekonstitusjon. I denne prosess be-traktes osteoblaster og osteoklaster som de celler som hovedsakelig er ansvarlige for hhv. bendannelse og benresorpsjon.
Et typisk eksempel på en sykdom forårsaket av utvikling av unormal benmetabolisme er osteoporose. Sykdommen er kjent for å bli fremkalt av tilstanden hvori benresorpsjon av osteoklaster overskrider bendannelse av osteoblaster, men meka-nismen for osteoporose har hittil ikke blitt fullstendig klar-gjort. Osteoporose forårsaker smerte i benstrukturen og gjør den skjør, hvilket fører til brudd. Fordi osteoporose øker antallet sengeliggende gamle mennesker, er dette blitt et sosialt problem med det økende antall gamle mennesker. Effektive legemidler for behandling av sykdommen, forventes derfor å bli utviklet. Benmassereduksjon forårsaket av den unormale benmetabolisme, antas og forebygges ved inhibering av benresorpsjon, forbedring av bendannelse eller forbedring av den balanserte metabolisme.
Bendannelse forventes og fremmes ved stimulering av vekst, differensiering eller aktivering av osteoblaster. Mange cytokiner er rapportert å stimulere vekst eller differensiering av osteoblaster, dvs. fibroblastvekstfaktor {FGF) (Rodan S. B. et al., Endocrinology vol. 121, s. 1917, 1987), insulinlignende vekstfaktor-I (IGF-I) (Hock J. M. et al., Endocrinology vol. 122, s. 254, 1988), insulinlignende vekstfaktor-II (IGF-II) (McCarthy T. et al., Endocrinology vol. 124, s. 301, 1989), Aktivin A (Centrella M. et al., Mol, Cell, Biol. vol.
11, s. 250, 1991), Vasculotropin (Varonique M et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 199, s. 380, 1994) og benmorfogen-etisk protein (BMP) (Yamaguchi, A et al., J. Cell Biol. vol. 113, s. 682, 1991, Sampath T. K. et al., J. Biol Chem. vol.
267, s. 20532, 1992 og Knutsen R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 194, s. 1352, 1993.
I F.W. Fawthrop et al.. Journal of Bone and Mineral Research, vol. 7, 1992, s. 1363-1371 fremkommer det at skjelettstrukturen opprettholdes i en kontinuerlig om-dannelsesprosess av den kalsifiserte matriksen v.h.a. aktiviteten til benceller. Omdannelsen begynner med en fase av benresorpsjon mediert av osteoklaster etterfulgt av bendannelse utført av osteoklaster. Disse prosessene antas å kontrolleres av cytokiner og vekstfaktorer og TBFS inhiberer trolig osteoklastfornyelse.
I A.J. Fenton et al., Journal of Cellular Physiology, vol. 155, 1993, s. 1-7, vises det til at et parathyroid hormonrelatert protein hPTHrP(107-13 9) virker som en potent langtidsinhibitor av osteoklastisk benresorpsjon. Det har også blitt vist at kalsitonin inhiberer fusjon av mononukleære osteoklaster i murine benmargskulturer og reduserer antallet av osteoklaster både in vivo og in vitro.
På den annen side har cytokiner som inhiberer differensiering og/eller modning av osteoklaster, tiltrukket seg oppmerksomhet og er blitt intensivt undersøkt. Transformerende vekstfaktor-p (Chenu C. et al.-. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 85, s. 5683, 1988) og interleukin-4 (Kasano K. et al., Bone-Miner., vol. 21, s. 179, 1993) er funnet å inhibere differensiering av osteoklaster. Kalsitonin (Bone-Miner., vol. 17, s. 347, 1992), makrofagkolonistimulerende faktor (Hatter-sley G. et al., J. Cell. Physiol. vol. 137, s. 199, 1988), interleukin-4 (Watanabe, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 172, s. 1035, 1990) og interferon-y {Gowen M. et al., J. Bone Miner. Res., vol 1, s. 469, 1986) er funnet å inhibere benresorpsjon av osteoklaster.
Disse cytokiner forventes å være effektive legemidler for forbedring av benmassereduksjon ved å stimulere bendannelse og/eller ved å inhibere benresorpsjon. Cytokinene, slik som insulinlignende vekstfaktor-I og benmorfogenetiske proteiner, blir nå undersøkt i kliniske forsøk for deres virkninger ved behandling av pasienter med bensykdommer. Kalsitonin anvendes allerede som et legemiddel for å behandle osteoporose
og for å minske smerte ved osteoporose.
Eksempler på legemidler som nå anvendes klinisk for behandling av bensykdommer og for å forkorte behandlings-perioden, er dihydroksyvitamin D3, vitamin K2, kalsitonin og dets derivater, hormoner som østradiol, ipriflavon og kalsium-preparater. Disse legemidler tilveiebringer imidlertid ikke tilfredsstillende terapeutiske effekter og nye legemiddel-materialer er forventet å bli utviklet. Som nevnt kontrolleres benmetabolisme ved balansen mellom benresorpsjon og bendannelse. Cytokiner som inhiberer osteoklastdifferensiering og/eller modning, forventes derfor å bli utviklet som legemidler for behandling av bensykdommer som osteoporose.
Beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse ble innledet fra det ovenfor beskrevne synspunkt. Formålet for oppfinnelsen er både å til-veiebringe en ny faktor betegnet osteoklastogeneseinhibitorisk faktor (0CIF) og en prosedyre for effektiv fremstilling av faktoren.
Oppfinnerne har forsket intensivt for osteoklastogen-eseinhibitoriske faktorer i humant, embryonisk fibroblast-IMR-90 {ATCC CCL186) kondisjonert medium og har funnet en ny osteoklastogeneseinhibitorisk faktor (0CIF) som inhiberer differensiering og/eller modning av osteoklaster.
Oppfinnerne har etablert en metode for akkumulering av proteinet til en høy konsentrasjon ved å dyrke IMR-90-celler ved anvendelse av aluminiumoksid-keramiske biter som celleadherensmatrikser.
Oppfinnerne har også etablert en effektiv metode for isolering av proteinet, OCIF, fra det IMR-90-kondisjonerte medium ved anvendelse av den følgende sekvensielle kolonnekromatografi, ionebytter, heparinaffinitet, cibacron-blå-affinitet og reversfase.
Basert på aminosyresekvensen av den rensede naturlige OCIF, har oppfinnerne lykkes med å klone et cDNA som koder for dette protein. Oppfinnerne etablerte også en prosedyre for å produsere dette protein som inhiberer differensiering av osteoklaster. Foreliggende oppfinnelse angår et OCIF-protein, kjennetegnet ved at det har de følgende egenskaper: (a) molekylvekt ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ;
ca. 60 kD under reduserende betingelser, og ca. 60 kD og 120 kD under ikke-reduserende betingelser, (b) en høy affinitet for kationbytterkolonne og heparinkolonne; (c) en biologisk aktivitet som inhiberer osteoklastdifferensiering og/eller -modning;
dets aktivitet reduseres ved oppvarming ved 70 °C i 10 min eller ved 56 °C i 30 min, og
dets aktivitet går tapt ved oppvarming ved 90 °C i 10
min, og
(d) interne aminosyresekvenser vist i sekvens-ID nr. 1, 2 og 3. Aminosyresekvensen av proteinet OCIF, som er beskrevet ved foreliggende oppfinnelse, er tydelig forskjellig fra enhver av de kjente faktorer som inhiberer dannelse av osteoklaster.
Foreliggende oppfinnelse inkluderer en fremgangsmåte for fremstilling av OCIF-protein, omfattende; dyrkning av humane fibroblaster; rensing av proteinet ved hjelp av en kombinasjon av ionebytterkolonnekromatografi, affinitetskolonnekromatografi og reversfase-kolonnekromatografi.
Foreliggende oppfinnelse inkluderer en fremgangsmåte for fremstilling av OCIF-proteinet i høy konsentrasjon ved dyrkning av humane fibroblaster under anvendelse av aluminiumoksid- keramiske biter som celleadherensmatrikser.
Ved foreliggende oppfinnelse er dessuten aminosyresekvensene av peptidene avledet fra OCIF bestemt, primerne basert på disse aminosyresekvenser er utformet og cDNA-fragmenter som koder for OCIF fra et cDNA-bibliotek av IMR-90-celler, er erholdt.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer OCIF-protein som har en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 4, et OCIF-cDNA som koder for en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 4, et OCIF-cDNA som har en nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 5, et OCIF-cDNA som er satt inn i en vektor som bæres av den transformerte Escerichia coli-stammen pBK/01F10 (FERM BP-5267), et OCIF-cDNA som har en nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 6, et OCIF-cDNA som hybridiserer med cDNA som vist i sekvens-ID nr. 6 under stringente betingelser, et OCIF-protein som er uttrykt fra cDNA som koder for aminosyresekvensen som vist i sekvens-ID nr. 4 og et OCIF-protein som har en biologisk aktivitet som inhiberer osteoklastdifferensiering og/eller -modning, og som er tilveiebrakt som aminosyreuttrykt cDNA og som har minst 80 % sekvensidentitet med aminosyrene som er vist i sekvens-ID nr. 4.
Foreliggende oppfinnelse gjelder også en fremgangsmåte for fremstilling av et OCIF-protein ifølge oppfinnelsen, der det anvendes genteknikk der det benyttes cDNA ifølge oppfinnelsen
Oppfinnelsen gjelder også OCIF-proteiner ifølge oppfinnelsen som er tilveiebrakt ved denne fremgangsmåten. I tillegg vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av OCIF-protein som er uttrykt fra cDNA som koder for aminosyresekvensen som vist i sekvens-ID nr. 4, og som er kjennetegnet ved at det anvendes genteknikk med benyttelse av pattedyrceller som vertsceller.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer OCIF-variant-, -mutant- eller trunkert OCIF-cDNA som er kjennetegnet ved at det er valgt fra: et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 8,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 10,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 12,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 14,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 83,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 84,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 85,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID
nr. 86,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 87,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 88,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 89,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 90,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 91,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 92,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 93,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 94,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 95,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 96,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 97,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 98,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 99,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 100,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 101,
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 102, og
et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID
nr. 103, og et
protein som er kodet for av disse.
Oppfinnelsen gjelder også OCIF-variant-, -mutant-eller trunkert OCIF-cDNA som er kjennetegnet ved at det er
valgt fra:
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 9,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 11,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 13,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 15,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 62,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 63,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 64,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 65,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 66,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 67,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 68,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 69,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 70,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 71,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 72,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID
nr. 73,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 74,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 75,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 76,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 77,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 78,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 79,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 80,
cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 81, og cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 82.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse genomisk
OCIF-DNA,
som er kjennetegnet ved at det koder for en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 5 og OCIF-variant-, -mutant- eller trunkert OCIF-protein som er valgt fra: et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 373 fra sekvens-ID nr. 9,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 341 fra sekvens-ID nr. 11,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 133 fra sekvens-ID nr. 13,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 124 fra sekvens-ID nr. 15,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 62,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 63,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 64,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 65,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 66,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer
aminosyrene 1 til 33 9 fra sekvens-ID nr. 67,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 338 fra sekvens-ID nr. 68,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 342 fra sekvens-ID nr. 69,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 338 fra sekvens-ID nr. 70,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 305 fra sekvens-ID nr. 71,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 306 fra sekvens-ID nr. 72,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 378 fra sekvens-ID nr. 73,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 330 fra sekvens-ID nr. 74,
et protein som har en aminosyresekvens som'tilsvarer aminosyrene 1 til 251 fra sekvens-ID nr. 75,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 176 fra sekvens-ID nr. 76,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 122 fra sekvens-ID nr. 77,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 85 fra sekvens-ID nr. 78,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 372 fra sekvens-ID nr. 79,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 300 fra sekvens-ID nr. 80,
et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 166 fra sekvens-ID nr. 81, og et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 63 fra sekvens-ID nr. 82, og OCIF-cDNA som koder for disse proteinene.
Oppfinnelsen angår også et farmasøytisk preparat som omfatter et protein ifølge oppfinnelsen, antistoff som har spesifikk aktivitet mot et protein ifølge oppfinnelsen, fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av proteinet som utgjør OCIF ved anvendelse av antistoffene ifølge oppfinnelsen og anvendelse av et protein ifølge oppfinnelsen for fremstillingen av medikament til behandlingen eller forebyggingen av osteoporose, minket benmasse og en unormal benmetabolisme.
Foreliggende oppfinnelse angår også en vektor som er kjennetegnet ved at ethvert av de følgende cDNAene (a) til (d) er satt inn i vektoren: (a) OCIF-cDNA som koder for en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 4, (b) OCIF-cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 6, (c) OCIF-cDNA som koder for en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr.5, (d) OCIF-cDNA som er satt inn i en vektor som er båret av den transformerte Escherichia coli-stammen pBK/01F10 (FERM BP-5267), og som koder for et protein som har en biologisk aktivitet som inhiberer osteoklastdifferensiering og/eller - modning, og en vertscelle der denne vektoren er introdusert i vertscellen. I tillegg til alt dette gjelder foreliggende oppfinnelse også den transformerte Escherichia coli-stammen pBK/01F10 (FERM BP5267).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
OCIF-proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres fra humant fibroblast-kondisjonert medium med høyt utbytte. Prosedyren for å isolere OCIF er basert på vanlige teknikker for rensing av proteiner fra biomaterialer, i overensstemmelse med de fysiske og kjemiske egenskaper til OCIF-proteinet. En konsentreringsprosedyre inkluderer f.eks. vanlige biokjemiske teknikker, slik som ultrafiltrering, lyofili-sering og dialyse. Rensingsprosedyrer inkluderer kombinasjoner av flere kromatografiske teknikker for rensing av proteiner, slik som ionebytterkolonnekromatografi, affinitetskolonnekromatografi, gelfiltreringskolonnekromatografi, hydrofob kolonnekromatografi, reversfase-kolonnekromatografi og preparativ gelelektroforese. De humane fibroblaster anvendt for produksjon av OCIF-proteinet er fortrinnsvis IMR-90. En fremgangsmåte for fremstilling av det IMR-90-kondisjonerte medium er fortrinnsvis en fremgangsmåte som omfatter adherens av humane embryoniske fibroblast-IMR-90-celler til aluminiumoksid- keramiske biter i roterende flasker, anvendelse av DMEM-medium supplert med 5 % serum fra nyfødte kalver for celle-kultur og dyrkning av cellene i roterende flasker i 7 til 10 dager ved dyrkning i stativ. CHAPS (3-[(3-kolamidopropyl)-dimetylammonio]-1-propansulfonat) tilsettes fortrinnsvis til bufferen som en detergent ved rensingstrinnene for OCIF-protein.
OCIF-proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan innledningsvis erholdes som en heparinbindende basisk OCIF-fraksjon ved applisering av kulturmediet på en heparinkolonne (Heparin-Sepharose CL-6B, Pharmacia), eluering med 10 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,5, inneholdende 2 M NaCl, og deretter ved applisering av OCIF-fraksjonen på en Q»anionbytterkolonne (HiLoad-Q/FF, Pharmacia) og oppsamling av ikke-adsorbert fraksjon. OCIF-protein kan renses ved applisering av den erholdte OCIF-fraksjon på en S»kationbytterkolonne (HiLoad-S/FF, Pharmacia), en heparinkolonne (Heparin-5PW( TOSOH), Cibacron-blå-kolonne (blå-5PW, TOSOH) og en reversfasekolonne (BU-300 C4, Perkin Eimer) og materialet defineres ved hjelp av de tidligere beskrevne egenskaper.
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for kloning av cDNA som koder for OCIF-proteinet, basert på aminosyresekvensen av naturlig OCIF og en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant OCIF-protein som inhiberer differensiering og/eller modning av osteoklaster. OCIF-proteinet renses i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet ved foreliggende oppfinnelse og behandles med endopeptidase (f.eks. lysylendopeptidase). Aminosyresekvensene av peptidene produsert fra spaltningen, bestemmes og blandingen av oligonukleotider som kan kode for hver intern aminosyresekvens, ble syntetisert. OCIF-cDNA-fragmentet erholdes ved hjelp av PCR (fortrinnsvis RT-PCR, reverstranskriptase PCR) ved anvendelse av oligo-nukleotidblandingene beskrevet ovenfor som primere. Det uforkortede OCIF-cDNA som koder for OCIF-proteinet, klones fra et cDNA-bibliotek ved anvendelse av det erholdte OCIF-DNA-fragment som en probe. OCIF-cDNA som inneholder hele kodingsområdet, innføyes i en ekspresjonsvektor. Det rekombinante OCIF kan produseres ved ekspresjon av OCIF-cDNA som inneholder hele kodingsområdet, i pattedyrceller eller bakterier.
Oppfinnelsen angår de nye proteiner 0CIF2, 0CIF3, 0CIF4 og 0CIF5, som er varianter av OCIF og har aktiviteten beskrevet ovenfor. Disse OCIF-varianter erholdes fra cDNA-biblioteket konstruert med IMR-90 poly(A) + RNA, ved hybridisering ved anvendelse av OCIF-cDNA-fragmentet som en probe. Hver av de OCIF-variant-cDNA som inneholder hele kodingsområdet, innføyes i en ekspresjonsvektor. Hver rekombinant OCIF-variant kan produseres ved ekspresjon av hver av de OCIF-variant-cDNA, inneholdende hele kodingsområdet, i de konvensjonelle verter. Hver rekombinant OCIF-variant kan renses i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet ved foreliggende oppfinnelse. Hver rekombinant OCIF-variant har en evne til å inhibere osteoklastogenese.
Foreliggende oppfinnelse inkluderer videre OCIF-mutanter. De er substitusjonsmutanter som omfatter erstatning av én cysteinrest som muligens er involvert i dimerdannelse, med en serinrest, og forskjellige delesjonsmutanter av OCIF. Substitusjoner eller delesjoner innføres i OCIF-cDNA ved anvendelse av polymerase-kjedereaksjon (PCR) eller ved res-triksjonsenzymspalting. Hver av disse muterte OCIF-cDNA inn-føyes i en vektor som inneholder en egnet promotor for gen-ekspresjon. Den resulterende ekspresjonsvektor for hver av OCIF-mutantene transfekteres inn i eukaryotiske celler, slik som pattedyrceller. Hver av OCIF-mutantene kan erholdes og renses fra de kondisjonerte media for de transfekterte celler.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer polyklonale antistoffer og en fremgangsmåte for kvantitativ bestemmelse av OCIF-konsentrasjon ved anvendelse av disse polyklonale antistoffer.
Som antigener (immunogener) kan det anvendes naturlig OCIF erholdt fra IMR-90-kondisjonert medium, rekombinant OCIF produsert av slike verter som mikroorganismer og eukaryoter ved anvendelse av OCIF-cDNA, syntetiske peptider utformet basert på aminosyresekvensen av OCIF, eller peptider erholdt fra OCIF ved partiell spaltning. Anti-OCIF-polyklonale antistoffer erholdes ved immunisering av egnede pattedyr med anti-genene, hvis nødvendig i kombinasjon med adjuvanser for immunisering og rensing fra serumet ved hjelp av vanlige rensingsmetoder. De anti-OCIF-polyklonale antistoffer som er merket med radioisotoper eller enzymer, kan anvendes i et radioimmunanalyse(RIA)system eller immunanalyse(EIA)system. Ved anvendelse av disse analysesystemer kan konsentrasjonene av OCIF i biologiske materialer, slik som blod og ascites og cellekulturmedier, lett bestemmes.
Antistoffene anvendt ved foreliggende oppfinnelse kan anvendes i radioimmunoanalyser (RIA) eller enzymimmunanalyser (EIA) . Ved anvendelse av disse analysesystemer kan konsentrasjonen av OCIF i biologiske materialer, slik som blod og ascites, lett bestemmes.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye monoklonale antistoffer og en fremgangsmåte for kvantitativ bestemmelse av OCIF-konsentrasjon ved anvendelse av disse monoklonale antistoffer.
Anti-OCIF-monoklonale antistoffer kan produseres ved hjelp av den konvensjonelle fremgangsmåte ved anvendelse av OCIF som et antigen. Native OCIF erholdt fra kulturmediet fra IMR-90-celler og rekombinant OCIF produsert av slike verter som mikroorganismer og eukaryoter ved anvendelse av OCIF-cDNA, kan anvendes som antigener. Alternativt kan syntetiserte peptider, utformet basert på aminosyresekvensen av OCIF og peptider erholdt fra OCIF ved partiell spaltning, også anvendes som antigener. Immuniserte lymfocytter erholdt ved immunisering av pattedyr med antigenet eller ved en in vitro-immuniseringsmetode, ble fusjonert med myelomer fra pattedyr for å erholde hybridomer. Hybridomklonene som utskiller antistoff som gjenkjenner OCIF ble utvalgt fra hybridomene erholdt fra cellefusjonen. De ønskede antistoffer kan erholdes ved celledyrkning av de utvalgte hybridomkloner. Ved fremstilling av hybridomer anvendes vanligvis små dyr, slik som mus eller rotter, for immunisering. Ved immuniseringen fortynnes OCIF passende med en saltoppløsning (0,15 M NaCl) og administreres intravenøst eller intraperitonealt sammen med et adjuvans til dyr 2-5 ganger hver 2.-20. dag. De immuniserte dyr ble avlivet 3 dager etter den siste immunisering, milten ble tatt ut og
splenocyttene ble anvendt som immuniserte B-lymfocytter.
Musemyelomcellelinjer for cellefusjon med de immuniserte B-lymfocytter inkluderer f.eks. p3/x63-Ag8, p3-Ul, NS-1, MPC-11, SP-2/0, FO, p3x63 Ag8.653 og S194. Rotte-R-210-celle-linje kan også anvendes. Humane B-lymfocytter immuniseres ved en in vi tro-immuniseringsmetode og fusjoneres med human myelomcellelinje- eller EB-virustransformerte, humane B-lymfocytter som anvendes som en stamcellelinje for cellefusjon, for å produsere antistoff av human type.
Cellefusjon av de immuniserte B-lymfocytter og mye-lomcellelinjen utføres hovedsakelig ved hjelp av konvensjonelle metoder. Metodene ifølge Koehler G. et al. (Nature, 256, 495-497, 1975) blir f.eks. vanligvis anvendt og også en elektrisk pulsmetode kan anvendes ved cellefusjon. De immuniserte B-lymfocytter og transformerte B-celler blandes i konvensjonelle forhold og et cellekulturmedium uten FBS og inneholdende polyetylenglykol anvendes vanligvis for cellefusjon. B-lymfocyttene fusjonert med myelomcellelinjer dyrkes i HAT-seleksjonsmedium inneholdende FBS for å utvelge hybridomer.
For screening av hybridomer som produserer anti-OCIF-antistoff, kan EIA, plakkanalyse, "Ouchterlony"- eller agglu-tineringsanalyse, prinsipielt anvendes. Blant disse er EIA enkelt og lett å utføre med tilstrekkelig nøyaktighet og anvendes vanligvis. Ved hjelp av EIA ved anvendelse av renset OCIF, kan det ønskede antistoff utvelges lett og nøyaktig. Således erholdte hybridomer kan dyrkes ved hjelp av den konvensjonelle metode for celledyrkning og nedfryses for lagring, hvis nødvendig. Antistoffet kan produseres ved å dyrke hybridomer ved anvendelse av den vanlige celledyrkningsmetode eller ved overføring av hybridomer intraperitonealt til dyr. Antistoffet kan renses ved hjelp av vanlige rensingsmetoder, slik som saltutfelling, gelfiltrering og affinitetskromatografi.
Det erholdte antistoff reagerer spesifikt med OCIF og kan anvendes for bestemmelse av OCIF-konsentrasjon og for rensing av OCIF. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse gjenkjenner epitoper på OCIF og har høy affinitet for OCIF. De kan derfor anvendes for konstruksjon av EIA. Ved hjelp av (anvendelse) dette analysesystem kan konsentrasjonen av OCIF i biologiske
materialer, slik som blod og ascites, lett bestemmes.
Midlene som inneholder OCIF som en effektiv bestanddel for behandling av bensykdommer, tilveiebringes ved foreliggende oppfinnelse. Nervetilførselen til det venstre forben hos rotter ble fjernet. Testforbindelser ble administrert daglig etter kirurgien i 14 dager. Etter 2 ukers behandling ble dyrene avlivet og deres forben ble dissekert. Benene ble deretter testet for mekanisk styrke ved hjelp av en trepunkts bøyemetode. OCIF forbedret mekanisk styrke til ben på en doseavhengig måte.
OCIF-proteinet ifølge oppfinnelsen er anvendelig som en farmasøytisk bestanddel for behandling eller forbedring av redusert benmasse ved tilstander som osteoporose, bensykdommer som reumatisme, osteoartritt og unormal benmetabolisme i multiple myelomer. OCIF-proteinet er også anvendelig som et antigen for å etablere immunologisk diagnose av sykdommene. Farmasøytiske preparater inneholdende OCIF-proteinet som en aktiv bestanddel, formuleres og kan administreres oralt eller parenteralt. Preparatet inneholder OCIF-proteinet ifølge oppfinnelsen som en effektiv bestanddel og administreres trygt til mennesker og dyr. Eksempler på de farmasøytiske preparater inkluderer preparater for injeksjon eller intravenøst drypp,. suppositorier, nesepreparater, sublinguale preparater og plastere for perkutan absorpsjon. Det farmasøytiske preparat for injeksjon kan fremstilles ved å blande den farmakologisk effektive mengde av OCIF-protein og farmasøytisk akseptable bærere. Bærerne er vehikler og/eller aktivatorer, f.eks. aminosyrer, sakkarider, cellulosederivater og andre organiske og uorganiske forbindelser som vanligvis tilsettes til aktive bestanddeler. Når OCIF-proteinet blandes med vehiklene og/<c->eller aktivatorene for å preparere injeksjoner, kan pH-juster-ingsmidler, buffere, stabilisatorer, oppløsningsmidler, etc, tilsettes hvis nødvendig.
Kort beskrivelse av figurene.
Figur 1 viser elueringsmønsteret for urenset OCIF-protein (Hiload-Q/FF-gjennompasseringsfraksjon; prøve 3) fra en Hiload-S/HP-kolonne. Figur 2 viser elueringsmønsteret for urenset OCIF-protein (heparin-5PW-fraksjon; prøve 5) fra en blå-5PW-kolonne. Figur 3 viser elueringsmønsteret for OCIF-protein (blå-5PW-fraksjon 49 til 50) fra en reversfasekolonne. Figur 4 viser SDS-PAGE av isolerte OCIF-proteiner under reduserende betingelser eller ikke-reduserende betingelser.
Beskrivelse av feltene:
felt 1, 4; molekylvektsmarkørproteiner,
felt 2, 5; OCIF-protein fra topp 6 i fig. 3,
felt 3, 6; OCIF-protein fra topp 7 i fig. 3.
Figur 5 viser elueringsmønsteret for peptider erholdt ved spaltning av pyridyletylert OCIF-protein spaltet med lysylendopeptidase på en reversfasekolonne. Figur 6 viser SDS-PAGE av isolert naturlig (n) OCIF-protein og rekombinant (r) OCIF-proteiner under ikke-reduserende betingelser. rOCIF(E) og rOCIF(C) ble produsert i hhv. 293/EBNA-celler og CHO-celler.
Beskrivelse av feltene:
felt 1; molekylvektsmarkørproteiner,
felt 2; en monomertype nOCIF-protein,
felt 3; en dimertype-nOCIF-protein,
felt 4; en monomertype rOCIF(E)-protein,
felt 5; en dimertype rOCIF(E)-protein,
felt 6; en monomertype rOCIF(C)-protein,
felt 7; en dimertype rOCIF(C)-protein.
Figur 7 viser SDS-PAGE av isolerte naturlige (n) OCIF-proteiner og rekombinante (r) OCIF-proteiner under reduserende betingelser. rOCIF(E) og rOCIF(C) ble produsert i hhv. 293/EBNA-celler og CHO-celler.
Beskrivelse av feltene:
felt 8; molekylvektsmarkørproteiner,
felt 9; en monomertype nOCIF-protein,
felt 10; en dimertype nOCIF-protein,
felt 11; en monomertype rOCIF(E)-protein,
felt 12; en dimertype rOCIF(E)-protein,
felt 13; en monomertype rOCIF(C)-protein,
felt 14; en dimertype rOCIF(C)-protein.
Figur 8 viser SDS-PAGE av isolerte naturlige (n) OCIF-proteiner og rekombinante (r) OCIF-proteiner, fra hvilke N-bundne sukkerkjeder var fjernet under reduserende betingelser. rOCIF(E) og rOCIF(C) er rOCIF-protein produsert i hhv. 293/EBNA-celler og CHO-celler.
Beskrivelse av feltene:
felt 15; molekylvektsmarkørproteiner,
felt 16; en monomertype nOCIF-protein,
felt 17; en dimertype nOCIF-protein,
felt 18; en monomertype rOCIF(E)-protein,
felt 19; en dimertype rOCIF(E)-protein,
felt 20; en monomertype rOCIF(C)-protein,
felt 21; en dimertype rOCIF(C)-protein.
Fig. 9 viser sammenligning mellom aminosyresekvenser for OCIF og OCIF2. Fig. 10 viser sammenligning mellom aminosyresekvenser for OCIF og OCIF3. Fig. 11 viser sammenligning mellom aminosyresekvenser for OCIF og OCIF4. Fig. 12 viser sammenligning mellom aminosyresekvenser for OCIF og OCIF5. Fig. 13 viser en standardkurve for bestemmelse av OCIF-proteinkonsentrasjon ved hjelp av en EIA som anvender ant i-OCIF-polyklonale ant istoffer. Fig. 14 viser en standardkurve for bestemmelse av OCIF-proteinkonsentrasjon ved hjelp av en EIA som anvender ant i-OCIF-monoklonale antistoffer. Fig. 15 viser effekten av rOCIF-protein på osteoporose .
Beste måte for utøvelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse vil forklares ytterligere ved hjelp av de følgende eksempler.
Eksempel 1
Fremstilling av et kondisjonert medium av human fibroblast IMR- 90
Humane fosterlungefibroblastceller IMR-90 (ATCC-
CCL186) ble dyrket på aluminiumoksid-keramiske biter (80 g)
(aluminiumoksid: 99,5 %, produsert av Toshiba Ceramic K.K.) i DMEM-medium (produsert av Gibco BRL Co.) supplert med 5 % CS og 10 mM HEPES-buffer (500 ml/roterende flaske) ved 37 °C under et trykk på 5 % C02 i 7 til 10 dager ved anvendelse av 60 roterende flasker (490 cm<2>, 110 x 171 mm, produsert av Coning Co.) i statisk kultur. Det kondisjonerte medium ble innhøstet og friskt medium ble tilsatt til rotasjonsflaskene. Det ble erholdt ca. 30 1 IMR-90 kondisjonert medium pr. satskultur. Det kondisjonerte medium ble betegnet som prøve 1.
Eksempel 2
Analysemetode for inhibitorisk aktivitet av osteoklastutvikling
Inhibitorisk aktivitet av osteoklastutvikling ble analysert ved å måle tartratresistent sur fosfatase(TRAP)-aktivitet i overensstemmelse med metoden ifølge M. Kumegawa et al. (Protein • Nucleic Acid • Enzyme, vol. 34, s. 999, 1989) og N. Takahashi et al. (Endocrynology, vol. 122, s. 1373, 1988) med modifikasjoner. Kort beskrevet ble benmargsceller erholdt fra 17 dager gamle mus suspendert i a-MEM (produsert av GIBCO BRL Co.), inneholdende 10 % FBS, 2 x IO"<8> M aktivert vitamin D3 og hver testprøve, og ble inokulert i hver brønn på en 96-brønners plate ved en celletetthet på 3 x 10<5> cell-
er/0,2 ml/brønn. Platene ble inkubert i 7 dager ved 37 °C i fuktet 5 % C02. Dyrkninger ble fortsatt videre ved å erstatte 0,16 ml gammelt medium med det samme volum av friskt medium på dag 3 og dag 5 etter start av dyrkningen. På dag 7, etter vask av platene med fosfatbufret saltløsning, ble celler fiksert med etanol/aceton (1:1) i 1 min ved romtemperatur og osteo-klast utvikl ingen ble deretter testet ved bestemmelse av fosfataseaktivitet ved anvendelse av et sett (sur fosfatase, leukocytt, katalog nr. 387-A, produsert av Sigma Co.). Reduksjonen av TRAP-positive celler ble tatt som en indikasjon på OCIF-aktivitet.
Eksempel 3
Rensing av OCIF
i) Heparinsepharose- CL- 6B- kolonnekromatografi
De 90 1 av IMR-90-kondisjonert medium (prøve 1) ble filtrert med 0,22 u membranfilter (hydrofil Milidisk, 2 000 cm<2>, Milipore Co.) og ble delt i tre porsjoner. Hver porsjon (30 1) ble applisert på en heparinsefarose-CL-6B-kolonne (5 x 4,1 cm, Pharmacia Co.) ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl inneholdende 0,3 M NaCl, pH 7,5. Etter vask av kolonnen med 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, ved en strømningshastig-het på 500 ml/t, ble heparinsefarose-CL-6B-adsorberende prote-infraksjon eluert med 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, inneholdende 2 M NaCl. Fraksjonen ble betegnet som prøve 2.
ii) HiLoad- Q/ FF- kolonnekromatografi
Den heparinsepharoseadsorberende fraksjon (prøve 2) ble dialysert mot 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, supplert med CHAPS, til en sluttkonsentrasjon på 0,1 % inkubert ved 4 °C over natten og delt i to porsjoner. Hver porsjon ble deretter applisert på en ionebytterkolonne (HiLoad-Q/FF, 2,6 x 10 cm, Pharmacia Co.) som var ekvilibrert med 50 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, for å erholde en ikke-adsorberende fraksjon
(1 000 ml). Fraksjonen ble betegnet som prøve 3.
iii) HiLoad- S/ HP- kolonnekromatograf i
Den HiLoad-Q-ikke-adsorberende fraksjon (prøve 3) ble applisert på en kationbytterkolonne (HiLoad-S/HP, 2,6 x 10 cm, Pharmacia Co.) som var ekvilibrert med 50 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5. Etter vask av kolonnen med 50 mM Tris-HCl,
0,1 % CHAPS, pH 7,5, ble det adsorberte protein eluert med en lineær gradient fra 0 til 1 M NaCl ved en strømningshastighet på 8 ml/min i 100 min og fraksjoner (12 ml) ble innsamlet.
Hver tiende fraksjon fra nummer 1 til 40 ble sammenslått for å danne én porsjon. 100 ul fra de fire porsjoner ble testet for OCIF-aktivitet. OCIF-aktivitet ble observert i fraksjoner fra 11 til 30 (som vist i fig. 1). Fraksjonene fra 21 til 30 som hadde høyere spesifikk aktivitet, ble innsamlet og betegnet som prøve 4.
iv) Heparin- 5 PW- af fini tetsko1onnekromatograf i
120 ml HiLoad-S-fraksjon fra nr. 21 til 30 (prøve 4) ble fortynnet med 240 ml 50 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, og applisert på en heparin-5PW-affinitetskolonne (0,8 x 7,5 cm, Tosoh Co.) som var ekvilibrert med 50 mM Tris-HCl,
0,1 % CHAPS, pH 7,5. Etter vask av kolonnen med 50 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, ble det adsorberte protein eluert med en lineær gradient fra 0 til 2 M NaCl ved en strømnings-hastighet på 0,5 ml/min i 60 min og fraksjoner (0,5 ml) ble oppsamlet. 50 ul ble fjernet fra hver fraksjon for å teste for OCIF-aktivitet. De aktive fraksjoner, eluert ved 0,7 til 1,3 M NaCl, ble sammenslått og betegnet som prøve 5.
v) Blå- 5PW- affinitetskolonnekromatografi
10 ml av prøve 5 ble fortynnet med 190 ml 50 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, og applisert på en blå-5PW-affinitetskolonne (0,5 x 5 cm, Tosoh Co.) som var ekvilibrert med 50 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5. Etter vask av kolonnen med 50 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, ble det adsorberte protein eluert med en 30 ml lineær gradient fra 0 til 2 M NaCl ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min og fraksjoner (0,5 ml) ble oppsamlet. Ved anvendelse av 25 ul av hver fraksjon ble OCIF-aktivitet evaluert. Fraksjonsnummeret 49 til 70, eluert med 1,0-1,6 M NaCl, hadde OCIF-aktivitet.
vi) Reversfasekolonnekromatografi
Blå-5PW-fraksjonen erholdt ved oppsamling av fraksjoner fra 49 til 50, ble surgjort med 10 ul 25 % TFA og applisert på en reversfase-C4-kolonne (BU-300, 2,1 x 220 mm, produsert av Perkin-Elmer) som var ekvilibrert med 0,1 % TFA og 25 % acetonitril. Det adsorberte protein ble eluert med en lineær gradient fra 25 til 55 % acetonitril ved en strømnings-hastighet på 0,2 ml/min i 60 min og hver proteintopp ble oppsamlet (fig. 3). 100 ul av hver toppfraksjon ble testet for OCIF-aktivitet og topp 6 og topp 7 hadde OCIF-aktivitet. Resultatene er vist i tabell 1.
Eksempel 4
Molekylærvekt av OCIF- protein
De to proteintopper (6 og 7) med OCIF-aktivitet ble underkastet SDS-polyakrylamidgelelektroforese under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Kort beskrevet ble 20 ul av hver toppfraksjon konsentrert under vakuum og oppløst i 1,5 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1- mM EDTA, 2,5 % SDS, 0,01 % bromfenolblått og inkubert ved 37 °C over natten under ikke-reduserende betingelser eller under reduserende betingelser {med 5 % 2-merkaptoetanol). 1,0 ul av hver prøve ble deretter analysert ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese med en gradientgel på 10-15 % akrylamid (Pharmacia Co.) og et elektroforeseutstyr (Fast System, Pharmacia Co.). De følgende molekylvektsmarkørproteiner ble anvendt for å beregne molekylvekt:fosforylase b (94 kD), bovint serumalbumin (67 kD), oval-bumin (43 kD), karbonanhydrase (30 kD), trypsininhibitor (20,0 kD) og laktalbumin (14,4 kD). Etter elektroforese ble proteinbånd visualisert ved sølvfarging ved anvendelse av Phast Silver Stain Kit. Resultatet er vist i fig. 4.
Et proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 60 KD, ble påvist i topp 6-proteinet under både reduserende og ikke-reduserende betingelser. Et proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 60 KD ble påvist under reduserende betingelser og et proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 120 KD ble påvist under ikke-reduserende betingelser i topp 7-proteinet. Proteinet i topp 7 ble derfor betraktet som en homodimer av proteinet i topp 6.
Eksempel 5
Termostabilitet av OCIF
20 ul prøve fra blå-5PW-fraksjoner 51 og 52 ble fortynnet til 30 ul med 10 mM fosfatbufret saltløsning, pH 7,2, og inkubert i 10 min ved 70 °C eller 90 °C, eller i 30 min ved 56 °C. De varmebehandlede prøver ble testet for OCIF-aktivitet . Resultatene er vist i tabell 2.
Eksempel 6
Intern aminosyresekvens av OCIF- protein
To og to fraksjoner {1 ml) fra nr. 51-70 av blå-5PW-fraksjonene ble surgjort med 10 ul 25 % TFA og applisert på en reversfase-C4-kolonne (BU-300, 2,1 x 220 mm, produsert av Perkin-Elmer Co.) ekvilibrert med 25 % acetonitril inneholdende 0,1 % TFA. Det adsorberte protein ble eluert med en 12 ml lineær gradient av 25 til 55 % acetonitril ved en strømnings-hastighet på 0,2 ml/min og proteinfraksjonene tilsvarende hhv. topp 6 og topp 7 ble oppsamlet. Proteinet i hver topp ble applisert på et proteinsekvenseringsapparat (PROCISE 494, Perkin-Elmer Co.). Den N-terminale sekvens av proteinet fra hver topp kunne imidlertid ikke analyseres. N-terminalen av proteinet fra hver topp ble derfor betraktet som blokkert. Interne aminosyresekvenser av disse proteiner ble derfor analysert.
Proteinet fra topp 6 eller topp 7 renses ved hjelp av C4-HPLC, ble konsentrert ved sentrifugering og pyridyletylert under reduserende betingelser. Kort beskrevet ble 50 ul 0,5 M Tris-HCl, pH 8,5, inneholdende 100 ug ditiotreitol, 10 mM EDTA, 7 M guanidin-HCl og 1 % CHAPS, tilsatt til hver prøve, og blandingen ble inkubert over natten i mørke ved romtemperatur. Hver av blandingene ble surgjort med 25 % TFA (en sluttkonsentrasjon på 0,1 %) og ble applisert på en reversfase-C4-kolonne (BU-300, 2,1 x 30 mm, Perkin-Elmer Co.) ekvilibrert med 20 % acetonitril inneholdende 0,1 % TFA. Det pyridyletylerte OCIF-protein ble eluert med en 9 ml lineær gradient fra 20 til 50 % acetonitril ved en strømnings-hastighet på 0,3 ml/min og hver proteintopp ble oppsamlet. Det pyridyletylerte OCIF-protein ble konsentrert under vakuum og oppløst i 25 ul 0,1 M Tris-HCl, pH 9, inneholdende 8 M Urea og 0,1 % Tween 80. 73 ul 0,1 M Tris-HCl, pH 9 og 0,02 ug lysylendopeptidase (Wako Pure Chemical, Japan) ble tilsatt til røret og inkubert ved 37 °C i 15 t. Hver behandlet prøve ble surgjort med 1 ul 25 % TFA og applisert på en reversfase-C8-kolonne (RP-300, 2,1 x 220 mm, Perkin-Elmer Co.) ekvilibrert med 0,1 % TFA. Peptidfragmentene ble eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 0 til 50 % acetonitril ved en strøm-ning sha st ighet på 0,2 ml/min i 70 min og hver peptidtopp ble oppsamlet. Hvert peptidfragment (P1-P3) ble applisert på proteinsekvenseringsapparatet. Sekvensene av peptidene er vist i sekvens-ID nr. 1-3.
Eksempel 7
Bestemmelse av nukleotidsekvens av OCIF- cDNA
i) Isolering av poly( A) + RNA fra IMR- 90- celler
Ca. 10 ug poly(A) + RNA ble isolert fra 1 x IO<8>
celler av IMR-90 ved anvendelse av Fast Track mRNA-isolerings-sett (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner.
ii) Fremstilling av blandede primere
De følgende to blandede primere ble syntetisert
basert på aminosyresekvensene av to peptider (peptid P2 og peptid P3, hhv. sekvens nr. 2 og 3). Alle oligonukleotidene i de blandede primere nr. 2F kan kode for aminosyresekvensen fra den 6. rest, glutamin (Gin), til den 12. rest, leucin (Leu), i peptid P2. Alle oligonukleotidene i de blandede primere nr. 3R kan kode for aminosyresekvensen fra den 6. rest, histidin (His), til den 12. rest, lysin (Lys), i peptid P3. Sekvensene av de blandede primere nr. 2F og nr. 3R, er vist i tabell 3.
iii) Amplifisering av OCIF- cDNA- fragment ved hjelp av PCR
( polymerasekj edereaksj on)
Første tråd-cDNA ble dannet ved anvendelse av Super-script II cDNA-syntesesett (Gibco BRL) og 1 ug poly(A) + RNA, erholdt i eksempel 7-i) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner. DNA-fragmentet som koder for OCIF, ble erholdt ved hjelp av PCR ved anvendelse av cDNA-templatet og primerne vist i eksempel 7-ii).
PCR ble utført under de følgende betingelser:
Komponentene i reaksjonsløsningen ble blandet i et mikrosentrifugerør. Et innledende denatureringstrinn ved 95 °C i 3 min ble etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 95 °C i 30 sek, annealering med 50 °C i 30 sek og utvidelse ved 70 °C i 2 min. Etter amplifiseringen ble det siste utvidelses-trinn utført ved 70 °C i 5 min. Størrelsen av PCR-produkter ble bestemt ved en 1,5 % agarosegelelektroforese. Ca. 400 bp OCIF-DNA-fragment ble erholdt.
Eksempel 8
Kloning av OCIF- cDNA- fragmentet amplifisert ved hjelp av PCR og bestemmelse av dets DNA- sekvens
OCIF-cDNA-fragmentet amplifisert ved hjelp av PCR i eksempel 7-iii) ble innføyd i plasmidet, pBluescript II SK" ved anvendelse av DNA-ligeringssett ver. 2 (Takara Shuzo) i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge Marchuk, D. et al.
(Nucleic Acids Res., vol 19, s. 1154, 1991). E. coli-DH5a (Gibco BRL) ble transformert med ligeringsblanding. Transformantene ble dyrket og et plasmid inneholdende OCIF-cDNA
(ca. 400 bp) ble renset ved anvendelse av den vanlig benyttede metode. Dette plasmid ble betegnet pBSOCIF. Sekvensen av OCIF-cDNA i pBSOCIF ble bestemt ved anvendelse av Taq-fargestoff-deoksy-terminatorsyklussekvenseringssett (Perkin Eimer). Stør-relsen av OCIF-cDNA er 3 97 bp. OCIF-cDNA koder for en aminosyresekvens som inneholder 132 rester. Aminosyresekvensene av de inerte peptider (peptid P2 og peptid P3, hhv. sekvens nr. 2 og 3) som ble anvendt for å utforme primerne, ble funnet ved den N- eller C-terminale side i aminosyresekvensen av polypeptidet med 132 aminosyrer, bestemt av det 397 bp OCIF-cDNA. Aminosyresekvensen av det interne peptid Pl (sekvens nr. 1) ble dessuten også funnet i den forutbestemte aminosyresekvens for polypeptidet. Disse data viser at det 397 bp OCIF-cDNA er en del av det uforkortede OCIF-cDNA.
Eksempel 9
Fremstilling av DNA- proben
Det 397 bp OCIF-cDNA ble fremstilt i overensstemmelse med betingelsene beskrevet i eksempel 7-iii). OCIF-cDNA ble underkastet en preparativ agarosegelelektroforese. OCIF-cDNA ble renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-gelekstraksjons-settet (QIAGEN) , merket med [a-32P] dCTP ved anvendelse av Megaprime DNA-merkingssystem (Amersham) og anvendt for å utvelge en fag som inneholder det uforkortede OCIF-cDNA.
Eksempel 10
Fremstilling av cDNA- biblioteket
cDNA ble dannet ved anvendelse av "Great Lengths" cDNA-syntesesett (Clontech), oligo(dT)primer, [a<32>P]dCTPog 2,5 U9 poly(A) + RNA erholdt i eksempel 7-i) i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner. EcoRI-Sall-Notl-adapter ble ligert til cDNA. cDNA ble separert fra den frie adapter og uinkorporert fritt [a<32>P]dCTP. Det rensede cDNA ble utfelt med etanol og oppløst i 10 ul TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). cDNA med adapter ble innføyd i AZAP EKSPRESS-vektor (Stratagene) ved EcoRI-sete. Det rekombinante AZAP EKSPRESS fag-DNA inneholdende cDNA, ble emballert in vi tro ved anvendelse av Gigapack gold II-emballasjeekstrakt
(Stratagene) og rekombinant AZAP EKSPRESS-fagbibliotek ble fremstilt.
Eksempel 11
Screening av rekombinant fag
Rekombinante fager erholdt i eksempel 10 ble infisert 1 E. Coli, XLl-Blue MRF<1> (Stratagene) ved 37 °C i 15 min. De infiserte E. Coli-celler ble tilsatt til NZY-medium inneholdende 0,7 % agar ved 50 °C og utspredt på NZY-agarplatene. Etter at platene var inkubert ved 37 °C over natten, ble Hybond N (Amersham) plassert på overflaten av plater som inneholdt plakker. Membranene ble denaturert i alkalisk opp-løsning, nøytralisert og vasket i 2 x SSC i overensstemmelse med standardprotokollen. Fag-DNA ble immobilisert på membranene ved anvendelse av UV-kryssbinding (Stratagene). membranene ble inkubert i hybridiseringsbuffer (Amersham) inneholdende 100 ug/ml 1 akse sperma-DNA ved 65 °C i 4 t og ble deretter inkubert ved 65 °C over natten i den samme buffer inneholdende 2 x IO<5> cpm/ml denaturert OCIF-DNA-probe. Membranene ble vasket to ganger med 2 x SSC og to ganger med en oppløsning inneholdende 0,1 x SSC og 0,1 % SDS ved 65 °C i 10 min hver gang. De positive kloner ble renset ved gjentakelse av screeningen to ganger. Den rensede AZAP EKSPRESS-fagklon inneholdende ca. 1,6 kb DNA-innføyelse, ble anvendt i eksperimentene beskrevet nedenfor. Denne fag ble betegnet AOCIF. Den rensede AOCIF ble infisert i E. Coli XLl-blå MRF'
(Stratagene) i overensstemmelse med en protokoll for AZAP EKSPRESS-kloningssett (Stratagene). Kulturløsningen av infisert XLl-blå MRF' ble preparert. Renset 10CIF og ExAssist-hjelperfag (Stratagene) ble koinfisert i E. Coli-stamme XL-l-blå MRF1 i overensstemmelse med protokollen som medfølger settet. Kulturløsningen av den koinfiserte XL-l-blå MRF<*> ble tilsatt til en kultur av E. Coli-stamme XLOR (Stratagene) for å transformere disse. Det ble således erholdt en kanamycin-resistent transformant som inneholdt et plasmid betegnet pBKOCIF, som er en pBKCMV(Stratagene)-vektor inneholdende innføyelsesfragmentet på 1,6 kb. Transformanten som inkluderer plasmidet inneholdende ca. 1,6 kb OCIF-cDNA ble erholdt ved å
utplukke de kanamycinresistente kolonier. Plasmidet ble betegnet pBKOCIF. Transformanten er deponert ved National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), byrå for industriell vitenskap og teknologi, som "FERM BP-5267" som pBK/01F10. En national deponering (aksesjonsnr. FERM P-14998) ble overført til det internasjonale depot den 25. oktober 1995, i overensstemmelse med Budapestavtalen. Transformanten pBK/01F10 ble dyrket og plasmidet pBKOCIF ble renset i overensstemmelse med standardprotokollen.
Eksempel 12
Bestemmelse av nukleotidsekvensen av OCIF- cDNA inneholdende det fullstendige kodingsområdet.
Nukleotidsekvensen av OCIF-cDNA erholdt i eksempel 11, ble bestemt ved anvendelse av Taq-farge-deoksy-terminator-syklussekvenseringssett (Perkin Eimer). De anvendte primere var T3-, T7-primere (Stratagene) og syntetiske primere utformet i overensstemmelse med OCIF-cDNA-sekvensen. Sekvensen av disse primere er vist i sekvens ID nr. 16 til 29. Nukleotidsekvensen av OCIF-cDNA er vist i sekvens ID nr. 6 og aminosyresekvensen bestemt av cDNA-sekvensen er vist i sekvens ID nr. 5.
Eksempel 13
Produksjon av rekombinant OCIF ved hjelp av 293/ EBNA- celler
i) Konstruksjon av plasmidet for ekspresjon av OCIF- cDNA
pBKOCIF inneholdende ca. 1,6 kb OCIF-cDNA ble fremstilt som beskrevet i eksempel 11 og spaltet med restriksjonsenzymer, BamHI og Xhol. OCIF-cDNA-innføyelsen ble utkuttet, separert ved agarosegelelektroforese og renset ved anvendelse av QIAEX-gelekstråksjonssett (QIAGEN). Den rensede OCIF-cDNA-innføyelse ble ligert ved anvendelse av DNA-ligeringssett ver.
2 (Takara Shuzo) til ekspresjonsvektor pCEP4 (Invitrogen) spaltet med restriksjonsenzymer, BamHI og Xhol. B. Coli DH5 a (Gibco BRL) ble transformert med ligeringsblåndingen. Transformantene ble dyrket og plasmidet inneholdende OCIF-cDNA (ca. 1,6 kb) ble renset ved anvendelse av QIAGEN-kolonne (QIAGEN). Ekspresjonsplasmidet pCEPOCIF ble utfelt med etanol og oppløst i sterilt destillert vann og anvendt i eksperimentene beskrevet nedenfor.
ii) Kortvarig ekspresjon av OCIF- cDNA og analyse av den biologiske aktivitet
Rekombinant OCIF ble produsert ved anvendelse av ekspresjonsplasmidet, pCEPOCIF fremstilt i eksempel 13-i) i overensstemmelse med metoden beskrevet nedenfor. 8 x IO<5 >celler av 293/EBNA (Invitrogen) ble inokulert i hver brønn på en 6-brønners plate ved anvendelse av IMDM inneholdende 10 % kalvefosterserum (Gibco BRL). Etter at cellene var inkubert i 24 t, ble dyrkningsmediet fjernet og cellene ble vasket med serumfritt IMDM. Ekspresjonsplasmidet, pCEPOCIF og lipofektamin (Gibco BRL) ble fortynnet med OPTI-MEM (Gibco BRL), blandet og tilsatt til cellene i hver brønn i overensstemmelse med fabrikantens instruksjoner. 3 ug pCEPOCIF og 12 ul lipofektamin ble anvendt for hver transfeksjon. Etter at cellene var inkubert med pCEPOCIF og lipofektamin i 38 t, ble mediet erstattet med 1 ml OPTI-MEM. Etter at de transfekterte celler var inkubert i 30 t, ble de kondisjonerte medium høstet og anvendt for biologisk analyse. Den biologiske aktivitet av OCIF ble analysert i overensstemmelse med metoden beskrevet nedenfor. Benmargsceller erholdt fra mus, 17 dager gamle, ble suspendert i a-MEM (produsert av GIBCO BRL Co.) inneholdende 10 % FBS, 2 x IO"<8> M aktivert vitamin D3 og hver testprøve, og ble inokulert og dyrket i 7 dager ved 37 °C i fuktet 5 % C02, som beskrevet i eksempel 2. Under inkubasjon ble 160 ul gammelt medium i hver brønn erstattet med det samme volum av friskt medium inneholdende testprøve fortynnet med 1 x IO"<8> M aktivert vitamin D3 og a-MEM inneholdende FBS på dag 3 og dag 5. På dag 7, etter vask av brønnene med fosfatbufret saltløsning, ble cellene fiksert med etanol/aceton (1:1) i 1 min, og deretter ble osteoklastutvikling testet ved anvendelse av et målesett for sur fosfataseaktivitet (sur fosfatase, leukocytt, katalog nr. 387-A, Sigma Co.). Reduksjonen av antallet TRAP-positive celler ble tatt som en OCIF-aktivitet. Som et resultat viste det kondisjonerte medium den samme OCIF-aktivitet som naturlig OCIF-protein fra IMR-90-kondisjonert
medium (Tabell 4) .
iii) Isolering av rekombinant OCIF- protein fra 293/ EBNA-kondisjonert medium
293/EBNA-kondisjonert medium (1,8 1) erholdt ved dyrkning av cellene beskrevet i eksempel 13-ii) ble supplert med 0,1 % CHAPS og filtrert med 0,22 um membranfilter (Steri-becs GS, Milipore Co.). Det kondisjonerte medium ble applisert på 50 ml av en heparinsepharose-CL-6B-kolonne (2,6 x 10 cm, Pharmacia Co.) ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. Etter vask av kolonnen med 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, ble det adsorberte protein eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 0 til 2 M NaCl ved en strømningshastighet på 4 ml/min i 100 min og fraksjoner (8 ml) ble oppsamlet. Ved anvendelse av 150 ul av hver fraksjon ble OCIF-aktivitet analysert i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 2. OCIF-aktiv
fraksjon (112 ml), eluert med ca. 0,6 til 1,2 M NaCl, ble erholdt .
112 ml av den aktive fraksjon ble fortynnet til
1 000 ml med 10 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, og applisert på en heparinaffinitetskolonne (heparin-5PW, 0,8 x 7,5 cm, Tosoh Co.) ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5. Etter vask av kolonnen med 10 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, ble det adsorberte protein eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 0 til 2 M NaCl og ved en.strømnings-hastighet på 0,5 ml/min i 60 min og fraksjoner (0,5 ml) ble oppsamlet. 4 ul av hver fraksjon ble analysert ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese under reduserende og ikke-reduserende betingelser, som beskrevet i eksempel 4. Ved SDS-PAGE under reduserende betingelser ble det påvist et enkelt bånd av rOCIF-protein med en tilsynelatende molekylvekt på 60 KD i fraksjoner fra 30 til 32, under ikke-reduserende betingelser, bånd av rOCIF-protein med tilsynelatende molekylvekt på 60 KD og 120 KD ble også påvist i fraksjoner fra 30 til 32. Den isolerte rOCIF-fraksjon fra 30 til 32 ble betegnet som rekombinant OCIF avledet fra 293/EBNA (rOCIF(E)). 1,5 ml av rOCIF(E) (535 ug/ml) ble erholdt ved bestemmelse etter fremgangsmåten ifølge Lowry ved anvendelse av bovint serumalbumin som et standardprotein.
Eksempel 14
Produksjon av rekombinant OCIF ved anvendelse av CHO- celler
i) Konstruksjon av plasmidet for ekspresjon av OCIF
pBKOCIF inneholdende ca. 1,6 kb OCIF-cDNA ble fremstilt som beskrevet i eksempel 11 og spaltet med restriksjonsenzymer, Sali og EcoRV. Ca. 1,4 kb OCIF-cDNA-innføyelse ble separert ved hjelp av agarosegelelektroforese og renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-gelekstraksjonssett (QIAGEN). Ekspresjonsvektoren, pcDL-SR a296 (Molecular and Cellular Bio-logy, vol. 8, s. 466, 1988), ble spaltet med restriksjonsenzymer Pstl og Kpnl. Ca. 3,4 kb av ekspresjonsvektorfragmentet ble utkuttet, separert ved agarosegelelektroforese og renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-gelekstraksjonssett (QIAGEN). Endene av den rensede OCIF-cDNA-innføyelse og eks-
presjonsfragmentet ble avstumpet ved anvendelse av DNA-av - stumpingssett {Takara Shuzo). Den rensede OCIF-cDNA-innføyelse og ekspresjonsvektorfragmentet ble ligert ved anvendelse av DNA-ligeringssett ver. 2 {Takara Shuzo). E. Coli.-DH5aa (Gibco BRL) ble transformert med ligeringsblandingen. Transformanten inneholdende OCIF-ekspresjonsplasmidet, pSRaOCIF, ble erholdt.
ii) Fremstilling av ekspresjonsplasmid
Transformanten inneholdende OCIF-ekspresjonsplasmidet, pSR aOCIF, fremstilt i eksempel 13-i) og transformanten inneholdende muse-DHFR-ekspresjonsplasmid, pBAdDSV, vist i WO92/01053, ble dyrket i overensstemmelse med standardmetoden. Begge plasmider ble renset ved alkalibehandling, polyetylen-glykolutfelling og cesiumkloridtetthetsgradient-ultrasentri-fugering, i overensstemmelse med metoden ifølge Maniatis et al. (Molecular cloning, 2. utgave).
iii) Tilpasning av CHOdhFr"- celler til det proteinfrie medium
CHOdhFr"-celler (ATCC, CRL 9096) ble dyrket i IMDM inneholdende 10 % kalvefosterserum. Cellene ble tilpasset til EX-CELL 301 (JRH Bioscience) og deretter tilpasset til EX-CELL PF CHO (JRH Bioscience) i overensstemmelse med fabrikantens instruksj oner.
iv) Transfeksjon av OCIF- ekspresjonsplasmidet og muse-DHFR- ekspresjonsplasmidet til CHOdhFr"- celler
CHOdhFr"-celler fremstilt i eksempel 14-iii), ble transfektert ved elektroporering med pSRaOCIF og pBAdDSV fremstilt i eksempel 14-ii). 200 ug pSRaOCIF og 20 ug pBAdDSV ble oppløst under sterile betingelser i 0,8 ml IMDM (Gibco BRL) inneholdende 10 % kalvefosterserum CG. 2 x 10<7> celler av CHOdhFr" ble suspendert i 0,8 ml av dette medium. Cellesuspen-sjon ble overført til en kyvette (Bio Rad) og cellene ble transfektert ved elektroforeringen ved anvendelse av genpulser (Bio Rad) ved 360 V og 960 uF. Suspensjonen av elektroporerte celler ble overført til T-flasker (Sumitomo Bakelite) inneholdende 10 ml EX-CELL PF-CHO, og inkubert i C02-inkubatoren i 2 dager. De transfekterte celler ble inokulert i hver brønn på en 96 brønners plate (Sumitomo Bakelite) ved en tetthet på 5 000 celler/brønn og dyrket i ca. 2 uker. Transformantene som uttrykker DHFR ble utvalgt fordi EX-CELL PF-CHO ikke inneholder nukleotider og stamcellelinjen CHO dhFr" ikke kan vokse i dette medium. Det meste av transformanten som uttrykker DHFR, uttrykker OCIF fordi OCIF-ekspresjonsplasmidet ble anvendt 10 ganger så mye som muse-DHFR-ekspresjonsplasmidet. Transformantene med et kondisjonert medium som hadde høyere OCIF-aktivitet ble utvalgt blant transformantene som uttrykker DHFR, i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 2. Transformantene som uttrykker store mengder OCIF, ble klonet ved begrensende fortynning. Klonene, hvis kondisjonerte medium hadde høy OCIF-aktivitet, ble utvalgt som beskrevet ovenfor, og transformanten som uttrykker store mengder OCIF, 5561, ble erholdt.
v) Produksjon av rekombinant OCIF
For å produsere rekombinant OCIF (rOCIF), ble EX-CELL 301-medium (3 1) i en 3 1 "spiner"-kolbe, inokulert med klonen
(5561) ved en celletetthet på 1 x IO<5> celler/ml. 5561-cellene ble dyrket i en "spiner"-kolbe ved 37 °C i 4 til 5 dager. Når konsentrasjonen av 5561-cellene nådde 1 x IO<6> celler/ml, ble ca. 2,7 1 av det kondisjonerte medium innhøstet. Deretter ble ca. 2,7 1 EX-CELL 301 tilsatt til "spiner"-kolben og 5561-cellene ble dyrket på nytt. ca. 20 1 av det kondisjonerte medium ble innhøstet ved anvendelse av 3 "spiner"-kolber.
vi) Isolering av rekombinant OCIF- protein fra CHO- cellekondisjonert medium
CHO-cellekondisjonert medium (1,0 1) beskrevet i eksempel 14-v), ble supplert med 1,0 g CHAPS og filtrert med 0,22 um membranfilter (Steribecks GS, Milipore Co.). Det kondisjonerte medium ble applisert på en heparinsepharose-FF-kolonne (2,6 x 10 cm, Pharmacia Co.) ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. Etter vask av kolonnen med 10 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, ble det adsorberte protein eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 0 til 2 M NaCl ved en strømningshastighet på 4 ml/min i 100 min og fraksjoner (8 ml) ble oppsamlet. Ved anvendelse av 150 ul av hver fraksjon ble OCIF-aktivitet analysert i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 2. Det ble erholdt en aktiv fraksjon (112 ml) eluert med ca. 0,6 til 1,2 M NaCl.
112 ml av den aktive fraksjon ble fortynnet til
1 2 00 ml med 10 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, og applisert på en affinitetskolonne (blå-SPW, 0,5 x 5,0 cm, Tosoh Co.) ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5. Etter vask av kolonnen med 10 mM Tris-HCl, 0,1 % CHAPS, pH 7,5, ble det adsorberte protein eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 0 til 3 M NaCl og ved en strømningshastighet på
0,5 ml/min i 60 min og fraksjoner (0,5 ml) ble oppsamlet. 4 ul av hver fraksjon ble underkastet SDS-polyakrylamidgelelektroforese under reduserende og ikke-reduserende betingelser, som beskrevet i eksempel 4. På SDS-PAGE under reduserende betingelser, ble det påvist et enkelt bånd av rOCIF-protein med en tilsynelatende molekylvekt på 60 KD i fraksjoner 30 til 38, under ikke-reduserende betingelser, bånd av rOCIF-protein med tilsynelatende molekylvekt på 60 KD og 120 KD ble også påvist i fraksjoner 30 til 38. Den isolerte rOCIF-fraksjon, 30 til 38, ble betegnet som renset, rekombinant OCIF avledet fra CHO-celler (rOCIF(C)). 4,5 ml av rOCIF(C) (113 ug/ml) ble erholdt etter bestemmelse ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Lowry ved anvendelse av bovint serumalbumin som et standardprotein.
Eksempel 15
Bestemmelse av N- terminal aminosyresekvens av rOCIF
3 ug av hver av det isolerte rOCIF(E) og rOCIF(C) ble adsorbert til polyvinylidendifluorid(PVDF)membraner med Prospin (PERKIN ELMER Co.). Membranene ble vasket med 20 % etanol og de N-terminale aminosyresekvenser av de adsorberte proteiner ble analysert ved hjelp av et proteinsekvenseringsapparat (PROCISE 492, PERKIN ELMER Co.). Den bestemte N-terminale aminosyresekvens er vist i sekvens-ID nr. 7.
Den N-terminale aminosyre i rOCIF(E) og rOCIF(C) var den 22. aminosyre glutamin fra Met som translasjonsstartpunkt, som vist i sekvens-ID nr. 5. De 21 aminosyrer fra Met til Gin ble identifisert som et signalpeptid. Den N-terminale aminosyresekvens av OCIF isolert fra IMR-90-kondisjonert medium var upåviselig. Den N-terminale glutamin i OCIF kan følgelig bli blokkert ved omdannelse fra glutamin til pyroglutamin under. dyrkning eller rensing.
Eksempel 16
Biologisk aktivitet av rekombinant ( r) OCIF og naturlig ( n)
OCIF
i) Inhibering av vitamin D3- indusert osteoklastdannelse fra musebenmargceller
Hver av rOCIF (E) og nOCIF-prøven ble fortynnet med a-MEM (GIBCO BRL Co.) inneholdende 10 % FBS og 2 x IO"<8> M aktivert vitamin D3 (en sluttkonsentrasjon på 250 ng/ml). Hver prøve ble seriefortynnet med det samme medium og 100 ul av hver fortynnet prøve ble tilsatt til hver brønn på 96-brønners plater. Benmargsceller erholdt fra mus, 17 dager gamle, ble inokulert ved en celletetthet på 3 x IO<5> celler/100 ul/brønn i hver brønn på 96-brønners plater og dyrket i 7 dager ved 37 °C
i fuktet 5 % C02. På dag 7 ble cellene fiksert og farget med et surt fosfatasemålingssett (sur fosfatase, leukocytt, nr. 387-A, Sigma) i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 2. Reduksjonen av sur fosfataseaktivitet (TRAP) ble tatt som OCIF-aktivitet. Reduksjonen av sur fosfatase-positive celler ble evaluert ved oppløsning av fargepigmentet og måling av absorbans. I detalj ble 100 ul av en blanding av 0,1 N NaOH og dimetylsulfoksid (1:1) tilsatt til hver brønn og brønnen ble vibrert for å oppløse fargestoffet. Etter fullstendig opp-løsning av fargestoffet ble absorbansen i hver brønn målt ved 590 nm ved subtraksjon av absorbansen ved 490 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser (Immunoreader NJ-2000, InterMed). Mikroplateavleseren ble justert til 0 absorbans ved anvendelse av en brønn med et enkelt lag av benmargsceller som var dyrket i mediet uten aktivert vitamin D3. Reduksjonen av TRAP-aktivitet ble uttrykt som en prosentdel av kontrollabsorbans-verdien (= 100 %) av det oppløste fargestoff fra brønner med benmargsceller som var dyrket i fravær av OCIF. Resultatene er vist i tabell 5.
Både nOCIF og rOCIF(E) inhiberte osteoklastdannelse på en doseavhengig måte ved en konsentrasjon på 16 ng/ml eller høyere.
ii) Inhibering av vitamin D3- indusert osteoklastdannelse i samkulturer av stromaceller og musemiltceller
Virkning av OCIF på osteoklastdannelse indusert av vitamin D3 i samkulturer av stromaceller og musemiltceller, ble testet i overensstemmelse med metoden ifølge N. Udagawa et al. (Endocrinology, vol. 125, s. 1805-1813, 1989). I detalj ble hver av rOCIF(E)-, rOCIF(C)- og nOCIF-prøven seriefortynnet med a-MEM (GIBCO BRL Co.) inneholdende 10 % FBS, 2 x IO"<8> M aktivert vitamin D3 og 2 x 10"<7> M deksametason og 100 ul av hver av de fortynnede prøver ble tilsatt til hver brønn på 96-brønners mikrobrønnplater. Musebenmargavledede stroma-ST2-celler (RIKEN Cell Bank RCB0224) ,- 5 x 10<3> celler pr. 100 ul a-MEM inneholdende 10 % FBS, og miltceller fra ddy-mus, 8 uker gamle; 1 x IO<5> celler pr. 100 pl i det samme medium, ble inokulert i hver brønn på 96-brønners plater og dyrket i 5 dager ved 37 °C i fuktet 5 % C02. På dag 5 ble cellene fiksert og farget med et sett for sur fosfatase (sur fosfatase, leukocytt, nr. 387-A, Sigma). Reduksjonen av sur fosfatase-positive celler ble tatt som OCIF-aktivitet. Reduksjonen av sur fosfatase-positive celler ble evaluert i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 16-i). Resultatene er vist i tabell 6; rOCIF(E) og rOCIF(C) og tabell 7; rOCIF(E) og nOCIF.
nOCIF-, rOCIF(E)- og rOCIF(C)-inhibert osteoklastdannelse på en doseavhengig måte i konsentrasjonsområdet 6-16 ng/ml eller høyere.
iii) Inhibering av PTH- indusert osteoklastdannelse fra musebenmargceller
Effekt av OCIF på osteoklastdannelse indusert av PTH ble testet i overensstemmelse med metoden ifølge N. Takahashi et al. (Endocrinology, vol. 122, s. 1373-1382, 1988). I detalj ble både rOCIF(E)- og nOCIF-prøven (125 ng/ml) seriefortynnet med a-MEM (produsert av GIBCO BRL Co.) inneholdende 10 % FBS og 2 x IO"<8> M PTH og 100 ul av hver av de fortynnede prøver ble tilsatt til 96 brønners plater. Benmargsceller fra ddy-mus, 17 dager gamle, i en celletetthet på 3 x 10<5> celler pr. 100 ul av a-MEM inneholdende 10 % FBS, ble inokulert i hver brønn på 96-brønners plater og dyrket i 5 dager ved 37 °C i fuktet 5 % C02-På dag 5 ble cellene fiksert med etanol/aceton (1:1) i 1 min ved romtemperatur og farget med et sett for sur fosfatase (sur fosfatase, leukocytt, nr. 387-A, Sigma) i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 2. Reduksjonen av sur fosfatase-positive celler ble tatt som OCIF-aktivitet. Reduksjonen av sur fosfatase-positive celler ble evaluert i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 16-i). Resultatene er vist i tabell 8.
nOCIF og rOCIF(E) inhiberte osteoklastdannelse på en doseavhengig måte ved en konsentrasjon på 16 ng/ml eller høyere.
iv) Inhibering av IL- 11- indusert osteoklastdannelse
Effekt av OCIF på osteoklastdannelse indusert av IL-11 ble testet i overensstemmelse med metoden ifølge T. Tamura et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 90, s. 11924-11928, 1993). I detalj ble hver rOCIF(E)- og nOCIF-prøve seriefortynnet med a-MEM (GIBCO BRL Co.) inneholdende 10 % FBS og 20 ng/ml IL-11 og 100 ul av hver fortynnet prøve ble tilsatt til hver brønn på 96-brønners plater. Nyfødte muse-kalvaria-avledede pre-adipocytt-MC3T3-G2/PA6-celler (RIKEN Cell Bank RCB1127) 5 x IO<3> celler pr. 100 ul a-MEM inneholdende 10 % FBS og miltceller fra ddy-mus, 8 uker gamle; 1 x 10s celler pr. 100 ul i det samme medium, ble inokulert i hver brønn på 96-brønners plater og dyrket i 5 dager ved 37 °C i fuktet 5 % C02. På dag 5 ble cellene fiksert og farget med et sett for sur fosfatase (sur fosfatase, leukocytt, nr. 387-A, Sigma). Sur fosfatase-positive celler ble tellet under mikroskop og en reduksjon av celleantallet ble tatt som OCIF-aktivitet. Resultatene er vist i tabell 9.
Både nOCIF og rOCIF(E) inhiberte osteoklastdannelse på en doseavhengig måte ved en konsentrasjon på 2 ng/ml eller høyere.
Resultatene vist i tabell 4-8 indikerer at OCIF inhiberer alle vitamin D3, PTH og IL-11-induserte osteoklastdann-elser i nesten de samme doser. OCIF vil følgelig kunne anvendes for behandling av forskjellige typer bensykdommer med redusert benmasse som forårsakes av forskjellige stoffer som indu-serer benresorpsjon.
Eksempel 17
Isolering av monomertype- OCIF og dimertype- OCIF
Hver rOCIF(E)- og rOCIF(C)-prøve inneholdende 100 ug OCIF-protein, ble supplert med 1/100 volum 25 % trifluoreddiksyre og applisert på en reversfasekolonne (PROTEIN-RP, 2,0 x 250 mm, YMC Co.) ekvilibrert med 30 % acetonitril inneholdende 0,1 % trifluoreddiksyre. OCIF-protein ble eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 30 til 55 % acetonitril ved en strømningshastighet på 0,2 ml/min i 50 min og hver OCIF-topp ble oppsamlet. Både den monomertype-OCIF-toppfraksjon og dimertype-OCIF-toppfraksjon ble lyofilisert.
Eksempel 18
Bestemmelse av molekylvekt av rekombinant OCIF
1 ug av den isolerte monomertype- og dimertype-nOCIF, renset ved anvendelse av en reversfasekolonne i overensstemmelse med eksempel 3-iv), og 1 ug monomertype- og dimertype-rOCIF beskrevet i eksempel 17, ble konsentrert under vakuum. Hver prøve ble inkubert i bufferen for SDS-PAGE, underkastet SDS-polyakrylamidgelelektroforese, og proteinbånd på gelen ble farget med sølv i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 4. Resultater fra elektroforese under ikke-reduserende betingelser og reduserende betingelser er vist i fig. 6 og fig. 7.
Et proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 60 KD ble påvist i hver monomertype-OCIF-prøve og et proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 120 KD ble påvist i hver dimertype-OCIF-prøve under ikke-reduserende betingelser. Et proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 60 KD ble påvist i hver monomertype-OCIF-prøve under reduserende betingelser. Molekylvekter av monomertype-nOCIF fra IMR-90-celler, rOCIF fra 293/EBNA-celler og rOCIF fra CHO-celler, var således nesten de samme. Molekylvekter av dimertype-nOCIF fra IMR-90-celler, rOCIF fra 2 93/EBNA-celler og rOCIF fra CHO-celler, var også de samme.
Eksempel 19
Fjerning av N- bundet oligosakkaridkjede og måling av molekylvekt av naturlig og rekombinant OCIF
Hver prøve inneholdende 5 ug av det isolerte monomertype- og dimertype-nOCIF renset ved anvendelse av en reversfasekolonne i overensstemmelse med eksempel 3-iv), og hver prøve inneholdende 5 ug monomertype- og dimertype-rOCIF beskrevet i eksempel 17, ble konsentrert under vakuum. Hver prøve ble oppløst i 9,5 ul 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 8,6, inneholdende 100 mM 2-merkaptoetanol, supplert med 0,5 ul 250 U/ml N-glykanase (Seikagaku kogyo Co.) og inkubert i én dag ved 37 °C. Hver prøve ble supplert med 10 ul 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, inneholdende 2 mM EDTA, 5 % SDS og 0,02 % bromfenolblått og oppvarmet i 5 min ved 100 °C. 1 ul av hver prøve ble underkastet SDS-polyakrylamidgelelektroforese og proteinbånd på gelen ble farget med sølv som beskrevet i eksempel 4. Elektroforesemønsterne er vist i fig. 8.
En tilsynelatende molekylvekt av hver av de deglyko-sylerte nOCIF fra IMR-90-celler, rOCIF fra CHO-celler og rOCIF fra 293/EBNA-celler, var 40 KD under reduserende betingelser. En tilsynelatende molekylvekt av hver ubehandlet nOCIF fra IMR-90-celler, rOCIF fra 293/EBNA-celler og rOCIF fra CHO-celler, var 60 KD under reduserende betingelser. Resultatene indikerer følgelig at OCIF-proteinene er glykoproteiner med N-bundne sukkerkjeder.
Eksempel 20
Kloning av OCIF- variant- cDNA og bestemmelse av deres DNA-sekvenser
Plasmidet pBKOCIF som er innføyd OCIF-cDNA i pBKCMV (Stratagene), ble erholdt fra noen rensede, positive fager som i eksempel 10 og 11. Under screeningen av cDNA-biblioteket med 397 bp OCIF-cDNA-proben, ble det dessuten erholdt transformanter inneholdende plasmider, hvis innføyelsesstørrelser var forskjellige fra størrelsen av pBKOCIF. Disse transformanter inneholdende plasmidene ble dyrket og plasmidene ble renset i overensstemmelse med standardmetoden. Sekvensen av det inn-føyde DNA i hvert plasmid ble bestemt ved anvendelse av "Taq Dye Deoxy Terminater Cycle Sequencing kit" (Perkin Eimer). De anvendte primere var T3-, T7-primere (Stratagene) og syntetiske primere fremstilt basert på nukleotidsekvensen av OCIF-cDNA. Det foreligger fire OCIF-varianter (OCIF2, 3, 4 og 5) i tillegg til OCIF. Nukleotidsekvensen av OCIF2 er vist i sekvens-ID nr. 8 og aminosyresekvensen av OCIF 2, bestemt ved nukleotidsekvensen, er vist i sekvens-ID nr. 9. Nukleotidsekvensen av 0CIF3 er vist i sekvens-ID nr. 10 og aminosyresekvensen av 0CIF3 bestemt ved nukleotidsekvensen, er bestemt i sekvens-ID nr. 11. Nukleotidsekvensen av OCIF4 er vist i sekvens-ID nr. 12 og aminosyresekvensen av OCIF4 bestemt ved nukleotidsekvensen, er vist i sekvens-ID nr. 13. Nukleotidsekvensen av 0CIF5 er vist i sekvens-ID nr. 14 og aminosyresekvensen av OCIF 5 bestemt ved nukleotidsekvensen, er vist i sekvens-ID nr. 15. Strukturene av OCIF-varianter er vist i fig. 9 til 12 og er kort beskrevet nedenfor.
0CIF2
0CIF2-CDNA har en delesjon på 21 bp fra guanin ved nukleotid nr. 265 til guanin ved nukleotid nr. 285 i OCIF-cDNA (sekvensnr. 6). OCIF2 har således en delesjon på 7 aminosyrer fra glutaminsyre (Glu) ved aminosyre nr. 68 til glutamin (Gin) ved aminosyre nr. 74 i OCIF (sekvensnr. 5).
0CIF3
0CIF3-cDNA har en punktmutasjon ved nukleotid nr. 9 i OCIF-cDNA (sekvens nr. 6) hvor cytidin er erstattet med guanin. 0CIF3 har således en mutasjon, og asparagin (Asn) ved aminosyre nr. -19 i OCIF (sekvens nr. 5) er erstattet med lysin (Lys). Mutasjonen synes å være lokalisert i signalsekvensen og har ingen vesentlig effekt på det utskilte 0CIF3. 0CIF3-CDNA har en delesjon av 117 bp fra guanin ved nukleotid nr. 872 til cytidin ved nukleotid nr. 988 i OCIF-cDNA (sekvens nr. 6).
0CIF3 har således en delesjon på 39 aminosyrer fra treonin (Thr) ved aminosyre nr. 270 til leucin (Leu) ved aminosyre nr. 308 i OCIF (sekvens nr. 5).
OCIF4
OCIF4-cDNA har topunktsmutasjoner i OCIF-cDNA (sekvens nr. 6). Cytidin ved nukleotid nr. 9, er erstattet med guanin og guanin ved nukleotidnr. 22 er erstattet med tymidin i OCIF-cDNA (sekvens nr. 6).
OCIF4 har således to mutasjoner. Asparagin (Asn) ved aminosyre nr. -19 i OCIF (sekvens nr. 5), er erstattet med lysin (Lys), og alanin (Ala) ved aminosyre nr. -14, er erstattet med serin (Ser). Disse mutasjoner synes å være lokalisert i signalsekvensen og har ingen vesentlig effekt på det utskilte OCIF4.
0CIF4-cDNA har ca. 4 kb DNA som er intron 2 ac OCIF-genet innføyd mellom nukleotid nr. 400 og nukleotid nr. 401 i
OCIF-cDNA (sekvens nr. 6). Den åpne avlesningsramme stopper i intron 2. 0CIF4 har følgelig en ytterligere ny aminosyresekvens inneholdende 21 aminosyrer etter alanin (Ala) ved aminosyre nr. 112 i OCIF (sekvens nr. 5).
0CIF5
0CIF5-cDNA har en punktmutasjon ved nukleotid nr. 9 i OCIF-cDNA (sekvens nr. 6) hvor cytidin er erstattet med guanin. 0CIF5 har således en mutasjon, og asparagin (Asn) ved aminosyre nr. -19 i OCIF (sekvens nr. 5) , er erstattet med lysin (Lys). Mutasjonen synes å være lokalisert i signalsekvensen og har ingen vesentlig effekt på det utskilte 0CIF5.
0CIF5-CDNA har den senere del (ca. 1,8 kb) av intron 2 mellom nukleotidnr. 400 og nukleotidnr. 401 i OCIF-cDNA (sekvensnr. 6). Den åpne avlesningsramme stopper i den senere del av intron 2. OCIF5 har således en ytterligere ny aminosyresekvens inneholdende 12 aminosyrer etter alanin (Ala) ved aminosyre nr. 112 i OCIF (sekvens nr. 5).
Eksempel 21
Produksjon av OCIF- varianter
i) Konstruksjon av plasmidet for ekspresjon av OCIF-varianter
Plasmidet inneholdende 0CIF2- eller 0CIF3-cDNA ble erholdt som beskrevet i eksempel 20 og betegnet som hhv. PBKOCIF2 og pBKOCIF3. pBK0CIF2 og pBKOCIF3 ble spaltet med restriksjonsenzymer BamHI og Xhol. OCIF2- og 0CIF3-cDNA-inn-føyelsene ble separert ved agarosegelelektroforese og renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-gelekstraksjonssett (QIAGEN). De rensede OCIF2- og 0CIF3-cDNA-innføyelser ble individuelt ligert ved anvendelse av DNA-ligeringssett ver. 2 (Takara Shuzo) til ekspresjonsvektor pCEP4 (Invitrogen) som var spaltet med restriksjonsenzymer, BamHI og Xhol. E. Coli-DH5a (Gibco BRL) ble transformert med ligeringsblandingen.
Plasmidet inneholdende 0CIF4-CDNA ble erholdt som beskrevet i eksempel 20 og betegnet pBKOCIF4. pBK0CIF4 ble spaltet med restriksjonsenzymer Spel og Xhol (Takara Shuzo). 0CIF4-cDNA-innføyelsen ble separert ved agarosegelelektroforese og renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-gelekstraksjonssett (QIAGEN). Den rensede 0CIF4-CDNA-innføyelse ble ligert ved anvendelse av DNA-ligeringssett ver. 2 (Takara Shuzo) til ekspresjonsvektor pCEP4 (Invitrogen) som var spaltet med restriksjonsenzymer, Nhel og Xhol (Takara Shuzo). E. Coli-DH5a (Gibco BRL) ble transformert med ligeringsblåndingen.
Plasmidet inneholdende 0CIF5-CDNA ble erholdt som beskrevet i eksempel 20 og betegnet pBKOCIFS. pBKOCIFS ble spaltet med restriksjonsenzym Hindlll (Takara Shuzo). 5'-enden av kodingsområdet i 0CIF5-cDNA-innføyelsen ble separert ved agarosegelelektroforese og renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-gelekstraksjonssett (QIAGEN). OCIF-ekspresjonsplasmid, pCEPOCIF, erholdt i eksempel 13-i) ble spaltet med restriksjonsenzym Hindlll (Takara Shuzo). 5'-enden av kodingsområdet i OCIF-cDNA ble fjernet. Resten av plasmidet som inneholder pCEP-vektor og 3<1->delen av kodingsområdet av OCIF-cDNA, ble betegnet pCEPOCIF-3'. pCEPOCIF-3<1> ble separert ved hjelp av agarosegelelektroforese og renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-gelekstraksjonssett (QIAGEN). 0CIF5-cDNA-HindIII-fragmentet og pCEPOCIF-3' ble ligert ved anvendelse av DNA-ligeringssett ver. 2 (Takara Shuzo)-. E. Coli-DH5a (Gibco BRL) ble transformert med ligeringsblandingen.
De erholdte transformanter ble dyrket ved 37 °C over natten og OCIF-variantekspresjonsplasmider (pCEP0CIF2, pCEP0CIF3, pCEPOCIF4 og pCEPOCIF5) ble renset ved anvendelse av QIAGEN-kolonne (QIAGEN). Disse OCIF-variantekspresjonsplasmider ble utfelt med etanol, oppløst i sterilt destillert vann og anvendt i eksperimentene beskrevet nedenfor.
ii) Kortvarig ekspresjon av OCIF- variant- cDNA og analyse av den biologiske aktivitet av rekombinante OCIF-varianter
Rekombinante OCIF-varianter ble produsert ved anvendelse av ekspresjonsplasmid, pCEP0CIF2, pCEP0CIF3, pCEP0CIF4 og pCEPOCIFS, fremstilt som beskrevet i eksempel 21-i) i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 13-ii). De biologiske aktiviteter av rekombinante OCIF-varianter ble analysert.
Resultatene var at disse OCIF-varianter (OCIF2, OCIF3, OCIF4
og 0CIF5) hadde en svak aktivitet.
Eksempel 22
Fremstilling av OCIF- mutanter
i) Konstruksjon av en plasmidvektor for subkloning av cDNA som koder for OCIF- mutanter
Plasmidvektoren (5 ug) beskrevet i eksempel 11, ble spaltet med restriksjonsenzymer BamHI og Xhol (Takara Shuzo). Det spaltede DNA ble underkastet preparativ agarosegelelektroforese. DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 1,6 kilobasepar (kb) som inneholdt hele kodingssekvensen for OCIF, ble renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-gelekstraksjonssett (QIAGEN). Det rensede DNA ble oppløst i 20 ul sterilt destillert vann. Denne oppløsning ble betegnet DNA-oppløsning 1. pBluescript II SK + (3 ug) (Stratagene) ble spaltet med restriksjonsenzymer BamHI og Xhol (Takara Shuzo). Det spaltede DNA ble underkastet preparativ agarosegelelektroforese. DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 3,0 kb, ble renset fra gelen ved anvendelse av QIAEX-DNA-ekstraksjonssett (QIAGEN).
Det rensede DNA ble oppløst i 20 ul sterilt destillert vann. Oppløsningen ble betegnet DNA-oppløsning 2. Én ul DNA-oppløs-ning 2, 4 ul DNA-oppløsning 1 og 5 ul ligeringsbuffer I fra DNA-ligeringssett ver. 2 (Takara Shuzo) ble blandet og inkubert ved 16 °C i 30 min. (Ligeringsblandingen ble anvendt for transformasjon av E. coli på en måte som er beskrevet nedenfor) . Betingelser for transformasjon av E. coli var som følger. 100 ul kompetente E. coli-DH5a-celler (GIBCO BRL) og 5 ul av ligeringsblandingen ble blandet i et sterilt 15 ml rør (IWAKI-glass). Røret ble oppbevart på is i 30 min. Etter inkubasjon i 45 sek ved 42 °C ble det til cellene tilsatt 250 ul L-næringsløsning (1 % Trypton, 0,5 % gjærekstrakt, 1 % NaCl). Cellesuspensjonen ble deretter inkubert ilt ved 37 "C under omrøring. 50 ul av cellesuspensjonen ble utspredt på en L-agarplate inneholdende 50 ug/ml ampicillin. Platen ble inkubert over natten ved 37 °C.
Seks kolonier som vokste på platen, ble individuelt inkubert i 2 ml L-næringsløsning inneholdende 50 ug/ml ampicillin over natten ved 37 °C under omrøring. Strukturen av plasmidene i koloniene ble analysert. Et plasmid hvori det 1,6-kb DNA-fragment som inneholder hele OCIF-cDNA er innføyd mellom spaltingssetene for BamHI og Xhol av pBluescript II SK +, ble erholdt og betegnet som pSK + -OCIF.
ii) Fremstilling av mutanter hvori én av Cys- restene i
OCIF er erstattet med en Ser- rest
1) Innføring av mutasjoner i OCIF- cDNA
OCIF-mutanter ble fremstilt hvori én av de fem Cys-rester til stede i OCIF ved posisjoner 174, 181, 256, 298 og 379 (i sekvens nr. 4) ble erstattet med en Ser-rest og ble betegnet som hhv. 0CIF-C19S (174 Cys til Ser), OCIF-C20S (181 Cys til Ser), 0CIF-C21S (256 Cys til Ser), OCIF-C22S (298 Cys til Ser) og OCIF-C23S (379 Cys til Ser).
For å fremstille mutantene ble nukleotider som koder for de tilsvarende Cys-rester, erstattet med de som koder for Ser. Mutagenese ble utført ved hjelp av en totrinns polymer-asekjedereaksjon (PCR). Det første trinn av PCR besto av to reaksjoner, PCR 1 og PCR 2.
Spesifikke primersett ble anvendt for hver mutasjon og andre komponenter var uendrede. Primere anvendt for reaksjonene er vist i tabell 10. Nukleotidsekvensene av primerne er vist i sekvens-ID nr. 20, 23, 27 og 30-40. PCR ble utført som beskrevet nedenfor under de følgende betingelser. Et innledende denatureringstrinn ved 97 °C i 3 min ble etterfulgt av 25 sykluser med denaturering ved 95 °C i 1 min, annealering ved 55 °C i 1 min og utvidelse ved 72 °C i 3 min. Etter disse amplifiseringssykluser ble den siste utvidelse utført ved 70 °C i 5 min. Størrelsen av PCR-produktene ble bekreftet ved agarosegelelektroforese ved anvendelse av reaksjonsløsning. Etter den første PCR ble overskudd av primere fjernet ved anvendelse av Amicon microcon (Amicon). Det endelige volum av oppløsningen som inneholdt PCR-produktene, ble justert til 50 ul med sterilt, destillert vann. Disse rensede PCR-produkter ble anvendt for den andre PCR {PCR 3).
ReaksjonsbetingeIsene var nøyaktig de samme som for PCR 1 eller PCR 2. Størrelsen av PCR-produktene ble bekreftet ved 1,0 % eller 1,5 % agarosegelelektroforese. DNA-fragmentene ble utfelt med etanol, tørket under vakuum og oppløst i 40 ul sterilt, destillert vann. Oppløsningene inneholdende DNA-fragmenter med mutasjoner C19S, C20S, C21S, C22S og C23S ble betegnet som hhv. DNA-oppløsning A, DNA-oppløsning B, DNA-oppløsning C, DNA-oppløsning D og DNA-oppløsning E.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning A
(20 ul) ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Sph I (Takara Shuzo). Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 400 basepar (bp) ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel og oppløst i 20 ul sterilt destillert vann. Denne DNA-opp-løsning ble betegnet DNA-oppløsning 3. To mikrogram pSK + -OCIF ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Sph I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 4,2 kb ble renset fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 4. To mikroliter DNA-opp-løsning 3, 3 ul DNA-oppløsning 4 og 5 ul ligeringsbuffer I fra DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringsreaksjonen ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 ul av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved hjelp av restriksjonsenzymkartlegging og DNA-sekvensering. Det således erholdte
plasmid ble betegnet pSK-0CIF-C19S.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning B
(20 ul), ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Sph I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 400 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med et QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet DNA-oppløsning 5. 2 pl DNA-oppløsning 5, 3 pl DNA-oppløsning 4 og 5 pl ligeringsbuffer I fra DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og. ligeringsreaksjonen ble utført. Kompetente E. co2i-DH5a-celler ble transformert med 5 pl av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-OCIF-C20S.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning C
(20 pl), ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Sph I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 400 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med et QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 pl sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 6. 2 pl DNA-oppløsning 6, 3 pl DNA-oppløsning 4 og 5 pl ligerings-buf f er I fra DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringsreaksjonen ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 pl av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-0CIF-C21S.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning D
(20 pl), ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Bst PI. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 600 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 pl sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 7. 2 pg pSK + -OCIF ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Bst PI. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 4,0 kb ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjons-
sett oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-opp-løsning ble betegnet som DNA-oppløsning 8. 2 ul DNA-oppløsning 7, 3 ul DNA-oppløsning 8 og 5 ul ligeringsbuffer I fra DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringsreaksjonen ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 ul av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA, hvori det 600 bp Nde I-BstPI-fragment med mutasjonen (C22S-mutasjonen) erstatter det 600 bp Nde I-BstPI-fragment av pSK+ -OCIF, ved analysering av DNA-strukturen. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-OCIF-C22S.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning E
(20 ul), ble spaltet med restriksjonsenzymer Bst PI og Eco RV. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 120 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og ble oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 9. 2 ug pSK + -OCIF ble spaltet med restriksjonsenzymer Bst Ell og Eco RV. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 4,5 kb ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 10. 2 ul DNA-oppløsning 9, 3 ul DNA-oppløsning 10 og 5 ul ligerings-buf f er I fra DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringen ble utført. Kompetente E. co2i-DH5a-celler ble transformert med 5 ul av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjons-enzymkart legg ing og DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-OCIF-C23S.
2) Konstruksjon av vektorer for ekspresjon av OCIF- mutantene
pSK-OCIF-C19S, pSK-OCIF-C20S, pSK-OCIF-C21S, pSK-OCIF-C22S og pSK-0CIF-C23S ble spaltet med restriksjonsenzymer Barn HI og Xho I. Det 1,6 kb Barn HI-Xho I DNA-fragment som koder for hver OCIF-mutant ble isolert og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. DNA-oppløsningene som inneholder
1,6 kb cDNA-fragmenter avledet fra pSK-0CIF-C19S, pSK-OCIF-C20S, pSK-OCIF-C21S, pSK-OCIF-C22S og pSK-OCIF-C23S ble betegnet som hhv. C19S DNA-oppløsning, C20S DNA-oppløsning, C21S DNA-oppløsning, C22S DNA-oppløsning og C23S DNA-oppløsning. 5 ug av en ekspresjonsvektor pCEP 4 (Invitrogen) ble spaltet med restriksjonsenzymer Bam HI og Xho I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 10 kb ble renset og oppløst i 40 ul sterilt destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som pCEP 4 DNA-oppløsning. 1 ul pCEP 4 DNA-oppløsning og 6 ul av enten Cl9SDNA-oppløsning, C20S DNA-oppløsning, C21S DNA-opp-løsning, C22S DNA-oppløsning eller C23S DNA-oppløsning, ble uavhengig av hverandre blandet med 7 ul ligeringsbuffer I fra DNA-ligeringssett ver. 2 og ligeringsreaksjoner ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler (100 ul) ble transformert med 7 ul av hver ligeringsblanding. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for kloner inneholdende plasmid, hvori et 1,6 kb cDNA-fragment er innføyd mellom gjenkjennelsessetene for Bam HI og Xho I av pCEP 4, ved analysering av DNA-strukturen. De erholdte plasmider inneholdende cDNA som koder for OCIF-C19S, OCIF-C20S, 0CIF-C21S, 0CIF-C22S og OCIF-C23S, ble betegnet som hhv. pCEP4-OCIF-C19S, pCEP4-OCIF-C20S, pCEP4-OCIF-C21S, pCEP4-OCIF-C22S og -pCEP4-OCIF-C23S.
ii) Fremstilling av domenedelesjonsmutanter av OCIF
(1) Delesjonsmutagenese av OCIF- cDNA
En serie av OCIF-mutanter med delesjoner av fra Thr 2 til Ala 42, fra Pro 43 til Cys 84, fra Glu 85 til Lys 122, fra Arg 123 til Cys 164, fra Asp 177 til Gin 251 og fra Ile 252 til His 326 ble fremstilt (posisjoner for aminosyrerestene er vist i sekvens-ID nr. 4). Disse mutanter ble betegnet som hhv. 0CIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, 0CIF-DCR4, 0CIF-DDD1 og OCIF-DDD2 .
Mutagenese ble utført ved hjelp av totrinns PCR som beskrevet i eksempel 22-(ii) . Primersettene for reaksjonene er vist i tabell 11 og nukleotidsekvensene av primerne er vist i sekvens nr. 19, 25, 40-53 og 54.
De endelige PCR-produkter ble utfelt med etanol, tørket under vakuum og oppløst i 40 ul sterilt, destillert vann. Oppløsninger av DNA-fragment som koder for deler av OCIF-DCR1, 0CIF-DCR2, 0CIF-DCR3, 0CIF-DCR4, 0CIF-DDD1 og OCIF-DDD2, ble betegnet som hhv. DNA-oppløsninger F, G, H, I, J og
K.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning F
(20 ul) ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Xho I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 500 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 11. 2 ug pSK+ -OCIF ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Xho I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 4,0 kb ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 12. 2 ul DNA-oppløsning 11,
3 ul DNA-oppløsning 12 og 5 ul ligeringsbuffer I av DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringen ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 pl av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-struktur ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-OCIF-
DCR1.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning G
(20 ul) ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Xho I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 500 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 13. 2 ul DNA-opp-løsning 13, 3 ul DNA-oppløsning 12 og 5 ul ligeringsbuffer I av DNA-ligeringssett ver. 2 ble blandet og ligeringen ble ut-ført. Kompetente B, coli-DH5a-celler ble transformert med 5 ul av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-OCIF-DCR2.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning H
(20 ul) ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og Xho I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 500 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 14. 2 ul DNA-opp-løsning 14, 3 ul DNA-oppløsning 12 og 5 ul ligeringsbuffer I av DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringsreaksjonen ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 ul av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-0CIF-DCR3.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning I
(20 ul) ble spaltet med restriksjonsenzymer Xho I og Sph I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 900 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 15. 2 ug pSK+ -OCIF ble spaltet med restriksjonsenzymer Xho I og Sph I. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 3,6 kb ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og
oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 16. 2 ul DNA-oppløsning 15, 3 ul DNA-oppløsning 16 og 5 ul ligeringsbuffer I av DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringsreaksjonen ble ut-, ført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 ul av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-0CIF-DCR4.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning J
(20 ul) ble spaltet med restriksjonsenzymer BstP I og Nde I.
Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 400 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-opplysning ble betegnet som DNA-opplysning 17. 2 ul DNA-oppløsning 17, 3 ul DNA-oppløsning 8 og 5 ul ligeringsbuffer I av DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringsreaksjonen ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 pl av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-OCIF-DDDl.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning K
(20 pl) ble spaltet med restriksjonsenzymer Nde I og BstP I.
Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 400 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 pl sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 18. 2 pl DNA-oppløsning 18, 3 pl DNA-oppløsning 8 og 5 pl ligeringsbuffer I av DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringsreaksjonen ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 pl av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-OCIF-DDD2.
2) Konstruksjon av vektorer for ekspresjon av OCIF- mutantene
pSK-OCIF-DCRl, pSK-0CIF-DCR2, pSK-0CIF-DCR3, pSK-0CIF-DCR4, pSK-OCIF-DDDl og pSK-0CIF-DDD2 ble spaltet med restriksjonsenzymer Bam HI og Xho I. Bam HI-Xho I-DNA-fragmentet inneholdende hele kodingssekvensen for hver OCIF-mutant, ble isolert og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Disse DNA-oppløsninger som inneholder Bam HI-Xho I-fragmentet avledet fra pSK-OCIF-DCRl, pSK-OCIF-DCR2, pSK-0CIF-DCR3, pSK-0CIF-DCR4, pSK-OCIF-DDDl og pSK-0CIF-DDD2, ble betegnet som hhv. DCR1-DNA-oppløsning, DCR2-DNA-oppløsning, DCR3-DNA-opp-løsning, DCR4-DNA-oppløsning, DDDlrDNA-oppløsning og DDD2-DNA-oppløsning. 1 ul pCEP 4-DNA-oppløsning og 6 ul av enten DCR1-DNA-oppløsning, DCR2-DNA-oppløsning, DCR3-DNA-oppløsning, DCR4-DNA-oppløsning, DDD1-DNA-oppløsning eller DDD2-DNA-opp-løsning, ble uavhengig av hverandre blandet med 7 ul liger-ingsbuf f er I av DNA-ligeringssett ver. 2 og ligeringsreaksjonene ble utført. Kompetente B. coli-DH5a-celler (100 ul) ble transformert med 7 ul av hver ligeringsblanding. Ampicillinresistente transformanter ble Bcreénet for en klon inneholdende et plasmid-DNA, hvori DNA-fragmentet med delesjoner er innføyd mellom gjenkjennelsessetene for Bam HI og Xho I av pCEP 4, ved analysering av DNA-strukturen. Plasmidene inneholdende cDNA som koder for 0CIF-DCR1, OCIF-DCR2, 0CIF-DCR3, 0CIF-DCR4, OCIF-DDD1 og 0CIF-DDD2, ble betegnet som hhv. pCEP4-0CIF-DCR1, pCEP4-OCIF-DCR2, pCEP4-0CIF-DCR3, pCEP4-0CIF-DCR4, pCEP4-OCIF-DDDl og pCEP4-OCIF-DDD2.
iii) Fremstilling av OCIF med C- terminal domenetronkering (1) Mutagenese av OCIF- cDNA
Det ble fremstilt en serie av OCIF-mutanter med delesjoner fra Cys i aminosyrerest 379 til Leu 380, fra Ser 331
til Leu 380, fra Asp 252 til Leu 380, fra Asp 177 til Leu 380, fra Arg 123 til Leu 380 og fra Cys 86 til Leu 380. Posisjoner av aminosyrerestene er vist i sekvens-ID nr. 4. Disse mutanter ble betegnet som hhv. OCIF-CL, OCIF-CC, OCIF-CDD2, 0CIF-CDD1, 0CIF-CCR4 og OCIF-CCR3.
Mutagenese for OCIF-CL ble utført ved hjelp av den totrinns PCR som beskrevet i eksempel 22-(ii). Primersettet for reaksjonen er vist i tabell 12. Nukleotidsekvensene av primerne er vist i sekvens-ID nr. 23, 40, 55 og 56. De endelige PCR-produkter ble utfelt med etanol, tørket under vakuum og oppløst i 40 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-opp-løsning ble betegnet som oppløsning L.
DNA-fragmentet som er inneholdt i oppløsning L
(20 ul) ble spaltet med restriksjonsenzymer BstP I og EcoR V. Et DNA-fragment med en tilnærmet størrelse på 100 bp ble ekstrahert fra en preparativ agarosegel med QIAEX-gelekstraksjonssett og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som DNA-oppløsning 19. 2 ul DNA-oppløsning 19, 3 ul DNA-oppløsning 10 (beskrevet i eksempel 22-(ii)) og 5 ul ligeringsbuffer I av DNA-ligeringssett ver. 2, ble blandet og ligeringsreaksjonen ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler ble transformert med 5 ul av ligeringsblandingen. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for en klon inneholdende et plasmid-DNA. DNA-strukturen ble analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og ved DNA-sekvensering. Det således erholdte plasmid ble betegnet pSK-OCIF-CL. Mutagenese av OCIF-cDNA for å fremstille OCIF-CC, 0CIF-CDD2, 0CIF-CDD1, OCIF-CCR4 og OCIF-CCR3, ble utført ved hjelp av en ett-trinns PCR.
PCR-reaksjoner for mutagenese for å fremstille OCIF-CC, 0CIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4 og 0CIF-CCR3.
Spesifikke primere ble anvendt for hver mutagenese og andre komponenter var uendrede.
Primere anvendt for mutagenesen er vist i tabell 13. Deres nukleotidsekvenser er vist i sekvens-ID nr. 57-61. Komponentene av hver PCR ble blandet i et mikrosentrifugerør og PCR ble utført som følger. Mikrosentrifugerørene ble behandlet i 3 min ved 97 °C og deretter inkubert sekvensielt, i 30 sek ved 95 °C, 30 sek ved 50 °C og 3 min ved 70 °C. Denne tretrinns inkubasjonsprosedyre ble gjentatt 25 ganger og deretter ble rørene inkubert i 5 min ved 70 °C. En aliquot av reaksjons-blandingen ble fjernet fra hvert rør og analysert ved hjelp av agarosegelelektroforese for å bekrefte størrelsen av hvert produkt. Størrelsen av PCR-produktene ble bekreftet på en agarosegel. Overskudd av primere i PCR ble fjernet ved anvendelse av Amicon microcon (Amicon) etter fullførelse av reaksjonen. DNA-fragmentene ble utfelt med etanol, tørket under vakuum og oppløst i 40 ul sterilt, destillert vann. DNA-fragmentet i hver DNA-oppløsning ble spaltet med restriksjonsenzymer Xho I og Bam HI. Etter reaksjonene ble DNA utfelt med etanol, tørket under vakuum og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann.
Oppløsningene inneholdende DNA-fragment med CC-delesjonen, CDD2-delesjonen, CDDl-delesjonen, CCR4-delesjonen og CCR3-delesjonen, ble betegnet som hhv. CC-DNA-oppløsning, CDD2-DNA-oppløsning, CDD1-DNA-oppløsning, CCR4-DNA-oppløsning og CCR3-DNA-oppløsning.
(2) Konstruksjon av vektorer for ekspresjon av OCIF- mutantene
pSK-OCIF-CL ble spaltet med restriksjonsenzymer
Bam HI og Xho I. Bam HI-Xho I-DNA-fragmentet inneholdende hele kodingssekvensen for OCIF-CL, ble isolert og oppløst i 20 ul sterilt, destillert vann. Denne DNA-oppløsning ble betegnet som CL-DNA-oppløsning. 1 ul pCEP 4-DNA-oppløsning og 6 ul av enten CL-DNA-oppløsning, CC-DNA-oppløsning, CDD2-DNA-oppløsn-ing, CDD1-DNA-oppløsning, CCR4-DNA-oppløsning eller CCR3-DNA-oppløsning, ble uavhengig av hverandre blandet med 7 ul ligeringsbuffer I av DNA-ligeringssett ver. 2 og ligeringsreaksjoner ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler (100 ul) ble transformert med 7 ul av hver ligeringsblanding. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for kloner inneholdende plasmider som har de ønskede mutasjoner i OCIF-cDNA, ved analysering av DNA-strukturen. I hvert plasmid ble et OCIF-cDNA-fragment med en delesjon innføyd mellom gjenkjennelsessetene for Xho I og Bam HI i pCEP 4. Plasmidene inneholdende cDNA som koder for OCIF-CL, OCIF-CC, OCIF-CDD1, OCIF-CDD2, OCIF-CCR4 og OCIF-CCR3 ble betegnet som hhv. pCEP4-OCIF-CL, pCEP4-OCIF-CC, pCEP4-0CIF-CDD2, pCEP4-0CIF-CDD1, pCEP4-0CIF-CCR4 og pCEP4-0CIF-CCR3.
iv) Fremstilling av OCIF- mutanter med C- terminal tronkering (1) Innføring av C- terminal tronkering i OCIF
En serie av OCIF-mutanter med C-terminal tronkering ble fremstilt. OCIF-mutant hvori 10 rester fra Gin ved 371 til Leu ved 380 er erstattet med 2 rester av Leu-Val ble betegnet som OCIF-CBst. OCIF-mutant hvori 83 rester fra Cys 298 til Leu 380 er erstattet med 3 rester av Ser-Leu-Asp, ble betegnet som OCIF-CSph. OCIF-mutant hvori 214 rester fra Asn 167 til Leu
380 er fjernet, ble betegnet som OCIF-CBsp. OCIF-mutant hvori 319 rester fra Asp 62 til Leu 380 er erstattet med 2 rester av Leu-Val, ble betegnet OCIF-CPst. Posisjonene for aminosyrerestene er vist i sekvens-ID nr. 4.
2 ug av pSK + -OCIF ble spaltet med ett av restrik-sjonsenzymene, Bst PI, Sph I, Pstl (Takara Shuzo) og Bsp EI (New England Biolabs), etterfulgt av fenolekstraksjon og etanolutfelling. Det utfelte DNA ble oppløst i 10 ul sterilt, destillert vann. Endene av DNA i 2 ul av hver oppløsning ble avstumpet ved anvendelse av et DNA-avstumpingssett i slutt-volumer på 5 ul. Til reaksjonsblandingene ble det tilsatt 1 ug (1 ul) av en Amber-kodoninneholdende Xba I-linker (5<1->CTAGTCTAGACTAG-3<1>), og 6 pl ligeringsbuffer I fra DNA-ligeringssett ver. 2, ble tilsatt. -
Etter ligeringsreaksjonene ble 6 pl av hver av reaksjonsblandingene anvendt for å transformere E. coli-DH5a. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for kloner inneholdende plasmider. DNA-strukturen ble analysert ved re-st riksjonsenzymkartlegging og DNA-sekvensering. De således erholdte plasmider ble betegnet som hhv. pSK-OCIF-CBst, pSK-OCIF-CSph, pSK-OCIF-CBsp og pSK-OCIF-CPst.
(2) Konstruksjon av vektorer for ekspresjon av OCIF- mutantene
pSK-OCIF-CBst, pSK-OCIF-CSph, pSK-OCIF-CBsp og pSK-OCIF-CPst ble spaltet med restriksjonsenzymer Bam HI og Xho I. De 1,5 kb av DNA-fragmentet inneholdende hele kodingssekvensen for hver OCIF-mutant, ble isolert og oppløst i 20 pl sterilt, destillert vann. Disse DNA-oppløsninger som inneholder Bam HI-Xhol-fragmentet avledet fra pSK-OCIF-CBst, pSK-OCIF-CSph, pSK-OCIF-CBsp og pSK-OCIF-CPst ble betegnet som hhv. CBst-DNA-opp-
løsning, CSph-DNA-oppløsning, CBsp-DNA-oppløsning og CPst-DNA-oppløsning. 1 ul pCEP 4-DNA-oppløsning (beskrevet i eksempel 22-ii)) og 6 ul av enten CBst-DNA-oppløsning, CSph-DNA-opp-løsning, CBsp-DNA-oppløsning eller CPst-DNA-oppløsning, ble uavhengig av hverandre blandet med 7 pl ligeringsbuffer I fra DNA-ligeringssett ver. 2 og ligeringsreaksjonene ble utført. Kompetente E. coli-DH5a-celler (100 pl) ble transformert med 7 pl av hver ligeringsblanding. Ampicillinresistente transformanter ble screenet for kloner inneholdende plasmider, hvori cDNA-fragment er innføyd mellom gjenkjennelsessetene for Bam HI og Xho I i pCEP 4, ved å analysere DNA-strukturen. Plasmidene inneholdende cDNA som koder for OCIF-CBst, OCIF-CSph, OCIF-CBsp og OCIF-CPst, ble betegnet som hhv. pCEP4-OCIF-CBst, pCEP4-OCIF-CSph, pCEP4-OCIF-CBsp og pCEP4-OCIF-CPst .
v) Fremstilling av vektorer for ekspresjon av OCIF-mutantene
E. coli-kloner inneholdende ekspresjonsvektorene for OCIF-mutanter (totalt 21 kloner) ble dyrket og vektorene ble renset ved hjelp av QIAGEN-kolonne (QIAGEN). Alle ekspresjonsvektorene ble utfelt med etanol og oppløst i passende volumer sterilt, destillert vann og anvendt for ytterligere mani-puleringer vist nedenfor.
vi) Kortvarig ekspresjon av cDNA for OCIF- mutanter og biologiske aktiviteter av mutantene
OCIF-mutanter ble produsert ved anvendelse av ekspresjonsvektorene fremstilt i eksempel 22-v). Fremgangsmåten var vesentlig den samme som beskrevet i eksempel 13. Kun de modi-fiserte punkter er beskrevet nedenfor. En 24-brønners plate ble anvendt for DNA-transfeksjonen. 2 x IO<5> celler av 293/EBNA suspendert i IMDM, inneholdende 10 % bovint fosterserum, ble tilsatt til hver brønn på platen. 1 pg renset vektor-DNA og 4 pl lipofektamin ble anvendt for hver transfeksjon. En blanding av ekspresjonsvektor og lipofektamin i OPTI-MEM (GIBCO BRL) i et sluttvolum på 0,5 ml, ble tilsatt til cellene i en brønn. Etter at cellene var inkubert ved 37 °C i 24 t i en C02-inkubator, ble mediet erstattet med 0,5 ml Ex-cell 301-medium (JSR) . Cellene ble inkubert ved 37 °C i ytterligere 48 t i C02-inkubatoren. Det kondisjonerte medium ble oppsamlet og anvendt for analyse av in vitro-biologisk aktivitet. Nukleotidsekvensene av cDNA for OCIF-mutantene er vist i sekvens-ID nr. 83-103. De utledede aminosyresekvenser for OCIF-mutantene er vist i sekvens-ID nr. 62-82. Analysen for in vi tro-biologisk aktivitet ble utført som beskrevet i eksempel 13. Antigenkonsen-trasjon i hvert kondisjonert medium ble bestemt ved hjelp av ELISA, som beskrevet i eksempel 24. Tabell 14 viser spesifikk aktivitet av mutantene i forhold til aktiviteten av den uendrede OCIF.
vii) Western blot- analyse
10 ul av det ferdige kondisjonerte medium ble anvendt for western blot-analyse. 10 ul av prøven ble blandet med 10 ul SDS-PAGE-prøvebuffer (0,5 M Tris-HCl, 20 % glyserol, 4 % SDS, 20 ug/ml bromfenolblått, pH 6,8), kokt i 3 min og underkastet en 10 % SDS-polyakrylamidgelelektroforese under ikke-reduserende betingelser. Etter elektroforesen ble de separerte proteiner blottet på PVDF-membran ("ProBlott", Perkin Eimer) ved anvendelse av en halvtørr elektroblotter (BIO-RAD). Membranen ble inkubert ved 37 °C med pepperrotperoksidasemerkede anti-OCIF-antistoffer i 2 t. Etter at membranen var vasket ble proteinbånd som reagerte med de merkede antistoffer, påvist ved anvendelse av ECL-system (Amersham). To proteinbånd med tilnærmede molekylmasser på 60 kD og 120 kD ble påvist for den uendrede OCIF. På den annen side ble nesten utelukkende et 60 kD-proteinbånd påvist for OCIF-C23S, OCIF-CL og OCIF-CC. Proteinbånd med tilnærmede molekylmasser på 40 kD-50 kD og 30 kD-40 kD, var hovedbåndene for hhv. 0CIF-CDD2 og 0CIF-CDD1.
Disse resultater indikerer at Cys i posisjon 379, er ansvarlig for dimerdannelsen, både monomerene og dimerene opprettholder den biologiske aktivitet og en delesjon av rester fra Asp i posisjon 177 til Leu i posisjon 380, opphever ikke den biologiske aktivitet av OCIF (posisjoner for aminosyrerestene er vist i sekvens-ID nr. 4).
Eksempel 23
Isolering av humant, genomisk OCIF- gen
i) Screening av et humant, genomisk bibliotek
Et amplifisert, humant, placenta-genomisk bibliotek i Lambda FIX II-vektor, innkjøpt fra STRATAGENE, ble screenet for genet som koder for humant OCIF ved anvendelse av det humane OCIF-cDNA som en probe. Screeningen ble hovedsakelig utført i overensstemmelse med instruksjonsmanualen som med-fulgte det genomiske bibliotek. De grunnleggende protokoller beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ble også anvendt for å manipulere fag, E. Coli og DNA.
Biblioteket ble titrert og 1 x IO<6> pfu fag ble blandet med XLl-blå MRA-E. coli-vertceller og utspredt på 20 plater (9 cm x 13 cm) med 9 ml toppagarose pr. plate. Platene ble inkubert over natten ved 37 °C-. Filterplakkopptrekk ble preparert ved anvendelse av Hybond-N-nylonmembraner (Amersham). Membranene ble bearbeidet ved denaturering i en oppløsning inneholdende 1,5 M NaCl og 0,5 M NaOH i 1 min ved romtemperatur. Membranene ble deretter nøytralisert ved suksessiv plas-sering i ett min i 1 M Tris-HCl (pH 7,5) og en oppløsning inneholdende 1,5 M NaCl og 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5). Membranene ble deretter overført til et filterpapir fuktet med 2 x SSC. Fag-DNA ble fiksert på membranene med en UV-energi på 1 200 u joule i STRATALINKER UV-kryssbinder 2 400 (STRATAGENE) og membranene ble lufttørket. Membranene ble nedsenket i hurtig hybridiseringsbuffer (Amersham) og inkubert ilt ved 65 °C før hybridisering med <32>P-merket cDNA-probe i den samme buffer over natten ved 65 °C. Screeningsprobe ble preparert ved merking av OCIF-cDNA med <32>P ved anvendelse av Megaprime DNA-merkingssystemet (Amersham) . Ca. 5 x IO<5> cpm probe ble anvendt for hver ml hybridiseringsbuffer. Etter hybridiseringen ble membranene skyllet i 2 x SSC i 5 min ved romtemperatur. Membranene ble deretter vasket 4 ganger, 20 min hver gang, i 0,5 x SSC inneholdende 0,1 % SDS ved 65 °C. Etter den siste vask ble membranene tørket og underkastet autoradiografi ved -80 °C med SUPER HR-H røntgenfilm (FUJI PFOTO FILM Co., Ltd.) og en intensifiseringsskjerm. Ved undersøkelse av autoradiogrammene ble det oppdaget 6 positive signaler. Agarpropper ble utplukket fra områdene som tilsvarte disse signaler for fagrensing. Hver agarpropp ble nedsenket over natten i 0,5 ml SM-buffer inneholdende 1 % kloroform for å ekstrahere fag. Hvert ekstrakt inneholdende fag ble fortynnet 1 000 ganger med SM-buffer og en aliquot på 1 ml eller 20 ml ble blandet med vert-E. Coli beskrevet ovenfor. Blandingen ble utspredt på agarplater med toppagarose, som beskrevet ovenfor. Platene ble inkubert over natten ved 37 °C og filteropptrekk ble separert, prehybridisert, hybridisert, vasket og autoradiografert, som beskrevet ovenfor. Denne prosess med fagrensing ble anvendt på alle seks positive signaler som opprinnelig ble påvist på autoradiogrammene og ble gjentatt inntil alle fagplakker på agarplater hybridiserte med cDNA-proben. Etter rensing ble agarpropper av hvert fagisolat nedsenket i SM-buffer inneholdende 1 % kloroform og lagret ved 4 °C. Seks individuelle fagisolater ble betegnet som hhv. AOIF3, AOIF8, AOIF9, AOIF11, AOIF12 og AOIF17.
ii) Analyse av de genomiske kloner ved restriksjons-enzymspalting og Southern blot- hybridisering
DNA ble fremstilt fra hvert fagisolat ved hjelp av platelysatmetoden som beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual. DNA fremstilt fra hvert fag ble spaltet med restriksjonsenzymer og fragmentene avledet fra spaltningen, ble separert på agarosegeler. Fragmentene ble deretter overført til nylonmembraner og underkastet Southern-blot-hybridisering ved anvendelse av OCIF-cDNA som en probe. Resultatene fra analysen avslørte at de seks fagisolater er individuelle kloner. Blant disse fragmenter avledet fra restriksjonsenzymspaltning-en ble de fragmenter som hybridiserte med OCIF-cDNA-proben, subklonet i plasmidvektorer og underkastet nukleotidsekvens-
analysen som beskrevet nedenfor.
iii) Subkloning av restriksjonsfragmenter avledet fra genomiske kloner i plasmidvektorer og bestemmelse av nukleot idsekvensen
AOIF8-DNA ble spaltet med restriksjonsenzymer EcoRI og Noti og DNA-fragmentene avledet fra disse, ble separert på en 0,7 % agarosegel. De 5,8 kilobasepar (kb) EcoRI/NotI-fragment ble ekstrahert fra gelen ved anvendelse av QIAEX II-gelekstråksjonssett (QIAGEN) i overensstemmelse med prosedyren anbefalt av produsenten. De 5,8 kb EcoRI/Notl-fragment ble ligert med pBluescript II SK+vektor (STRATAGENE) som var linearisert med restriksjonsenzymer EcoRI og Noti ved anvendelse av Ready-To-Go T4-DNA-ligase (Pharmacia) i overensstemmelse med prosedyren anbefalt av produsenten. Kompetente DH5a-E. Coli-celler (Amersham) ble transformert med det rekombinante plasmid og transformanter ble utvalgt.på L-plater inneholdende 50 ug/ml ampicillin. En klon inneholdende det rekombinante plasmid som inneholder det 5,8 kb EcoRI/Noti-fragment, ble isolert og dette plasmid ble betegnet pBSG8-5.8. pBSG8-5.8 ble spaltet med Hindlll og 0,9 kb DNA-fragment avledet fra denne spaltning ble isolert på samme måte som beskrevet ovenfor. Dette 0,9 kb fragment ble deretter klonet i pBluescript II SK- ved Hindlll-setet, som beskrevet ovenfor. Dette rekombinante plasmid som inneholder 0,9 kb HindIII-fragment, ble betegnet pBS8H0.9.
AOIF11-DNA ble spaltet med EcoRI og 6 kb, 3,6 kb, 2,6 kb EcoRI-fragmenter ble isolert på samme måte som beskrevet ovenfor og klonet i pBluescript II SK+vektor ved EcoRI-setet, som beskrevet ovenfor. Disse rekombinante plasmider ble betegnet som hhv. pBSGll-6, pBSGll-3.6 og pBSGll-2.6. pBSGll-6 ble spaltet med Hindlll og spaltingsproduktet ble applisert på en 0,7 % agarosegel. Tre fragmenter med lengde på 2,2 kb, 1,1 kb og 1,05 kb ble ekstrahert fra gelen og klonet uavhengig av hverandre i pBluescript II SK-vektor ved Hindlll-setet på samme måte som beskrevet ovenfor. Disse rekombinante plasmider ble betegnet som hhv. pBS6H2.2, pBS6Hl.l og pBS6H1.05. Nukleotidsekvensen av det klonede genomiske DNA ble bestemt ved anvendelse av "ABI Dye deoxy Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (PERKIN ELMER) og 373A DNA-sekvenseringssystem (Applied Biosystems). Plasmider pBSG8-5.8, pBS8H0.9, pBSGll-6, pBSGll-3.6, pBSGll-2.6, pBS6H2.2, pBS6Hl.l og pBS6H1.05 ble fremstilt i overensstemmelse med den alkal-iske SDS-prosedyre som beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual og anvendt som templater for DNA-sekvensanalysen. Nukleotidsekvensen av det humane OCIF-gen er vist i sekvens-ID nr. 104 og sekvens-ID nr. 105. Nukleotidsekvensen av DNA, mellom exon 1 og exon 2, ble ikke fullstendig bestemt. Det er en strekning på ca. 17 kb med nukleotider mellom sekvensene gitt i sekvens nr. 104 og sekvens nr. 105.
Eksempel 24
Kvantifisering av OCIF ved hjelp av EIA
i) Fremstilling av anti- OCIF- antistoff
JW-hannkaniner (Kitayama LABES Co., LTD) med vekt på 2,5-3,0 kg, ble anvendt for immunisering for å fremstille antisera. 3 JW-hannkaniner (Kitayama LABES Co., LTD) med vekt på 2,5-3,0 kg, ble anvendt for immuniseringen. For immunisering ble det fremstilt en emulsjon ved å blande et like stort volum rOCIF (200 ug/ml) og komplett Freund's adjuvans (Difco, katalog nr. 0638-60-7). Kaninene ble immunisert subkutant 6 ganger med én ukers mellomrom med 1 ml emulsjon pr. injeksjon. Kaninene ble injisert subkutant 6 ganger med 7 dagers mellomrom. Blod ble tappet 10 dager etter den siste immunisering og serum ble separert. Antistoff ble renset fra serum som følger. Antiserum ble fortynnet to ganger med PBS. Etter tilsetning av ammoniumsulfat til en sluttkonsentrasjon på 40 vekt/volum%, ble antiserum tillatt å henstå ved 4 °C i 1 t. Bunnfall dannet ved sentrifugering ved 8 000 x g i 20 min ble oppløst i et lite volum PBS og ble dialysert mot PBS. Den resulterende opp-løsning ble applisert på en protein-G-sepharosekolonne (Pharmacia) . Etter vask med PBS ble absorbert immunglobulin G eluert med 0,1 M glysin-HCl-buffer (pH 3,0). Eluater ble nøytral-isert med 1,5 M Tris-HCl-buffer (pH 8,7) umiddelbart, og ble dialysert mot PBS. Proteinkonsentrasjon ble bestemt ved absorbans ved 280 nm (E<1%> 13,5) .
Pepperrotperoksidasemerket antistoff ble preparert ved anvendelse av immunrent raaleimidaktivert pepperrotperoksi-dasesett {Pierce, katalog nr. 31494). Kort beskrevet ble 1 mg IgG inkubert med 80 ug N-succinimidyl-S-acetyltioacetat i 30 min. Etter deacetylering med 5 g hydroksylamin-HCl, ble modifisert IgG separert ved anvendelse av en polyakrylamid-avsaltningskolonne. De samlede proteinfraksjoner blandet med 1 ug maleimidaktivert pepperrotperoksidase, ble inkubert ved romtemperatur ilt.
ii) Kvantifisering av OCIF ved hjelp av sandwich- EIA
Mikrotiterplater (Nunc MaxiSorp Immunoplate) ble belagt med kanin-anti-OCIF-IgG ved inkubasjon av 0,2 ug i 100 ul 50 mM natriumbikarbonatbuf f er, pH 9,6, ved 4 °C over natten. Etter blokkering av platene ved inkubasjon ilt ved 37 °C med 300 ul 25 % BlockAce/PBS (Snow Brand Milk Products), ble 100 ul prøver inkubert i 2 t ved romtemperatur. Etter vask av platene 3 ganger med PBST (PBS inneholdende 0,05 % Tween 20), ble 100 ul 1:1 000-fortynnet pepperrotperoksidasemerket anti-OCIF-IgG tilsatt og inkubert i 2 t ved romtemperatur. Mengden av OCIF ble bestemt ved inkubasjon med 100 ul av en substrat-løsning (TMB, ScyTek Lab., katalog nr. TM4999) og måling av absorbansen ved 450 nm ved anvendelse av en immunavleser (Nunc NJ2000). Renset rekombinant OCIF ble anvendt som et standardprotein og en typisk standardkurve er vist i fig. 13.
Eksempel 25
Anti- OCIF- monoklonalt antistoff
i) Fremstilling av hybridomer som produserer anti- OCIF-monoklonalt antistoff
OCIF ble renset til homogenitet fra kulturmedium fra humane fibroblaster, IMR-90, ved hjelp av rensingsmetoden beskrevet i eksempel 11. Renset OCIF ble oppløst i PBS ved en konsentrasjon på 10 ug/100 ul. BALB/c-mus ble immunisert ved administrering av denne oppløsning intraperitonealt tre ganger hver andre uke. Ved den første og andre immunisering ble det administrert emulsjonene som var sammensatt av et like stort volum OCIF og Freund's komplette adjuvans. 3 dager etter den siste administrering ble milten tatt ut, lymfocytter ble isolert og fusjonert med musemyelom p3x63-Ag8.653-celler i overensstemmelse med den konvensjonelle metode ved anvendelse av polyetylenglykol. De fusjonerte celler ble deretter dyrket i HAT-medium for å utvelge hybridomer. For å undersøke hvorvidt de utvalgte hybridomer produserer anti-OCIF-antistoff, ble anti-OCIF-antistoff i hvert kulturmedium av hybridomer bestemt ved fastfase-ELISA som ble preparert ved å belegge hver brønn i 96-brønners immunplater (Nunc) med 100 ul renset OCIF
(10 ug/ml i 0,1 M NaHC03) og ved å blokkere hver brønn med 50 % BlockAce (Snow Brand Milk Products Co. Ltd.). Hybridomklonene som utskiller anti-OCIF-antistoff, ble etablert ved å klone 3-5 ganger ved hjelp av begrenset fortynning og ved screening ved anvendelse av den ovennevnte fastfase-ELISA. Blant således erholdte hybridomkloner ble det utvalgt flere hybridomkloner med høy produksjon av anti-OCIF-antistoff.
ii) Produksjon av anti- OCIF- monoklonale antistoffer
Hver hybridomklon som utskilte anti-OCIF-antistoff, som ble erholdt i eksempel 25-i), ble overført intraperitonealt til mus som var gitt Pristane (Aldrich) ved en celletetthet på 1 x 10s celler/mus. Den- akkumulerte ascites ble oppsamlet 10-14 dager etter overføringen og ascites som inneholdt anti-OCIF-spesifikt monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, ble erholdt. Rensede antistoffer ble erholdt ved hjelp av Affigel-protein A-sepharosekromatografi (BioRad) i overensstemmelse med fabrikantens bruksanvisning. Dette vil si at ascites ble fortynnet med et like stort volum av en bind-ingsbuffer (BioRad) og applisert på en protein A-kolonne. Kolonnen ble vasket med et tilstrekkelig volum av bindings-bufferen og eluert med en elueringsbuffer (BioRad). Etter nøy-tralisering ble det erholdte eluat dialysert i vann og deretter lyofilisert. Renheten av det erholdte antistoff ble analysert ved hjelp av SDS/PAGE og et homogent bånd med en molekylvekt på ca. 150 000 ble påvist.
iii) Utvelgelse av monoklonalt antistoff med høy affinitet for OCIF
Hvert antistoff erholdt i eksempel 25-ii) ble oppløst
i PBS og konsentrasjonen av protein i oppløsningen ble bestemt ved hjelp av metoden ifølge Lowry. Hver antistoffoppløsning med den samme konsentrasjon ble fremstilt og deretter seriefortynnet med PBS. Monoklonale antistoffer som kan gjenkjenne OCIF, selv i sterkt fortynnet oppløsning, ble utvalgt ved
hjelp av fastfase-ELISA beskrevet i eksempel 25-ii). 3 monoklonale antistoffer, A1G5, E3H8 og D2F4, kan således utvelges.
iv) Bestemmelse av klasse og underklasse av antistoffer
Klassen og underklassen av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse erholdt i eksempel 25-iii), ble analysert ved anvendelse av et immunglobulinklasse- og subklasse-analysesett (Amersham). Prosedyren ble utført i overensstemmelse med protokollen beskrevet i anvisningene. Resultatene er vist i tabell 15. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, E3H8, A1G5 og D2F4, tilhører hhv. IgGi, IgG2a og IgG2b.
v) Bestemmelse av OCIF ved hjelp av ELISA
3 typer av monoklonale antistoffer, A1G5, E3H8 og D2F4, som ble erholdt i eksempel 25-iv), ble anvendt som hhv. fastfase-antistoffer og enzymmerkede antistoffer. Sandwich-
ELISA ble konstruert ved hjelp av hver kombinasjon av fastfase-antistoff og merket antistoff. Det merkede antistoff ble fremstilt ved anvendelse av immunrent maleimidaktivert pepper-rotperoksidasesett (Pierce, katalog nr. 31494). Hvert mono-. klonalt antistoff ble oppløst i 0,1 M NaHC03 ved en konsentrasjon på 10 ug/ml, og 100 ul av oppløsningen ble tilsatt til hver brønn på 96-brønners immunplater (Nunc, MaxiSorp katalog nr. 442404), etterfulgt av henstand ved romtemperatur over natten. Hver brønn på platene ble deretter blokkert med 50 % Blockace (Snow Brand Milk Products Co. Ltd.) ved romtemperatur i 50 min og ble deretter vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,1 % Tween 20 (vaskebuffer).
En serie med konsentrasjoner av OCIF ble preparert ved å fortynne OCIF med 1. reaksjonsbuffer (0,2 M Tris-HCl-buffer, pH 7,4, inneholdende 40 % Blockace og 0,1 % Tween 20). Hver brønn på 96-brønners immunplater ble fylt med 100 ul av den preparerte OCIF-oppløsning med hver konsentrasjon, tillatt å henstå ved 37 °C i 3 t og deretter vasket tre ganger med vaskebufferen. For å fortynne POD-merket antistoff ble 2. reaksjonsbuffer (0,1 M Tris-HCl-buffer, pH 7,4, inneholdende 25 % Blockace og 0,1 % Tween 20) anvendt. POD-merket antistoff ble fortynnet 400 ganger med 2-, reaksjonsbuf f er og 100 ul av den fortynnede oppløsning ble tilsatt til hver brønn på immunplatene. Hver immunplate ble tillatt å henstå ved 37 °C i 2 t og ble deretter vasket 3 ganger med vaskebufferen. Etter vask ble 100 ul av en substratoppløsning (0,1 M sitratfosfatbuffer, pH 4,5, inneholdende 0,4 mg/ml o-fenylendiamin-HCl og 0,006 % H202) tilsatt til hver brønn på immunplatene og immunplatene ble inkubert ved 37 °C i 15 min. Enzymreaksjonen ble stanset ved tilsetning av 50 ul 6 N H2S04 til hver brønn. Den optiske tetthet i hver brønn ble bestemt ved 492 nm ved anvendelse av en immunavleser (ImmunoReader NJ 2000, Nunc).
Ved anvendelse av tre typer monoklonalt antistoff ved foreliggende oppfinnelse, fører hver kombinasjon av fastfase-og POD-merkede antistoffer til en nøyaktig bestemmelse av OCIF. Hvert monoklonalt antistoff ved foreliggende oppfinnelse ble bekreftet å gjenkjenne en forskjellig epitop av OCIF. En typisk standardkurve for OCIF ved anvendelse av en kombinasjon av fastfase-antistoff, A1G5 og POD-merket antistoff, E3H8, er vist i fig. 14.
vi) Bestemmelse av OCIF i humant serum
Konsentrasjon av OCIF i 5 prøver av normalt humant serum ble bestemt ved anvendelse av et EIA-system beskrevet i eksempel 25-v). Immunplatene ble belagt med A1G5 som beskrevet i eksempel 25-v) og 50 ul av 1. reaksjonsbuffer ble tilsatt til hver brønn på immunplatene. 50 ul av hvert humant serum ble deretter tilsatt til hver brønn på immunplatene. Immunplatene ble inkubert ved 37 °C i 3 t og deretter vasket 3 ganger med vaskebufferen. Etter vask ble hver brønn på immunplatene fylt med 100 ul POD-E3H8-antistoff fortynnet 400 ganger med 2. reaksjonsbuffer og inkubert ved 37 °C i 2 t. Etter vask av immunplatene 3 ganger med vaskebufferen, ble 100 ul av substratoppløsningen beskrevet i eksempel 25-v), tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 °C i 15 min. Enzymreaksjonen ble stanset ved tilsetning av 50 ul 6 N H2S04 til hver brønn på immunplatene. Den optiske tetthet i hver brønn ble bestemt ved 492 nm ved anvendelse av en immunavleser (ImmunoReader NJ 2000, Nunc).
1. reaksjonsbuffer som inneholdt den kjente mengde OCIF, ble behandlet på samme måte og en standardkurve for OCIF som vist i fig. 2, ble erholdt. Ved anvendelse av standard-kurven for OCIF ble mengden av OCIF i humane serumprøver bestemt. Resultatene er vist i tabell 14.
Eksempel 26
Terapeutisk effekt på osteoporose
(1) Metode
Fischer-hannrotter, 6 uker gamle, ble underkastet denervering av det venstre forben. Disse rotter ble delt i fire grupper (10 rotter/gruppe) og behandlet som følger: gruppe A, sham-opererte rotter uten administrering; gruppe B, denerverte rotter med intravenøs administrering av vehikkel; gruppe C, denerverte rotter administrert OCIF intravenøst i en dose på 5 ug/kg to ganger pr. dag; gruppe D, denerverte rotter administrert OCIF intravenøst i en dose på 50 ug/kg to ganger pr. dag. Etter denervering ble OCIF administrert daglig i 14 dager. Etter 2 ukers behandling ble dyrene avlivet og deres forben ble dissekert. Deretter ble benene testet for mekanisk styrke.
(2) Resultater
Reduksjon av benstyrke ble observert hos dyrene i kontrollgruppene sammenlignet med dyrene i de normale grupper, mens benstyrken ble økt i gruppene av dyr som mottok 50 mg OCIF pr. kg. kroppsvekt.
Industriell tilgjengelighet
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer både et nytt protein som inhiberer dannelse av osteoklaster, og en effektiv fremgangsmåte for fremstilling av proteinet. Proteinet i følge oppfinnelsen har en aktivitet som inhiberer dannelse av osteoklaster. Proteinet vil være anvendelig for behandling av mange sykdommer som ledsager bentap, slik som osteoporose, og som et antigen anvendt for immunologisk diagnose av slike sykdommer.
Opplysninger vedrørende den deponerte mikroorganisme
Navn og adresse for deponeringsmyndigheten Navn:National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology
Ministry of International Trade and Industry Adresse:1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken
305, Japan
Deponeringsdato: 21. juni 1995
(Den ble overført fra Bikkoken nr. P-14998, som var deponert den 21. juni 1995. Overføringsdato: 25. oktober 1995.)
Aksesjonsnr. FERM BP-5267
Claims (40)
1. OCIF-protein,
karakterisert ved at det har de følgende egenskaper: (a) molekylvekt ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ;
ca. 60 kD under reduserende betingelser, og ca. 60 kD og 120 kD under ikke-reduserende beting
elser, (b) en høy affinitet for kationbytterkolonne og heparinkolonne; (c) en biologisk aktivitet som inhiberer osteoklastdifferensiering og/eller -modning;
dets aktivitet reduseres ved oppvarming ved 70 °C i 10 min eller ved 56 °C i 30 min, og dets aktivitet går tapt ved oppvarming ved 90 °C i 10
min, og (d) interne aminosyresekvenser vist i sekvens-ID nr. 1, 2 og 3.
2. Protein ifølge krav 1,
karakterisert ved at det har en N-terminal aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 7.
3. Protein ifølge krav 1,
karakterisert ved at det produseres i humane fibroblaster.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av proteinet ifølge krav 1, 2 og 3,
karakterisert ved: dyrkning av humane fibroblaster; rensing av proteinet ved hjelp av en kombinasjon av ionebytterkolonnekromatografi, affinitetskolonnekromatografi og reversfase-kolonnekromatografi.
5. Fremgangsmåte for fremstilling av proteinet ifølge krav 4,
karakterisert ved dyrkning av humane fibroblaster på aluminiumoksid-keramiske biter.
6. OCIF-protein,
karakterisert ved at det har en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 4.
7. OCIF-CDNA,
karakterisert ved at det koder for en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 4.
8. OCIF-cDNA,
karakterisert ved at det har en nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 5.
9. OCIF-cDNA,
karakterisert ved at det er satt inn i en vektor som bæres av den transformerte Escerichia coli-stammen pBK/01F10 (FERM BP-5267).
10. OCIF-CDNA,
karakterisert ved at det har en nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 6.
11. OCIF-cDNA,
karakterisert ved at det hybridiserer med cDNA som vist i sekvens-ID nr. 6 under stringente betingelser.
12. OCIF-protein,
karakterisert ved at det er uttrykt fra cDNA som koder for aminosyresekvensen som vist i sekvens-ID nr. 4.
13. OCIF-protein,
karakterisert ved at det har en biologisk aktivitet som inhiberer osteoklastdifferensiering og/eller - modning, og som er tilveiebrakt som aminosyreuttrykt cDNA og som har minst 80 % sekvensidentitet med aminosyrene som er vist i sekvens-ID nr.4.
14. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein ifølge krav 1,
karakterisert ved at det anvendes genteknikk der det benyttes cDNA fra ethvert av kravene 7 til 11.
15. Protein ifølge krav 1,
karakterisert ved at nevnte protein er tilveiebrakt med fremgangsmåten ifølge krav 14.
16. Fremgangsmåte for fremstilling av protein ifølge krav 12,
karakterisert ved at det anvendedeB genteknikk med benyttelse av pattedyrceller som vertsceller.
17. Fremgangsmåte for fremstilling av protein ifølge krav 16,
karakterisert ved at det anvendes genteknikk med benyttelse av 293/EBNA-celler eller CHO-celler som pattedyrvertsceller.
18. Protein ifølge krav 6 eller 12, karakterisert ved at nevnte protein er tilveiebrakt med fremgangsmåten ifølge krav 16 eller 17.
19. OCIF-variant, -mutant eller trunkert OCIF-cDNA, karakterisert ved at det er valgt fra: et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 8, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 10, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 12, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 14, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 83, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 84, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 85, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 86, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 87, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 88, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr, 89, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 90, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 91, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 92, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 93, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 94, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 95, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 96, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 97, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 98, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 99, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 100, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 101, et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 102, og et cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 103.
20. Protein,
karakterisert ved at det er kodet for av et cDNA som er valgt blant de som er vist i krav 19.
21. OCIF-variant-, -mutant- eller trunkert OCIF-cDNA, karakterisert ved at det er valgt fra: cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 9, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 11, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 13, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 15, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 62, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 63, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 64, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 65, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 66, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 67, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 68, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 69, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 70, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvenB-ID nr.'71, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 72, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 73, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 74, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 75, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 76, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 77, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 78, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 79, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 80, cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 81, og cDNA som koder for en aminosyresekvens som tilveiebrakt i sekvens-ID nr. 82.
22 . Genomisk OCIF-DNA,
karakterisert ved at det koder for en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 5.
23. Genomisk DNA ifølge krav 22, karakterisert ved at det har nukleotidsekvensen som er vist i sekvens-ID nr. 104 eller 105.
24. OCIF-variant-, -mutant- eller trunkert OCIF-protein, karakterisert ved at det er valgt fra: et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 373 fra sekvens-ID nr. 9, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 341 fra sekvens-ID nr. 11, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 133 fra sekvens-ID nr. 13, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 124 fra sekvens-ID nr. 15, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 62, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 63, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 64, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 65, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 380 fra sekvens-ID nr. 66, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 339 fra sekvens-ID nr. 67, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 338 fra sekvens-ID nr. 68, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 342 fra sekvens-ID nr. 69, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 338 fra sekvens-ID nr. 70, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 305 fra sekvens-ID nr. 71, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 306 fra sekvens-ID nr. 72, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 378 fra sekvens-ID nr. 73, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 330 fra sekvens-ID nr. 74, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 251 fra sekvens-ID nr. 75, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 176 fra sekvens-ID nr. 76, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 122 fra sekvens-ID nr. 77, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 85 fra sekvens-ID nr. 78, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 372 fra sekvens-ID nr. 79, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 300 fra sekvens-ID nr. 80, et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 166 fra sekvens-ID nr. 81, og et protein som har en aminosyresekvens som tilsvarer aminosyrene 1 til 63 fra sekvens-ID nr. 82.
25. OCIF-cDNA,
karakterisert ved at det koder for et protein ifølge krav 24.
26. Farmasøytisk preparat,
karakterisert ved at det omfatter et protein ifølge ethvert av kravene 1-3, 6, 12, 13, 15, 18, 20 og 24.
27. Antistoff,
karakterisert ved at det har spesifikk aktivitet mot et protein ifølge ethvert av kravene 1-3, 6, 12-13, 15, 18, 20 og 24.
28. Antistoff ifølge krav 27, karakterisert ved at det er et polyklonalt antistoff.
29. Antistoff ifølge krav 27, karakterisert ved at det er et monoklonalt antistoff.
30. Monoklonalt antistoff ifølge krav 29, karakterisert ved de følgende egenskaper: molekylvekt på omtrent 150,000 og tilhørende underklasse IgGi, IgG2a eller IgG2b.
31. Fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av proteinet som utgjør OCIF,
karakterisert ved anvendelse av antistoffene ifølge ethvert av kravene 27 til 30.
32. Anvendelse av et protein ifølge ethvert av kravene 1-3, 6, 12, 13, 15, 18, 2 0 og 24 for fremstillingen av medikament til behandlingen eller forebyggingen av osteoporose.
33. Anvendelse av et protein ifølge ethvert av kravene 1-3, 6, 12, 13, 15, 18, 20 og 24 for fremstillingen av medikament til behandlingen eller forebyggingen av minket benmasse.
34. Anvendelse av et protein ifølge ethvert av kravene 1-3, 6, 12, 13, 15, 18, 20 og 24 for fremstillingen av medikament til behandlingen eller forebyggingen av en unormal benmetaboli sme.
35. Vektor,
karakterisert ved at ethvert av de følgende cDNAene (a) til (d) er satt inn i vektoren: (a) OCIF-cDNA som koder for en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr. 4, (b) OCIF-cDNA med nukleotidsekvens som vist i sekvens-ID nr. 6, (c) OCIF-cDNA som koder for en aminosyresekvens som vist i sekvens-ID nr.5, (d) OCIF-cDNA som er -satt inn i en vektor som er båret av den transformerte Escherichia coli-stammen pBK/01F10 (FERM BP-5267), og som koder for et protein som har en biologisk aktivitet som inhiberer osteoklastdifferensiering og/eller -modning.
36. Vektor ifølge krav 35,
karakterisert ved at nevnte vektor er båret av den transformerte Escerichia coli-stammen pBK/01F10 (FERM BP-5267).
37. Vertscelle,
karakterisert ved at vektoren ifølge krav 35 eller 36 er introdusert i vertscellen.
38. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein ifølge krav 1,
karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene (I) og (II): (I) dyrke vertscellen ifølge krav 37, (II) gjenvinne nevnte protein fra den tilveiebrakte kultur.
39. Protein ifølge krav 1,
karakterisert ved at nevnte protein er tilveiebrakt med fremgangsmåten ifølge krav 38.
40. Den transformerte Escherichia coli-stammen pBK/01F10 (FERM BP5267).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5497795 | 1995-02-20 | ||
| JP20750895 | 1995-07-21 | ||
| PCT/JP1996/000374 WO1996026217A1 (fr) | 1995-02-20 | 1996-02-20 | Proteine nouvelle et ses procedes de production |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO973801D0 NO973801D0 (no) | 1997-08-19 |
| NO973801L NO973801L (no) | 1997-10-20 |
| NO318898B1 true NO318898B1 (no) | 2005-05-18 |
Family
ID=26395808
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19973801A NO318898B1 (no) | 1995-02-20 | 1997-08-19 | OCIF-proteiner, fremgangsmate for fremstilling av dem, cDNA som koder for dem, OCIF variant-, mutant- og trunkert OCIF-cDNA, OCIF-variant-, mutant-, og trunkert OCIF-protein, genomisk OCIF-DNA, farmasoytisk preparat omfattende OCIF-protein, variant, mutant og trunkert OCIF-protein, antistoff mot disse, anvendelse av disse for fremstilling av medikament, fremgangsmate for bestemmelse av konsentrasjon av OCIF, vektor med insatt OCIF-cDNA, vertscelle inneholdende vektoren og transformert E. coli-stamme. |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (9) | US7125686B1 (no) |
| EP (2) | EP1528103B1 (no) |
| JP (1) | JP3502102B2 (no) |
| KR (1) | KR100381788B1 (no) |
| CN (1) | CN1218961C (no) |
| AT (2) | ATE274580T1 (no) |
| AU (1) | AU702557C (no) |
| CA (1) | CA2213469A1 (no) |
| DE (2) | DE69633225T2 (no) |
| ES (1) | ES2227579T3 (no) |
| FI (1) | FI973402A (no) |
| HU (1) | HU224570B1 (no) |
| IL (1) | IL117175A (no) |
| MX (1) | MX9706341A (no) |
| NO (1) | NO318898B1 (no) |
| NZ (1) | NZ301362A (no) |
| PT (1) | PT816380E (no) |
| RU (2) | RU2238948C2 (no) |
| TW (1) | TW538049B (no) |
| WO (1) | WO1996026217A1 (no) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2159995A (en) * | 1995-03-15 | 1996-10-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| US7094564B1 (en) | 1995-03-15 | 2006-08-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| US8110659B1 (en) | 1995-03-15 | 2012-02-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like genes |
| US7078493B1 (en) | 1995-03-15 | 2006-07-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like genes |
| US7632922B1 (en) * | 1995-12-22 | 2009-12-15 | Amgen, Inc. | Osteoprotegerin |
| US6369027B1 (en) * | 1995-12-22 | 2002-04-09 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| JPH1057071A (ja) * | 1996-08-19 | 1998-03-03 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法 |
| WO1998012344A1 (en) * | 1996-09-18 | 1998-03-26 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like genes |
| US6242586B1 (en) * | 1996-12-13 | 2001-06-05 | Schering Corporation | Mammalian cell surface antigens: related reagents |
| EP0951551B9 (en) | 1996-12-23 | 2012-12-26 | Immunex Corporation | Ligand for receptor activator of nf-kappa b, ligand is member of tnf superfamily |
| US6271349B1 (en) | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
| NZ332995A (en) * | 1997-04-15 | 2000-07-28 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | A protein which binds to osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) |
| US6316408B1 (en) | 1997-04-16 | 2001-11-13 | Amgen Inc. | Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors |
| ES2284203T5 (es) | 1997-04-16 | 2016-03-11 | Amgen Inc. | Proteínas de unión a osteoprotegerina y sus receptores |
| JP2002514078A (ja) * | 1997-04-18 | 2002-05-14 | ミレニアム ファーマシューティカルズ インク． | Ｆｔｈｍａ−０７０関連蛋白質ファミリーおよびｔ８５関連蛋白質ファミリーの新規分子ならびにそれらの使用 |
| AU7469998A (en) * | 1997-05-01 | 1998-11-24 | Amgen, Inc. | Chimeric opg polypeptides |
| US6346388B1 (en) | 1997-08-13 | 2002-02-12 | Smithkline Beecham Corporation | Method of identifying agonist and antagonists for tumor necrosis related receptors TR1 and TR2 |
| HUP0002062A3 (en) * | 1997-09-24 | 2002-09-30 | Sankyo Co | Method for diagnosing bone dysbolism |
| US6297022B1 (en) | 1997-10-08 | 2001-10-02 | Smithkline Beecham Corporation | Method of identifying agonists and antagonists for tumor necrosis related receptor TR1 |
| US6087555A (en) * | 1997-10-15 | 2000-07-11 | Amgen Inc. | Mice lacking expression of osteoprotegerin |
| JPH11155420A (ja) * | 1997-12-02 | 1999-06-15 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | トランスジェニック動物 |
| CA2328140C (en) | 1998-05-14 | 2012-03-13 | Immunex Corporation | Method of inhibiting osteoclast activity |
| AU6006099A (en) * | 1998-10-09 | 2000-05-01 | Sankyo Company Limited | Preventives or remedies for cachexia |
| AU755422B2 (en) * | 1998-10-28 | 2002-12-12 | Sankyo Company Limited | Remedies for bone metabolic errors |
| AUPQ167599A0 (en) * | 1999-07-19 | 1999-08-12 | St. Vincent's Institute Of Medical Research | Inhibitor of osteoclast precursor formation |
| AU7720600A (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-30 | Eli Lilly And Company | Osteoprotegerin regulatory region |
| JP2001103964A (ja) * | 1999-10-05 | 2001-04-17 | Teijin Ltd | 破骨細胞形成抑制方法または骨吸収抑制方法 |
| WO2002062990A1 (fr) * | 2001-02-07 | 2002-08-15 | Sankyo Company, Limited | Anticorps et utilisation de cet anticorps |
| WO2002064782A2 (en) * | 2001-02-09 | 2002-08-22 | Maxygen Holdings Ltd. | Rank ligand-binding polypeptides |
| CN1238379C (zh) * | 2001-03-21 | 2006-01-25 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 新的破骨细胞形成抑制因子、其编码序列及用途 |
| CA2442694C (en) * | 2001-04-03 | 2012-03-06 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Osteoprotegerin in milk |
| AU2002309647C1 (en) | 2001-05-25 | 2008-09-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors |
| CZ20022231A3 (cs) * | 2001-06-29 | 2003-02-12 | Sankyo Company Limited | Komplex skládající se z osteoklastogenezi inhibujícího faktoru a polysacharidu |
| JP4336467B2 (ja) * | 2001-10-15 | 2009-09-30 | 株式会社林原生物化学研究所 | 破骨細胞形成抑制因子の産生を調節し得る物質のスクリーニング方法 |
| EP1482978A1 (en) * | 2002-03-01 | 2004-12-08 | Sankyo Company, Limited | Pharmaceutical composition comprising osteoclastogenesis inhibitory factor |
| PL375041A1 (en) | 2002-04-05 | 2005-11-14 | Amgen Inc. | Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors |
| US20050014264A1 (en) * | 2002-12-11 | 2005-01-20 | University Of Massachusetts | Method of introducing siRNA into adipocytes |
| US7740861B2 (en) | 2004-06-16 | 2010-06-22 | University Of Massachusetts | Drug delivery product and methods |
| US7300773B2 (en) * | 2004-08-27 | 2007-11-27 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of TNFR-Ig |
| ATE536175T1 (de) | 2004-09-17 | 2011-12-15 | Univ Massachusetts | Zusammensetzungen und ihre verwendungen bei lysosomalen enzymstörungen |
| US8076293B2 (en) * | 2005-04-19 | 2011-12-13 | Gabriel Stavros Panayi | Use of BiP or a variant, homologue, derivative or fragment thereof in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of bone loss or bone resorption |
| US20090209624A1 (en) * | 2005-10-24 | 2009-08-20 | University Of Massachusetts | Compositions and their uses for gene therapy of bone conditions |
| NZ568369A (en) * | 2005-11-23 | 2011-10-28 | Acceleron Pharma Inc | Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth |
| US10741034B2 (en) | 2006-05-19 | 2020-08-11 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity |
| ES2540733T3 (es) | 2007-10-11 | 2015-07-13 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Anticuerpo que se dirige a la proteína Siglec-15 relacionada con osteoclastos |
| WO2009058913A2 (en) * | 2007-10-29 | 2009-05-07 | University Of Massachusetts | Encapsulated nanoparticles for nucleic acid delivery |
| JP5653909B2 (ja) | 2009-04-09 | 2015-01-14 | 第一三共株式会社 | 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体 |
| MX2013003828A (es) | 2010-10-05 | 2013-06-28 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Anticuerpo dirigido a la proteina lectina tipo inmunoglobulina de union a acido sialico-15 relacionada con osteoclastos. |
| CN102011025A (zh) * | 2010-10-11 | 2011-04-13 | 宁波市鄞州品达电器焊料有限公司 | 一种耐超高温的无铅焊锡 |
| RU2014143798A (ru) | 2012-03-30 | 2016-05-27 | Дайити Санкио Компани, Лимитед | Антитело к сиглек-15 с модифицированной cdr |
| US9963740B2 (en) * | 2013-03-07 | 2018-05-08 | APDN (B.V.I.), Inc. | Method and device for marking articles |
| EP3058339B1 (en) | 2013-10-07 | 2019-05-22 | APDN (B.V.I.) Inc. | Multimode image and spectral reader |
| US10745825B2 (en) | 2014-03-18 | 2020-08-18 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Encrypted optical markers for security applications |
| WO2015142990A1 (en) | 2014-03-18 | 2015-09-24 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Encryped optical markers for security applications |
| JP6339855B2 (ja) * | 2014-05-14 | 2018-06-06 | 住友ゴム工業株式会社 | エアレスタイヤ及びその製造方法 |
| CN109070130B (zh) | 2016-04-11 | 2022-03-22 | 亚普蒂恩（B V I）公司 | 用于标记纤维素产品的方法 |
| US10995371B2 (en) | 2016-10-13 | 2021-05-04 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Composition and method of DNA marking elastomeric material |
| US10920274B2 (en) | 2017-02-21 | 2021-02-16 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Nucleic acid coated submicron particles for authentication |
Family Cites Families (85)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US207827A (en) * | 1878-09-10 | Improvement in siphon-condensers | ||
| US175840A (en) * | 1876-04-11 | Improvement in circular-knitting machines | ||
| US100069A (en) * | 1870-02-22 | Geokge h | ||
| US181418A (en) * | 1876-08-22 | Improvement in gas apparatus | ||
| US176647A (en) * | 1876-04-25 | Improvement in car-couplings | ||
| US166097A (en) * | 1875-07-27 | Improvement in buttons for wearing apparel | ||
| US33535A (en) * | 1861-10-22 | Improvement in machines for making bricks | ||
| US104485A (en) * | 1870-06-21 | Improvement in sleeping-cars | ||
| US86827A (en) * | 1869-02-09 | Improved rubber boot | ||
| US81720A (en) * | 1868-09-01 | Isaac williams | ||
| US144480A (en) * | 1873-11-11 | Improvement in cutting attachments for sewing-machines | ||
| US127637A (en) * | 1872-06-04 | Improvement in couplings for divided axles | ||
| US139325A (en) * | 1873-05-27 | Improvement in carriage-springs | ||
| US103978A (en) * | 1870-06-07 | Improvement in bee-hives | ||
| US216297A (en) * | 1879-06-10 | Improvement in ironing-stands | ||
| US45456A (en) * | 1864-12-13 | Improved apparatus for carbureting air | ||
| US86826A (en) * | 1869-02-09 | Improvement in mechanical movement | ||
| US208045A (en) * | 1878-09-17 | Improvement in ether-meters for refrigerating-machines | ||
| US150989A (en) * | 1874-05-19 | Improvement in pin and dowel machines | ||
| US169117A (en) * | 1875-10-26 | Improvement in revolution-indicators | ||
| US100488A (en) * | 1870-03-01 | Improved tire-xjfsetting machine | ||
| US886826A (en) * | 1907-12-14 | 1908-05-05 | Reece Button Hole Machine Co | Button-sewing machine. |
| US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4710473A (en) | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
| EP0192658A4 (en) | 1984-07-30 | 1987-07-13 | Salk Inst For Biological Studi | RETROVIRAL GENE TRANSFER VECTORS. |
| US4959314A (en) * | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| JP2604135B2 (ja) | 1986-02-28 | 1997-04-30 | ライオン株式会社 | 口腔骨疾患治療剤 |
| US5266683A (en) * | 1988-04-08 | 1993-11-30 | Stryker Corporation | Osteogenic proteins |
| JPH04502854A (ja) * | 1988-10-24 | 1992-05-28 | カターソン，ブルース | 変形性関節症の初期段階の診断、モニタリングならびに治療の方法および組成物 |
| AU648505B2 (en) | 1989-05-19 | 1994-04-28 | Amgen, Inc. | Metalloproteinase inhibitor |
| CA2071912C (en) | 1990-11-30 | 2002-10-15 | Hanne Bentz | Use of a bone morphogenetic protein in synergistic combination with tgf-beta for bone repair |
| US5118667A (en) | 1991-05-03 | 1992-06-02 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation |
| CA2068389A1 (en) | 1991-05-13 | 1992-11-14 | Masahiko Sato | Method for inhibiting bone resorption |
| TW318142B (no) * | 1991-06-03 | 1997-10-21 | Mitsubishi Chemicals Co Ltd | |
| MX9204303A (es) | 1991-07-23 | 1993-11-01 | Rhone Poulenc Rorer Int | Factor regulador del crecimiento de osteoclasto. |
| IL99120A0 (en) | 1991-08-07 | 1992-07-15 | Yeda Res & Dev | Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| US5366859A (en) * | 1991-10-31 | 1994-11-22 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | Radioimmunoassay method |
| EP0746609A4 (en) | 1991-12-17 | 1997-12-17 | Genpharm Int | NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES |
| US5447851B1 (en) | 1992-04-02 | 1999-07-06 | Univ Texas System Board Of | Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells |
| US5427954A (en) * | 1992-04-29 | 1995-06-27 | Shriner's Hospitals For Crippled Children | Compositions and methods for detection and treatment of human osteoarthritis |
| ATE188610T1 (de) | 1992-04-30 | 2000-01-15 | Amgen Inc | Methoden zur behandlung von interleukin- 1 und - tumor - nekrose - faktor - verursachten krankheiten |
| US5585479A (en) | 1992-07-24 | 1996-12-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA |
| US5578569A (en) | 1993-03-12 | 1996-11-26 | Tam; Cherk S. | Method of increasing bone growth |
| US5457035A (en) | 1993-07-23 | 1995-10-10 | Immunex Corporation | Cytokine which is a ligand for OX40 |
| CA2171610A1 (en) | 1993-09-14 | 1995-03-23 | Gideon A. Rodan | Cdna encoding a novel human protein tyrosine phosphatase |
| US6268212B1 (en) | 1993-10-18 | 2001-07-31 | Amgen Inc. | Tissue specific transgene expression |
| WO1996000240A1 (fr) * | 1994-06-27 | 1996-01-04 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Nouvelle proteine et procede pour sa fabrication |
| AU4440496A (en) | 1995-02-10 | 1996-08-22 | Smithkline Beecham Corporation | Use of src SH2 specific compounds to treat a bone resorption disease |
| US6001349A (en) | 1995-02-22 | 1999-12-14 | Therion Biologics Corporation | Generation of human cytotoxic T-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof |
| US7094564B1 (en) | 1995-03-15 | 2006-08-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| US20030166097A1 (en) | 1995-03-15 | 2003-09-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| WO1996028546A1 (en) * | 1995-03-15 | 1996-09-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| WO1997000318A1 (en) | 1995-06-07 | 1997-01-03 | Osteosa Inc. | Osteoclast growth regulatory factor |
| US5843901A (en) | 1995-06-07 | 1998-12-01 | Advanced Research & Technology Institute | LHRH antagonist peptides |
| WO1997000317A1 (en) | 1995-06-07 | 1997-01-03 | Osteosa Inc. | Osteoclast growth regulatory factor |
| US6613544B1 (en) | 1995-12-22 | 2003-09-02 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| US20030207827A1 (en) | 1995-12-22 | 2003-11-06 | William J. Boyle | Osteoprotegerin |
| US6369027B1 (en) * | 1995-12-22 | 2002-04-09 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| JPH1057071A (ja) | 1996-08-19 | 1998-03-03 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法 |
| US5830850A (en) * | 1996-08-28 | 1998-11-03 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York | Methods for the treatment of bone resorption disorders, including osteoporosis |
| US6242586B1 (en) * | 1996-12-13 | 2001-06-05 | Schering Corporation | Mammalian cell surface antigens: related reagents |
| EP0951546A2 (en) | 1996-12-20 | 1999-10-27 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods of use for osteoclast inhibitory factors |
| EP0951551B9 (en) * | 1996-12-23 | 2012-12-26 | Immunex Corporation | Ligand for receptor activator of nf-kappa b, ligand is member of tnf superfamily |
| US6271349B1 (en) * | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
| NZ332995A (en) | 1997-04-15 | 2000-07-28 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | A protein which binds to osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) |
| US5843678A (en) | 1997-04-16 | 1998-12-01 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin binding proteins |
| US6316408B1 (en) | 1997-04-16 | 2001-11-13 | Amgen Inc. | Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors |
| ES2284203T5 (es) | 1997-04-16 | 2016-03-11 | Amgen Inc. | Proteínas de unión a osteoprotegerina y sus receptores |
| US6656508B2 (en) | 1997-04-17 | 2003-12-02 | Amgen Inc. | Sustained-release alginate gels |
| AU7469998A (en) | 1997-05-01 | 1998-11-24 | Amgen, Inc. | Chimeric opg polypeptides |
| AU7705098A (en) | 1997-05-29 | 1998-12-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like protein 8 |
| HUP0002062A3 (en) | 1997-09-24 | 2002-09-30 | Sankyo Co | Method for diagnosing bone dysbolism |
| US6297022B1 (en) * | 1997-10-08 | 2001-10-02 | Smithkline Beecham Corporation | Method of identifying agonists and antagonists for tumor necrosis related receptor TR1 |
| US6087555A (en) | 1997-10-15 | 2000-07-11 | Amgen Inc. | Mice lacking expression of osteoprotegerin |
| US6790823B1 (en) | 1998-04-23 | 2004-09-14 | Amgen Inc. | Compositions and methods for the prevention and treatment of cardiovascular diseases |
| CA2328140C (en) | 1998-05-14 | 2012-03-13 | Immunex Corporation | Method of inhibiting osteoclast activity |
| AU755422B2 (en) | 1998-10-28 | 2002-12-12 | Sankyo Company Limited | Remedies for bone metabolic errors |
| AU6078500A (en) | 1999-07-09 | 2001-01-30 | Amgen, Inc. | Combination therapy for conditions leading to bone loss |
| EP1800691A3 (en) | 1999-09-03 | 2007-10-31 | Amgen Inc. | Compositions and methods for the prevention or treatment of cancer and bone loss associated with cancer |
| US20030144187A1 (en) | 1999-09-03 | 2003-07-31 | Colin R. Dunstan | Opg fusion protein compositions and methods |
| US20030103978A1 (en) | 2000-02-23 | 2003-06-05 | Amgen Inc. | Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein |
| DE60235989D1 (de) | 2001-06-26 | 2010-05-27 | Amgen Fremont Inc | Antikörper gegen opgl |
| CZ20022231A3 (cs) | 2001-06-29 | 2003-02-12 | Sankyo Company Limited | Komplex skládající se z osteoklastogenezi inhibujícího faktoru a polysacharidu |
| EP1482978A1 (en) | 2002-03-01 | 2004-12-08 | Sankyo Company, Limited | Pharmaceutical composition comprising osteoclastogenesis inhibitory factor |
| EP1963515B1 (en) | 2005-12-23 | 2014-05-28 | Synthetic Genomics, Inc. | Installation of genomes or partial genomes into cells or cell-like systems |
-
1996
- 1996-02-19 IL IL11717596A patent/IL117175A/xx active IP Right Review Request
- 1996-02-20 AU AU46773/96A patent/AU702557C/en not_active Revoked
- 1996-02-20 DE DE69633225T patent/DE69633225T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 ES ES96902484T patent/ES2227579T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 EP EP04076464A patent/EP1528103B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 PT PT96902484T patent/PT816380E/pt unknown
- 1996-02-20 WO PCT/JP1996/000374 patent/WO1996026217A1/ja active IP Right Grant
- 1996-02-20 AT AT96902484T patent/ATE274580T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 EP EP96902484A patent/EP0816380B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 RU RU2002120050A patent/RU2238948C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 NZ NZ301362A patent/NZ301362A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 CN CNB96192019XA patent/CN1218961C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 AT AT04076464T patent/ATE391178T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 DE DE69637486T patent/DE69637486D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 CA CA002213469A patent/CA2213469A1/en not_active Withdrawn
- 1996-02-20 JP JP52555396A patent/JP3502102B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-20 KR KR1019970705767A patent/KR100381788B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 RU RU97115710/04A patent/RU2194714C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 HU HU9900422A patent/HU224570B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 TW TW085108022A patent/TW538049B/zh active
-
1997
- 1997-08-19 NO NO19973801A patent/NO318898B1/no not_active Application Discontinuation
- 1997-08-20 FI FI973402A patent/FI973402A/fi unknown
- 1997-08-20 MX MX9706341A patent/MX9706341A/es not_active IP Right Cessation
- 1997-08-20 US US08/915,004 patent/US7125686B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-04-17 US US09/062,113 patent/US7205397B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-09-03 US US10/232,858 patent/US6855808B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-02-25 US US10/785,109 patent/US20040142426A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-25 US US10/785,114 patent/US7276344B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-31 US US10/929,958 patent/US20050014229A1/en not_active Abandoned
- 2004-08-31 US US10/929,748 patent/US7468268B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-03 US US10/979,654 patent/US20050124054A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-03 US US10/979,303 patent/US20050118682A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO318898B1 (no) | OCIF-proteiner, fremgangsmate for fremstilling av dem, cDNA som koder for dem, OCIF variant-, mutant- og trunkert OCIF-cDNA, OCIF-variant-, mutant-, og trunkert OCIF-protein, genomisk OCIF-DNA, farmasoytisk preparat omfattende OCIF-protein, variant, mutant og trunkert OCIF-protein, antistoff mot disse, anvendelse av disse for fremstilling av medikament, fremgangsmate for bestemmelse av konsentrasjon av OCIF, vektor med insatt OCIF-cDNA, vertscelle inneholdende vektoren og transformert E. coli-stamme. | |
| US6919434B1 (en) | Monoclonal antibodies that bind OCIF | |
| CA2210724A1 (en) | Human interleukin-1 receptor accessory protein | |
| IE913034A1 (en) | New insulin-like growth factor binding protein (igfbp-5) | |
| WO1992003470A1 (en) | Genetic material encoding igfbp-5 | |
| US5212074A (en) | Genetic material encoding new insulin-like growth factor binding protein igfbp-6 | |
| US5872220A (en) | Antibodies to insulin-like growth factor binding protein IGFBP-6 | |
| US5972702A (en) | Osteoclast transporter | |
| EP1487874A1 (en) | Falp proteins | |
| US20030139591A1 (en) | Isolation and use of tissue growth-inducing Frzb protein | |
| JP4025853B2 (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 | |
| JP3793180B2 (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 | |
| WO1998036064A9 (en) | Phosphonate binding proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC2A | Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application |