HU224570B1 - Új fehérjék és eljárások a fehérjék előállítására - Google Patents
Új fehérjék és eljárások a fehérjék előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU224570B1 HU224570B1 HU9900422A HUP9900422A HU224570B1 HU 224570 B1 HU224570 B1 HU 224570B1 HU 9900422 A HU9900422 A HU 9900422A HU P9900422 A HUP9900422 A HU P9900422A HU 224570 B1 HU224570 B1 HU 224570B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- seq
- sequence shown
- cdna
- ocif
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 150
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 138
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 159
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 258
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 111
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 83
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 83
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 53
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 claims description 47
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 claims description 47
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 33
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 17
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 17
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N Alumina Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 37
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 184
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 80
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 76
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 75
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 40
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 39
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 38
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 37
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 30
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 30
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 28
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 25
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 21
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 20
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 19
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 18
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 15
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 15
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 15
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 13
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- -1 1991) Proteins 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical class C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 11
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000007591 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108010032050 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 102100036829 Probable peptidyl-tRNA hydrolase Human genes 0.000 description 5
- 101100327347 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CDD1 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 4
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000716068 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 description 4
- 101100100119 Homo sapiens TNFRSF10C gene Proteins 0.000 description 4
- 101000597785 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Proteins 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 101100121770 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GID8 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100009020 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) dcr1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102220527619 Transmembrane protein with metallophosphoesterase domain_C22S_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 4
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 4
- 102100035284 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 3
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 3
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 3
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 3
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- 102220560970 Flotillin-2_C19S_mutation Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 3
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 3
- 102220483438 LIM domain-binding protein 1_C20S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 102220483439 LIM domain-binding protein 1_C23S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 3
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220527615 Transmembrane protein with metallophosphoesterase domain_C21S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 3
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- MDSUKZSLOATHMH-IUCAKERBSA-N Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C([O-])=O MDSUKZSLOATHMH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N N-L-leucyl-L-valine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 101800004193 Peptide P3 Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-acetylsulfanylacetate Chemical compound CC(=O)SCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPWMTBZSRRLQNJ-VKHMYHEASA-N (3s)-3-aminopiperidine-2,6-dione Chemical compound N[C@H]1CCC(=O)NC1=O NPWMTBZSRRLQNJ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 1,25-dihydroxy vitamin D3 Chemical compound C1([C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=CC=C1C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFRQBZFETXBLTP-RCIYGOBDSA-N 2-[(2e,6e,10e,14e,18e)-3,7,11,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaen-1-yl]-3-methyl-1,4-dihydronaphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 PFRQBZFETXBLTP-RCIYGOBDSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKKDSIYTXTZFAU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 MKKDSIYTXTZFAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000782236 Bothrops leucurus Thrombin-like enzyme leucurobin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 description 1
- WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine hydrochloride Chemical compound Cl.ON WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- SFBODOKJTYAUCM-UHFFFAOYSA-N Ipriflavone Chemical compound C=1C(OC(C)C)=CC=C(C2=O)C=1OC=C2C1=CC=CC=C1 SFBODOKJTYAUCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 238000009013 Lowry's assay Methods 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010068647 P2 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800004191 Peptide P2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940069978 calcium supplement Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960005431 ipriflavone Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000020395 negative regulation of osteoclast differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001599 osteoclastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011224 oxide ceramic Substances 0.000 description 1
- 229910052574 oxide ceramic Inorganic materials 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 238000013001 point bending Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány egy új fehérjére, az osteoclastogenesis inhibíciós faktorra (OCIF) és a fehérje előállítására szolgáló módszerre vonatkozik.
Az emberi csontok állandó jelleggel újjáépülnek a reszorpció és rekonstitúció ismétlődő folyamata által. E folyamatban az osteoblastokat és osteoclastokat olyan sejteknek tekintik, melyek elsősorban felelősek a csont kialakulásáért, illetve a csont reszorpciójáért. A csontmetabolizmus rendellenes folyamata által okozott betegségek közül tipikus az osteoporosis. A tudomány jelenlegi állása szerint a betegséget olyan körülmény váltja ki, melynek során az osteoclastok által végzett csontreszorpció mértéke meghaladja az osteoblastok által végzett csontképzés mértékét, bár meg kell jegyezni, hogy az osteoporosis mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. Az osteoporosis fájdalmat okoz a csontban, és törékennyé teszi azt, ami csonttöréshez vezet. Mivel az osteoporosis növeli az ágyban fekvő idős betegek számát, ez a probléma szociális kérdéssé vált az idős emberek számának növekedtével. Következésképpen a betegség kezeléséhez hatékony gyógyszerek kifejlesztése vált szükségessé. A csonttömeg rendellenes csontmetabolizmus által okozott csökkenését a csontreszorpció gátlásával, a csontképzés növelésével vagy a kiegyensúlyozott metabolizmus javításával lehet meggátolni.
A csontképzést valószínűleg a növekedés, a differenciálódás stimulálása vagy az osteoblastok aktiválása segíti elő. Sok citokint írtak le, melyek osteoblastok növekedését vagy differenciálódását stimulálják, ilyen a fibroblast növekedési faktor (fibroblast growth factor, FGF) (Rodan S. B. etal., Endocrinology vol. 121, p1917, 1987), az inzulin jellegű növekedési faktor-l (insulin-like growth factor-l, IGF-I) (Hock J. M. et al., Endocrinology vol. 122, p254, 1988), az inzulin jellegű növekedési faktor-ll (insulin-like growth factor-ll, IGF-II) (McCarthy T. et al., Endocrinology vol. 124, p301, 1989), az aktivin A (activin A) (Centrella M. et al., Mól, Cell., Bioi. vol. 11, p250, 1991), a vasculotropin (Varonique M. et al., Biochem. Biophis. Rés. Commun. vol. 199, p380, 1994) és a csont morfogenetikus fehérje (boné morphogenetic protein, BMP) (Yamaguchi, A. et al., J. Cell. Bioi. vol. 113, p682, 1991, Sampath T. K. et al., J. Bioi. Chem. vol. 267, p20532, 1992, és Knutsen R. et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun. vol. 194, p1352, 1993).
Másrészt alapos gonddal tanulmányozták azokat a citokineket, melyek az osteoclastok differenciálódását és/vagy kifejlődését gátolják. Azt találták, hogy a β transzformáló növekedési faktor (transforming growth factor-β) (Chenu C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, p5683, 1988) és az interleukin-4 (Kasano K. et al., Bone-Miner., vol. 21, p179, 1993) az osteoclastok differenciálódását gátolják. A kalcitoninról (Bone-Miner., vol. 17, p347, 1992), a makrofág kolóniastimuláló faktorról (Hattersley G. et al., J. Cell. Physiol. Vol. 137, p199, 1988), az interleukin-4-ről (Watanabe, K. et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun. vol. 172, p1035, 1990) és az interferon-y-ról (Gowen M. et al., J. Boné Miner. Rés., vol. 1, p469, 1986) azt találták, hogy az osteoclastok által végzett csontreszorpciót gátolják.
E citokinek hatásos gyógyszerei lehetnek a csonttömegcsökkenésnek a csontképzés stimulálása és/vagy a csontreszorpció gátlása által. Jelenleg folyik az olyan citokinek, mint az inzulin jellegű növekedési faktor-l és a csont morfogenetikus fehérjék klinikai próbája a csontbetegségekben szenvedő betegek kezelése hatékonyságának vizsgálata céljából. Már gyógyszerként használják a kalcitonint az osteoporosis elhárítására és az osteoporosis okozta fájdalmak csökkentésére.
Csontbetegségek kezelésére és a kezelési időszak rövidítésére klinikailag használt gyógyszerek manapság például a dihidroxi-D3-vitamin, a K2-vitamin, a kalcitonin és származékai, a hormonok, mint az ösztradiol, ipriflavon, és kalciumkészítmények. Mivel e gyógyszerek nem biztosítanak kielégítő gyógyászati hatást, új gyógyszerhatóanyagok kifejlesztése szükséges. Mint említettük, a csontmetabolizmus szabályozása a csontreszorpció és csontképzés egyensúlyán alapszik. Ezért - mint az várható volt - a citokineket, melyek az osteoclast differenciálódását és/vagy érését gátolják, csontbetegségek, mint például az osteoporosis kezelésére szolgáló gyógyszerekként fejlesztették ki.
A találmány a továbbiakban közölt ismertetés alapján született. A találmány célja, hogy egyrészt olyan új faktort biztosítson, amelyet osteoclastogenesis inhibíciós faktornak (OCIF) neveznek, másrészt olyan eljárást szolgáltasson, mellyel e faktort hatékonyan lehet előállítani.
A feltalálók osteoclastogenesis inhibíciós faktor után kutattak humán embrionális fibroblast IMR-90 (ATCC CCL186) kondicionált médiumban, és egy új osteoclastogenesis inhibíciós faktort (OCIF) találtak, amely az osteoclastok differenciálódását és/vagy érését gátolja.
A feltalálók kidolgoztak egy eljárást, amellyel az IMR-90 sejteket alumínium-oxid-kerámia-darabkák által biztosított tapadási mátrixon növesztve nagy koncentrációban lehet a fehérjét akkumulálni.
A feltalálók egy hatékony módszert dolgoztak ki arra is, hogy a fehérjét, az OCIF-et az IMR-90 kondicionált médiumból a következő oszlopkromatográfiás módszerek sorozatával izolálják: ioncserélő kromatográfia, heparin-affinitáskromatográfia, Cibacron-kék-affinitáskromatográfia és reverz fázisú kromatográfia.
A feltalálók a tisztított természetes OCIF aminosavsorrendje alapján sikeresen klónoztak egy cDNS-t, amely kódolja ezt a fehérjét. A feltalálók továbbá kifejlesztettek egy eljárást is, amellyel ez a fehérje, amely az osteoclastok differenciálódását gátolja, előállítható. A találmány egy fehérjére vonatkozik, melyet a humán tüdő-flbroblastsejtek állítanak elő, molekulatömege SDS-PAGE módszerrel redukáló körülmények között meghatározva 60 kD, és nem redukáló körülmények között 120 kD, affinitással rendelkezik mind kationcserélő gyantákhoz, mind heparinhoz, osteoclastok differenciálódását és érését gátló aktivitása csökken, ha 10 percen át 70 °C-on vagy 30 percen át 56 °C-on kezeljük, és az osteoclastok differenciálódását és érését gátló aktivitása elvész, ha 10 percen át 90 °C-on kezel2
HU 224 570 Β1 jük. Az OCIF-fehérje aminosavsorrendje, amely a jelen találmányban le van írva, egyértelműen különbözik bármely olyan ismert faktor aminosavsorrendjétől, amely osteoclastformációt gátol.
A találmány kiterjed egy OCIF-fehérje tisztítására vonatkozó eljárásra, mely magában foglal: (1) humánfibroblast-növesztést, (2) az adszorbeált frakció kinyeréséhez a kondicionált médium felhasználását heparinoszlopon, (3) az OCIF-fehérje tisztítását kationcserélő oszlop felhasználásával, (4) az OCIF-fehérje tisztítását heparin-affinitásoszlop felhasználásával, (5) az OCIF-fehérje tisztítását Cibacron-kék-affinitásoszlop felhasználásával, (6) az OCIF-fehérje izolálását reverz fázisú oszlopkromatográfia segítségével. Cibacron-kék-oszlopok készítéséhez szükséges anyagokra példaképpen megemlíthetjük, hogy Cibacron-kék F3GA-t kapcsolunk szintetikus hidrofil polimerből készült hordozóhoz. Az oszlopokat konvencionálisán „kék oszlopoknak” nevezik.
A találmány tárgya egy olyan eljárás is, amellyel az OCIF-fehérjét nagy koncentrációban lehet azáltal akkumulálni, hogy humán fibroblastokat alumínium-oxid-kerámia-darabkákon mint tapadási mátrixon növesztünk.
Továbbá a feltalálók meghatározták az OCIF-ből származó peptidek aminosavsorrendjét, ezekre az aminosavszekvenciákra tervezték a primereket, és megkapták az IMR-90 sejtek cDNS-könyvtárából származó cDNS-fragmenteket, melyek az OCIF-et kódolják.
A jelen találmány szerinti OCIF-fehérjét humán fibroblastsejtek kondicionált médiumából nagy kitermeléssel lehetett izolálni. Az OCIF izolálására szolgáló eljárás fehérjék bioanyagokból történő tisztításának hétköznapi technikáin alapszik, az OCIF-fehérje fizikai és kémiai tulajdonságainak megfelelően. Például a töményítési eljárás mindennapi biokémiai technikákat foglal magában, mint például az ultraszűrés, a liofilizálás és a dialízis. A tisztítási eljárás különféle, fehérje tisztítására szolgáló kromatográfiás technikák kombinációit tartalmazza, mint például az ioncserélő oszlopkromatográfia, az affinitás-oszlopkromatográfia, a gélszűréses oszlopkromatográfia, a hidrofób oszlopkromatográfia, a reverz fázisú oszlopkromatográfia és a prepa ratív gélelektroforézis. Az OCIF-fehérje előállításához használt humán fibroblast előnyösen IMR-90. Az IMR-90 kondicionált médium előállítására szolgáló módszer előnyösen egy olyan eljárás, amely áll a humán embrionális fibroblast IMR-90 sejtek hengerpalackban történő alumínium-oxid-kerámia-darabkákhoz tapasztásából, 5% újszülöttborjú-szérumot tartalmazó DMEM médiumot használva a sejttenyészethez, és a sejtek 7-10 napig tartó, hengerpalackban történő növesztéséből, statikus tenyésztést alkalmazva. Az OCIF-fehérje tisztítási lépései során a pufferhez detergensként előnyösen CHAPS-t, 3-((3-cholamid-opropil)-dimetil-ammonio]-1-propánszulfonátot adtunk.
A jelen találmány szerinti OCIF-fehérjét kezdetben heparinkötő bázikus OCIF-frakcióként lehetett megfigyelni, amikor a tenyészet médiumát heparinoszlopra (heparín Sepharose CL-6B, Pharmacia) vittük, 10 mM-os 7,5-es pH-értékű TRIS-HCI-pufferrel eluáltuk, amely 2 M NaCI-ot tartalmazott, ezután az OCIF-frakciót Qanioncserélő oszlopra (HiLoad-Q/FF, Pharmacia) vittük, és összegyűjtöttük a nem adszorbeálódott frakciókat. Az OCIF-fehérjét úgy tudtuk tisztítani, hogy a kapott OCIF-frakciót Skationcserélő oszlopra (HiLoad-S/FF, Pharmacia), heparinoszlopra (Heparin-5PW, TOSOH), Cibacron-kék-oszlopra (blue-5PW, TOSOH) és reverz fázisú oszlopra (BU-300 C4, Perkin-Elmer) vittük fel, és az anyag az előbb említett tulajdonságok szerint definiálható.
A jelen találmány egy olyan eljárásra is vonatkozik, amely az OCIF-fehérjét kódoló cDNS klónozására szolgál, mely a természetes OCIF-fehérje aminosavsorrendjén alapul, továbbá egy olyan eljárásra, amelynek segítségével olyan rekombináns OCIF-fehérjéhez juthatunk, amely az osteoclastok differenciálódását és/vagy érését gátolja. Az OCIF-fehérjét a jelen találmányban ismertetésre kerülő eljárás szerint tisztítottuk, és endopeptidázzal (például lizil-endopeptidázzal) kezeltük. Az emésztés termékeként keletkező peptidek aminosavsorrendjét meghatároztuk, és az oligonukleotidok keverékét, amelyek az internális aminosavsorrendeket kódolhatják, megszintetizáltuk. PCR-technika (előnyösen RT-PCR, reverz transzkriptáz PCR) segítségével kaptuk meg az OCIF cDNS-fragmentjét, primerekként az előbb említett oligonukleotidok keverékeit használva. Az OCIF-fehérjét kódoló OCIF-cDNS teljes hosszát egy cDNS-könyvtárból klónoztuk, próbaként a kapott OCIF-DNS-fragmentet használva. Egy expressziós vektorba vittük be a teljes kódolórégiót tartalmazó OCIF-cDNS-t. A rekombináns OCIF előállítható a teljes kódolórégiót tartalmazó OCIF-cDNS emlőssejtekben vagy baktériumban történő expresszálásával.
A jelen találmány az OCIF2, OCIF3, OCIF4 és OCIF5 új fehérjékre vonatkozik, melyek az OCIF különböző változatai, és a fent ismertetett aktivitással rendelkeznek. Ezek az OCIF-változatok abból a cDNS-könyvtárból kaphatók, amely hibridizáció segítségével IMR-90 poli-A+RNS-ből készült, próbaként az OCIF-cDNS-fragmentet használva. Mindegyik OCIF-változat cDNS-ét, mely a teljes kódolórégiót tartalmazza, expressziós vektorba vittük be. Mindegyik rekombináns OCIF-változat előállítható mindegyik OCIF-változat teljes kódolórégiót tartalmazó cDNS-ének hagyományos gazdaszervezetekben történő expresszálása által. Mindegyik rekombináns OCIF-változat tisztítható az ebben a találmányban leírt módszer szerint. Mindegyik rekombináns OCIF-változatnak megvan az osteoclastogenesist gátló képessége.
A jelen találmány továbbá OCIF-mutánsokra is vonatkozik. Ezek szubsztitúciós OCIF-mutánsok, melyek esetében egy valószínűsíthetően dimer formában előforduló cisztein szerinre van cserélve, és számos deléciós OCIF mutáns. Az OCIF-cDNS-be polimeráz-láncreakció (polymerase chain reaction, PCR) vagy restrikciós enzimmel történő emésztés segítségével vittük be a szubsztitúciókat és deléciókat. Mindegyik ilyen mutált OCIF-cDNS-t egy vektorba vittük, mely a génexpresszióhoz alkalmas promotert tartalmazott. Az így kapott OCIF-mutáns expressziós vektorok mindegyikét
HU 224 570 Β1 eukarióta sejtekbe, mint például emlőssejtekbe vittük be. Mindegyik OCIF-mutáns megkapható és tisztítható a transzfektált sejtek kondicionált médiumából.
A jelen találmány poliklonális antitestekre is vonatkozik, és ezen antitestek felhasználásával az OCIF koncentrációjának mennyiségi meghatározására szolgáló módszert biztosít.
Antigénekként (immunogénekként) IMR-90 kondicionált médiumból nyerhető természetes OCIF, OCIF-cDNS felhasználásával olyan gazdaszervezetek, mint mikroorganizmusok és eukarióták által termelt rekombináns OCIF, az OCIF aminosavsorrendje alapján tervezett szintetikus peptidek vagy az OCIF részleges emésztése során kapható peptidek alkalmasak. Anti-OCIF poliklonális antitestek nyerhetők alkalmas emlősök antigénnel és szükség esetén immunizálási hatásjavítókkal történő immunizálása és a szérumból a szokásos tisztítási módszerekkel történő tisztítás által. Radioizotópokkal vagy enzimekkel jelölt anti-OCIF poliklonális antitestek használhatók radioimmunoassay(RIA) vagy immunoassay- (EIA) módszerek alkalmazásakor. Ezen assay-módszerek használatával könnyen meghatározható az OCIF koncentrációja biológiai anyagokban, mint például vérben, ascitesben és a sejttenyészet médiumában.
A jelen találmány szerinti antitestek radioimmunoassay-ben (RIA) vagy enzimimmunoassay-ben (EIA) használhatók fel. Ezen assay-módszerek alkalmazásakor könnyen meghatározható az OCIF koncentrációja biológiai anyagokban, mint például vérben és ascitesben.
A jelen találmány továbbá új monoklonális antitesteket szolgáltat, és ezen antitestek felhasználásával az OCIF koncentrációjának mennyiségi meghatározására szolgáló módszert nyújt.
Anti-OCIF monoklonális antitestek előállíthatók a szokásos módszerekkel, antigénként OCIF-et használva. IMR-90 sejtek tenyészetének médiumából natív OCIF nyerhető, és OCIF-cDNS felhasználásával olyan gazdaszervezetek, mint mikroorganizmusok és eukarióták által termelt rekombináns OCIF, antigénekként használhatók. Alternatív megoldásként az OCIF aminosavsorrendje alapján tervezett szintetikus peptidek és az OCIF részleges emésztése során kapható peptidek is használhatók antigénekként. Emlősök antigénnel vagy egy in vitro immunizációs módszerrel történő immunizációja során kapható immunizált limfocitákat fuzionáltattunk emlős myelomasejtekkel abból a célból, hogy hibridómasejtekhez jussunk. A sejtfúzió során kapott hibridóma sejtek közül kiválasztottuk az OCIF-et felismerő antitesteket szekretáló hibridómaklónokat. A kiválasztott hibridómaklónok sejttenyészetéből nyerhetők a kívánt antitestek. Hibridóma preparációjakor az immunizációhoz általában kisméretű állatokat, mint például egereket vagy patkányokat használtunk. Konyhasóoldattal (0,15 M NaCI) megfelelő mértékben hígított OCIF-et használtunk az immunizációhoz, és az állatoknak 2-5 alkalommal minden 2-20 napon intravénásán vagy intraperitoneálisan egy hatásjavítóval adtuk be. Az utolsó immunizáció után három nappal leöltük az immunizált állatokat, kivettük a lépet, és a splenocitákat használtuk immunizált B-limfocitákként.
Az immunizált B-limfocitákkal sejtfúzióra használt egérmyeloma-sejtvonalak közé tartozik például a p3/x63-Ag8, a p3-U1, az NS-1, az MPC-11, az SP-2/0, az F0, a p3*63-Ag8.653 és az S194. Patkány R-210 sejtvonal is használható. Humán B-limfocitákat immunizáltunk egy in vitro immunizációs módszerrel, és humán myeloma-sejtvonallal vagy EB-vírussal transzformált humán B-limfocitákkal fuzionáltuk, melyeket kiindulási sejtvonalakként használtunk a sejtfúzióhoz abból a célból, hogy humán típusú antitestet állítsunk elő.
Az immunizált B-limfociták és a myeloma-sejtvonal sejtfúzióját főként hagyományos módszerekkel végeztük. Például általánosan használt Koehler G. és munkatársai módszere (Natúré 256, 495-497, 1975), továbbá a sejtfúzióhoz egy elektromos pulzust használó módszer is használható. Az immunizált B-limfocitákat és a transzformált B-sejteket a szokásos arányokban keverjük össze, és a sejtfúzióhoz általában egy FBS nélküli, polietilénglikolt tartalmazó sejttenyészet médiumát használtuk. A myeloma-sejtvonalakkal fuzionált B-limfocitákat HAT szelekciós médiumban tenyésztettük, mely FBS-t tartalmazott a hibridóma kiválasztásához.
Anti-OCIF-antitestet termelő hibridóma szűréséhez elsősorban ΕΙΑ-t, plakk-assay-t, Ouchterlonyt vagy agglutinációs assay-t lehet használni. Ezek közül egyszerű és könnyű dolgozni az ΕΙΑ-val, elegendő a pontossága és általánosan használt módszer. Tisztított OCIF-et használva az EIA esetében a kívánt antitest könnyen és pontosan szűrhető. így a kapott hibridómát a sejttenyésztés hagyományos módszereivel növeszthetjük, és szükség esetén raktározáshoz fagyaszthatjuk. Az antitest előállítható mindennapi sejttenyésztési módszerek felhasználásával a hibridóma növesztésével vagy a hibridóma állatokba történő intraperitoneális átültetésével. Az antitest a szokásos tisztítási módszerekkel, mint például sókicsapással, gélszűréssel és affinitáskromatográfiával tisztítható. Az így kapott antitest specifikusan reagál az OCIF-fel, és felhasználható az OCIF koncentrációjának meghatározásához, illetve az OCIF tisztításához. A jelen találmány szerinti antitestek OCIF-epitópokat ismernek fel, és az OCIF felé nagy affinitással rendelkeznek. Ezért felhasználhatók EIA tervezéséhez. Az OCIF koncentrációja biológiai anyagokban, mint például vérben és ascitesben könnyen meghatározható ezen assay-módszer segítségével.
A jelen találmány OCIF-et, mint hatékony összetevőt tartalmazó, csontbetegségek kezelésére használt hatóanyagokat szolgáltat. Patkányok bal mellső lábán idegeltávolítást hajtottunk végre. A sebészeti beavatkozás után 14 napon keresztül naponta végeztünk tesztvegyületekkel való kezelést. Két hét kezelés után az állatokat leöltük, és mellső lábaikat felboncoltuk. Ezt követően hárompontos hajlítási módszerrel vizsgáltuk a csontok mechanikai szilárdságát. Az OCIF dózisfüggő módon megjavította a csont mechanikai szilárdságát.
A találmány szerinti OCIF-fehérje hasznos gyógyszerészeti alapanyag csonttömegcsökkenés, mint az
HU 224 570 Β1 osteoporosis, csontbetegségek, mint a reuma, az osteoarthritis, és multimyelomában a rendellenes csontmetabolizmus kezelésére vagy javítására. Az OCIF-fehérje felhasználható a betegségek immunológiai diagnózisához alapul szolgáló antigénként is. OCIF-fehérjét, mint aktív összetevőt tartalmazó gyógyszerészeti készítményeket dolgoztunk ki, melyek orálisan vagy parenterálisan adhatók. A készítmény a jelen találmány szerinti OCIF-fehérjét, mint hatékony összetevőt tartalmazza, és kockázat nélkül adható embernek és állatoknak. A gyógyszerészeti készítményekre vonatkozó példák injekciókhoz vagy intravénás cseppekhez, végbélkúpokhoz, szaglószervi készítményekhez, nyelv alatt használatos készítményekhez és bőr alatti abszorpcióhoz való tapaszokhoz tartalmaznak kompozíciókat. Az injekcióhoz való gyógyszerészeti készítmény elkészíthető úgy, hogy az OCIF-fehérjéből farmakológiailag hatásos mennyiséget és gyógyszerészetileg elfogadható hordozót keverünk össze. A hordozók olyan szállítók és/vagy aktivátorok, mint például aminosavak, cukrok, cellulózszármazékok, és más szerves és szervetlen vegyületek, melyeket rendszerint az aktív összetevőkhöz adunk. Az injekció készítésekor, amikor az OCIF-fehérjét a hordozókkal és/vagy aktivátorokkal összekeverjük, szükség esetén pH-szabályozót, puffért, stabilizátort, szolubilizálóadalékot stb. adhatunk hozzá.
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábra egy Hiload-S/HP oszlopról származó nyers OCIF-fehérje elúciós mintázatát mutatja (Hiload-Q/FF átmenőfrakció, 3. minta).
A 2. ábra egy blue-5PW oszlopról származó nyers OCIF-fehérje elúciós mintázatát mutatja (heparin-5PW frakció, 5. minta).
A 3. ábra egy reverz fázisú oszlopról származó OCIF-fehérje elúciós mintázatát mutatja (49-50 blue-5PW frakciók).
A 4. ábra az elválasztott OCIF-fehérjék redukáló és nem redukáló körülmények között mért SDS-PAGE vizsgálatának eredményét mutatja.
Az egyes sávok leírása
1. és 4. sáv: molekulatömeg-marker fehérjék,
2. és 5. sáv: a 3. ábra 6-os jelű csúcsának megfelelő OCIF-fehérje,
3. és 6. sáv: a 3. ábra 7-es jelű csúcsának megfelelő OCIF-fehérje.
Az 5. ábra reverz fázisú oszlopra vitt piridiletilált OCIF-fehérje lizil-endopeptidázzal történő emésztésekor kapott peptidek elúciós mintázatát mutatja.
A 6. ábra az elválasztott természetes (n) és rekombináns (r) OCIF-fehérjék nem redukáló körülmények közötti SDS-PAGE vizsgálatának eredményét mutatja. Az rOCIF(E)-t és rOCIF(C)-t 293/EBNA, illetve CHO-sejtekben állítottuk elő.
Az egyes sávok leírása
1. sáv: molekulatömeg-marker fehérjék,
2. sáv: monomer típusú nOCIF-fehérje,
3. sáv: dimer típusú nOCIF-fehérje,
4. sáv: monomer típusú rOCIF(E) fehérje,
5. sáv: dimer típusú rOCIF(E) fehérje,
6. sáv: monomer típusú rOCIF(C) fehérje,
7. sáv: dimer típusú rOCIF(C) fehérje.
A 7. ábra az elválasztott természetes (n) és rekombináns (r) OCIF-fehérjék redukáló körülmények közötti SDS-PAGE vizsgálatának eredményét mutatja. Az rOCIF(E)-t és rOCIF(C)-t 293/EBNA, illetve CHO-sejtekben állítottuk elő.
Az egyes sávok leírása
8. sáv: molekulatömeg-marker fehérjék,
9. sáv: monomer típusú nOCIF-fehérje,
10. sáv: dimer típusú nOCIF-fehérje,
11. sáv: monomer típusú rOCIF(E) fehérje,
12. sáv: dimer típusú rOCIF(E) fehérje,
13. sáv: monomer típusú rOCIF(C) fehérje,
14. sáv: dimer típusú rOCIF(C) fehérje.
A 8. ábra az elválasztott természetes (n) és rekombináns (r) OCIF-fehérjék redukáló körülmények közötti SDS-PAGE vizsgálatának eredményét mutatja, ahol a fehérjék N-kötött cukorláncait eltávolítottuk. Az rOCIF(E) és rOCIF(C) rOCIF-fehérjék, melyeket 293/EBNA, illetve CHO-sejtekben állítottunk elő.
Az egyes sávok leírása
15. sáv: molekulatömeg-marker fehérjék,
16. sáv: monomer típusú nOCIF-fehérje,
17. sáv: dimer típusú nOCIF-fehérje,
18. sáv: monomer típusú rOCIF(E) fehérje,
19. sáv: dimer típusú rOCIF(E) fehérje,
20. sáv: monomer típusú rOCIF(C) fehérje,
21. sáv: dimer típusú rOCIF(C) fehérje.
A 9. ábrán az OCIF és OCIF2 aminosavsorrendjének összehasonlítása látható.
A 10. ábrán az OCIF és OCIF3 aminosavsorrendjének összehasonlítása látható.
A 11. ábrán az OCIF és OCIF4 aminosavsorrendjének összehasonlítása látható.
A 12. ábrán az OCIF és OCIF5 aminosavsorrendjének összehasonlítása látható.
A 13. ábra egy standardgörbét mutat anti-OCIF poliklonális antitesteket alkalmazó EIA által történő OCIF-fehérje-koncentráció meghatározáshoz.
A 14. ábra egy standardgörbét mutat anti-OCIF monoklonális antitesteket alkalmazó EIA által történő OCIF-fehérje-koncentráció meghatározáshoz.
HU 224 570 Β1
A 15. ábra az rOCIF-fehérje osteoporosisra kifejtett hatását mutatja.
A találmányt a továbbiakban példákon keresztül ismertetjük részletesen, az oltalmi kör azonban nem korlátozódik ezekre a példákra.
1. példa
Humán fibroblast IMR-90 kondicionált médium elkészítése
Humán magzattüdő-fibroblast IMR-90 (ATCCCCL186) sejteket növesztettünk alumínium-oxid-kerámia-darabkákon (80 g) (alumínium-oxid: 99,5%, a Toshiba Ceramic K. K. gyártmánya), 5% CS-t és 10 mM HEPES-puffert tartalmazó DMEM médiumban (a Gibco BRL Co. gyártmánya) (500 ml/hengerpalack), 37 °C-on, 5% CO2 jelenlétében, 7-10 napon keresztül, 60 hengerpalackot (490 cm2, 110*171 mm, a Coning Co. gyártmánya) használva, statikus tenyésztést alkalmazva. A kondicionált médiumot arattuk, és a hengerpalackokba frissen készített médiumot adtunk. Egy adag tenyészetből körülbelül 30 liter IMR-90 kondicionált médiumot kaptunk. A kondicionált médiumot 1. mintának jelöltük.
2. példa
Mérési módszer az osteoclastfejlődés inhibeálási aktivitásának meghatározására Az osteoclastfejlődés inhibeálási aktivitásának meghatározását a tartarátrezisztens sav-foszfatáz (tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) aktivitásának meghatározásával végeztük M. Kumegawa és munkatársai (ProteinNucleic AcidEnzyme, vol. 34 p999, 1989), valamint N. Takahashi és munkatársai (Endocrynology, vol. 122, p1373, 1988) módosított módszerei szerint. Röviden, a 17 napos egérből származó csontvelősejteket 10% FBS-t, 2*10~8 M aktivált D3-vitamint és az összes tesztmintát tartalmazó α-ΜΕΜ-ben (GIBCO BRL Co. gyártmánya) szuszpendáltuk, és inokuláltuk 96 lyukat tartalmazó lemezek minden egyes lyukába 3*103 * 5 * * sejt/0,2 ml/lyuk sejtsűrűséggel. A lemezeket 7 napon át 37 °C-on inkubáltuk nedves, 5% CO2-ot tartalmazó környezetben. Úgy folytattuk a tenyésztést, hogy megkezdése után a 3. és 5. napon a régi médiumból 0,16 ml-t ugyanekkora térfogatú friss médiumra cseréltünk. A 7. napon a lemezek foszfáttal puffereit konyhasóoldattal való mosása után a sejteket etanol/aceton (1:1) elegyben 1 percen át, szobahőmérsékleten fixáltuk, és ezután a foszfatázaktivitás mérésével vizsgáltuk az osteoclastfejlődést, mely méréshez egy kitet (Acid Phosphatase, Leucocyte, katalógusszáma 387-A, a Sigma Co. gyártmánya) használtunk. A TRAP pozitív sejtek számának csökkenését értelmeztük OCIF-aktivitásként.
3. példa
Az OCIF tisztítása
i) Heparin Sepharose CL-6B oszlopkromatográfia
0,22 pm-os membránszűrővel (hidrofil Milidisk,
2000 cm2, Millipore Co.) szűrtünk le 90 litert az
IMR-90 kondicionált médiumból (1. minta), és három részre osztottuk. Minden részletet (30 liter) felvittünk egy heparin Sepharose CL-6B oszlopra (5*4,1 cm, Pharmacia Co.), és 0,3 M NaCI-ot tartalmazó, 7,5-es pH-értékű 10 mM TRIS-HCI-oldattal állítottuk be. Az oszlopot egy 7,5 pH-értékű 10 mM TRIS-HCI-oldattal mostuk 500 ml/óra térfogatárammal, majd a heparin Sepharose CL-6B adszorbeált fehérjefrakciót egy 10 mM TRIS-HCI-oldattal eluáltuk, aminek a pH-értéke
7,5 volt, és tartalmazott 2 M NaCI-ot. Ezt a frakciót 2. mintának jelöltük.
ii) HiLoad-Q/FF oszlopkromatográfia
A heparin Sepharose-adszorbeált frakciót (2. minta) egy 7,5 pH-értékű, 10 mM koncentrációjú TRIS-HCI-oldattal szemben dializáltuk, mely oldatot CHAPS-szal egészítettünk ki 0,1% végső koncentrációra, egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk, és utána két részre osztottuk. Mindkét részt anioncserélő oszlopra (HiLoad-Q/FF, 2,6*10 cm, Pharmacia Co.) vittük, melyet 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 7,5-es pH-értékű 50 mM TRIS-HCI-oldattal állítottunk be, hogy nem adszorbeáló frakciót (1000 ml) kapjunk. Ezt a frakciót 3. mintának jelöltük.
iii) HiLoad-S/HP oszlopkromatográfia
A HiLoad-Q nem adszorbeáló frakciót (3. minta) egy kationcserélő oszlopra (HiLoad-S/HP, 2,6*10 cm, Pharmacia Co.) vittük, melyet 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 7,5-es pH-értékű 50 mM TRIS-HCI-oldattal állítottunk be. Az oszlop 50 mM TRIS-HCI, 0,1% CHAPS, pH
7,5 oldattal való mosása után az adszorbeált fehérjét 0-1 M NaCI lineáris gradienssel eluáltuk 8 ml/perc térfogatárammal, 100 percen keresztül, és a frakciókat (12 ml) összegyűjtöttük. Az 1-40 számú frakciókat tízesével összeöntöttük, hogy egy adagot képezzünk belőlük. Mind a 4 adagból 100 μΙ-t vizsgáltunk OCIF-aktivitásra. A 11-30 frakciókban volt megfigyelhető OCIF-aktivitás (mint ahogy azt az 1. ábra mutatja). A nagyobb specifikus aktivitású 21-30 frakciókat összegyűjtöttük, és ezeket 4. mintának jelöltük.
iv) Heparin-5PW affinitás-oszlopkromatográfia
A 21-30 HiLoad frakciókból (4. minta) 120 ml-t hígítottunk 240 ml 7,5-es pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 50 mM TRIS-HCI-oldattal, és heparin-5PW affinitásoszlopra (0,8*7,5 cm, Tosoh Co.) vittük fel, amit
7,5-es pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 50 mM TRIS-HCI-oldattal állítottunk be. Az oszlopot 7,5-es pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 50 mM TRIS-HCI-oldattal mostuk, majd ezután az adszorbeált fehérjét 0-2 M NaCI lineáris gradienssel eluáltuk 0,5 ml/perc térfogatárammal, 60 percen keresztül, és a frakciókat (0,5 ml) összegyűjtöttük. Minden frakcióból kivettünk 50 μΙ-t, hogy OCIF-aktivitásra vizsgáljuk. Az aktivitást mutató frakciókat, melyeket 0,7-1,3 M NaCI-oldattal eluáltunk, összeöntöttük, és ezeket 5. mintának jelöltük.
v) Blue-5PW affinitás-oszlopkromatográfia
Az 5. minta 10 ml-ét 190 ml 7,5 pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 50 mM TRIS-HCI-oldattal hígítottuk, és blue-5PW affinitásoszlopra (0,5*5 cm, Tosoh Co.) vittük fel, melyet 7,5-es pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 50 mM TRIS-HCI-oldattal állítottunk be. Az
HU 224 570 Β1 oszlopot 7,5 pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 50 mM TRIS-HCI-oldattal mostuk, majd ezután az adszorbeált fehérjét 30 ml 0-2 M NaCI lineáris gradienssel eluáltuk 0,5 ml/perc térfogatárammal, és a frakciókat (0,5 ml) összegyűjtöttük. Minden frakcióból 25 μΙ-t felhasználva mértük meg az OCIF-aktivitást. A 49-70-es számú frakciók mutattak OCIF-aktivitást, melyeket 1,0-1,6 M NaCI-oldattal eluáltunk.
vi) Reverz fázisú oszlopkromatográfia A 49-50 frakciók összegyűjtésével kapott blue-5PW frakciót 10 μΙ 25%-os TFA-val megsavanyítottuk, és reverz fázisú C4 oszlopra (BU-300, 2,1*220 mm, Perkin-Elmer-gyártmány) vittük, melyet 0,1% TFA-val és 25% acetonitrillel állítottunk be. Az adszorbeált fehérjét 25-55% acetonitril lineáris gradienssel eluáltuk, 0,2 ml/perc térfogatárammal, 60 percen keresztül, és minden fehérjecsúcsot összegyűjtöttünk (3. ábra). Minden csúcs frakciójából 100 μΙ-t vizsgáltunk OCIF-aktivitásra, a 6 és 7 csúcsok mutattak OCIF-aktivitást. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk meg.
1. táblázat
A reverz fázisú C4 oszlopról eluált minták OCIF-aktivitása
| Minta | Hígítás | |||
| 1/40 | 1/120 | 1/360 | 1/1080 | |
| 6-os csúcs | + + | + + | + | - |
| 7-es csúcs | + + | + | - | - |
(+ + jelentése: az OCIF-aktivitás 80%-nál nagyobb mértékben gátolja az osteoclastfejlődést, + jelentése: az OCIF-aktivitás 30-80% közötti mértékben gátolja az osteoclastfejlődést, és -jelentése: nincs OCIF-aktivitás.)
4. példa
Az OCIF-fehérje molekulatömege Az OCIF-aktivitással rendelkező két fehérjecsúcsot (6 és 7 csúcsok) SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel redukáló és nem redukáló körülmények között vizsgáltuk. Röviden, a két csúcsnak megfelelő frakciók mindegyikéből 20 μΙ-t betöményítettünk vákuumban, és 8-as pH-értékű, 1 mM EDTA-t, 2,5% SDS-t és 0,01% bróm-fenolkéket tartalmazó 1,5 μΙ 10 mM TRIS-HCI-oldatban újra feloldottuk, és egy éjszakán át nem redukáló vagy redukáló (5% 2-merkapto-etanollal) körülmények között 37 °C-on inkubáltuk. Ezután SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel analizáltuk mindkét minta 1 μΙ-ét, melynek során 10-15% akrilamidgél- (Pharmacia Co.) gradienst, valamint egy elektroforéziskészüléket (Fást System, Pharmacia Co.) használtunk. A következő molekulatömeg-marker fehérjéket használtuk a molekulatömeg meghatározásához: foszforiláz b (94 kD), marhaszérum-albumin (67 kD), ovalbumin (43 kD), szénsavanhidráz (30 kD), tripszininhibitor (20,0 kD) és laktalbumin (14,4 kD). Az elektroforézis után a fehérjesávokat a Phast Silver Stain Kit segítségével ezüstfestéssel tettük láthatóvá. Az eredményt a
4. ábrán mutatjuk meg.
A 6-os csúcsnak megfelelő fehérjemintában mind redukáló, mind nem redukáló körülmények között jól láthatóan van egy 60 kD-os fehérjesáv. A 7-es csúcsnak megfelelő fehérjemintában egy 60 kD-os fehérjesáv mutatható ki redukáló körülmények között, és egy 120 kD-os fehérjesáv nem redukáló körülmények között. Ezért a 7-es csúcsnak megfelelő fehérjét tekintettük a 6-os csúcsnak megfelelő fehérje homodimerjének.
5. példa
Az OCIF termostabilitása
Az 51 és 52 blue-5PW frakciókból 20 μΙ-t 7,2-es pH-értékű 10 mM-os foszfáttal puffereit konyhasóoldattal 30 μΙ-re hígítottunk, és 10 percen keresztül 70 °C-on vagy 90 °C-on, illetve 30 percen keresztül 56 °C-on inkubáltuk. A hőkezelt minták OCIF-aktivitását mértük. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók.
2. táblázat
Az OCIF termostabilitása
| Minta | Hígítás | ||
| 1/300 | 1/900 | 1/2700 | |
| Kezeletlen | + + | + | - |
| 70 °C, 10 perc | + | - | - |
| 56 °C, 30 perc | + | - | - |
| 90 °C, 10 perc | - | - | :. |
(+ + jelentése: az OCIF-aktivitás 80%-nál nagyobb mértékben gátolja az osteoclastfejlődést, + jelentése: az OCIF-aktivitás 30-80% közötti mértékben gátolja az osteoclastfejlődést, és -jelentése: nincs OCIF-aktivitás.)
6. példa
Az OCIF-fehérje internális aminosavsorrendje
A blue-5PW minta 51-70-es számú frakciói minden két frakcióját (1 ml) 10 μΙ 25%-os TFA-val megsavanyítottuk, és egy reverz fázisú C4 oszlopra (BU-300, 2,1x220 mm, a Perkin-Elmer Co. gyártmánya) vittük fel, az oszlopot 0,1% TFA-t tartalmazó 25%-os acetonitrillel állítottuk be. Az adszorbeált fehérjét 12 ml 25-55%-os lineáris gradiensű acetonitrillel eluáltuk 0,2 ml/perc térfogatárammal, és a 6-os és 7-es csúcsnak megfelelő fehérjefrakciókat összegyűjtöttük. Mindkét csúcsnak megfelelő fehérjét egy fehérjeszekvenátorra (PROCISE 494, Perkin-Elmer Co.) vittük. Az egyik csúcsnak megfelelő fehérje N-terminális szekvenciáját sem tudtuk meghatározni. Ezért úgy tekintettük, hogy minkét csúcsnak megfelelő fehérje N-terminálisa blokkolt. így ezen fehérjék internális aminosavsorrendjét határoztuk meg.
A 6-os és 7-es csúcsnak megfelelő fehérjét C4-HPLC-vel tisztítottuk, centrifugálással töményítettük, és redukáló körülmények között piridiletiláltuk. Rö7
HU 224 570 Β1 viden, 8,5-es pH-értékű, 100 pg ditiotreitolt, 10 mM EDTA-t, 7 M guanidin-HCI-ot és 1% CHAPS-t tartalmazó 0,5 M TRIS-HCI-oldatból 50 μΙ-t adtunk mindegyik mintához, és a keveréket sötétben, szobahőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk. A keverékek közül mindegyiket megsavanyítottuk 25% TFA-val (0,1% végső koncentrációra), és reverz fázisú C4 oszlopra (BU-300, 2,1*30 mm, Perkin-Elmer Co.) vittük fel, az oszlopot 0,1% TFA-t tartalmazó 20%-os acetonitrillel állítottuk be. A piridiletilált OCIF-fehérjét 9 ml 20-50% acetonitril lineáris gradienssel eluáltuk 0,3 ml/perc térfogatárammal, és mindegyik fehérjecsúcsot összegyűjtöttük. A piridiletilált OCIF-fehérjét vákuumban töményítettük, és 25 μΙ, 9-es pH-értékű, 8 M karbamidot és 0,1% Tween 80-at tartalmazó 0,1 M TRIS-HCI-oldatban feloldottuk. 73 μΙ 9-es pH-értékű 0,1 M TRIS-HCI-oldatot és 0,02 pg lizil-endopeptidázt (Wako Pure Chemical, Japán) adtunk a kémcsőbe, és 15 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Mindegyik emésztvényt 1 pl 25%-os TFA-val megsavanyítottuk, ezután felvittük egy reverz fázisú C8 oszlopra (RP-300, 2,1*220 mm, Perkin-Elmer Co.), és az oszlopot 0,1% TFA-val állítottuk be.
A peptidfragmenteket az oszlopról 0-50% acetonitril lineáris gradienssel eluáltuk 0,2 ml/perc térfogatárammal 70 percen át, és mindegyik peptidcsúcsot összegyűjtöttük. Az összes peptidfragmentet (P1-P3) fehérjeszekvenátorra vittük. A peptidek szekvenciáit az 1-3. számú szekvenciákban mutatjuk meg.
7. példa
Az OCIF-cDNS nukleotidszekvenciájának meghatározása
i) A poli-A+RNS izolálása IMR-90 sejtekből
Körülbelül 10 pg poli-A+RNS-t izoláltunk 1*108
IMR-90 sejtből a Fást Track mRNA izoláló kit felhasználásával (Invitrogen), a gyártó útmutatásainak megfelelően.
ii) A kevert primerek előállítása
A következő két kevert prímért két peptid (P2 és P3 peptidek, 2-es, illetve 3-as számú szekvenciák) aminosavsorrendje alapján szintetizáltuk. A 2F számú kevert primerekben az összes oligonukleotid kódolhatja a P2 pepiidben a hatos számú glutamin (Gin) aminosavtól a tizenkettes számú leucin (Leu) aminosavig az aminosavsorrendet. A 3R számú kevert primerekben az összes oligonukleotid kódolhatja a P3 pepiidben a hatos számú hisztidin (His) aminosavtól a tizenkettes számú lizin (Lys) aminosavig az aminosavsorrendet. A 2F és 3R számú kevert primerek szekvenciáit a 3. táblázatban mutatjuk meg.
3. táblázat
| No. 2F | ||
| 5' -CAAGAACAAA | CTTTTCAATT-3' | |
| GGG | C C G C A G |
| No. 3R | ||
| 5'-TTTATACATT | GTAAAAGAAT-3' | |
| C G | C | G GCTG |
| A | C | |
| G | T |
iii) OCIF-cDNS-fragment amplifikálása PCR (polymerase chain reaction, polimeráz-láncreakció) segítségével
Az első cDNS-szálat a Superscript II cDNA synthesis kit (Gibco BRL) és a 7—i) példa alapján kapott 1 pg poli-A+RNS segítségével hoztuk létre, a gyártó útmutatásai alapján. Az OCIF-et kódoló DNS-fragmentet PCR alkalmazásával kaptuk a cDNS-templát és a 7—ii) példában bemutatott primerek felhasználásával.
A PCR-t a következő körülmények között hajtottuk végre:
10X Ex Taq puffer (Takara Shuzo) 5 pl
2,5 mM dNTP-oldat 4 pl cDNS-oldat 1 pl
Ex Taq (Takara Shuzo) 0,25 pl steril desztillált víz 29,75 pl μΜ 2F számú primerek oldata 5 pl μΜ 3R számú primerek oldata 5 pl
A reakció komponenseit egy mikrocentrifugacsöben összekevertük. Egy 3 perces, 95 °C-on végzett kezdeti denaturációs lépést követően 30 ciklusban végeztünk denaturációt 95 °C-on, 30 másodpercen át, hőkezelést 50 °C-on, 30 másodpercen át, és extenciót 70 °C-on, 2 percen át. Az amplifikáció után egy utolsó extenciós lépést végeztünk 70 °C-on, 5 percen át. A PCR termékeinek méretét egy 1,5%-os agarózgél-elektroforézis segítségével határoztuk meg. Egy körülbelül 400 bp nagyságú OCIF-DNS-t kaptunk.
8. példa
PCR által amplifikált OCIF-cDNS-fragment klónozása és DNS-szekvenciájának meghatározása A 7—iii) példában a PCR által amplifikált
OCIF-cDNS fragmentet a pBluescript II SK_ plazmidba vittük be egy DNA ligation kit 2. változat (Takara Shuzo) segítségével Marchuk, D. és munkatársai módszere (Nucleic Acids Rés., vol 19, p1154, 1991) szerint. E. coli DH5 α-t (Gibco BRL) transzformáltunk a ligációs keverékkel. Növesztettük a transzformánsokat, és az OCIF-cDNS-t (körülbelül 400 bp) tartalmazó plazmidot egy általánosan használt módszer segítségével tisztítottuk. Ezt a plazmidot pBSOCIF-nek neveztük el. A pBSOCIF-ben lévő OCIF cDNS-szekvenciáját a Taq Dye Deoxy Terminater Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer) segítségével határoztuk meg. Az OCIF cDNS-mérete 397 bp. Az OCIF-cDNS 132 aminosavat tartalmazó aminosavsorrendet kódol. Az internális peptidek (P2 és P3 peptidek, 2-es, illetve 3-as számú szekvenciák) aminosavsorrendjét, melyeket a primerek tervezéséhez használtunk, a 397 bp hosszú OCIF-cDNS által előre megjósolt 132 aminosavat tartalmazó polipeptid aminosavsorrendjében az N- vagy C-terminális
HU 224 570 Β1 oldalon találtuk. Továbbá a P1 internális peptid (1-es számú szekvencia) aminosavsorrendjét is megtaláltuk a polipeptid előre megjósolt aminosavsorrendjében. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a 397 bp hosszú OCIF-cDNS egy részlete a teljes hosszúságú OCIF-cDNS-nek.
9. példa
A DNS-próba előállítása
A 397 bp hosszú OCIF-cDNS-t a 7—iii) példában leírt körülmények szerint állítottuk elő. Az OCIF-cDNS-t preparatív agarózgél elektroforézisre vittük. Az OCIF-cDNS-t a gélről egy QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk, egy Megaprime DNS-jelölő rendszer (Amersham) felhasználásával [a32P]dCTP-vel jelöltük, és segítségével kiválasztottuk a teljes hosszúságú OCIF-cDNS-t tartalmazó fágot.
10. példa
A cDNS-könyvtár előállítása
A cDNS-t a Great Length cDNA synthesis kit (Clontech), oligo (dT) primer, [a32P]dCTP és 2,5 gg a 7-i) példának megfelelően kapható poli-A+RNS felhasználásával hoztuk létre, a gyártók útmutatásainak megfelelően. A cDNS-hez EcoRI-Sall-Notl adaptert ligáltunk. A cDNS-t elválasztottuk a szabad adaptertól és a nem inkorporálódott szabad [a32P]dCTP-től. A tisztított cDNS-t etanollal kicsaptuk, és 10 gl TE-pufferben [10 mM TRIS-HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA] feloldottuk. Az adapterrel együtt lévő cDNS-t λ ZAP EXPRESS vektorba (Stratagene) vittük be az EcoRI helyen. A cDNS-t tartalmazó rekombináns λ ZAP EXPRESS fág DNS-t in vitro körülmények között csomagoltuk be a Gigapack gold II packaging extract (Stratagene) felhasználásával, és így elkészült a rekombináns λ ZAP EXPRESS fágkönyvtár.
11. példa
Rekombináns fág szűrése
E. coli XL1-Blue MRF’ sejteket (Stratagene) fertőztünk a 10. példa alapján kapott rekombináns fágokkal 37 °C-on, 15 percen keresztül. A fertőzött E. coli-sejteket 50 °C-on 0,7% agart tartalmazó NZY médiumhoz adtuk, és szétterítettük az NZY agarlemezeken. Miután a lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, a plakkot tartalmazó lemezek felszínére Hybond N-t (Amersham) tettünk. A membránokat alkálioldatban denaturáltuk, semlegesítettük, és a standard protokoll szerint 2*SSC-ben mostuk. A fág DNS-t az UV Crosslink (Stratagene) segítségével immobilizáltuk a membránokon. A membránokat 100 gg/ml lazacspermiumDNS-t tartalmazó hibridizációs pufferben (Amersham) inkubáltuk 65 °C-on, 4 órán keresztül, és ezután ugyanebben a pufferben, ami tartalmazott 2*105 cpm/ml denaturált OCIF-DNS-próbát, egy éjszakán át 65 °C-on inkubáltuk. A membránokat minden alkalommal kétszer mostuk 2*SSC-vel, és kétszer 0,1*SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal 65 °C-on, tíz percen át. A pozitív kiónokat a szűrési eljárás kétszeri megismétlésével tisztítottuk. A körülbelül 1,6 kb méretű
DNS-beékelődést tartalmazó tisztított λ ZAP EXPRESS fágklónt az alább ismertetésre kerülő kísérletekben használtuk fel. Ezt a fágot XOCIF-nek neveztük el. Ezután a tisztított XOCIF-fel E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagene) sejteket fertőztünk a λ ZAP EXPRESS cloning kit (Stratagene) protokollja szerint, így elkészült a fertőzött XL1-Blue MRF’ tenyészet táptalaja.
A tisztított XOCIF-fel és az ExAssist segítő fággal (Stratagene) együtt fertőztünk egy E. coli XL1-Blue MRF’ törzset a kithez tartozó protokoll szerint. Az együtt fertőzött XL1-Blue MRF' tenyészet táptalaját egy E. coli XLOR törzs tenyészetéhez (Stratagene) adtuk abból a célból, hogy transzformáljuk őket. így kaptunk egy kanamicinrezisztens transzformánst, mely tartalmaz egy pBKOCIF jelű plazmidot, amely az 1,6 kb nagyságú beékelt fragmentet tartalmazó pBKCMV (Stratagene) vektor.
A körülbelül 1,6 kb nagyságú OCIF-cDNS-t tartalmazó plazmidot magában foglaló transzformánst a kanamicinrezisztens kolóniák összegyűjtésével kaptuk. A plazmidot pBKOCIF-nek neveztük el. A transzformánst „FERM BP-5267” néven pBK/01F10-ként letétbe helyeztük a National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technologynál. A nemzeti letétet (leltári szám: FERM P-14998) 1995. október 25-én nemzetközi letétté alakítottuk a Budapesti Egyezménynek megfelelően. A standard protokoll szerint növesztettük a pBK/01F10 transzformánst és tisztítottuk a pBKOCIF plazmidot.
12. példa
A teljes kódolórégiót tartalmazó OCIF-cDNS nukleotidsorrendjének meghatározása A 11. példában említettek alapján kapott OCIFcDNS nukleotidsorrendjét Taq Dye Deoxy Terminater Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer) felhasználásával határoztuk meg. A felhasznált primerek a T3 és T7 primerek (Stratagene), valamint az OCIF-cDNS szekvenciájának megfelelően tervezett szintetikus primerek voltak. Ezen primerek szekvenciáit a 16-29-es számú szekvenciákban mutatjuk be. Az OCIF-cDNS nukleotidsorrendjét a 6-os számú szekvenciában és a cDNS szekvenciája alapján előre jelzett aminosavsorrendet az 5-ös számú szekvenciában mutatjuk be.
13. példa
Rekombináns OCIF előállítása 293/EBNA sejtek segítségével
i) Plazmid felépítése OCIF-cDNS expresszálásához
A körülbelül 1,6 kb nagyságú OCIF-cDNS-t tartalmazó pBKOCIF-et a 11. példában leírtak szerint készítettük el, és BamHI, valamint Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. A beékelt OCIF-cDNS-darabot kivágtuk, agarózgél-elektroforézissel elválasztottuk, és egy QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. A megtisztított OCIF-cDNS-darabot egy DNA ligation kit 2. változat (Takara Shuzo) felhasználásával a
HU 224 570 Β1 pCEP 4 expressziós vektorhoz (Invitrogen) ligáltuk, és BamHI, valamint Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. A ligációs keverékkel E. coli DH5 a (Gibco BRL) sejteket transzformáltunk. A transzformánsokat növesztettük, és az OCIF-cDNS-t (körülbelül 1,6 kb) tartalmazó plazmidot QIAGEN oszlopon (QIAGEN) tisztítottuk. A pCEPOCIF expressziós plazmidot etanollal kicsaptuk, és az alább leírt kísérletekben használt steril desztillált vízben feloldottuk.
ii) OCIF-cDNS tranziens expressziója és biológiai aktivitásának vizsgálata
A 13—i) példa alapján elkészített pCEPOCIF expressziós plazmid segítségével az alább ismertetett módszer szerint rekombináns OCIF-et állítottunk elő. 8*105 293/EBNA sejtet (Invitrogen) inokuláltunk a hat lyukat tartalmazó lemez minden egyes lyukába 10% magzati borjúszérumot (Gibco BRL) tartalmazó IMDM felhasználásával. A sejtek 24 órás inkubációja után eltávolítottuk a tenyészet médiumát, és a sejteket szérummentes IMDM-mel mostuk. A pCEPOCIF expressziós plazmidot és lipofektamint (Gibco BRL) OPTI-MEM-mel (Gibco BRL) hígítottuk és kevertük, és minden egyes lyukba a gyártók utasításai szerint a sejtekhez adtuk. Mindegyik transzfekciónál 3 gg pCEPOCIF-et és 12 gl lipofektamint használtunk. Miután 38 órán keresztül lipofektaminnal és pCEPOCIF-fel inkubáltuk a sejteket, a médiumot 1 ml OPTI-MEM-re cseréltük ki. A transzfektált sejtek 30 perces inkubációja után a kondicionált médiumot arattuk, és biológiai tesztben használtuk fel. Az OCIF biológiai aktivitását az alább leírt módszer alapján vizsgáltuk. 17 napos egerekből származó csontvelősejteket 10% FBS-t, 2χ10-8 M aktivált D3-vitamint és a vizsgálandó mintákat tartalmazó α-ΜΕΜ-ben (a GIBCO BRL Co. gyártmánya) szuszpendáltunk és inokuláltunk, majd 7 napon át 37 °C-on nedves, 5% CO2-ot tartalmazó környezetben növesztettük, mint ahogy ezt a 2. példában ismertettük. Az inkubáció során a 3. és 5. napon mindegyik lyukban 160 gl régi médiumot ugyanekkora térfogatú friss médiumra cseréltünk, amely a vizsgálandó mintát 1x10“® M aktivált D3-vitaminnal és FBS-t tartalmazó α-ΜΕΜ-mel hígítva tartalmazta. A 7. napon, a lyukak foszfáttal puffereit konyhasóoldattal történő mosása után a sejteket 1 percen keresztül etanol/aceton (1:1) oldattal fixáltuk, és ezután az osteoclastfejlődést vizsgáltuk a sav-foszfatáz-aktivitást mérő kit (Acid Phosphatase, Leucocyte, katalógusszáma 387-A, Sigma Co.) segítségével. A TRAP pozitív sejtek számának csökkenését OCIF-aktivitásként értelmeztük. Mindennek az eredménye, hogy a kondicionált médium ugyanakkora OCIF-aktivitást mutatott, mint az IMR-90 kondicionált médiumból származó természetes OCIF-fehérje (4. táblázat).
4. táblázat
293/EBNA kondicionált médium OCIF-aktivitása
| Tenyésztett sejt | Hígítás | ||||||
| 1/20 | 1/40 | 1/80 | 1/160 | 1/320 | 1/640 | 1/1280 | |
| OCIF expressziós vektorral transzfektált | + + | + + | + + | + + | + + | + | - |
| Vektorral transzfektált | - | - | - | - | - | - | - |
| Kezeletlen | - | - | - | - | - | - |
(+ + jelentése: az OCIF-aktivitás 80%-nál nagyobb mértékben gátolja az osteoclastfejlődést, + jelentése: az OCIF-aktivitás 30-80% közötti mértékben gátolja az osteoclastfejlődést, és -jelentése: nincs OCIF-aktivitás.) iii) Rekombináns OCIF-fehérje izolálása 293/EBNA kondicionált médiumból
A 13—ii) példában leírtak szerinti sejttenyésztés során kapott 293/EBNA kondicionált médiumhoz (1,8 I) 0,1% CHAPS-t adtunk, és 0,22 gm-es membránszűrőn (Steribecks GS, Millipore Co.) szűrtük. A kondicionált médiumot 50 ml-es heparin Sepharose CL-6B oszlopra (2,6x10 cm, Pharmacia Co.) vittük, és 10 mM-os,
7,5-es pH-értékű TRIS-HCI-dal állítottuk be. 10 mM-os,
7,5-es pH-értékű TRIS-HCI-dal történő mosás után az adszorbeált fehérjét az oszlopról 0-2 M NaCI lineáris gradienssel eluáltuk 4 ml/perc térfogatárammal, 100 percen keresztül, és a frakciókat (8 ml) összegyűjtöttük. Mindegyik frakcióból 150 μΙ-t felhasználva mértük az OCIF-aktivitást a 2. példában leírt módszer szerint. Kaptunk OCIF aktív frakciót (112 ml), melyet hoz45 závetőlegesen 0,6-1,2 M NaCI-koncentrációnál eluáltunk.
Az aktív frakció 112 ml-ét 7,5-es pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 10 mM TRIS-HCI-oldattal 1000 ml-re hígítottuk, és egy heparin-affinitásoszlopra (heparin-5PW, 0,8x7,5 cm, Tosoh Co.) vittük fel, amit
7,5-es pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 10 mM TRIS-HCI-oldattal állítottunk be. Az oszlop 7,5-es pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 10 mM TRIS-HCI-oldattal történő mosása után az adszorbeált fehérjét az oszlopról 0-2 M NaCI lineáris gradienssel eluáltuk 0,5 ml/perc térfogatárammal 60 percen át, és a frakciókat (0,5 ml) összegyűjtöttük. Minden frakcióból 4 μΙ-t vizsgáltunk redukáló és nem redukáló körülmények között SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, mint ahogy ezt a 4. példában leírtuk. Redukáló körül10
HU 224 570 Β1 mények között az SDS-PAGE-n az rOCIF-fehérje egyetlen sávja volt megfigyelhető a 30-32 frakciókban, 60 kD hozzávetőleges molekulasúllyal; nem redukáló körülmények között az rOCIF-fehérje sávjai 60 kD-os és 120 kD-os formában is megfigyelhetőek voltak a 30-32 frakciókban. A 30-32 elválasztott rOCIF-frakció 293/EBNA-ból származó rekombináns rOCIF-nek mondható [rOCIF(E)]. Lowry módszerével meghatározva 1,5 ml rOCIF(E)-t (535 pg/ml) kaptunk, standard fehérjeként marhaszérum-albumint használva.
14. példa
Rekombináns OCIF előállítása CHO-sejtek felhasználásával
i) Plazmid elkészítése OCIF expresszálásához
1,6 kb OCIF-cDNS-t tartalmazó pBKOCIF-et állítottunk elő a 11. példában leírtak szerint, és Sáli, valamint EcoRV restrikciós enzimekkel emésztettük. Körülbelül
1,4 kb OCIF-cDNS-inzertet választottunk el agarózgél-elektroforézis segítségével, és a gélből QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) felhasználásával tisztítottuk. A pcDL-SR a296 expressziós vektort (Molecular and Cellular Biology, vol. 8, p466, 1988) Pstl és KpnI restrikciós enzimekkel emésztettük. Az expressziós vektor fragment körülbelül 3,4 kb méretű darabját kivágtuk, agarózgél-elektroforézissel elválasztottuk, és a gélből QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. A tisztított OCIF-cDNS-inzert végeit és az expressziós vektor fragmentet DNA blunting kit (Takara Shuzo) segítségével tompítottuk le. A tisztított OCIF-cDNS-inzertet és az expressziós vektor fragmentet DNA ligation kit 2. változat (Takara Shuzo) segítségével ligáltuk. E. coli DH5 a (Gibco BRL) sejteket transzformáltunk a ligációs keverékkel. A pSR a OCIF jelű OCIF expressziós plazmidot tartalmazó transzformánst kaptuk.
ii) Az expressziós plazmid előállítása
A 13—i) példa szerint előállított pSR a OCIF jelű OCIF expressziós plazmidot tartalmazó transzformánst és az egér-DHFR expressziós plazmidot, a WO92/01053-ban leírt pBAdDSV-t tartalmazó transzformánst a standard eljárás szerint növesztettük. Mindkét plazmidot alkálikezeléssel, polietilénglikol-kicsapással és cézium-klorid sűrűséggradiens ultracentrifugálással tisztítottuk Maniatis és munkatársai módszere szerint (Molecular Cloning, 2. kiadás).
iii) A CHOdhFr sejtek adaptálása fehérjementes médiumhoz
CHOdhFr sejteket (ATCC, CRL 9096) növesztettünk 10% magzati borjúszérumot tartalmazó IMDMben. A sejteket EX-CELL 301-hez (JRH Bioscience), és ezután EX-CELL PF CHO-hoz (JRH Bioscience) adaptáltuk a gyártó előírásai szerint.
iv) Az OCIF expressziós plazmid és az egér-DHFR expressziós plazmid transzfekciója CHOdhFr sejtekbe
A 14—iii) példa szerint előállított CHOdhFr sejteket elektroporáció segítségével transzfektáltuk a 14—ii) példa alapján előállított pSR aOCIF és pBAdDSV plazmidokkal.
200 pg pSR aOCIF-et és 20 pg pBAdDSV-t steril körülmények között 10% CG magzati borjúszérumot tartalmazó 0,8 ml IMDM-ben (Gibco BRL) feloldottunk. 2*107 CHOdhFr sejtet szuszpendáltunk e médium 0,8 ml-ében. A sejtszuszpenziót átvittük egy küvettába (Bio Rád), és a sejteket elektroporáció segítségével transzfektáltuk „génpulzáló” (gene pulser, Bio Rád) felhasználásával 360 V-on 960 pF-dal. Az elektroporációval kezelt sejtek szuszpenzióját 10 ml EX-CELL PF-CHO-t tartalmazó T-edényekbe (Sumitomo Bakelité) vittük, és CO2-inkubátorban inkubáltuk 2 napon át. Ezután egy 96 lyukat tartalmazó lemez (Sumitomo Bakelité) minden lyukába inokuláltuk 5000 sejt/lyuk sűrűséggel a transzfektált sejteket, és körülbelül két héten át növesztettük őket. A DHFR-t expresszáló transzformánsokat elválasztottuk, mivel az EX-CELL PF-CHO nem tartalmaz nukleotidokat, és a szülői CHO dhFr sejtvonal ebben a médiumban nem tud nőni. A DHFR-t expresszáló transzformánsok legnagyobb része expresszál OCIF-et, mivel az OCIF expressziós plazmidot tízszer nagyobb mennyiségben használtuk, mint az egér DHFR expressziós plazmidot. Azokat a transzformánsokat, melyek kondicionált médiuma magas OCIF-aktivitással rendelkezett, kiválasztottuk a DHFR-t expresszáló transzformánsok közül a 2. példában leírt módszer szerint. A nagy mennyiségű OCIF-et expresszáló transzformánsokat a hígítás limitálásával klónoztuk. Azokat a kiónokat, melyek kondicionált médiuma magas OCIF-aktivitással rendelkezett, a fent leírtak szerint kiválasztottuk, és megkaptuk a nagy mennyiségű OCIF-et expresszáló 5561 jelű transzformánst.
v) Rekombináns OCIF előállítása
Rekombináns OCIF (rOCIF) előállításához 3 liter
EX-CELL 301 médiumot 3 literes forgóedényben inokuláltunk a klónnal (5561) 1*105 sejt/ml sejtsűrűséggel. Az 5561 jelű sejteket forgóedényben 37 °C-on, 4-5 napon át növesztettük. Amikor az 5561 jelű sejtek koncentrációja elérte az 1*106 sejt/ml értéket, a kondicionált médiumból körülbelül 2,7 litert arattunk le. Ezután körülbelül 2,7 liter EX-CELL 301 médiumot adtunk a forgóedénybe, és ismételten növesztettük az 5561 jelű sejteket. Körülbelül 20 liter kondicionált médiumot arattunk le a három forgóedény felhasználásával.
vi) Rekombináns OCIF-fehérje izolálása
CHO-sejt-kondicionált médiumból
A 14-v) példában leírt CHO-sejt-kondicionált médiumhoz (1,0 liter) 1,0 g CHAPS-t adtunk, és 0,22 pm-es membránszűrővel (Steribecks GS, Millipore Co.) szűrtük. A kondicionált médiumot heparin Sepharose FF oszlopra (2,6*10 cm, Pharmacia Co.) vittük, és 7,5-es pH-értékű, 10 mM TRIS-HCI-oldattal állítottuk be. Az oszlop 7,5 pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 10 mM TRIS-HCI-oldattal történő mosása után az adszorbeált fehérjét az oszlopról 0-2 M NaCI lineáris gradienssel eluáltuk 4 ml/perc térfogatárammal, 100 percen keresztül, és a frakciókat (8 ml) összegyűjtöttük. Minden frakcióból 150 pl-t felhasználva mértük az OCIF-aktivitást a 2. példában leírt módszer szerint. Aktív frakciót (112 ml-t) hozzávetőlegesen 0,6-1,2 M NaCI-oldattal történő eluálás során kaptunk.
HU 224 570 Β1
A 112 ml aktív frakciót 7,5-es pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 10 mM TRIS-HCI-oldattal 1200 ml-re hígítottuk, és affinitásoszlopra (blue-5PW, 0,5*5,0 cm, Tosoh Co.) vittük, melyet 7,5 pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 10 mM TRIS-HCI-oldattal állítottunk be. Az oszlop 7,5 pH-értékű, 0,1% CHAPS-t tartalmazó, 10 mM TRIS-HCI-oldattal történő mosása után az adszorbeált fehérjét az oszlopról 0-3 M NaCI lineáris gradienssel eluáltuk 0,5 ml/perc térfogatárammal, 60 percen át, és a frakciókat (0,5 ml) összegyűjtöttük. Minden frakcióból 4 μΙ-t vizsgáltunk a 4. példában leírtak szerint redukáló és nem redukáló körülmények között SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel. Redukáló körülmények között az SDS-PAGE-n az rOCIF-fehérje egy egyedüli sávja volt megfigyelhető egy látszólagos 60 kD molekulasúllyal a 30-38 frakciókban, nem redukáló körülmények között az rOCIF-fehérje 60 kD és 120 kD látszólagos molekulatömegnek megfelelő sávjai is megfigyelhetők voltak a 30-38 frakciókban. A 30-38 izolált rOCIF-frakciót CHO-sejtekből származó tisztított rekombináns OCIF-nek [rOCIF(C)] mondhatjuk. A 4,5 ml rOCIF(C) Lowry módszerével meghatározva, standard fehérjeként marhaszérum-albumint használva 113 pg/ml volt.
15. példa
Az rOCIF N-terminális aminosavsorrendjének meghatározása
Az izolált rOCIF(E)-ből és rOCIF(C)-ből 3-3 pg-ot poli(vinilidén-difluorid)- (PVDF) membránhoz adszorbeáltuk Prospin (Perkin-Elmer Co.) segítségével. A membránokat 20%-os etanollal mostuk, és az adszorbeált fehérjék N-terminális aminosavszekvenciáit fehérjeszekvenátorral (PROCISE 492, Perkin-Elmer Co.) analizáltuk. Az így meghatározott N-terminális aminosavszekvenciát a 7. számú szekvenciában mutatjuk meg.
Az rOCIF(E) és rOCIF(C) N-terminális aminosava a Met-tól, mint transzlációs kezdőponttól számított 22. glutamin aminosav volt, mint ahogy az az 5. számú szekvenciában látható. A Met-tól a Gln-ig terjedő 21 aminosavat szignálpeptidnek tekintettük. Az IMR-90 kondicionált médiumból izolált OCIF N-terminális aminosavsorrendjét nem tudtuk meghatározni. Következésképpen az OCIF N-terminális glutaminja valószínűleg blokkolt amiatt, hogy a tenyésztés vagy tisztítás során a glutaminból piroglutamin képződött.
16. példa
A rekombináns (r) OCIF és természetes (n) OCIF biológiai aktivitása
i) Patkány/egérszerű csontvelősejtekből történő
D3-vitamin által indukált osteoclastképződés gátlása 10% FBS-t és 2x10-8 M aktivált D3-vitamint (250 ng/ml végső koncentráció) tartalmazó α-MEM oldattal (GIBCO BRL Co.) hígítottuk mind az rOCIF(E)-, mind az nOCIF-mintákat. Mindegyik mintát sorozatosan hígítottuk ugyanazzal a médiummal, és mindegyik hígított mintából 100 μΙ-t adtunk 96 lyukat tartalmazó lemezek mindegyik lyukába. 17 napos egerekből származó csontvelősejteket inokuláltunk 3χ105 sejt/100 μΙ/lyuk sejtsűrűséggel 96 lyukat tartalmazó lemezek mindegyik lyukába, és 7 napon át 37 °C-on növesztettük ezeket nedves, 5%-os CO2-ot tartalmazó környezetben. A hetedik napon fixáltuk a sejteket, és egy sav-foszfatáz-mérő kittel (Acid Phosphatase, Leucocyte, No387-A, Sigma) festettük a 2. példában leírt módszer szerint.
A sav-foszfatáz-aktivitás (TRAP) csökkenését tekintettük OCIF-aktivitásnak. A sav-foszfatáz pozitív sejtek számának csökkenését úgy becsültük meg, hogy a festék pigmentjét feloldottuk, és mértük az abszorbanciát. Részletesebben, 0,1 N NaOH és dimetil-szulfoxid (1:1) keverékéből 100 μΙ-t adtunk mindegyik lyukhoz, és a lyukat ráztuk a festék feloldásához. A festék teljes oldódása után mindegyik lyuknak 590 nm-en mértük az abszorbanciáját, mely értékből kivontuk a 490 nm-en mért abszorbanciát, amihez mikrolemezleolvasót (microplate reader, ImmunoReader NJ-2000, InterMed) használtunk. A mikrolemezleolvasót 0 abszorbanciához igazítottuk, amihez egy olyan lyukat használtunk, mely aktivált D3-vitamin-mentes médiumban növesztett egyrétegű csontvelősejteket tartalmazott. A TRAP-aktivitás csökkenését az OCIF nélkül növesztett csontvelősejteket tartalmazó lyukakból származó feloldott festék kontroll-abszorbanciaértékének (=100%) százalékaként fejeztük ki. Az eredmények az 5. táblázatban láthatók.
5. táblázat
Patkány/egérszerű csontvelősejtekből történő D3-vitamin által indukált osteoclastképződés gátlása
| OCIF-koncentráció (ng/ml) | 250 | 125 | 63 | 31 | 16 | 0 |
| rOCIF(E) | 0 | 0 | 3 | 62 | 80 | 100 |
| nOCIF | 0 | 0 | 27 | 27 | 75 | 100 (%) |
Mind az nOCIF és rOCIF(E) dózistól függően 16 ng/ml vagy magasabb koncentráció esetében gátol- 55 ta az osteoclastképződést.
ii) D3-vitamin által indukált osteoclastképződés gátlása sztrómasejtek és egérlépsejtek kokultúráiban Sztrómasejtek és egérlépsejtek kokultúráiban vizsgáltuk az OCIF D3-vitamin által indukált osteoclastkép- 60 ződésre kifejtett hatását N. Udagawa és munkatársai módszere szerint (Endocrinology, vol. 125, p1805—1813, 1989). Részletesebben, az rOCIF(E)-, rOCIF(C)- és nOCIF-minták mindegyikét 10% FBS-t, 2x1ο-8 M aktivált D3-vitamint és 2*10-7 M dexametazont tartalmazó α-MEM oldattal (GIBCO BRL Co.) sorozatosan hígítottuk, és mindegyik hígított mintából 100 μΙ-t adtunk
HU 224 570 Β1 lyukat tartalmazó „lyuk-mikrolyuk” lemezek minden egyes lyukába. Patkány/egérszerű csontvelőszármazékok sztróma ST2 sejteket (RIKEN Sejtbank, RIKEN Cell. Bank RCB0224); 5*103 sejt/10% FBS-t tartalmazó a-MEM-oldat 100 μΙ-e koncentrációban, és 8 hetes ddy 5 egerekből származó lépsejteket; 1*105 sejt/ugyanazon médium 100 μΙ-e koncentrációban, inokuláltunk 96 lyukat tartalmazó lemezek minden egyes lyukába, és 5 napon keresztül 37 °C-on növesztettük nedves, 5% CO2-ot tartalmazó környezetben. Az 5. napon a sejteket fixáltuk, és a sav-foszfatáz-vizsgálathoz (Acid Phosphatase, Leucocyte, No387-A, Sigma) egy kittel megfestettük őket. A sav-foszfatáz pozitív sejtek számának csökkenését tekintettük OCIF-aktivitásnak. A sav-foszfatáz pozitív sejtek számának csökkenését a 16—i) példában ismertetett módszer alapján becsültük meg. Az eredmények a 6. táblázatban, rOCIF(E) és rOCIF(C); illetve a 7. táblázatban, rOCIF(E) és nOCIF láthatók.
6. táblázat
Osteoclastképződés gátlása sztrómasejtek és egérlépsejtek kokultúráiban
| OCIF-koncentráció (ng/ml) | 50 | 25 | 13 | 6 | 0 |
| rOCIF(E) | 3 | 22 | 83 | 80 | 100 |
| rOCIF(C) | 13 | 19 | 70 | 96 | 100 (%) |
7. táblázat
Osteoclastképződés gátlása sztrómasejtek és egérlépsejtek kokultúráiban
| OCIF-koncentráció (ng/ml) | 250 | 63 | 16 | |
| rOCIF(E) | 7 | 27 | 37 | 100 |
| nOCIF | 13 | 23 | 40 | 100 (%) |
Az nOCIF, rOCIF(E) és rOCIF(C) dózistól függően 6-16 ng/ml vagy magasabb koncentráció esetében gátolta az osteoclastképződést. 30 iii) Patkány/egérszerű csontvelősejtekből történő
PTH-indukált osteoclastképződés gátlása
Az OCIF PTH által indukált osteoclastképződésre kifejtett hatását vizsgáltuk N. Takahashi és munkatársai módszere szerint (Endocrinology, vol. 122, 35 p1373-1382, 1988). Részletesebben, az rOCIF(E)- és nOCIF-minták mindegyikét (125 ng/ml) sorozatosan hígítottuk 10% FBS-t és 2*10~8 M PTH-t tartalmazó α-MEM oldattal (a GIBCO BRL Co. gyártmánya), és mindegyik hígított mintából 100 μΙ-t adtunk a 96 lyukat 40 tartalmazó lemezekhez. 17 napos ddy egerekből származó csontvelősejteket 3*105 sejt/100 μΙ 10% FBS-t tartalmazó α-ΜΕΜ-oldat sejtsűrűséggel inokuláltunk 96 lyukat tartalmazó lemezek minden egyes lyukába, és 5 napon át 37 °C-on növesztettük nedves, 5% CO2-ot tartalmazó környezetben. Az 5. napon 1 percen keresztül etanol/aceton (1:1) eleggyel szobahőmérsékleten fixáltuk a sejteket, és a sav-foszfatáz-vizsgálathoz (Acid Phosphatase, Leucocyte, No387-A, Sigma) egy kittel megfestettük a 2. példában leírt módszer alapján. A sav-foszfatáz pozitív sejtek számának csökkenését tekintettük OCIF-aktivitásnak. A sav-foszfatáz pozitív sejtek számának csökkenését a 16—i) példában ismertetett módszer alapján becsültük meg. Az eredmények a 8. táblázatban láthatók.
8. táblázat
Patkány/egérszerű csontvelősejtekből történő PTH által indukált osteoclastképződés gátlása
| OCIF-koncentráció (ng/ml) | 125 | 63 | 31 | 16 | 8 | 0 |
| rOCIF(E) | 6 | 58 | 58 | 53 | 88 | 100 |
| nOCIF | 18 | 47 | 53 | 56 | 91 | 100 | |
Mind az nOCIF és rOCIF(E) dózistól függően 16 ng/ml vagy magasabb koncentráció esetében gátolta az osteoclastképződést.
iv) IL-11-indukált osteoclastképződés gátlása
Az OCIF IL-11 által indukált osteoclastképződésre kifejtett hatását vizsgáltuk T. Tamura és munkatársai módszere szerint (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, p11 924-11 928, 1993). Részletesebben, az rO55
CIF(E)- és nOCIF-minták mindegyikét sorozatosan hígítottuk 10% FBS-t és 20 ng/ml IL-11-et tartalmazó α-ΜΕΜ-oldattal (GIBCO BRL Co.), és mindegyik hígított mintából 100 μΙ-t adtunk 96 lyukat tartalmazó lemezek minden egyes lyukába. Újszülött egér koponyatető-származék preadipocita MC3T3-G2/PA6 sejteket (RIKEN Sejtbank, RIKEN Cell. Bank RCB1127); 5*103 sejt/10% FBS-t tartalmazó a-MEM-oldat
HU 224 570 Β1
100 μΙ-e koncentrációban, és 8 hetes ddy egerekből származó lépsejteket; 1*105 sejt/ugyanazon médium 100 μΙ-e koncentrációban, inokuláltunk 96 lyukat tartalmazó lemezek minden egyes lyukába, és 5 napon keresztül 37 °C-on növesztettük nedves, 5% C02-ot 5 tartalmazó környezetben. Az 5. napon fixáltuk a sejteket, és a sav-foszfatáz-vizsgálathoz (Acid Phosphatase, Leucocyte, No387-A, Sigma) egy kittel megfestettük. A sav-foszfatáz pozitív sejteket mikroszkóp alatt megszámoltuk, és a sejtszám csökkenését tekintettük OCIF-aktivitásnak. Az eredmények a 9. táblázatban láthatók.
9. táblázat
| OCIF-koncentráció (ng/ml) | 500 | 125 | 31 | 7,8 | 2,0 | 0,5 | 0 |
| nOCIF | 0 | 0 | 1 | 4 | 13 | 49 | 31 |
| rOCIF(E) | 0 | 0 | 1 | 3 | 10 | 37 | 31 |
Mind az nOCIF és rOCIF(E) dózistól függően 2 ng/ml vagy magasabb koncentráció esetében gátolta az osteoclastképződést.
A 4-8. táblázatokban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy az OCIF mind a D3-vitamin, mind a PTH és mind az IL—11 által indukált osteoclastképződést csaknem ugyanakkora dózisban gátolja. Ennek megfelelően az OCIF feltehetően használható különböző típusú csökkent csonttömeggel járó csontrendellenességek kezelésére, amelyeket különböző, csontreszorpciót indukáló anyagok okoznak.
17. példa
Monomer és dimer típusú OCIF izolálása
Mind az rOCIF(E)- és rOCIF(C)-mintákhoz, melyek 100 gg OCIF-fehérjét tartalmaznak, 1/100 térfogatnyi 25%-os trifluor-ecetsavat adtunk, és reverz fázisú oszlopra vittük (PROTEIN-RP, 2,0*250 mm YMC Co.), és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 30%-os acetonitrillel állítottuk be. Az OCIF-fehérjét az oszlopról 30-55% acetonitril lineáris gradienssel eluáltuk 0,2 ml/perc térfogatárammal 50 percen át, és mindegyik OCIF-csúcsot összegyűjtöttük. Mind a monomer típusú, mind a dimer típusú OCIF-csúcsnak megfelelő frakciót liofilizáltuk.
18. példa
A rekombináns OCIF molekulatömegének meghatározása
1-1 gg izolált monomer típusú és dimer típusú nOCIF-et a 3—iv) példa szerint reverz fázisú oszlopot használva tisztítottunk, és 1-1 gg-ot a 17. példában ismertetett monomer típusú és dimer típusú rOCIF-ből vákuum alatt koncentráltunk. Mindegyik mintát az SDS-PAGE-hez használatos pufferben inkubáltuk, SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel futtattuk, és a 4. példában leírt módszer szerint a gélen lévő fehérjesávokat ezüsttel festettük. Az elektroforézis eredményét nem redukáló és redukáló körülmények között a 6. és
7. ábrán mutatjuk meg.
Nem redukáló körülmények között egy 60 kD molekulatömegnek megfelelő fehérjesávot figyeltünk meg mindegyik monomer típusú OCIF-mintában, és egy 120 kD molekulatömegnek megfelelő fehérjesávot mindegyik dimer típusú OCIF-mintában. Redukáló körülmények között egy 60 kD molekulatömegnek megfelelő fehérjesávot figyeltünk meg mindegyik monomer típusú OCIF-mintában. Ennek megfelelően az IMR-90 sejtekből származó monomer típusú nOCIF molekulatömege, a 293/EBNA sejtekből származó rOCIF molekulatömege és a CHO-sejtekből származó rOCIF molekulatömege megközelítőleg azonos volt. Az IMR-90 sejtekből származó dimer típusú nOCIF molekulatömege, a 293/EBNA sejtekből származó rOCIF molekulatömege és a CHO-sejtekből származó rOCIF molekulatömege szintén azonos volt.
19. példa
A N-kapcsolt oligoszacharidlánc eltávolítása és a természetes, valamint a rekombináns OCIF molekulatömegének mérése
Mindegyik mintát, melyek 5 gg izolált monomer és dimer típusú nOCIF-et tartalmaztak, a 3—iv) példa alapján reverz fázisú oszlopon tisztítottuk, és mindegyik mintát, melyek 5 gg izolált monomer és dimer típusú rOCIF-et tartalmaztak, a 17. példában leírtak szerint vákuumban koncentráltuk. Mindegyik mintát feloldottuk 50 mM koncentrációjú, 8,6-es pH-értékű, 100 mM 2-merkapto-etanolt tartalmazó 9,5 gl nátrium-foszfátpufferben, melyhez 0,5 gl 250 U/ml N-glikanázt (Seikagaku kogyo Co.) adtunk, és 1 napon át 37 °C-on inkubáltuk. Mindegyik mintához adtunk 10 gl, 8,0 pH-értékű, 2 mM EDTA-t, 5% SDS-t és 0,02% bróm-fenolkéket tartalmazó 20 mM TRIS-HCI-ot, és 5 percen át 100 °C-on melegítettük. Mindegyik mintából 1 μΙ-t vizsgáltunk meg SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, és a gélen lévő fehérjesávokat a 4. példában leírtak alapján ezüsttel festettük. Az elektroforetikus mintázatok a
8. ábrán láthatók.
Redukáló körülmények között az IMR-90 sejtekből származó deglikozilált nOCIF, CHO-sejtekből származó deglikozilált rOCIF és 293/EBNA sejtekből származó deglikozilált rOCIF mindegyikének látszólagos molekulatömege 40 kD volt. Redukáló körülmények között az IMR-90 sejtekből származó kezeletlen nOCIF, 293/EBNA sejtekből származó kezeletlen rOCIF és CHO-sejtekből származó kezeletlen rOCIF mindegyikének látszólagos molekulatömege 60 kD volt. Ennek megfelelően az eredmények azt mutatják, hogy az OCIF-fehérjék N-kapcsolt cukorláncokkal rendelkező glükoproteinek.
HU 224 570 Β1
20. példa
OCIF-cDNS-változatok klónozása és ezek
DNS-szekvenciájának meghatározása
A pBKOCIF plazmidot, amely egy pBKCMV-be (Stratagene) inzertált OCIF-cDNS, a tisztított pozitív fágok közül egyből kaptuk, mint a 10. és 11. példákban. Továbbá a cDNS-könyvtár a 397 bp OCIF-cDNS-próbával történő szűrése során a pBKOCIF-től különböző inzert méretű plazmidot tartalmazó transzformánsokat kaptunk. Növesztettük e plazmidokat tartalmazó transzformánsokat, és a plazmidokat a standard eljárás szerint tisztítottuk. Mindegyik plazmidban meghatároztuk az inzert DNS-szekvenciáját a Taq Dye Deoxy Terminater Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer) felhasználásával. A felhasznált primerek a T3 és T7 primerek (Stratagene), illetve az OCIF-cDNS nukleotidszekvenciája alapján elkészített szintetikus primerek voltak. Az OCIF-en felül négy OCIF-változat (OCIF2, 3, 4 és 5) van. Az OCIF2 nukleotidszekvenciája a 8. számú szekvenciában látható, és az OCIF2 nukleotidszekvencia alapján előre jelezhető aminosavsorrend a 9. számú szekvenciában látható. Az OCIF3 nukleotidszekvenciája a 10. számú szekvenciában látható, és az OCIF3 nukleotidszekvencia alapján előre jelezhető aminosavsorrend a 11. számú szekvenciában látható. Az OCIF4 nukleotidszekvenciája a 12. számú szekvenciában látható, és az OCIF4 nukleotidszekvencia alapján előre jelezhető aminosavsorrend a 13. számú szekvenciában látható. Az OCIF5 nukleotidszekvenciája a 14. számú szekvenciában látható, és az OCIF5 nukleotidszekvencia alapján előre jelezhető aminosavsorrend a 15. számú szekvenciában látható. Az OCIF-változatok szerkezete a 9-12. ábrákon látható, és az alábbiakban ezeket röviden ismertetjük.
OCIF2
Az OCIF2 cDNS-ben van egy 21 bp nagyságú deléció az OCIF-cDNS (6. számú szekvencia) 265. számú guanin nukleotidjától a 285. számú guanin nukleotidjáig.
Ennek megfelelően az OCIF2-ben van egy 7 aminosavra kiterjedő deléció az OCIF (5. számú szekvencia) 68. számú glutaminsav aminosavától (Glu) a 74. számú glutamin aminosaváig (Gin),
OCIF3
Az OCIF3 cDNS-ben van egy pontmutáció az OCIF-cDNS (6. számú szekvencia) 9. számú nukleotidjánál, ahol a citozin guaninra cserélődött ki.
Ezért az OCIF3-ban van egy mutáció, és az OCIF(5. számú szekvencia) -19. számú aszparagin aminosava (Asn) lizin aminosavra (Lys) van kicserélve. Úgy tűnik, hogy a mutáció a szignálszekvenciában van, és így nincs esszenciális hatása a szekretált OCIF3-ra.
Az OCIF3 cDNS-ben van egy 117 bp hosszúságú deléció az OCIF-cDNS (6. számú szekvencia) 872. számú guanin nukleotidjától a 988. számú citozin nukleotidjáig.
Ennek következtében az OCIF3-ban van egy 39 aminosavra kiterjedő deléció az OCIF (5. számú szekvencia) 270. számú treonin aminosavától (Thr) a 308. számú leucin aminosaváig (Leu).
OCIF4
Az OCIF4 cDNS-ben van két pontmutáció az OCIF-cDNS-hez képest (6. számú szekvencia). Az OCIF-cDNS (6. számú szekvencia) 9. számú citozin nukleotidja guaninra van cserélve, és a 22. számú guanin timinre van cserélve.
Ennek következtében az OCIF4-ben két mutáció van. Az OCIF (5. számú szekvencia) -19. számú aszparagin aminosava (Asn) lizin aminosavra (Lys), és a -14. számú alanin aminosava (Alá) szerinre (Ser) van kicserélve. Úgy tűnik, hogy ezek a mutációk a szignálszekvenciában vannak, és így nincs esszenciális hatásuk a szekretált OCIF4-re.
Az OCIF4 cDNS rendelkezik körülbelül 4 kb DNS-sel, ami az OCIF-gén 2. számú intronja, amely az OCIF-cDNS-ben (6. számú szekvencia) a 400. és 401. számú nukleotidok közé van beékelve. A nyitott leolvasókeret megáll a 2. számú intronban.
Ennek következtében az OCIF4 rendelkezik egy kiegészítő, új aminosavszekvenciával, amely 21 aminosavat tartalmaz az OCIF (5. számú szekvencia) 112. számú alanin aminosava (Alá) után.
OCIF5
Az OCIF5 cDNS-ben van egy pontmutáció az OCIF-cDNS (6. számú szekvencia) 9. számú nukleotidjánál, ahol a citozin guaninra cserélődött.
Ennek következtében az OCIF5-ben van egy mutáció, és az OCIF (5. számú szekvencia) -19. számú aszparagin aminosava (Asn) lizin aminosavra (Lys) cserélődött. Úgy tűnik, hogy a mutáció a szignálszekvenciában van, és így nincs esszenciális hatása a szekretált OCIF5-re. Az OCIF5 cDNS-ben van az OCIF-cDNS (6. számú szekvencia) 400. és 401. számú nukleotidjai között a 2. számú intron hátsó része (körülbelül 1,8 kb). A nyitott leolvasókeret megáll a 2. számú intron hátsó részében.
Ennek megfelelően az OCIF5 rendelkezik egy kiegészítő, új aminosavszekvenciával, amely 12 aminosavat tartalmaz az OCIF (5. számú szekvencia) 112. számú alanin aminosava (Alá) után.
21. példa
OCIF-változatok előállítása
i) OCIF-változatok expresszálásához szolgáló plazmid előállítása
Az OCIF2 vagy OCIF3 cDNS-t tartalmazó plazmidot a 20. példában leírtak szerint kaptuk meg, és pBKOCIF2-nek, illetve pBKOCIF3-nak neveztük el. A pBKOCIF2-t és pBKOCIF3-at BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Az OCIF2- és OCIF3-cDNS-inzerteket agarózgél-elektroforézissel elválasztottuk, és a gélről QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. A megtisztított OCIF2- és OCIF3-cDNS-inzerteket egyenként ligáltuk DNA ligation kit 2. változat (Takara Shuzo) segítségével a pCEP 4 (Invitrogen) expressziós vektorhoz, amelyet BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettünk. A ligációs keverékkel E. coli DH5 α (Gibco BRL) sejteket transzformáltunk.
Az OCIF4 cDNS-t tartalmazó plazmidot a 20. példában leírtak szerint kaptuk, és pBKOCIF4-nek neveztük
HU 224 570 Β1 el. A pBKOCIF4-et Spel és Xhol restrikciós enzimekkel (Takara Shuzo) emésztettük. Az OCIF4-cDNS-inzertet agarózgél-elektroforézissel választottuk el, és a gélről QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. A megtisztított OCIF4-cDNS-inzertet DNA ligation kit 2. változat (Takara Shuzo) segítségével ligáltuk a pCEP 4 (Invitrogen) expressziós vektorhoz, amelyet Nhel és Xhol restrikciós enzimekkel (Takara Shuzo) emésztettünk. A ligációs keverékkel E. coli DH5 a (Gibco BRL) sejteket transzformáltunk.
Az OCIF5 cDNS-t tartalmazó plazmidot a 20. példában leírtak szerint kaptuk, és pBKOCIF5-nek neveztük el. A pBKOCIF5-öt Hindlll restrikciós enzimmel (Takara Shuzo) emésztettük. Az OCIF5-cDNS-inzert kódolórégiójának 5’-részét agarózgél-elektroforézissel választottuk el, és a gélről QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. Az OCIF expressziós plazmidot, a pCEPOCIF-et, amit a 13-i) példa alapján kaptunk, Hindlll restrikciós enzimmel (Takara Shuzo) emésztettük. Az OCIF-cDNS-ben lévő kódolórégió 5’-részét eltávolítottuk. A plazmid maradék részét, amely a pCEP vektort és az OCIF-cDNS kódolórégiójának 3’-részét tartalmazta, pCEPOCIF-3’-nek neveztük el. A pCEPOCIF-3’-t agarózgél-elektroforézissel elválasztottuk, és a gélről QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. Az OCIF5 cDNS Hindlll fragmentet és a pCEPOCIF-3’-t DNA ligation kit 2. változat (Takara Shuzo) segítségével ligáltuk. A ligációs keverékkel E. coli DH5 a (Gibco BRL) sejteket transzformáltunk.
Az így kapott transzformánsokat egy éjszakán át 37 °C-on növesztettük, és az OCIF-változatokat kódoló expressziós plazmidokat (pCEPOCIF2, pCEPOCIF3, PCEPOCIF4 és pCEPOCIF5) QIAGEN oszlopot (QIAGEN) használva tisztítottuk. Ezen OCIF-változatokat kódoló expressziós plazmidokat etanollal kicsaptuk, steril desztillált vízben feloldottuk, és az alább leírt kísérletekben használtuk fel.
ii) OCIF-változatot kódoló cDNS-ek tranziens expressziója és a rekombináns OCIF-változatok biológiai aktivitásának vizsgálata
A 13—ii) példában említett módszer szerint a 21—i) példában leírtak alapján előállított pCEPOCIF2, pCEPOCIF3, pCEPOCIF4 és pCEPOCIF5 expressziós plazmidok felhasználásával állítottunk elő rekombináns OCIF-változatokat. Megvizsgáltuk a rekombináns OCIF-változatok biológiai aktivitását. Az eredmények szerint ezen OCIF-változatok (OCIF2, OCIF3, OCIF4 és OCIF5) gyenge aktivitással rendelkeztek.
22. példa
OCIF-mutánsok előállítása i) Plazmidvektor előállítása OCIF-mutánsokat kódoló cDNS-ek szubklónozásához
A 11. példában leírt plazmidvektor 5 pg-ját BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel (Takara Shuzo) emésztettük. Az így emésztett DNS-t preparatív agarózgél-elektroforézisre vittük. A körülbelül 1,6 kilobázispár (kb) méretű DNS-fragmentet, amely az OCIF teljes kódolószekvenciáját tartalmazta, a gélről QIAEX gélextrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. A tisztított DNS-t 20 pl steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt az oldatot 1. DNS-oldatnak neveztük el. 3 pg pBluescript II SK+-t (Stratagene) emésztettünk BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel (Takara Shuzo). Az így emésztett DNS-t preparatív agarózgél-elektroforézisre vittük. Egy körülbelül 3,0 kb nagyságú DNS-fragmentet a gélről QIAEX DNS-extrakciós kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. A tisztított DNS-t 20 pl steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt az oldatot 2. DNS-oldatnak neveztük el. Összekevertünk 1 μΙ-t a 2. DNS-oldatból, 4 μΙ-t az 1. DNS-oldatból és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat (Takara Shuzo) ligációs pufferéből, és 30 percen át 16 °C-on inkubáltuk. (A ligációs keveréket az alább ismertetett módszer szerint használtuk E. coli transzformálásához.)
Az E. coli transzformálásának a körülményei a következők voltak: 100 pl megfelelő E. coli DH5 a sejtet (GIBCO BRL) és 5 pl ligációs keveréket elegyítettünk steril, 15 ml-es kémcsőben (IWAKI üveg). A kémcsövet 30 percen át jégen tartottuk. 45 másodperces, 42 °C-on végzett inkubáció után 250 pl L-táptalajt (1% Tryptone, 0,5% élesztőkivonat, 1% NaCI) adtunk a sejtekhez. Ezután a sejtszuszpenziót egy órán át 37 °C-on, rázatás közben inkubáltuk. A sejtszuszpenzióból 50 ml-t szélesztettünk L-agar-lemezre, amely 50 pg/ml ampicillint tartalmazott. A lemezt egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk.
A lemezen kinőtt hat kolóniát külön-külön inkubáltuk egy éjszakán keresztül, rázatás közben, 37 °C-on, ml L-táptalajban, mely 50 pg/ml ampicillint tartalmazott. Megvizsgáltuk a kolóniákban lévő plazmidok szerkezetét. Kaptunk egy plazmidot, amelyben a teljes OCIF-cDNS-t tartalmazó 1,6 kb nagyságú DNS-fragment beékelődött a pBluescript II SK+ BamHI és Xhol által emésztett részei közé, ezt pSK+-OCIF-ként neveztük el.
ii) Mutánsok előállítása, melyekben az OCIF egyik
Cys aminosava Ser aminosavra van kicserélve
1. Mutáció bevitele OCIF-cDNS-be
Olyan OCIF-mutánsokat állítottunk elő, amelyekben az OCIF öt, 174, 181, 256, 298 és 379 helyein (4. számú szekvencia) lévő Cys aminosavak Ser aminosavakra vannak cserélve, és amiket OCIF-C19S(174CysSer)-ként, OCIF-C20S(181Cys-Ser)-ként, OCIFC21 S(256Cys-Ser)-ként, OCIF-C22S(298Cys-Ser)-ként és OCIF-C23S(379Cys-Ser)-ként jelöltünk.
A mutánsok előállításához az adott cisztein aminosavat kódoló nukleotidokat kicseréltük a szerin aminosavat kódoló nukleotidokra. A mutagenezist kétlépéses polimeráz-láncreakcióval (PCR) végeztük. A PCR első lépése két reakcióból, a PCR 1-ből és a PCR 2-ből állt.
| 10X Ex Taq puffer (Takara Shuzo) | 10 pl |
| 2,5 mM dNTP-oldat | 8 pl |
| a 11. példában leírt | |
| plazmidvektor (8 ng/ml) | 2 pl |
| steril desztillált víz | 73,5 pl |
| 20 pM primer-1 oldat | 5 pl |
| 100 pM primer-2 oldat | |
| (a mutagenezishez) | 1 Pl |
| Ex Taq (Takara Shuzo) | 0,5 pl |
HU 224 570 Β1
PCR 2 10X Ex Taq puffer
| (Takara Shuzo) | 10 gl |
| 2,5 mM dNTP-oldat | 8 gl |
| a 11. példában leírt | |
| plazmidvektor (8 ng/ml) | 2 gl |
| steril desztillált víz | 73,5 gl |
| 20 gM primer-3 oldat | 5 gl |
| 100 gM primer-4 oldat | |
| (a mutagenezishez) | 1 Ml |
| Ex Taq (Takara Shuzo) | 0,5 gl |
Mindegyik mutációhoz primerek specifikus készletét használtuk, és a többi komponenst változatlanul hagytuk. A 10. táblázatban láthatók azok a primerek, amelyeket a reakciókhoz használtunk. A primerek nukleotidsorrendje a 20., 23., 27. és a 30-40. szekvenciákban látható. A PCR reakciókat a következő körülmények között hajtottuk végre: egy 97 °C-on, 3 percig tartó bevezető denaturációs lépést követően 25 ciklusban, 95 °C-on és 1 percen át denaturáltunk 55 °C-on, 1 percen át temperálva, és 72 °C-on, 3 percen át végezve extenciót. Ezen amplifikációs lépések után elvégeztünk egy utolsó extenciós lépést 70 °C-on, 5 percen keresztül. A PCR-termékek méretének meghatározását a reakcióelegyet felhasználva végeztük agarózgél-elektroforézis segítségével. Az első PCR után a primerfelesleget Amicon microcon (Amicon) felhasználásával távolítottuk el. A PCR-termékeket tartalmazó oldatokat steril desztillált vízzel 50 μΙ végső térfogatra egészítettük ki. Ezen tisztított PCR-termékeket használtuk fel a második PCR-hez (PCR 3).
| 10X Ex Taq puffer (Takara Shuzo) | 10 gl |
| 2,5 mM dNTP-oldat | 8 gl |
| a PCR 1-ből kapott | |
| DNS-fragmentet tartalmazó oldat | 5 gl |
| a PCR 2-ből kapott | |
| DNS-fragmentet tartalmazó oldat | 5 gl |
| steril desztillált víz | 61,5 gl |
| 20 gM primer-1 oldat | 5 gl |
| 20 gM primer-3 oldat | 5 gl |
| Ex Taq (Takara Shuzo) | 0,5 gl |
10. táblázat
| Mutánsok | Primer-1 | Primer-2 | Primer-3 | Primer-4 |
| OCIF-C19S | IF10 | C19SR | IF3 | C19SF |
| OCIF-C20S | IF10 | C20SR | IF3 | C20SF |
| OCIF-C21S | IF10 | C21SR | IF3 | C21SF |
| OCIF-C22S | IF10 | C22SR | IF14 | C22SF |
| OCIF-C23S | IF6 | C23SR | IF14 | C23SF |
A reakciókörülmények pontosan ugyanazok voltak, 35 mint a PCR 1 vagy PCR 2 esetében. A PCR-termékek méretét 1%-os vagy 1,5%-os agarózgél-elektroforézissel határoztuk meg. A DNS-fragmenteket etanollal kicsaptuk, vákuumban megszárítottuk, és 40 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. A C19S, C20S, C21S, 40 C22S és C23S mutációkkal rendelkező DNS-fragmenteket tartalmazó oldatokat A DNS-oldatként, B DNS-oldatként, C DNS-oldatként, D DNS-oldatként és E DNS-oldatként jelöltük.
Az A oldatban (20 gl) lévő DNS-fragmentet Ndel és Sphl restrikciós enzimekkel (Takara Shuzo) emésztettük. Egy körülbelül 400 bázispár (bp) méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből és oldottunk fel 20 gl steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 3. DNS-oldatként. 2 gg pSK+-OCIF-et emésztettünk Ndel és Sphl restrikciós enzimekkel. Egy körülbelül 4,2 kb méretű DNS-fragmentet mostunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kit segítségével, és 20 gl steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 4. DNS-oldatként. Összekever- 55 tünk 2 gl 3. DNS-oldatot, 3 gl 4. DNS-oldatot és 5 gl-t a DNA ligatton kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót.
Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 gl ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-C19S-nek neveztük el.
A B oldatban (20 gl) lévő DNS-fragmentet Ndel és Sphl restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 400 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 gl steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 5. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 gl 5. 45 DNS-oldatot, 3 gl 4. DNS-oldatot és 5 gl-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 gl ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t 50 tartalmazó kiónért. Restrikciós enzim térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-C20S-nek neveztük el.
A C oldatban (20 gl) lévő DNS-fragmentet Ndel és Sphl restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 400 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 gl steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 6. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 gl 6. DNS-oldatot, 3 gl 4. DNS-oldatot és 5 gl-t a DNA ligat60 ion kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtot17
HU 224 570 Β1 tűk a ligációs reakciót. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-C21S-nek neveztük el.
A D oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet Ndel és BstPI restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 600 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 7. DNS-oldatként. 2 μg pSK+-OCIF-et emésztettünk Ndel és BstPI restrikciós enzimekkel. Egy körülbelül 4,0 kb méretű DNS-fragmentet mostunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kit segítségével, és 20 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 8. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 μΙ 7. DNS-oldatot, 3 μΙ 8. DNS-oldatot és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót.
Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért a DNS-szerkezet vizsgálatával, amely plazmid DNS-ben a mutációt tartalmazó (C22S mutáció) 600 bp Ndel-BstPi fragmentet kicseréltük a pSK+-OCIF 600 bp Ndel-BstPI fragmentjére. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIFC22S-nek neveztük el.
Az E oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet BstPI és EcoRV restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 120 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 9. DNS-oldatként. 2 μg pSK+-OCIF-et emésztettünk BstEII és EcoRV restrikciós enzimekkel. Egy körülbelül 4,5 kb méretű DNS-fragmentet mostunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kit segítségével, és 20 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 10. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 μΙ 9. DNS-oldatot, 3 μΙ 10. DNS-oldatot és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációt. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-C23S-nek neveztük el.
2. Vektorok készítése OCIF-mutánsok expresszálásához
A pSK-OCIF-C19S-t, pSK-OCIF-C20S-t, pSKOCIF-C21S-t, pSK-OCIF-C22S-t és pSK-OCIF-C23S-t BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Izoláltuk mindegyik OCIF-mutánst kódoló 1,6 kb BamHl-Xhol DNS-fragmentet, és 20 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk.
A pSK-OCIF-C19S-ből, pSK-OCIF-C20S-ből, pSK-OCIF-C21S-ből, pSK-OCIF-C22S-ből és pSKOCIF-C23S-ből származó 1,6 kb cDNS-fragmenteket tartalmazó DNS-oldatokat C19S DNS-oldatnak, C20S DNS-oldatnak, C21S DNS-oldatnak, C22S DNS-oldatnak és C23S DNS-oldatnak neveztük el. 5 μg pCEP 4 expressziós vektort (Invitrogen) emésztettünk BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel. Egy körülbelül 10 kb nagyságú DNS-fragmentet tisztítottunk meg és oldottunk fel 40 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot pCEP 4 DNS-oldatnak neveztük el. összekevertünk 1 μΙ pCEP 4 DNS-oldatot 6 μΙ DNS-oldattal a C19S DNS-oldat, C20S DNS-oldat, C21S DNS-oldat, C22S DNS-oldat, illetve C23S DNS-oldat valamelyikével és 7 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket (100 μΙ) transzformáltunk mindegyik ligációs keverékből 7 μΙ-rel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmidot tartalmazó kiónokért a DNS-szerkezet vizsgálata segítségével, mely plazmidban egy 1,6 kb nagyságú cDNS-fragment van beékelve a pCEP 4 BamHI és Xhol felismerési helyei közé. A kapott plazmidokat, melyek tartalmazzák az OCIFC19S-t, az OCIF-C20S-t, az OCIF-C21S-t, az OCIF-C22S-t és az OCIF-C23S-t kódoló cDNS-t, pCEP4-OCIF-C19S-nek, pCEP4-OCIF-C20S-nek, pCEP4-OCIF-C21S-nek, pCEP4-OCIF-C22S-nek és pCEP4-OCIF-C23S-nek neveztük el.
ii) Doméndeléciós OCIF-mutánsok előállítása
1. OCIF-cDNS deléciós mutagenezise
OCIF-mutánsok sorozatát állítottuk elő, melyek delécióval rendelkeznek a 2 Thr-tól a 42 Ala-ig, a 43 Pro-tól a 84 Cys-ig, a 85 Glu-tól a 122 Lys-ig, a 123 Arg-tól a 164 Cys-ig, a 177 Asp-tól a 251 Gln-ig és a 252 lle-tól a 326 His-ig (az aminosavak pozíciói a 4. számú szekvenciában láthatók). Ezeket a mutánsokat OCIF-DCR1-nek, OCIF-DCR2-nek, OCIF-DCR3-nak, OCIF-DCR4-nek, OCIF-DDD1-nek és OCIF-DDD2-nek neveztük el. A mutagenezist a 22—ii) példában leírtak szerint kétlépéses PCR reakcióval végeztük el. A reakcióhoz használt primerkészletet a 11. táblázatban mutatjuk meg, a primerek nukleotidsorrendje a 19., 25., 40-53. és 54. szekvenciákban van leírva.
11. táblázat
| Mutánsok | Primer-1 | Primer-2 | Primer-3 | Primer-4 |
| OCIF-DCR1 | XholF | DCR1R | IF2 | DCR1F |
| OCIF-DCR2 | XholF | DCR2R | IF2 | DCR2F |
| OCIF-DCR3 | XholF | DCR3R | IF2 | DCR3F |
HU 224 570 Β1
11. táblázat (folytatás)
| Mutánsok | Primer-1 | Primer-2 | Primer-3 | Primer-4 |
| OCIF-DCR4 | XholF | DCR4R | IF16 | DCR4F |
| OCIF-DDD1 | IF8 | DDD1R | IF14 | DDD1F |
| OCIF-DDD2 | IF8 | DDD2R | IF14 | DDD2F |
A végső PCR-termékeket etanollal kicsaptuk, vákuumban megszárítottuk, és 40 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Az oldatokat, melyek az OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIF-DDD1 és OCIF-DDD2 részleteit kódoló DNS-fragmenteket tartalmazták, F, G, Η, I, J és K DNS-oldatoknak neveztük el.
Az F oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet Ndel és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 500 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kit segítségével és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 11. DNS-oldatként. 2 μg pSK+-OCIF-et emésztettünk Ndel és Xhol restrikciós enzimekkel. Egy körülbelül 4,0 kb méretű DNS-fragmentet mostunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kit segítségével, és 20 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 12. DNS-oldatként. összekevertünk 2 μΙ 11. DNS-oldatot, 3 μΙ 12. DNS-oldatot és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációt. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-DCR1-nek neveztük el.
A G oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet Ndel és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 500 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 13. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 μΙ 13. DNS-oldatot, 3 μ112. DNS-oldatot és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációt. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-DCR2-nek neveztük el.
A H oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet Ndel és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 500 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 14. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 μΙ 14. DNS-oldatot, 3 μ112. DNS-oldatot és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-DCR3-nak neveztük el.
Az I oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet Xhol és Sphl restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 900 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 15. DNS-oldatként. 2 μg pSK+-OCIF-et emésztettünk Xhol és Sphl restrikciós enzimekkel. Egy körülbelül 3,6 kb méretű DNS-fragmentet mostunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kit segítségével, és 20 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 16. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 μ115. DNS-oldatot, 3 μ116. DNS-oldatot és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIFDCR4-nek neveztük el.
A J oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet BstPI és Ndel restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 400 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 17. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 μΙ 17. DNS-oldatot, 3 μΙ 8. DNS-oldatot és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-DDD1-nek neveztük el.
A K oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet Ndel és BstPI restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 400 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 18. DNS-oldatként. Összekevertünk 2 μΙ 18. DNS-oldatot, 3 μΙ 8. DNS-oldatot és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és
HU 224 570 Β1
DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-DDD2-nek neveztük el.
2. Vektorok készítése OCIF-mutánsok expresszálásához
A pSK-OCIF-DCR1, pSK-OCIF-DCR2, pSK-OCIFDCR3, pSK-OCIF-DCR4, pSK-OCIF-DDD1 és pSKOCIF-DDD2 plazmidokat BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Izoláltuk mindegyik OCIF-mutáns teljes kódolószekvenciáját tartalmazó BamHI-Xhol DNS-fragmentet, és feloldottuk 20 pl steril desztillált vízben. Ezeket a DNS-oldatokat, melyek tartalmazzák a pSK-OCIF-DCR1-ből, pSK-OCIF-DCR2-ből, pSK-OCIFDCR3-ból, pSK-OCIF-DCR4-ből, pSK-OCIF-DDD1-ből és pSK-OCIF-DDD2-ből származó BamHI-Xhol fragmenteket, DCR1 DNS-oldatnak, DCR2 DNS-oldatnak, DCR3 DNS-oldatnak, DCR4 DNS-oldatnak, DDD1 DNS-oldatnak és DDD2 DNS-oldatnak neveztük el. 1 μΙ pCEP 4 DNS-oldatot és 6 μΙ-t a DCR1 DNS-oldat, DCR2 DNS-oldat, DCR3 DNS-oldat, DCR4 DNS-oldat, DDD1 DNS-oldat és DDD2 DNS-oldat valamelyikéből összekevertünk 7 μΙ-rel a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciókat. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket (100 μΙ) transzformáltunk mindegyik ligációs keverékből 7 μΙ-rel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk a DNS-szerkezet vizsgálata alapján plazmid DNS-t tartalmazó kiónért, amely plazmid DNS-ben a deléciókkal rendelkező DNS-fragment a pCEP 4 BamHI és Xhol felismerőhelyei közé van beékelve. Az OCIF-DCR1-et, OCIF-DCR2-t, OCIF-DCR3-at, OCIF-DCR4-et, OCIF-DDD1-et és OCIF-DDD2-t kódoló cDNS-eket tartalmazó plazmidokat pCEP4-OCIF-DCR1-nek, pCEP4-OCIF-DCR2-nek, pCEP4-OCIF-DCR3-nak, pCEP4-OCIF-DCR4-nek, pCEP4-OCIF-DDD1-nek és pCEP4-OCIF-DDD2-nek neveztük el.
iii) OCIF előállítása a C-terminális dómén levágásával
OCIF-mutánsok sorozatát állítottuk elő, melyek delécióval rendelkeznek a 379 Cys-től a 380 Leu-ig, a 331 Ser-tői a 380 Leu-ig, a 252 Asp-tól a 380 Leu-ig, a 177 Asp-tól a 380 Leu-ig, a 123 Arg-tól a 380 Leu-ig és a 86 Cys-től a 380 Leu-ig. Az aminosavak pozíciói a 4.
számú szekvenciában láthatók. Ezeket a mutánsokat OCIF-CL-nek, OCIF-CC-nek, OCIF-CDD2-nek, OCIFCDD1-nek, OCIF-CCR4-nek és OCIF-CCR3-nak neveztük el.
Az OCIF-CL előállításához a mutagenezist a 22—ii) példában leírtak szerinti kétlépéses PCR reakcióval végeztük el. A reakcióhoz használt primerkészletet a 12. táblázatban mutatjuk meg. A primerek nukleotidsorrendje a 23., 40., 55. és 56. szekvenciákban van leírva. A PCR végső termékeit etanollal kicsaptuk, vákuumban szárítottuk, és 40 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt a DNS-oldatot elneveztük L oldatnak.
Az L oldatban (20 μΙ) lévő DNS-fragmentet BstPI és EcoRV restrikciós enzimekkel emésztettük. Egy körülbelül 100 bp méretű DNS-fragmentet vontunk ki preparatív agarózgélből QIAEX gélextrakciós kittel és oldottunk fel 20 μΙ steril desztillált vízben. Ezt a DNS-oldatot jelöltük 19. DNS-oldatként. összekevertünk 2 μΙ 19. DNS-oldatot, 3 μ110. DNS-oldatot [22—ii) példában ismertetett] és 5 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciót. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket transzformáltunk 5 μΙ ligációs keverékkel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmid DNS-t tartalmazó kiónért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS-szerkezetet. Az így kapott plazmidot pSK-OCIF-CL-nek neveztük el. OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4 és OCIF-CCR3 előállításához az OCIF-cDNS mutagenezisét egylépéses PCR-rel végeztük.
A PCR reakciók a mutagenezishez OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4 és OCIF-CCR3 előállítása céljából
| 10X Ex Taq puffer (Takara Shuzo) | 10 μΙ |
| 2,5 mM dNTP-oldat | 8 μΙ |
| a 11. példában leírt, teljes OCIF- | |
| cDNS-t tartalmazó plazmidvektor | |
| (8 ng/ml) | 2μΙ |
| steril desztillált víz | 73,5 μΙ |
| 20 μΜ OCIF Xho F primer oldat | 5 μΙ |
| 100 μΜ primer oldat | |
| (a mutagenezishez) | 1μΙ |
| Ex Taq (Takara Shuzo) | 0,5 μΙ |
12. táblázat
| Mutánsok | Primer-1 | Primer-2 | Primer-3 | Primer-4 |
| OCIF-CL | IF6 | CLR | IF14 | Ξ7 |
Mindegyik mutagenezishez specifikus primereket használtunk, és a többi komponenst változatlanul hagytuk.
A mutagenezishez használt primereket a 13. táblázatban mutatjuk meg. Ezek nukleotidszekvenciái az 55 57-61. számú szekvenciákban láthatók. Egy mikrocentrifugacsőben összekevertük mindegyik PCR komponenseit, és a következők szerint végeztük a PCR-t.
A mikrocentrifugacsöveket 3 percen át 97 °C-on kezeltük, és inkubáltuk egymás után 30 másodpercig 60 °C-on, 30 másodpercig 50 °C-on és 3 percen át 70 °C-on. Ezt a háromlépéses inkubációs műveletet 25-ször ismételtük meg, és ezt követően a mikrocentrifugacsöveket 5 percen keresztül 70 °C-on inkubáltuk. Minden mikrocentrifugacsőben lévő reakcióelegyből kivettünk egy kis részletet, és az egyes termékek méretének megállapítása céljából agarózgél-elektroforézissel vizsgáltuk.
A PCR-termékek méretét agarózgélen határoztuk meg. A reakció végeztével a PCR-ekben a primerfeles20
HU 224 570 Β1 leget Amicon microcon (Amicon) segítségével távolítottuk el. A DNS-fragmenteket etanollal kicsaptuk, vákuumban szárítottuk, és 40 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Mindegyik DNS-oldatban a DNS-fragmenteket Xhol és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük. A reakciók lezajlása után a DNS-t etanollal kicsaptuk, vákuumban szárítottuk, és 20 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk.
A CC-delécióval, a CDD2-delécióval, a CDD1-delécióval, a CCR4-delécióval és a CCR3-delécióval rendelkező DNS-fragmenteket tartalmazó oldatokat CC DNS-oldatnak, CDD2 DNS-oldatnak, CDD1 DNS-oldatnak, CCR4 DNS-oldatnak és CCR3 DNS-oldatnak neveztük el.
13. táblázat
| Mutánsok | Primerek a mutagenezishez I |
| OCIF-CC | CC R |
| OCIF-CDD2 | CDD2 R |
| OCIF-CDD1 | CDD1 R |
| OCIF-CCR4 | CCR4 R |
| OCIF-CCR3 | CCR3R |
2. Vektorok készítése OCIF-mutánsok expresszálásához
A pSK-OCIF-CL plazmidot BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Az OCIF-CL teljes kódolószekvenciáját tartalmazó BamHI-Xhol DNS-fragmentet izoláltuk, és 20 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Ezt a DNS-oldatot CL DNS-oldatnak neveztük el. Összekevertünk 1 μΙ pCEP 4 DNS-oldatot, 6 μΙ-t a CL DNS-oldat, a CC DNS-oldat, a CDD2 DNS-oldat, a CDD1 DNS-oldat, a CCR4 DNS-oldat és a CCR3 DNS-oldat valamelyikéből külön-külön és 7 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciókat. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket (100 μί) transzformáltunk mindegyik ligációs keverékből 7 μΙ-rel. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmidot tartalmazó kiónért a DNS-szerkezet vizsgálata által, mely plazmidok rendelkeznek az OCIF-cDNS-ben a szükséges mutációkkal. Mindegyik plazmidba inzertáltunk deléciót tartalmazó OCIF-cDNS-fragmentet a pCEP 4 Xhol és BamHI felismerőhelyei közé. Az OCIFCL-t, az OCIF-CC-t, az OCIF-CDD2-t, az OCIFCDD1-et, az OCIF-CCR4-et és az OCIF-CCR3-at kódoló cDNS-t tartalmazó plazmidokat pCEP4-OCIF-CL-nek, pCEP4-OCIF-CC-nek, pCEP4-OCIF-CDD2-nek, pCEP4-OCIF-CDD1-nek, pCEP4-OCIF-CCR4-nek és pCEP4-OCIF-CCR3-nak neveztük el.
iv) OCIF-mutánsok előállítása a C-terminális dómén levágásával
1. C-terminális levágás bevitele az OCIF-be
C-terminális levágással rendelkező OCIF-mutánsok sorozatát állítottuk elő. Azt az OCIF-mutánst, melyben 10 aminosavat a 371 Glu-tól a 380 Leu-ig 2 aminosavra, Leu-Val-ra cseréltünk, OCIF-CBst-nek neveztük el. Azt az OCIF-mutánst, melyben 83 aminosavat a 298 Cys-től a 380 Leu-ig 3 aminosavra, Ser-LeuAsp-ra cseréltünk, OCIF-CSph-nak neveztük el. Azt az OCIF-mutánst, melyből eltávolítottunk 214 aminosavat a 167 Asn-tól a 380 Leu-ig, OCIF-CBsp-nek neveztük el. Azt az OCIF-mutánst, melyben 319 aminosavat a 62 Asp-tól a 380 Leu-ig 2 aminosavra, Leu-Val-ra cseréltünk, OCIF-CPst-nek neveztük el. Az aminosavak pozícióit a 4. számú szekvenciában mutatjuk meg.
Mindegyik pSK+-OCIF-ből 2 pg-ot emésztettünk a BstPI, Sphl, Pstl (Takara Shuzo) és BspEI (New England Biolabs) restrikciós enzimek valamelyikével, ezt követően fenollal extrakciót és etanollal kicsapást végeztünk. A kicsapott DNS-t 10 μΙ steril desztillált vízben feloldottuk. Mindegyik oldatból 2 μΙ-ben lévő DNS-ek végeit letompítottuk DNA blunting kit segítségével, ezután a végső térfogat 5 μΙ lett. A reakcióelegyhez adtunk 1 pg (1 pl) Amber-kodon-tartalmú Xbal linkért (5’-CTAGTCTAGACTAG-3’) és 6 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből. A ligációs reakciók lezajlása után mindegyik reakcióelegyből 6 μΙ-t használtunk fel E. coli DH5 a sejtek transzformálásához. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmidokat tartalmazó kiónokért. Restrikciósenzim-térképezéssel és DNS-szekvenálással vizsgáltuk a DNS szerkezetét. Az így kapott plazmidokat pSK-OCIF-CBst-nek, pSK-OCIF-CSph-nak, pSK-OCIF-CBsp-nek és pSK-OCIF-CPst-nek neveztük el.
2. Vektorok készítése OCIF-mutánsok expresszálásához
A pSK-OCIF-CBst, pSK-OCIF-CSph, pSK-OCIFCBsp és pSK-OCIF-CPst plazmidokat BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük. Izoláltuk a mindegyik OCIF-mutáns teljes kódolószekvenciáját tartalmazó 1,5 kb nagyságú DNS-fragmentet, és feloldottuk 20 pl steril desztillált vízben. Ezeket a pSK-OCIF-CBst, pSK-OCIF-CSph, pSK-OCIF-CBsp és pSK-OCIF-CPst plazmidokból származó BamHI-Xhol fragmenteket tartalmazó DNS-oldatokat CBst DNS-oldatnak, CSph DNS-oldatnak, CBsp DNS-oldatnak és CPst DNS-oldatnak neveztük. Összekevertünk 1 pl pCEP 4 DNS-oldatot [22—ii) példában ismertetve] és 6 μΙ-t a CBst DNS-oldat, CSph DNS-oldat, CBsp DNS-oldat és CPst DNS-oldat valamelyikéből külön-külön és 7 μΙ-t a DNA ligation kit 2. változat I ligációs pufferéből, és végrehajtottuk a ligációs reakciókat. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket (100 pl) transzformáltunk mindegyik ligációs elegy 7 μΙ-ével. Ampicillinrezisztens transzformánsokra szűrtünk plazmidokat tartalmazó kiónokért a DNS-szerkezet vizsgálata segítségével, mely plazmidba cDNS-fragmentet inzertáltunk a pCEP 4 BamHI és Xhol felismerési helyei közé. Az OCIF-CBst-t, az OCIF-CSph-t, az OCIF-CBsp-t és az OCIF-CPst-t kódoló cDNS-t tartalmazó plazmidokat pCEP4-OCIF-CBst-nek, pCEP4OCIF-CSph-nak, pCEP4-OCIF-CBsp-nek és pCEP4OCIF-CPst-nek neveztük el.
v) Vektorok készítése OCIF-mutánsok expresszálásához
OCIF-mutánsok expressziós vektoraival rendelkező E. coli-klónokat (összesen 21 kiónt) növesztettünk, és a vektorokat QIAGEN oszlopokon (QIAGEN) tisztítottuk. Mindegyik expressziós vektort etanollal kicsaptuk,
HU 224 570 Β1 és alkalmas mennyiségű steril desztillált vízben feloldottuk, és ezeket a következőkben ismertetésre kerülő további műveletekhez használtuk fel.
vi) OCIF-mutánsok cDNS-ének tranziens expressziója és a mutánsok biológiai aktivitása A 22-v) példa alapján előállított expressziós vektorokat felhasználva állítottunk elő OCIF-mutánsokat. A módszer lényegében a 13. példában leírttal egyezett meg. Itt csak a módosított részleteket ismertetjük. Egy 24 lyukat tartalmazó lemezt használtunk a DNS-transzfekcióhoz. 10% magzati marhaszérum-albumint tartalmazó IMDM-ben szuszpendált 2*105 293/EBNA típusú sejtet tettünk a lemez mindegyik lyukába, 1 pg tisztított vektor DNS-t és 4 μΙ lipofektamint használtunk mindegyik transzfekcióhoz. Egy expressziós vektor és lipofektamin OPTI-MEM-ben (GIBCO BRL) készült, 0,5 ml végső térfogattal rendelkező keverékét adtuk a lyukban lévő sejtekhez. Miután a sejteket 37 °C-on, 24 órán át egy CO2-inkubátorban inkubáltuk, a médiumot 0,5 ml Ex-cell 301 médiumra (JSR) cseréltük. A sejteket további 48 órán át inkubáltuk 37 °C-on, CO2-inkubátorban. Összegyűjtöttük a kondicionált médiumot, és in vitro biológiaiaktivitás-assay-hez használtuk fel. Az OCIF-mutánsok cDNS-einek nukleotidszekvenciáit a 83-103. számú szekvenciákban mutatjuk meg. Az OCIF-mutánsok ebből levezethető aminosavszekvenciáit a 62-82. számú szekvenciákban mutatjuk meg. Az in vitro biológiaiaktivitás-assay-t a 13. példában leírtak szerint végeztük el. Mindegyik kondicionált médium antigénkoncentrációját a 24. példában leírtak szerinti ELISA-módszerrel határoztuk meg. A 14. táblázat a mutánsok specifikus aktivitását mutatja a változatlanul hagyott OCIF-hez képest.
14. táblázat
| Mutáns | Aktivitás |
| Változatlanul hagyott OCIF | + + |
| OCIF-C19S | + |
| OCIF-C20S | ± |
| OCIF-C21S | ± |
| OCIF-C22S | + |
| OCIF-C23S | + + |
| OCIF-DCR1 | + |
| OCIF-DCR2 | + |
| OCIF-DCR3 | ± |
| OCIF-DCR4 | ± |
| OCIF-DDD1 | + |
| OCIF-DDD2 | ± |
| OCIF-CL | + + |
| OCIF-CC | + + |
| OCIF-CDD2 | + + |
| OCIF-CDD1 | + |
| OCIF-CCR4 | + |
| OCIF-CCR3 | ± |
| Mutáns | Aktivitás |
| OCIF-CBst | + + |
| OCIF-CSph | + + |
| OCIF-CBsp | + |
| OCIF-CPst | ± |
A + + a változatlanul hagyott OCIF-hez képest több mint 50% relatív aktivitást jelöl, a + 10% és 50% közötti relatív aktivitást jelöl, a ± 10%-nál kisebb relatív aktivitást jelöl, vagy azt, hogy a produkciós szint túl alacsony a pontos biológiai aktivitás meghatározásához.
vii) Western-blot-vizsgálat
Az utolsó kondicionált médiumból 10 μΙ-t használtunk a Western-blot-vizsgálathoz. Összekevertünk 10 μΙ mintát és 10 μΙ SDS-PAGE mintapuffert (0,5 M TRIS-HCI, 20% glicerin, 4% SDS, 20 pg/ml bróm-fenolkék, 6,8-es pH), 3 percen keresztül forraltuk, és nem redukáló körülmények között 10%-os SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáltuk. Az elektroforézis után az elválasztott fehérjéket PVDF membránra (ProBlott®, Perkin-Elmer) biotoltuk félszáraz elektroblotter (BIO-RAD) segítségével. A membránt 37 °C-on torma-peroxidázzal jelölt anti-OCIF antitestekkel inkubáltuk két órán keresztül. A membrán mosása után a jelzett antitestekkel reagáló fehérjesávokat ECL-rendszer (Amersham) segítségével detektáltuk. A változatlanul hagyott OCIF esetében két fehérjesávot észleltünk, egy körülbelül 60 kD és egy körülbelül 120 kD molekulatömegnek megfelelőt. Másrészt szinte kizárólag 60 kD-os fehérjesávokat figyeltünk meg az OCIF-C23S, az OCIF-CL és az OCIF-CC esetében. Hozzávetőlegesen 40 kD-50 kD és 30 kD-40 kD molekulatömegű fehérjesávok voltak megfigyelhetők fősávokként az OCIF-CDD2 és OCIF-CDD1 esetében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 379. számú cisztein felelős a dimerképződésért, mind a monomerek, mind a dimerek megtartják biológiai aktivitásukat, és a 177 Asp aminosavtól a 380 Leu aminosavig terjedő deléció nem szünteti meg az OCIF biológiai aktivitását (az aminosavak helyzete a 4. számú szekvenciában látható).
23. példa
Humán genomiális OCIF-gén izolálása
i) Humán genomiális könyvtár szűrése Egy STRATAGENE-től beszerzett Lambda FIX II vektorban lévő amplifikált humán placenta genomiális könyvtárat szűrtünk humán OCIF-et tartalmazó génre, próbaként humán OCIF-cDNS-t használva. A szűrést lényegében a genomiális könyvtárral együtt érkező útmutató szerint végeztük. A Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekuláris klónozás: Laboratóriumi kézikönyv) című munkában ismertetett alapvető eljárásokat is használtunk fág, E. coli és DNS kezelésekor.
A könyvtárat titráltuk, és 1 *10® pfu mennyiségű fágot kevertünk XL1-Blue MRA E. coli-gazdasejtekkel (Strata22
HU 224 570 Β1 gene), és 20 lemezen (9cmx13cm) szélesztettük ezeket, lemezenként 9 ml felső agarózzal. A lemezeket egy éjszakán át, 37 °C-on inkubáltuk. Hybond-N nejlonmembránok (Amersham) segítségével plakkátvivő membránokat készítettünk. A membránokat szobahőmérsékleten, 1 percig tartó 1,5 M NaCI-ot és 0,5 M NaOH-ot tartalmazó oldatban való denaturálással dolgoztuk fel. A membránokat ezután egymást követő lépésekben semlegesítettük, először mindegyiket beleraktuk egy 1 M TRIS-HCI (7,5-es pH) oldatba egy percre, majd egy 1,5 M NaCI-ot és 0,5 M TRIS-HCI-ot (7,5-es pH) tartalmazó oldatba, szintén egy percre. Ezután a membránokat egy 2*SSC-vel megnedvesített szűrőpapírra vittük. A fág DNS-t a membránokon 1200 pjoule energiájú UV fénnyel fixáltuk egy STRATALINKER UV crosslinker 2400 (STRATAGENE) berendezés segítségével, és a membránokat levegőn szárítottuk. A membránokat Rapid Hybridization pufferbe (azaz gyors hibridizációs puffer, Amersham) mártottuk, és egy órán keresztül 65 °C-on inkubáltuk, majd 32P-vel jelölt cDNS-próbával hibridizáltuk ugyanabban a pufferben egy éjszakán át, 65 °C-on. Az OCIF-cDNS 32P-vel való jelölésével szűrési próbát állítottunk elő, amely művelethez a Megaprime DNA labeling systemet (azaz Megaprime DNS-jelölő rendszer, Amersham) használtuk.
Megközelítőleg 5*105 cpm mennyiségű próbát használtunk a hibridizációs puffer minden ml-éhez. A hibridizáció után a membránokat 2*SSC-ben mostuk öt percen át, szobahőmérsékleten. A membránokat négyszer mostuk 0,1% SDS-t tartalmazó 0,5><SSC-vel, minden alkalommal 20 percen át, 65 °C-on. Az utolsó mosás után a membránokat szárítottuk, és -80 °C-on autoradiográfiás berendezésben vizsgáltuk őket SUPER HR-H X-ray filmmel (FUJI PHOTO FILM Co., Ltd.) és erősítőernyővel. Az autoradiogramok vizsgálata során hat pozitív jelet detektáltunk. Fágtisztítás céljából agardugókat vágtunk ki ezen jeleknek megfelelő régiókból. Mindegyik agardugót 0,5 ml 1 % kloroformot tartalmazó SM-pufferben áztattuk egy éjszakán át fágextrakció céljából. Mindegyik fágot tartalmazó extraktumot SM-pufferrel ezerszeresére hígítottuk, és 1 ml-t vagy 20 ml-t kevertünk E. coli-gazdasejtekkel a fent leírtak szerint. A keveréket agarlemezekre szélesztettük felső agarózzal, mint azt fentebb leírtuk. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, róluk plakkátvivő membránokat készítettünk, előhibridizáltuk, hibridizáltuk, mostuk és autoradiografáltuk őket, mint ahogy azt fent leírtuk. Ezt a fágtisztítási eljárást mind a hat, kezdetben az autoradiogramokon detektált pozitív jel esetében elvégeztük, és addig ismételtük, amíg az agarlemezen minden fágplakk nem hibridizálódott a cDNS-próbával. A tisztítás végeztével mindegyik fágizolátum agardugóját 1% kloroformot tartalmazó SM-pufferbe áztattuk be, és ezeket 4 °C-on tároltuk. A hat független fágizolátumot XOIF3-nak, XOIF8-nak, XOIF9-nek, λΟΙΠ 1-nek, ÁOIF12-nek és XOIF17-nek neveztük el.
ii) Genomiális kiónok vizsgálata restrikciós enzim emésztéssel és Southern-blot-hibridizációval Mindegyik fágizolátumból előállítottunk DNS-t a lemezlizátum-módszerrel (plate lysate method) a Molecular Cloning: A Laboratory Manual alapján. A DNS-t, melyet az egyes fágokból állítottunk elő, restrikciós enzimekkel emésztettük, és az emésztésből származó fragmenteket agarózgélen elválasztottuk. A fragmenteket ezután nejlonmembránokra vittük, és próbaként OCIF-cDNS-t használva Southern-blot-hibridizációt hajtottunk végre. A vizsgálatok eredménye megmutatta, hogy mind a hat fágizolátum egyedi klón. Ezen restrikciós enzimekkel való emésztésből származó fragmentek közül azokat, melyek az OCIF-cDNS-próbával hibridizáltak, az alább leírtak szerint plazmidvektorokba szubklónoztuk, és a nukleotidsorrendjüket analizáltuk, iii) Genomiális kiónokból származó restrikciós fragmentek szubklónozása plazmidvektorokba és a nukleotidszekvencia meghatározása A XOIF8 DNS-t EcoRI és Notl restrikciós enzimekkel emésztettük, és az ezekből származó DNS-fragmenteket 0,7%-os agarózgélen elválasztottuk. Az 5,8 kilobázispár (kb) méretű EcoRI/Notl fragmentet a gélről QIAEX II Gél Extraction Kit (QIAGEN) felhasználásával extraháltuk a gyártó által javasolt eljárás szerint. Az 5,8 kb méretű EcoRI/Notl fragmentet pBluescript II SK+ vektorral (Stratagene) ligáltuk, mely vektort EcoRI és Notl restrikciós enzimekkel linearizáltunk a Ready-To-Go T4 DNA Ligásé (Pharmacia) felhasználásával a gyártó által javasolt eljárás szerint. Megfelelő E. coli DH5 a sejteket (Amersham) transzformáltunk a rekombináns plazmiddal, és a transzformánsokat 50 pg/ml ampicillintartalmú L-lemezeken szűrtük ki. Izoláltunk egy kiónt, mely tartalmazta az 5,8 kb nagyságú EcoRI/Notl fragmentet tartalmazó rekombináns plazmidot, és ezt a plazmidot pBSG8-5.8-nak neveztük el. A pBSG8-5.8-at Hindi11 restrikciós enzimmel emésztettük, és az ebből az emésztésből származó 0,9 kb méretű DNS-fragmentet izoláltuk ugyanazon a módon, mint amit fent említettünk. Ezt a 0,9 kb méretű fragmentet ezután pBluescript II SK- plazmidba klónoztuk a Hindlll helyen, mint ahogy azt fentebb leírtuk. Ezt a 0,9 kb nagyságú Hindlll fragmentet tartalmazó rekombináns plazmidot pBS8H0.9-nek neveztük el.
A XOIF DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel emésztettük, és egy 6 kb nagyságú, egy 3,6 kb nagyságú és egy
2,6 kb nagyságú fragmentet izoláltunk ugyanazon a módon, mint ahogy azt fent leírtuk, és pBluescript II SK+ vektorba klónoztuk az EcoRI helyen úgy, ahogy azt fentebb ismertettük. Ezeket a rekombináns plazmidokat pBSG11-6-nak, pBSG11-3.6-nak és pBSG11-2.6-nak neveztük el. A pBSG11-6 plazmidot Hindlll restrikciós enzimmel emésztettük, és az emésztett elegyet 0,7%-os agarózgélre vittük. Három fragmentet, egy 2,2 kb méretűt, egy 1,1 kb méretűt és egy 1,05 kb méretűt extraháltunk a gélből, és pBluescript II SK- plazmidba klónoztuk ezeket külön-külön a Hindlll helyen, ugyanazon a módon, mint ahogy azt fentebb leírtuk. Ezeket a rekombináns plazmidokat pBS6H2.2-nek, pBS6H1.1-nek és pBS6H1.05-nek neveztük el.
A klónozott genomiális DNS nukleotidsorrendjét ABI Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer) és 373A DNA Sequencing rendszer (Applied Biosystems) felhasználásával hatá23
HU 224 570 Β1 roztuk meg. A pBSG8-5.8, pBS8H0.9, pBSG11-6, pBSG11-3.6, pBSG11-2.6, pBS6H2.2, pBS6H1.1 és pBS6H1.05 plazmidokat a Molecular Cloning: A Laboratory Manual-ban leírtak alapján készítettük az alkatikus-SDS-eljárás szerint, és ezeket használtuk templátokként a DNS-szekvencia vizsgálatakor. A humán OCIF-gén nukleotidszekvenciáját a 104. és 105. szekvenciákban mutattuk be. Nem teljesen határoztuk meg a DNS nukleotidszekvenciáját az 1 és 2 exonok között. Van egy körülbelül 17 kb nagyságú nyúlás a 104. számú és 105. számú szekvenciák között.
24. példa
OCIF kvantitatív meghatározása EIA segítségével
i) Anti-OCIF-antitest előállítása
2,5-3,0 kg tömegű hím JW nyulakat (Kitayama LABES Co., LTD) használtunk immunizálásra ellenszérumok előállításához. Három 2,5-3,0 kg tömegű hím JW nyulat (Kitayama LABES Co., LTD) használtunk az immunizációhoz. Emulziót készítettünk az immunizációhoz egyenlő térfogatú rOCIF (200 pg/ml) és Freund komplett hatásjavítója (Difco, Cat. 0638-60-7) összekeverésével. A nyulakat hat alkalommal egyhetes közökkel immunizáltuk bőr alá adott, 1 ml emulziót tartalmazó injekciókkal. A nyulaknak hat alkalommal, hétnapos közökkel adtunk bőr alá injekciót. Az utolsó immunizáció után tíz nappal kinyertük a teljes vérmennyiséget, és a szérumot elválasztottuk. Az antitestet a következők alapján tisztítottuk a szérumból. Az ellenszérumot PBS-sel kétszeresére hígítottuk. Ehhez ammónium-szulfátot adtunk 40 tömeg% végső koncentrációban, majd az ellenszérumot állni hagytuk egy órán keresztül, 4 °C-on. A 8000 g-n 20 percen át végzett centrifugálással kapott csapadékot kis mennyiségű PBS-ben feloldottuk, és PBS-sel szemben dializáltuk. Az így kapott oldatot protein G Sepharose oszlopra (Pharmacia) vittük. PBS-sel való mosás után az adszorbeálódott immunglobulin G-t 0,1 M glicin-HCI-pufferrel (3,0-es pH) eluáltuk. Az eluátumokat azonnal semlegesítettük
1,5 M TRIS-HCI-pufferrel (8,7-es pH), és PBS-sel szemben dializáltuk. A fehérjekoncentrációt 280 nm-en mért abszorbanciából határoztuk meg (E1% 13,5).
Torma-peroxidázzal jelölt antitestet készítettünk ImmunoPure Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit (Pierce, Cat. 31 494) felhasználásával. Röviden, 1 mg IgG-t inkubáltunk 80 pg N-szukcinimidil-S-acetil-tioacetáttal 30 percen keresztül. 5 mg hidroxilamin-HCI-dal történő deacilálás után a módosított IgG-t poliakrilamid kisózóoszlopon választottuk el. A fehérjét 1 mg maleimiddel aktivált torma-peroxidázzal inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át.
ii) OCIF kvantitatív meghatározása szendvics-EIA segítségével
Nyúl anti-OCIF-lgG-vel vontunk be mikrotiterlemezeket (Nunc MaxiSorp Immunoplate) úgy, hogy 0,2 pg-ot inkubáltunk 100 pl 50 mM nátrium-hidrogén-karbonát-pufferben 9,6-es pH-n, 4 °C-on, egy éjszakán át. Miután a lemezeket blokkoltuk 300 pl 25%-os Block/Ace/PBS-sel (Snow Brand Milk) egy órán át tartó, 37 °C-os inkubációval, 100 pl-nyi mintákat inkubáltunk 2 órán keresztül szobahőmérsékleten. Miután háromszor mostuk a lemezeket PBST-vel (0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS), 100 pl 1:10 000-hez hígítású torma-peroxidázzal jelölt anti-OCI F-lgG-t adtunk hozzájuk, és két órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az OCIF mennyiségét 100 pl szubsztrátoldattal (TMB, ScyTek Láb., Cat. TM4999) történő inkubációval és 450 nm-en mért abszorbancia mérésével [ImmunoReader (Nunc NJ 2000)] határoztuk meg. Standard fehérjeként tisztított rekombináns OCIF-et használtunk, és egy tipikus standardgörbe látható a 13. ábrán.
25. példa
Anti-OCIF monoklonális antitest
i) Anti-OCIF monoklonális antitestet előállító hibridóma elkészítése
Az OCIF-et a 11. példában ismertetett tisztítási eljárás szerint tisztítottuk homogenitásig IMR-90 humán fibroblast tenyészmédiumból. A tisztított OCIF-et PBSben feloldottuk úgy, hogy 10 pg/100 pl koncentrációjú oldatot kaptunk. Ezen oldat intraperitoneális bejuttatásával BALB/c egereket immunizáltunk, mely műveletet minden két héten három alkalommal végeztünk el. Az első és második immunizációk során a beadott emulziót egyenlő térfogatú OCIF-ből és Freund-komplett hatásjavítójából készítettük. Három nappal az utolsó adag beadása után a lépet kivettük, izoláltuk a limfocitákat, és ezeket p3x63-Ag8.653 egér-myelomasejtekkel fuzionáltuk a polietilénglikolt használó általános módszer szerint. Ezután a fuzionált sejteket HAT médiumban növesztettük, hogy kiválasszuk a hibridómákat. Ezt követően, hogy megvizsgáljuk, vajon a kiválasztott hibridómák termelnek-e anti-OCIF-antitestet, a hibridómák mindegyik tenyészmédiumában meghatároztuk az anti-OCIF-antitestet szilárd fázisú ELISA-val, mely úgy készült, hogy 96 lyukat tartalmazó lemezek (Nunc) mindegyik lyukát bevontuk 100 pl tisztított OCIF-fel (10 pg/ml 0,1 M NaHCO3-ban), és mindegyik lyukat 50%-os BlockAce-val (Snow Brand Milk Products Co. Ltd.) blokkoltuk. Az anti-OCIF-antitesteket szekretáló hibridómaklónokat úgy alakítottuk ki, hogy limitált hígítással 3-5 alkalommal klónoztuk, és a fenti szilárd fázisú ELISA-t használtuk a szűréshez. Az így kapott hibridómaklónok közül számos olyan hibridómaklónt választottunk ki, mely nagy mennyiségű anti-OCIF-antitestet termel.
ii) Anti-OCIF monoklonális antitestek termelése
Mindegyik anti-OCIF-antitestet szekretáló hibridómaklónt, melyet a 25—i) példában kaptunk, intraperitoneálisan transzplantáltuk Pristane-nel kezelt (Aldrich) egerekbe 1 *106 sejt/egér sejtsűrűséggel. A transzplantáció után 10-14 nappal összegyűjtöttük a felgyűlt ascitest, és a jelen találmány szerinti anti-OCIF specifikus monoklonális antitestet tartalmazó ascitest kaptuk.
A tisztított antitesteket egy Affigel protein A Sepharose kromatográfiával (BioRad) kaptuk, mely műveletet a gyártó használati útmutatója alapján végeztünk. Azaz az ascitest egyenlő térfogatú kötőpufferrel (BioRad) hígítottuk, és fehérje A oszlopra vittük. Az oszlopot ele24
HU 224 570 Β1 gendő mennyiségű kötőpufferrel mostuk, és egy elúciós pufferrel (BioRad) eluáltuk. Semlegesítés után a kapott eluátumot vízben dializáltuk, és ezt követően liofilizáltuk. Az így kapott antitest tisztaságát SDS-PAGEmódszerrel vizsgáltuk, és egy körülbelül 150 000 mole- 5 kulatömegű homogén sávot figyeltünk meg.
iii) OCIF-re nézve nagy affinitással rendelkező monoklonális antitest kiválasztása Mindegyik 25—ii) példában kapott antitestet feloldottuk PBS-ben, és a fehérje koncentrációját az oldatban 10 Lowry módszere szerint határoztuk meg. Elkészítettük mindegyik antitest oldatát ugyanabban a koncentrációban, és ezután sorozatosan hígítottuk PBS-sel. A monoklonális antitesteket, melyek még a nagymértékben hígított oldatok esetében is képesek felismerni az
OCIF-et, a 25—ii) példában ismertetett szilárd fázisú
ELISA-technika segítségével választottuk el. így három monoklonális antitestet, az A1 G5-öt, az E3H8-at és a
D2F4-et tudtuk elválasztani.
iv) Az antitestek osztályának és alosztályának meghatározása
A jelen találmány szerinti, 25—iii) példában kapott antitestek osztályát és alosztályát egy immunglobulinosztály és alosztályvizsgáló kit (Amersham) segítségével vizsgáltuk. Az eljárást az útmutatóhoz csatolt leirat szerint végeztük. Az eredmények a 15. táblázatban láthatók. A jelen találmány szerinti E3H8, A1G5 és D2F4 antitestek az lgGrhez, lgG2a-hoz és lgG2b-hez tartoznak.
15. táblázat
A jelen találmány szerinti antitestek osztályának és alosztályának vizsgálata
| Antitest | ige. | !gG2a | igG2b | lgG3 | IgA | IgM | K |
| A1G5 | - | + | - | - | - | - | + |
| E3H8 | + | - | - | - | - | - | + |
| D2F4 | - | - | + | - | - | - | + |
v) OCIF meghatározása ELISA-módszerrel
Három típusú monoklonális antitestet, az A1 G5-öt, az E3H8-at és a D2F4-et, melyeket a 25—iv) példában kaptunk, használtunk szilárd fázisú antitestekként és enzimjelölt antitestekként. A szilárd fázisú antitest és jelölt antitest minden kombinációjából szendvics-ELISA-t készítettünk. A jelölt antitestet Immuno Pure Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit (Pierce, Cat. No. 31 494) felhasználásával állítottuk elő. Mindegyik monoklonális antitestet feloldottuk 0,1 M NaHCO3-ban úgy, hogy 10 pg/ml koncentrációjú oldatot kapjunk, és ezen oldatból 100 μΙ-t adtunk 96 lyukat tartalmazó immunlemezek (Nunc, MaxiSorp Cat. No. 442 404) minden egyes lyukába, majd ezt követően ezeket egy éjszakán át szobahőmérsékleten hagytuk állni. Ezt követően a lemez minden egyes lyukát blokkoltuk 50% Blockace-val (Snow Brand Milk Products, Co., Ltd.) szobahőmérsékleten, 50 percen át, és ezután háromszor mostuk 0,1% Tween 20-tartalmú PBS-sel (mosópuffer).
Különböző koncentrációjú OCIF-oldatok sorozatát állítottuk elő az 1. reakciópufferrel (0,2 M TRIS-HCI puffer, 7,4-es pH, 40% Blockace és 0,1% Tween 20) történő hígítással. 96 lyukat tartalmazó immunlemezek minden egyes lyukába 100 μΙ elkészített OCIF-oldatot adtunk minden egyes koncentrációban, 3 órán át 37 °C-on állni hagytuk, és ezt követően háromszor mostuk a mosópufferrel. POD-jelölt antitestek hígításához a 2. reakciópuffert (0,1 M TRIS-HCI puffer, 7,4-es pH, mely tartalmazott 25% Blockace-t és 0,1% Tween 20-at) használtuk. A POD-jelölt antitesteket négyszázszorosra hígítottuk a 2. reakciópufferrel, és a hígított oldatok 100 μΙ-ét adtuk az immunlemezek minden egyes lyukába. Mindegyik immunlemezt 37 °C-on és 2 órán át állni hagytuk, és ezután háromszor mostuk ezeket a mosópufferrel. A mosás után 100 μΙ szubsztrátoldatot (0,1 M citrát-foszfát-puffer, 4,5-es pH, mely tartalmazott 0,4 mg/ml ofenilén-diamin-HCI-ot és 0,006% H2O2-ot) adtunk az immunlemezek minden egyes lyukába, és az immunlemezeket 37 °C-on, 15 percen át inkubáltuk. Az enzimreakciót 50 μΙ 6 N H2SO4 minden egyes lyukhoz adásával állítottuk le. Egy immunleolvasó segítségével megmértük minden lyuk optikai denzitását 492 nm-en (ImmunoReader NJ 2000, Nunc).
A jelen találmány szerinti három típusú monoklonális antitest felhasználásával, szilárd fázisú és POD-jelölt antitestek mindegyik kombinációja az OCIF pontos meghatározásához vezet. Igazoltuk, hogy a jelen találmány szerinti mindegyik monoklonális antitest különböző OCIF-epitópot ismer fel. Egy szilárd fázisú antitest, az A1G5 és egy POD-jelölt antitest, az E3H8 kombinációját használó OCIF egy tipikus standardgörbéje látható a 14. ábrán.
vi) OCIF meghatározása humán szérumban
A 25-v) példában leírt ΕΙΑ-rendszer segítségével öt normál humán szérummintában meghatároztuk az OCIF koncentrációját. Az immunlemezeket a 25-v) példában leírtak alapján bevontuk A1 G5-tel, és az 1. reakciópufferből 50 μΙ-t adtunk az immunlemez minden egyes lyukához. Továbbá mindegyik humán szérumból 50 μΙ-t adtunk az immunlemez minden egyes lyukához. Az immunlemezeket három órán át 37 °C-on inkubáltuk, és ezután ezeket háromszor mostuk a mosópufferrel. Mosás után az immunlemez mindegyik lyukába 100 μΙ, a 2. reakciópufferrel négyszázszorosára hígított POD-E3H8 antitestet adtunk, és 37 °C-on két órán keresztül inkubáltuk. Az immunlemezek háromszori mosópufferrel való mosása után a 25-v) példában leírt
HU 224 570 Β1 szubsztrátoldat 100 μΙ-ét adtuk mindegyik lyukhoz, és 15 percen át inkubáltuk ezeket 37 °C-on. Az enzimreakciót úgy állítottuk le, hogy az immunlemezek minden lyukához 50 μΙ 6 N H2SO4-ot adtunk. Egy immunleolvasó segítségével megmértük minden lyuk optikai denzitását 492 nm-en (ImmunoReader NJ 2000, Nunc).
Ismert mennyiségű OCIF-et tartalmazó 1. reakciópuffert kezeltünk ugyanezen a módon, és a 2. ábrán látható OCIF standardgörbét kaptuk. Az OCIF standardgörbe segítségével meghatároztuk az OCIF mennyiségét humán szérummintában. Az eredmények a 16. táblázatban láthatók.
16.táblázat
Az OCIF mennyisége normál humán szérumban
| Szérumminta | OCIF-koncentráció (ng/ml) |
| 1 | 5,0 |
| 2 | 2,0 |
| 3 | 1,0 |
| 4 | 3,0 |
| 5 | 1,5 |
26. példa
Az osteoporosisra gyakorolt terápiás hatás
1. Módszer
Hím, hathetes Fischer-patkányok bal mellső lábait idegeltávolításnak vetettük alá. Ezeket a patkányokat négy csoportba osztottuk (10 patkány csoportonként), és a következők szerint kezeltük őket: az A csoport alkotta a kezeletlen patkányokat; a B csoportba olyan idegeltávolításnak alávetett patkányok kerültek, melyeknek intravénásán adtuk be a vivőanyagot; a C csoport tagjai olyan idegeltávolításnak alávetett patkányok voltak, melyeknek naponta kétszer adtunk be intravénásán OCIF-et 5 pg/kg dózisban; a D csoport tagjai olyan idegeltávolításnak alávetett patkányok voltak, melyeknek naponta kétszer adtunk be OCIF-et intravénásán 50 pg/kg dózisban. Az idegeltávolítás után az OCIF-et naponta adtuk be, 14 napon keresztül. Két hétig tartó kezelés után az állatokat leöltük, és a mellső lábaikat felboncoltuk. Ezt követően vizsgáltuk a csontok mechanikai szilárdságát.
2. Eredmények
A kontrollcsoportba tartozó állatok esetében a csontszilárdság csökkenését figyeltük meg a normálcsoportokba tartozó állatokhoz viszonyítva, míg a csontszilárdság azon állatcsoportok esetében növekedett, melyek 50 pg OCIF-et kaptak testtömegkilogrammonként.
A jelen találmány egyrészt egy olyan új fehérjét ad, amely gátolja az osteoclastképződést, másrészt egy hatásos eljárást biztosít a fehérje előállításához. A jelen találmány szerinti fehérje osteoclastképződést gátló aktivitással rendelkezik. A fehérje hatásos lesz sok, csontveszteséggel járó betegség, mint például osteoporosis kezelésében és ilyen betegségek immunológiai diagnózisában antigénként.
A mikroorganizmus letétjére vonatkozó információk
A letétet kezelő hatóság neve és címe:
Neve: National Institute of Bioscience and Humán
Technology Agency of Industrial Science and Technology Ministry of International Trade and Industry
Címe: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, JAPAN
A letét dátuma: 1995. június 21.
(Át lett véve a Bikkoken No. Ρ-14998-tól, melyet
1995. június 21-én helyeztek letétbe. Átvétel dátuma: 1995. október 25.)
Letéti száma: FERM BP-5267
Claims (96)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a következő tulajdonságokkal rendelkezik:a) molekulatömege SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) alapján:- redukáló körülmények között körülbelül 60 kD,- nem redukáló körülmények között körülbelül 60 kD és 120 kD;b) nagy affinitással rendelkezik kationcserélő oszlophoz és heparinoszlophoz;c) osteoclastdifferenciálódást és/vagy -érést gátló biológiai aktivitással rendelkezik;70 °C-on 10 percen keresztül vagy 56 °C-on 30 percen keresztül történő melegítés hatására csökken az aktivitása,90 °C-on 10 percen keresztül történő melegítés hatására elveszti aktivitását;d) aminosavsorrendje tartalmazza az 1., 2. és 3. számú szekvenciákban bemutatott aminosavszekvenciákat, mint internális aminosavszekvenciákat.
- 2. Az első igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy a 7. számú szekvencia szerinti N-terminális aminosavsorrenddel rendelkezik.
- 3. Az első igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy humán fibroblastokban állítjuk elő.
- 4. Eljárás az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerint fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy növesztjük a humán fibroblastot; ioncserélő oszlopkromatográfia, affinitás-oszlopkromatográfia és reverz fázisú oszlopkromatográfia kombinációjával tisztítjuk a fehérjét.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a humán fibroblastot alumínium-oxid-kerámia-darabkákon növesztjük.
- 6. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 4. számú szekvenciában leírt aminosavsorrenddel rendelkezik.
- 7. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 4. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 8. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 6. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 9. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy mérsékelten szigorú körülmények között a 6. számú szekvenciában látható cDNS-hez hibridizálnak, és az 1. igénypont szerinti fehérjét kódolják.HU 224 570 Β1
- 10. Fehérje, azzal jellemezve, hogy egy olyan cDNS-ről expresszálódik, mely a 4. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolja.
- 11. Fehérje, azzal jellemezve, hogy osteoclastdifferenciálódást és/vagy -érést gátló biológiai aktivitással rendelkezik, és cDNS-ről expresszált aminosavakként kapjuk, mely a 4. számú szekvenciában leírt aminosavsorrenddel összehasonlítva legalább 80% szekvenciaazonossággal rendelkezik.
- 12. Eljárás osteoclastdifferenciálódást és/vagy -érést gátló fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a fehérjét, amelyre az jellemző, hogya) molekulatömege SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) alapján:- redukáló körülmények között körülbelül 60 kD,- nem redukáló körülmények között körülbelül 60 kD és 120 kD;b) nagy affinitással rendelkezik kationcserélő oszlophoz és heparinoszlophoz;c) osteoclastdifferenciálódást és/vagy -érést gátló biológiai aktivitással rendelkezik;70 °C-on 10 percen keresztül vagy 56 °C-on 30 percen keresztül történő melegítés hatására csökken az aktivitása,90 °C-on 10 percen keresztül történő melegítés hatására elveszti aktivitását;d) aminosavsorrendje tartalmazza az 1., 2. és 3. számú szekvenciákban bemutatott aminosavszekvenciákat, mint internális aminosavszekvenciákat;a 4. számú szekvenciában leírt aminosavsorrendet kódoló cDNS felhasználásával, génmanipulációs technikával állítjuk elő.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy génmanipulációs technikát alkalmazva gazdasejtekként emlőssejteket használunk.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy génmanipulációs technikát alkalmazva emlősgazdasejtekként 293/EBNA sejteket vagy CHO-sejteket használunk.
- 15. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 8. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 16. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 8. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 17. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 9. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 18. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 10. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 19. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 10. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 20. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 11. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 21. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 12. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 22. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 12. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 23. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 13. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 24. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 14. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 25. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 14. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 26. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 15. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 27. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 83. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 28. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 83. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 29. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 62. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 30. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 84. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 31. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 84. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 32. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 63. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 33. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 85. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 34. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 85. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 35. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 64. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 36. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 86. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 37. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 86. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 38. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 65. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 39. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 87. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 40. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 87. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 41. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 66. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 42. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 88. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 43. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 88. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 44. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 67. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 45. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 89. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 46. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 89. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 47. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 68. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 48. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 90. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.HU 224 570 Β1
- 49. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 90. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 50. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 69. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 51. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 91. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 52. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 91. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 53. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 70. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 54. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 92. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 55. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 92. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 56. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 71. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 57. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 93. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 58. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 93. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 59. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 72. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 60. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 94. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 61. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 94. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 62. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 73. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 63. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 95. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 64. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 95. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 65. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 74. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 66. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 96. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 67. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 96. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 68. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 75. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 69. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 97. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 70. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 97. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 71. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 76. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 72. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 98. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 73. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 98. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 74. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 77. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 75. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 99. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 76. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 99. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 77. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 78. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 78. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 100. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 79. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 100. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 80. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 79. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 81. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 101. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 82. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 101. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 83. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 80. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 84. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 102. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 85. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 102. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 86. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 81. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 87. cDNS, azzal jellemezve, hogy a 103. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkezik.
- 88. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 103. számú szekvenciában látható nukleotidsorrenddel rendelkező cDNS kódolja.
- 89. cDNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 82. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 90. Genomiális DNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 4. számú szekvenciában látható aminosavsorrendet kódolják.
- 91. A 90. igénypont szerinti genomiális DNS-ek, azzal jellemezve, hogy a 104. vagy 105. számú szekvenciákban látható nukleotidsorrenddel rendelkeznek.
- 92. Antitest, azzal jellemezve, hogy OCIF-hez specifikus affinitással rendelkezik.
- 93. A 92. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy ez egy poliklonális antitest.
- 94. A 92. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy ez egy monoklonális antitest.
- 95. A 94. igénypont szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy molekulatömege körülbelül 150 000, és az IgG-,, lgG2a vagy lgG2b alosztályokba tartozik.
- 96. OCIF fehérje koncentrációjának meghatározására szolgáló eljárás, azzal jellemezve, hogy a 92., 93., 94. vagy 95. igénypontok szerinti antitesteket használjuk fel.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5497795 | 1995-02-20 | ||
| JP20750895 | 1995-07-21 | ||
| PCT/JP1996/000374 WO1996026217A1 (fr) | 1995-02-20 | 1996-02-20 | Proteine nouvelle et ses procedes de production |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9900422A1 HUP9900422A1 (hu) | 1999-06-28 |
| HUP9900422A3 HUP9900422A3 (en) | 2002-11-28 |
| HU224570B1 true HU224570B1 (hu) | 2005-10-28 |
Family
ID=26395808
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9900422A HU224570B1 (hu) | 1995-02-20 | 1996-02-20 | Új fehérjék és eljárások a fehérjék előállítására |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (9) | US7125686B1 (hu) |
| EP (2) | EP1528103B1 (hu) |
| JP (1) | JP3502102B2 (hu) |
| KR (1) | KR100381788B1 (hu) |
| CN (1) | CN1218961C (hu) |
| AT (2) | ATE274580T1 (hu) |
| AU (1) | AU702557C (hu) |
| CA (1) | CA2213469A1 (hu) |
| DE (2) | DE69633225T2 (hu) |
| ES (1) | ES2227579T3 (hu) |
| FI (1) | FI973402A (hu) |
| HU (1) | HU224570B1 (hu) |
| IL (1) | IL117175A (hu) |
| MX (1) | MX9706341A (hu) |
| NO (1) | NO318898B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ301362A (hu) |
| PT (1) | PT816380E (hu) |
| RU (2) | RU2238948C2 (hu) |
| TW (1) | TW538049B (hu) |
| WO (1) | WO1996026217A1 (hu) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0819168A4 (en) * | 1995-03-15 | 2000-11-08 | Human Genome Sciences Inc | HUMAN RECEPTOR FOR THE TUMOR NECROSIS FACTOR |
| US7078493B1 (en) | 1995-03-15 | 2006-07-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like genes |
| US7094564B1 (en) | 1995-03-15 | 2006-08-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| US8110659B1 (en) | 1995-03-15 | 2012-02-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like genes |
| US6369027B1 (en) * | 1995-12-22 | 2002-04-09 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| US7632922B1 (en) | 1995-12-22 | 2009-12-15 | Amgen, Inc. | Osteoprotegerin |
| JPH1057071A (ja) * | 1996-08-19 | 1998-03-03 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法 |
| AU7364696A (en) * | 1996-09-18 | 1998-04-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like genes |
| DK1114864T4 (da) * | 1996-12-13 | 2012-09-03 | Schering Corp | Pattedyrcelleoverfladeantigener samt tilhørende reagenser |
| US6271349B1 (en) | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
| EP0951551B9 (en) | 1996-12-23 | 2012-12-26 | Immunex Corporation | Ligand for receptor activator of nf-kappa b, ligand is member of tnf superfamily |
| EP2336168A1 (en) | 1997-04-15 | 2011-06-22 | Sankyo Company Limited | Novel protein and method for producing the protein |
| CN1264427A (zh) | 1997-04-16 | 2000-08-23 | 安姆根有限公司 | osteoprotegerin结合蛋白和受体 |
| US6316408B1 (en) | 1997-04-16 | 2001-11-13 | Amgen Inc. | Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors |
| JP2002514078A (ja) * | 1997-04-18 | 2002-05-14 | ミレニアム ファーマシューティカルズ インク． | Ｆｔｈｍａ−０７０関連蛋白質ファミリーおよびｔ８５関連蛋白質ファミリーの新規分子ならびにそれらの使用 |
| JP2002514079A (ja) * | 1997-05-01 | 2002-05-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | キメラｏｐｇポリペプチド |
| US6346388B1 (en) | 1997-08-13 | 2002-02-12 | Smithkline Beecham Corporation | Method of identifying agonist and antagonists for tumor necrosis related receptors TR1 and TR2 |
| NZ335759A (en) | 1997-09-24 | 2002-02-01 | Sankyo Co | Method of diagnosing metabolic bone diseases by measuring osteoclastgenesis inhibitory factor (OCIF) |
| US6297022B1 (en) | 1997-10-08 | 2001-10-02 | Smithkline Beecham Corporation | Method of identifying agonists and antagonists for tumor necrosis related receptor TR1 |
| US6087555A (en) * | 1997-10-15 | 2000-07-11 | Amgen Inc. | Mice lacking expression of osteoprotegerin |
| JPH11155420A (ja) * | 1997-12-02 | 1999-06-15 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | トランスジェニック動物 |
| AU762574B2 (en) | 1998-05-14 | 2003-06-26 | Immunex Corporation | Method of inhibiting osteoclast activity |
| WO2000021554A1 (fr) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Sankyo Company, Limited | Prevention et traitement de la cachexie |
| TW529954B (en) * | 1998-10-28 | 2003-05-01 | Sankyo Co | Agent for treating abnormal bone metabolism |
| AUPQ167599A0 (en) * | 1999-07-19 | 1999-08-12 | St. Vincent's Institute Of Medical Research | Inhibitor of osteoclast precursor formation |
| AU7720600A (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-30 | Eli Lilly And Company | Osteoprotegerin regulatory region |
| JP2001103964A (ja) * | 1999-10-05 | 2001-04-17 | Teijin Ltd | 破骨細胞形成抑制方法または骨吸収抑制方法 |
| WO2002062990A1 (fr) * | 2001-02-07 | 2002-08-15 | Sankyo Company, Limited | Anticorps et utilisation de cet anticorps |
| AU2002231602A1 (en) * | 2001-02-09 | 2002-08-28 | Maxygen Holdings Ltd. | Rank ligand-binding polypeptides |
| CN1238379C (zh) * | 2001-03-21 | 2006-01-25 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 新的破骨细胞形成抑制因子、其编码序列及用途 |
| ATE458004T1 (de) * | 2001-04-03 | 2010-03-15 | Nestle Sa | Osteoprotegerin in milch |
| US7064189B2 (en) | 2001-05-25 | 2006-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors |
| CZ20022231A3 (cs) * | 2001-06-29 | 2003-02-12 | Sankyo Company Limited | Komplex skládající se z osteoklastogenezi inhibujícího faktoru a polysacharidu |
| JP4336467B2 (ja) * | 2001-10-15 | 2009-09-30 | 株式会社林原生物化学研究所 | 破骨細胞形成抑制因子の産生を調節し得る物質のスクリーニング方法 |
| TW200303757A (en) * | 2002-03-01 | 2003-09-16 | Sankyo Co | A pharmaceutical composition |
| MXPA04009681A (es) | 2002-04-05 | 2005-01-11 | Amgen Inc | Anticuerpos humanos neutralizantes anti-ligando de osteoprotegerina como inhibidores selectivos de la ruta del ligando de osteoprotegerina. |
| WO2004053103A2 (en) * | 2002-12-11 | 2004-06-24 | University Of Massachusetts | METHOD OF INTRODUCING siRNA INTO ADIPOCYTES |
| US7740861B2 (en) | 2004-06-16 | 2010-06-22 | University Of Massachusetts | Drug delivery product and methods |
| TWI364458B (en) * | 2004-08-27 | 2012-05-21 | Wyeth Res Ireland Ltd | Production of tnfr-lg |
| CN101052383B (zh) | 2004-09-17 | 2013-01-30 | 马萨诸塞大学 | 用于溶酶体酶缺乏症的组合物和其用途 |
| DK1874331T3 (en) * | 2005-04-19 | 2014-12-01 | King S College London | APPLICATION OF BIP against bone loss and osteoporosis |
| WO2007050643A2 (en) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | University Of Massachusetts | Compositions and their uses for gene therapy of bone conditions |
| KR20180030264A (ko) * | 2005-11-23 | 2018-03-21 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도 |
| US10741034B2 (en) | 2006-05-19 | 2020-08-11 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity |
| KR101534884B1 (ko) | 2007-10-11 | 2015-07-08 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 파골 세포 관련 단백질 Ｓｉｇｌｅｃ-15 를 표적으로 한 항체 |
| US8389485B2 (en) * | 2007-10-29 | 2013-03-05 | University Of Massachusetts | Encapsulated nanoparticles for nucleic acid delivery |
| KR101690340B1 (ko) | 2009-04-09 | 2016-12-27 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체 |
| MX2013003828A (es) | 2010-10-05 | 2013-06-28 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Anticuerpo dirigido a la proteina lectina tipo inmunoglobulina de union a acido sialico-15 relacionada con osteoclastos. |
| CN102011025A (zh) * | 2010-10-11 | 2011-04-13 | 宁波市鄞州品达电器焊料有限公司 | 一种耐超高温的无铅焊锡 |
| KR20150003170A (ko) | 2012-03-30 | 2015-01-08 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | ＣＤＲ 개변 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체 |
| US9963740B2 (en) * | 2013-03-07 | 2018-05-08 | APDN (B.V.I.), Inc. | Method and device for marking articles |
| EP3058339B1 (en) | 2013-10-07 | 2019-05-22 | APDN (B.V.I.) Inc. | Multimode image and spectral reader |
| US10745825B2 (en) | 2014-03-18 | 2020-08-18 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Encrypted optical markers for security applications |
| WO2015142990A1 (en) | 2014-03-18 | 2015-09-24 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Encryped optical markers for security applications |
| JP6339855B2 (ja) * | 2014-05-14 | 2018-06-06 | 住友ゴム工業株式会社 | エアレスタイヤ及びその製造方法 |
| US10519605B2 (en) | 2016-04-11 | 2019-12-31 | APDN (B.V.I.), Inc. | Method of marking cellulosic products |
| US10995371B2 (en) | 2016-10-13 | 2021-05-04 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Composition and method of DNA marking elastomeric material |
| WO2018156352A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Apdn (B.V.I) Inc. | Nucleic acid coated submicron particles for authentication |
Family Cites Families (85)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US176647A (en) * | 1876-04-25 | Improvement in car-couplings | ||
| US144480A (en) * | 1873-11-11 | Improvement in cutting attachments for sewing-machines | ||
| US169117A (en) * | 1875-10-26 | Improvement in revolution-indicators | ||
| US181418A (en) * | 1876-08-22 | Improvement in gas apparatus | ||
| US166097A (en) * | 1875-07-27 | Improvement in buttons for wearing apparel | ||
| US33535A (en) * | 1861-10-22 | Improvement in machines for making bricks | ||
| US86827A (en) * | 1869-02-09 | Improved rubber boot | ||
| US45456A (en) * | 1864-12-13 | Improved apparatus for carbureting air | ||
| US216297A (en) * | 1879-06-10 | Improvement in ironing-stands | ||
| US81720A (en) * | 1868-09-01 | Isaac williams | ||
| US150989A (en) * | 1874-05-19 | Improvement in pin and dowel machines | ||
| US175840A (en) * | 1876-04-11 | Improvement in circular-knitting machines | ||
| US207827A (en) * | 1878-09-10 | Improvement in siphon-condensers | ||
| US139325A (en) * | 1873-05-27 | Improvement in carriage-springs | ||
| US104485A (en) * | 1870-06-21 | Improvement in sleeping-cars | ||
| US208045A (en) * | 1878-09-17 | Improvement in ether-meters for refrigerating-machines | ||
| US86826A (en) * | 1869-02-09 | Improvement in mechanical movement | ||
| US100069A (en) * | 1870-02-22 | Geokge h | ||
| US127637A (en) * | 1872-06-04 | Improvement in couplings for divided axles | ||
| US100488A (en) * | 1870-03-01 | Improved tire-xjfsetting machine | ||
| US103978A (en) * | 1870-06-07 | Improvement in bee-hives | ||
| US886826A (en) * | 1907-12-14 | 1908-05-05 | Reece Button Hole Machine Co | Button-sewing machine. |
| US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4710473A (en) | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
| EP0192658A4 (en) | 1984-07-30 | 1987-07-13 | Salk Inst For Biological Studi | RETROVIRAL GENE TRANSFER VECTORS. |
| US4959314A (en) * | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| JP2604135B2 (ja) | 1986-02-28 | 1997-04-30 | ライオン株式会社 | 口腔骨疾患治療剤 |
| US5266683A (en) * | 1988-04-08 | 1993-11-30 | Stryker Corporation | Osteogenic proteins |
| JPH04502854A (ja) * | 1988-10-24 | 1992-05-28 | カターソン，ブルース | 変形性関節症の初期段階の診断、モニタリングならびに治療の方法および組成物 |
| AU648505B2 (en) | 1989-05-19 | 1994-04-28 | Amgen, Inc. | Metalloproteinase inhibitor |
| AU651421B2 (en) | 1990-11-30 | 1994-07-21 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Use of a bone morphogenetic protein in synergistic combination with TGF-beta for bone repair |
| US5118667A (en) | 1991-05-03 | 1992-06-02 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation |
| CA2068389A1 (en) | 1991-05-13 | 1992-11-14 | Masahiko Sato | Method for inhibiting bone resorption |
| TW318142B (hu) * | 1991-06-03 | 1997-10-21 | Mitsubishi Chemicals Co Ltd | |
| MX9204303A (es) | 1991-07-23 | 1993-11-01 | Rhone Poulenc Rorer Int | Factor regulador del crecimiento de osteoclasto. |
| IL99120A0 (en) | 1991-08-07 | 1992-07-15 | Yeda Res & Dev | Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| US5366859A (en) * | 1991-10-31 | 1994-11-22 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | Radioimmunoassay method |
| EP0746609A4 (en) | 1991-12-17 | 1997-12-17 | Genpharm Int | NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES |
| US5447851B1 (en) | 1992-04-02 | 1999-07-06 | Univ Texas System Board Of | Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells |
| US5427954A (en) * | 1992-04-29 | 1995-06-27 | Shriner's Hospitals For Crippled Children | Compositions and methods for detection and treatment of human osteoarthritis |
| WO1993021946A1 (en) | 1992-04-30 | 1993-11-11 | Synergen, Inc. | Methods for treating interleukin-1 and tumor necrosis factor mediated diseases |
| US5585479A (en) | 1992-07-24 | 1996-12-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA |
| US5578569A (en) | 1993-03-12 | 1996-11-26 | Tam; Cherk S. | Method of increasing bone growth |
| US5457035A (en) | 1993-07-23 | 1995-10-10 | Immunex Corporation | Cytokine which is a ligand for OX40 |
| DE69427588T2 (de) | 1993-09-14 | 2002-04-25 | Merck & Co Inc | HUMANE PROTEIN-TYROSINPHOSPHATASE DECODIERENDE cDNA |
| US6268212B1 (en) | 1993-10-18 | 2001-07-31 | Amgen Inc. | Tissue specific transgene expression |
| KR960703943A (ko) * | 1994-06-27 | 1996-08-31 | 가다야마 스미오 | 신규단백질 및 그 제조방법 |
| EP0727211A1 (en) | 1995-02-10 | 1996-08-21 | Smithkline Beecham Corporation | Use of src SH2 specific compounds to treat a bone resorption disease |
| US6001349A (en) | 1995-02-22 | 1999-12-14 | Therion Biologics Corporation | Generation of human cytotoxic T-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof |
| WO1996028546A1 (en) * | 1995-03-15 | 1996-09-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| US20030166097A1 (en) | 1995-03-15 | 2003-09-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| US7094564B1 (en) | 1995-03-15 | 2006-08-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
| US5843901A (en) | 1995-06-07 | 1998-12-01 | Advanced Research & Technology Institute | LHRH antagonist peptides |
| AU6090896A (en) | 1995-06-07 | 1997-01-15 | Osteosa Inc. | Osteoclast growth regulatory factor |
| WO1997000317A1 (en) | 1995-06-07 | 1997-01-03 | Osteosa Inc. | Osteoclast growth regulatory factor |
| US6613544B1 (en) | 1995-12-22 | 2003-09-02 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| US20030207827A1 (en) | 1995-12-22 | 2003-11-06 | William J. Boyle | Osteoprotegerin |
| US6369027B1 (en) * | 1995-12-22 | 2002-04-09 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| JPH1057071A (ja) | 1996-08-19 | 1998-03-03 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法 |
| US5830850A (en) * | 1996-08-28 | 1998-11-03 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York | Methods for the treatment of bone resorption disorders, including osteoporosis |
| DK1114864T4 (da) | 1996-12-13 | 2012-09-03 | Schering Corp | Pattedyrcelleoverfladeantigener samt tilhørende reagenser |
| AU5901598A (en) | 1996-12-20 | 1998-07-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods of use for osteoclast inhibitory factors |
| EP0951551B9 (en) | 1996-12-23 | 2012-12-26 | Immunex Corporation | Ligand for receptor activator of nf-kappa b, ligand is member of tnf superfamily |
| US6271349B1 (en) * | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
| EP2336168A1 (en) | 1997-04-15 | 2011-06-22 | Sankyo Company Limited | Novel protein and method for producing the protein |
| US5843678A (en) | 1997-04-16 | 1998-12-01 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin binding proteins |
| US6316408B1 (en) | 1997-04-16 | 2001-11-13 | Amgen Inc. | Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors |
| CN1264427A (zh) | 1997-04-16 | 2000-08-23 | 安姆根有限公司 | osteoprotegerin结合蛋白和受体 |
| US6656508B2 (en) | 1997-04-17 | 2003-12-02 | Amgen Inc. | Sustained-release alginate gels |
| JP2002514079A (ja) | 1997-05-01 | 2002-05-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | キメラｏｐｇポリペプチド |
| AU7705098A (en) | 1997-05-29 | 1998-12-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor-like protein 8 |
| NZ335759A (en) * | 1997-09-24 | 2002-02-01 | Sankyo Co | Method of diagnosing metabolic bone diseases by measuring osteoclastgenesis inhibitory factor (OCIF) |
| US6297022B1 (en) * | 1997-10-08 | 2001-10-02 | Smithkline Beecham Corporation | Method of identifying agonists and antagonists for tumor necrosis related receptor TR1 |
| US6087555A (en) | 1997-10-15 | 2000-07-11 | Amgen Inc. | Mice lacking expression of osteoprotegerin |
| US6790823B1 (en) | 1998-04-23 | 2004-09-14 | Amgen Inc. | Compositions and methods for the prevention and treatment of cardiovascular diseases |
| AU762574B2 (en) | 1998-05-14 | 2003-06-26 | Immunex Corporation | Method of inhibiting osteoclast activity |
| TW529954B (en) | 1998-10-28 | 2003-05-01 | Sankyo Co | Agent for treating abnormal bone metabolism |
| WO2001003719A2 (en) | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Amgen Inc. | Combination therapy for conditions leading to bone loss |
| US20030144187A1 (en) | 1999-09-03 | 2003-07-31 | Colin R. Dunstan | Opg fusion protein compositions and methods |
| CN1345246A (zh) | 1999-09-03 | 2002-04-17 | 安姆根有限公司 | 预防或治疗癌症及与癌症相关的骨损失的组合物和方法 |
| US20030103978A1 (en) | 2000-02-23 | 2003-06-05 | Amgen Inc. | Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein |
| CN103232539B (zh) | 2001-06-26 | 2015-06-03 | 安姆根弗里蒙特公司 | 抗opgl抗体 |
| CZ20022231A3 (cs) | 2001-06-29 | 2003-02-12 | Sankyo Company Limited | Komplex skládající se z osteoklastogenezi inhibujícího faktoru a polysacharidu |
| TW200303757A (en) | 2002-03-01 | 2003-09-16 | Sankyo Co | A pharmaceutical composition |
| US9434974B2 (en) | 2005-12-23 | 2016-09-06 | Synthetic Genomics, Inc. | Installation of genomes or partial genomes into cells or cell-like systems |
-
1996
- 1996-02-19 IL IL11717596A patent/IL117175A/xx active IP Right Review Request
- 1996-02-20 JP JP52555396A patent/JP3502102B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-20 DE DE69633225T patent/DE69633225T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 EP EP04076464A patent/EP1528103B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 KR KR1019970705767A patent/KR100381788B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 EP EP96902484A patent/EP0816380B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 HU HU9900422A patent/HU224570B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 CN CNB96192019XA patent/CN1218961C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 PT PT96902484T patent/PT816380E/pt unknown
- 1996-02-20 ES ES96902484T patent/ES2227579T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 NZ NZ301362A patent/NZ301362A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 RU RU2002120050A patent/RU2238948C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 WO PCT/JP1996/000374 patent/WO1996026217A1/ja active IP Right Grant
- 1996-02-20 DE DE69637486T patent/DE69637486D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 AU AU46773/96A patent/AU702557C/en not_active Revoked
- 1996-02-20 CA CA002213469A patent/CA2213469A1/en not_active Withdrawn
- 1996-02-20 AT AT96902484T patent/ATE274580T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 AT AT04076464T patent/ATE391178T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 RU RU97115710/04A patent/RU2194714C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 TW TW085108022A patent/TW538049B/zh active
-
1997
- 1997-08-19 NO NO19973801A patent/NO318898B1/no not_active Application Discontinuation
- 1997-08-20 FI FI973402A patent/FI973402A/fi unknown
- 1997-08-20 MX MX9706341A patent/MX9706341A/es not_active IP Right Cessation
- 1997-08-20 US US08/915,004 patent/US7125686B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-04-17 US US09/062,113 patent/US7205397B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-09-03 US US10/232,858 patent/US6855808B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-02-25 US US10/785,109 patent/US20040142426A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-25 US US10/785,114 patent/US7276344B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-31 US US10/929,748 patent/US7468268B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-31 US US10/929,958 patent/US20050014229A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-03 US US10/979,303 patent/US20050118682A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-03 US US10/979,654 patent/US20050124054A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU224570B1 (hu) | Új fehérjék és eljárások a fehérjék előállítására | |
| US6919434B1 (en) | Monoclonal antibodies that bind OCIF | |
| AU716846B2 (en) | Persephin and related growth factors | |
| AU9483898A (en) | Persephin and related growth factors | |
| US6846908B2 (en) | DCR-5 bone affecting ligand | |
| EP0954575A2 (en) | Cerebellum and embryo specific protein | |
| WO1996000240A1 (fr) | Nouvelle proteine et procede pour sa fabrication | |
| US7208578B2 (en) | Adipocyte complement related protein homolog zacrp2 | |
| JP4025853B2 (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 | |
| JP3793180B2 (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 | |
| AU6177998A (en) | Morphogenic proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050923 |
|
| MH4A | Lapse of definitive patent protection due to relinquishment |