KR19980703438A - 성장 촉진 특성을 지닌 펩티드 - Google Patents
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Abstract
돼지 소마토트로핀(pST)의 해당 영역을 모방하며, pST 활성을 강화시키고, 온혈 동물의 성장을 촉진시키는, 잘-정의된 2 차 구조, 바람직하게는 나선 구조를 가지는 펩티드에 관하여 기술한다. 이들 펩티드는 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위하여 pST와 경쟁한다. 이들 펩티드는, 필수 아미노산의 위치가 나선을 따라 거의 한 회전을 나타내는 세 개의 아미노산에 의하여 이동되며, 천연 pST 서열과 상이한 아미노산 서열 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Val (서열 번호 18) 뿐 아니라, 천연 pST의 서열과 상이한 아미노산 서열 Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Val-Xaa-Xaa (서열 번호 1)의 서열을 함유한다.
Description
돼지 소마토트로핀(pST)은 다양한 생물학적 활성을 가지는(문헌 목록 제 1) 191 아미노산 길이의 뇌하수체 호르몬이다. 이 호르몬은 네 개의 역평행 α-나선으로 정렬된 단일 체인 폴리펩티드로 존재한다 (2). 각각의 α-나선은 한 회전 당 3.6 개의 아미노산을 함유한다. 이러한 주기성은 나선의 동일 면 상에 세 개 내지 네 개의 잔기를 위치시킨다.
사육 동물에의 pST의 투여는 근육 성장, 사료의 효율을 증가시키며, 지방 축적을 감소시킨다 (3,4). 내인성 pST의 양은 적다; 따라서, 대규모 농업용 외인성 pST의 제조에 초점이 집중되어 왔다. 외인성 pST 이용의 보급은 제조 및 투여의 어려움으로 인하여 방해되어 왔다. 장기간의 이식은 pST 분자의 안정화 및 시간의 경과에 따른 pST 방출의 조절을 필요로 한다. 대안적으로, pST의 매일 또는 주기적인 주입은 pST의 이익을 비경제적으로 만드는 노동 비용을 수반한다. 상기 어려움을 감소시키기 위한 노력은 pST 활성을 상승시키는 성분의 추가를 통하여 요구되는 pST의 양을 감소시키는 것을 수반한다.
소마토트로핀과 복합체를 형성하는 단일 클론 및 다-클론성 항체는 생체 내에서 소마토트로핀의 생물학적 활성을 더욱 강화시키는 것으로 보고되었다 (5 내지 9). 항체-매개의 성장 촉진 기작은 전적으로 명백하지는 않으나, 소마토트로핀의 생-분포 및/또는 변형된 약제 역학이 부분적으로 성장 촉진 현상을 설명하기 위하여 제안되어 왔다 (10). 촉진이, 항체에 의한 소마토트로핀 수용체의 하위클래스에의 결합의 선택적 변조로 인함이 또한 제안되어 왔다 (5,6,11,12). 간 소마토트로핀 수용체에 결합하는 소마토트로핀의 향상 또한 가능한 설명으로 보고되었다 (13). 외인성 pST의 부재 하에, 이러한 항체 자체는 성장을 촉진시키지 않는다는 것은 주목할 만 하다.
동물의 성장을 면역학적으로 증가시키려는 시도는, pST의 부재 하에 그 자체로는 성장을 증가시키지 않으나, 뇌하수체-절개된 (hypox) 분석 래트 (10) 내 pST의 생물학적 활성을 증가시키는, PS-7.6으로 지정된 단일 클론성 항체를 생산하여 왔다. 그러나, 이러한 성장-강화 단일 클론성 항체를 이용한 사육 동물의 수동면역법은, 단일 클론성 항체 및 항체의 다수 투약에 요구되는 노동 비용으로 인하여, 경제적으로 최적의 것이 아니다.
따라서, 현재 접근의 어려움을 감소시키는 성장 촉진에의 새로운 접근이 요구된다. 그러한 접근 중 하나는 PS-7.6 단일 클론성 항체에 결합하는 pST 영역을 모방하는 펩티드의 설계를 수반한다. PS-7.6 단일 클론성 항체에 의하여 인식되는 에피토프에 해당하는 펩티드 단편을 이용한 동물의 능동면역법은, 내인성 pST 활성을 강화시키기 위하여, PS-7.6 단일 클론성 항체와 기능면에서 유사한 항체를 생성하여야 한다. 따라서, PS-7.6 단일 클론성 항체에 의하여 인식되는 에피토프의 식별은 동물 성장을 촉진시키는 펩티드 백신의 설계에 결정적이다. 대부분의 펩티드는 천연 단백질의 1 차 구조를 가지나, 2 차 구조가 결여되어 있다. 짧은 펩티드는 전형적으로 용액 내에서 신속한 상호-전환 구조로서(랜덤 코일) 존재한다. 요구되는 pST 영역과 유사한 구조는, 주어진 시간에 펩티드의 단지 소-분획 내에 존재할 것이다. 따라서, 정의된 2 차 구조를 가지는 펩티드를 설계할 필요가 있다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 목적은 해당 pST 영역을 모방하는 잘 정의된 2 차 구조, 바람직하게는 나선 구조를 가지는 펩티드를 설계하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위하여 pST와 경쟁하는 펩티드를 설계하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 온혈 동물의 성장 촉진을 위하여 이러한 펩티드를 이용하는 조성물을 개발하는 것이다.
본 발명의 상기 목적은, 천연의 pST 서열과 상이한 아미노산 Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Val-Xaa-Xaa (서열번호 1) 서열을 함유하는 펩티드를 통하여 달성된다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 첫번째 또는 두번째 루신 또는 발린 하나 이상이 정상적인 (직쇄) 루신(Nle)으로 대체되어 있는 펩티드를 포함한다. 본 발명은 또한, 천연 pST 서열과 상이한 아미노산 서열 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa- Val (서열번호 18)을 함유하며, 나선을 따라 거의 한 회전을 나타내는 세 개의 아미노산에 의하여 필수 아미노산의 위치가 이동되는 펩티드에 관한 것이다. 서열번호 18의 펩티드는 세번째 아미노산 잔기를 이소루신으로 제한하여, 천연 pST 서열과 상이한 아미노산 서열: Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Val (서열번호 19)을 생성함으로써, 추가로 변형된다.
이들 펩티드는 바람직하게는 나선 구조의 프로모터로서 서열번호 1의 첫번째 루신의 아미노-말단 및 서열번호 19의 첫번째 이소루신의 아미노-말단에 접한 아미노산인 세린을 함유한다.
본 발명의 펩티드는 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께, 온혈 동물의 성장을 촉진시키기 위한 방법 내의 조성물을 제조하는데에 사용된다.
본 발명은 돼지 소마토트로핀의 활성을 강화하고, 온혈 동물의 성장을 촉진시키는 항체를 유도하는 펩티드에 관한 것이다.
도 1은, PS-7.6 단일 클론성 항체로 배양되고, 자성화된 염소 항-마우스 IgG 항체에 의하여 면역-침전되고, SDS-PAGE에 투입되고, PVDF 막 상으로 전기블랏팅되고, 토끼 항-pST 다-클론성 항체 및 요오드화된 당나귀 항-토끼 IgG 항체를 이용하여 탐침되어, 마침내 x-레이 필름 및 방사선촬영술에 노출된 트립신 분해물 (레인 1), 분획 #9 (레인 2) 및 #9-5 (레인 3)을 도시한다.
도 2는, 합성되어, 경쟁적인 RIA 내에서125I-pST 펩티드와 PS-7.6 단일 클론성 항체와의 상호 작용에 대한 억제 효과에 관하여 시험되는, pST(70-95), pST(64-95) 및 pST(54-95) (도 2A), 및 pST(75-95) 및 pST(75-90) (도 2B)을 도시한다. 손상되지 않은 pST 또한 시험되고, 양성 대조군으로서 작용한다.
도 3은, (1) pGH(75 내지 95) 펩티드, (2) pGH(80 내지 90) 및 (3) pGH(80 내지 90)펩티드와 비교하여, 방사선-표지된 pST의 PS-7.6 단일 클론성 항체에 결합하기 위한 경쟁을 측정하는 방사선-면역학적 분석의 결과에 대하여 도시한다.
도 4는, 아미노산 잔기 75 내지 90이 연속적으로 알라닌으로 대체된 pST(75-95)단편의 아미노산에 대하여 도시한다. 이들 동족체는 경쟁 RIA에 의하여 시험된다. 각각의 잔기에 대한 효율적인 경쟁의 IC50은 다섯 개의 개별적 시험으로부터 평균된다.
도 5는 pST의 pST(75 내지 95)의 나선 투영도를 도시한다. 음영 원은 PS-7.6 단일 클론성 항체에 의한 인식에 결정적인 아미노산이다.
도 6은, (1) pST의 천연 아미노산 서열 75 내지 95(pGH(75 내지 95)로 언급)에 해당하는 펩티드, (2) 서열번호 2의 펩티드(펩티드-X로 언급) 및 (3) 아미노-말단 아미노기가 아세틸기의 첨가에 의하여 변형된 펩티드-X의 변형된 형태(캡핑된 펩티드-X로 언급)와 비교하여, 방사선-표지된 pST(도 5에서 pGH로 언급)의 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위한 경쟁을 측정하는 방사선-면역학적 분석의 결과를 도시한다.
도 7은, (1) pGH(75-95) 펩티드, 및 (2) 본 발명의 범위 밖인 서열번호 21의 펩티드(도 6에서 펩티드-Y로 언급)와 비교하여, 방사선-표지된 pST의 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위한 경쟁을 측정하는 방사선-면역학적 분석의 결과를 도시한다.
도 8은, (1) pGH(75-95) 펩티드, (2) 펩티드-X, (3) 펩티드-Y, 및 (4) 첫번째 루신이 정상적인 루신(Nle)으로 대체되어 서열번호 13을 생성하는 펩티드-X(도 7에서 Nle80으로 언급), (5) 두번째 루신이 정상적인 루신(Nle)으로 대체되어, 서열번호 14를 생성하는 펩티드-X (Nle87로 언급), 및 (6) 발린이 정상적인 루신(Nle)으로 대체되어, 서열번호 15를 생성하는 펩티드-X (Nle90으로 언급)과 비교하여, 방사선-표지된 pST의 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위한 경쟁을 측정하는 방사선-면역학적 분석의 결과를 도시한다.
도 9는, 어떠한 처리도 받지 않거나(음성 대조군, 첫번째 막대기); pST만으로 처리되거나(양성 대조군, 두번째 막대기); pST, 및 펩티드-X(서열번호 2)를 이용한 면역화 전후에 세 개의 상이한 돼지의 항체로 처리된 (세 개의 래트 그룹, 세번째 내지 여덟번째 막대기), 뇌하수체-절개된 래트의 성장에 대한 효과를 도시한다.
본 발명은 pST의 나선 영역을 모방하는 펩티드의 설계를 포함한다. 이들 펩티드는 나선 구조를 유지할 수 있도록 pST에 상응하는 최소의 서열을 가진다. 이들 모방 펩티드는 천연 pST를 인식할 수 있는 항체를 유도한다.
PS-7.6 단일 클론성 항체(천연 pST에 대해 상승)에 의하여 인식되는 에피토프를 함유하는 펩티드를 이용한 표적 동물 종의 면역법은 PS-7.6 단일 클론성 항체와 기능면에서 유사한 항체를 생산하며, 동물의 성장을 촉진한다.
PS-7.6 단일 클론성 항체에 의하여 인식되는 에피토프를 이용한 동물의 능동면역법은 PS-7.6 단일 클론성 항체의 수동적 투여에 대한 실행 가능한 대안이다. 상기 고안은, 촉진과 관련된 상이한 영역인 소마토트로핀 단편(잔기 135-154)을 이용한 양의 면역화가 저지방 근육 성장율을 증가시킴을 입증한 Pell et al (14)의 최근 보고서에 의하여 지지된다.
본 발명에서, PS-7.6 단일 클론성 항체에 결합하는 pST의 에피토프는 역상 액체 크로마토그래피 분리 및 면역성-침전과 결부된 pST의 제한된 트립신 분해에 의하여 맵핑된다. 그리고 나서, 에피토프의 일련의 연속적인 알라닌 동족체의 면역학적 분석에 의하여, PS-7.6 단일 클론성 항체와 상호 작용하는 에피토프의 결정적인 아미노산을 식별한다. PS-7.6으로 지정된 단일 클론성 항체에 의하여 인식되는 에피토프를 함유하는 펩티드는 재조합 pST에 대항하는 것이며, 뇌하수체-절개 래트 표본 내 pST의 성장 촉진 활성을 증가시키며, 돼지의 성장을 촉진시키는 것으로 나타난다.
아미노산 잔기 70-95에 상응하는 pST 단편(pST (2)의 두번째 나선을 함유)은 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 분리되며, 또한 PS-7.6 단일 클론성 항체에 의하여 면역-침전된다. 이 단편은 방사선-면역학적 분석(RIA)결과, PS-7.6 단일 클론성 항체에 결합하기 위하여 투여량에 의존하여 방사선-표지된 pST와 경쟁하는 것으로 발견된다. 그러나, pST(70-95)로 면역화된 돼지 혈청은 상당한 수준의 항-pST 항체를 증가시키지 않는다. 이러한 결과는 pST(70-95)의 구조가 실제 에피토프와 일치하지 않거나, 펩티드가 충분히 면역원성이지 않음을 암시한다.
pST(70-95)의 잠재적인 에피토프 영역을 포함하는 몇몇 펩티드가 합성되고 경쟁적 RIA에 의하여 분석된다. 그 결과는 pST(75-95)가 PS-7.6 단일 클론성 항체에 의하여 인식되는 최적의 서열임을 암시한다. 이와 대조적으로, pST(85-95)는 PS-7.6 단일 클론성 항체에 매우 약하게, 반복 불가능하게 결합하며, pST(81-95)는 전혀 결합하지 않는다. 펩티드 pGH(80-90)은 pGH(75-95)과 거의 마찬가지로 강하게 결합하는 반면, pGH(81-90)은 PS-7.6 단일 클론성 항체에 매우 약하게 결합한다. 더욱이, 펩티드가 pST(80-95)와 같이 너무 작다면, 결합이 우수할 지라도, 개별적 아미노산 잔기의 소수성으로 인하여 실질적인 응집이 일어난다. 응집 문제를 감소시키고 용해도를 향상시키기 위하여, 펩티드는 길어야 한다.
에피토프 영역 pST(75-95) 내의 펩티드 설계는 수많은 인자를 수반한다. 대부분의 펩티드는 천연 단백질의 1차 구조를 가지나, 2 차 구조가 결여되어 있다. 짧은 펩티드는 전형적으로 용액 내에서 신속한 상호-전환 구조로서(랜덤 코일) 존재한다. 요구되는 pST 영역과 유사한 구조가 주어진 시간에 펩티드의 단지 소-분획 내에 존재할 것이다.
설계의 목적은 나선 구조를 안정화시킴으로써, 단백질에 대한 항체의 친화력을 증가시키는 것이다. 이러한 친화력은 항체의 결합 영역과 단백질 상의 에피토프 간의 구조적 상보성을 필요로 한다.
항체 결합 영역과 접촉하는 아미노산 잔기는 치환에 비교적 내성이지 못하다. 루신의 이소루신으로의 대체는 항체에 결합하는 펩티드를 제거하기에 충분하다. 비-결정적인 잔기는, 요구되는 구조, 이 경우 펩티드로 하여금 천연 단백질의 구조를 더 잘 모방하도록 하는 α-나선 구조를 안정화시키거나 촉진시키는 잔기로 대체될 수 있다.
α-나선을 안정화시키기 위하여 사용되는 기술에는, (1)나선-사이의 소수성기 연결 (15); (2) 측쇄의 전하 간의 상호 작용 (16); (3) 디설파이드(17) 또는 락탐 결합(18)에 의한 측쇄 공유 결합; (4) 고-나선 성향의 아미노산 잔기 통합 (19); (5) 전하-나선 쌍극자 안정화 (20); (6) 펩티드의 말단-캡핑 (21) 및 금속 이온 측쇄 안정화 (22).
첫번째 루신의 중요성은, 펩티드(서열번호 2)의 첫번째 루신이 이소루신으로 대체되어 서열번호 21의 펩티드를 생산하는 하기 실시예 1에서 입증된다. 이와 대조적으로, 비-접촉 잔기는 자유롭게 대체되어, 여전히 효율적으로 결합할 수 있다. 따라서, 필수 항체 접촉 잔기를 식별한 후, 펩티드의 잔류 잔기를 대체함으로써, 안정한 나선 구조를 얻을 수 있다.
pST(75-90)의 각각의 잔기의 연속적인 알라닌 대체는, Leu80, Ile83및 Leu87과 Leu76또는 Val90의 잔기가 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합에 결정적임을 나타낸다(도 5의 나선 투영도에 도시된 바와 같이). 기타 잔기는 결합 친화력을 실질적으로 변화시키지 않고 알라닌으로 대체된다. 아미노산 75-95 영역은 pST의 두번째 나선을 포함하며, 결정적인 아미노산의 i 및 i+3 (i+7)의 반복 패턴은 나선의 소수성 측면에 결합하는 PS-7.6 단일 클론성 항체와 일치하는 것으로 보인다. 이는 펩티드로 하여금 i 및 i+3 패턴(거의 하나의 나선 회전) 모두를 이용하여 합성되는 것을 가능케 한다. PS-7.6 단일 클론성 항체에 의하여 인식되는 에피토프의 나선 구조 및 서열은 동물의 성장을 촉진시키기는데 효율적인 펩티드 백신의 설계를 위한 기초를 제공한다.
pST 및 펩티드는 다음과 같이 생성된다. 재조합 pST는 American Cyanamid Co., Pearl River, NY에 의하여 제조된다. 펩티드는 고체-상 자동 펩티드 합성기(9600, Milligen/Biosearch, Bedford, MA) 상에서 합성된다. 모든 시약은 Penisula Laboratories, Inc., Belmont. CA로부터 구입된다. 모든 펩티드는 수지 지지체로부터 분할된 후, C18 칼럼(Rainin Instrument Corp., Woburn, MA) 상에서 준비된 역-상 고-실행 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의하여 정제된다. 이들 펩티드의 순도는, 분석적 HPLC, FAB 질량 분광법 및 아미노산 조성 분석에 의하여 측정한 바에 의하면, 항상 97% 이상이다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드는 용액-상 화학적 합성 또는 적절한 숙주 내에서의 DNA 뉴클레오티드 서열의 재조합 발현과 같은 당업계에 공지된 기타 기술에 의하여 또한 작제될 수 있다. 재조합 발현은 또한 말토오즈-결합 단백질 또는 펩티드와 같이 펩티드의 담체에의 융합 형태일 수 있다.
항체-인식 영역의 맵핑은 종래에 항원의 효소적 분해(23.24) 또는 고체 지지체 상에 다수의 펩티드의 동시 합성(25)에 의하여 접근되어 왔다. 다수의 펩티드 합성을 이용한 초기의 시도는 성공적이지 못하였기 때문에, 본 연구에서는 PS-7.6 단일 클론성 항체의 에피토프 매핑을 완성하기 위하여, pST의 단백질 분해를 사용한다. 우선, pST를 37℃에서 키모트립신, 트립신 및 엔도프로티나아제 Glu-C 를 포함하는 다양한 프로테아제로 처리한다. 이들은 모두 소-pST 단편(m.w.4 kDa)을 생산한다. 이들 소-단편을 선별하는 이론적 근거는 장래의 펩티드 백신 후보의 고체-상 합성의 편리성이다. 그러나, PS-7.6 단일 클론성 항체는 RIA 및 Western Analysis에 의하여 이들 소-단편들을 인식하지 못한다. 더욱이, 짧은 단편은 일반적으로 구조적으로 유연하며, 용액 내에서 다양한 상호-전환 구조를 생산한다. 그 결과, 생성되는 항-펩티드 항체가 때때로 매우 저 효율을 가지는 상응하는 천연 단백질과 상호 작용한다.
효소적 분해의 초기 실험 결과는, PS-7.6 단일 클론성 항체에 의하여 인식되는 에피토프는 37℃에서 프로테아제에 매우 민감함을 나타낸다. pST의 2 차/3 차 구조가 이 온도에서 약간 폴딩되지 않음으로 인하여, 결정적인 에피토프 영역을 전체 분해를 위한 프로테아제에 노출시킬 수 있다. 효소적 분해 정도를 제한하여 비손상 PS-7.6 에피토프, 특히 루프 및 회전(26)을 보호하기 위하여, 반응 온도를 3 일간 25℃로 제한한다.
특히, 재조합 pST (100 mg)를, 25℃에서 3 일간, 200 ml 인산 완충제(pH 9.5) 내에서, 아가로오스와 가교된 1 ml의 소 췌장 트립신(충진된 겔의 ml 당 50 단위 효소 활성, Sigma Co., St. Louis, MO)을 이용하여 배양함으로써, 제한적-트립신 분해되도록 한다. 트립신 단편을 30 분 이내에 0 내지 100%의 B 완충제(A 완충제 = 물 내에 0.1% TFA; B 완충제 = 아세토니트릴 내에 0.1% TFA)의 선형 구배를 가지는 준비된 HPLC(C18 칼럼, 21.4 mm×25 cm, 유동율=24 ml/min., 235 nm에서 UV., Dyanamax-300A, Rainin)에 의하여 분리한다. 모든 단편을 수집하여, RIA에 의하여 분석함으로써, 활성 성분을 식별한다. 37℃ 분해시 존재하지 않는 주된 안정한 트립신이 생산되고, 이를 분획 #9로 지정한다. 이 분획은 18.89 분의 보유 시간으로 용출되고, 초기 pST 분해의 60% 산출을 포함한다. RIA에서, PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위하여,125I-pST와 경쟁함이 후에 발견되며, 이는 분획 #9가 PS-7.6 에피토프를 함유함을 암시하는 것이다. 분획 #9는 pH 9.5에서 0.1 M 암모늄 중탄산염 용액 내 10 몰의 과량의 디티오트레이톨에 의하여 더욱 감소되며, HPLC에 의하여 다시 분획화된다. #9-5로 지정되고 18.43 분의 보유 시간으로 용출되는 하나의 분획은 PS-7.6 단일 클론성 항체 결합을 위한125I-pST와의 경쟁력을 계속하여 나타낸다.
상기 샘플들을 분석하기 위하여, 면역성-침전 및 웨스턴 블랏팅 실험이 배합되어 수행된다. 트립신 분해물인 분획 #9 및 #9-5를 PS-7.6 단일 클론성 항체를 이용하여 37℃에서 60 분간 배양시킨다. 염소 항-마우스 IgG(Advanced Magnetics Inc., Cambridge, MA)로 코팅된 자기 구슬을 혼합물에 가하고, 실온에서 30 분간 가볍게 계속하여 흔들어 주면서 배양한다. 구슬을 수 회 세척하고, 자석에 의하여 수집한다. SDS-PAGE 샘플 완충제 내에서 끓임으로써, 단백질을 구슬로부터 분리하고, 16% 겔(PAGE, Novex, San Diego, CA) 상에서 감소된 트리스-트리신 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 가한다. 분리된 단백질 성분을, pH 11에서 20% 메탄올을 함유하는 10 mM 3-[시클로헥실아미노]-1-프로판설폰산(CAPS) 완충제 내에서, 겔로부터 폴리비닐리딘 디플루오라이드 미공 (PVDF) 막 (Applied Biosystem, Foster City, CA)상으로 전기-블랏팅한다. 막을 5%의 무지방 우유로 처리한 다음, 토끼 항-pST 다-클론성 항체 및 요오드화된 당나귀 항-토끼 IgG 항체(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)에 연속적으로 노출시킨다. 방사선촬영술의 개발을 위하여, PVDF 막을 마침내 x-레이 필름에 노출시킨다. 트립신 단편의 아미노산 서열을 측정하기 위하여, 막 블랏을 0.1% Coomassie, 40% 메탄올 및 10% 아세트산을 함유하는 용액으로 간단히 염색하고, 눈에 보이는 밴드를 절개한다. 상기 밴드를 기체-상 서열 분석기 (Applied Biosystem)의 상부 카트리지 블록 내에 단일층으로 정렬하고, Hankapiller Hood (27)의 방법에 의하여 페닐티오히단토인-유도 아미노산을 측정한다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
pST의 주성분은, 트립신을 이용한 제한적 분해 후, 10 kDa, 4 kDa 및 2.5 kDa (레인 1)의 부차적인 오염물을 가지는 15 kDa 물질임이 명백하다. 그러나, 이들 부차적인 성분이 강화되어, HPLC 분획화에 따르는 분획 #9 내에 주된 성분이 된다 (레인 2). 마침내, 2.5 kDa 단편이 분획 #9-5 내에 존재하는 유일한 성분으로 나타나며, 이는 PS-7.6 단일 클론성 항체에 의하여 인식되는 에피토프가 이 분획 내에 존재함(레인 3)을 암시한다. 그리고 나서, 2.5 kDa 단편을 서열 분석하면, pST의 아미노산 70-95에 상응함이 발견된다. 합성된 펩티드는 RIA에서 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위하여 투약-의존성 방식으로125I-pST와 경쟁할 수 있으므로(도 2), 이 단편의 면역학적 특성 및 화학적 구조는 고체-상 펩티드 합성에 의하여 확인된다(28). pST(70-95)에 의한 경쟁은 완전한 pST에 의한 것보다 대략 100 배 떨어지는 활성을 가진다.
정확한 에피토프를 특징짓기 위하여, 세 개의 추가적인 펩티드를 합성한다. N-말단의 아미노산 잔기를 연장함으로써, 펩티드 pST(54-95) 및 pST(64-95)가 제조되는 반면, pST(75-90)은 양 말단에서 잔기를 잘라냄으로써 생성된다. 이들 펩티드를 RIA 시험하면, 트립신 pST(70-95)와 비교하여 유사한 경쟁 효율을 보이며, 이는 75 내지 90 잔기가 에피토프를 함유함을 암시하는 것이다 (도 2). 이들 펩티드의 경쟁은, 아마도 짧은 펩티드 본래의 구조적 유연성 및 항체 인식에서의 기타 불연속 잔기의 수반으로 인하여, 대조 pST의 것보다 실질적으로 낮다.
별도의 경쟁 RIA는 Leu80잔기의 중요성을 확립한다. 도 3에 도시하는 바와 같이, 펩티드 pGH(80-90)은 pGH(75-95)와 거의 마찬가지로 강하게 PS-7.6 단일 클론성 항체에 결합하는 반면, pGH(81-90)은 매우 약하게 결합한다.
펩티드 항원의 구조적 유연성은 그들의 항원으로서의 실질적 유용성을 제한한다. 그러나, 펩티드의 구조적 유연성을 천연 단백질 항원의 2 차 구조를 모방하도록 제한함으로써, 상기 제한을 극복할 수 있다. 에피토프 내 모든 잔기가 반드시 항체 결합 영역과 접촉하지 않아도 되는 것으로 또한 알려져 있다 (29). PS-7.6 단일 클론성 항체 에피토프의 2 차 구조는 중요한 것으로 간주되기 때문에, PS-7.6 단일 클론성 항체와 상호 작용하는 pST(75-95) 단편의 아미노산 측쇄는 각각의 잔기를 알라닌으로 대체함으로써 측정된다. 펩티드 또는 단백질 내에서 나선 구조를 형성하려는 경향이 높은(30) 알라닌으로의 연속적 치환은 접근 가능한 pST(75-95)의 백본 구조를 쉽게 변화시키지 않을 것이다.
알라닌-스캐닝 돌연변이 유발로 호칭되는 상기 접근은, 그 수용체와 상호 작용하는 인간 소마토트로핀의 결정적인 아미노산을 식별하는데 매우 유용하다 (31). 알라닌은 2 차 구조를 변화시키지 않는 반면, 항체와의 잠재적인 상호 작용 영역을 제거시키는 것으로 간주된다. 치환된 알라닌을 함유하는 펩티드가 여전히 항체에 결합한다면, 대체된 아미노산은 비-접촉성 잔기인 것으로 간주된다.
따라서, pST(75-90)의 일련의 알라닌-치환 동족체는 고체-상 방법에 의하여 합성되며, 그들의 PS-7.6 단일 클론성 항체 결합을 위한 pST와의 경쟁력은 RIA에 의하여 측정된다. 알라닌 대체가 IC50에 있어서 상당한 증가를 나타낸다면, 잔기의 측쇄는 상당한 경쟁을 달성하는데 있어서 결정적인 것으로 간주된다. 다섯 개의 별도 실험을 요약한 도 4에서의 발견은, 모두 소수성 아미노산인 Leu80(또한 도 3 참조), Ile83및 Leu87가 PS-7.6 단일 클론성 항체 인식에 있어서 결정적이며, Leu76또는 Val90또한 결정적임을 가리킨다. Fisher's 배합 p-값 시험을 이용하여 p 값을 계산할 때, 도 4에서 포지션 89에 대한 막대기 값은 포지션 90에 대한 값보다 크지만, 포지션 90에 대한 p 값은 통계상 주목할 만 하나(p=0.00162), 포지션 89에 대한 p 값은 통계상 주목할 만 하지 않다 (p=0.16048). 도 4 는 결과가 다른 다섯 개의 실험과 전적으로 모순되는 여섯번째 실험 데이터를 포함하지 않음을 주목하라.
pST (2)의 3 차 구조 및 두번째 나선의 투영도에 근거하여, 도 5에서 음영 원으로 나타내는 다섯 개의 결정적 잔기는 PS-7.6 단일 클론성 항체와 상호 작용하기 위하여 소수성 리본을 니타내는 나선의 동일면 상에 위치한다.
요약하면, 성장-촉진 항체 PS-7.6 단일 클론성 항체의 에피토프는 제한적 트립신 분해에 의하여 매핑되며, 에피토프 상의 결정적인 아미노산은 연속적인 알라닌 대체에 의하여 식별된다. pST의 α-나선 투영도는 결정적인 아미노산이 두번째 나선의 동일 면 상에 위치하는 소수성 리본임을 보여준다. 에피토프의 2 차 구조 및 서열의 특성은, 상응하는 pST 에피토프의 천연 구조를 모방하는 효율적인 펩티드 항원의 설계에 대한 기초를 제공한다.
에피토프 내의 결정적인 아미노산에 근거하여, 일련의 펩티드를 설계한다. 본 발명의 한 구체예에서, 펩티드는 천연 pST 서열과 상이한 하기의 조성을 함유하는 서열로부터 선택된다: Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Val-Xaa-Xaa (서열번호 1). 그러한 펩티드의 예는 다음을 포함한다: Tyr-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Ile-Arg-Arg-Leu-Asp-Asp-Val-Ile-Arg-Arg-Ile (서열번호 2), Tyr-Ser-Leu-Asp-Arg-Ile-Ile-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Val-Ile-Arg-Asp-Ile (서열번호 3), Tyr-Ser-Leu-Arg-Arg-Ile-Ile-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Val-Ile-Arg-Arg-Ile (서열번호 4), Tyr-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Ile-Asp- Asp-Leu-Asp-Asp-Val-Ile-Asp-Asp-Ile (서열번호 5), Tyr-Ser-Leu-Asp-Asp- Ile-Ala-Arg-Arg-Leu-Asp-Asp-Val-Ala-Arg-Arg-Leu (서열번호 6), Tyr- Ser-Leu-Lys-Ala-Ile-Ala-Glu-Ala-Leu-Lys-Ala-Val-Ala-Glu-Ala (서열번호 7), Tyr-Ser-Leu-Lys-Glu-Ile-Glu-Lys-Leu-Leu-Lys-Glu-Val-Leu-Glu-Lys- Leu (서열번호 8), Tyr-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Ala-Arg-Arg-Leu-Asp-Asp-Val-Ala-Arg-Arg-Ala (서열번호 9), Tyr-Ser-Leu-Lys-Ile-Ile-Ile-Glu-Ile-Leu- Lys-Ile-Val-Ile-Glu-Ile (서열번호 10), Tyr-Ser-Leu-Lys-Glu-Ile-Glu-Lys-Leu -Leu-Lys-Glu-Val-Leu-Glu-Lys-Leu (서열번호 11), 및 Aib가 2-아미노이소부티르산인 Tyr-Ser-Leu-Lys-Aib-Ile-Aib-Glu-Aib-Leu-Lys-Aib-Val-Aib-Glu-Aib (서열번호 12). 더욱이, 다음과 같이 서열번호 1의 하나 이상의 루신 또는 발린이 정상적인 루신 (Nle)으로 대체될 수 있다:
Tyr-Ser-Nle-Asp-Asp-Ile-Ile-Arg-Arg-Leu-Asp-Asp-Val-Ile-Arg- Arg-Ile (서열번호 13), Tyr-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Ile-Arg-Arg-Nle-Asp-Asp-Val-Ile-Arg-Arg-Ile (서열번호 14), Tyr-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Ile-Arg-Arg- Leu-Asp-Asp-Nle-Ile-Arg-Arg-Ile (서열번호 15), 및 Tyr-Ser-Nle-Asp-Asp-Ile-Ile-Arg-Arg-Nle-Asp-Asp-Val-Ile-Arg-Arg-Ile (서열번호 16).
더욱이, 시스테인이 서열번호 1의 펩티드의 한 쪽 또는 양 말단에 첨가될 수 있다. 그러한 펩티드의 예는 다음과 같다: Cys-Tyr-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Ile-Arg-Arg-Leu-Asp-Asp-Val-Ile-Arg-Arg-Ile (서열번호 17).
본 발명의 다른 구체예에서, 필수 아미노산 잔기의 위치는 나선을 따라 거의 한 회전을 나타내는 세 개의 아미노산에 의하여 이동된다. 이들 펩티드는 하기의 조성을 함유하는 천연 pST 서열과 상이한 서열로부터 선택된다:
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Val (서열번호 18). 특히, 이들 펩티드는 세번째 잔기로서 이소루신을 포함하며, 하기의 조성을 함유하는 천연 pST 서열과 상이한 서열로부터 선택된다:
Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Val (서열번호 19). 그러한 펩티드의 예는 다음과 같다:
Tyr-Ser-Ile-Asp-Asp-Leu-Ile-Arg-Arg-Ile-Asp-Asp-Leu-Ile-Arg-Arg-Val ( 서열번호 20).
이들 펩티드는 바람직하게는 나선 구조의 프로모터로서, 서열번호 1의 첫번째 루신의 아미노-말단 및 서열번호 19의 첫번째 이소루신의 아미노-말단에 접하는 아미노산인 세린을 함유한다.
이들 펩티드의 아미노산 서열은 첫번째 필수 잔기가 아미노-말단을 향하며, 마지막 필수 잔기가 카복시-말단을 향한다는 관례를 이용하여 기술된 것이다. 본 발명은 또한 첫번째 필수 잔기가 카복시-말단을 향하고 마지막 필수 잔기가 아미노-말단을 향하는 역 배향 내의 동일한 서열을 포함한다. 양 배향은 측쇄 상에 동일한 나선 투영도를 가지며 (도 5 참조), 기능면에서 동일하다.
본 발명의 범위 내의 기타 펩티드는 본원에 기술된 방법 및 기준을 이용하여 용이하게 생성된다.
본 발명의 펩티드는 하기의 실시예에 상세히 기술하는 바와 같이 다양한 실험으로 시험된다.
우선, 다양한 펩티드(본 발명의 범위 내외 모두)가 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위하여 방사선-표지된 pST와 경쟁하는 정도를 측정하기 위하여, 방사선-면역학적 분석을 수행한다. 실시예 1에서 상세히 기술하고 도 1에 도시하는 바와 같이, 서열번호 2의 펩티드(펩티드-X로 언급)는 투여량에 의존하여 pST의 아미노산 75-95 천연 서열에 상응하는 펩티드보다 강하게 PS-7.6 단일 클론성 항체와 방사선-표지된 pST의 상호 작용을 억제한다. 아미노-말단 아미노기가 아세틸기로 대체되어 있는 펩티드-X의 변형 형태(캡핑된 펩티드-X로 언급)는 상호 작용을 억제하지 않는다. 도 6에 나타내지 않은 실험에서는, 펩티드-X뿐 아니라 서열번호 8-11의 펩티드가 상호 작용을 억제하는 반면, 서열번호 3 및 12의 펩티드는 펩티드-X보다 저비율로 상호작용을 억제한다.
실시예 1에서 상세히 기술하고 도 7에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 범위 밖의 Tyr-Ser-Ile-Asp-Asp-Ile-Ile-Arg-Arg-Ile-Asp-Asp-Ile-Arg-Arg-Ile (서열번호 21; 펩티드-Y로 언급) 서열을 가지는 펩티드는 상호 작용을 억제함에 있어서 pGH(75-95) 펩티드보다 덜 효율적이다. 따라서, 서열번호 2의 펩티드 내의 첫번째 루신 및 발린의 이소루신으로의 대체는 항체에의 결합을 제거한다.
실시예 1에서 상세히 기술하고, 도 8에 도시하는 바와 같이, 펩티드-X 및 루신 또는 발린이 정상적인 루신(Nle)으로 대체되어 있는 세 개의 변이체(서열번호 13-15)는 상호 작용을 억제함에 있어 pGH(75-95)보다 더 효율적인 반면, 펩티드-Y는 훨씬 덜 효울적이다. 도 8에 나타내지 않는 실시예에서는, 펩티드-X뿐 아니라 서열번호 16의 펩티드가 상호 작용을 억제한다.
다음, 뇌하수체 절개된 (hypox) 래트 내에서 이들 펩티드의 생물학적 활성을 시험한다. Hypox 래트는 뇌하수체 제거 수술의 결과 성장이 결핍되어 있다. Hypox 래트는 성장에 대한 소마토트로핀의 영향에 관한 연구의 유용한 표본으로서 작용한다 (32).
실시예 2에서 상세히 기술하고 도 9에 도시하는 바와 같이, 펩티드-X (서열번호 2)는 오브알부민과 접합되며, 완전 프로인트 보조액 내에서 에멀션화된다. 세 마리의 돼지를 펩티드-X로 면역시키고, 불완전한 프로인트 보조액으로 두 개의 부스터 투여를 한다. 상기 동물로부터 혈액 샘플을 채취하고, 첫번째 주입 전에 동일한 돼지로부터 대조 혈청 영역을 또한 채취한다. 항체를 정제하고, pST와 혼합하여, 5일 간 연속하여 hypox 래트 내로 주입한다. pST만을 주입받은 래트는 통계상 상당한 성장을 보인다. pST 및 돼지 #1 또는 #2로부터의 항체를 주입받은 래트는 면역화 후 상당한 성장 증가를 보인다. 돼지 #3의 항체 투약의 효과는 통계상 상당한 수준에 이르지 못하나 (p=0.08), 식별할 만한 성장 증가를 보인다. 이와 대조적으로, 예비-면역 항체는 효율적이지 못하다. Hypox 래트 실험의 결과로서, 돼지를 이용한 면역 시도를 수행한다.
펩티드는 단독으로 또는 보다 바람직하게는 생체 내에서 항체 생산을 강화시키는 거대 분자와 결합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)과 같은 단백질과 접합될 수 있다. 본 발명의 범위 내의 기타 거대 분자는 인간 및 소 혈청 알부민, 오브알부민, 미오글로빈, β-갈락토시다아제, 페니실리나아제, 가열 쇼크 단백질 및 박테리아 독소와 같은 공지된 것을 포함한다. 멀티-폴리-DL-알라닐-폴리-L-리신 및 폴리-L-리신과 같은 합성 분자 또한 적절하다.
경피 및 경구 투여뿐 아니라, 피하 주사, 근육 내 주사 및 정맥 내 유동과 같은 전형적인 경로에 의하여 펩티드를 투여할 수 있다. 펩티드(또는 그 접합체)를 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 펩티드를 처음 투여한 후, 일정한 시간 간격으로 동일한 펩티드를 하나 이상의 부스터 투여하는 것이 특히 바람직하다.
실시예 3 내지 5에서 상세히 기술하는 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 이용한 돼지의 면역화는 사료 효율의 증가 및 육질 증가 및 지방 감소의 결과를 일으킨다.
실시예 3의 표 1에서, 서열번호 2의 펩티드를 투여받은 성장을 마친 돼지는 실험 전반에 걸쳐 오브알부민만을 투여받은 돼지와 비교하여 통계상 상당한 사료 효율 증가를 보인다. 실시예 3의 표 2에서, 펩티드를 투여받은 동일한 돼지는, 오브알부민만을 투여받은 돼지와 비교하여, 통계상 상당한 육질 증가 및 지방 감소와 함께, 향상된 도축 특성을 보인다. 펩티드를 투여받은 돼지가 대부분의 기관 중량에 있어서 상당한 증가를 보이지 않음은 흥미롭다. 이와 대조적으로, pST는 기관 중량을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
실시예 5에서, 서열번호 2 또는 서열번호 17(Cys-펩티드)의 펩티드를 투여받은 성장을 마친 다른 그룹의 돼지를 이용하여 실시예 3을 반복할 때, 양 그룹의 돼지는, 오브알부민만을 투여받은 돼지와 비교하여, 통계상 상당한 비바람직한 엽상 지방의 감소를 보이는 반면, 서열번호 2의 펩티드를 투여받은 돼지는 통계상 상당한 반건질의 감소를 보인다(표 5 및 6 참조).
실시예 4의 표 3 및 4에서, 펩티드를 투여받은 성장기 돼지는, 오브알부민만을 투여받은 돼지와 비교시 실험 전반에 걸쳐 통계상 상당한 육질의 증가를 보인다. 이는 처리를 중단한 성장을 마친 돼지와 비교하여, 처리 단계 중에 특히 주목할 만 하다.
본 발명을 보다 잘 이해하기 위하여, 하기의 실시예를 기술한다. 이 실시예는 예증적 목적만을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1
경쟁적 방사선-면역학적 분석
다양한 펩티드가 PS-7.6 단일 클론 항체에의 결합을 위하여 방사선-표지된 pST와 경쟁하는 정도를 측정하기 위하여, 방사선-면역학적 분석을 수행한다. 주어진 농도의 펩티드에 대하여, 분석에서 항체에 결합하는 pST의 양이 적을수록, 펩티드의 항체에 대한 경쟁은 크다. 구조적으로 천연 pST를 모방하는 펩티드는 pST를 PS-7.6 단일 클론 항체로부터 더욱 효율적으로 대체시켜야 한다.
제거할 수 있는 마이크로티터 웰을 1 ㎍/웰로 PS-7.6 단일 클론 항체로 코팅하고, 잔류 마이크로티터 웰 결합 영역을 2% BSA로 블록킹한다. 요오드화된 pST (125I-pST, 특수 활성 = 180-250 μCi/㎍, New England Nuclear/DuPont, Co., Boston, MA)를 다양하게 희석시켜 경쟁적 시약과 함께 가한다. 60 분간 배양하고, 모든 웰을 철저히 세척하여, 비결합125I-pST 및 잔류 방사능을 제거한 후, 각각의 웰 내에 PS-7.6 단일 클론 항체와 결합된125I-pST의 양을 감마 카운터 내에서 개별적으로 계산한다.
도 6에 도시하는 첫번째 실험에서, (1) pST의 천연 아미노산 서열 75-95에 해당하는 펩티드 (도 6에서 pGH(75-95로 언급), (2) 서열번호 2의 펩티드(펩티드-X로 언급), 및 (3) 아미노-말단 아미노기가 아세틸기로 대체되어 있는 펩티드-X의 변형 형태 (캡핑된 펩티드-X로 언급)와 비교하여, (방사선-표지된 pST(도 6에서 pGH로 언급)의 PS-7.6 단일 클론 항체에의 결합을 위한 경쟁을 측정하는 방사선-면역학적 분석을 수행한다.
그 결과는, 웰에의 pGH(75-95)의 첨가가 투여량에 따라 PS-7.6 단일 클론성 항체 및 방사성 pST의 상호 작용을 억제함을 나타낸다. 펩티드-X 또한 약간 강하게 유사한 방식으로 상호 작용을 억제하는 것으로 나타나는 반면, 캡핑된 펩티드-X는 그러하지 못하다. 이론에 구애받지 않고, 경쟁 분석에서 캡핑된 펩티드-X의 불능은 시험 용액 내에서의 펩티드 간의 응집에 의한 것일 수 있다.
도 7에 도시된 두번째 실험에서, (1) pGH(75-95) 펩티드, 및 (2) 본 발명의 범위 밖인 서열번호 21의 펩티드(도 7에서 펩티드-Y로 언급)와 비교하여, 방사선-표지된 pST의 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위한 경쟁을 측정하는 방사선-면역학적 분석을 수행한다.
상기 결과는, 웰에의 pGH(75-95)의 첨가가 PS-7.6 단일 클론성 항체와 방사성 pST의 상호 작용을 투여량에 따라 억제함을 나타낸다. 이와 대조적으로, 펩티드-Y는 훨씬 덜 효율적인 것으로 나타난다.
도 8에 도시된 세번째 실험에서, (1) pGH(75-95) 펩티드, (2) 펩티드-X, (3) 펩티드-Y, (4) 첫번째 루신이 정상적인 루신(Nle)으로 대체되어 서열번호 13을 생성하는 펩티드-X (도 8에서 Nle80으로 언급), (5) 두번째 루신이 정상적인 루신(Nle)으로 대체되어 서열번호 14를 생성하는 펩티드-X (Nle87로 언급), 및 (6) 발린이 정상적인 루신(Nle)으로 대체되어 서열번호 15를 생성하는 펩티드-X (Nle90으로 언급)와 비교하여, 방사선-표지된 pST의 PS-7.6 단일 클론성 항체에의 결합을 위한 경쟁을 측정하는 방사선-면역학적 분석을 수행한다.
상기 결과는, 웰에의 pGH(75-95)의 첨가가 PS-7.6 단일 클론성 항체와 방사성 pST와의 상호 작용을 투여량에 따라 억제함을 나타낸다. 펩티드-X, Nle80, Nle87 및 Nle90을 포함하는 본 발명의 범위 내의 몇몇 펩티드는 경쟁 분석에서 pGH(75-95)보다 더 효율적인 것으로 나타난다. 그러나, 펩티드-Y는 훨씬 덜 효율적인 것으로 나타난다.
실시예 2
펩티드에 대한 돼지 항체를 이용한
하이폭스 래트 내의 pST 활성의 증진
본 실시예에서, 돼지에 펩티드를 주입한다. 이 펩티드에 대항하는 항체를 함유한 혈청 샘플을, hypox 래트 내로 pST와 더불어 주입한다. 항체는 hypox 래트의 성장을 촉진케하는 pST의 성능을 강화한다. 실험은 하기의 방식으로 수행된다.
펩티드-X (서열 번호: 2)를 오브알부민에 접합시켜 완전 프로인트 보조액(Complete Freund's Adjuvant) 내에서 에멀션화한다. 세 마리의 돼지를 펩티드-X로 면역시키고, 불완전 프로인트 보조액으로 부스터 복용시켜 4 및 8 주 동안 둔다. 마지막 부스팅 후 일주일 후에, 이들 동물로부터 혈청 샘플을 채취한다. 대조 혈청도 또한, 일차 주입 이전에 동일 돼지로부터 채취해둔다. 항체를 황산암모늄 침전에 의해 정제하고 pST와 혼합하여 항체 1 mg 및 pST 5 ㎍으로 이루어진 혼합물을 제공한 후, 이를 연속 5일 동안 hypox 래트에게 주입한다. 이들 래트의 세 개의 분리 그룹은 각각 상이한 하나의 돼지로부터 수득된 항체를 제공받으며; 네번째 래트 그룹은 주입받지 않는 반면, 다섯번째 래트 그룹은 오직 pST만을 받는다. 5일 동안의 래트의 천연 체중 증가는 도 9에 도시되어 있다.
pST만으로 처리할 경우, 하이폭스 래트의 성장은 통계적으로 상당한 방식(*p0.05)으로 자극된다. pST 및 돼지 #1 또는 #2로부터의 항체를 주입받은 래트는, 면역화 후에 상당히 증가된 성장을 보인다. 돼지 #3으로부터의 항체의 효과는 통계상 상당한 수준 (p=0.08)에 도달하지는 않지만, 역시 식별할 수 있는 성장 증가를 보인다. 대조적으로, 예비-면역 항체는 아무런 효과를 보이지 않았다.
실시예 3
펩티드를 이용한 성장이 끝난 돼지의 면역화
본 실험은 본 발명의 성장이 끝난 돼지(70-80 kg 이상으로부터의 최종 성장 단계)의 펩티드에 의한 면역화가 성장율, 사료 효율 및 체내 조성에 미치는 효과를 설명한다.
펩티드(Tyr-Ser-Leu-Asp-Asp-Ile-Ile-Arg-Arg-Leu-Asp-Asp-Val-Ile-Arg-Arg-Ile; 서열 번호: 2)를 합성한 후, 오브알부민에 접합시킨다. 대조하기 위해, 오브알부민 항원을 그 자체로 오브알부민에 접합시킴으로써 발생시킨다.
70 내지 80 kg의 잡종 수퇘지 (신규한 상업적 DeKalb terminal cross genetic line)을 Gold Kist Pork, Hillsborough, NC로부터 구입한다. 돼지는 펩티드에 대한 표적 동물이며, 처리 그룹 당 최소 25 마리의 돼지가 처리들 간의 통계학적 변별력을 얻기 위하여 필요하다. 번호매겨진 귀 표지에 의하여 각각의 동물들을 식별하며 번호매겨진 우리 내에 둔다. 돼지가 운송된 후, 돼지에 200 g/ton 농도의 클로르테트라사이클린으로 약물 처리한 식이를 약 1 주일 동안 공급한다. 본 실험의 잔류 기간 동안 돼지는 돼지 ST 배급 (20% 조 단백질)을 받는다. 사료 및 물은 충분히 이용가능하다.
동물들을 랜덤화 완전 블록 디자인에 따라서 두 번의 처리 각각에 할당한다. 동물들은 초기 체중에 의해 구분된다. 하기의 처리가 투입된다:
그룹
항원
n
우리 번호
A 오브알부민/오브알부민 25 5
B 펩티드/오브알부민 25 5
돼지들을 무작위로 각각의 블록내의 처리 그룹 A 또는 B로 할당한다. 평균 체중이 약 75 kg이 되었을때, 각 블록의 15 마리의 돼지에 처리하기 시작한다.
돼지를 일차 면역화 주입 이전에, 우리내에서 최소 1-주일동안 예비처리한다. 사료 흐름은 최소한의 소모에 비제한적 접근을 제공하도록 맞춰진다.
완전 프로인트 보조액으로 완전히 에멀션화된 펩티드/오브알부민 접합체 0.5 mg을 귀의 바로 뒤 목 근처에 피하 (SC) 주사함으로써, 돼지를 면역화시킨다. 모든 돼지는 동일 정량의 접합체를 이용하여 4-주 간격 후에 한 번의 부스터 주입을 받는다. 대조군 돼지는 펩티드가 없는 오브알부민 접합체를 주입받는다.
돼지를 매일 관찰한다. 아프거나 상처입은 동물에게는 적절한 수의학적 치료를 행한다. 몇 일내로 회복되지 않거나 회복하기 위해서 격리되는 동물(예; 펜메이트에 의해 악화된 절음발이)을 본 실험 대상에서 제외시킨다.
돼지가 도축 중량에 도달하였는지를 알아보기 위해서, 체중 및 사료 소비를 일주일 또는 필요하다면 그 보다 자주 측정한다.
평균 체중이 115±2 kg일때, 각 우리의 돼지를 도살한다. 도축 측정은 냉장 체중, 후방지방 두께, 늑골 정면적, 도축 길이 및 심장, 간, 비장, 이자, 엽상 지방 및 반건질 근육의 중량을 포함한다.
데이타를 랜덤 완전 블록 디자인을 위한 변이 분석을 이용하여 분석한다. 체중 증가 및 도축 측정 평가에 대한 실험 단위는 개별 돼지이다. 사료 소비 및 사료 효율 데이타는 실험 단위로서 우리를 사용한다. 평균 비교는 피셔의 보호된 LSD(Fisher's Protected LSD)를 사용하여 행해진다.
실험은 하기 스케쥴에 따라 진행된다. 첫째날, 모든 돼지의 무게를 달고 평균 체중이 75 kg에 도달했을때 각 블록마다 처리(그룹 B에 대한 초기 면역화를 포함)를 개시한다.
부스터 주입을 초기 면역화 후 4 및 8주 후에 투여한다. 1주일 간격으로 돼지의 무게를 달고 사료 소비를 측정한다. 이 후, 평균 우리 체중이 115±2 kg인 돼지를 도살한다.
본 실험 결과는 표 1 및 2에 제시한다.
| 항목 | 대조군오브알부민/오브알부민 | 면역화된 펩티드 | SEM |
| 우리/돼지 수 | 5/25 | 5/25 | |
| 체중, kg초기4주 후최종 | 76.299.2116.2 | 76.398.8117.1 | 0.30.81.0 |
| 실험 일수 | 51.2 | 51.0 | 1.3 |
| 증가, g/일1-4 주5주-최종1-최종 | 819743781 | 804805802 | 26.927.518.4 |
| 사료 섭취, g/일1-4 주5주-최종1주-최종 | 339033163357 | 325033263285 | 59.793.454.5 |
| 증가/사료1-4주5주-최종1주-최종 | .241.222.233 | .247.242.244* | .005.009.004 |
| * 대조군과 상당히 상이, P.05 |
| 항목 | 대조군오브알부민/오브알부민 | 면역화된 펩티드 | SEM |
| 우리/돼지 수 | 5/25 | 5/25 | |
| 사체 중량, kg | 82.5 | 82.2 | .8 |
| 드레싱 % | 71.0 | 70.2 | .3 |
| 사체 길이, cm | 82.6 | 83.0 | .4 |
| 기관 중량, g심장간이자비장엽상 지방반건질 | 37018043751611663394 | 37318293841751389**434*** | 8.637.88.76.660.98.2 |
| 지방 두께, cm첫째 늑골마지막 늑골요추후방지방여섯번째 늑골열번째 늑골 | 4.92.92.63.53.63.7 | 4.4*3.02.33.23.1**3.2*** | .14.10.12.09.11.11 |
| 조정된 열번째 늑골 지방, cm | 3.3 | 2.8*** | .1 |
| 허리 정면적, cm2 | 44.2 | 44.6 | .8 |
| 조정된 허리 정면적, cm2 | 41.6 | 41.9 | .8 |
| 계산된 육질 (33)Kg% | 38.156.1 | 39.7**57.6* | .4.5 |
| * 대조군과 상당히 상이, P.05** 대조군과 상당히 상이, P.01*** 대조군과 상당히 상이, P.001 |
실시예 4
펩티드를 이용한 성장하는 돼지의 면역화
실시예 3의 면역화 실험을 American Cyanamid Company(뉴저지 프린스턴)의 가축으로부터 어린 성장 돼지(대략 15 내지 20 kg)를 사용하여 반복한다. 두 개의 부스터를 4주 간격으로 주입한다(대략 50 내지 60 kg 에 이른 성장 단계 동안). 그리고 나서, 동물을 대략 115 kg의 최종 무게에서 도살한다. 본 실험 결과는 표 3 및 4에 제시한다.
| 항목 | 대조군오브알부민/오브알부민 | 면역화된 펩티드 | SEM |
| 우리/돼지 수 | 6/27 | 6/26 | |
| 체중, kg초기4주 후8주 후12주 후16주 후최종 | 18.539.856.372.997.6113.0 | 18.840.759.1*76.3*100.7114.1 | .3.6.81.11.41.5 |
| 실험 일수 | 135.0 | 131.2+ | 1.4 |
| 증가, g/일1-4주1-8주1-12주1-16주1주-최종8주-최종 | 762.0675.4647.8706.3704.0725.1 | 782.2718.9*683.7730.7728.5735.2 | 13.411.612.311.611.616.4 |
| 육질 조직 (34) | 326.6 | 343.6* | 5.8 |
| 사료 섭취, g/일1-4주1-8주1-12주1-16주1주-최종8주-최종 | 170216701843213123522872 | 163216311857218724013061 | 37.252.170.572.070.689.2 |
| 증가/사료1-4주1-8주1-12주1-16주1주-최종8주-최종 | .448.404.351.331.298.251 | .480*.444*.371.337.305.242 | .011.013.010.011.010.009 |
| 육질 조직 (34) | .137 | .144 | .005 |
| +대조군과 상당히 상이, P.10*대조군과 상당히 상이, P.05 |
| 항목 | 대조군오브알부민/오브알부민 | 면역화된 펩티드 | SEM |
| 우리/돼지 수 | 6/27 | 6/26 | |
| 도축 중량, kg | 79.8 | 80.6 | 1.1 |
| 드레싱 % | 71.1 | 71.0 | .3 |
| 도축 길이, cm | 83.2 | 83.5 | .5 |
| 기관 중량, g심장간이자비장엽상 지방반건질 | 40017963871501441425 | 439*1841385158988***461* | 10.933.38.55.054.712.1 |
| 지방 두께, cm첫째 늑골마지막 늑골요추후방지방여섯번째 늑골열번째 늑골 | 4.32.22.22.92.12.7 | 4.22.22.02.82.0+2.5* | .16.09.09.09.07.08 |
| 조정된 열번째 늑골 지방, cm | 2.5 | 2.2* | .07 |
| 허리 정면적, cm2 | 38.2 | 42.1** | .8 |
| 조정된 허리 정면적, cm2 | 36.4 | 40.0*** | .7 |
| 계산된 육질 (33)Kg% | 39.956.2 | 41.1**58.5*** | .3.4 |
| + 대조군과 상당히 상이, P.10* 대조군과 상당히 상이, P.05** 대조군과 상당히 상이, P.01*** 대조군과 상당히 상이, P.001 |
실시예 5
펩티드를 이용한 성장이 끝난 돼지의 면역화
실시예 3의 면역화 실험을 오브알부민에 하기와 같이 접합된, 아미노-말단에 시스테인 결합을 가지는 이차 펩티드(서열 번호: 17) (Cys-펩티드)를 포함하여 반복한다: 오브알부민 (10 mg)을 수용액 (pH 8)내에 용해시키고 요오도아세트산 무수물 (16 mg; 20배 과량)로 처리하고, 주변 온도에서 2시간 동안 휘젓는다. 과량의 요오도아세트산 무수물을 초여과에 의해 분리시키고, 변형된 오브알부민을 주변 온도에서 4시간 동안 Cys-펩티드와 반응시키고, 투석시킴으로써, 최종 생산물을 생산한다. 본 실험의 결과는 표 5 및 6에 제시되어 있다. 접합된 Cys-펩티드를 받은 두 마리가 돼지가 본 실험 동안 죽었음을 주목하라.
| 항목 | 대조군오브알부민/오브알부민 | 면역화된 펩티드 | 면역화된 Cys-펩티드 | SEM |
| 우리/돼지 수 | 5/25 | 5/25 | 5/23 | |
| 체중, kg초기4주 후최종 | 76.6100.8119.2 | 76.7102.2119.2 | 76.7102.2120.1 | 0.30.91.2 |
| 실험 일수 | 49.8 | 49.0 | 48.4 | 1.2 |
| 증가, g/일1-4 주4주-최종1-최종 | 866845856 | 909811870 | 903896902 | 30.228.723.8 |
| 사료 섭취, g/일1-4 주4주-최종1주-최종 | 318034303285 | 333334403381 | 322236303389 | 118.7116.2100.8 |
| 증가/사료1-4주4주-최종1주-최종 | .273.247.261 | .273.236.257 | .281.247.266 | .008.009.008 |
| 항목 | 대조군오브알부민/오알부민 | 면역화된펩티드 | 면역화된Cys-펩티드 | SEM |
| 우리/돼지 수 | 5/25 | 5/25 | 5/23 | |
| 도축 중량, kg | 86.0 | 86.4 | 85.9 | .9 |
| 드레싱 % | 72.1 | 72.5 | 71.5 | .3 |
| 도축 길이, cm | 82.6 | 82.7 | 83.5 | .5 |
| 기관 중량, g심장간이자비장엽상 지방반걸질 | 39718383971661569457 | 40018103881671297**492* | 41518854111831313*467 | 8.438.99.36.973.110.0 |
| 지방 두께, cm첫째 늑골마지막 늑골요추후방지방여섯 번째 늑골열번째 늑골 | 4.52.62.03.02.43.0 | 4.32.62.03.02.32.9 | 4.52.62.33.12.32.9 | .13.10.09.09.09.13 |
| 조정된 열번째늑골 지방, cm | 2.6 | 2.5 | 2.4 | .1 |
| 허리 정면적, cm2 | 46.8 | 46.7 | 46.8 | 1.1 |
| 조정된 허리정면적, cm2 | 43.6 | 43.6 | 43.4 | 1.1 |
| 계산된 육질 (33)Kg% | 40.658.2 | 40.758.5 | 40.958.6 | .5.7 |
| * 대조군과 상당히 상이, P.05** 대조군과 상당히 상이, P.01 |
문헌 목록
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34. National Pork Producers Council,Procedures to Evaluate Market Hog Performance(1983).
서열 목록
(1) 일반적 정보
(i)출원인: 버크월터, 브라이언 엘.
쉐, 홍-밍
왕, 보스코 에스.
(ii) 발명의 명칭: 성장 촉진 특성을 지닌 펩티드
(iii) 서열 수: 21
(iv) 서신 주소:
(A) 주소: 아메리칸 사이아나미드 캄파니
(B) 거리: 원 사이아나미드 플라자
(C) 도시: 웨인
(D) 주: 뉴저지
(E) 국가: 미국
(F) 우편 번호: 07470-8426
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 현 출원 데이타:
(A) 출원 번호: US
(B) 출원일:
(C) 분류:
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: 고든, 알랜 엠.
(B) 등록 번호: 30,637
(C) 참조/도켓 번호: 32,083-00
(ix) 원거리통신 정보:
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Claims (10)
- 천연 돼지 소마토트로핀(pST)의 서열과 상이한 아미노산 서열 Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Val-Xaa-Xaa (서열 번호 1)을 포함하는 펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 첫번째 루신의 아미노-말단에 접하는 아미노산이 세린인 펩티드.
- 제 2 항에 있어서, 근본적으로 서열 번호 2 내지 서열 번호 12로 나타내어 지는 서열을 가지는 펩티드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 시스테인이 펩티드의 한 쪽 또는 양 말단에 첨가되는 펩티드.
- 제 4 항에 있어서, 서열 번호 17로 나타내어지는 서열을 가지는 펩티드.
- 천연 pST 서열과 상이한 아미노산 서열 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu- Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Val (서열 번호 18)을 포함하는 펩티드.
- 제 6 항에 있어서, 세번째 잔기가 이소루신이며, 따라서 천연 pST 서열과 상이한 아미노산 서열 Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Val (서열 번호 19)을 포함하는 펩티드
- 제 7 항에 있어서, 첫번째 이소루신의 아미노-말단에 접하는 아미노산이 세린인 펩티드.
- 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께, 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항, 제 6 항, 제 7 항 또는 제 8 항의 펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 온혈 동물의 성장을 촉진시키는 조성물.
- 온혈 동물에게 제 9 항의 조성물을 투여시키는 것을 포함하는, 온혈 동물의 성장을 촉진시키는 방법.
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