JPH0880195A - アドゼベリンをコードする遺伝子 - Google Patents
アドゼベリンをコードする遺伝子Info
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- JPH0880195A JPH0880195A JP6340692A JP34069294A JPH0880195A JP H0880195 A JPH0880195 A JP H0880195A JP 6340692 A JP6340692 A JP 6340692A JP 34069294 A JP34069294 A JP 34069294A JP H0880195 A JPH0880195 A JP H0880195A
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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- Compression, Expansion, Code Conversion, And Decoders (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 アクチン調節タンパク質であるヒトアドゼベ
リンをコードする遺伝子の塩基配列を決定する。 【構成】 配列表の配列番号４または５に示すアミノ酸
配列をコードする塩基配列、またはこれを一部置換、欠
失もしくは付加した塩基配列、あるいはこれらにハイブ
リダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、該遺伝子を含有す
る組換えベクター、該ベクターによる形質転換体、該遺
伝子を用いるアドゼベリンの製造方法、該製造方法によ
って得られる組換えアドゼベリンタンパク質、および配
列番号４または５に示すアミノ酸配列をコードする塩基
配列とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、なら
びに該オリゴヌクレオチドを動物に投与することからな
る、動物におけるアドゼベリンの生成を抑制する方法、
ならびにアドゼベリンタンパク質を認識する抗体。
リンをコードする遺伝子の塩基配列を決定する。 【構成】 配列表の配列番号４または５に示すアミノ酸
配列をコードする塩基配列、またはこれを一部置換、欠
失もしくは付加した塩基配列、あるいはこれらにハイブ
リダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、該遺伝子を含有す
る組換えベクター、該ベクターによる形質転換体、該遺
伝子を用いるアドゼベリンの製造方法、該製造方法によ
って得られる組換えアドゼベリンタンパク質、および配
列番号４または５に示すアミノ酸配列をコードする塩基
配列とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、なら
びに該オリゴヌクレオチドを動物に投与することからな
る、動物におけるアドゼベリンの生成を抑制する方法、
ならびにアドゼベリンタンパク質を認識する抗体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃａ２＋依存性のアク
チンフィラメント切断タンパク質であり、エキソサイト
ーシスを制御する機能を有するアドゼベリン（ａｄｓｅ
ｖｅｒｉｎ）タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子
を含有する組換えベクター、該ベクターによる形質転換
体、該遺伝子を用いるアドゼベリンの製造方法、該製造
方法によって得られる組換えアドゼベリンタンパク質に
関する。本発明はまた、アドゼベリンタンパク質をコー
ドする塩基配列と特異的にハイブリダイズしうるオリゴ
ヌクレオチド、およびアドゼベリンタンパク質をコード
する塩基配列と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌ
クレオチドを動物に投与することからなるアドゼベリン
の生成を抑制する方法、ならびにアドゼベリンタンパク
質を認識する抗体に関する。
チンフィラメント切断タンパク質であり、エキソサイト
ーシスを制御する機能を有するアドゼベリン（ａｄｓｅ
ｖｅｒｉｎ）タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子
を含有する組換えベクター、該ベクターによる形質転換
体、該遺伝子を用いるアドゼベリンの製造方法、該製造
方法によって得られる組換えアドゼベリンタンパク質に
関する。本発明はまた、アドゼベリンタンパク質をコー
ドする塩基配列と特異的にハイブリダイズしうるオリゴ
ヌクレオチド、およびアドゼベリンタンパク質をコード
する塩基配列と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌ
クレオチドを動物に投与することからなるアドゼベリン
の生成を抑制する方法、ならびにアドゼベリンタンパク
質を認識する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの分泌細胞では、休止状態において
は神経伝達物質やホルモンなどの分泌産物は顆粒または
小胞の形で貯蔵されており、細胞が適当なシグナルを受
け取ったときにエキソサイトーシスによって細胞から外
ヘと放出される。エキソサイトーシスの過程において
は、顆粒や小胞が形質膜の方へと移動してこれと接触し
て融合し、膜が開口する。
は神経伝達物質やホルモンなどの分泌産物は顆粒または
小胞の形で貯蔵されており、細胞が適当なシグナルを受
け取ったときにエキソサイトーシスによって細胞から外
ヘと放出される。エキソサイトーシスの過程において
は、顆粒や小胞が形質膜の方へと移動してこれと接触し
て融合し、膜が開口する。
【０００３】このエキソサイトーシスは細胞内の遊離カ
ルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉによって大きく制御されて
いる（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４９３：５０４−５２３，１９８
７）。すなわち、休止細胞では［Ｃａ２＋］ｉが低く、
エキソサイトーシスは［Ｃａ２＋］ｉ依存性の数段階に
よって阻害されると考えられている（Ｂｕｒｇｏｙｎ
ｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＢｉｏｐｈｙＳｓ．Ａｃｔａ ７
７９：２０１−２１６，１９８４）。副腎髄質の分泌細
胞であるクロマフィン細胞（ｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ ｃ
ｅｌｌｓ）を含む多くの分泌細胞では、アクチンフィラ
メントからなる形質膜下のミクロフィラメント・ネット
ワークをもっており、このネットワークが顆粒や小胞が
形質膜に移動するのを阻害する機能を有していると思わ
れる（Ｃｈｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．２０７：１１０−１１４，１９８６；Ｌｅｌｋｅｓ
ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０８：３５７−
３６３，１９８６）。エキソサイトーシスによって分泌
産物を放出する前には、Ｃａ２＋依存性のメカニズムに
よって［Ｃａ２＋］ｉが増加して、このネットワークが
分解される（Ｖｉｔａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．１１３：１０５７−１０６７，１９９
１）。
ルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉによって大きく制御されて
いる（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４９３：５０４−５２３，１９８
７）。すなわち、休止細胞では［Ｃａ２＋］ｉが低く、
エキソサイトーシスは［Ｃａ２＋］ｉ依存性の数段階に
よって阻害されると考えられている（Ｂｕｒｇｏｙｎ
ｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＢｉｏｐｈｙＳｓ．Ａｃｔａ ７
７９：２０１−２１６，１９８４）。副腎髄質の分泌細
胞であるクロマフィン細胞（ｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ ｃ
ｅｌｌｓ）を含む多くの分泌細胞では、アクチンフィラ
メントからなる形質膜下のミクロフィラメント・ネット
ワークをもっており、このネットワークが顆粒や小胞が
形質膜に移動するのを阻害する機能を有していると思わ
れる（Ｃｈｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．２０７：１１０−１１４，１９８６；Ｌｅｌｋｅｓ
ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０８：３５７−
３６３，１９８６）。エキソサイトーシスによって分泌
産物を放出する前には、Ｃａ２＋依存性のメカニズムに
よって［Ｃａ２＋］ｉが増加して、このネットワークが
分解される（Ｖｉｔａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．１１３：１０５７−１０６７，１９９
１）。
【０００４】ここで、アクチンとは真核細胞に普遍的に
存在する分子量４２ｋＤの球状タンパク質で、筋細胞の
収縮などに密接に関わる細胞骨格タンパク質であり、モ
ノ−アクチンは重合してフィラメントになる。アクチン
は生理的イオン強度下では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそのお
よそ１００％が重合してフィラメントになってしまう
が、実際の細胞内では、各種のアクチン調節タンパク質
の作用によりフィラメント（ゲル）とモノマー（ゾル）
の状態が可逆的に調節されており、それが細胞外刺激に
応じて変化する。
存在する分子量４２ｋＤの球状タンパク質で、筋細胞の
収縮などに密接に関わる細胞骨格タンパク質であり、モ
ノ−アクチンは重合してフィラメントになる。アクチン
は生理的イオン強度下では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそのお
よそ１００％が重合してフィラメントになってしまう
が、実際の細胞内では、各種のアクチン調節タンパク質
の作用によりフィラメント（ゲル）とモノマー（ゾル）
の状態が可逆的に調節されており、それが細胞外刺激に
応じて変化する。
【０００５】ウシクロマフィン細胞において、このプロ
セスに直接関与すると思われるタンパク質であるゲルゾ
リン（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）が同定された（Ｙｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５８３−５８６，１
９７９）。ゲルゾリンはｉｎｖｉｔｒｏでＣａ２＋に依
存するアクチンフィラメント切断活性を有し、さらにア
クチンフィラメントの反矢じり端（ｂａｒｂｅｄ ｅｎ
ｄ）のキャップ作用および核形成活性を有している。さ
らに最近になってゲルゾリンと類似の活性を有するが、
異なる物質であるアドゼベリン（７４ｋＤａのタンパク
質）が東京大学医学部薬理学教室、野々村教授らのグル
ープによりウシ副腎髄質から単離された（Ｍａｅｋａｗ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：
１０９４０−１０９４２，１９９０）。
セスに直接関与すると思われるタンパク質であるゲルゾ
リン（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）が同定された（Ｙｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５８３−５８６，１
９７９）。ゲルゾリンはｉｎｖｉｔｒｏでＣａ２＋に依
存するアクチンフィラメント切断活性を有し、さらにア
クチンフィラメントの反矢じり端（ｂａｒｂｅｄ ｅｎ
ｄ）のキャップ作用および核形成活性を有している。さ
らに最近になってゲルゾリンと類似の活性を有するが、
異なる物質であるアドゼベリン（７４ｋＤａのタンパク
質）が東京大学医学部薬理学教室、野々村教授らのグル
ープによりウシ副腎髄質から単離された（Ｍａｅｋａｗ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：
１０９４０−１０９４２，１９９０）。
【０００６】ゲルゾリンは各種組織や血漿中に比較的広
く分布している（Ｓｔｏｓｓｅｌｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１：３５３−４０
２，１９８５）が、アドゼベリンの分布は主として分泌
機能を有する組織に限られている（Ｓａｋｕｒａｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３８：７４３
−７５６，１９９０）。このような組織分布における差
は、アドゼベリンの方がゲルゾリンよりも分泌プロセス
に、すなわち、神経伝達物質、内分泌物質あるいは生理
活性物質の放出のコントロールにより深く関与している
ことを示唆している。したがって、アドゼベリンの構造
と機能を解明することはエキソサイトーシスにおけるア
クチンフィラメントの役割と、その調節機構を明らかに
することとなり、極めて興味深い。
く分布している（Ｓｔｏｓｓｅｌｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１：３５３−４０
２，１９８５）が、アドゼベリンの分布は主として分泌
機能を有する組織に限られている（Ｓａｋｕｒａｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３８：７４３
−７５６，１９９０）。このような組織分布における差
は、アドゼベリンの方がゲルゾリンよりも分泌プロセス
に、すなわち、神経伝達物質、内分泌物質あるいは生理
活性物質の放出のコントロールにより深く関与している
ことを示唆している。したがって、アドゼベリンの構造
と機能を解明することはエキソサイトーシスにおけるア
クチンフィラメントの役割と、その調節機構を明らかに
することとなり、極めて興味深い。
【０００７】従来、この過程は、融合タンパク質などの
働きによって調節されるという考えが主流であった（西
崎孝道、「開口放出現象における細胞質タンパク質の役
割」、細胞工学、１３：３５３−３６０，１９９４）
が、野々村教授らの仮説は、この過程が最終的にアクチ
ン−ミオシン相互作用によるものであるとする点で新し
く、またミオシン軽鎖キナーゼによるミオシン側の調節
（持田澄子、「ミオシン軽鎖キナーゼ神経伝達物質放出
とその調節におけるミオシン軽鎖キナーゼの役割」、細
胞工学、１３：３８１−３８８，１９９４）ではない、
アクチン切断タンパクによるアクチン側からの調節が非
筋細胞で起こっているとする全く新しい画期的概念であ
る。
働きによって調節されるという考えが主流であった（西
崎孝道、「開口放出現象における細胞質タンパク質の役
割」、細胞工学、１３：３５３−３６０，１９９４）
が、野々村教授らの仮説は、この過程が最終的にアクチ
ン−ミオシン相互作用によるものであるとする点で新し
く、またミオシン軽鎖キナーゼによるミオシン側の調節
（持田澄子、「ミオシン軽鎖キナーゼ神経伝達物質放出
とその調節におけるミオシン軽鎖キナーゼの役割」、細
胞工学、１３：３８１−３８８，１９９４）ではない、
アクチン切断タンパクによるアクチン側からの調節が非
筋細胞で起こっているとする全く新しい画期的概念であ
る。
【０００８】
【発明が解決すべき課題】アクチンは、細胞の崩壊によ
り細胞外に露出し、血液中で血小板凝集を惹起あるいは
増強し、血栓の成長の引き金になると考えられている
（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ，ｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ・Ｃｏｍｍｕｎ．１０
０：１３１４−１３１９，１９８１）。一方、アドゼベ
リンは上述したように生体内において、ゲルゾリンと類
似の活性、すなわちアクチンフィラメント切断活性を有
している。これらのことより、アドゼベリンは血栓にか
かわる薬剤（例えば血栓抑制剤）などのような医薬用途
に利用できる可能性があると考えられる。
り細胞外に露出し、血液中で血小板凝集を惹起あるいは
増強し、血栓の成長の引き金になると考えられている
（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ，ｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ・Ｃｏｍｍｕｎ．１０
０：１３１４−１３１９，１９８１）。一方、アドゼベ
リンは上述したように生体内において、ゲルゾリンと類
似の活性、すなわちアクチンフィラメント切断活性を有
している。これらのことより、アドゼベリンは血栓にか
かわる薬剤（例えば血栓抑制剤）などのような医薬用途
に利用できる可能性があると考えられる。
【０００９】さらに、アドゼベリンをコードする塩基配
列から、そのアンチセンスＤＮＡ配列を作製して投与す
ることにより、例えば、生理活性物質の放出を遺伝子レ
ベルで抑制することも考えられる。特に、アドゼベリン
は血管平滑筋の増殖に深く関わっている可能性があるこ
とから、アンチセンスＤＮＡの投与によりアドゼベリン
の機能を抑制し、これによって平滑筋増殖を抑制しうる
と考えられる。したがって、アドゼベリンのアンチセン
スＤＮＡの投与は、バイパス手術時などの血管移植時の
血管狭窄の抑制剤や経皮的冠血管形成術（ｐｅｒｃｕｔ
ａｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ ｃｏｒｏｎａ
ｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ：ＰＴＣＡ）後の再狭窄
の抑制剤として利用できる可能性を有している。
列から、そのアンチセンスＤＮＡ配列を作製して投与す
ることにより、例えば、生理活性物質の放出を遺伝子レ
ベルで抑制することも考えられる。特に、アドゼベリン
は血管平滑筋の増殖に深く関わっている可能性があるこ
とから、アンチセンスＤＮＡの投与によりアドゼベリン
の機能を抑制し、これによって平滑筋増殖を抑制しうる
と考えられる。したがって、アドゼベリンのアンチセン
スＤＮＡの投与は、バイパス手術時などの血管移植時の
血管狭窄の抑制剤や経皮的冠血管形成術（ｐｅｒｃｕｔ
ａｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ ｃｏｒｏｎａ
ｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ：ＰＴＣＡ）後の再狭窄
の抑制剤として利用できる可能性を有している。
【００１０】アクチン調節タンパク質であるアドゼベリ
ンを上述のような医薬用途に用いるには、これを大量に
かつ均一に得る必要がある。しかしながら、従来、アド
ゼベリンを動物組織自体、あるいはその産生細胞の培養
上清から単離する方法では大量に均一なアドゼベリンを
得ることは困難であった。そこで、アドゼベリンをコー
ドする遺伝子の塩基配列を明らかにし、遺伝子組換え技
術を用いてアドゼベリンを大量に製造することが望まれ
ていた。
ンを上述のような医薬用途に用いるには、これを大量に
かつ均一に得る必要がある。しかしながら、従来、アド
ゼベリンを動物組織自体、あるいはその産生細胞の培養
上清から単離する方法では大量に均一なアドゼベリンを
得ることは困難であった。そこで、アドゼベリンをコー
ドする遺伝子の塩基配列を明らかにし、遺伝子組換え技
術を用いてアドゼベリンを大量に製造することが望まれ
ていた。
【００１１】本発明の目的はアドゼベリンをコードする
遺伝子の塩基配列を決定することにあり、併せて該配列
を含む組換えベクターを用いる遺伝子組換え技術を用い
てアドゼベリンを大量に製造し、これを用いたスクリー
ニング系などを構築することにより、新たな医薬品を開
発する可能性を示すことである。さらに、アドゼベリン
をコードする遺伝子の塩基配列に基づいてアンチセンス
ＤＮＡを製造し、アドゼベリンの生成抑制剤として用い
ることも目的の１つである。また、アドゼベリンタンパ
ク質を認識する抗体を提供することも目的とする。
遺伝子の塩基配列を決定することにあり、併せて該配列
を含む組換えベクターを用いる遺伝子組換え技術を用い
てアドゼベリンを大量に製造し、これを用いたスクリー
ニング系などを構築することにより、新たな医薬品を開
発する可能性を示すことである。さらに、アドゼベリン
をコードする遺伝子の塩基配列に基づいてアンチセンス
ＤＮＡを製造し、アドゼベリンの生成抑制剤として用い
ることも目的の１つである。また、アドゼベリンタンパ
ク質を認識する抗体を提供することも目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ウシ副腎
髄質からアドゼベリンを単離、精製して、その性状を明
らかにした（Ｓａｋｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ ３８：７４３−７５６，１９９０；
Ｓａｋｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ・Ｂｉｏｌ．Ｏｈｅ
ｍ．２６６：４５８１−４５８４，１９９１：Ｓａｋｕ
ｒａｉ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
６：１５９７９−１５９８３，１９９１）。
髄質からアドゼベリンを単離、精製して、その性状を明
らかにした（Ｓａｋｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ ３８：７４３−７５６，１９９０；
Ｓａｋｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ・Ｂｉｏｌ．Ｏｈｅ
ｍ．２６６：４５８１−４５８４，１９９１：Ｓａｋｕ
ｒａｉ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
６：１５９７９−１５９８３，１９９１）。
【００１３】さらにこのタンパク質の加水分解断片を得
て、そのアミノ酸配列の部分情報をもとにオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成し、ウシ腎臓から樹立した細胞
系であるＭＤＢＫ細胞（ＪＣＲＢ−Ｃｅｌｌ：財団法人
がん研究振興財団から入手）から調製したｍＲＮＡから
逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記合成プライ
マーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）により、ウシアドゼベリンをコードするＤＮＡ断片
を特異的に増幅した。次いで３２Ｐで標識したこのＤＮ
Ａ断片をプローブとしてウシ副腎髄質から調製したｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングし、得られた３つの
重複するクローンから目的とするアクチンフィラメント
切断タンパク質をコードする遺伝子を組み立て、その全
塩基配列を明らかにすることに成功した。
て、そのアミノ酸配列の部分情報をもとにオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成し、ウシ腎臓から樹立した細胞
系であるＭＤＢＫ細胞（ＪＣＲＢ−Ｃｅｌｌ：財団法人
がん研究振興財団から入手）から調製したｍＲＮＡから
逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記合成プライ
マーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）により、ウシアドゼベリンをコードするＤＮＡ断片
を特異的に増幅した。次いで３２Ｐで標識したこのＤＮ
Ａ断片をプローブとしてウシ副腎髄質から調製したｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングし、得られた３つの
重複するクローンから目的とするアクチンフィラメント
切断タンパク質をコードする遺伝子を組み立て、その全
塩基配列を明らかにすることに成功した。
【００１４】本発明者らは、次いで、このウシアドゼベ
リンｃＤＮＡをプローブとし、ヒト腎臓ｍＲＮＡより作
製したｃＤＮＡライブラリーを厳密度の低い条件のプラ
ークハイブリダイゼーションによってスクリーニングし
た結果、ヒトアドゼベリンｃＤＮＡを単離し、その全塩
基配列を明らかにすることに成功した。
リンｃＤＮＡをプローブとし、ヒト腎臓ｍＲＮＡより作
製したｃＤＮＡライブラリーを厳密度の低い条件のプラ
ークハイブリダイゼーションによってスクリーニングし
た結果、ヒトアドゼベリンｃＤＮＡを単離し、その全塩
基配列を明らかにすることに成功した。
【００１５】すなわち、本発明は、アドゼベリンをコー
ドする遺伝子を提供する。さらに詳しくは本発明は、配
列表の配列番号４または５に示すアミノ酸配列をコード
する塩基配列、またはこれを一部置換、欠失もしくは付
加した塩基配列、あるいはこれらにハイブリダイズする
塩基配列を含むＤＮＡを提供する。
ドする遺伝子を提供する。さらに詳しくは本発明は、配
列表の配列番号４または５に示すアミノ酸配列をコード
する塩基配列、またはこれを一部置換、欠失もしくは付
加した塩基配列、あるいはこれらにハイブリダイズする
塩基配列を含むＤＮＡを提供する。
【００１６】本発明はまた、アドゼベリンタンパク質を
コードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
コードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
【００１７】本発明はさらに、アドゼベリンタンパク質
をコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質
転換された原核もしくは真核宿主細胞を提供する。
をコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質
転換された原核もしくは真核宿主細胞を提供する。
【００１８】本発明はさらに、アドゼベリンタンパク質
をコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質
転換して得られた形質転換体を培養し、産生された目的
タンパク質を分離、精製することを特徴とする、ヒトア
ドゼベリンタンパク質の製造方法を提供する。
をコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質
転換して得られた形質転換体を培養し、産生された目的
タンパク質を分離、精製することを特徴とする、ヒトア
ドゼベリンタンパク質の製造方法を提供する。
【００１９】本発明はさらに、上記製造方法で製造され
た組換えアドゼベリンタンパク質を提供する。
た組換えアドゼベリンタンパク質を提供する。
【００２０】本発明はさらに、アドゼベリンをコードす
る遺伝子と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレ
オチドを提供する。
る遺伝子と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレ
オチドを提供する。
【００２１】本発明はさらに、アドゼベリンをコードす
る遺伝子と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレ
オチドを動物に投与することからなる、動物におけるア
ドゼベリンの生成を抑制する方法を提供する。
る遺伝子と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレ
オチドを動物に投与することからなる、動物におけるア
ドゼベリンの生成を抑制する方法を提供する。
【００２２】本発明はさらに、アドゼベリンタンパク質
を認識する抗体を提供する。
を認識する抗体を提供する。
【００２３】さらに、本発明者らは標識したアドゼベリ
ンｃＤＮＡの断片をプローブとして用いてインサイチュ
ハイブリダイゼーションを行い、組織中におけるアドゼ
ベリンｍＲＮＡの発現を試験して、アドゼベリンの組織
中における分布を明らかにした。また、アドゼベリン中
におけるアクチン切断ドメインも併せて検討した。
ンｃＤＮＡの断片をプローブとして用いてインサイチュ
ハイブリダイゼーションを行い、組織中におけるアドゼ
ベリンｍＲＮＡの発現を試験して、アドゼベリンの組織
中における分布を明らかにした。また、アドゼベリン中
におけるアクチン切断ドメインも併せて検討した。
【００２４】
【具体的な説明】アドゼベリンをコードするｃＤＮＡ
は、例えばアドゼベリンを産生する細胞などからｍＲＮ
Ａを調製した後、既知の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変
換することにより得られる。
は、例えばアドゼベリンを産生する細胞などからｍＲＮ
Ａを調製した後、既知の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変
換することにより得られる。
【００２５】本発明ではｍＲＮＡの供給源として、ウシ
アドゼベリンに関してはウシ腎臓から樹立した細胞系で
あるＭＤＢＫ細胞およびウシ副腎髄質（Ｍａｄｉｎ ｅ
ｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．９
８：５７４−５７６，１９５８）を、またヒトアドゼベ
リンに関してはＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．社より購入したヒト腎臓ｍＲＮＡを用
いたが、これに限らず、副腎髄質クロマフィン細胞、腎
臓髄質、甲状腺組織のホモジェネートなどを用いてもよ
い。
アドゼベリンに関してはウシ腎臓から樹立した細胞系で
あるＭＤＢＫ細胞およびウシ副腎髄質（Ｍａｄｉｎ ｅ
ｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．９
８：５７４−５７６，１９５８）を、またヒトアドゼベ
リンに関してはＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．社より購入したヒト腎臓ｍＲＮＡを用
いたが、これに限らず、副腎髄質クロマフィン細胞、腎
臓髄質、甲状腺組織のホモジェネートなどを用いてもよ
い。
【００２６】ＲＮＡを調製するには、例えば、Ｃｈｉｒ
ｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９
４−５２９９，１９７９）の方法にしたがって、グアニ
ジンチオシアネート処理後、塩化セシウム密度勾配遠心
を行うことによって全ＲＮＡを調製できる。また、他の
生理活性タンパク質の遺伝子をクローン化するときに用
いられた方法、例えばバナジウム複合体などのリボヌク
レアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノ
ール処理を行うことによっても実施することができる。
ｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９
４−５２９９，１９７９）の方法にしたがって、グアニ
ジンチオシアネート処理後、塩化セシウム密度勾配遠心
を行うことによって全ＲＮＡを調製できる。また、他の
生理活性タンパク質の遺伝子をクローン化するときに用
いられた方法、例えばバナジウム複合体などのリボヌク
レアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノ
ール処理を行うことによっても実施することができる。
【００２７】こうして得られたｍＲＮＡから二本鎖ｃＤ
ＮＡを得るには、例えばｍＲＮＡを鋳型にして、３’末
端にあるポリＡ−鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）またはラ
ンダムプライマー、あるいはアドゼベリンのアミノ酸配
列の一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして逆転写反応を行い、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を合成する。
ＮＡを得るには、例えばｍＲＮＡを鋳型にして、３’末
端にあるポリＡ−鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）またはラ
ンダムプライマー、あるいはアドゼベリンのアミノ酸配
列の一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして逆転写反応を行い、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を合成する。
【００２８】本発明では、以下の方法によってウシアド
ゼベリンのｃＤＮＡを得た。すなわち、ランダムヘキサ
マーをプライマーとする逆転写反応を行い、次いで縮重
プライマーを用いるＰＣＲによりこれを増幅して、約７
００ｂｐのアドゼベリンの部分ｃＤＮＡを表すＰＣＲ産
物を得た。上記ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳ
Ｋ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にサブクローニ
ングした。次いでウシ副腎髄質から調製したλｇｔ１１
ｃＤＮＡライブラリーを、３２Ｐ−標識したクローン
化ＰＣＲ産物をプローブとしてスクリーニングした。本
発明ではこれにより３つのプラークを得て、その重複す
る塩基配列から目的とするアドゼベリンをコードするｃ
ＤＮＡを組み立てた。オープンリーディングフレームは
７１５アミノ酸からなる８０５２７ダルトンのタンパク
質であることが判明した（配列表の配列番号４参照）。
ゼベリンのｃＤＮＡを得た。すなわち、ランダムヘキサ
マーをプライマーとする逆転写反応を行い、次いで縮重
プライマーを用いるＰＣＲによりこれを増幅して、約７
００ｂｐのアドゼベリンの部分ｃＤＮＡを表すＰＣＲ産
物を得た。上記ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳ
Ｋ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にサブクローニ
ングした。次いでウシ副腎髄質から調製したλｇｔ１１
ｃＤＮＡライブラリーを、３２Ｐ−標識したクローン
化ＰＣＲ産物をプローブとしてスクリーニングした。本
発明ではこれにより３つのプラークを得て、その重複す
る塩基配列から目的とするアドゼベリンをコードするｃ
ＤＮＡを組み立てた。オープンリーディングフレームは
７１５アミノ酸からなる８０５２７ダルトンのタンパク
質であることが判明した（配列表の配列番号４参照）。
【００２９】また、ヒトアドゼベリンのｃＤＮＡは以下
の方法で得た。すなわち、ＰｈａｒｍａＣｉａ社より購
入したＴｉｍｅＳａｖｅｒＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて二本鎖ｃＤＮＡの合成を行っ
た。
の方法で得た。すなわち、ＰｈａｒｍａＣｉａ社より購
入したＴｉｍｅＳａｖｅｒＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて二本鎖ｃＤＮＡの合成を行っ
た。
【００３０】合成した二本鎖ｃＤＮＡを、上記Ｋｉｔに
含まれているＳｐｕｎ Ｃｏｌｕｍｎか、あるいはアガ
ロース電気泳動によりサイズ分画し、前者の場合には約
４００塩基対（ｂｐ）以上、後者の場合は約２−３ｋｂ
ｐのサイズをもつｃＤＮＡのみを回収した。この末端に
アダプターを連結しベクターへ組み込んだ。ベクターに
組み込んだｃＤＮＡをＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入
したＧＩＧＡＰＡＣＫＲ ＩＩ ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ
ＥＸＴＲＡＣＴを用いてパッケージングを行い、ｃＤＮ
Ａライブラリーとした。
含まれているＳｐｕｎ Ｃｏｌｕｍｎか、あるいはアガ
ロース電気泳動によりサイズ分画し、前者の場合には約
４００塩基対（ｂｐ）以上、後者の場合は約２−３ｋｂ
ｐのサイズをもつｃＤＮＡのみを回収した。この末端に
アダプターを連結しベクターへ組み込んだ。ベクターに
組み込んだｃＤＮＡをＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入
したＧＩＧＡＰＡＣＫＲ ＩＩ ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ
ＥＸＴＲＡＣＴを用いてパッケージングを行い、ｃＤＮ
Ａライブラリーとした。
【００３１】次いで、３２Ｐで標識し、熱変性したウシ
アドゼベリンｃＤＮＡをプローブとし、厳密度を下げた
条件でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、１
つの陽性ファージクローンを得た。このｃＤＮＡ部分を
ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドベクターに組み込
み、クローンｐＡＤａ−１７を得た。このクローンの塩
基配列を部分的に決定したところ、ウシアドゼベリンｃ
ＤＮＡの塩基配列と非常に高い相同性（８０−９０％）
を示した。一方、アドゼベリンのファミリータンパク質
であり、既に塩基配列が報告されているゲルゾリンとは
６０％以下の相同性しか示さず、明らかに異なる遺伝子
であったので、このクローンはアドゼベリンのヒトカウ
ンターパートであると推察された。しかしながら、この
クローンは全長約１ｋｂｐ程度であり、全コーディング
領域を含むものとは考えられなかったので、さらにスク
リーニングが必要であった。
アドゼベリンｃＤＮＡをプローブとし、厳密度を下げた
条件でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、１
つの陽性ファージクローンを得た。このｃＤＮＡ部分を
ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドベクターに組み込
み、クローンｐＡＤａ−１７を得た。このクローンの塩
基配列を部分的に決定したところ、ウシアドゼベリンｃ
ＤＮＡの塩基配列と非常に高い相同性（８０−９０％）
を示した。一方、アドゼベリンのファミリータンパク質
であり、既に塩基配列が報告されているゲルゾリンとは
６０％以下の相同性しか示さず、明らかに異なる遺伝子
であったので、このクローンはアドゼベリンのヒトカウ
ンターパートであると推察された。しかしながら、この
クローンは全長約１ｋｂｐ程度であり、全コーディング
領域を含むものとは考えられなかったので、さらにスク
リーニングが必要であった。
【００３２】そこで、上記クローンｐＡＤａ−１７をプ
ローブとし、厳密度を上げた、通常の条件でプラークハ
イブリダイゼーションを行った。その際、完全長のクロ
ーンを効率よく得ることを目的として、新たにヒト腎臓
ｍＲＮＡより作製した、２−３ｋｂｐのｃＤＮＡのみを
濃縮したライブラリーを使用した。これから５つの陽性
ファージクローンを得て、ＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭ／ＳＯ
ＬＲ ＳＹＳＴＥＭによるプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＲＳＫ（−）ベクター）への切り出しを行い、
プラスミドクローンｐｈＡＤ−２〜６を得た。このうち
ｐｈＡＤ−２とｐｈＡＤ−４について塩基配列を決定
し、両者の配列を組み合わせることにより、配列表の配
列番号５に示す配列を決定した。この塩基配列から、７
９番目からのＡＴＧを開始コドン（Ｍｅｔ）とする７１
５アミノ酸からなるオープンリーディングフレームが見
いだされた。このアミノ酸配列をウシアドゼベリンのア
ミノ酸配列と比較した結果が図９である。両者はアミノ
酸レベルで約９２％の相同性がみられ、種を越えて非常
によく保存されているタンパク質であると考えられる。
完全に一致していないアミノ酸についても、類似性の高
いアミノ酸が使用されていることが多いことも明らかと
なった。また塩基レベルでもコーディング領域内では約
９０％の相同性がみられるが、ストップコドン以降は急
激に相同性を失っており、種の違いを反映しているもの
と考えられる。
ローブとし、厳密度を上げた、通常の条件でプラークハ
イブリダイゼーションを行った。その際、完全長のクロ
ーンを効率よく得ることを目的として、新たにヒト腎臓
ｍＲＮＡより作製した、２−３ｋｂｐのｃＤＮＡのみを
濃縮したライブラリーを使用した。これから５つの陽性
ファージクローンを得て、ＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭ／ＳＯ
ＬＲ ＳＹＳＴＥＭによるプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＲＳＫ（−）ベクター）への切り出しを行い、
プラスミドクローンｐｈＡＤ−２〜６を得た。このうち
ｐｈＡＤ−２とｐｈＡＤ−４について塩基配列を決定
し、両者の配列を組み合わせることにより、配列表の配
列番号５に示す配列を決定した。この塩基配列から、７
９番目からのＡＴＧを開始コドン（Ｍｅｔ）とする７１
５アミノ酸からなるオープンリーディングフレームが見
いだされた。このアミノ酸配列をウシアドゼベリンのア
ミノ酸配列と比較した結果が図９である。両者はアミノ
酸レベルで約９２％の相同性がみられ、種を越えて非常
によく保存されているタンパク質であると考えられる。
完全に一致していないアミノ酸についても、類似性の高
いアミノ酸が使用されていることが多いことも明らかと
なった。また塩基レベルでもコーディング領域内では約
９０％の相同性がみられるが、ストップコドン以降は急
激に相同性を失っており、種の違いを反映しているもの
と考えられる。
【００３３】また、図９の中で、四角で囲んだ部分はリ
ン脂質が結合すると推定される領域である。ウシアドゼ
ベリンにおいてリン脂質の結合領域であるとされている
部分（１１２）ＫＧＧＬＫＹＫＡ（１１９）と、（１３
８）ＲＬＬＨＶＫＧＲＲ（１４６）は、ともにヒトアド
ゼベリンにおいても完全に保存されていた。アドゼベリ
ンとゲルゾリンとのリン脂質に対する感受性の差異は、
この領域のアミノ酸配列の違いに起因しているのかも知
れないことが示唆された。アドゼベリンは細胞内におい
て、細胞膜付近に存在することが示唆されており、細胞
膜の構成成分による活性調節が存在するならば、重要な
意味をもつものと思われる。特にゲルゾリンもＣａ２＋
で同様に活性化されることを考えると、両者の使い分け
がこのリン脂質による調節に依っている可能性が高い。
ン脂質が結合すると推定される領域である。ウシアドゼ
ベリンにおいてリン脂質の結合領域であるとされている
部分（１１２）ＫＧＧＬＫＹＫＡ（１１９）と、（１３
８）ＲＬＬＨＶＫＧＲＲ（１４６）は、ともにヒトアド
ゼベリンにおいても完全に保存されていた。アドゼベリ
ンとゲルゾリンとのリン脂質に対する感受性の差異は、
この領域のアミノ酸配列の違いに起因しているのかも知
れないことが示唆された。アドゼベリンは細胞内におい
て、細胞膜付近に存在することが示唆されており、細胞
膜の構成成分による活性調節が存在するならば、重要な
意味をもつものと思われる。特にゲルゾリンもＣａ２＋
で同様に活性化されることを考えると、両者の使い分け
がこのリン脂質による調節に依っている可能性が高い。
【００３４】このようにして得られた本発明のクローン
化されたアドゼベリンをコードする遺伝子を用いると、
遺伝子組み換え技術によってアドゼベリンを大量に製造
し、医薬用途に使用することが可能である。
化されたアドゼベリンをコードする遺伝子を用いると、
遺伝子組み換え技術によってアドゼベリンを大量に製造
し、医薬用途に使用することが可能である。
【００３５】すなわち、本発明のアドゼベリンをコード
する遺伝子を適当なベクターに組み込むことにより、原
核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換することが
できる。
する遺伝子を適当なベクターに組み込むことにより、原
核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換することが
できる。
【００３６】さらに、これらのベクターに適当なプロモ
ーターや形質発現にかかわる配列を導入することによ
り、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現すること
が可能である。また、目的とする遺伝子に他のポリペプ
チドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質と
して発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げた
り、また精製工程において適当な処理を施すことによ
り、目的タンパク質を切り出すことも可能である。
ーターや形質発現にかかわる配列を導入することによ
り、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現すること
が可能である。また、目的とする遺伝子に他のポリペプ
チドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質と
して発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げた
り、また精製工程において適当な処理を施すことによ
り、目的タンパク質を切り出すことも可能である。
【００３７】一般に、真核生物の遺伝子はヒトインター
フェロン遺伝子で知られているように、多形現象を示す
と考えられ、この多形現象によって１個またはそれ以上
のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化
はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。
フェロン遺伝子で知られているように、多形現象を示す
と考えられ、この多形現象によって１個またはそれ以上
のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化
はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。
【００３８】また、配列表の配列番号４または５のアミ
ノ酸配列中の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くかま
たは付加したポリペプチド、あるいはアミノ酸が１個ま
たはそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでも
アクチンフィラメント切断活性を有することがある。例
えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシ
ステインに相当する塩基配列をセリンに相当する塩基配
列に変換して得られたポリペプチドがＩＬ−２活性を保
持することも既に公知になっている（Ｗａｎｇｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４３１，１９８
４）。これらのアドゼベリンをコードする遺伝子の改変
体を作製する技術は当業者には公知である。
ノ酸配列中の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くかま
たは付加したポリペプチド、あるいはアミノ酸が１個ま
たはそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでも
アクチンフィラメント切断活性を有することがある。例
えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシ
ステインに相当する塩基配列をセリンに相当する塩基配
列に変換して得られたポリペプチドがＩＬ−２活性を保
持することも既に公知になっている（Ｗａｎｇｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４３１，１９８
４）。これらのアドゼベリンをコードする遺伝子の改変
体を作製する技術は当業者には公知である。
【００３９】さらに、上記したように、ウシアドゼベリ
ンとヒトアドゼベリンとは相同性が高く、完全に一致し
ていないアミノ酸についても類似のアミノ酸が使用され
ている部分が多い。したがって、ウシアドゼベリンとヒ
トアドゼベリンの一部が置換した遺伝子、あるいはこれ
らのキメラ遺伝子も本発明の範囲内である。
ンとヒトアドゼベリンとは相同性が高く、完全に一致し
ていないアミノ酸についても類似のアミノ酸が使用され
ている部分が多い。したがって、ウシアドゼベリンとヒ
トアドゼベリンの一部が置換した遺伝子、あるいはこれ
らのキメラ遺伝子も本発明の範囲内である。
【００４０】また、真核細胞で発現させた場合、その多
くは糖鎖が付加され、アミノ酸を１個ないしそれ以上変
換することにより糖鎖付加を調節することができるが、
この場合でもアクチンフィラメント切断活性を有するこ
とがある。それゆえ、本発明におけるヒトアドゼベリン
をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて、
得られたポリペプチドがアクチンフィラメント切断活性
を有する限り、それらのポリペプチドをコードする遺伝
子はすべて本発明に含まれる。
くは糖鎖が付加され、アミノ酸を１個ないしそれ以上変
換することにより糖鎖付加を調節することができるが、
この場合でもアクチンフィラメント切断活性を有するこ
とがある。それゆえ、本発明におけるヒトアドゼベリン
をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて、
得られたポリペプチドがアクチンフィラメント切断活性
を有する限り、それらのポリペプチドをコードする遺伝
子はすべて本発明に含まれる。
【００４１】さらに、得られたポリペプチドがアクチン
フィラメント切断活性を有し、配列番号４または５に示
す遺伝子とハイブリダイズする遺伝子も本発明に含まれ
る。なお、ハイブリダイゼーション条件は、通常行われ
ているプローブハイブリダイゼーションの条件を適用す
ることができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａ
ｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ，１９８９）。
フィラメント切断活性を有し、配列番号４または５に示
す遺伝子とハイブリダイズする遺伝子も本発明に含まれ
る。なお、ハイブリダイゼーション条件は、通常行われ
ているプローブハイブリダイゼーションの条件を適用す
ることができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａ
ｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ，１９８９）。
【００４２】発現ベクターは、複製起源、選択マーカ
ー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナルなどを含むことができる。
ー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナルなどを含むことができる。
【００４３】発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細
胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌などが挙げられ
る。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞とし
ては、例えばイースト、粘菌が挙げられる。あるいは、
Ｓｆ９などの昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよ
い。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例え
ば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。
胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌などが挙げられ
る。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞とし
ては、例えばイースト、粘菌が挙げられる。あるいは、
Ｓｆ９などの昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよ
い。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例え
ば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。
【００４４】以上のようにしてアドゼベリンをコードす
る遺伝子で形質転換した形質転換体を培養することによ
り産生されたタンパク質は細胞内または細胞外から分離
し、精製することができる。
る遺伝子で形質転換した形質転換体を培養することによ
り産生されたタンパク質は細胞内または細胞外から分離
し、精製することができる。
【００４５】なお、アドゼベリンの分離、精製には通常
のタンパク質で用いられる分離、精製方法を使用するこ
とができる。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾
過、塩析、透析などを適宜選択、組み合わせて使用する
ことができる。
のタンパク質で用いられる分離、精製方法を使用するこ
とができる。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾
過、塩析、透析などを適宜選択、組み合わせて使用する
ことができる。
【００４６】本発明によると、アドゼベリンをコードす
る遺伝子の塩基配列に基づいて、アンチセンスＤＮＡの
作製ができる。アンチセンスＤＮＡは、ｍＲＮＡに対し
て相補的塩基配列をもち、ｍＲＮＡと塩基対を形成する
ことにより、遺伝情報の流れを遮断し、最終産物である
アドゼベリンタンパク質の合成を抑制する。本発明にお
いて使用できるアンチセンスＤＮＡは、配列表の範囲番
号４または５に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列
と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドで
ある。
る遺伝子の塩基配列に基づいて、アンチセンスＤＮＡの
作製ができる。アンチセンスＤＮＡは、ｍＲＮＡに対し
て相補的塩基配列をもち、ｍＲＮＡと塩基対を形成する
ことにより、遺伝情報の流れを遮断し、最終産物である
アドゼベリンタンパク質の合成を抑制する。本発明にお
いて使用できるアンチセンスＤＮＡは、配列表の範囲番
号４または５に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列
と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドで
ある。
【００４７】ここで「オリゴヌクレオチド」の語は、天
然に存在する塩基および本来のホスホジエステル結合に
よって結合した糖部分から生成されたオリゴヌクレオチ
ドおよびその類似体を意味する。したがって、この用語
が含む第１の群は、天然に存在する種または天然に存在
するサブユニットまたはそれらの同族体から生成された
合成種である。また、サブユニットとは隣接するサブユ
ニットに対してホスホジエステル結合または他の結合に
よって結合した塩基−糖の組み合わせをいう。またオリ
ゴヌクレオチドの第２の群はその類似体であり、これは
オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在し
ていない部分を有する残基を意味する。これらには、安
定性を増加するためにリン酸基、糖部分、３’，５’末
端に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドを含む。例え
ば、ヌクレオチド間のホスホジエステル基の酸素原子の
１つを硫黄に置換したオリゴホスホロチオエート、−Ｃ
Ｈ３に置換したオリゴメチルホスホネートなどが挙げら
れる。また、ホスホジエステル結合は、非イオン性かつ
非キラル性である他の構造で置換されていてもよい。さ
らに、オリゴヌクレオチド類似体としては、修飾された
塩基形態、すなわち天然に通常見いだされるもの以外の
プリンおよびピリミジンを含む種を用いてもよい。
然に存在する塩基および本来のホスホジエステル結合に
よって結合した糖部分から生成されたオリゴヌクレオチ
ドおよびその類似体を意味する。したがって、この用語
が含む第１の群は、天然に存在する種または天然に存在
するサブユニットまたはそれらの同族体から生成された
合成種である。また、サブユニットとは隣接するサブユ
ニットに対してホスホジエステル結合または他の結合に
よって結合した塩基−糖の組み合わせをいう。またオリ
ゴヌクレオチドの第２の群はその類似体であり、これは
オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在し
ていない部分を有する残基を意味する。これらには、安
定性を増加するためにリン酸基、糖部分、３’，５’末
端に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドを含む。例え
ば、ヌクレオチド間のホスホジエステル基の酸素原子の
１つを硫黄に置換したオリゴホスホロチオエート、−Ｃ
Ｈ３に置換したオリゴメチルホスホネートなどが挙げら
れる。また、ホスホジエステル結合は、非イオン性かつ
非キラル性である他の構造で置換されていてもよい。さ
らに、オリゴヌクレオチド類似体としては、修飾された
塩基形態、すなわち天然に通常見いだされるもの以外の
プリンおよびピリミジンを含む種を用いてもよい。
【００４８】本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ま
しくは８〜４０個、さらに好ましくは１５〜３０個のサ
ブユニットを有する。
しくは８〜４０個、さらに好ましくは１５〜３０個のサ
ブユニットを有する。
【００４９】本発明においては、オリゴヌクレオチドが
ハイブリダイズするｍＲＮＡの標的部分は転写開始部
位、翻訳開始部位、イントロン／エキソン結合部位また
は５’キャップ部位が好ましいが、ｍＲＮＡの二次構造
を考慮して立体障害のない部位を選択すべきである。
ハイブリダイズするｍＲＮＡの標的部分は転写開始部
位、翻訳開始部位、イントロン／エキソン結合部位また
は５’キャップ部位が好ましいが、ｍＲＮＡの二次構造
を考慮して立体障害のない部位を選択すべきである。
【００５０】本発明によるオリゴヌクレオチドは、当業
界で公知の合成法、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社などの合成装置を用いる固相合成法によっ
て製造できる。同様の方法を用いて、他のオリゴヌクレ
オチド類似体、例えば、ホスホロチオエートやアルキル
化誘導体を製造することもできる（村上 章ら、「機能
性アンチセンスＤＮＡの合成」、有機合成化学、４８
（３）：１８０−１９３、１９９０）。
界で公知の合成法、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社などの合成装置を用いる固相合成法によっ
て製造できる。同様の方法を用いて、他のオリゴヌクレ
オチド類似体、例えば、ホスホロチオエートやアルキル
化誘導体を製造することもできる（村上 章ら、「機能
性アンチセンスＤＮＡの合成」、有機合成化学、４８
（３）：１８０−１９３、１９９０）。
【００５１】本発明のアドゼベリンをコードする遺伝子
と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを
動物に投与することによって、動物におけるアドゼベリ
ンの生成を抑制することが可能である。また、アドゼベ
リンは上述したように、血管平滑筋の増殖に関与してい
る可能性がある。血管平滑筋の増殖はバイパス手術など
の血管移植時の血管狭窄やＰＴＣＡ施行例の３０−４０
％に観察される血管再狭窄をもたらす原因の１つである
と見なされている。したがって、アドゼベリンをコード
する遺伝子のアンチセンスＤＮＡの投与により血管平滑
筋の増殖を抑制し、このような狭窄の予防・治療剤とし
て使用することができる。例えば、移植血管を、移植す
る前に本発明のオリゴヌクレオチドを含む溶液に浸して
おいて、オリゴヌクレオチドを細胞内に取り込ませた後
に移植することにより血管狭窄を防止することが考えら
れる。また、ＰＴＣＡカテーテルあるいはステントを利
用して本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによ
る再狭窄の抑制も可能である。
と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを
動物に投与することによって、動物におけるアドゼベリ
ンの生成を抑制することが可能である。また、アドゼベ
リンは上述したように、血管平滑筋の増殖に関与してい
る可能性がある。血管平滑筋の増殖はバイパス手術など
の血管移植時の血管狭窄やＰＴＣＡ施行例の３０−４０
％に観察される血管再狭窄をもたらす原因の１つである
と見なされている。したがって、アドゼベリンをコード
する遺伝子のアンチセンスＤＮＡの投与により血管平滑
筋の増殖を抑制し、このような狭窄の予防・治療剤とし
て使用することができる。例えば、移植血管を、移植す
る前に本発明のオリゴヌクレオチドを含む溶液に浸して
おいて、オリゴヌクレオチドを細胞内に取り込ませた後
に移植することにより血管狭窄を防止することが考えら
れる。また、ＰＴＣＡカテーテルあるいはステントを利
用して本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによ
る再狭窄の抑制も可能である。
【００５２】本発明のアドゼベリンタンパク質を認識す
る抗体を作製するには、定法（例えば、新生化学実験講
座１、タンパク質Ｉ、ｐ．３８９−３９７、１９９２参
照）を用いて、抗原となるアドゼベリンを動物に免疫
し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによ
って得ることができる。このようにして得られた抗アド
ゼベリン抗体はＥＬＩＳＡなどのエンザイムイムノアッ
セイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光法などの各種免
疫学的測定法に用いることができる。
る抗体を作製するには、定法（例えば、新生化学実験講
座１、タンパク質Ｉ、ｐ．３８９−３９７、１９９２参
照）を用いて、抗原となるアドゼベリンを動物に免疫
し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによ
って得ることができる。このようにして得られた抗アド
ゼベリン抗体はＥＬＩＳＡなどのエンザイムイムノアッ
セイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光法などの各種免
疫学的測定法に用いることができる。
【００５３】本発明のアドゼベリンをコードする遺伝子
を得る方法および該遺伝子の宿主細胞中での発現につい
て以下の実施例で詳細に説明するが、この実施例によっ
て本発明が限定されるものではない。
を得る方法および該遺伝子の宿主細胞中での発現につい
て以下の実施例で詳細に説明するが、この実施例によっ
て本発明が限定されるものではない。
【００５４】
実施例１：ウシアドゼベリンの単離および精製 ウシ副腎を屠殺場から得た。以下のすべての操作は４℃
で実施した。副腎髄質を皮質から注意深く分離し、ハサ
ミで細かく切断した。得られた副腎髄質８０ｇを、Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ４０ｍＭ、ＥＧＴＡ ４ｍＭ、ＥＤＴＡ
２ｍＭ、ＤＴＴ １ｍＭ、ＤＦＰ １ｍＭ、ＰＭＳＦ
１ｍＭおよび１０−６Ｍ Ｅ−６４−ｃ、１０μｇ／
ｍｌ アプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ、Ｂａｙｅｒ
社）および０．０２％ＮａＮ３を含むバッファーＡ（ｐ
Ｈ８．０）３容量中、Ｗａｒｉｎｇブレンダーでホモジ
ェナイズした。ホモジェネートを最大１３，０００ｇで
３０分間遠心して上清を濾過し、次いでさらに最大１５
０，０００ｇで９０分間遠心した。上清にＣａＣｌ２お
よびＭｇＣｌ２溶液１モルを最終濃度がそれぞれ０．５
および１ｍＭとなるように加えた。この溶液をＫＣｌ
５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２
０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＰＭＳＦ０．１ｍＭ
および０．０２％ＮａＮ３を含むバッファーＢ（ｐＨ
７．５）であらかじめ平衡化しておいたＤＮａｓｅＩ−
Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５カラムにかけた。カラムをバッ
ファーＢ、次いでＫＣｌ濃度を５０ｍＭから０．６Ｍに
変えたバッファーＢで洗浄した。
で実施した。副腎髄質を皮質から注意深く分離し、ハサ
ミで細かく切断した。得られた副腎髄質８０ｇを、Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ４０ｍＭ、ＥＧＴＡ ４ｍＭ、ＥＤＴＡ
２ｍＭ、ＤＴＴ １ｍＭ、ＤＦＰ １ｍＭ、ＰＭＳＦ
１ｍＭおよび１０−６Ｍ Ｅ−６４−ｃ、１０μｇ／
ｍｌ アプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ、Ｂａｙｅｒ
社）および０．０２％ＮａＮ３を含むバッファーＡ（ｐ
Ｈ８．０）３容量中、Ｗａｒｉｎｇブレンダーでホモジ
ェナイズした。ホモジェネートを最大１３，０００ｇで
３０分間遠心して上清を濾過し、次いでさらに最大１５
０，０００ｇで９０分間遠心した。上清にＣａＣｌ２お
よびＭｇＣｌ２溶液１モルを最終濃度がそれぞれ０．５
および１ｍＭとなるように加えた。この溶液をＫＣｌ
５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ２
０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＰＭＳＦ０．１ｍＭ
および０．０２％ＮａＮ３を含むバッファーＢ（ｐＨ
７．５）であらかじめ平衡化しておいたＤＮａｓｅＩ−
Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５カラムにかけた。カラムをバッ
ファーＢ、次いでＫＣｌ濃度を５０ｍＭから０．６Ｍに
変えたバッファーＢで洗浄した。
【００５５】次いでＣａ２＋−感受性タンパク質を０．
５ｍＭ ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭ ＥＧＴＡを含
む修飾バッファーＢで、次いで６Ｍ尿素を含む修飾バッ
ファーＢで溶出した。ＥＧＴＡ含有バッファーによって
３つのＣａ２＋−感受性アクチン結合タンパク質および
アクチン（分子量４２，０００）が溶出された。これら
の３つのタンパク質の分子量は、ＳＤＳ ＰＡＧＥによ
りそれぞれ８６，０００、８４，０００および７４，０
００と推定された（図１、レーン１−４）。カラムをバ
ッファーＢで洗浄して再生して４℃で保存した。
５ｍＭ ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭ ＥＧＴＡを含
む修飾バッファーＢで、次いで６Ｍ尿素を含む修飾バッ
ファーＢで溶出した。ＥＧＴＡ含有バッファーによって
３つのＣａ２＋−感受性アクチン結合タンパク質および
アクチン（分子量４２，０００）が溶出された。これら
の３つのタンパク質の分子量は、ＳＤＳ ＰＡＧＥによ
りそれぞれ８６，０００、８４，０００および７４，０
００と推定された（図１、レーン１−４）。カラムをバ
ッファーＢで洗浄して再生して４℃で保存した。
【００５６】回収したＥＧＴＡ溶出物中のｐＨを１Ｍ
Ｔｒｉｓで８．２に調整し、ＫＣｌ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＰＭＳＦ
０．１ｍＭ、２−メルカプトエタノール ７ｍＭおよび
０．０２％ＮａＮ３を含む溶液（ｐＨ８．２）であらか
じめ平衡化しておいたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交
換カラム（１．５×１２ｃｍ）にかけた。５０から２５
０ｍＭのＫＣｌの直線状グラジエントでタンパク質を溶
出し、次いで１Ｍ ＫＣｌで溶出した。ＫＣｌ濃度０−
１５０ｍＭに相当する最初のピークに分子量７４，００
０のタンパク質と少量の夾雑タンパク質とが含まれてい
た（図１、レーン６）。分子量８６，０００と８４，０
００のタンパク質ならびにアクチンは１Ｍ ＫＣｌ溶出
物である第２のピークに含まれていた（図１、レーン
７）。
Ｔｒｉｓで８．２に調整し、ＫＣｌ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＰＭＳＦ
０．１ｍＭ、２−メルカプトエタノール ７ｍＭおよび
０．０２％ＮａＮ３を含む溶液（ｐＨ８．２）であらか
じめ平衡化しておいたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交
換カラム（１．５×１２ｃｍ）にかけた。５０から２５
０ｍＭのＫＣｌの直線状グラジエントでタンパク質を溶
出し、次いで１Ｍ ＫＣｌで溶出した。ＫＣｌ濃度０−
１５０ｍＭに相当する最初のピークに分子量７４，００
０のタンパク質と少量の夾雑タンパク質とが含まれてい
た（図１、レーン６）。分子量８６，０００と８４，０
００のタンパク質ならびにアクチンは１Ｍ ＫＣｌ溶出
物である第２のピークに含まれていた（図１、レーン
７）。
【００５７】分子量７４，０００のタンパク質が含まれ
る分画を回収し、濃縮してＮａＣｌ１５０ｍＭ、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＤＴＴ
０．１ｍＭおよび０．０２％ＮａＮ３を含むバッファー
Ｃ（ｐＨ７．０）で平衡化したゲル濾過ＨＰＬＣカラム
（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ、トーソー社）にかけた（図
１、レーン８）。ピーク分画を回収して氷上で保存し
た。
る分画を回収し、濃縮してＮａＣｌ１５０ｍＭ、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ２０ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＤＴＴ
０．１ｍＭおよび０．０２％ＮａＮ３を含むバッファー
Ｃ（ｐＨ７．０）で平衡化したゲル濾過ＨＰＬＣカラム
（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ、トーソー社）にかけた（図
１、レーン８）。ピーク分画を回収して氷上で保存し
た。
【００５８】実施例２：ウシアドゼベリンのプロテアー
ゼ分解 （１）スタフィロコッカスＶ８プロテアーゼによる分解 消化バッファーＣ（１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ、０．０２％ ＮａＮ３および５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣ
Ｏ３）中のアドゼベリンを、室温中、１：２５（ｗｔ／
ｗｔ）の比率でスタフィロコッカスＶ８プロテアーゼで
分解した。ＤＦＰ１ｍＭを加えて反応を停止し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析した。その結果、アドゼベリンは
分子量４２，０００と３９，０００の２つの主要断片に
分解された。Ｖ８プロテアーゼで長時間消化を続ける
と、分子量３９，０００の断片はさらに分子量２８，０
００と分子量１５，０００の断片に分解されたが、分子
量４２，０００の断片は安定であった。 （２）トリプシンによる分解 バッファーＤ（１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、
０．０２％ ＮａＮ３および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０）中のアドゼベリンを、１：２００の比
率でトリプシンにより分解した。２５℃で６０分後、エ
タノール中の２００ｍＭ ＰＭＳＦを最終濃度が４ｍＭ
となるように加えた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したとこ
ろ、この場合にも分子量４２，０００と３９，０００の
２つの断片を生じ、長時間かけてもこれ以上分解されな
かった。
ゼ分解 （１）スタフィロコッカスＶ８プロテアーゼによる分解 消化バッファーＣ（１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ、０．０２％ ＮａＮ３および５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣ
Ｏ３）中のアドゼベリンを、室温中、１：２５（ｗｔ／
ｗｔ）の比率でスタフィロコッカスＶ８プロテアーゼで
分解した。ＤＦＰ１ｍＭを加えて反応を停止し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析した。その結果、アドゼベリンは
分子量４２，０００と３９，０００の２つの主要断片に
分解された。Ｖ８プロテアーゼで長時間消化を続ける
と、分子量３９，０００の断片はさらに分子量２８，０
００と分子量１５，０００の断片に分解されたが、分子
量４２，０００の断片は安定であった。 （２）トリプシンによる分解 バッファーＤ（１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、
０．０２％ ＮａＮ３および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０）中のアドゼベリンを、１：２００の比
率でトリプシンにより分解した。２５℃で６０分後、エ
タノール中の２００ｍＭ ＰＭＳＦを最終濃度が４ｍＭ
となるように加えた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したとこ
ろ、この場合にも分子量４２，０００と３９，０００の
２つの断片を生じ、長時間かけてもこれ以上分解されな
かった。
【００５９】また、２種類の抗ゲルゾリンポリクローナ
ル抗体と上記２つの断片との認識反応を用いることによ
り、分子量３９，０００の断片は分子量４２，０００の
断片の分解物ではないことを確認した。 （３）Ｖ８プロテアーゼによる分解物の精製 Ｖ８プロテアーゼによる分解産物を、あらかじめバッフ
ァーＤで平衡化しておいたＨＰＬＣ ＤＥＡＥイオン交
換カラム（ＤＥＡＥ−ＳＰＷ、トーソー社）にかけた。
分子量３９，０００の断片はカラムに吸着するが、分子
量４２，０００の断片は０−１５０ｍＭ ＮａＣｌのグ
ラジエントで溶出し、１０ｍＭ ＮａＣｌで単一ピーク
として得られた。次いで１ｍＭ ＥＧＴＡに代えて０．
５ｍＭＣａＣｌ２を含むバッファーＤを用いると、分子
量３９，０００の断片が５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出さ
れ、分子量４２，０００の断片は少量しか回収されなか
った。このＶ８プロテアーゼ分解由来の２つの精製断片
はトリプシン分解物とＳＤＳ−ＰＡＧＥでほとんど同じ
パターンを示した。 （４）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 （３）で精製した２つの断片と天然型アドゼベリンのＮ
末端アミノ酸配列を検討した。天然型アドゼベリンおよ
び分子量４２，０００の断片のＮ末端はブロックされて
いたが、分子量３９，０００の断片のＮ末近傍アミノ酸
配列をエドマン分解によって分析したところ以下の配列
表の配列番号１に示す配列： ＫＶＡＨＶＫＱＩＰＦＤＡ を有していることが明らかとなった。この配列を公知の
アクチンフィラメント切断タンパク質であるゲルゾリン
（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２３：４５５−４５８，１９８６）およびビリン
（ｖｉｌｌｉｎ）（Ｂａｚａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
５：４９８６−４９９０，１９８８）の配列と比較し
た。その結果、図２に示すように、この配列はゲルゾリ
ンおよびビリンの保存反復のセグメント３と４との間の
ヒンジ領域、すなわちこれらの分子の真ん中付近と類似
していた。したがって、分子量４２，０００の断片はア
ドゼベリンのＮＨ２末端側の半分にあるタンパク質（以
下”Ｎ４２”と呼ぶ）であり、分子量３９，０００の断
片はアドゼベリンのＣＯＯＨ末端側の半分にあるタンパ
ク質（以下”Ｃ３９”と呼ぶ）であることが示唆され
た。 （５）Ｎ４２およびＣ３９のアクチン結合性 上記のようにして得られたＮ４２とＣ３９のアクチン結
合性をアガロースビーズに結合したアクチン単量体（Ｇ
−アクチン）を用いて試験した。その結果、Ｎ４２もＣ
３９もカルシウムの存在下でＧ−アクチンと結合する
が、カルシウムの非存在下ではＧ−アクチンと結合しな
いことが明らかとなった。 （６）アドゼベリンの機能的ドメインの同定（サーモリ
シンによるＮ４２の分解） Ｎ４２をメタロプロテイナ
ーゼの１種であるサーモリシンで分解したところ、分子
量３１，０００、３０，０００、１６，０００の断片お
よび分子量１５，０００の２種の異なる断片の合計５つ
の断片が得られ、これをＨＰＬＣで精製した。分子量３
１，０００および３０，０００の断片をそれぞれＴＬ１
およびＴＬ２と命名し、その他の３つの断片をＨＰＬＣ
カラムの溶出順にＴＬ３（分子量１５，０００）、ＴＬ
４（分子量１６，０００）およびＴＬ５（分子量１５，
０００）と命名した。ＴＬ１およびＴＬ３のＮ末端は抗
体Ａによって検出されず、Ｎ４２や天然型アドゼベリン
と同様にブロックされていた。これらの結果ならびにＴ
Ｌ２およびＴＬ５が抗体Ａと反応したことから、Ｎ４２
は２つの開裂部位を有しており、断片のマッピングは図
３に示すものと推定された。
ル抗体と上記２つの断片との認識反応を用いることによ
り、分子量３９，０００の断片は分子量４２，０００の
断片の分解物ではないことを確認した。 （３）Ｖ８プロテアーゼによる分解物の精製 Ｖ８プロテアーゼによる分解産物を、あらかじめバッフ
ァーＤで平衡化しておいたＨＰＬＣ ＤＥＡＥイオン交
換カラム（ＤＥＡＥ−ＳＰＷ、トーソー社）にかけた。
分子量３９，０００の断片はカラムに吸着するが、分子
量４２，０００の断片は０−１５０ｍＭ ＮａＣｌのグ
ラジエントで溶出し、１０ｍＭ ＮａＣｌで単一ピーク
として得られた。次いで１ｍＭ ＥＧＴＡに代えて０．
５ｍＭＣａＣｌ２を含むバッファーＤを用いると、分子
量３９，０００の断片が５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出さ
れ、分子量４２，０００の断片は少量しか回収されなか
った。このＶ８プロテアーゼ分解由来の２つの精製断片
はトリプシン分解物とＳＤＳ−ＰＡＧＥでほとんど同じ
パターンを示した。 （４）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 （３）で精製した２つの断片と天然型アドゼベリンのＮ
末端アミノ酸配列を検討した。天然型アドゼベリンおよ
び分子量４２，０００の断片のＮ末端はブロックされて
いたが、分子量３９，０００の断片のＮ末近傍アミノ酸
配列をエドマン分解によって分析したところ以下の配列
表の配列番号１に示す配列： ＫＶＡＨＶＫＱＩＰＦＤＡ を有していることが明らかとなった。この配列を公知の
アクチンフィラメント切断タンパク質であるゲルゾリン
（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２３：４５５−４５８，１９８６）およびビリン
（ｖｉｌｌｉｎ）（Ｂａｚａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
５：４９８６−４９９０，１９８８）の配列と比較し
た。その結果、図２に示すように、この配列はゲルゾリ
ンおよびビリンの保存反復のセグメント３と４との間の
ヒンジ領域、すなわちこれらの分子の真ん中付近と類似
していた。したがって、分子量４２，０００の断片はア
ドゼベリンのＮＨ２末端側の半分にあるタンパク質（以
下”Ｎ４２”と呼ぶ）であり、分子量３９，０００の断
片はアドゼベリンのＣＯＯＨ末端側の半分にあるタンパ
ク質（以下”Ｃ３９”と呼ぶ）であることが示唆され
た。 （５）Ｎ４２およびＣ３９のアクチン結合性 上記のようにして得られたＮ４２とＣ３９のアクチン結
合性をアガロースビーズに結合したアクチン単量体（Ｇ
−アクチン）を用いて試験した。その結果、Ｎ４２もＣ
３９もカルシウムの存在下でＧ−アクチンと結合する
が、カルシウムの非存在下ではＧ−アクチンと結合しな
いことが明らかとなった。 （６）アドゼベリンの機能的ドメインの同定（サーモリ
シンによるＮ４２の分解） Ｎ４２をメタロプロテイナ
ーゼの１種であるサーモリシンで分解したところ、分子
量３１，０００、３０，０００、１６，０００の断片お
よび分子量１５，０００の２種の異なる断片の合計５つ
の断片が得られ、これをＨＰＬＣで精製した。分子量３
１，０００および３０，０００の断片をそれぞれＴＬ１
およびＴＬ２と命名し、その他の３つの断片をＨＰＬＣ
カラムの溶出順にＴＬ３（分子量１５，０００）、ＴＬ
４（分子量１６，０００）およびＴＬ５（分子量１５，
０００）と命名した。ＴＬ１およびＴＬ３のＮ末端は抗
体Ａによって検出されず、Ｎ４２や天然型アドゼベリン
と同様にブロックされていた。これらの結果ならびにＴ
Ｌ２およびＴＬ５が抗体Ａと反応したことから、Ｎ４２
は２つの開裂部位を有しており、断片のマッピングは図
３に示すものと推定された。
【００６０】Ｎ末端がブロックされていないＴＬ４およ
びＴＬ５のアミノ酸配列をエドマン分解により分析した
ところ、ＴＬ４のＮ末端アミノ酸配列は以下に示す配列
表の配列番号２の配列： ＶＬＴＮＤＬＴＡＱ を有しており、これはゲルゾリンのセグメント１と２の
間のヒンジ領域の配列と相同性を有している。一方ＴＬ
５のＮ末端アミノ酸配列は以下に示す配列表の配列番号
３の配列： ＩＴＮＲＫ を有しており、これはゲルゾリンのセグメント２と３の
間のヒンジ領域の配列と相同性を有していた（図３）。
びＴＬ５のアミノ酸配列をエドマン分解により分析した
ところ、ＴＬ４のＮ末端アミノ酸配列は以下に示す配列
表の配列番号２の配列： ＶＬＴＮＤＬＴＡＱ を有しており、これはゲルゾリンのセグメント１と２の
間のヒンジ領域の配列と相同性を有している。一方ＴＬ
５のＮ末端アミノ酸配列は以下に示す配列表の配列番号
３の配列： ＩＴＮＲＫ を有しており、これはゲルゾリンのセグメント２と３の
間のヒンジ領域の配列と相同性を有していた（図３）。
【００６１】したがって、アドゼベリンはゲルゾリンと
類似の構造を有していると考えられる。アドゼベリンの
Ｎ末端側の半分はゲルゾリンと同様に、３つの反復セグ
メントからなっており、１セグメントはそれぞれ〜１５
ｋＤａのタンパク質分解断片に対応する。
類似の構造を有していると考えられる。アドゼベリンの
Ｎ末端側の半分はゲルゾリンと同様に、３つの反復セグ
メントからなっており、１セグメントはそれぞれ〜１５
ｋＤａのタンパク質分解断片に対応する。
【００６２】実施例３：縮重プライマーの合成 実施例２で決定したＮ４２の第２セグメント（Ｓ２）の
Ｎ末端アミノ酸配列、およびＣ３９のＮ末端アミノ酸配
列をコードする遺伝子として可能性のあるすべてのコド
ンを含むミックスプライマーをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ３８０Ｂ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒにより合成した。センスおよびアンチセンスなプラ
イマーの５’末端に、それぞれＢａｍＨＩ部位およびＣ
ｌａＩ部位を付加した。
Ｎ末端アミノ酸配列、およびＣ３９のＮ末端アミノ酸配
列をコードする遺伝子として可能性のあるすべてのコド
ンを含むミックスプライマーをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ３８０Ｂ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒにより合成した。センスおよびアンチセンスなプラ
イマーの５’末端に、それぞれＢａｍＨＩ部位およびＣ
ｌａＩ部位を付加した。
【００６３】縮重プライマーの配列は以下の通りであ
る： ５’．．．ＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／ Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＣＡ ．．．．３’および ５’．．．ＧＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ ）ＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＴＣ．．．３’。
る： ５’．．．ＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／ Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＣＡ ．．．．３’および ５’．．．ＧＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ ）ＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＴＣ．．．３’。
【００６４】実施例４：逆転写反応およびＰＣＲ ウシ腎臓から樹立した細胞系であるＭＤＢＫ細胞（ＪＣ
ＲＢ−Ｃｅｌｌ：財団法人がん研究振興財団より入手：
Ｍａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘ
ｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．９８：５７４−５７６，１９５
８）から、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ １８：５２９４−５２９９，１９７９）の方法に
よりＲＮＡを調製した。
ＲＢ−Ｃｅｌｌ：財団法人がん研究振興財団より入手：
Ｍａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘ
ｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．９８：５７４−５７６，１９５
８）から、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ １８：５２９４−５２９９，１９７９）の方法に
よりＲＮＡを調製した。
【００６５】逆転写およびＰＣＲはＫａｗａｓａｋｉ
（ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ）ｐｐ．２１−
２７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，１９９０）の方法により行った。逆転写にはラン
ダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用い、また
ＰＣＲには実施例３で得られた縮重プライマーを用いた
（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅ
ｄｓ）ｐｐ．４６−５３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０）。ＰＣＲの条件
は、最初に９４℃で１分、３７℃で１分、７２℃で２分
を１サイクルとして５サイクル行った。ただし、このと
き３７℃から７２℃へ温度を上げるのに２分３０秒かけ
てゆっくり昇温させた。次に、通常の方法により、９４
℃で１分、５０℃で１分、７２℃で２分を１サイクルと
して２９サイクル実施し、さらに９４℃で１分、５０℃
で１分、７２℃で１０分を１サイクル実施した後、４℃
においておいた。
（ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ）ｐｐ．２１−
２７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，１９９０）の方法により行った。逆転写にはラン
ダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用い、また
ＰＣＲには実施例３で得られた縮重プライマーを用いた
（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅ
ｄｓ）ｐｐ．４６−５３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０）。ＰＣＲの条件
は、最初に９４℃で１分、３７℃で１分、７２℃で２分
を１サイクルとして５サイクル行った。ただし、このと
き３７℃から７２℃へ温度を上げるのに２分３０秒かけ
てゆっくり昇温させた。次に、通常の方法により、９４
℃で１分、５０℃で１分、７２℃で２分を１サイクルと
して２９サイクル実施し、さらに９４℃で１分、５０℃
で１分、７２℃で１０分を１サイクル実施した後、４℃
においておいた。
【００６６】実施例５：ＰＣＲ産物のクローニング 実施例４で得られたＰＣＲ産物をエチジウムブロミド１
μｇ／ｍｌを含む１％アガロースの電気泳動に付したと
ころ、およそ７００ｂｐのところに主要バンドが見られ
た。これを切り出してＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩキット
（ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．）で精製した。この大きさ
は、アドゼベリンとゲルゾリンとの１次構造に高い相同
性があるという仮定に基づいて、縮重プライマーの基と
なった断片の位置から予期できた。この精製した産物を
ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化してｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にク
ローン化した。
μｇ／ｍｌを含む１％アガロースの電気泳動に付したと
ころ、およそ７００ｂｐのところに主要バンドが見られ
た。これを切り出してＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩキット
（ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．）で精製した。この大きさ
は、アドゼベリンとゲルゾリンとの１次構造に高い相同
性があるという仮定に基づいて、縮重プライマーの基と
なった断片の位置から予期できた。この精製した産物を
ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化してｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にク
ローン化した。
【００６７】クローン化したＰＣＲ産物の配列決定を行
ったところ、Ｎ４２の第３セグメント（Ｓ３）のＮ末端
部分をコードするヌクレオチド配列がこのＰＣＲ産物中
に含まれていたので、これが実際にアドゼベリンＣＤＮ
Ａの一部であることが確認された。この配列とヒトゲル
ゾリン配列との高い相同性（ヌクレオチドレベルでの同
一性は６４％）もこの見解を支持した。
ったところ、Ｎ４２の第３セグメント（Ｓ３）のＮ末端
部分をコードするヌクレオチド配列がこのＰＣＲ産物中
に含まれていたので、これが実際にアドゼベリンＣＤＮ
Ａの一部であることが確認された。この配列とヒトゲル
ゾリン配列との高い相同性（ヌクレオチドレベルでの同
一性は６４％）もこの見解を支持した。
【００６８】かくして得られたＰＣＲ産物を３２Ｐで標
識して以下のスクリーニングにプローブとして用いた。
識して以下のスクリーニングにプローブとして用いた。
【００６９】実施例６：ライブラリースクリーニング ウシ副腎髄質から調製したλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブ
ラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を、標準法（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ Ｍａｎｕａｌ，２ｎ
ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により、実施
例５で得られたアドゼベリンの部分ｃＤＮＡを表す３２
Ｐ−標識したクローン化ＰＣＲ産物でスクリーニングし
た。２回のスクリーニングの後、十分に単離された陽性
プラークを取り出して、個々のプラーク中のファージを
蒸留水２００μｌ中に放ち、室温で１時間インキュベー
トした。ファージ溶液を凍結、融解して９０℃で１０分
間加熱した。
ラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を、標準法（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ Ｍａｎｕａｌ，２ｎ
ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により、実施
例５で得られたアドゼベリンの部分ｃＤＮＡを表す３２
Ｐ−標識したクローン化ＰＣＲ産物でスクリーニングし
た。２回のスクリーニングの後、十分に単離された陽性
プラークを取り出して、個々のプラーク中のファージを
蒸留水２００μｌ中に放ち、室温で１時間インキュベー
トした。ファージ溶液を凍結、融解して９０℃で１０分
間加熱した。
【００７０】適当量のファージ溶液を鋳型として用い
て、組換えファージＤＮＡの挿入物を、λｇｔ１１のＥ
ｃｏＲＩ特異的部位の上流と下流からの配列を含む２つ
のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの
条件は実施例４と同様である。これらのプライマーの
５’末端にそれぞれＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位を付加
した。プライマーの１つは以下の配列： ５’．．．ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣ．．．３’ を有しており、他の１つは以下の配列： ５’．．．ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡ．．．３’ を有していた。
て、組換えファージＤＮＡの挿入物を、λｇｔ１１のＥ
ｃｏＲＩ特異的部位の上流と下流からの配列を含む２つ
のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの
条件は実施例４と同様である。これらのプライマーの
５’末端にそれぞれＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位を付加
した。プライマーの１つは以下の配列： ５’．．．ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣ．．．３’ を有しており、他の１つは以下の配列： ５’．．．ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡ．．．３’ を有していた。
【００７１】ＰＣＲの後、反応混合物を１％アガロース
ゲルの電気泳動にかけた。増幅した挿入ＤＮＡを切り出
してＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩキットで精製した。これ
をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化した後、挿入ｃＤＮＡ
を、あらかじめＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化しておい
たｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中にクローン化
した。
ゲルの電気泳動にかけた。増幅した挿入ＤＮＡを切り出
してＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩキットで精製した。これ
をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化した後、挿入ｃＤＮＡ
を、あらかじめＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化しておい
たｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中にクローン化
した。
【００７２】クローン化ＰＣＲ産物をプローブとして、
ウシ副腎髄質のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
した。２×１０６個の組換えファージから単一のプラー
クまで精製した３つの重複するｃＤＮＡクローンを得
た。
ウシ副腎髄質のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
した。２×１０６個の組換えファージから単一のプラー
クまで精製した３つの重複するｃＤＮＡクローンを得
た。
【００７３】上記３つの重複するｃＤＮＡクローンは、
図４の番号１９、５および２１で示すものである。これ
らのクローン化ＤＮＡの塩基配列をジデオキシチェイン
ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７
４：５４６３−５４６７，１９７７）により両方向で調
べ、これをもとにアドゼベリンの全ヌクレオチド配列を
決定した。このヌクレオチド配列を配列表の配列番号４
に示す。また、組み立てたｃＤＮＡの制限酵素地図を図
４に示す。
図４の番号１９、５および２１で示すものである。これ
らのクローン化ＤＮＡの塩基配列をジデオキシチェイン
ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７
４：５４６３−５４６７，１９７７）により両方向で調
べ、これをもとにアドゼベリンの全ヌクレオチド配列を
決定した。このヌクレオチド配列を配列表の配列番号４
に示す。また、組み立てたｃＤＮＡの制限酵素地図を図
４に示す。
【００７４】組み立てたｃＤＮＡのヌクレオチド配列お
よび最長オープンリーディングフレームに対応するアミ
ノ酸配列を同じく配列表の配列番号４に示す。オープン
リーディングフレームは７１５アミノ酸からなる８０５
２７ダルトンのタンパク質をコードする。最初のＡＴＧ
はクローンの始めの部分から２７ヌクレオチド３’側に
あり、脊椎動物の翻訳開始にとって矛盾のない配列を表
す。アドゼベリンｃＤＮＡの配列をゲルゾリンおよびビ
リンの配列と比較しても、上記ＡＴＧが開始コドンであ
ること、ならびにアドゼベリンの全コーディング配列が
組み立てたｃＤＮＡ中に含まれていることが支持され
た。
よび最長オープンリーディングフレームに対応するアミ
ノ酸配列を同じく配列表の配列番号４に示す。オープン
リーディングフレームは７１５アミノ酸からなる８０５
２７ダルトンのタンパク質をコードする。最初のＡＴＧ
はクローンの始めの部分から２７ヌクレオチド３’側に
あり、脊椎動物の翻訳開始にとって矛盾のない配列を表
す。アドゼベリンｃＤＮＡの配列をゲルゾリンおよびビ
リンの配列と比較しても、上記ＡＴＧが開始コドンであ
ること、ならびにアドゼベリンの全コーディング配列が
組み立てたｃＤＮＡ中に含まれていることが支持され
た。
【００７５】次いで、上記の３つの重複するクローンか
らＡｃｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて組み立て
たウシアドゼベリンの全コーディング領域を含む２４１
８ｂｐのｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（−）のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ消化部位に組み込んで
ｐＳＫ−アドゼベリンを作製した。
らＡｃｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて組み立て
たウシアドゼベリンの全コーディング領域を含む２４１
８ｂｐのｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（−）のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ消化部位に組み込んで
ｐＳＫ−アドゼベリンを作製した。
【００７６】実施例７：アドゼベリンの予測アミノ酸配
列とヒトゲルゾリンおよびビリンのアミノ酸配列との比
較 生化学的分析およびｃＤＮＡからの予測アミノ酸配列か
ら、ヒトゲルゾリンおよびビリンはいずれも６つの相同
セグメントを有している（Ｂａｚａｒｉ ｅｔａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８５：４９８６−４９９０，１９８８；Ｍａｔｕｓｄａ
ｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１３９−１４０，
１９８８；Ｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２０３：１１２７−１１３３，１９８８）ことが明
らかとなっている。セグメント１、２および３は、その
他の組み合わせにおけるよりもセグメント４、５および
６とそれぞれより高い相同性を有する。アドゼベリンの
予測アミノ酸配列の分析から、アドゼベリンも６つの相
同セグメントを有していることが明らかとなった。さら
に、セグメント１から６はゲルゾリンおよびビリンのそ
れぞれ対応するセグメントと相同性を有する（図５）。
図５から明らかなように、ゲルゾリンとビリンの６セグ
メントのそれぞれに存在するモチーフＢ、ＡおよびＣが
アドゼベリンの６セグメントのそれぞれにも存在してい
た。したがって、アドゼベリンはゲルゾリン族タンパク
質に属することが示された。
列とヒトゲルゾリンおよびビリンのアミノ酸配列との比
較 生化学的分析およびｃＤＮＡからの予測アミノ酸配列か
ら、ヒトゲルゾリンおよびビリンはいずれも６つの相同
セグメントを有している（Ｂａｚａｒｉ ｅｔａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８５：４９８６−４９９０，１９８８；Ｍａｔｕｓｄａ
ｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１３９−１４０，
１９８８；Ｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２０３：１１２７−１１３３，１９８８）ことが明
らかとなっている。セグメント１、２および３は、その
他の組み合わせにおけるよりもセグメント４、５および
６とそれぞれより高い相同性を有する。アドゼベリンの
予測アミノ酸配列の分析から、アドゼベリンも６つの相
同セグメントを有していることが明らかとなった。さら
に、セグメント１から６はゲルゾリンおよびビリンのそ
れぞれ対応するセグメントと相同性を有する（図５）。
図５から明らかなように、ゲルゾリンとビリンの６セグ
メントのそれぞれに存在するモチーフＢ、ＡおよびＣが
アドゼベリンの６セグメントのそれぞれにも存在してい
た。したがって、アドゼベリンはゲルゾリン族タンパク
質に属することが示された。
【００７７】ゲルゾリンおよびビリンに存在する推定の
ポリホスホイノシチド結合配列も、ゲルゾリンやビリン
中の領域に対応する領域、すなわちアドゼベリンの第１
および第２セグメント（Ｓ１、Ｓ２）中に見つかった。
これは、Ｓ１−２に対応するアドゼベリンのタンパク質
断片の切断活性がポリホスホイノシチドによって阻害さ
れることと一致する。これらの配列を図５中に箱で囲ん
で示し、また表１に模式図として示す。２つの推定配列
のうちの１つはコンセンサス配列と完全に一致し、また
第１セグメントにある他方はコンセンサス配列と１アミ
ノ酸だけ異なっており、コンセンサス配列のＣＯＯＨ末
端が塩基性アミノ酸の代わりにアラニンとなっている。
このため、ゲルゾリンの対応するドメインよりもアドゼ
ベリンのこのドメインの塩基性が低くなる。この相違
は、ホスファチジルインシトール４，５−ビスリン酸や
ホスファチジルインシトール４−モノリン酸以外の酸性
リン脂質、例えばホスファチジルインシトールやホスフ
ァチジルセリンがアドゼベリンの切断活性を阻害できて
も、ゲルゾリンの切断活性は阻害できない、ということ
を部分的に説明する理由となろう。
ポリホスホイノシチド結合配列も、ゲルゾリンやビリン
中の領域に対応する領域、すなわちアドゼベリンの第１
および第２セグメント（Ｓ１、Ｓ２）中に見つかった。
これは、Ｓ１−２に対応するアドゼベリンのタンパク質
断片の切断活性がポリホスホイノシチドによって阻害さ
れることと一致する。これらの配列を図５中に箱で囲ん
で示し、また表１に模式図として示す。２つの推定配列
のうちの１つはコンセンサス配列と完全に一致し、また
第１セグメントにある他方はコンセンサス配列と１アミ
ノ酸だけ異なっており、コンセンサス配列のＣＯＯＨ末
端が塩基性アミノ酸の代わりにアラニンとなっている。
このため、ゲルゾリンの対応するドメインよりもアドゼ
ベリンのこのドメインの塩基性が低くなる。この相違
は、ホスファチジルインシトール４，５−ビスリン酸や
ホスファチジルインシトール４−モノリン酸以外の酸性
リン脂質、例えばホスファチジルインシトールやホスフ
ァチジルセリンがアドゼベリンの切断活性を阻害できて
も、ゲルゾリンの切断活性は阻害できない、ということ
を部分的に説明する理由となろう。
【００７８】実施例８：大腸菌中でのアドゼベリンｃＤ
ＮＡの発現 実施例６で得たウシアドゼベリンｃＤＮＡ（ｐＳＫ−ア
ドゼベリン）をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに使用
したプライマーは、得られるｃＤＮＡの開始コドン（Ａ
ＴＧ）がＮｄｅＩの一部を構成し、また停止コドン（Ｔ
ＡＡ）の直後にＸｈｏＩ部位が位置するようにデザイン
した。得られるｃＤＮＡを発現ベクターｐＥＴ−２３ａ
（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中に、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部
位を介して組み込んだ。かくして得られる組換えベクタ
ーｐＥＴ−アドゼベリンをＣｈｕｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：２１７
２−２１７５，１９８８）の方法によりコンピテント細
胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に組み込んだ。形質
転換体の選択、培養およびＩＰＴＧ（イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による誘導はＳｔｕｄ
ｉｅｒら（ｉｎ Ｍｉｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，Ｇｅｎｅ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｄｓ．）Ｖｏｌ．１８
５，ｐｐ．６０−８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９１）の方法により行っ
た。すなわち、アンピシリンおよびクロラムフェニコー
ル耐性コロニーを選択して、アンピシリン５０μｇ／ｍ
ｌを補充したＭ９ＺＢ培地中で培養した。ＩＰＴＧでｃ
ＤＮＡの発現を誘導すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約７４
ｋＤａのタンパク質の産生が観察された（図６のＡ、矢
印）。形質転換しなかったコントロールＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳはＩＰＴＧ誘導しても何ら余計なタンパ
ク質を産生しなかった。誘導されたタンパク質のＳＤＳ
−ＰＡＧＥにおける大きさ、７４ｋＤａはウシ副腎髄質
から調製したアドゼベリンの大きさと同じである。
ＮＡの発現 実施例６で得たウシアドゼベリンｃＤＮＡ（ｐＳＫ−ア
ドゼベリン）をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに使用
したプライマーは、得られるｃＤＮＡの開始コドン（Ａ
ＴＧ）がＮｄｅＩの一部を構成し、また停止コドン（Ｔ
ＡＡ）の直後にＸｈｏＩ部位が位置するようにデザイン
した。得られるｃＤＮＡを発現ベクターｐＥＴ−２３ａ
（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中に、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部
位を介して組み込んだ。かくして得られる組換えベクタ
ーｐＥＴ−アドゼベリンをＣｈｕｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：２１７
２−２１７５，１９８８）の方法によりコンピテント細
胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に組み込んだ。形質
転換体の選択、培養およびＩＰＴＧ（イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による誘導はＳｔｕｄ
ｉｅｒら（ｉｎ Ｍｉｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，Ｇｅｎｅ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｄｓ．）Ｖｏｌ．１８
５，ｐｐ．６０−８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９１）の方法により行っ
た。すなわち、アンピシリンおよびクロラムフェニコー
ル耐性コロニーを選択して、アンピシリン５０μｇ／ｍ
ｌを補充したＭ９ＺＢ培地中で培養した。ＩＰＴＧでｃ
ＤＮＡの発現を誘導すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約７４
ｋＤａのタンパク質の産生が観察された（図６のＡ、矢
印）。形質転換しなかったコントロールＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳはＩＰＴＧ誘導しても何ら余計なタンパ
ク質を産生しなかった。誘導されたタンパク質のＳＤＳ
−ＰＡＧＥにおける大きさ、７４ｋＤａはウシ副腎髄質
から調製したアドゼベリンの大きさと同じである。
【００７９】形質転換した大腸菌の培養上清を、実施例
１でウシ副腎髄質から分離、精製したのと実質的に同じ
方法によって精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥの電気泳動に付して、ニトロセルロース膜に移
し取り、アドゼベリンに特異的な抗体と反応させたとこ
ろ、図６のＢに示すように、このタンパク質は該抗体と
免疫反応した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質の見か
けサイズおよびアドゼベリン特異抗体との免疫反応か
ら、このタンパク質がアドゼベリンをコードするｃＤＮ
Ａであることを確認した。
１でウシ副腎髄質から分離、精製したのと実質的に同じ
方法によって精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥの電気泳動に付して、ニトロセルロース膜に移
し取り、アドゼベリンに特異的な抗体と反応させたとこ
ろ、図６のＢに示すように、このタンパク質は該抗体と
免疫反応した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質の見か
けサイズおよびアドゼベリン特異抗体との免疫反応か
ら、このタンパク質がアドゼベリンをコードするｃＤＮ
Ａであることを確認した。
【００８０】実施例９：大腸菌により産生されたアドゼ
ベリンのアクチンフィラメント切断活性 大腸菌によって産生されたアドゼベリンが天然型アドゼ
ベリンと同様のＣａ２＋依存性のアクチンフィラメント
切断活性を有するか、否かを試験するために、アクチン
重合に対するアドゼベリンの効果を粘度計により測定し
た。
ベリンのアクチンフィラメント切断活性 大腸菌によって産生されたアドゼベリンが天然型アドゼ
ベリンと同様のＣａ２＋依存性のアクチンフィラメント
切断活性を有するか、否かを試験するために、アクチン
重合に対するアドゼベリンの効果を粘度計により測定し
た。
【００８１】０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度のアクチンを、
バッファーＰ（５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２
および２０ｍＭイミダゾールーＨＣｌ、ｐＨ７．２）
中、１ｍＭ ＥＧＴＡまたは０．１ｍＭ ＣａＣｌ２の
存在下、２５．５℃で、アクチンに対するモル比が１：
３０のアドゼベリンの存在下または非存在下に重合させ
た。
バッファーＰ（５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２
および２０ｍＭイミダゾールーＨＣｌ、ｐＨ７．２）
中、１ｍＭ ＥＧＴＡまたは０．１ｍＭ ＣａＣｌ２の
存在下、２５．５℃で、アクチンに対するモル比が１：
３０のアドゼベリンの存在下または非存在下に重合させ
た。
【００８２】その結果、図７に示すように、アクチン溶
液の粘度はＣａ２＋が存在するときのみアドゼベリンに
よって影響を受け（図７のＡとＢを比較されたい）、Ｃ
ａ２＋の存在下にアドゼベリンはアクチン重合化の核形
成を促進し、重合したアクチン溶液の最終粘度を減少す
る作用を有する。重合化アクチン溶液にアドゼベリンを
加えると（図中矢印で示した）、溶液にＣａ２＋が含ま
れている場合には比粘度が急激に落ちた。
液の粘度はＣａ２＋が存在するときのみアドゼベリンに
よって影響を受け（図７のＡとＢを比較されたい）、Ｃ
ａ２＋の存在下にアドゼベリンはアクチン重合化の核形
成を促進し、重合したアクチン溶液の最終粘度を減少す
る作用を有する。重合化アクチン溶液にアドゼベリンを
加えると（図中矢印で示した）、溶液にＣａ２＋が含ま
れている場合には比粘度が急激に落ちた。
【００８３】これらの結果はウシ副腎髄質から調製した
アドゼベリンを用いて得た結果と実質的に同一であり、
本発明の遺伝子組換え手法によって産生されたタンパク
質が天然型アドゼベリンと同じアクチンフィラメント切
断活性を有することが示された。
アドゼベリンを用いて得た結果と実質的に同一であり、
本発明の遺伝子組換え手法によって産生されたタンパク
質が天然型アドゼベリンと同じアクチンフィラメント切
断活性を有することが示された。
【００８４】実施例１０：インサイチュハイブリダイゼ
ーション ウシアドゼベリンｃＤＮＡの３２９ｂｐ断片（＃２０９
０−＃２４１８）を、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎ
ｇおよびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いて、ジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰで標識した。
ーション ウシアドゼベリンｃＤＮＡの３２９ｂｐ断片（＃２０９
０−＃２４１８）を、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎ
ｇおよびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いて、ジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰで標識した。
【００８５】屠殺場で皮質と髄質との中間領域を含む新
鮮なウシ副腎をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中の１％パラ
ホルムアルデヒドで固定した。実験室に戻り、これを小
片に切断し、ＰＢＳで洗浄した。次いで試料を８、１
２、１６および２０％の段階的スクロースーＰＢＳ中に
２４時間浸漬した。試料をＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（Ｍｉ
ｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に入れて液体窒素で
凍結した。凍結試料をミクロトームで５−７μｍのセク
ションに切断してスライドグラスに回収した。
鮮なウシ副腎をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中の１％パラ
ホルムアルデヒドで固定した。実験室に戻り、これを小
片に切断し、ＰＢＳで洗浄した。次いで試料を８、１
２、１６および２０％の段階的スクロースーＰＢＳ中に
２４時間浸漬した。試料をＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（Ｍｉ
ｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に入れて液体窒素で
凍結した。凍結試料をミクロトームで５−７μｍのセク
ションに切断してスライドグラスに回収した。
【００８６】セクションのいくつかをＰＢＳ中の０．５
％トルイジンブルーで染色し、ＰＢＳ中の５０％グリセ
ロールで染色して同溶液中に入れておいた。
％トルイジンブルーで染色し、ＰＢＳ中の５０％グリセ
ロールで染色して同溶液中に入れておいた。
【００８７】免疫蛍光染色には、セクションを１％パラ
ホルムアルデヒド−ＰＢＳで１分、アセトンで５分固定
した。ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理
してＰＢＳで洗浄した後、セクションをＰＢＳ中に２．
５％ウシ血清アルブミンと２．５％ヒナ血清とを含むブ
ロッキング溶液中に入れて、ブロッキング溶液中の抗ア
ドゼベリン抗体（抗アドゼベリン抗体の作製方法は後述
する実施例１８参照）とともに３７℃で３時間インキュ
ベートした。セクションを４００ｍＭ ＭｇＣｌ２およ
び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を含む溶
液中で洗浄し、次いでＰＢＳ中で洗浄した後、ブロッキ
ング溶液中のＦＩＴＣ−結合抗ウサギＩｇＧとともに３
７℃で３時間インキュベートした。上記と同様の方法お
よび溶液で十分に洗浄した後、５０％グリセロールおよ
び２．５％１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オク
タン（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を含むＰＢＳに
入れて、Ｎｉｋｏｎ ＦＥＸ−Ａ蛍光顕微鏡で観察し
た。
ホルムアルデヒド−ＰＢＳで１分、アセトンで５分固定
した。ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理
してＰＢＳで洗浄した後、セクションをＰＢＳ中に２．
５％ウシ血清アルブミンと２．５％ヒナ血清とを含むブ
ロッキング溶液中に入れて、ブロッキング溶液中の抗ア
ドゼベリン抗体（抗アドゼベリン抗体の作製方法は後述
する実施例１８参照）とともに３７℃で３時間インキュ
ベートした。セクションを４００ｍＭ ＭｇＣｌ２およ
び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を含む溶
液中で洗浄し、次いでＰＢＳ中で洗浄した後、ブロッキ
ング溶液中のＦＩＴＣ−結合抗ウサギＩｇＧとともに３
７℃で３時間インキュベートした。上記と同様の方法お
よび溶液で十分に洗浄した後、５０％グリセロールおよ
び２．５％１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オク
タン（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を含むＰＢＳに
入れて、Ｎｉｋｏｎ ＦＥＸ−Ａ蛍光顕微鏡で観察し
た。
【００８８】インサイチュハイブリダイゼーションに
は、セクションを２倍強度の標準食塩−クエン酸（２×
ＳＳＣ、１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ
Ｎａ−クエン酸、ｐＨ７．０）で１０分、室温でイン
キュベートし、次いでプレハイブリダイゼーション溶液
（５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０、５０μｇ／ｍｌヘパリン、１００μｇ／ｍｌ音
波処理、変性したサケ精巣ＤＮＡ）中、室温で１時間イ
ンキュベートした。
は、セクションを２倍強度の標準食塩−クエン酸（２×
ＳＳＣ、１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ
Ｎａ−クエン酸、ｐＨ７．０）で１０分、室温でイン
キュベートし、次いでプレハイブリダイゼーション溶液
（５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０、５０μｇ／ｍｌヘパリン、１００μｇ／ｍｌ音
波処理、変性したサケ精巣ＤＮＡ）中、室温で１時間イ
ンキュベートした。
【００８９】プレハイブリダイゼーションバッファーを
除去して、ジゴキシゲニンで標識したＤＮＡプローブ
０．５μｇ／ｍｌを含む新しいプレハイブリダイゼーシ
ョンバッファーをセクションに適用した。セクションを
カバースライドで覆い、ゴムセメントで封印した。
除去して、ジゴキシゲニンで標識したＤＮＡプローブ
０．５μｇ／ｍｌを含む新しいプレハイブリダイゼーシ
ョンバッファーをセクションに適用した。セクションを
カバースライドで覆い、ゴムセメントで封印した。
【００９０】ＤＮＡプローブをオーブン中、８０℃、１
０分で変性した。次いでオーブン中、４２℃で一夜イン
キュベーションを行った。ガラスカッターでカバースラ
イドを取り除き、セクションを室温において２×ＳＳＣ
で３０分、４２℃において０．１×ＳＳＣで３０分、室
温において２×ＳＳＣで１５分洗浄した。
０分で変性した。次いでオーブン中、４２℃で一夜イン
キュベーションを行った。ガラスカッターでカバースラ
イドを取り除き、セクションを室温において２×ＳＳＣ
で３０分、４２℃において０．１×ＳＳＣで３０分、室
温において２×ＳＳＣで１５分洗浄した。
【００９１】ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎ
ｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社）を用いてセクション中のプロー
ブを検出した。ジゴキシゲニン標識したＤＮＡプローブ
とインキュベートしたセクションは洗浄バッファー（１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ７．５）中、室温で１０分洗浄し、洗浄バッファ
ー中の０．５％（ｗ／ｖ）Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒブロッ
キング試薬とともにインキュベートし、最後に洗浄バッ
ファーで洗浄した。
ｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社）を用いてセクション中のプロー
ブを検出した。ジゴキシゲニン標識したＤＮＡプローブ
とインキュベートしたセクションは洗浄バッファー（１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ７．５）中、室温で１０分洗浄し、洗浄バッファ
ー中の０．５％（ｗ／ｖ）Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒブロッ
キング試薬とともにインキュベートし、最後に洗浄バッ
ファーで洗浄した。
【００９２】次いでセクションをアルカリ性ホスファタ
ーゼー結合抗ジゴキシゲニン抗体（１５０ｍＵ／ｍｌ）
と３７℃、暗所で２時間インキュベートした。洗浄バッ
ファーで２回洗浄した後、スライドを１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、ｐＨ９．５を含む溶液で短時間処理し、ニトロブ
ルーテトラゾリウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルホスフェートおよび０．２５ｍｇ／ｍｌレバ
ミソールを含む同溶液とともに室温、暗所で３時間イン
キュベートした。発色を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で停止した。
ーゼー結合抗ジゴキシゲニン抗体（１５０ｍＵ／ｍｌ）
と３７℃、暗所で２時間インキュベートした。洗浄バッ
ファーで２回洗浄した後、スライドを１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、ｐＨ９．５を含む溶液で短時間処理し、ニトロブ
ルーテトラゾリウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルホスフェートおよび０．２５ｍｇ／ｍｌレバ
ミソールを含む同溶液とともに室温、暗所で３時間イン
キュベートした。発色を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で停止した。
【００９３】グリセロール中においたセクションを光学
顕微鏡で観察した。
顕微鏡で観察した。
【００９４】その結果、低倍率で観察すると、髄質に発
色が観察されたが、髄質に隣接する場所以外の皮質には
観察されなかった。次いで髄質と皮質との間の界面領域
を高倍率で観察した。トルイジンブルーによる染色（図
８のａ）によって、皮質中の細胞は密に詰まっているの
に対して、髄質中の細胞はゆるやかに分布しており、小
胞を含む鞘状構造によってグループ分けされていること
が明らかとなった。皮質と髄質とはインサイチュハイブ
リダイゼーションにおいても免疫蛍光染色においても、
対比染色法を用いなくとも上記の細胞の性質によって容
易に区別できる。図８のｃおよびｆはそれぞれ中倍率お
よび高倍率で観察したインサイチュハイブリダイゼーシ
ョンの結果であり、髄質のクロム親和性細胞に対応する
ゆるやかに詰まった細胞で主として染色が観察された。
さらに、髄質に面する少数の皮質細胞も矢印で示すよう
に染色された。
色が観察されたが、髄質に隣接する場所以外の皮質には
観察されなかった。次いで髄質と皮質との間の界面領域
を高倍率で観察した。トルイジンブルーによる染色（図
８のａ）によって、皮質中の細胞は密に詰まっているの
に対して、髄質中の細胞はゆるやかに分布しており、小
胞を含む鞘状構造によってグループ分けされていること
が明らかとなった。皮質と髄質とはインサイチュハイブ
リダイゼーションにおいても免疫蛍光染色においても、
対比染色法を用いなくとも上記の細胞の性質によって容
易に区別できる。図８のｃおよびｆはそれぞれ中倍率お
よび高倍率で観察したインサイチュハイブリダイゼーシ
ョンの結果であり、髄質のクロム親和性細胞に対応する
ゆるやかに詰まった細胞で主として染色が観察された。
さらに、髄質に面する少数の皮質細胞も矢印で示すよう
に染色された。
【００９５】抗アドゼベリン抗体による免疫蛍光染色で
は同じパターンのアドゼベリンの分布が観察された（図
８のｂおよびｅ）。すなわち、髄質のクロム親和性細胞
に蛍光が観察され、また髄質に面する皮質領域の細胞に
も観察された。クロム親和性細胞では蛍光は主として形
質膜下領域に観察された。
は同じパターンのアドゼベリンの分布が観察された（図
８のｂおよびｅ）。すなわち、髄質のクロム親和性細胞
に蛍光が観察され、また髄質に面する皮質領域の細胞に
も観察された。クロム親和性細胞では蛍光は主として形
質膜下領域に観察された。
【００９６】以上の結果を要約すると、アドゼベリンｍ
ＲＮＡおよびアドゼベリンタンパク質のいずれもが副腎
髄質で発現するが、皮質の大部分では発現しないことが
示された。例外的に髄質と面する皮質の一部分ではアド
ゼベリンｍＲＮＡとタンパク質の両方の発現が観察され
た。したがって、ウシ副腎におけるアドゼベリンのこの
ような組織部位における差別された発現は転写レベルで
制御されていると結論された。エキソサイトーシスの型
による分泌は副腎髄質で起こり、皮質では起きないの
で、このような差別された発現は、アドゼベリンが分泌
過程一般に関与しているというよりは、むしろエキソサ
イトーシスの型による分泌過程にのみ関与していること
を強く示唆している。さらに、形質膜下領域にアドゼベ
リンが局在していることは、該タンパク質がエキソサイ
トーシスの制御に関与しているという考えと合致する。
ＲＮＡおよびアドゼベリンタンパク質のいずれもが副腎
髄質で発現するが、皮質の大部分では発現しないことが
示された。例外的に髄質と面する皮質の一部分ではアド
ゼベリンｍＲＮＡとタンパク質の両方の発現が観察され
た。したがって、ウシ副腎におけるアドゼベリンのこの
ような組織部位における差別された発現は転写レベルで
制御されていると結論された。エキソサイトーシスの型
による分泌は副腎髄質で起こり、皮質では起きないの
で、このような差別された発現は、アドゼベリンが分泌
過程一般に関与しているというよりは、むしろエキソサ
イトーシスの型による分泌過程にのみ関与していること
を強く示唆している。さらに、形質膜下領域にアドゼベ
リンが局在していることは、該タンパク質がエキソサイ
トーシスの制御に関与しているという考えと合致する。
【００９７】実施例１１：ヒト腎臓ｍＲＮＡ由来ｃＤＮ
Ａライブラリーの作製 ヒト腎臓ｍＲＮＡは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社より購入したものを用いた。
このｍＲＮＡ２μｇより、ＴｉｍｅｓａｖｅｒＴＭ ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社）を用い、添付されたプロトコールに従って二本
鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
Ａライブラリーの作製 ヒト腎臓ｍＲＮＡは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社より購入したものを用いた。
このｍＲＮＡ２μｇより、ＴｉｍｅｓａｖｅｒＴＭ ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社）を用い、添付されたプロトコールに従って二本
鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
【００９８】すなわち、熱変性したｍＲＮＡをＭｕｒｉ
ｎｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅお
よびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーを含むＦ
ｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘに
加え、３７℃で１時間保温することによって、第１鎖の
合成を行った。次いでこの反応液を、Ｅ．ＣｏｌｉＲＮ
ａｓｅＨ、およびＥ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ Ｉを含むＳｅｃｏｎｄ−Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘに加え、１２℃、３０分、次いで
２２℃、１時間保温することにより第２鎖の合成を行っ
た。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＫｉｔに含まれているＳ
ｐｕｎ Ｃｏｌｕｍｎか、あるいはアガロース電気泳動
によってサイズ分画し、前者の場合には約４００ｂｐ以
上、後者の場合には約２−３ｋｂｐのサイズをもつｃＤ
ＮＡのみを回収した。
ｎｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅお
よびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーを含むＦ
ｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘに
加え、３７℃で１時間保温することによって、第１鎖の
合成を行った。次いでこの反応液を、Ｅ．ＣｏｌｉＲＮ
ａｓｅＨ、およびＥ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ Ｉを含むＳｅｃｏｎｄ−Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘに加え、１２℃、３０分、次いで
２２℃、１時間保温することにより第２鎖の合成を行っ
た。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＫｉｔに含まれているＳ
ｐｕｎ Ｃｏｌｕｍｎか、あるいはアガロース電気泳動
によってサイズ分画し、前者の場合には約４００ｂｐ以
上、後者の場合には約２−３ｋｂｐのサイズをもつｃＤ
ＮＡのみを回収した。
【００９９】この末端にアダプター（ＥｃｏＲＩ／Ｎｏ
ｔＩアダプター）を連結し、未反応のアダプターは先の
Ｓｐｕｎ Ｃｏｌｕｍｎで除き、ベクターへ組み込ん
だ。ベクターはＰｈａｒｍａｃｉａ社から購入したＥｘ
Ｃｅｌｌベクター（λ ＥｘＣｅｌｌ ＥｃｏＲＩ／Ｃ
ＩＰ）あるいは、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入した
Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰＲＩＩベクター（ＰＲＥＤＩＧＥ
ＳＴＥＤ ＬＡＭＢＤＡＺＡＰＲＩＩ／ＥｃｏＲＩ／Ｃ
ＩＡＰ ＣＬＯＮＩＮＧ ＫＩＴ）の２種類を使用し
た。宿主大腸菌として、前者の場合はＮＭ５２２株、後
者の場合はＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を用いた。ベクターに組
み込んだｃＤＮＡを、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入
したＧＩＧＡＰＡＣＫＲ ＩＩ ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ
ＥＸＴＲＡＣＴを用い、添付されたプロトコールに従い
パッケージングした。すなわち、Ｆｒｅｅｚｅ／Ｔｈａ
ｗ ｅｘｔｒａｃｔ、Ｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔおよ
びＤＮＡを混合し、２２℃、２時間保温することにより
パッケージングを行い、ｃＤＮＡライブラリーとした。
ｔＩアダプター）を連結し、未反応のアダプターは先の
Ｓｐｕｎ Ｃｏｌｕｍｎで除き、ベクターへ組み込ん
だ。ベクターはＰｈａｒｍａｃｉａ社から購入したＥｘ
Ｃｅｌｌベクター（λ ＥｘＣｅｌｌ ＥｃｏＲＩ／Ｃ
ＩＰ）あるいは、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入した
Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰＲＩＩベクター（ＰＲＥＤＩＧＥ
ＳＴＥＤ ＬＡＭＢＤＡＺＡＰＲＩＩ／ＥｃｏＲＩ／Ｃ
ＩＡＰ ＣＬＯＮＩＮＧ ＫＩＴ）の２種類を使用し
た。宿主大腸菌として、前者の場合はＮＭ５２２株、後
者の場合はＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を用いた。ベクターに組
み込んだｃＤＮＡを、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入
したＧＩＧＡＰＡＣＫＲ ＩＩ ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ
ＥＸＴＲＡＣＴを用い、添付されたプロトコールに従い
パッケージングした。すなわち、Ｆｒｅｅｚｅ／Ｔｈａ
ｗ ｅｘｔｒａｃｔ、Ｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔおよ
びＤＮＡを混合し、２２℃、２時間保温することにより
パッケージングを行い、ｃＤＮＡライブラリーとした。
【０１００】実施例１２：プラークハイブリダイゼーシ
ョンによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（ウ
シアドゼベリンｃＤＮＡをプローブとするハイプリダイ
ゼーション） スクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ，Ｅ．Ｆ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９８９）に記載され
ている標準的な方法を参考に行った。すなわち、ＬＢ寒
天プレート上に生育させたファージプラークを、Ｈｙｂ
ｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に移し取
り、アルカリ変性させた後、紫外線を照射することによ
って固定化した。このフィルターを、ハイブリダイゼー
ション液中で４０℃、３時間保温することによりプレハ
イブリダイゼーションを行い、次に、３２Ｐで標識し、
熱変性したプローブ（約１μＣｉ／ｍｌ）とともに４０
℃で１６時間以上保温することによりハイブリダイゼー
ションを行った。プローブにはウシアドゼベリンｃＤＮ
Ａ（ｐＳＫ−アドゼベリン）よりＰｓｔＩ、ＮｄｅＩで
切り出されるほぼｃＤＮＡの全長に当たる断片を用い
た。ハイブリダイゼーションには厳密度の低い条件、す
なわち２５％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーショ
ン液（その他の組成は４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ ｐＨ７．０、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ）
を使用した（東京大学医科学研究所、制癌研究部、新細
胞工学実験プロトコール、細胞工学（１９９３））。ハ
イブリダイゼーション後、まずフィルターを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液で、室温、１５分、２
回洗浄してから、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液中
で、室温から徐々に温度を上げていきながら、バックグ
ラウンドの放射活性がなくなるまで洗浄した。フィルタ
ーを乾燥した後、オートラジオグラフィーを行った。
ョンによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（ウ
シアドゼベリンｃＤＮＡをプローブとするハイプリダイ
ゼーション） スクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ，Ｅ．Ｆ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９８９）に記載され
ている標準的な方法を参考に行った。すなわち、ＬＢ寒
天プレート上に生育させたファージプラークを、Ｈｙｂ
ｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に移し取
り、アルカリ変性させた後、紫外線を照射することによ
って固定化した。このフィルターを、ハイブリダイゼー
ション液中で４０℃、３時間保温することによりプレハ
イブリダイゼーションを行い、次に、３２Ｐで標識し、
熱変性したプローブ（約１μＣｉ／ｍｌ）とともに４０
℃で１６時間以上保温することによりハイブリダイゼー
ションを行った。プローブにはウシアドゼベリンｃＤＮ
Ａ（ｐＳＫ−アドゼベリン）よりＰｓｔＩ、ＮｄｅＩで
切り出されるほぼｃＤＮＡの全長に当たる断片を用い
た。ハイブリダイゼーションには厳密度の低い条件、す
なわち２５％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーショ
ン液（その他の組成は４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ ｐＨ７．０、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ）
を使用した（東京大学医科学研究所、制癌研究部、新細
胞工学実験プロトコール、細胞工学（１９９３））。ハ
イブリダイゼーション後、まずフィルターを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液で、室温、１５分、２
回洗浄してから、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液中
で、室温から徐々に温度を上げていきながら、バックグ
ラウンドの放射活性がなくなるまで洗浄した。フィルタ
ーを乾燥した後、オートラジオグラフィーを行った。
【０１０１】プローブの３２Ｐによる標識は、Ｒａｍｄ
ｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉ
ｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて行った。添付され
たプロトコールに従い、熱変性したＤＮＡ約１００ｎｇ
をランダムプライマー、５０μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＣ
ＴＰおよびＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔとともに３
７℃、３０分保温することにより標識した。
ｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉ
ｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社）を用いて行った。添付され
たプロトコールに従い、熱変性したＤＮＡ約１００ｎｇ
をランダムプライマー、５０μＣｉ［α−３２Ｐ］ｄＣ
ＴＰおよびＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔとともに３
７℃、３０分保温することにより標識した。
【０１０２】まず実施例１１で得られたヒト腎臓ｍＲＮ
Ａから作製したｃＤＮＡライブラリーの１．６×１０５
プラークをウシアドゼベリンｃＤＮＡをプローブとして
スクリーニングしたところ、１つの陽性ファージクロー
ンが得られた。
Ａから作製したｃＤＮＡライブラリーの１．６×１０５
プラークをウシアドゼベリンｃＤＮＡをプローブとして
スクリーニングしたところ、１つの陽性ファージクロー
ンが得られた。
【０１０３】実施例１３：陽性ファージクローンからプ
ラスミドベクターへのサブクローニング λ ＥｘＣｅｌｌベクターの塩基配列から合成したプラ
イマー（ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣ
ＣＡＡ、ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＣＧＴ
ＡＡＴ）を用いたＰＣＲによって実施例１２で得たクロ
ーンのインサート部分を増幅（東京大学医科学研究所、
制癌研究部、新細胞工学実験プロトコール、細胞工学
（１９９３））し、これをＥｃｏＲＩで切断後、あらか
じめＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸処理したｐＵＣ１８
プラスミドベクターにサブクローニングした。得られた
クローンをｐＡＤａ−１７と命名した。
ラスミドベクターへのサブクローニング λ ＥｘＣｅｌｌベクターの塩基配列から合成したプラ
イマー（ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣ
ＣＡＡ、ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＣＧＴ
ＡＡＴ）を用いたＰＣＲによって実施例１２で得たクロ
ーンのインサート部分を増幅（東京大学医科学研究所、
制癌研究部、新細胞工学実験プロトコール、細胞工学
（１９９３））し、これをＥｃｏＲＩで切断後、あらか
じめＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸処理したｐＵＣ１８
プラスミドベクターにサブクローニングした。得られた
クローンをｐＡＤａ−１７と命名した。
【０１０４】実施例１４：プラークハイブリダイゼーシ
ョンによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（ｐ
ＡＤａ−１７をプローブとするハイブリダイゼーショ
ン） 実施例１１の方法に準じて新たにヒト腎臓ｍＲＮＡより
作製した２−３ｋｂｐのｃＤＮＡのみを濃縮したライブ
ラリーを用いて、実施例１３で得たクローンｐＡＤａ−
１７をプローブとして厳密度を上げて（５０％ホルムア
ミド含有ハイブリダイゼーション液：その他の組成は実
施例１２と同じ）通常の条件でプラークハイブリダイゼ
ーションを行った。ｃＤＮＡライブラリーの作製に使用
したベクターはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入したＬ
ａｍｂｄａ ＺＡＰＲ ＩＩベクター（ＰＲＥＤＩＧＥ
ＳＴＥＤ ＬＡＭＢＤＡ ＺＡＰＲＩＩ／ＥｃｏＲＩ／
ＣＩＡＰ ＣＬＯＮＩＮＧ ＫＩＴ）であり、宿主大腸
菌としてＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を用いた。また、プローブ
の３２Ｐによる標識は、実施例１２に記載するのと同様
の方法を用いて、クローンｐＡＤａ−１７よりＥｃｏＲ
Ｉによって切り出される断片をアガロースゲル電気泳動
後精製し、約１００ｎｇ相当量を５０μＣｉの［α−
３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイゼーション
後、まずフィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを
含む溶液で、室温１５分、２回洗浄し、次いで０．５×
ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液で５０℃、１５分、２回
洗浄し、フィルターを乾燥した後、オートラジオグラフ
ィーを行った。
ョンによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（ｐ
ＡＤａ−１７をプローブとするハイブリダイゼーショ
ン） 実施例１１の方法に準じて新たにヒト腎臓ｍＲＮＡより
作製した２−３ｋｂｐのｃＤＮＡのみを濃縮したライブ
ラリーを用いて、実施例１３で得たクローンｐＡＤａ−
１７をプローブとして厳密度を上げて（５０％ホルムア
ミド含有ハイブリダイゼーション液：その他の組成は実
施例１２と同じ）通常の条件でプラークハイブリダイゼ
ーションを行った。ｃＤＮＡライブラリーの作製に使用
したベクターはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入したＬ
ａｍｂｄａ ＺＡＰＲ ＩＩベクター（ＰＲＥＤＩＧＥ
ＳＴＥＤ ＬＡＭＢＤＡ ＺＡＰＲＩＩ／ＥｃｏＲＩ／
ＣＩＡＰ ＣＬＯＮＩＮＧ ＫＩＴ）であり、宿主大腸
菌としてＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を用いた。また、プローブ
の３２Ｐによる標識は、実施例１２に記載するのと同様
の方法を用いて、クローンｐＡＤａ−１７よりＥｃｏＲ
Ｉによって切り出される断片をアガロースゲル電気泳動
後精製し、約１００ｎｇ相当量を５０μＣｉの［α−
３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイゼーション
後、まずフィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを
含む溶液で、室温１５分、２回洗浄し、次いで０．５×
ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液で５０℃、１５分、２回
洗浄し、フィルターを乾燥した後、オートラジオグラフ
ィーを行った。
【０１０５】その結果、１．７×１０５のプラークをス
クリーニングして５つの陽性ファージクローンを得た。
クリーニングして５つの陽性ファージクローンを得た。
【０１０６】実施例１５：陽性ファージクローンからプ
ラスミドベクターへのサブクローニング 陽性ファージクローンより、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰＲ
ＩＩベクターの特性を利用したＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭ／
ＳＯＬＲＴＭ ＳＹＳＴＥＭによるプラスミド（ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＲ ＳＫ（−）ベクター）への切り出
しを行った。ＰＲＥＤＩＧＥＳＴＥＤ ＬＡＭＢＤＡ
ＺＡＰＲＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰＣＬＯＮＩＮＧ
ＫＩＴ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に添付されたプロト
コールに従い、実施例１４で得た陽性ファージとＥｘＡ
ｓｓｉｓｔＴＭヘルパーファージをＸＬ１−Ｂｌｕｅ株
大腸菌に感染させた後３７℃で２．５時間培養し、培養
液中に切り出されたプラスミドをＳＯＬＲ株大腸菌に取
り込ませた。このようにしてプラスミドクローンｐｈＡ
Ｄ−２〜６を得た。
ラスミドベクターへのサブクローニング 陽性ファージクローンより、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰＲ
ＩＩベクターの特性を利用したＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭ／
ＳＯＬＲＴＭ ＳＹＳＴＥＭによるプラスミド（ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＲ ＳＫ（−）ベクター）への切り出
しを行った。ＰＲＥＤＩＧＥＳＴＥＤ ＬＡＭＢＤＡ
ＺＡＰＲＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰＣＬＯＮＩＮＧ
ＫＩＴ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に添付されたプロト
コールに従い、実施例１４で得た陽性ファージとＥｘＡ
ｓｓｉｓｔＴＭヘルパーファージをＸＬ１−Ｂｌｕｅ株
大腸菌に感染させた後３７℃で２．５時間培養し、培養
液中に切り出されたプラスミドをＳＯＬＲ株大腸菌に取
り込ませた。このようにしてプラスミドクローンｐｈＡ
Ｄ−２〜６を得た。
【０１０７】実施例１６：ヒトアドゼベリンｃＤＮＡの
塩基配列の決定 実施例１５で得たプラスミドクローンｐｈＡＤ−２とｐ
ｈＡＤ−４について塩基配列を決定した。塩基配列は、
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｕｎｉｔ
ｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用
いたＤｉｄｅｏｘｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、あるい
は、ＰＲＩＳＭＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｍｉｘ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた
Ｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法を行い、Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＭｏｄｅｌ ３７３Ａ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで解読することにより決定した。
塩基配列の決定 実施例１５で得たプラスミドクローンｐｈＡＤ−２とｐ
ｈＡＤ−４について塩基配列を決定した。塩基配列は、
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｕｎｉｔ
ｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用
いたＤｉｄｅｏｘｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、あるい
は、ＰＲＩＳＭＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｍｉｘ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた
Ｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法を行い、Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＭｏｄｅｌ ３７３Ａ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで解読することにより決定した。
【０１０８】ｐｈＡＤ−２およびｐｈＡＤ−４で決定し
た塩基配列を組み合わせて得られたヒトアドゼベリンの
ｃＤＮＡの塩基配列および最長オープンリーディングフ
レームに対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号５に
示す。７９番目のＡＴＧを開始コドンとする７１５アミ
ノ酸からなるオーブンリーディングフレームが見いださ
れた。
た塩基配列を組み合わせて得られたヒトアドゼベリンの
ｃＤＮＡの塩基配列および最長オープンリーディングフ
レームに対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号５に
示す。７９番目のＡＴＧを開始コドンとする７１５アミ
ノ酸からなるオーブンリーディングフレームが見いださ
れた。
【０１０９】実施例１７：ヒトアドゼベリンとウシアド
ゼベリンとの比較 実施例１６で得られたヒトアドゼベリンのアミノ酸配列
と実施例６で得られたウシアドゼベリンのアミノ酸配列
を比較した結果を図９に示す。図中、上段はヒト、下段
はウシのアミノ酸配列を示す。また、両者が完全に一致
しているアミノ酸を＊で、類似性の高いアミノ酸を・で
示す。ヒトアドゼベリンとウシアドゼベリンとはアミノ
酸レベルで約９２％の相同性を有しており、完全に一致
していないアミノ酸でも類似性が高かった。また塩基レ
ベルでもコーディング領域内では約９０％の相同性が見
られた。しかしながら、ストップコドン以降は急激に相
同性を失っていた。
ゼベリンとの比較 実施例１６で得られたヒトアドゼベリンのアミノ酸配列
と実施例６で得られたウシアドゼベリンのアミノ酸配列
を比較した結果を図９に示す。図中、上段はヒト、下段
はウシのアミノ酸配列を示す。また、両者が完全に一致
しているアミノ酸を＊で、類似性の高いアミノ酸を・で
示す。ヒトアドゼベリンとウシアドゼベリンとはアミノ
酸レベルで約９２％の相同性を有しており、完全に一致
していないアミノ酸でも類似性が高かった。また塩基レ
ベルでもコーディング領域内では約９０％の相同性が見
られた。しかしながら、ストップコドン以降は急激に相
同性を失っていた。
【０１１０】実施例１８：抗アドゼベリン抗体および抗
ペプチド抗体（ヒトアドゼベリン由来ペプチドに対する
抗体）の作製抗アドゼベリン抗体の作製 ウシ副腎髄質より精製したアドゼベリン１ｍｇをフロイ
ントの完全アジュバントと混合してエマルジョンを作製
し、ウサギの皮下に１０数カ所に分けて注入した。さら
に、４週間おきに同量のタンパク質を不完全アジュバン
トと混合後エマルジョンを作製し、同様に皮下に注入し
た。注入１週間後に耳静脈から採血し血清を分離し、Ｅ
ＬＩＳＡにて抗体価を検討したところ、２−３回のブー
スト後に血清中の抗体価の上昇が見られた。ゲルゾリン
との交差反応が観察されたため、得られた血清はアガロ
ースビーズに固定化したゲルゾリンで吸収後、固定化し
たアドゼベリンに吸着させ０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ
（ｐＨ２．５）、０．１Ｍトリエチルアミン−ＨＣｌ
（ｐＨ１１．５）、３．５Ｍ ＭｇＣｌ２にて順次溶出
し、トリス緩衝塩溶液に対して透析、濃縮した。このよ
うにして得られたアフィニティー精製抗体はゲルゾリン
と交差反応を示さず、アドゼベリンに対して特異的な反
応が見られた。この抗体はイムノブロット法では０．１
−１μｇ／ｍｌ、蛍光抗体法では１−１０μｇ／ｍｌの
濃度で使用した。抗ペプチド抗体（ヒトアドゼベリン由来ペプチドに対す
る抗体）の作製 タンパク質分子の表面に露出しており、ウシ、ヒトのア
ドゼベリンで種間の保存性が高く、ゲルゾリンとの相同
性の低い部位のヒトアドゼベリン由来のペプチド配列
（１６残基）を２カ所選んだ（配列番号６、７）。枝分
かれ構造に７つのリジン残基がつながった樹脂からペプ
チド合成をスタートさせ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｔｉ
ｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）を合成する（Ｔａ
ｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８５：５４０９−５４１３，１９８８）。
初回は完全アジュバントと、２回目以降は不完全アジュ
バントとペプチドでエマルジョンを作製し、ウサギ２羽
の皮下に１週おきに注入した。７、８、９週後に耳静脈
から採血し、ＥＬＩＳＡにて抗体価を調べた。その結
果、ゲルゾリンとの交差反応性が少なく、ラット、ウ
シ、ヒトのアドゼベリンと反応する抗体が得られた。免
疫前の血清にも認められる非特異的な反応が観察された
ため精製タンパク質を免疫して得た抗体と同様に抗原に
よるアフィニティー精製を行った。
ペプチド抗体（ヒトアドゼベリン由来ペプチドに対する
抗体）の作製抗アドゼベリン抗体の作製 ウシ副腎髄質より精製したアドゼベリン１ｍｇをフロイ
ントの完全アジュバントと混合してエマルジョンを作製
し、ウサギの皮下に１０数カ所に分けて注入した。さら
に、４週間おきに同量のタンパク質を不完全アジュバン
トと混合後エマルジョンを作製し、同様に皮下に注入し
た。注入１週間後に耳静脈から採血し血清を分離し、Ｅ
ＬＩＳＡにて抗体価を検討したところ、２−３回のブー
スト後に血清中の抗体価の上昇が見られた。ゲルゾリン
との交差反応が観察されたため、得られた血清はアガロ
ースビーズに固定化したゲルゾリンで吸収後、固定化し
たアドゼベリンに吸着させ０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ
（ｐＨ２．５）、０．１Ｍトリエチルアミン−ＨＣｌ
（ｐＨ１１．５）、３．５Ｍ ＭｇＣｌ２にて順次溶出
し、トリス緩衝塩溶液に対して透析、濃縮した。このよ
うにして得られたアフィニティー精製抗体はゲルゾリン
と交差反応を示さず、アドゼベリンに対して特異的な反
応が見られた。この抗体はイムノブロット法では０．１
−１μｇ／ｍｌ、蛍光抗体法では１−１０μｇ／ｍｌの
濃度で使用した。抗ペプチド抗体（ヒトアドゼベリン由来ペプチドに対す
る抗体）の作製 タンパク質分子の表面に露出しており、ウシ、ヒトのア
ドゼベリンで種間の保存性が高く、ゲルゾリンとの相同
性の低い部位のヒトアドゼベリン由来のペプチド配列
（１６残基）を２カ所選んだ（配列番号６、７）。枝分
かれ構造に７つのリジン残基がつながった樹脂からペプ
チド合成をスタートさせ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｔｉ
ｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）を合成する（Ｔａ
ｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８５：５４０９−５４１３，１９８８）。
初回は完全アジュバントと、２回目以降は不完全アジュ
バントとペプチドでエマルジョンを作製し、ウサギ２羽
の皮下に１週おきに注入した。７、８、９週後に耳静脈
から採血し、ＥＬＩＳＡにて抗体価を調べた。その結
果、ゲルゾリンとの交差反応性が少なく、ラット、ウ
シ、ヒトのアドゼベリンと反応する抗体が得られた。免
疫前の血清にも認められる非特異的な反応が観察された
ため精製タンパク質を免疫して得た抗体と同様に抗原に
よるアフィニティー精製を行った。
【０１１１】
【発明の効果】本発明により、アクチンフィラメント切
断活性を有するタンパク質であるアドゼベリンをコード
する遺伝子の配列が明らかとなった。したがって、本遺
伝子配列からそのアンチセンスＤＮＡ配列を作製してヒ
トに投与することにより、例えば、血管平滑筋の増殖を
抑制して血管狭窄を予防・治療したり、あるいは生理活
性物質の放出を遺伝子レベルで抑制することが可能であ
ると考えられている。また、本発明の遺伝子配列を遺伝
子組換え技術に応用することにより、アドゼベリンを大
量かつ均一に生産することが可能となった。したがっ
て、ヒトアドゼベリンを用いたスクリーニング系などを
構築することにより、新たな医薬品の開発が期待でき
る。さらに、アドゼベリンはゲルゾリンと同じ活性を示
すことから、血栓抑制剤などの医薬用途に利用できる可
能性もある。
断活性を有するタンパク質であるアドゼベリンをコード
する遺伝子の配列が明らかとなった。したがって、本遺
伝子配列からそのアンチセンスＤＮＡ配列を作製してヒ
トに投与することにより、例えば、血管平滑筋の増殖を
抑制して血管狭窄を予防・治療したり、あるいは生理活
性物質の放出を遺伝子レベルで抑制することが可能であ
ると考えられている。また、本発明の遺伝子配列を遺伝
子組換え技術に応用することにより、アドゼベリンを大
量かつ均一に生産することが可能となった。したがっ
て、ヒトアドゼベリンを用いたスクリーニング系などを
構築することにより、新たな医薬品の開発が期待でき
る。さらに、アドゼベリンはゲルゾリンと同じ活性を示
すことから、血栓抑制剤などの医薬用途に利用できる可
能性もある。
【０１１２】配列番号：１ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： ＫＶＡＨＶＫＱＩＰＦＤＡ
【０１１３】配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： ＶＬＴＮＤＬＴＡＱ
【０１１４】配列番号：３ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： ＩＴＮＲＫ
【０１１５】配列番号：４ 配列の長さ：２４１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：２７．．２１７１ 配列：
【０１１６】配列番号：５ 配列の長さ：２６３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：７９．．２２２３ 配列：
【０１１７】配列番号：６ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： ＬＮＨＶＬＴＮＤＬＴＡＫＲＬＬＨ
【０１１８】配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： ＫＶＹＶＴＥＫＶＡＱＩＫＱＩＰＦ
【図１】ウシ副腎髄質から得たアドゼベリンの精製を、
ウシ大動脈から得たゲルゾリンの精製と比較して示す電
気泳動の写真である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは６．５〜１
０．５％のリニヤーグラジエントゲルを用いて行った。
レーン１および２はウシ大動脈から得た分画をＤＮａｓ
ｅＩアフィニティーカラムにかけたものを示し、このう
ちレーン１はＥＧＴＡ溶出分画、レーン２は６Ｍ尿素溶
出分画である。レーン３−８はウシ副腎髄質から得た分
画を示し、このうちレーン３は粗抽出物、レーン４はＤ
ＮａｓｅＩアフィニティーカラムのＥＧＴＡ溶出分画、
レーン５はＤＮａｓｅＩアフィニティーカラムの６Ｍ尿
素溶出分画、レーン６はアドゼベリンを含むＱ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ分画、レーン７は血漿ゲルゾリン、細胞質
ゲルゾリンおよびアクチンを含むＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ分画、レーン８はＨＰＬＣゲル濾過で精製したアドゼ
ベリン、レーンＭは分子量マーカーであり、上から９
４，０００、６７，０００、４３，０００および３０，
０００の分子量を表す。
ウシ大動脈から得たゲルゾリンの精製と比較して示す電
気泳動の写真である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは６．５〜１
０．５％のリニヤーグラジエントゲルを用いて行った。
レーン１および２はウシ大動脈から得た分画をＤＮａｓ
ｅＩアフィニティーカラムにかけたものを示し、このう
ちレーン１はＥＧＴＡ溶出分画、レーン２は６Ｍ尿素溶
出分画である。レーン３−８はウシ副腎髄質から得た分
画を示し、このうちレーン３は粗抽出物、レーン４はＤ
ＮａｓｅＩアフィニティーカラムのＥＧＴＡ溶出分画、
レーン５はＤＮａｓｅＩアフィニティーカラムの６Ｍ尿
素溶出分画、レーン６はアドゼベリンを含むＱ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ分画、レーン７は血漿ゲルゾリン、細胞質
ゲルゾリンおよびアクチンを含むＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ分画、レーン８はＨＰＬＣゲル濾過で精製したアドゼ
ベリン、レーンＭは分子量マーカーであり、上から９
４，０００、６７，０００、４３，０００および３０，
０００の分子量を表す。
【図２】アドゼベリンの分子量３９，０００の断片（Ｃ
３９）の部分的アミノ酸配列と、そのゲルゾリンおよび
ビリンの対応部分のアミノ酸配列との比較を示す。
３９）の部分的アミノ酸配列と、そのゲルゾリンおよび
ビリンの対応部分のアミノ酸配列との比較を示す。
【図３】アドゼベリンのサーモリシン分解によって得ら
れる断片のＮ末端アミノ酸配列とその予期される位置を
ゲルゾリンと比較して示す。
れる断片のＮ末端アミノ酸配列とその予期される位置を
ゲルゾリンと比較して示す。
【図４】ウシアドゼベリンのｃＤＮＡの制限酵素地図を
示す。ＰＣＲで示した部分はＭＤＢＫ細胞のＲＮＡから
逆転写およびＰＣＲによって得られたｃＤＮＡを示す。
１９、５および２１で示す部分は、ウシ副腎髄質のλｇ
ｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーから単離してアドゼベリ
ンのｃＤＮＡ構築に使用した個々のｃＤＮＡを示する。
示す。ＰＣＲで示した部分はＭＤＢＫ細胞のＲＮＡから
逆転写およびＰＣＲによって得られたｃＤＮＡを示す。
１９、５および２１で示す部分は、ウシ副腎髄質のλｇ
ｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーから単離してアドゼベリ
ンのｃＤＮＡ構築に使用した個々のｃＤＮＡを示する。
【図５】本発明で明らかにされたウシアドゼベリンのア
ミノ酸配列を、ヒトゲルゾリンおよびヒトビリンの対応
するセグメントのアミノ酸配列と比較して示す。配列の
右側に示す番号はアドゼベリン、ゲルゾリン、ビリンの
セグメント番号である。セグメント１と４、セグメント
２と５、およびセグメント３と６の間に最大の相同性が
存在する。高度に保存されたモチーフを図中にボックス
で囲んで示す。また、推定されるポリホスホイノシチド
結合部位を点線で囲んで示す。さらに、下に楕円で囲ん
だ番号で示す模式図は、これらのタンパク質の６個の相
同セグメントである。
ミノ酸配列を、ヒトゲルゾリンおよびヒトビリンの対応
するセグメントのアミノ酸配列と比較して示す。配列の
右側に示す番号はアドゼベリン、ゲルゾリン、ビリンの
セグメント番号である。セグメント１と４、セグメント
２と５、およびセグメント３と６の間に最大の相同性が
存在する。高度に保存されたモチーフを図中にボックス
で囲んで示す。また、推定されるポリホスホイノシチド
結合部位を点線で囲んで示す。さらに、下に楕円で囲ん
だ番号で示す模式図は、これらのタンパク質の６個の相
同セグメントである。
【図６】大腸菌における発現とアドゼベリンの精製を示
す電気泳動の写真である。図中、Ａは大腸菌におけるア
ドゼベリンの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
形質転換体を０．４ｍＭ ＩＰＴＧの存在下（レーン
３）または不在下（レーン２）にインキュベートした３
時間後に、ペレット化した細胞をＳＤＳサンプルバッフ
ァーに溶解して、加熱し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルにのせた。電気泳動の後、ゲルをクマシー（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅ）ブリリアントブルーで染色した。矢印は
アドゼベリンのバンドを示す。なお、レーン１は分子量
マーカーである。図中、Ｂは大腸菌で発現させたアドゼ
ベリンを精製した後に行ったイムノブロット分析であ
る。精製アドゼベリンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニ
トロセルロース膜に移し取った。ブロットをポンソー
（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓで染色（レーン２）し、脱染色し
た後、アフィニティー精製したアドゼベリンに対する抗
体で免疫検出した（レーン３）。なお、レーン１は分子
量マーカーである。
す電気泳動の写真である。図中、Ａは大腸菌におけるア
ドゼベリンの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
形質転換体を０．４ｍＭ ＩＰＴＧの存在下（レーン
３）または不在下（レーン２）にインキュベートした３
時間後に、ペレット化した細胞をＳＤＳサンプルバッフ
ァーに溶解して、加熱し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルにのせた。電気泳動の後、ゲルをクマシー（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅ）ブリリアントブルーで染色した。矢印は
アドゼベリンのバンドを示す。なお、レーン１は分子量
マーカーである。図中、Ｂは大腸菌で発現させたアドゼ
ベリンを精製した後に行ったイムノブロット分析であ
る。精製アドゼベリンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニ
トロセルロース膜に移し取った。ブロットをポンソー
（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓで染色（レーン２）し、脱染色し
た後、アフィニティー精製したアドゼベリンに対する抗
体で免疫検出した（レーン３）。なお、レーン１は分子
量マーカーである。
【図７】大腸菌で発現したアドゼベリンのアクチン重合
に対する効果を粘度計によって測定した結果を示す。
０．１ｍＭ ＣａＣｌ２（Ａ）または１ｍＭ ＥＧＴＡ
（Ｂ）を含むバッファーＰ中でアクチンを重合させた。
図中、○および△で示すのは、アクチンのみの存在下で
重合を行った結果を示し、●および▲で示すのは、アク
チンに１：３０のモル比で加えたアドゼベリンの存在下
に行った結果を示す。矢印で示す時点で、１：３０のモ
ル比でアクチン溶液にアドゼベリンを加えた。
に対する効果を粘度計によって測定した結果を示す。
０．１ｍＭ ＣａＣｌ２（Ａ）または１ｍＭ ＥＧＴＡ
（Ｂ）を含むバッファーＰ中でアクチンを重合させた。
図中、○および△で示すのは、アクチンのみの存在下で
重合を行った結果を示し、●および▲で示すのは、アク
チンに１：３０のモル比で加えたアドゼベリンの存在下
に行った結果を示す。矢印で示す時点で、１：３０のモ
ル比でアクチン溶液にアドゼベリンを加えた。
【図８】ウシ副腎の皮質と髄質の境界領域におけるアド
ゼベリンとｍＲＮＡの発現を示す光学顕微鏡写真（生物
の形態を示す写真）である。各写真の上側が皮質に対応
し、下側が髄質に対応する。セクションをトルイジンブ
ルーで染色する（パネルａ）か、あるいは抗−アドゼベ
リンウサギ抗体で染色し、次いで蛍光結合抗−ウサギイ
ムノグロブリンで染色した（パネルｂおよびｅ）。パネ
ルｄは、パネルｅと同じ視野を位相差顕微鏡によって観
察した像である。インサイチュハイブイダイゼーション
の像をパネルｃおよびｆに示す。なお、パネルａ−ｃは
１２０×の倍率であり、パネルｄ−ｆは２８０×の倍率
である。
ゼベリンとｍＲＮＡの発現を示す光学顕微鏡写真（生物
の形態を示す写真）である。各写真の上側が皮質に対応
し、下側が髄質に対応する。セクションをトルイジンブ
ルーで染色する（パネルａ）か、あるいは抗−アドゼベ
リンウサギ抗体で染色し、次いで蛍光結合抗−ウサギイ
ムノグロブリンで染色した（パネルｂおよびｅ）。パネ
ルｄは、パネルｅと同じ視野を位相差顕微鏡によって観
察した像である。インサイチュハイブイダイゼーション
の像をパネルｃおよびｆに示す。なお、パネルａ−ｃは
１２０×の倍率であり、パネルｄ−ｆは２８０×の倍率
である。
【図９】ヒトアドゼベリンのアミノ酸配列とウシアドゼ
ベリンのアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
図中、上段はヒト、下段はウシのアミノ酸配列を示す。
両者が完全に一致しているアミノ酸を＊で、類似性の高
いアミノ酸を・で示す。また、四角で囲んだ部分は、リ
ン脂質が結合すると推定されている領域を示す。
ベリンのアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
図中、上段はヒト、下段はウシのアミノ酸配列を示す。
両者が完全に一致しているアミノ酸を＊で、類似性の高
いアミノ酸を・で示す。また、四角で囲んだ部分は、リ
ン脂質が結合すると推定されている領域を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年２月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７７】ゲルゾリンおよびビリンに存在する推定の
ポリホスホイノシチド結合配列も、ゲルゾリンやビリン
中の領域に対応する領域、すなわちアドゼベリンの第１
および第２セグメント（Ｓ１、Ｓ２）中に見つかった。
これは、Ｓ１−２に対応するアドゼベリンのタンパク質
断片の切断活性がポリホスホイノシチドによって阻害さ
れることと一致する。これらの配列を図５中に箱で囲ん
で示し、また表１に模式図として示す。 表１ 他のアクチンフィラメント切断タンパク質と比較した アドゼベリンの推定ポリホスホイノシチド結合部位タンパク質 結合部位の位置 アミノ酸配列 アドゼベリン １１２−１１９ Ｋ Ｇ Ｇ − Ｌ Ｋ Ｙ Ｋ Ａ ゲルゾリン １３５−１４２ Ｋ Ｓ Ｇ − Ｌ Ｋ Ｙ Ｋ Ｋ ビリン １１２−１１９ Ｋ Ｑ Ｇ − Ｌ Ｖ Ｉ Ｒ Ｋ アドゼベリン １３８−１４６ Ｒ Ｌ Ｌ Ｈ Ｖ Ｋ Ｇ Ｒ Ｒ ゲルゾリン １６１−１６９ Ｒ Ｌ Ｆ Ｑ Ｖ Ｋ Ｇ Ｒ Ｒ ビリン １３８−１４６ Ｒ Ｌ Ｌ Ｈ Ｖ Ｋ Ｇ Ｋ Ｒ コンセンサス Ｋ Ｋ Ｋ Ｘ Ｘ(Ｘ)Ｘ Ｋ Ｘ Ｒ Ｒ Ｒ ２つの推定配列のうちの１つはコンセンサス配列と完全
に一致し、また第１セグメントにある他方はコンセンサ
ス配列と１アミノ酸だけ異なっており、コンセンサス配
列のＣＯＯＨ末端が塩基性アミノ酸の代わりにアラニン
となっている。このため、ゲルゾリンの対応するドメイ
ンよりもアドゼベリンのこのドメインの塩基性が低くな
る。この相違は、ホスファチジルイノシトール４，５−
ビスリン酸やホスファチジルイノシトール４−モノリン
酸以外の酸性リン脂質、例えばホスファチジルイノシト
ールやホスファチジルセリンがアドゼベリンの切断活性
を阻害できても、ゲルゾリンの切断活性は阻害できな
い、ということを部分的に説明する理由となろう。
ポリホスホイノシチド結合配列も、ゲルゾリンやビリン
中の領域に対応する領域、すなわちアドゼベリンの第１
および第２セグメント（Ｓ１、Ｓ２）中に見つかった。
これは、Ｓ１−２に対応するアドゼベリンのタンパク質
断片の切断活性がポリホスホイノシチドによって阻害さ
れることと一致する。これらの配列を図５中に箱で囲ん
で示し、また表１に模式図として示す。 表１ 他のアクチンフィラメント切断タンパク質と比較した アドゼベリンの推定ポリホスホイノシチド結合部位タンパク質 結合部位の位置 アミノ酸配列 アドゼベリン １１２−１１９ Ｋ Ｇ Ｇ − Ｌ Ｋ Ｙ Ｋ Ａ ゲルゾリン １３５−１４２ Ｋ Ｓ Ｇ − Ｌ Ｋ Ｙ Ｋ Ｋ ビリン １１２−１１９ Ｋ Ｑ Ｇ − Ｌ Ｖ Ｉ Ｒ Ｋ アドゼベリン １３８−１４６ Ｒ Ｌ Ｌ Ｈ Ｖ Ｋ Ｇ Ｒ Ｒ ゲルゾリン １６１−１６９ Ｒ Ｌ Ｆ Ｑ Ｖ Ｋ Ｇ Ｒ Ｒ ビリン １３８−１４６ Ｒ Ｌ Ｌ Ｈ Ｖ Ｋ Ｇ Ｋ Ｒ コンセンサス Ｋ Ｋ Ｋ Ｘ Ｘ(Ｘ)Ｘ Ｋ Ｘ Ｒ Ｒ Ｒ ２つの推定配列のうちの１つはコンセンサス配列と完全
に一致し、また第１セグメントにある他方はコンセンサ
ス配列と１アミノ酸だけ異なっており、コンセンサス配
列のＣＯＯＨ末端が塩基性アミノ酸の代わりにアラニン
となっている。このため、ゲルゾリンの対応するドメイ
ンよりもアドゼベリンのこのドメインの塩基性が低くな
る。この相違は、ホスファチジルイノシトール４，５−
ビスリン酸やホスファチジルイノシトール４−モノリン
酸以外の酸性リン脂質、例えばホスファチジルイノシト
ールやホスファチジルセリンがアドゼベリンの切断活性
を阻害できても、ゲルゾリンの切断活性は阻害できな
い、ということを部分的に説明する理由となろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ 14/575 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/46 ＡＣＢ ＡＥＤ ＡＦＣ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＥＤ ＡＦＣ
Claims (9)
- 【請求項１】 配列表の配列番号４または５に示すアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列、またはこれを一部置
換、欠失もしくは付加した塩基配列、あるいはこれらに
ハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡを含有する組換え
ベクター。 - 【請求項３】 請求項２記載の組換えベクターにより形
質転換された原核または真核宿主細胞。 - 【請求項４】 請求項３記載の宿主細胞を培養し、産生
されたタンパク質を分離、精製することを特徴とする組
換えタンパク質の製造方法。 - 【請求項５】 組換えタンパク質がアクチンフィラメン
ト切断活性を有するタンパク質である請求項４記載の組
換えタンパク質の製造方法。 - 【請求項６】 請求項３記載の宿主細胞を培養して得ら
れる培養清を分離、精製して得られる組換えアドゼベリ
ンタンパク質。 - 【請求項７】 配列表の配列番号４または５に示すアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列と特異的にハイブリダイ
ズしうるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項８】 配列表の配列番号４または５に示すアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列と特異的にハイブリダイ
ズしうるオリゴヌクレオチドを動物に投与することから
なる、動物におけるアドゼベリンの生成を抑制する方
法。 - 【請求項９】 アドゼベリンタンパク質を認識する抗
体。
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|---|---|---|---|
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| US08/669,286 US6130060A (en) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | Gene encoding for adseverin |
| AU12814/95A AU1281495A (en) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | Gene coding for adseverins |
| CA002180103A CA2180103C (en) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | Gene encoding adseverin |
| EP95903966A EP0756005B1 (en) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | Gene coding for adseverin |
| AT95903966T ATE290591T1 (de) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | Für adseverin kodierendes gen |
| DE69434292T DE69434292T2 (de) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | Für adseverin codierendes gen |
| EP03017504A EP1371728A1 (en) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | Gene encoding adseverin |
| PCT/JP1994/002227 WO1995018221A1 (fr) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | Gene codant pour les adseverines |
| TW084106842A TW438886B (en) | 1993-12-28 | 1995-06-22 | Gene encoding human adseverin |
| US09/469,253 US6184352B1 (en) | 1993-12-28 | 1999-12-22 | Adseverin protein |
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| CA (1) | CA2180103C (ja) |
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| TW (1) | TW438886B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1998020887A1 (en) * | 1996-11-14 | 1998-05-22 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polyphosphoinositide binding peptides for intracellular drug delivery |
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| US6489125B1 (en) * | 2000-05-10 | 2002-12-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for identifying chemical compounds that inhibit dissociation of FKBP12.6 binding protein from type 2 ryanodine receptor |
| US8022058B2 (en) | 2000-05-10 | 2011-09-20 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors |
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| US20060293266A1 (en) * | 2000-05-10 | 2006-12-28 | The Trustees Of Columbia | Phosphodiesterase 4D in the ryanodine receptor complex protects against heart failure |
| US7393652B2 (en) | 2000-05-10 | 2008-07-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for identifying a chemical compound that directly enhances binding of FKBP12.6 to PKA-phosphorylated type 2 ryanodine receptor (RyR2) |
| US20040229781A1 (en) * | 2000-05-10 | 2004-11-18 | Marks Andrew Robert | Compounds and methods for treating and preventing exercise-induced cardiac arrhythmias |
| US7879840B2 (en) | 2005-08-25 | 2011-02-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors |
| US20030220374A1 (en) * | 2002-01-14 | 2003-11-27 | Pharmacia Corporation | Compositions and methods of treatment involving peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists and cyclooxygenase-2 selective inhibitors |
| US7544678B2 (en) | 2002-11-05 | 2009-06-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Anti-arrythmic and heart failure drugs that target the leak in the ryanodine receptor (RyR2) |
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| PL1694342T3 (pl) * | 2003-11-12 | 2021-07-05 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Sposoby zastosowania gelsoliny do leczenia lub zapobiegania posocznicy bakteryjnej |
| US8710045B2 (en) | 2004-01-22 | 2014-04-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the ryanodine receptors |
| CN1980694B (zh) * | 2004-05-12 | 2012-09-26 | 布赖汉姆妇女医院有限公司 | 凝溶胶蛋白治疗感染的用途 |
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| WO2007080457A2 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-19 | Institut Gustave Roussy | Use of inhibitors of scinderin and/or of ephrin-a1 for treating tumors |
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| CN102119173B (zh) * | 2007-08-15 | 2015-04-08 | 北京同为时代生物技术有限公司 | 凝溶胶蛋白结合剂组合物及其用途 |
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