DE69434292T2

DE69434292T2 - Für adseverin codierendes gen

Info

Publication number: DE69434292T2
Application number: DE69434292T
Authority: DE
Inventors: Seiji Nakamura; Takashi Sakurai; Jun-ichi 1-9 NEZU
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-12-28
Filing date: 1994-12-27
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2014-12-28
Also published as: EP0756005A4; JP3914272B2; AU1281495A; EP1371728A1; WO1995018221A1; TW438886B; US6130060A; JPH0880195A; EP0756005B1; US6184352B1; US6271353B1; DE69434292D1; CA2180103C; CA2180103A1; EP0756005A1; ATE290591T1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft ein Gen, das Adseverin codiert, welches ein Ca²⁺-abhängiges, Actin-Filamente zerstörendes Protein ist und die Funktion hat die Exocytose zu regulieren, einen rekombinanten Vektor, der dieses Gen enthält, eine mit diesem Vektor transformierte Rekombinante, einen Prozess für die Herstellung von Adseverin durch die Verwendung des oben genannten Gens und ein durch diesen Prozess gewonnenes, rekombinantes Adseverin-Protein. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein spezifisch mit einer Basensequenz, die das Adseverin-Protein codiert, hybridisierbares Oligonucleotid, ein Verfahren zur Regulierung der Erzeugung von Adseverin, welches die Verabreichung eines Oligonucleotids, welches spezifisch mit einer Basensequenz, die das Adseverin-Protein codiert, hybridisierbar ist, an ein Tier umfasst, und einen Antikörper, der fähig ist, das Adseverin-Protein zu erkennen.
Stand der Technik
In vielen sekretorischen Zellen im Ruhezustand werden Sekretionsprodukte wie Neurotransmitter und Hormone in Form von Granula oder Vesikeln gespeichert. Wenn die Zellen adäquate Signale empfangen, werden diese Substanzen aus den Zellen durch Exocytose freigesetzt. Während des Prozesses der Exocytose wandern die Granula und Vesikel zur Plasmamembran. Dann kommen sie in Kontakt mir der Plasmamembran, gefolgt von einer Fusion mit ihr, wodurch die Membran geöffnet wird.
Diese Exocytose wird straff durch die Konzentration von freiem intrazellulären Calcium [Ca²⁺]_i kontrolliert (Knight et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 493 (1987), 504–523). Es wird nämlich angenommen, dass in ruhenden Zellen, wo [Ca²⁺]_i niedrig ist, die Exocytose abhängig von [Ca²⁺]_i an mehreren Schritten blockiert ist (Burgoyne, Biochem. Biophys. Acta 779 (1984), 201–216). Mehrere sekretorische Zellen, einschließlich chromaffiner Zellen, welche sekretorische Zellen des Nebennierenmarks sind, haben ein aus Actin-Filamenten bestehendes Microfilamentnetzwerk unter der Plasmamembran, von dem angenommen wird, dass es als Barriere gegen die Wanderung von Granula und Vesikeln zur Plasmamembran dient (Cheek et al., FEBS Lett. 207 (1986), 110–114; Lelkes et al., FEBS Lett. 208 (1986), 357–363). Vor der Freisetzung von Sekretionsprodukten durch Exocytose wird dieses Netzwerk aufgrund der Zunahme von [Ca²⁺]_i durch einen Ca²⁺-abhängigen Mechanismus zerlegt (Vitale et al., J. Cell Biol. 113 (1991), 1057–1067).
Actin ist ein globuläres Protein mit einem Molekulargewicht von 42 kD, welches in eukaryontischen Zellen gleichmäßig verteilt ist. Es ist ein Protein des Cytoskeletts, welches in engem Zusammenhang mit der Kontraktion von Muskelzellen steht, und so weiter. Actin-Monomere werden polymerisiert um Filamente zu bilden. Bei physiologischer Ionenstärke wird Actin in vitro zu einem Anteil von etwa 100% polymerisiert, wobei Filamente erzeugt werden. In wirklichen Zellen tragen jedoch verschiedene Actin-regulierende Proteine zur reversiblen Umwandlung von Filamenten (Gel) und Monomeren (Sol) bei und Änderungen treten in Abhängigkeit von extrazellulären Reizen auf.
In chromaffinen Rinderzellen wurde Gelsolin, welches anscheinend direkt mit diesem Prozess in Beziehung steht, identifiziert (Yin et al., Nature 281 (1979), 583–586). Gelsolin zeigt in vitro eine Ca²⁺-abhängige, Actin-Filament-zerstörende Aktivität, bringt endständige Stachelkappenstrukturen bei Actin-Filamenten an und übt Keimbildungs-Aktivitäten bei Actin-Filamenten aus. Kürzlich wurde Adseverin (ein Protein von 74 kD), welches dem Gelsolin im Bezug auf die Aktivität ähnlich, aber von diesem verschieden ist, aus dem Rinder-Nebennierenmark durch Prof. Nonomura et al., Fachbereich Pharmakologie, medizinische Fakultät, Universität Tokio (Maekawa et al., J. Biol. Chem. 265, 10940–10942) isoliert.
Gelsolin ist in verschiedenen Geweben und im Blutplasma relativ weit verbreitet (Stossel et al., Annu. Rev. Cell Biol. 1 (1985), 353–402), während die Verbreitung von Adseverin hauptsächlich auf Gewebe mit sekretorischen Funktionen beschränkt ist (Sakurai et al., Neuroscience 38 (1990), 743–756). Dieser Unterschied in der Gewebeverteilung dieser Proteine legt nahe, dass Adseverin enger mit sekretorischen Prozessen in Beziehung steht (das heißt, Kontrolle der Freisetzung von Neurotransmittern, endokrinen Substanzen oder physiologisch aktiven Substanzen), als dies Gelsolin tut. Folglich ist es in hohem Maße interessant die Struktur und die Funktion von Adseverin zu enthüllen, um damit die Rolle und die regulatorischen Mechanismen von Actin-Filamenten bei der Exocytose zu klären.
In früheren Tagen wurde im Allgemeinen angenommen, dass dieser Prozess durch fusionierte Proteine, etc. reguliert wird, [Nishizaki, "Kaiko Hoshutsu Gesho ni okeru Saiboshitsu Tanpakushitsu no Yakuwari (Roles of Cytoplasmic Proteins in Exocytosis)", Saibo Kogaku (Cell Technology), 13 (1994), 353–360]. Nonomura et al. wiesen jedoch neulich in ihrer Hypothese darauf hin, dass dieser Prozess letztendlich von einer Interaktion zwischen Actin und Myosin abhängt. Diese Hypothese stellt weiterhin die Epoche machende Idee bereit, dass die Regulation durch das Actin-zerstörende Protein in nicht-muskulären Zellen, im Unterschied zur Regulation auf der Myosin-Seite durch die Kinase der leichten Myosinkette auf der Actin-Seite stattfindet (Mochida, "Miosin Keisa Kinaze Shinkei Dentatsu Busshitsu Hoshutsu to sono Chosetsu ni okeru Miosin Keisa Kinaze no Yakuwari (Role of Myosin Light Chain Kinase in Release of Myosin Light Chain Kinase Neurotransmitter and Regulation thereof)", Saibo Kogaku (Cell Technology), 13 (1994), 381–388].
Es wird angenommen, dass Actin aus aufgebrochenen Zellen freigesetzt wird und die Agglutination von Blutplättchen im Blut induziert oder fördert, um so die Entstehung eines Thrombus auszulösen (Scarborough et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 100 (1981), 1314–1319). Andererseits hat Adseverin in vivo, wie vorstehend beschrieben, eine dem Gelsolin ähnliche Aktivität (das heißt, eine Actin-Filament-zerstörende Aktivität). Diese Tatsachen weisen darauf hin, dass das Adseverin für Thromben betreffende Arzneistoffe geeignet sein könnte (zum Beispiel: Thrombose-Inhibitoren).
Es wird weiterhin erwartet, dass die Freisetzung von zum Beispiel einer physiologisch aktiven Substanz auf der Gen-Ebene durch Verabreichung einer Antisense-DNA-Sequenz, welche auf der Basis der Basensequenz, die Adseverin codiert, entworfen wurde, reguliert werden könnte. Da Adseverin in enger Beziehung zur Vermehrung der glatten Muskulatur der Gefäße stehen könnte, wird angenommen, dass die Verabreichung von Antisense-DNA die Funktion von Adseverin regulieren würde, um damit die Vermehrung der glatten Muskulatur zu inhibieren. Dementsprechend wird erwartet, dass die Verabreichung der Antisense-DNA von Adseverin bei der Inhibition der Angiostenose bei der Gefäßtransplantation bei Bypass-Operationen etc. oder bei der Hemmung der Restenose nach perkutaner tansluminaler koronarer Angioplastie (PTCA) anwendbar sein könnte.
Um das Actin-regulierende Protein Adseverin für die medizinischen Zwecke, wie vorstehend beschrieben, zu verwenden, ist es notwendig, Adseverin in großen Mengen und in gleichförmiger Qualität herzustellen. Es ist jedoch schwierig gleichförmiges Adseverin in großen Mengen durch konventionelle Verfahren zu gewinnen, bei denen Adseverin aus einem tierischen Gewebe an sich oder aus einem Kulturüberstand von Adseverin produzierenden Zellen isoliert wird. Es ist deshalb notwendig, die Basensequenz des Gens, welches Adseverin codiert, zu klären, um Adseverin in großen Mengen unter Verwendung von Techniken der Genrekombination herzustellen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Basensequenz des Gens, welches Adseverin codiert, zu klären. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Adseverin in einer großen Menge unter Verwendung von Techniken der Genrekombination unter Verwendung eines rekombinanten Vektors, welcher die vorstehend genannte Sequenz enthält, herzustellen und ein Durchmusterungs-System etc. unter Verwendung desselben zu entwickeln und so neue Arzneistoffe zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Antisense-DNA auf der Basis der Basensequenz des Gens, welches Adseverin codiert, herzustellen und sie als Arzneistoff zur Hemmung der Erzeugung von Adseverin zu verwenden. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Antikörper bereitzustellen, der fähig ist das Adseverin-Protein zu erkennen.
Die hier genannten Erfinder isolierten und reinigten Adseverin aus Rinder-Nebennierenmark und klärten seine Eigenschaften auf (Sakurai et al., Neuroscience 38 (1990), 743–756; Sakurai et al., J. Biol. Chem. 226 (1991), 4581–4584; Sakurai et al., J. Bio. Chem. 266 (1991), 15979–15983).
Im Weiteren wurde ein hydrolysiertes Fragment dieses Proteins gewonnen und es wurden, basierend auf der partiellen Information über seine Aminosäuresequenz, Oligonucleotidprimer synthetisiert. Andererseits wurde durch reverse Transkription cDNA aus der aus MDBK-Zellen, einer Zelllinie, die aus Rinder-Nieren etabliert wurde (JCRB-Zelle, erhalten von der Japan Foundation for Cancer Research), präparierten mRNA hergestellt. Dann wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der vorstehend synthetisierten Primer durchgeführt, um dadurch spezifisch das DNA-Fragment, welches das Rinder-Adseverin codiert, zu amplifizieren. Als Nächstes wurde eine cDNA-Genbank, welche aus Rinder-Nebennierenmark hergestellt wurde, unter Verwendung des vorstehend genannten, mit ³²P markierten DNA-Fragmentes als Sonde einer Durchmusterung unterzogen. Das Zielgen, welches das Actin-Filament-zerstörende Protein codiert, wurde aus 3 so erhaltenen, überlappenden Clonen zusammengesetzt. Somit wurde die gesamte Basensequenz des Gens erfolgreich identifiziert.
Anschließend verwendeten die hier genannten Erfinder diese Rinder-Adseverin-cDNA als Sonde und führten eine Durchmusterung einer cDNA-Genbank, welche aus menschlicher Nieren-mRNA hergestellt wurde, mittels Plaque-Hybridisierung unter wenig-stringenten Bedingungen durch. Somit isolierten sie die cDNA des menschlichen Adseverins und identifizierten erfolgreich die gesamte Basensequenz der selben.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Gen bereit, welches Adseverin codiert. Im Einzelnen stellt sie eine DNA bereit, die eine Basensequenz, welche die in SEQ ID Nr. 4 im Sequenzprotokoll gezeigte Aminosäuresequenz codiert und optional teilweise Austäusche, Deletionen oder Hinzufügungen aufweist, oder eine Basensequenz enthält, die mit dieser hybridisierbar ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Vektor bereit, der das Gen enthält, welches das Adseverin-Protein codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen bereit, die durch den rekombinanten Vektor, der das Gen enthält, welches das Adseverin-Protein codiert, transformiert wurden.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Herstellung des Adseverin-Proteins bereit, welches die Inkubation einer Transformanten, die durch Transformation mit dem rekombinanten Vektor, welcher das Gen enthält, welches das Adseverin-Protein codiert, gewonnen wurde, und die Isolation und Aufreinigung des gewünschten Proteins, welches so hergestellt wurde, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem das rekombinante Adseverin-Protein bereit, welches durch das vorstehend genannte Verfahren hergestellt wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Oligonucleotid bereit, welches spezifisch mit dem Gen hybridisierbar ist, welches das Adseverin codiert.
Die vorliegende Erfindung beschreibt zudem ein Verfahren zur Regulation der Erzeugung von Adseverin in einem Tier, welches die Verabreichung eines Oligonucleotides, welches spezifisch mit dem Gen hybridisierbar ist, welches das Adseverin codiert, an das Tier umfasst.
Durch Verwendung eines markierten Adseverin-cDNA-Fragmentes als Sonde, führten die Erfinder weiterhin in situ-Hybridisierungen durch und untersuchten die Expression von Adseverin-mRNA in Geweben, um dadurch die Verteilung von Adseverin in den Geweben aufzuklären. Es wurde auch die Actin-zerstörende Domäne im Adseverin untersucht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Photographie, welche das elektrophoretische Muster von aufgereinigtem Adseverin, welches aus Rinder-Nebennierenmark gewonnen wurde, im Vergleich mit aufgereinigtem Gelsolin, welches aus Rinder-Aorta gewonnen wurde, zeigt. Eine SDS-PAGE wurde unter Verwendung eines linearen 6,5–10,5%igen Gradientengels durchgeführt. Die Spuren 1 und 2 zeigen Fraktionen von Rinder-Aorta, welche mit einer DNAse I-Affinitätssäule behandelt wurden. Die Spur 1 entspricht dem EGTA-Eluat, während die Spur 2 dem 6 M Harnstoff-Eluat entspricht. Die Spuren 3 bis 8 zeigen Fraktionen welche aus Rinder-Nebennierenmark gewonnen wurden. Die Spuren 3, 4, 5, 6, 7 und 8 entsprechen nämlich jeweils: dem unbehandelten Extrakt; dem EGTA-Eluat von der DNAse I-Affinitätssäule; 6 M Harnstoff-Eluat von der DNAse I-Affinitätssäule; der das Adseverin enthaltenden Q-Sepharose-Fraktion; der das Plasma-Gelsolin, das cytoplasmatische Gelsolin und das Actin enthaltenden Q-Sepharose-Fraktion; und dem durch HPLC-Gelfiltration aufgereinigten Adseverin. Die Spur M zeigt Molekulargewichtsmarker von 94000, 67000, 43000 und 30000 von oben nach unten.
2 zeigt einen Vergleich zwischen der partiellen Aminosäuresequenz eines Adseverin-Fragmentes mit einem Molekulargewicht von 39000 (C39) und der Aminosäuresequenzen der entsprechenden Teile des Gelsolins und des Villins.
3 zeigt die Aminosäuresequenz des N-Terminus eines Fragments, welches durch die Spaltung von Adseverin mit Thermolysin gewonnen wurde, und seiner vorhergesagten Position im Vergleich mit Gelsolin.
4 zeigt eine Restriktionskarte der Rinder-Adseverin-cDNA. Der als PCR bezeichnete Balken steht für die cDNA, welche durch Reverse Transkription von RNA von MDBK-Zellen und PCR hergestellt wurde. Die offenen Balken, welche mit 19, 5 und 21 nummeriert sind, stehen für individuelle cDNA-Clone, die aus der λgt11-cDNA-Genbibliothek aus Rinder-Nebennierenmark isoliert und bei der Erstellung der Adseverin-cDNA verwendet wurden.
5 zeigt die Aminosäuresequenz des Rinder-Adseverins, welche in der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, im Vergleich mit den Aminosäuresequenzen der entsprechenden Segmente des menschlichen Gelsolins und des menschlichen Villins. Die Zahlen an der rechten Seite bezeichnen die Segmentnummern für Adseverin, Gelsolin und Villin. Die größte Homologie besteht zwischen den Segmenten 1 und 4, 2 und 5 und 3 und 6. Die hochkonservierten Sequenzmotive werden durch Umrahmung gezeigt. Mögliche Polyphosphoinositid-Bindungsstellen sind durch Umrahmung mit gepunkteten Linien gezeigt. Das Diagramm mit den von 1 bis 6 nummerierten Ellipsen, welches unten gezeigt wird, deutet die 6 homologen Segmente dieser Proteine an.
6 ist eine Photographie, welche das elektrophoretische Muster der Expression von Adseverin in Escherichia coli und seiner Aufreinigung zeigt. In 6 zeigt A eine SDS-PAGE-Untersuchung der Expression von Adseverin in E. coli. Die Transformante wurde bei Anwesenheit (Spur 3) oder Abwesenheit (Spur 2) von 0,4 mM IPTG für 3 Stunden inkubiert. Dann wurden die pelettierten Zellen in einem SDS-Probenpuffer aufgelöst, erhitzt und auf ein SDS-Polyacrylamidgel geladen. Nach der Durchführung der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Der Pfeil zeigt die Adseverin-Bande. Spur 1 zeigt Molekulargewichtsmarker. In 6 zeigt B eine Immunblot-Untersuchung, welche nach der Expression von Adseverin in E. coli und Aufreinigung desselben durchgeführt wurde. Das aufgereinigte Adseverin wurde mit einer SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Der Blot wurde mit Ponceau S gefärbt (Spur 2) und nach Entfärbung unter Verwendung eines durch Affinitätsreinigung aufgereinigten Antikörpers gegen Adseverin (Spur 3) immunologisch nachgewiesen. Die Spur 1 zeigt Molekulargewichtsmarker.
7 zeigt den Effekt von in E. coli exprimiertem Adseverin auf die Actin-Polymerisierung, welche mit einem Viskosimeter gemessen wurde. Actin wurde in Puffer P, welcher 0,1 mM CaCl₂ (A) oder 1 mM EGTA (B) enthält, polymerisiert. In 7 zeigen die durch o und Δ ausgedrückten Daten die Ergebnisse der Polymerisierung bei der alleinigen Anwesenheit von Actin, während die durch • und
ausgedrückten Daten die Ergebnisse für die Polymerisierung bei der Anwesenheit des Adseverins, welches in einem molaren Verhältnis zu Actin von 1:30 hinzugefügt wurde, zeigen. Das Adseverin wurde der Actin-Lösung in einem molaren Verhältnis von 1:30 an den durch die Pfeile angezeigten Punkten hinzugefügt.
8 stellt lichtmikroskopische Photographien bereit, welche die Morphologie von Organismen und die Expression von Adseverin und seiner mRNA im Grenzbereich zwischen der Rinde und dem Mark der Rinder-Nebenniere zeigen. In jeder Photographie entspricht der obere Teil der Rinde, während der untere Teil dem Mark entspricht. Die Schnitte wurden mit Toluidin-Blau gefärbt (Bildtafel a) oder aufeinanderfolgend mit einem anti-Adseverin-Antikörper aus dem Kaninchen und Fluorescein-konjugiertem anti-Kaninchen-Immunglobulin (Bildtafeln b und e). Bildtafel d zeigt ein Phasenkontrastbild des gleichen Bereichs wie der in der Bildtafel e. Bildtafeln c und f zeigen die Bilder einer in situ-Hybridisierung. Die Bildtafeln a bis c zeigen eine 120-fache Vergrößerung, während die Bildtafeln d bis feine 280-fache Vergrößerung zeigen.
9 zeigt einen Vergleich zwischen der Aminosäuresequenz des menschlichen Adseverins und der Aminosäuresequenz von Rinder-Adseverin. In 9 entsprechen die oberen und unteren Säulen der menschlichen Aminosäuresequenz bzw. der Rinder-Aminosäuresequenz. Diese Aminosäuresequenzen sind an den Aminosäuren mit der Markierung * vollständig miteinander identisch und an den Aminosäuren mit der Markierung • in hohem Maße analog. Mögliche Phospholipid-Bindungsstellen sind durch durchgezogene Linien umrahmt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Adseverin codierende cDNA kann zum Beispiel durch Präparation von mRNA aus Adseverin produzierenden Zellen und dann Umwandlung dieser in eine doppelsträngige cDNA durch ein bekanntes Verfahren gewonnen werden.
In der vorliegenden Erfindung wird die mRNA des Rinder-Adseverins aus MDBK-Zellen, welches eine Zelllinie ist, die aus Rinder-Nieren etabliert worden ist, und aus Rinder-Nebennierenmark gewonnen (Madin et al., Proc. Soc. Exp. Biol. 98 (1958), 574–576), während die mRNA des menschlichen Adseverins aus menschlicher Nieren-mRNA gewonnen wurde, welche von CLONTECH Laboratories Inc. erworben wurde. Die Quellen für mRNA sind jedoch nicht darauf beschränkt, sondern es können chromaffine Zellen des Nebennierenmarks, Nierenmark, homogenisiertes Schilddrüsengewebe und so weiter dazu verwendet werden.
Die RNA kann zum Beispiel in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry 18 (1979), 5294–5299) hergestellt werden. Es kann nämlich die gesamte RNA durch Behandlung der Quelle für die RNA mit Guanidin-Thiocyanat, gefolgt von einer Caesium-Chlorid-Gradientenzentrifugation, gewonnen werden. Alternativ können auch Verfahren verwendet werden, die bei der Clonierung von den Genen anderer physiologisch aktiver Proteine angewendet werden, zum Beispiel Behandlung mit einem grenzflächenaktiven Mittel oder Phenol in der Anwesenheit eines Ribonucleaseinhibitors (zum Beispiel eines Vanadium-Komplexes).
Um die doppelsträngige cDNA aus der so erhaltenen mRNA zu gewinnen, wird eine reverse Transkription zum Beispiel unter Verwendung der mRNA als Matrize und eines Oligo (dT) oder eines Zufallsprimers, welcher komplementär zu der Poly-A-Kette am 3'-Ende ist, oder eines synthetischen Oligonucleotids, welches mit einem Teil der Aminosäuresequenz des Adseverins übereinstimmt, als Primer durchgeführt, um so eine DNA (cDNA) zu synthetisieren, die komplementär zu der mRNA ist.
In der vorliegenden Erfindung wird die Rinder Adseverin-cDNA in folgender Weise gewonnen: Es wird nämlich eine reverse Transkription unter Verwendung von Zufallshexameren als Primer durchgeführt. Als Nächstes wird das resultierende Produkt durch eine PCR unter Verwendung von kondensierten Primern amplifiziert, um ein PCR-Produkt zu ergeben, welches einer partiellen cDNA des Adseverins von etwa 700 Bp entspricht. Dann wird dieses PCR-Produkt in pBluescript SK(–) (Stratagene) subcloniert. Als Nächstes wird eine aus Rinder-Nebennierenmark hergestellte λgt11-cDNA-Genbibliothek unter Verwendung des mit ³²P markierten, clonierten PCR-Produktes als Sonde einer Durchmusterung unterzogen. In der vorliegenden Erfindung wurden so 3 Plaques gewonnen und die Adseverin codierende Ziel-cDNA wird auf der Basis der überlappenden Basensequenzen dieser Plaques zusammengesetzt. So wird herausgefunden, dass der offene Leserahmen ein Protein von 80527 Dalton ist, welches aus 715 Aminosäuren zusammengesetzt ist (siehe SEQ ID Nr. 4 im Sequenzprotokoll).
In einem vergleichbaren Beispiel wird die cDNA des menschlichen Adseverins in der folgenden Weise gewonnen: Eine doppelsträngige cDNA wird unter Verwendung des TimeSaver^TM cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) synthetisiert. Dann wird die so synthetisierte doppelsträngige cDNA unter Verwendung einer im vorstehend genannten Kit enthaltenen Spun Column oder einer Agarose-Gelelektrophorese der Größe nach fraktioniert. So wird ausschließlich eine cDNA von etwa 400 Bp oder mehr (im ersteren Fall) oder von etwa 2 bis 3 kBp (im letzteren Fall) aufgenommen. Nach der Ligierung eines Adapters an ein Ende wird die cDNA in einen Vektor eingebaut. Dann wird die so in den Vektor eingebaute cDNA einer Verpackung unter Verwendung des GIGAPACK^® II PACKAGING EXTRACT (STRATAGENE) unterzogen, um eine cDNA-Genbibliothek zu ergeben.
Als Nächstes wird die cDNA-Genbibliothek unter wenig-stringenten Bedingungen und unter Verwendung von thermisch denaturierter Rinder Adseverin-cDNA als Sonde durchmustert. So wird ein positiver Phagen-Clon gewonnen. Dann wird sein cDNA-Abschnitt mittels PCR amplifiziert und in einen Plasmidvektor eingebaut, um dadurch den Clon pADa-17 zu ergeben. Wenn sie teilweise sequenziert wird, zeigt die Basensequenz dieses Clons eine sehr große Homologie (80–90%) mit der Basensequenz der Rinder-Adseverin-cDNA. Im Kontrast dazu, zeigt sie nur eine geringe Homologie von 60% oder weniger mit Gelsolin, welches ein Protein ist, das zur Adseverin-Familie gehört und eine bekannte Basensequenz hat, was nahe legt, dass dieses Gen offensichtlich davon verschieden ist. Somit wird angenommen, dass dieser Clon das menschliche Gegenstück zu Adseverin ist. Dieser Clon hat jedoch etwa eine volle Länge von 1 kBp und enthält so anscheinend nicht die gesamte codierende Region. Dementsprechend sollte eine weitere Durchmusterung durchgeführt werden.
So wird eine Plaque-Hybridisierung unter Verwendung des vorstehend genannten Clons pADa-17 als Sonde bei üblichen Bedingungen mit erhöhter Stringenz durchgeführt. In diesem Schritt wird eine neue Genbibliothek verwendet, welche aus menschlicher Nieren-mRNA durch ausschließliche Konzentrierung von cDNAs mit 2 bis 3 kBp hergestellt wurde, um effizient Clone voller Länge zu gewinnen. So werden daraus 5 positive Phagenclone gewonnen und durch Herausschneiden mit dem ExAssist^TM/SOLR SYSTEM in ein Plasmid (pBluescirpt^® SK(–)-Vektor) gebracht, um dadurch die Plasmid-Clone phAD-2 bis 6 zu ergeben. Unter diesen Plamid-Clonen wurde die Basensequenz von phAD-2 und phAD-4 identifiziert. Durch Kombination dieser Basensequenzen wird eine Sequenz, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist, bestimmt. In dieser Basensequenz wird ein offener Leserahmen, der aus 715 Aminosäuren besteht und ein ATG als Startcodon (Met) an der Position 79 hat, gefunden. 9 zeigt das Ergebnis eines Vergleichs dieser Aminosäuresequenz mit der Rinder-Adseverin-Aminosäuresequenz. Diese Aminosäuresequenzen zeigen eine Homologie von etwa 92% auf der Aminosäureebene, was nahe legt, dass dieses Protein sehr gut über den Speziesunterschied hinweg konserviert worden ist. Es wird ebenfalls aufgeklärt, dass diese Aminosäuresequenzen große Analogie in vielen Aminosäuren haben, obwohl sie untereinander nicht vollständig gleich sind. Obwohl eine große Homologie von etwa 90% auf der Basenebene beobachtet wird, zeigt die Homologie eine schnelle Abnahme nach dem Stoppcodon, was anscheinend den Speziesunterschied reflektiert.
In 9 sind mögliche Phospholipid-Bindungsstellen durch durchgezogene Linien umrahmt. Die möglichen Phospholipid-Bindungsstellen in Rinder-Adseverin, nämlich (112) KGGLKYKA (119) und (138) RLLHVKGRR (146), sind auch beide im menschlichen Adseverin vollständig konserviert. Somit wird vorgeschlagen, dass der Unterschied in der Sensitivität für Phospholipide zwischen Adseverin und Gelsolin durch den Unterschied in den Aminosäuresequenzen dieser Regionen bedingt sein könnte. Es wird berichtet, dass Adseverin in Zellen in der Nähe der Zellmembran lokalisiert ist. Somit könnte die Regulation der Aktivität von Adseverin durch Bestandteile der Zellmembran, wenn sie existiert, von großer Wichtigkeit sein. Da Gelsolin ebenfalls durch Ca²⁺ aktiviert wird, besteht eine echte Wahrscheinlichkeit, dass Phospholipide kontrollieren könnten, wie diese Proteine von Fall zu Fall verwendet werden.
Unter Verwendung des so erhaltenen clonierten Gens der vorliegenden Erfindung, welches Adseverin codiert, kann Adseverin in großen Mengen durch Techniken der Genrekombination hergestellt und für medizinische Zwecke verwendet werden.
Dementsprechend können prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen durch geeignete Vektoren transformiert werden, in welche das Gen der vorliegenden Erfindung, welches das Adseverin codiert, eingebaut wurde.
Weiterhin kann das Gen durch die Einführung eines geeigneten Promotors oder einer die Expression betreffenden Sequenz in diese Vektoren, in jeder Wirtszelle exprimiert werden. Zudem kann das Zielgen an ein anderes Gen, welches ein Polypeptid codiert, ligiert werden und als Fusionsprotein exprimiert werden, wodurch die Aufreinigung vereinfacht oder das Expressionsniveau erhöht werden kann. Es ist ebenso möglich, das Zielprotein durch die Anwendung geeigneter Behandlungsverfahren während des Aufreinigungsschrittes auszuschneiden.
Es wird im Allgemeinen angenommen, dass ein eukaryontisches Gen einen Polymorphismus aufweist, wie dies im Fall des menschlichen Interferon-Gens bekannt ist. In einigen Fällen sind eine oder mehrere Aminosäuren aufgrund dieses Polymorphismus ausgetauscht, während in anderen Fällen Änderungen nicht bei den Aminosäuren, sondern ausschließlich in der Basensequenz auftreten.
Es wird manchmal beobachtet, dass ein Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 im Sequenzprotokoll besitzt und eine Deletion, Addition oder einen Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren besitzt, eine Actin-Filament-zerstörende Aktivität aufweist. Zum Beispiel ist es allgemein bekannt, dass ein Polypeptid, welches durch den Austausch der Basensequenz, die einem Cystein des menschlichen Interleukin 2 (IL-2) entspricht, durch eine andere Basensequenz, welche Serin entspricht, gewonnen wird, die IL-2-Aktivität behält (Wang et al., Science 224 (1984), 1431). Somit sind die Techniken zur Herstellung der Varianten dieser Adseverin codierenden Gene den Fachleuten wohl bekannt.
Zudem ist Rinder-Adseverin in hohem Maße homolog mit dem menschlichen Adseverin und in einem hohem Maße bei vielen Aminosäuren analog, obwohl diese nicht vollkommen gleich sind, wie vorstehend beschrieben.
Dementsprechend liegen Gene, welche teilweise Austausche des Rinder-Adseverins besitzen, und chimäre Gene des selben auch im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Wenn Adseverin in eukaryontischen Zellen exprimiert wird, werden häufig eine Zuckerkette oder Zuckerketten daran angefügt und das Anfügen der Zuckerketten kann durch die Umwandlung einer oder mehrerer Aminosäuren kontrolliert werden. In solch einem Fall hat das Expressionsprodukt manchmal eine Actin-Filament-zerstörende Aktivität. Deshalb schließt die vorliegende Erfindung jedes Gen ein, welches durch die künstliche Variation des Adseverin codierenden Gens gewonnen wird und ein Polypeptid codiert, so lange das gewonnene Polypeptid eine Actin-Filament-zerstörende Aktivität besitzt.
Weiterhin schließt die vorliegende Erfindung ein Gen ein, welches fähig ist, ein Polypeptid zu ergeben, das eine Actin-Filament-zerstörende Aktivität hat und mit einem in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls dargestellten Gen hybridisierbar ist. Die Hybridisierung kann unter den Bedingungen durchgeführt werden, die für gewöhnlich bei der Hybridisierung von Sonden verwendet werden (vgl. zum Beispiel: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Ein Expressionsvektor kann einen Replikationsursprung, einen Selektionsmarker, einen Promotor, eine RNA-Spleißstelle, ein Polyadenylierungssignal und so weiter enthalten.
Beispiele für die prokaryontischen Zellen, welche als Wirtszellen in dem Expressionssystem zu verwenden sind, schließen E. coli und Bacillus subtilis ein. Beispiele für die eukaryontischen Zellen, welche als Wirtszellen verwendbar sind, schließen Hefen und Myxomycota ein. Alternativ können Insektenzellen wie Sf9 als Wirtszellen verwendet werden. Zusätzlich können Wirtszellen mit tierischem Ursprung wie COS-Zellen und CHO-Zellen dazu verwendet werden.
Das Protein, welches durch Inkubation einer Transformante, welche durch das Adseverin codierende Gen transformiert wurde, hergestellt wurde, kann entweder in den Zellen oder nach Isolierung aus den Zellen aufgereinigt werden.
Adseverin kann durch Verfahren, welche üblicher Weise zur Isolierung und Aufreinigung von Proteinen verwendet werden, isoliert und aufgereinigt werden. Zum Beispiel können dazu verschiedene Chromatographien, Ultrafiltration, Aussalzung, Dialyse und so weiter in adäquater Weise ausgewählt und kombiniert werden.
Eine Antisense-DNA kann auf der Basis der Basensequenz des Adseverin codierenden Gens hergestellt werden. Die Antisense-DNA, welche eine Basensequenz hat, die komplementär zu der mRNA ist, bildet Basenpaare mit der mRNA und blockiert die Weiterleitung von genetischer Information und reguliert somit die Synthese des Adseverin-Proteins, das heißt des Endproduktes. Die in der vorliegenden Erfindung verwendbare Antisense-DNA ist ein Oligonucleotid, das spezifisch mit einer Basensequenz hybridisierbar ist, welche die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls dargestellt ist, codiert.
Die Bezeichnung "Oligonucleotid", wie sie hier verwendet wird, bedeutet ein Oligonucleotid, welches aus einer in der Natur vorkommenden Base mit einer daran über eine Phosphodiesterbindung im eigentlichen Sinne oder über ein Analog davon bindenden Zuckereinheit zusammengesetzt ist. Das heißt, die erste so gemeinte Gruppe schließt natürliche Oligonucleotide und synthetische Oligonucleotide, welche aus natürlich vorkommenden oder dazu homologen Untereinheiten hergestellt sind, ein. Die Bezeichnung "Untereinheit" bedeutet eine Kombination einer Base mit einem Zucker, die an die benachbarte Untereinheit über eine Phosphodiesterbindung oder eine andere Bindung gebunden ist. Die zweite Gruppe des Oligonucleotides schließt Analoga der vorstehend genannten Oligonucleotide ein, welche die selbe Funktion wie Oligonucleotide haben, aber Reste haben, die einige Bestandteile aufweisen, welche in der Natur nicht beobachtet werden. Oligonucleotide, welche an der Phosphatgruppe, der Zuckereinheit oder dem 3'- oder 5'-Ende chemisch modifiziert worden sind, um die Stabilität zu steigern, fallen ebenfalls in diese Kategorie. Beispiele dafür schließen Oligophosphorothioate und Oligomethylphosphonate ein, worin ein Sauerstoffatom in der Phosphodiesterbindung zwischen den Nucleotiden durch ein Schwefelatom bzw. eine Methylgruppe ersetzt worden ist. Die Phosphodiesterbindung kann durch eine andere Struktur ersetzt werden, welche nicht-ionisch oder nicht-chiral ist. Als Oligonucleotidanaloga können jene verwendet werden, die modifizierte Basen enthalten, wie zum Beispiel Purine und Pyrimidine, welche in der Natur nicht beobachtet werden.
Das Oligonucleotid hat bevorzugt 8 bis 40, stärker bevorzugt 15 bis 30 Untereinheiten.
Es ist bevorzugt, dass der Zielbereich der mRNA, mit dem das Oligonucleotid hybridisiert wird, die Initiationsstelle der Transkription, die Initiationsstelle der Translation, der Intron – Exon-Übergang oder die Position der 5'-Kappen-Struktur ist. Es ist erforderlich durch Berücksichtigung der Sekundärstruktur der mRNA einen Bereich auszuwählen, der frei von starken Behinderungen ist.
Das Oligonucleotid kann durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Syntheseverfahren hergestellt werden, zum Beispiel die Festphasensynthese unter Verwendung eines von Applied Biosystems hergestellten Syntheseautomaten und so weiter. Es ist auch möglich, unter Verwendung ähnlicher Verfahren andere Oligonucleotidanaloga wie Phosphorothioat oder alkylierte Derivate herzustellen [Murakami et al., "Kinosei Antisense DNA no Kagaku Gosei (Chemical Synthesis of Funktional Antisense DNA)", Yuki Gosei Kagaku (Organic Synthesis Chemistry), 48 (1990), 180–193].
Durch Verabreichung eines spezifisch mit dem Adseverin codierenden Gen der vorliegenden Erfindung hybridisierbaren Oligonucleotids an ein Tier kann die Erzeugung von Adseverin in dem Tier reguliert werden. Wie vorstehend beschrieben, könnte Adseverin mit der Vermehrung der glatten Muskulatur der Blutgefäße in Beziehung stehen. Die Vermehrung der glatten Muskulatur der Blutgefäße wird als einer der Faktoren angesehen, die Angiostenose bei der Blutgefäßtransplantation bei Bypassoperationen und so weiter oder Restenose, welche in einem Anteil von 30 bis 40% nach einer PTCA beobachtet wird, verursachen. Dementsprechend ist die Antisense-DNA des Adseverin codierenden Gens, deren Verabreichung die Vermehrung von glatter Muskulatur der Blutgefäße unterdrücken kann, als Präventivmittel und Heilmittel für diese Stenosen verwendbar. Zum Beispiel wird erwartet, dass eine Angiostenose durch Einlegen eines zu transplantierenden Blutgefäßes in eine Lösung verhindert werden kann, die ein solches Oligonucleotid enthält, um dadurch das Oligonucleotid in die Zellen zu inkorporieren, gefolgt von der Transplantation. Es ist auch möglich eine Restenose durch Verabreichung eines solchen Oligonucleotids unter Verwendung eines PTCA-Katheters oder Stents zu verhindern.
Ein Antikörper, der fähig ist das Adseverin-Protein zu erkennen, kann in Übereinstimmung mit einem konventionellen Verfahren [vgl. zum Beispiel: Shinseikagaku Jikken Koza (New Biochemistry Experiment Lecture) 1, Tanpakushitsu (Protein) I (1992), 389–397] durch Immunisierung eines Tiers mit dem als Antigen dienenden Adseverin und der Entnahme und Aufreinigung des so im Körper des Tiers hergestellten Antikörpers, hergestellt werden. Der so gewonnene anti-Adseverin-Antikörper ist in verschiedenen immunologischen Testverfahren wie Enzym-Immuntests (zum Beispiel ELISA), Radioimmuntests und Immunfluoreszenzverfahren anwendbar.
Beispiele
Um das Verfahren zur Gewinnung des Adseverin codierenden Gens der vorliegenden Erfindung und zur Expression dieses Gens in Wirtszellen weiter und noch detaillierter darzustellen, werden die folgenden Beispiele gegeben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Beispiel 1: Isolierung und Aufreinigung des Rinder-Adseverins.
Rinder-Nebennieren wurden von einem Schlachthaus erhalten. Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden bei 4°C durchgeführt. Das Mark der Nebennieren wurde sorgfältig von der Rinde getrennt und mit Scheren zerkleinert. 80 g des so gewonnen Materials wurden in dem dreifachen Volumen Puffer A (pH 8,0), der 40 mM Tris-HCl, 4 mM EGTA, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM DFP, 1 mM PMSF, 10^–6 M E-64-c, 10 μg/ml Aprotinin (Trasylol, Bayer) und 0,02% NaN₃ enthielt, in einem Waning-Mixer homogenisiert. Das Homogenat wurde dann bei einem Maximum von 13000 g über 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde gefiltert und weiter bei einem Maximum von 150000 g über 90 Minuten zentrifugiert. Dem Überstand wurden 1 mol CaCl₂- und MgCl₂-Lösungen zugesetzt, um Endkonzentrationen von 0,5 mM beziehungsweise 1 mM zu ergeben. Dann wurde die sich ergebende Lösung über eine DNAse I-Affi-Gel 15-Säule geschickt, welche mit Puffer B (pH 7,5), der 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM PMSF und 0,02% NaN₃ enthielt, äquilibriert worden war. Dann wurde die Säule nacheinander mit dem Puffer B und dem modifizierten Puffer B, der nicht 50 mM, sondern 0,6 M KCl enthielt, gewaschen.
Als Nächstes wurden mit dem modifizierten Puffer B, der 10 mM EGTA als Ersatz für 0,5 mM CaCl₂ enthielt, Ca²⁺-empfindliche Proteine eluiert und mit dem modifizierten Puffer B, der 6 M Harnstoff enthielt, eluiert. So wurden 3 Ca²⁺-empfindliche, Actin-bindende Proteine und Actin (Molekulargewicht 42000) mit dem EGTA enthaltenden Puffer eluiert. Die Ergebnisse der SDS-PAGE legten nahe, dass diese 3 Proteine Molekulargewichte von 86000, 84000 bzw. 74000 hatten (1, Spuren 1 bis 4). Die Säule wurde durch Waschen mit dem Puffer B regeneriert und bei 4°C gelagert.
Das so gesammelte EGTA-Eluat wurde mit 1 M Tris auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt und dann auf eine Q-Sepharose-Ionen-Austauschersäule (1,5 × 12 cm) aufgetragen, welche mit einer Lösung (pH 8,2), die 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 0,1 mM PMSF, 7 mM 2-Mercaptoethanol und 0,02% NaN₃ enthielt, äquilibriert worden war. Die Proteine wurden mit einem linearen KCl-Gradienten von 50 bis 250 mM und dann mit 1 M KCl eluiert. Die erste Peak-Fraktion, die 0 bis 150 mM KCl entsprach, enthielt das Protein mit einem Molekulargewicht von 74000 zusammen mit einer geringen Menge kontaminierender Proteine (1, Spur 6). Die Proteine mit den Molekulargewichten von 86000 und 84000 und Actin waren im zweiten Peak enthalten, der das Eluat mit 1 M KCl war (1, Spur 7)
Die Fraktion, die das Protein mit einem Molekulargewicht von 74000 enthielt, wurde gesammelt, konzentriert und auf eine Gelfiltrations-HPLC-Säule (TSK-G3000SW, Tosoh) aufgetragen, welche mit Puffer C (pH 7,0), der 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 0,1 mM DTT und 0,02% NaN3 enthielt, äquilibriert worden war (1, Spur 8). Die Peak-Fraktionen wurden gesammelt und auf Eis gelagert.
Beispiel 2: Protease-Spaltung von Rinder-Adseverin
(1) Spaltung durch Staphylococcus V8-Protease
Adseverin im Spaltungspuffer C (1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,02% NaN₃ und 50 mM NH₄HCO₃) wurde durch Staphylococcus V8-Protease bei Raumtemperatur in einem Verhältnis von 1:25 (Gew./Gew.) gespalten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 mM DFP gestoppt und nachfolgend durch SDS-PAGE untersucht. So wurde herausgefunden, dass Adseverin in zwei Hauptfragmente mit einem Molekulargewicht von 42000 und 39000 gespalten wurde. Nach Spaltung mit der V8-Protease über längere Zeit wurde das Fragment mit einem Molekulargewicht von 39000 weiter in Fragmente mit Molekulargewichten von 28000 und 15000 gespalten, während das Fragment mit einem Molekulargewicht von 42000 stabil blieb.
(2) Spaltung durch Trypsin
Adseverin in Puffer D (1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,02% NaN₃ und 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) wurde durch Trypsin in einem Verhältnis von 1:200 gespalten. Nach Umsetzung über 60 Minuten bei 25°C wurde eine 200 mM Lösung von PMSF in Ethanol hinzugefügt, um eine PMSF-Endkonzentration von 4 mM zu ergeben, gefolgt von einer SDS-PAGE-Untersuchung. So wurde herausgefunden, dass Adseverin ebenfalls in zwei Fragmente mit einem Molekulargewicht von 42000 und 39000 gespalten wurde und dass danach keine weitere Spaltung auftrat.
Durch die Ergebnisse der Erkennungsreaktionen von 2 polyclonalen anti-Gelsolin-Antikörpern mit den vorstehend genannten 2 Fragmenten konnte bestätigt werden, dass das Fragment mit einem Molekulargewicht von 39000 kein Spaltungsprodukt des Fragments mit einem Molekulargewicht von 42000 war.
(3) Aufreinigung des Spaltungsproduktes der V8-Protease
Das V8-Spaltungsprodukt wurde auf eine HPLC-DEAE-Ionenaustauschersäule (DEAE-SPW, Tosoh), welche mit Puffer D äquilibriert worden war, aufgetragen. Das Fragment mit einem Molekulargewicht von 39000 wurde durch die Säule adsorbiert, während dasjenige mit dem Molekulargewicht von 42000 mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 150 mM eluiert wurde und als einzelner Peak bei der NaCl-Konzentration von 10 mM erhalten wurde. Als Nächstes wurde der Puffer D, der kein EGTA, sondern 0,5 mM CaCl₂ enthielt, verwendet. So wurde das Fragment mit einem Molekulargewicht von 39000 eluiert, das Fragment mit einem Molekulargewicht von 42000 wurde jedoch nur in geringer Menge gewonnen. Diese 2 so aufgereinigten Spaltungsfragmente der V8-Protease zeigten annähernd die selben Muster in der SDS-PAGE.
(4) Identifizierung der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen der zwei vorangehend (3) aufgereinigten Fragmente und des nativen Adseverins wurden diskutiert. Obwohl die N-Termini des nativen Adseverins und des Fragmentes mit einem Molekulargewicht von 42000 blockiert waren, konnte durch das Edman-Degradationsverfahren aufgeklärt werden, dass der benachbarte Bereich des N-Terminus des Fragmentes mit einem Molekulargewicht von 39000 die folgende Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls hat:
KVAHVKQIPFDA.
Diese Sequenz wurde mit denen der allgemein bekannten Actin-Filament-zerstörenden Proteine Gelsolin (Kwiatkowski et al., Nature 323 (1986), 455–458) und Villin (Bazari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988), 4986–4990) verglichen. Im Ergebnis war die vorstehend genannte Sequenz ähnlich zur Gelenk-Region, welche zwischen den konservierten, repetitiven Segmenten 3 und 4 im Gelsolin und Villin liegt, das heißt, wie in 2 gezeigt, den Mittelteilen dieser Moleküle. Somit wird nahe gelegt, dass das Fragment mit einem Molekulargewicht von 42000 ein Protein ist, welches sich in der NH₂-terminalen Hälfte des Adseverins befindet (nachstehend als "N42" bezeichnet), während das Fragment mit einem Molekulargewicht von 39000 ein Protein ist, welches sich in der COOH-terminalen Hälfte des Adseverins befindet (nachstehend als "C39" bezeichnet).
(5) Actin-bindende Eigenschaften von N42 und C39
Die Actin-bindenden Eigenschaften der vorstehend gewonnenen N42 und C39 wurden unter Verwendung eines an Agarose-Kügelchen gebundenen Actin-Monomers (G-Actin) untersucht. Im Ergebnis wurde aufgeklärt, dass N42 und C39 beide in der Anwesenheit, aber nicht in der Abwesenheit von Calcium an G-Actin banden.
(6) Identifizierung der funktionellen Domäne des Adseverins (Spaltung des N42 durch Thermolysin)
Wenn N42 durch Thermolysin, welches eine Metaproteinase ist, gespalten wurde, wurden 5 Fragmente, einschließlich derer mit einem Molekulargewicht von 31000, 30000 und 16000 und 2 anderer mit einem Molekulargewicht von 15000, gewonnen. Diese Fragmente wurden durch HPLC aufgereinigt. Die Fragmente mit einem Molekulargewicht von 31000 und 30000 wurden als TL1 bzw. TL2 bezeichnet, während die anderen 3 Fragmente als TL3 (Molekulargewicht: 16000), TL4 (Molekulargewicht: 16000) und TL5 (Molekulargewicht: 15000) in der Reihenfolge der Elution von der HPLC-Säule bezeichnet wurden. Die N-Termini von TL1 und TL3 wurden von einem Antikörper A nicht nachgewiesen, da sie, wie im Fall des N42 und des nativen Adseverins, blockiert waren. Andererseits reagierten TL2 und TL5 mit dem Antikörper A. Basierend auf diesen Ergebnissen wird angenommen, dass N42 zwei Spaltungsstellen aufweist, wobei das Fragment, wie in 3 gezeigt, kartiert wird.
Die Aminosäuresequenzen von TL4 und TL5, deren N-Termini nicht blockiert waren, wurden durch das Edman-Degradationsverfahren untersucht. Im Ergebnis wurde bewiesen, dass die N-terminale Aminosäuresequenz von TL4, dargestellt durch SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls, die folgende ist:
VLTNDLTAQ,
was homolog mit der Sequenz der Gelenk-Region zwischen den Segmenten 1 und 2 des Gelsolins ist. Andererseits ist die N-terminale Aminosäuresequenz von TL5, dargestellt durch SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls, die folgende:
ITNRK,
was homolog mit der Sequenz der Gelenk-Region zwischen den Segmenten 2 und 3 des Gelsolins ist (3).
Dementsprechend wird angenommen, dass Adseverin eine Struktur hat, die ähnlich der des Gelsolins ist. Ähnlich dem Gelsolin ist die N-terminale Hälfte des Adseverins aus 3 repetitiven Segmenten, jedes entsprechend einem Proteinspaltungsfragment von bis zu 15 kD, zusammengesetzt.
Beispiel 3: Synthese von degenerierten Primern
Primer-Gemische, welche alle Codons enthielten, die potentiell als die N-terminale Aminosäuresequenz des zweiten Segments (S2) von N42, identifiziert in Beispiel 2, und die N-terminale Aminosäuresequenz von C39 codierende Gene dienen könnten, wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems 380B DNA-Syntheseautomaten synthetisiert. An die 5'-Enden der Sense- und Antisense-Primer wurden BamHI-Schnittstellen bzw. ClaI-Schnittstellen angefügt.
Die Sequenzen der degenerierten Primer waren wie folgt:
5' ... GATGCGGATCCAA (C/T) GA (C/T) (C/T) T (A/C/G/T) AC (A/C/G/T) GC (A/C/G/T) CA ... 3'; und
5' ... GATGCATCGATAC (A/G) TG (A/C/G/T) GC (A/C/G/T) AC (C/T) TT (C/T) TC ... 3'.
Beispiel 4: Reverse Transkription und PCR
RNA wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry 18 (1979), 5294–5299) aus MDBK-Zellen hergestellt, das ist eine aus Rinder-Nieren etablierte Zelllinie (JCRB-Zelle, erhalten von der Japan Foundation for Cancer Research: Madin et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 98 (1958), 574–576).
Die Reverse Transkription und PCR wurden in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Kawasaki durchgeführt [in "PCR protocols: A guide to Methods and Application" (Innis et al., Herausgeber) Seiten 21–27, Academic Press, San Diego, 1990]. Zufallshexamere (Pharmacia) wurden für die reverse Transkription verwendet, während die degenerierten Primer, die in Beispiel 3 gewonnen wurden, für die PCR verwendet wurden [Lee et al., in "PCR protocols: Guide to Methods and Application" (Innis et al., Herausgeber) Seiten 46–53, Academic Press, San Diego, 1990]. Die PCR wurde als erstes mit 5 Zyklen durchgeführt, jeder bestehend aus 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 37°C und 2 Minuten bei 72°C, wobei die Inkubationstemperatur über 2,5 Minuten langsam von 37 auf 72°C erhöht wurde. Als Nächstes wurden 29 Zyklen, jeder bestehend aus 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 2 Minuten bei 72°C, in üblicher Weise wiederholt, gefolgt von 1 Zyklus, bestehend aus 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 10 Minuten bei 72°C. Dann konnte das Reaktionsgemisch bei 4°C stehen.
Beispiel 5: Clonierung des PCR-Produktes
Das in Beispiel 4 gewonnene PCR-Produkt wurde einer Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel, das 1 μg/ml Ethidiumbromid enthielt, unterzogen. Als Ergebnis wurde die Hauptbande bei etwa 700 Bp beobachtet. Dann wurde sie aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung eines GENECLEAN II Kit (BIO 101 Inc.) aufgereinigt. Ihre Größe konnte auf der Basis der Annahme, dass Adseverin in der Primärstruktur in hohem Maße homolog mit Gelsolin sein könnte, in Abhängigkeit von den Positionen der Fragmente, von denen die degenerierten Primer abgeleitet waren, geschätzt werden. Das so aufgereinigte Produkt wurde mit BamHI und ClaI gespalten und in pBluescript SK(–) (Stratagene) cloniert.
Als das clonierte PCR-Produkt sequenziert wurde, war eine den N-Terminus des dritten Segments (S3) von N42 codierende Nucleotidsequenz darin enthalten. Somit war bestätigt, dass dieses PCR-Produkt tatsächlich einem Teil der Adseverin cDNA entsprach. Die große Homologie (Identität auf der Nucleotidebene: 64%) zwischen dieser Sequenz und der Sequenz des menschlichen Gelsolins unterstützte diese Vorstellung ebenfalls.
Das so gewonnene PCR-Produkt wurde mit ³²P markiert und als Sonde in der nachfolgenden Durchmusterung verwendet.
Beispiel 6: Durchmusterung der Genbibliothek
Eine λgt11-cDNA-Genbibliothek, welche aus Rinder-Nebennierenmark (CLONETECH) hergestellt wurde, wurde in Übereinstimmung mit dem Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) unter Verwendung des mit ³²P markierten PCR-Produktes, das in Beispiel 5 gewonnen wurde und welches einer partiellen cDNA des Adseverins entspricht, einer Durchmusterung unterzogen. Nach der zweimaligen Durchführung der Durchmusterung, wurden gut isolierte, positive Plaques entnommen und die Phagen in jedem Plaque wurden in 200 μl destilliertem Wasser freigesetzt und bei Raumtemperatur über 1 Stunde inkubiert. Dann wurde die Phagenlösung eingefroren, aufgetaut und über 10 Minuten auf 90°C erhitzt.
Unter Verwendung einer angemessenen Menge der Phagenlösung als Matrize wurde die Insertion der rekombinanten Phagen-DNA unter Verwendung eines Primerpaars, welches Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts der spezifischen EcoRI-Stelle von λgt11 enthielt, durch eine PCR vervielfältigt. Die PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie jene, die in Beispiel 4 beschrieben wurden, durchgeführt. An die 5'-Enden dieser Primer wurden jeweils XhoI- und NotI-Schnittstellen angefügt. Einer dieser Primer hatte die folgende Sequenz:
5' ... Adseverin CTCGAGGGTGGCGACGACTCC ... 3; und ein anderer hatte die folgende Sequenz:
5' ... Adseverin GCGGCCGCTTGACACCAGACCAA ... 3'.
Nach dem Abschluss der PCR wurde das Reaktionsprodukt einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen. Die vervielfältigte DNA-Insertion wurde ausgeschnitten und unter Verwendung eines GENECLEAN II Kit aufgereinigt. Nach Spaltung mit XhoI und NotI wurde die cDNA-Insertion in pBluescirpt SK(–), der mit XhoI und NotI gespalten worden war, cloniert.
Unter Verwendung des clonierten PCR-Produktes als Sonde wurde die cDNA-Genbibliothek aus Rinder-Nebennierenmark einer Durchmusterung unterzogen. So wurden 3 überlappende cDNA-Clone über Plaques aus 2 × 10⁶ rekombinanten Phagen aufgereinigt.
Die 3 vorstehend erwähnten cDNA-Clone, die sich gegenseitig überlappen, werden durch die Nummern 19, 5 und 21 in 4 dargestellt. Die Basensequenzen dieser clonierten DNAs wurden in beiden Richtungen durch das Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren untersucht (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74 (1977): 5463–5467) und die gesamte Nucleotidsequenz des Adseverins wurde darauf basierend identifiziert. Diese Nucleotidsequenz wird in SEQ ID Nr. 4 im Sequenzprotokoll dargestellt. Die 4 zeigt eine Restriktionskarte der so zusammengesetzten cDNA.
Die Nucleotidsequenz der zusammengesetzten cDNA und die Aminosäuresequenz, die dem längsten offenen Leserahmen entspricht, sind ebenfalls in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls dargestellt. Der offene Leserahmen codiert ein Protein von 80527 Dalton, das aus 715 Aminosäuren besteht. Das erste ATG befindet sich 27 Nucleotide nach 3' vom Start des Clons und entspricht einer guten Konsensussequenz der Translationsinitiation der Wirbeltiere. Ein Vergleich der Adseverin-cDNA-Sequenz mit den Sequenzen von Gelsolin und Villin unterstützt ebenfalls, dass das ATG das Startcodon darstellt und dass die zusammengesetzte cDNA die gesamte codierende Sequenz des Adseverins enthält.
Als Nächstes wurde eine cDNA von 2418 Bp Länge, welche die gesamte codierende Region des Adseverins enthielt, aus den 3 überlappenden Clonen unter Verwendung von AccI- und HindIII-Schnittstellen zusammengesetzt. Diese cDNA wurde in die XhoI- und NotI-Schnittstellen von pBluescript SK(–) eingebaut, um dadurch pSK-Adseverin zu ergeben.
Beispiel 7: Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz von Adseverin mit der Aminosäuresequenz des menschlichen Gelsolins und Villins
Biochemische Untersuchungen und die aus der cDNA vorhergesagte Aminosäuresequenz haben offengelegt, dass menschliches Gelsolin und Villin jeweils aus 6 homologen Segmenten bestehen (Bazari et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 85 (1988), 4986–4990; Matsudaira et al., Cell 54 (1988), 139–140; Way et al., J. Mol. Biol. 203 (1988), 1127–1133). Die Segmente 1, 2 und 3 haben jeweils größere Homologien mit den Segmenten 4, 5 bzw. 6 als alle anderen Kombinationen. Die Untersuchung der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Adseverins hat offengelegt, dass Adseverin ebenfalls 6 homologe Segmente hat. Die Segmente 1 bis 6 haben jeweils Homologien mit den entsprechenden Segmenten des Gelsolins und des Villins (5). Wie die 5 klar zeigt, wurden die Motive B, A und C, welche in jedem der 6 Segmente des Gelsolins und des Villins vorkommen, ebenfalls in den 6 Segmenten des Adseverins gefunden. Diese Tatsachen deuten an, dass Adseverin zur Familie der Gelsolin-Proteine gehört.
Zudem wurden die möglichen Polyphosphoinositid-Bindungssequenzen, welche in Gelsolin und Villin vorkommen, auch im Adseverin in den Bereichen, die den Bereichen des Gelsolins und Villins entsprechen, das heißt, den ersten und zweiten Segmenten (S1, S2), gefunden. Diese Tatsache stimmt mit den Daten überein, dass die Protein-Fragment-zerstörende Aktivität, entsprechend S1–S2 des Adseverins, durch Polyphosphoinositid gehemmt wird. Diese Sequenzen sind in 5 umrahmt und werden als Modellansicht in Tabelle 1 gezeigt. Eine dieser 2 möglichen Sequenzen stimmte vollständig mit der Konsensussequenz überein, während eine andere, die sich im ersten Segment befand, sich von der Konsensussequenz in nur einer Aminosäure unterschied. Das heißt, dass sie ein Alanin am COOH-Terminus aufwies, während die Konsensussequenz eine basische Aminosäure an dieser Position aufwies. Somit hatte diese Domäne des Adseverins eine weniger basische Beschaffenheit als jene der entsprechenden Domäne des Gelsolins. Dieser Unterschied könnte zum Teil dafür verantwortlich sein, dass saure Phospholipide, die von Phosphatidylinosit-4,5-Bisphosphat und Phosphatidylinosit-4-Monophosphat verschieden sind, wie zum Beispiel Phosphatidylinosit und Phosphatidylserin, die zerstörende Aktivität des Adseverins, aber nicht die des Gelsolins hemmen können.
Beispiel 8: Expression der Adseverin-cDNA in E. coli.
Die Rinder-Adseverin-cDNA (pSK-Adseverin), welche in Beispiel 6 gewonnen wurde, wurde durch PCR vervielfältigt. Die in der PCR verwendeten Primer wurden so entworfen, dass das Startcodon (ATG) der hergestellten cDNA einen Teil von NdeI bildete, während dem Stoppcodon (TAA) unmittelbar eine XhoI-Schnittstelle nachfolgte. Die so gewonnene cDNA wurde in den Expressionsvektor pET-23a (Novagen) über die NdeI- und XhoI-Schnittstellen eingebaut. Der sich ergebende, rekombinante Vektor pET-Adseverin wurde dann in kompetente BL21 (DE3) pLysS-Zellen mittels des Verfahrens von Chung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86 (1988), 2172–2175) eingeführt. Transformanten wurden in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Studier et al. [in "Methods in Enzymology, Gene Expression Technology" (Goeddle, Herausgeber) Band 185, Seiten 60–89, Academic Press, San Diego, 1991] selektioniert, inkubiert und mit IPTG (Isopropyl-β-Thiogalactopyranosid) induziert. Es wurde nämlich eine gegenüber Ampicillin und Chloramphenicol tolerante Kolonie entnommen und in M9ZB-Medium, supplementiert mit 50 μg/ml Ampicillin, inkubiert. Wenn die Expression der cDNA durch IPTG induziert wurde, wurde ein Protein von etwa 74 kD auf einer SDS-PAGE (6A, gezeigt durch einen Pfeil) produziert. Im Gegensatz dazu stellte die untransformierte BL21 (DE3) pLysS-Kontrolle bei Induktion mit IPTG kein zusätzliches Protein her. Die Größe (das heißt 74 kD) des induzierten Proteins bei der SDS-PAGE war die gleiche wie die des Adseverins, das aus Rinder-Nebennierenmark isoliert wurde.
Der Kulturüberstand der transformierten E. coli wurde durch die im Wesentlichen gleichen Methoden aufgereinigt wie jene, die zur Isolierung und Aufreinigung von Adseverin aus Rinder-Nebennierenmark in Beispiel 1 verwendet wurden. Das aufgereinigte Protein wurde einer Elektrophorese bei einer SDS-PAGE unterzogen und auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen. Das Protein ging bei Umsetzung mit einem für Adseverin spezifischen Antikörper, wie in 6B gezeigt, eine immunologische Reaktion mit diesem Protein ein. Basierend auf der augenscheinlichen Größe dieses Proteins bei der SDS-PAGE und seiner immunologische Reaktivität mit dem für Adseverin spezifischen Antikörper wurde bestätigt, dass dieses Protein durch die cDNA codiertes Adseverin war.
Beispiel 9: Actin-Filament-zerstörende Aktivität des durch E. coli hergestellten Adseverins
Um zu untersuchen, ob das durch E. coli hergestellte Adseverin eine Ca²⁺-abhängige Actin-Filament-zerstörende Aktivität ähnlich dem nativen Adseverin hat oder nicht hat, wurden die Effekte von Adseverin auf die Actin-Polymerisation mit einem Viskosimeter gemessen.
0,15 mg/ml Actin wurden in Puffer P (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂ und 20 mM Imidazol-HCl, pH 7,2) mit 1 mM EGTA oder 0.1 mM CaCl₂ bei 25,5°C in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Adseverin in einem molaren Verhältnis zu Actin von 1:30 polymerisiert.
Wie die 7 zeigt, wurde die Viskosität der Actin-Lösung von Adseverin ausschließlich bei der Anwesenheit von Ca²⁺ beeinflusst (vergleiche 7A mit 7B). Bei der Anwesenheit von Ca²⁺ förderte Adseverin die Bildung von Nucleationskeimen im Prozess der Actin-Polymerisation, so dass die Viskosität der polymerisierten Actin-Lösung am Endpunkt abgesenkt war. Wenn das Adseverin der polymerisierten Actin-Lösung zugesetzt wurde (angezeigt durch Pfeile), zeigte die spezifische Viskosität im Fall der Ca²⁺ enthaltenden Lösung einen plötzlichen Abfall.
Diese Ergebnisse waren im Wesentlichen die selben wie jene, die unter Verwendung von aus Rinder-Nebennierenmark hergestelltem Adseverin gewonnen wurden, was andeutet, dass das Protein, welches durch Techniken der Genrekombination in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, eine Actin-Filament-zerstörende Aktivität ähnlich dem nativen Adseverin hatte.
Beispiel 10: in situ-Hybridisierung
Ein 329 Bp-Fragment der Rinder-Adseverin-cDNA (Position 2090–2418) wurde mit Digoxigenin-dUTP unter Verwendung eines DIG-DNA-Markierungs- und Nachweiskits (Boehringer Mannheim) markiert.
Der Teil der frischen Rinder-Nebenniere, der den Grenzbereich zwischen Rinde und Mark enthält, wurde mit 1% Paraformaldehyd in Phosphat-Kochsalzlösung (PBS) im Schlachthaus fixiert. Im Labor wurde er in kleine Stücke geschnitten und mit PBS gewaschen. Als Nächstes wurden die Proben schrittweise in 8, 12, 16 und 20% Saccharose-PBS über 24 Stunden eingetaucht. Dann wurden die Proben in TISSUE-TEM (Miles Scientific) eingebettet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die gefrorenen Proben wurden mit einem Microtom in Schnitte von 5 bis 7 μm geschnitten und auf einen Objektträger aus Glas aufgebracht.
Einige dieser Schnitte wurden mit 0,5% Toluidin Blau in PBS und 50% Glycerin in PBS gefärbt und in dieser Lösung gelagert.
Für Immunfluoreszenzfärbungen wurden die Schnitte mit 1% Paraformaldehyd-PBS über 1 Minute und mit Aceton über 5 Minuten fixiert. Nach Behandlung mit 1% Triton X-100 in PBS und Waschen mit PBS wurden die Schnitte in eine Blockierlösung, die 2,5% Rinder-Serum-Albumin und 2,5% Kükenserum in PBS enthielt, eingebracht und zusammen mit einem anti-Adseverin-Antikörper (das Verfahren zur Herstellung des anti-Adseverin-Antikörpers wird nachstehend im Beispiel 18 beschrieben) in der Blockierlösung bei 37°C über 3 Stunden inkubiert. Die Schnitte wurden aufeinanderfolgend mit einer Lösung, die 400 mM MgCl₂ und 20 mM Tris-HCl (pH 8,6) enthielt, und PBS gewaschen. Dann wurden sie mit einem FITC-konjugierten anti-Kaninchen-IgG in der Blockierlösung bei 37°C über 1 Stunde inkubiert. Nach gründlichem Waschen nach dem gleichen Protokoll und unter Verwendung der gleichen Lösungen wie jene, die voranstehend beschrieben wurden, wurden die Schnitte in PBS eingebettet, welche 50% Glycerin und 2,5% 1,4-Diazabicyclo[2,2,2]octan (Wako Chemical Co., Ltd.) enthielt, und unter einem Nikon-FEX-A-Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Für die in situ-Hybridisierung wurden die Schnitte in doppelt konzentrierter Standard-Citrat-Kochsalzlösung (2 × SSC, 1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Na-Citrat, pH 7,0) über 10 Minuten bei Raumtemperatur und dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Prähybridisierungs-Lösung (5 × SSC, 50% Formamid, 0,1% Tween 20, 50 μg/ml Heparin, 100 g/ml mit Ultraschall behandelte und denaturierte Lachs-Sperma-DNA) inkubiert.
Nach Entfernung des Prähybridisierungs-Puffers wurde ein frischer Prähybridisierungs-Puffer, der 0,5 μg/ml der mit Digoxigenin markierten DNA-Sonde enthielt, auf die Schnitte aufgebracht. Dann wurden die Schnitte mit Glasdeckgläsern abgedeckt, welche als Nächstes mit Gummi-Zement versiegelt wurden.
Die DNA-Sonde wurde in einem Ofen bei 80°C über 10 Minuten denaturiert, gefolgt von einer Inkubation in dem Ofen bei 42°C über Nacht. Dann wurden die Deckgläser unter Verwendung eines Glasschneiders entfernt und die Schnitte wurden aufeinanderfolgend mit 2 × SSC über 30 Minuten bei Raumtemperatur, 0,1 × SSC über 30 Minuten bei 42°C und 2 × SSC über 15 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen.
Die Sonden wurden in den Schnitten durch Verwendung eines DIG-DNA-Markierungs- und Nachweiskits (Boehringer Mannheim) nachgewiesen. Dann wurden die Schnitte, die mit der mit Digoxigenin markierten DNA-Sonde inkubiert wurden, mit einem Waschpuffer (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) über 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen, dann zusammen mit 0,5% (Gew./Vol.) Boehringer Blockierungs-Reagenz im Waschpuffer inkubiert und schließlich mit dem Waschpuffer gewaschen.
Anschließend wurden die Schnitte zusammen mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten anti-Digoxigenin-Antikörper (150 mU/ml) über 2 Stunden bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit dem Waschpuffer wurden die Objektträger kurz mit einer Lösung, die 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl und 20 mM MgCl₂ (pH 9.5) enthielt, behandelt und dann zusammen mit der gleichen Lösung, die Nitroblau-Tetrazolium Salz, 5-Brom-4-Chlor-3-Indeyl-Phosphat und 0,25 mg/ml Levamisol enthielt, über 3 Stunden bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert. Die Farbentwicklung wurde durch Verwendung von 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA (pH 8,0) gestoppt.
Die in Glycerin gehaltenen Schnitte wurden unter einem Lichtmikroskop betrachtet.
Bei geringer Vergrößerung wurde die Farbentwicklung im Mark, aber nicht in der Rinde, außer im an das Mark angrenzenden Bereich, beobachtet. Als Nächstes wurde der Grenzbereich zwischen dem Mark und der Rinde bei stärkerer Vergrößerung beobachtet. Färbung mit Toluidin-Blau (8a) offenbarte, dass die Zellen in der Rinde dicht angeordnet waren, während die Zellen im Mark locker verteilt waren und sich durch blattartige, Gefäße enthaltende Strukturen in Gruppen aufteilten. Die Rinde und das Mark waren in beiden Fällen, der in situ-Hybridisierung und der Immunfluoreszenzfärbung, in Abhängigkeit von den zellulären Charakteristika, wie voranstehend beschrieben, ohne Durchführung einer Gegenfärbung einfach voneinander zu unterscheiden. 8c und f zeigen die Ergebnisse der in situ-Hybridisierung, die bei mittlerer bzw. starker Vergrößerung beobachtet wurden. Eine Färbung wurde hauptsächlich in locker angeordneten Zellen, welche den chromaffinen Zellen des Marks entsprechen, beobachtet. Zudem war auch eine kleine Zahl von Zellen in der dem Mark zugewandten Rinde, wie durch Pfeile gezeigt wird, ebenfalls angefärbt.
Eine Adseverin-Verteilung von gleichem Muster wurde in der Immunfluoreszenzfärbung mit dem anti-Adseverin-Antikörper beobachtet (8b und e). Es wurde nämlich Fluoreszenz in den chromaffinen Zellen des Marks und in den Zellen in der dem Mark zugewandten Rinde beobachtet. In den chromaffinen Zellen wurde die Fluoreszenz hauptsächlich in den Regionen unterhalb des Plasmalemmas beobachtet.
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die Adseverin-mRNA und das Adseverin-Protein beide im Mark der Nebenniere, aber nicht im größten Teil der Rinde exprimiert werden. Ausnahmsweise wurde die Expression von beiden, der Adseverin-mRNA und dem Adseverin-Protein, in einem dem Mark zugewandten Teil der Rinde beobachtet. So wird geschlossen, dass diese differentielle Expression des Adseverins in den Teilen der Rinder-Nebenniere auf der transkriptionellen Ebene kontrolliert wird. Sekretion mit dem Mechanismus der Exocytose findet im Mark der Nebenniere, aber nicht in der Rinde der Nebenniere statt. Deshalb weist diese differentielle Expression deutlich darauf hin, dass Adseverin nicht mit der Regulation sekretorischer Prozesse im Allgemeinen, sondern ausschließlich mit sekretorischen Prozessen, die von Mechanismen der Exocytose abhängen, in Beziehung steht. Weiterhin stimmt die Lokalisierung von Adseverin in der Region unterhalb des Plasmalemmas mit der Vorstellung überein, dass dieses Protein mit der Regulation der Exocytose in Beziehung steht.
Vergleichendes Beispiel 11: Konstruktion einer aus menschlicher Nieren-mRNA stammenden cDNA-Genbibliothek
Als humane Nieren-mRNA wurde ein Produkt verwendet, welches von CLONTECH Laboratories, Inc. erworben wurde. Aus 2 μg dieser mRNA wurde doppelsträngige cDNA unter Verwendung des TimeSaver^TM cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) in Übereinstimmung mit dem zugehörigen Protokoll synthetisiert.
Es wurde nämlich die thermisch denaturierte mRNA dem First-Strand Reaction Mix, das murine reverse Transkriptase und Oligo(dT)_12–18-Primer enthält, hinzugefügt und über 1 Stunde bei 37°C gehalten, um dadurch den ersten Strang zu synthetisieren. Als Nächstes wurde das Reaktionsgemisch dem Second-Strand Reaction Mix, das E. coli RNAseH und E. coli DNA-Polymerase I enthält, hinzugefügt und über 30 Minuten bei 12°C und dann über 1 Stunde bei 22°C gehalten, um dadurch den zweiten Strang zu synthetisieren. Dann wurde die so synthetisierte, doppelsträngige cDNA durch Verwendung der im vorstehend genannten Kit enthaltenen Spun Column oder durch Agarosegel-Elektrophorese der Größe nach fraktioniert. Somit wurde ausschließlich eine cDNA von etwa 400 Bp oder mehr (im ersteren Fall) oder von etwa 2 bis 3 kBp (im letzteren Fall) aufgenommen.
Nach der Ligierung eines Adapters (EcoRI/NotI-Adapter) an ein Ende und der Eliminierung des nicht umgesetzten Adapters mit der vorstehend erwähnten Spun Column wurde die cDNA in einen Vektor eingebaut. Dafür wurden zwei Vektoren vorbereitet, nämlich der ExCell-Vektor (λExCell EcoRI/CIP), erworben von Pharmacia, und der Lambda ZAP^®II-Vektor (PREDIGESTED LAMBDA ZAP^®II/EcoRI/CIAP CLONING KIT), erworben von STRATAGENE. Als Wirts-E. coli wurde im ersteren Fall der NM522-Stamm verwendet, während im letzteren Fall der XL1-Blue-Stamm verwendet wurde. Dann wurde die so in den Vektor eingebaute cDNA einer Verpackung unter Verwendung des GIGAPACK^® II PACKAGING EXTRACT (STRATAGENE) in Übereinstimmung mit dem zugehörigen Protokoll unterzogen. Es wurden nämlich der Einfrier/Auftau-Extrakt, der Ultraschall-Extrakt und die DNA gemischt und über 2 Stunden bei 22°C gehalten um eine cDNA-Genbibliothek zu ergeben.
Vergleichendes Beispiel 12: Durchmusterung einer cDNA-Genbibliothek durch Plaque-Hybridisierung (Hybridisierung unter Verwendung der Rinder-Adseverin-cDNA als Sonde)
Die Durchmusterung wurde unter Bezugnahme auf das Standardverfahren, beschrieben durch Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1988), durchgeführt. Es wurden nämlich auf LB-Platten gezüchtete Phagen-Plaques auf Hybond-N-Filter (Amersham) übertragen, mit Alkali denaturiert und dann durch UV-Bestrahlung immobilisiert. Die Prähybridisierung wurde durch Inkubieren dieses Filters über 3 Stunden bei 40°C in einer Hybridisierungslösung durchgeführt. Anschließend wurde die Hybridisierung durch Inkubation des Filters zusammen mit einer mit ³²P markierten, durch Hitze denaturierten Sonde (etwa 1 μCi/ml) über 16 Stunden bei 40°C durchgeführt. Als Sonde wurde eine Fragment, das aus der Rinder-Adseverin-cDNA (pSK-Adseverin) unter Verwendung von PstI und NdeI ausgeschnitten wurde und fast der Gesamtlänge der cDNA entsprach, verwendet. Die Hybridisierung wurde unter wenig-stringenten Bedingungen durchgeführt, das heißt durch Verwendung einer Hybridisierungslösung, die 25% Formamid (4 × SSC, 50 mM HEPES, pH 7,0, 10 × Denhardt-Lösung, 100 μg/ml thermisch denaturiertes Lachssperma) enthielt [Institute of Medical Science, University of Tokyo, Carcinostatic Research Section, "Shin Saibo Kogaku Jikken Purotokoru (New Protocols for Cell Technological Experiments)", Saibo Kogaku (Zelltechnologie), 1993]. Nach dem Abschluss der Hybridisierung wurde der Filter mit einer 2 × SCC-Lösung, die 0,1% SDS enthielt, zweimal über 15 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Als Nächstes wurde er weiter mit einer 1 × SSC, 0,1% SDS-Lösung bei langsam, von der Raumtemperatur aus bis zum Verschwinden der Hintergrundradioaktivität ansteigender Temperatur gewaschen. Dann wurde der Filter, gefolgt von der Autoradiographie, getrocknet.
Die Sonde wurde unter Verwendung eines Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit ³²P markiert. In Übereinstimmung mit dem zugehörigen Protokoll wurden etwa 100 ng der thermisch denaturierten DNA durch Inkubation zusammen mit den Zufallsprimern, 50 μCi [α-³²P] dCTP und Klenow-Fragment über 30 Minuten bei 37°C markiert.
Als Erstes wurden 1,6 × 10⁵ Plaques der cDNA-Genbibliothek, die aus der menschlichen Nieren-mRNA hergestellt wurde und in Beispiel 11 gewonnen wurde, unter Verwendung der Rinder-Adseverin-cDNA als Sonde durchmustert. So wurde ein positiver Phagen-Clon gewonnen.
Vergleichendes Beispiel 13: Subclonierung eines positiven Phagen-Clones in einen Plasmidvektor.
Unter Verwendung von Primern (CAGCTATGACCATGATTACGCCAA, ACGACGGCCAGTGAATTGCGTAAT), die aus der Basensequenz des λExCell-Vektors synthetisiert wurden, wurde die Insertion des in Beispiel 12 gewonnenen Clons vervielfältigt [Institute of Medical Science, University of Tokyo, Carcinostatic Research Section, "Shin Saibo Kogaku Jikken Purotokoru (New Protocols for Cell Technological Experiments)", Saibo Kogaku (Cell Technology), 1993] und mit EcoRI gespalten. Dann wurde sie in den pUC18-Plasmidvektor, welcher mit EcoRI gespalten und dephosphoryliert worden war, subcloniert. Der so gewonnene Clon wurde als pADa-17 bezeichnet.
Vergleichendes Beispiel 14: Durchmustern der cDNA-Genbibliothek mittels Plaque-Hybridisierung (Hybridisierung unter Verwendung von pADa-17 als Sonde)
Unter Verwendung einer Genbibliothek, die neu aus der menschlichen Nieren-mRNA in Übereinstimmung mit dem Verfahren aus Beispiel 11, hergestellt wurde und in der ausschließlich cDNA von 2 bis 3 kBp angereichert war, wurde eine Plaque-Hybridisierung unter Verwendung des Clons pADa-17 als Sonde bei erhöhter Stringenz (50% Formamid enthaltende Hybridisierungslösung – die restliche Zusammensetzung war die gleiche wie jene in Beispiel 12) unter konventionellen Bedingungen durchgeführt. Der zur Herstellung der cDNA-Genbibliothek verwendete Vektor war der Lambda ZAP^® II-Vektor (PREDIGESTED LAMBDA ZAP^®II/EcoRI/CIAP CLONING KIT), erworben von STRATAGENE, während der XL1-Blue-Stamm als Wirts-E. coli verwendet wurde. Die Sonde wurde mit ³²P in der gleichen Weise, wie die in Beispiel 12 beschriebene, markiert. Es wurde nämlich ein aus dem Clon pADa-17 ausgeschnittenes Fragment einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen und aufgereinigt und etwa 100 ng davon wurden mit 50 μCi [α-³²P] dCTP markiert. Nach Abschluss der Hybridisierung wurde der Filter mit einer 2 × SSC-Lösung, die 0,1% SDS enthielt, zweimal über 15 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Als Nächstes wurde er weiter zweimal mit einer 0,5 × SSC, 0,1% SDS-Lösung über 15 Minuten bei 50°C gewaschen. Dann wurde der Filter, gefolgt von der Autoradiographie, getrocknet.
So wurden 5 positive Phagen-Clone durch die Durchmusterung von 1,7 × 10⁵ Plaques gewonnen.
Vergleichendes Beispiel 15: Subclonierung eines positiven Phagen-Clones in einen Plasmidvektor
Aus den positiven Phagen-Clonen wurden ausgeschnittene Fragmente in ein Plasmid (pBluescirpt^® SK(–)-Vektor) unter Verwendung des ExAssist^TM/SOLR^TM SYSTEM durch Ausnutzung der Eigenschaften des Lambda ZAP^® II-Vektors überführt. In Übereinstimmung mit dem dem PREDIGESTED LAMBDA ZAP^®II/EcoRI/CIAP CLONING KIT (STRATAGENE) zugehörigen Protokoll wurde der E. coli XL1-Blue-Stamm mit den in Beispiel 14 gewonnenen positiven Phagen und dem ExAssist^TM-Helferphagen infiziert und über 2,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurde das in das Kulturmedium freigesetzte Plasmid in den E. coli-SOLR-Stamm eingebaut. So wurden die Plasmidclone phAD-2 bis 6 erhalten.
Vergleichendes Beispiel 16: Identifizierung der Basensequenz der menschlichen Adseverin-cDNA.
Die Basensequenzen der Plasmidclone phAD-2 und phAD-4, welche in Beispiel 15 gewonnen wurden, wurden identifiziert. Die Basensequenzen wurden durch Durchführung einer Didesoxysequenzierung unter Verwendung von Sequence Version 2.0 (United States Biochemical) oder durch Cycle-Sequenzierung unter Verwendung des PRISM^TM Terminator Mix (Applied Biosystems) und Codierung unter Verwendung eines Model 373A Sequenziergeräts (Applied Biosystems) identifiziert.
Die Basensequenz der menschlichen Adseverin-cDNA, welche durch die Zusammensetzung der voranstehend identifizierten Basensequenzen von phAD-2 und phAD-4 gewonnen wurde, und die Aminosäuresequenz, die dem längsten offenen Leserahmen entspricht, werden in SEQ ID Nr. 5 des Sequenzprotokolls gezeigt. So wurde ein offener Leserahmen, welcher ein Startcodon am ATG an der Position 79 hatte und aus 715 Aminosäuren aufgebaut war, gefunden.
Vergleichendes Beispiel 17: Vergleich des menschlichen Adseverins mit dem Rinder-Adseverin
9 zeigt das Ergebnis eines Vergleichs zwischen der Aminosäuresequenz des in Beispiel 16 gewonnenen menschlichen Adseverins mit der Aminosäuresequenz des in Beispiel 6 gewonnenen Rinder-Adseverins. In 9 entsprechen die oberen und unteren Säulen der menschlichen Aminosäuresequenz bzw. der Rinder-Aminosäuresequenz. Diese Aminosäuresequenzen sind an den Aminosäuren mit der Markierung * vollständig miteinander identisch und an den Aminosäuren mit der Markierung • in hohem Maße analog. Das menschliche Adseverin und das Rinder-Adseverin zeigen eine Homologie von etwa 92% auf der Aminosäureebene und sind bei vielen Aminosäuren in hohem Maße analog, obwohl sie nicht vollständig gleich sind. Obwohl auch eine große Homologie von etwa 90% auf der Basenebene beobachtet wird, zeigt die Homologie eine schnelle Abnahme nach dem Stoppcodon.
Vergleichendes Beispiel 18: Herstellung eines anti-Adseverin-Antikörpers und anti-Peptid-Antikörpers (Antikörper gegen ein von menschlichem Adseverin abgeleitetes Peptid)
HERSTELLUNG EINES ANTI-ADSEVERIN-ANTIKÖRPERS
1 mg Adseverin, welches aus Rinder-Nebennierenmark aufgereinigt wurde, wurde mit komplettem Freundschen Adjuvans vermischt, um dadurch eine Emulsion zu ergeben. Diese Emulsion wurde einem Kaninchen in zehn Teilen an verschiedener Stelle injiziert. Zudem wurde die gleiche Menge des Proteins mit inkomplettem Freundschen Adjuvans vermischt und die erhaltene Emulsion wurde in gleicher Weise in Abständen von 4 Wochen subkutan injiziert. 1 Woche nach der Injektion wurde Blut aus der Ohrvene abgenommen und das Serum abgetrennt. Wenn der Antikörpertiter mittels ELISA bestimmt wurde, wurde eine Zunahme des Antikörpertiters des Serums nach der zweiten oder dritten Auffrischungsimmunisierung beobachtet. Da eine Kreuzreaktivität mit Gelsolin beobachtet wurde, wurde das Serum durch an Agarosekügelchen immobilisiertes Gelsolin absorbiert und dann durch immobilisiertes Adseverin absorbiert. Als Nächstes wurde es sukzessiv mit 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5), 0,1 M Triethylamin-HCl (pH 11,5) und 3,5 M MgCl₂ eluiert, gegen mit Tris gepufferte Kochsalzlösung dialysiert und konzentriert. Der so durch eine Affinitätsreinigung gewonnene, gereinigte Antikörper zeigte keine Kreuzreaktivität mit Gelsolin, aber eine für Adseverin spezifische Reaktivität. Dieser Antikörper wurde im Immunblotverfahren mit Konzentrationen von 0,1 bis 1 μg/ml und im Fluoreszenzantikörperverfahren mit 1 bis 10 μg/ml verwendet.
HERSTELLUNG EINES ANTI-PEPTID-ANTIKÖRPERS (ANTIKÖRPER GEGEN EIN VOM MENSCHLICHEN ADSEVERIN ABGELEITETES PEPTID)
2 Peptidsequenzen (16 Reste) von Stellen, welche an der Oberfläche von Proteinmolekülen exponiert waren, über die Speziesunterschiede zwischen dem Rinder-Adseverin und dem menschlichen Adseverin sehr gut konserviert waren und weniger homolog mit Gelsolin waren (SEQ ID Nr. 6, 7), wurden ausgewählt. Ausgehend von einem Harz mit verzweigter Struktur, an welches 7 Lysinreste gebunden waren, wurde ein Mehrfachantigen-Peptid (MAP) synthetisiert (Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5409–5413). Dann wurden unter Verwendung dieses Peptids Emulsionen mit komplettem Freundschen Adjuvans beim ersten Mal und inkomplettem Freundschen Adjuvans beim zweiten Mal und danach hergestellt. Diese Emulsionen wurden 2 Kaninchen in Abständen von 1 Woche subkutan injiziert. Nach 7, 8 und 9 Wochen wurde Blut aus den Ohrvenen abgenommen und der Antikörpertiter mittels ELISA bestimmt. So wurde ein Antikörper gewonnen, der kaum eine Kreuzreaktivität mit Gelsolin zeigte und mit Rinder-, menschlichem und Adseverin der Ratte reaktiv war. Da eine im Serum nicht immunisierter Tiere gezeigte, unspezifische Reaktion beobachtet wurde, wurde eine Affinitätsreinigung, ähnlich wie im Fall des durch Immunisierung mit dem aufgereinigten Protein gewonnenen Antikörpers, durchgeführt.
Sequenzprotokoll

Claims

DNA-Molekül, das ein Polypeptid codiert, das eine Actin-Filament-zerstörende Aktivität hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA-Molekülen, die ein Polypeptid codieren, umfassend die in SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz; (b) DNA-Molekülen, umfassend die Nucleotidsequenz der in SEQ ID Nr. 4 dargestellten codierenden Sequenz; und (c) DNA-Molekülen, deren Nucleotidsequenz eine Homologie hat von 90% oder höher mit der Nucleotidsequenz eines in (b) definierten DNA-Moleküls.
Vektor, umfassend ein DNA-Molekül nach Anspruch 1.
Vektor nach Anspruch 2, in dem das DNA-Molekül operativ mit regulatorischen Elementen verbunden ist um Transkription in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen zu erlauben.
Wirtszelle, die mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder einem Vektor nach Anspruch 2 oder 3 genetisch verändert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das eine Actin-Filament-zerstörende Aktivität hat, umfassend das Inkubieren einer Wirtszelle nach Anspruch 4 und das Isolieren und Aufreinigen des so hergestellten Proteins aus der Kultur.
Protein, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 5.
Diagnostische Zusammensetzung, die ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 umfasst.