CN105330735A - 一种prrt2蛋白相关的抗原表位肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种PRRT2蛋白相关的抗原表位肽及其应用，具体的本发明提供了一种抗原表位肽，所述抗原表位肽源自PRRT2蛋白，并且所述抗原表位肽的氨基酸长度为100-200个氨基酸。实验结果表明，使用该抗原表位肽免疫动物，能够制备出对PRRT2特异性强、灵敏度高的抗PRRT2抗体。而且该抗体对检测方法的适用性广，可用于western？blot分析、细胞免疫荧光检测、组织免疫荧光检测和免疫共沉淀(IP)分析等。

Description

一种PRRT2蛋白相关的抗原表位肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种PRRT2蛋白相关的抗原表位肽及其应用。

背景技术

PRRT2(proline-richtransmembraneprotein)为富含脯氨酸的跨膜蛋白，在人类已发现了3个PRRT2蛋白亚型(isoform1、isoform2和isoform3)，其编码基因定位于16号染色体上(16p11.2)。最近的研究表明，PRRT2基因突变与运动诱发性运动障碍(PKD)、良性家族性婴儿癫痫症(BFIE)和婴儿惊厥伴发作性手足舞蹈徐动征(ICCA)等多种运动障碍疾病的发病相关，提示PRRT2突变是多种运动障碍疾病共同的致病因素之一。

目前，已经出现了商业化的PRRT2抗体，但这些商品化的抗体基本都只适用于单一的检测方法，如PRRT2的westernblot检测，而且其识别抗原的特异性不强。此外，PRRT2基因的突变会导致运动障碍等相关的疾病。现有的商品化PRRT2抗体大多只能检测正常的PRRT2蛋白，不能检测突变的PRRT2蛋白，因此，这类抗体无法用于疾病发病机理研究。

由于没有高质量的同时可以检测正常和突变PRRT2的抗体，人们无法在蛋白水平上系统研究PRRT2在组织中的分布、表达规律、亚细胞定位及其与其他蛋白的相互作用，因而无法揭示PRRT2基因突变导致运动障碍的致病机理。因此，制备灵敏度高、特异性强、同时可检测正常和突变PRRT2的PRRT2抗体是此类运动障碍疾病发病机理研究工作中亟待解决的关键技术问题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备PRRT2抗体的技术，通过该技术制备的PRRT2抗体适用于组织、细胞中PRRT2的检测，特别适合针对由PRRT2基因突变导致的人神经系统疾病的致病机理的研究。

本发明的第一方面，提供了一种抗原表位肽，所述抗原表位肽源自PRRT2蛋白，并且所述抗原表位肽的氨基酸长度为100-200个氨基酸。

在另一优选例中，所述的抗原表位肽的氨基酸序列选自下组：

(A)具有SEQIDNO:4或6所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQIDNO:4或6中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽具有与抗PRRT2蛋白抗体的结合能力；

(C)将SEQIDNO:4或6中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留与抗PRRT2蛋白抗体的结合能力的衍生多肽。

在另一优选例中，所述PRRT2蛋白为哺乳动物的PRRT2蛋白(包括人)。

本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有本发明第一方面所述的抗原肽和任选的标签序列。

在另一优选例中，所述标签序列选自：GST标签序列、FLAG标签序列、HIS标签序列、MYC标签序列。

本发明的第三方面，提供了一种抗体，所述抗体特异性的结合本发明第一方面所述的抗原表位肽或本发明第二方面所述的融合蛋白，并且所述抗体能够特异性地结合天然的PRRT2蛋白和突变的PRRT2蛋白。

在另一优选例中，所述天然的PRRT2蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示。

在另一优选例中，所述突变的PRRT2蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.:10所示。

在另一优选例中，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。

本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，它编码本发明第一方面所述的抗原肽或本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第三方面所述的抗体。

本发明的第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第四方面所述的多核苷酸。

本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第五方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。

本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的抗体、本发明第四方面所述的多核苷酸、本发明第五方面所述的表达载体或者本发明第六方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。

本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的抗体、本发明第四方面所述的多核苷酸、本发明第五方面所述的表达载体或者本发明第六方面所述的宿主细胞的用途，

(a)用于制备针对所述PRRT2蛋白的抗体；和/或

(b)用于制备治疗与所述PRRT2蛋白相关的疾病的药物。

在另一优选例中，所述疾病包括发作性运动诱发性运动障碍(PKD)、良性家族性婴儿癫痫症(BFIE)和婴儿惊厥伴发作性手足舞蹈徐动征(ICCA)。

本发明的第九方面，提供了本发明第三方面所述的抗体的用途，用于

(1)PRRT2蛋白的分离纯化；或

(2)非诊断目的PRRT2蛋白的检测；或

(3)制备检测PRRT2蛋白的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述PRRT2蛋白包括天然PRRT2蛋白和/或突变的PRRT2蛋白。

本发明的第十方面，提供了一种制备抗PRRT2蛋白抗体的方法，包括步骤：

(1)使用本发明的本发明第一方面所述的抗原表位肽或本发明第二方面所述的融合蛋白作为抗原免疫动物，并在动物体内产生抗PRRT2蛋白的抗体；

(2)分离纯化所述抗PRRT2蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述动物为哺乳动物。

在另一优选例中，所述动物包括人、鼠、兔、牛或羊。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施1中所制备的抗原肽电泳结果。

图2显示了以人流产胎儿脑组织为材料，通过WesternBlot实验，检测本抗体对组织中PRRT2的检测效果；其中图2A为实施例中所用的脑组织图片以及3个不同部位的检测结果，图2B为对照抗体的检测结果。

图3显示了以流产胎儿的脑组织为材料，通过IP实验，检测抗体在IP实验中的应用效果；图3A为本发明抗体的检测结果，图3B为对照抗体的检测结果。

图4免疫荧光染色实验的检测结果，其中图4A显示了体外过表达PRRT2-flag蛋白，通过免疫荧光染色实验，检测本发明抗体的特异性，图4B显示了对照抗体检测神经前体细胞的免疫荧光结果，图4C显示了本发明抗体检测神经前体细胞的免疫荧光结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种源于PRRT2的抗原表位，实验结果表明，使用包含该抗原表位的多肽免疫动物，能够制备出对PRRT2特异性强、灵敏度度高的抗PRRT2抗体。而且该抗体对检测方法的适用性广，可用于westernblot分析、细胞免疫荧光检测、组织免疫荧光检测和免疫共沉淀(IP)分析等。

术语

PRRT

PRRT家族包括PRRT1、PRRT2、PRRT3、PRRT4，其中PRRT2(proline-richtransmembraneprotein2)包含4个外显子，共3794bp，编码一个由340个氨基酸组成的跨膜蛋白/膜蛋白，UCSC上的序列编号为NM_145239。PRRT2主要在大脑表达，尤其是基底节区，其功能不详，编码的蛋白与SNAP25(synaptosomal-associatedprotein)是互做蛋白。SNAP25蛋白是一种突触相关膜蛋白，参与轴突发生、钙离子依赖性神经递质胞吐作用、神经递质(乙酰胆碱、GABA、谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、胰岛素)等的分泌和循环过程、突触发生的调节，且SNAP25的过表达可抑制钾离子通道蛋白的活性。

在本发明中，术语“PRRT2”、“PRRT2蛋白”具有相同的含义。在本发明的一个优选地实施方式中，天然PRRT2的氨基酸序列为：

MAASSSEISEMKGVEESPKVPGEGPGHSEAETGPPQVLAGVPDQPEAPQPGPNTTAAPVDSGPKAGLAPETTETPAGASETAQATDLSLSPGGESKANCSPEDPCQETVSKPEVSKEATADQGSRLESAAPPEPAPEPAPQPDPRPDSQPTPKPALQPELPTQEDPTPEILSESVGEKQENGAVVPLQAGDGEEGPAPEPHSPPSKKSPPANGAPPRVLQQLVEEDRMRRAHSGHPGSPRGSLSRHPSSQLAGPGVEGGEGTQKPRDYIILAILSCFCPMWPVNIVAFAYAVMSRNSLQQGDVDGAQRLGRVAKLLSIVALVGGVLIIIASCVINLGVYK

(SEQIDNO.:2)；

其编码多核苷酸序列为：

ATGGCAGCCAGCAGCTCTGAGATCTCTGAGATGAAGGGGGTTGAGGAGAGTCCCAAGGTTCCAGGCGAAGGGCCTGGCCATTCTGAAGCTGAAACTGGCCCTCCCCAGGTCCTAGCAGGGGTACCAGACCAGCCAGAGGCCCCGCAGCCAGGTCCAAACACCACTGCGGCCCCTGTGGACTCAGGGCCCAAGGCTGGGCTGGCTCCAGAAACCACAGAGACCCCGGCTGGGGCCTCAGAAACAGCCCAGGCCACAGACCTCAGCTTAAGCCCAGGAGGGGAATCAAAGGCCAACTGCAGCCCCGAAGACCCATGCCAAGAAACAGTGTCCAAACCAGAAGTGAGCAAAGAGGCCACTGCAGACCAGGGGTCCAGGCTGGAGTCTGCAGCCCCACCTGAACCAGCCCCAGAGCCTGCTCCCCAACCAGACCCCCGGCCAGATTCCCAGCCTACCCCCAAGCCAGCCCTTCAACCAGAGCTCCCTACCCAGGAGGACCCCACCCCTGAGATTCTGTCTGAGAGTGTAGGGGAAAAGCAAGAGAATGGGGCAGTGGTGCCCCTGCAGGCTGGTGATGGGGAAGAGGGCCCAGCCCCTGAGCCTCACTCACCACCCTCAAAAAAATCCCCCCCAGCCAATGGGGCCCCCCCCCGAGTGCTGCAGCAGCTGGTTGAGGAGGATCGAATGAGAAGGGCACACAGTGGGCATCCAGGATCTCCCCGAGGTAGCCTGAGCCGCCACCCCAGCTCCCAGCTGGCAGGTCCTGGGGTGGAGGGGGGTGAAGGCACCCAGAAACCTCGGGACTACATCATCCTTGCCATCCTGTCCTGCTTCTGCCCCATGTGGCCTGTCAACATCGTGGCCTTCGCTTATGCTGTCATGTCCCGGAACAGCCTGCAGCAGGGGGACGTGGACGGGGCCCAGCGTCTGGGCCGGGTAGCCAAGCTCTTAAGCATCGTGGCGCTGGTGGGGGGAGTCCTCATCATCATCGCCTCCTGCGTCATCAACTTAGGCGTGTATAAGTGA(SEQIDNO.:1)

突变的PRRT2的氨基酸序列为：

第一种突变类型：

PKD-(CDS573dupT)：192fs8

MAASSSEISEMKGVEESPKVPGEGPGHSEAETGPPQVLAGVPDQPEAPQPGPNTTAAPVDSGPKAGLAPETTETPAGASETAQATDLSLSPGGESKANCSPEDPCQETVSKPEVSKEATADQGSRLESAAPPEPAPEPAPQPDPRPDSQPTPKPALQPELPTQEDPTPEILSESVGEKQENGAVVPLQAGDWGRGPSP(SEQIDNO.:8)

其对应的编码多核苷酸序列为：

ATGGCAGCCAGCAGCTCTGAGATCTCTGAGATGAAGGGGGTTGAGGAGAGTCCCAAGGTTCCAGGCGAAGGGCCTGGCCATTCTGAAGCTGAAACTGGCCCTCCCCAGGTCCTAGCAGGGGTACCAGACCAGCCAGAGGCCCCGCAGCCAGGTCCAAACACCACTGCGGCCCCTGTGGACTCAGGGCCCAAGGCTGGGCTGGCTCCAGAAACCACAGAGACCCCGGCTGGGGCCTCAGAAACAGCCCAGGCCACAGACCTCAGCTTAAGCCCAGGAGGGGAATCAAAGGCCAACTGCAGCCCCGAAGACCCATGCCAAGAAACAGTGTCCAAACCAGAAGTGAGCAAAGAGGCCACTGCAGACCAGGGGTCCAGGCTGGAGTCTGCAGCCCCACCTGAACCAGCCCCAGAGCCTGCTCCCCAACCAGACCCCCGGCCAGATTCCCAGCCTACCCCCAAGCCAGCCCTTCAACCAGAGCTCCCTACCCAGGAGGACCCCACCCCTGAGATTCTGTCTGAGAGTGTAGGGGAAAAGCAAGAGAATGGGGCAGTGGTGCCCCTGCAGGCTGGTGATTGGGGAAGAGGGCCCAGCCCCTGAGCCTCACTCACCACCCTCAAAAAAATCCCCCCCAGCCAATGGGGCCCCCCCCCGAGTGCTGCAGCAGCTGGTTGAGGAGGATCGAATGAGAAGGGCACACAGTGGGCATCCAGGATCTCCCCGAGGTAGCCTGAGCCGCCACCCCAGCTCCCAGCTGGCAGGTCCTGGGGTGGAGGGGGGTGAAGGCACCCAGAAACCTCGGGACTACATCATCCTTGCCATCCTGTCCTGCTTCTGCCCCATGTGGCCTGTCAACATCGTGGCCTTCGCTTATGCTGTCATGTCCCGGAACAGCCTGCAGCAGGGGGACGTGGACGGGGCCCAGCGTCTGGGCCGGGTAGCCAAGCTCTTAAGCATCGTGGCGCTGGTGGGGGGAGTCCTCATCATCATCGCCTCCTGCGTCATCAACTTAGGCGTGTATAAGTGA(SEQIDNO.:7)

第二种突变类型：

PKD-(CDSC487T)：163X

MAASSSEISEMKGVEESPKVPGEGPGHSEAETGPPQVLAGVPDQPEAPQPGPNTTAAPVDSGPKAGLAPETTETPAGASETAQATDLSLSPGGESKANCSPEDPCQETVSKPEVSKEATADQGSRLESAAPPEPAPEPAPQPDPRPDSQPTPKPALQPELPT(SEQIDNO.:10)

其对应的编码多核苷酸序列为：

ATGGCAGCCAGCAGCTCTGAGATCTCTGAGATGAAGGGGGTTGAGGAGAGTCCCAAGGTTCCAGGCGAAGGGCCTGGCCATTCTGAAGCTGAAACTGGCCCTCCCCAGGTCCTAGCAGGGGTACCAGACCAGCCAGAGGCCCCGCAGCCAGGTCCAAACACCACTGCGGCCCCTGTGGACTCAGGGCCCAAGGCTGGGCTGGCTCCAGAAACCACAGAGACCCCGGCTGGGGCCTCAGAAACAGCCCAGGCCACAGACCTCAGCTTAAGCCCAGGAGGGGAATCAAAGGCCAACTGCAGCCCCGAAGACCCATGCCAAGAAACAGTGTCCAAACCAGAAGTGAGCAAAGAGGCCACTGCAGACCAGGGGTCCAGGCTGGAGTCTGCAGCCCCACCTGAACCAGCCCCAGAGCCTGCTCCCCAACCAGACCCCCGGCCAGATTCCCAGCCTACCCCCAAGCCAGCCCTTCAACCAGAGCTCCCTACCTAGGAGGACCCCACCCCTGAGATTCTGTCTGAGAGTGTAGGGGAAAAGCAAGAGAATGGGGCAGTGGTGCCCCTGCAGGCTGGTGATGGGGAAGAGGGCCCAGCCCCTGAGCCTCACTCACCACCCTCAAAAAAATCCCCCCCAGCCAATGGGGCCCCCCCCCGAGTGCTGCAGCAGCTGGTTGAGGAGGATCGAATGAGAAGGGCACACAGTGGGCATCCAGGATCTCCCCGAGGTAGCCTGAGCCGCCACCCCAGCTCCCAGCTGGCAGGTCCTGGGGTGGAGGGGGGTGAAGGCACCCAGAAACCTCGGGACTACATCATCCTTGCCATCCTGTCCTGCTTCTGCCCCATGTGGCCTGTCAACATCGTGGCCTTCGCTTATGCTGTCATGTCCCGGAACAGCCTGCAGCAGGGGGACGTGGACGGGGCCCAGCGTCTGGGCCGGGTAGCCAAGCTCTTAAGCATCGTGGCGCTGGTGGGGGGAGTCCTCATCATCATCGCCTCCTGCGTCATCAACTTAGGCGTGTATAAGTGA(SEQIDNO.:9)

活性多肽

如本文所用，术语“PRRT2抗原”、“PRRT2抗原肽”、“多肽抗原”可互换使用。指多肽序列来自于PRRT2蛋白的多肽。

如本文所用，术语“本发明的PRRT2抗原”、“本发明PRRT2抗原肽”可互换使用，指可结合于抗PRRT2抗体的抗原肽(如SEQIDNO:4或6所示的多肽)。

在本发明的一个优选地实施方式中，根据本发明的所述PRRT2抗原肽的氨基酸序列如下所示：

MAASSSEISEMKGVEESPKVPGEGPGHSEAETGPPQVLAGVPDQPEAPQPGPNTTAAPVDSGPKAGLAPETTETPAGASETAQATDLSLSPGGESKANCSPEDPCQETVSKPEVSKEATADQGSRLESAAPPEPAPEPAPQPDPRPDSQPTPKPALQPELPT(SEQIDNO.:4)；

其编码多核苷酸序列如下；

ATGGCAGCCAGCAGCTCTGAGATCTCTGAGATGAAGGGGGTTGAGGAGAGTCCCAAGGTTCCAGGCGAAGGGCCTGGCCATTCTGAAGCTGAAACTGGCCCTCCCCAGGTCCTAGCAGGGGTACCAGACCAGCCAGAGGCCCCGCAGCCAGGTCCAAACACCACTGCGGCCCCTGTGGACTCAGGGCCCAAGGCTGGGCTGGCTCCAGAAACCACAGAGACCCCGGCTGGGGCCTCAGAAACAGCCCAGGCCACAGACCTCAGCTTAAGCCCAGGAGGGGAATCAAAGGCCAACTGCAGCCCCGAAGACCCATGCCAAGAAACAGTGTCCAAACCAGAAGTGAGCAAAGAGGCCACTGCAGACCAGGGGTCCAGGCTGGAGTCTGCAGCCCCACCTGAACCAGCCCCAGAGCCTGCTCCCCAACCAGACCCCCGGCCAGATTCCCAGCCTACCCCCAAGCCAGCCCTTCAACCAGAGCTCCCTACCTGA(SEQIDNO.:3)。

在本发明的另一个优选地实施方式中，根据本发明的所述PRRT2抗原肽的氨基酸序列如下所示：

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSLVPRMAASSSEISEMKGVEESPKVPGEGPGHSEAETGPPQVLAGVPDQPEAPQPGPNTTAAPVDSGPKAGLAPETTETPAGASETAQATDLSLSPGGESKANCSPEDPCQETVSKPEVSKEATADQGSRLESAAPPEPAPEPAPQPDPRPDSQPTPKPALQPELPT(SEQIDNO.:6)；

其编码多核苷酸序列如下；

ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCTGGTTCCGCGTATGGCAGCCAGCAGCTCTGAGATCTCTGAGATGAAGGGGGTTGAGGAGAGTCCCAAGGTTCCAGGCGAAGGGCCTGGCCATTCTGAAGCTGAAACTGGCCCTCCCCAGGTCCTAGCAGGGGTACCAGACCAGCCAGAGGCCCCGCAGCCAGGTCCAAACACCACTGCGGCCCCTGTGGACTCAGGGCCCAAGGCTGGGCTGGCTCCAGAAACCACAGAGACCCCGGCTGGGGCCTCAGAAACAGCCCAGGCCACAGACCTCAGCTTAAGCCCAGGAGGGGAATCAAAGGCCAACTGCAGCCCCGAAGACCCATGCCAAGAAACAGTGTCCAAACCAGAAGTGAGCAAAGAGGCCACTGCAGACCAGGGGTCCAGGCTGGAGTCTGCAGCCCCACCTGAACCAGCCCCAGAGCCTGCTCCCCAACCAGACCCCCGGCCAGATTCCCAGCCTACCCCCAAGCCAGCCCTTCAACCAGAGCTCCCTACCTGA(SEQIDNO.:5)

此外，所述术语还包括具有结合抗PRRT2的抗体功能的、SEQIDNO：4或6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括PRRT2抗原肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与抗PRRT2的抗体相结合的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与本发明的PRRT2抗原肽的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln

Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还提供PRRT2抗原肽的类似物。这些类似物与SEQIDNO:4或6所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明还涉及编码PRRT2抗原肽的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQIDNO:4或6所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:4或6所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

在较佳的实施方式中，本发明的编码PRRT2抗原肽的多核苷酸序列如SEQIDNO.:3或5所示。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一优选例中，本发明PRRT2抗原肽，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的PRRT2抗原肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码PRRT2抗原肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

本发明中所涉及的抗原肽、核酸、载体和细胞包括体外分离的形式。

药物组合物和施用方法

本发明的抗原肽或融合蛋白可作为免疫原在体内诱导产生抗PRRT2的抗体。此外，本发明抗原肽具有优异的特异性和免疫活性，故可用于制备免疫治疗或预防的疫苗。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物(包括疫苗组合物)，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐(或其编码序列)；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为注射剂。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，PRRT2抗原肽或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入人的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于预防或治疗时，作为活性成分的PRRT2抗原肽或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待预防或治疗的每个对象(病人)的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明制备的PRRT2抗体具备灵敏度高、特异性强的特点，可用于westernblot、免疫共沉淀、细胞免疫荧光分析和组织免疫荧光分析，能更全面、更有效地用于PRRT2蛋白质的研究工作。

(2)本发明制备的PRRT2抗体可用于PRRT2在组织和细胞中表达规律分析、PRRT2在细胞内定位的示踪、PRRT2与其他蛋白质之间相互作用等研究中。

(3)使用本发明的抗原肽制备的PRRT2抗体，在westernblot实验中，能够根据分子量的大小区分正常和突变的PRRT2，能够从细胞水平上识别PRRT2的突变导致的其亚细胞定位的变化；

(4)本发明经过大量地、系统地分析了PRRT2多肽，意外地发现使用源于PRRT2的SEQIDNO.:4或6所示的抗原肽，制备的抗体既能识别正常PRRT2蛋白，又能识别突变型PRRT2蛋白；

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实验材料

本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得，其中，菌株E.coliBL21(DE3)pLysS购自天根生物科技公司，货号为CB105-2；质粒pGEX-4T-1购自GEHealthcare，货号为28-9545-49；COS7细胞来源于非洲绿猴肾成纤维细胞，购自ATCCCRL-1651；对照的兔抗-PRRT2抗体，购自SIGMA。

实施例1制备抗PRRT2抗体

(1)抗原的设计、克隆和表达

A.根据实验需要和抗原决定簇的选择条件，经系统分析和大量筛选，确定能够特异性识别人正常和突变型PRRT2蛋白的抗原表位。抗原表位的氨基酸序列如SEQIDNO.:4所示。

B.设计合适的引物，克隆得到上述PRRT2抗原表位的DNA序列。

引物序列如下表所示：

克隆所得的DNA序列如SEQIDNO.:1所示，经测序，所得DNA序列与预期相符。

C.以pGEX-4T-1质粒(该质粒可以购自GEHealthcare，货号为28-9545-49)为表达载体，构建抗原的表达质粒。

D.摸索合适的条件，诱导PRRT2(抗原)的表达。

以E.coliBL21(DE3)pLysS菌株为宿主细胞，将构建好的表达质粒转化到宿主细胞。10ml菌液(LB)摇菌过夜，然后按1：30接种于250mlYTA(准备4X250mlYTA，分4组同时摇菌)，摇2～3h；在30℃0.1mMIPTG的诱导条件下诱导3h。

(2)抗原的纯化和富集

A.10000g离心3min收集诱导PRRT2表达的菌体。用10ml预冷的PBS重悬菌体，按1：100加入PMSF(终浓度1mM)或1：50加入proteinaseinhibitorcocktail(混合型蛋白酶抑制剂)。超声裂细胞，强度：40-50；时间：10-12min；间隔：2s。若时间不够可以延时，直至溶液澄清停止超声。

B.超声后加入1％TritonX-100，10000g离心10min，沉淀细胞碎片。取上清，收集到一支新的离心管。

C.离心期间处理GST-beads(商品名：GlutathioneSepharose4B，每毫升可结合5-10mg蛋白)，取200ulbeads，加入1mlPBS，4℃，500g离心5min，洗三次。

D.将离心后的菌液上清与处理后的beads混匀，4℃，旋转结合3-6h。

E.4℃，500g离心5min沉淀beads，吸出上清，beads用1mlPBS洗三次，每次4℃旋转5-10min。

F.将4个试管中的beads集中在一起，用2-4mlGSTElutionBuffer(ElutionBuffer：50mMTris-cl，10mMGlutathione)洗脱，4℃转动1-2h，离心收上清，上清液即为含有GST-PRRT2融合蛋白的洗脱液。此后可以通过考马斯亮蓝染色定量。

G.将制得的融合蛋白(抗原肽)进行电泳检测，结果如图1所示，图中泳道1为分子量标记、泳道2-4为纯化洗脱后的PRRT2-GST样品、泳道5为PRRT2-GST从GST-beads上洗脱后beads上残余的蛋白样品、泳道6为蛋白混合液和GST-beads结合后上清液的蛋白样品、泳道7为超声破碎后的细胞裂解液、泳道8为2μg0.1％的BSA、泳道9为5μg0.1％的BSA、泳道10为10μg0.1％的BSA，箭头所示的为目标条带。电泳结果表明，本实施例成功的制得了PRRT2-GST融合蛋白。

(3)抗体的获得、纯化和浓度测定

A.将富集的含PRRT2(抗原)的融合蛋白免疫实验用兔子，三轮免疫，第一次免疫时兔子为2.5-3月龄，两周后进行第二次免疫，三周后进行第三次免疫，免疫三周后取兔血清进行抗体的纯化。

B.通过亲和层析法纯化抗血清，利用LOWRY法测定抗体浓度。

经检测抗体浓度为1.12mg/ml。

实施例2抗体的应用效果检测

1.WesternBlot

以人流产胎儿脑组织为材料，通过WesternBlot实验，检测本抗体对组织中PRRT2的检测效果。

具体实验方法简述如下：

A.实验材料的获得和处理：以人流产胎儿脑组织(PRRT2高表达于神经系统)为材料，取不同部位的脑组织样品，用组织匀浆器破碎样品，提取蛋白质。

B.SDS-PAGE胶电泳分离混合液中各蛋白组分：将脑组织不同部位的蛋白质样品分别加样于10％SDS-PAGE胶，于80V电泳30min，然后以120V电泳1h。

C.转膜：采用invitrogeniBlotwesternblottingsystem转膜

D.一抗孵育：5％脱脂牛奶封闭纤维膜1-2h，加一抗anti-PRRT2(本发明制备的抗体)4℃孵育过夜。

E.二抗孵育：第二天，加荧光二抗室温孵育2h。

F.显色、压片及结果分析：二抗孵育后加显色液显色，压片，分析实验结果。

实验结果如图2所示，图2A中1-3为脑组织样本的WesternBlot结果。使用本发明的抗-PRRT2抗体进行实验。从图中可以看出本发明制备的抗体(anti-PRRT2抗体)可以清晰特异地检测出组织内PRRT2蛋白的表达情况，而且条带单一，说明本发明的抗体具有优异的特异性。

图2B中市场化销售的Anti-PRRT2抗体的WesternBlot结果，图中，FS-PKD-W、FS-PKD-T分别来源于两位PKD疾病患者的皮肤成纤维细胞，在60KD和100KD的位置可以检测到两条明显的条带，而且在FS-PKD-T实验组中100KD位置条带强度远大于60KD处的目标条带，说明该抗体特异性差，不能准确、特异地捕获待测的目的蛋白。目前市场化的抗体均存在此类问题，因此不能用于精确度高，灵敏性强的生物学实验。

2.IP(免疫共沉淀)

以流产胎儿的脑组织为材料，通过IP实验，检测本抗体在IP实验中的应用效果。

具体实验方法简述如下：

A.样品与IP抗体孵育：以1mg脑组织蛋白混合液为实验材料，分别以4μg本发明制备的PRRT2抗体和4μg正常兔IgG(对照实验)作为IP抗体，蛋白和相应抗体混匀后4℃摇晃孵育过夜。

B.与ProteinA/Gbeads结合：取ProteinA(nProteinASepharose^TM4FastFlow，GEHealthcare)和ProteinG(ProteinGSepharose^TM4FastFlow，GEHealthcare)各15μl，混合摇匀，加入与IP抗体孵育后的蛋白裂解液，4℃摇晃孵育4-8h或过夜。

C.清洗ProteinA/Gbeads：免疫沉淀反应后，4℃，500g离心3min，将beads离心至管底。将上清小心吸去，用1ml裂解缓冲液洗beads3-4次。

D.SDS-PAGE电泳及Westernblotting检测IP效果：于beads中加入20μl2×PLB，沸水煮5分钟。SDS-PAGE电泳，转膜，应用本发明制备的抗体孵育，二抗孵育后检测IP实验的效果。

实验结果如图3所示，图3A所示为本发明制备的PRRT2抗体与蛋白裂解液孵育后免疫共沉淀的结果，图中“60μginput”为未经免疫共沉淀的原始蛋白裂解液，在此作为本实验是否正确操作的参考，有条带出现说明本实验操作正确；Ab-IgG为普通的兔血清来源的抗体，购自SantaCruz公司，由于该抗体不具备针对目的蛋白的特异性识别能力，因此不能捕获目的蛋白，图中没有出现条带；Ab-PRRT2为本发明的抗体，目标条带显著，说明本发明制备的抗体(ab-PRRT2抗体)可以高效特异地免疫沉淀得到组织内的PRRT2蛋白。

图3B所示为市场化销售的PRRT2抗体与蛋白裂解液孵育后免疫共沉淀的结果，从图中可以看出在60KD位置无特异性条带出现，说明该抗体不能特异性地捕获目的蛋白，因此不能用于免疫共沉淀中，限制了其使用范围，无法用于蛋白质之间的相互作用和蛋白质的表观遗传修饰等研究中。

3.免疫荧光染色

体外过表达PRRT2-FLAG融合蛋白，通过免疫荧光染色实验，检测本抗体的特异性。

具体实验方法简述如下：

A.PRRT2-FLAG质粒的制备：以带FLAG标签的p3XFLAG-CMV^TM-14(购自SIGMA公司)作为载体，将PCR(以PKD疾病患者的cDNA为模板)得到的PRRT2基因作为插入片段，在连接酶的作用下，经连接反应得到PRRT2-FLAG质粒。

B.COS7细胞中过表达PRRT2-FLAG融合蛋白：用2000TransfectionReagent(lifetechnologies)进行PRRT2-FLAG表达质粒的细胞转染。

C.细胞的固定、通透和封闭：细胞在培养皿中的密度达到约80％时，用4％PFA固定细胞15min，然后用0.2％tritonX-100通透细胞15min，再用3％BSA封闭30min。

D.抗体孵育：用本发明制备的PRRT2抗体和抗FLAG的抗体为一抗于4℃共染孵育过夜，用激发产生红色荧光信号(荧光Cy3标记)以及激发产生绿色荧光信号(荧光FITC标记)的荧光抗体为二抗于37℃共孵育1-2h。

E.封片及镜检：DAPI染液进行5min细胞核染色，然后用封片剂(DAKOFMM)封片，共聚焦显微镜下观察抗体和细胞内目的蛋白的结合情况。

实验结果如图4所示，图4A所示为在COS7细胞中过表达PRRT2-FLAG融合蛋白的免疫荧光染色结果，从图中可以看出本发明制备的PRRT2抗体能够与抗FLAG抗体共定位，在COS7细胞中表达的PRRT2-FLAG融合蛋白主要定位于细胞膜上，表明本发明制备的PRRT2抗体能够特异性地检测细胞中的PRRT2。

图4B所示为市场化销售的PRRT2抗体，在神经前体细胞中的免疫荧光染色结果，DAPI为细胞核的分子标记，PAX6为神经前体细胞的分子标记，MERGE为DAPI、PAX6以及PRRT2三张照片叠加的照片。从图中可以看出该PRRT2抗体结合荧光信号的强度非常弱，无法准确地在细胞水平上反映目的蛋白的表达水平。

图4C所示为本发明制备的PRRT2抗体在神经前体细胞中的免疫荧光染色结果。从图中可以看出本发明制备的PRRT2抗体与细胞中目的蛋白的特异性结合能力强，并具有较强的结合荧光信号的能力，通过imageJ软件对荧光信号强度进行量化，量化后的结果表明本发明制备的PRRT2抗体的荧光强度是商品化抗体荧光强度的17.6倍，可以用于免疫荧光染色检测细胞中PRRT2的表达情况。

讨论

本发明人通过系统分析PRRT2基因，对源于PRRT2的多肽片段进行筛选，最终获得了SEQIDNO.:4或6所示的多肽片段。以该抗原表位编码序列构建抗原表位表达载体，以其表达的产物免疫兔子，所产生的抗体制备的PRRT2抗体具备灵敏度高、特异性强的特点，可用于westernblot、免疫共沉淀、细胞免疫荧光分析和组织免疫荧光分析，能更全面、更有效地用于PRRT2蛋白质的研究工作，而且其既能识别正常PRRT2蛋白，又能识别突变型PRRT2蛋白。由于突变蛋白分子被截短，在westernblot实验中，本发明能够根据分子量的大小区分正常和突变的PRRT2；由于PRRT2分子的跨膜区位于被截断的区域，所以正常蛋白和突变蛋白在细胞中有不同的定位，在细胞荧光免疫实验中，本发明能够从细胞水平上证明PRRT2的突变会导致其亚细胞定位的变化。

目前，本发明已用于PRRT2在组织和细胞中表达规律分析、PRRT2在细胞内定位的示踪、PRRT2与其他蛋白质之间相互作用等研究中。

综上所述，本发明制备的抗人PRRT2抗体对于阐明PRRT2的生物学特性，揭示与PRRT2突变相关的运动障碍疾病的发病机理具有重要意义。同时，高质量、高特异性的PRRT2抗体也可用于与PRRT2基因突变相关的运动障碍疾病的药物筛选，为PRRT2基因突变导致的运动障碍疾病的治疗开拓新的途径。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽源自PRRT2蛋白，并且所述抗原表位肽的氨基酸长度为100-200个氨基酸；优选地，所述的抗原表位肽的氨基酸序列选自下组：

(A)具有SEQIDNO:4或6所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQIDNO:4或6中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽具有与抗PRRT2蛋白抗体的结合能力；

(C)将SEQIDNO:4或6中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留与抗PRRT2蛋白抗体的结合能力的衍生多肽。

2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有权利要求1所述的抗原肽和任选的标签序列。

3.一种抗体，其特征在于，所述抗体特异性的结合权利要求1所述的抗原表位肽或权利要求2所述的融合蛋白，并且所述抗体能够特异性地结合天然的PRRT2蛋白和/或突变的PRRT2蛋白。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1中所述的抗原肽或权利要求2所述的融合蛋白或权利要求3中所述的抗体。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求8所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的抗体、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的表达载体或者权利要求6所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

8.权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的表达载体或者权利要求6所述的宿主细胞的用途，

(a)用于制备针对所述PRRT2蛋白的抗体；和/或

(b)用于制备治疗与所述PRRT2蛋白相关的疾病的药物。

9.权利要求3所述的抗体的用途，用于

(1)PRRT2蛋白的分离纯化；或

(2)非诊断目的PRRT2蛋白的检测；或

(3)制备检测PRRT2蛋白的试剂或试剂盒。

10.一种制备抗PRRT2蛋白抗体的方法，其特在于，包括步骤：

(1)使用权利要求1所述的抗原表位肽或权利要求2所述的融合蛋白作为抗原免疫动物，并在动物体内产生抗PRRT2蛋白的抗体；

(2)分离纯化所述抗PRRT2蛋白的抗体。