CN108846258B - 一种自动检测分节段rna病毒重配的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自动检测分节段RNA病毒重配的方法。本发明提供了一种基于病毒各个节段系统发育树进化关系进行病毒重配检测的方法，包括如下步骤：1)建立病毒各个节段系统发育树；2)将步骤1)得到的分节段系统发育树进行依据平均成对距离的聚类划分，得到每个毒株的各个节段的划分类重定义；3)依据该定义可实现病毒毒株的重配历史检测，同时对于新毒株数据，可依据分节段相似度进行相应的重配检测。本发明的实验证明，本发明通过进化树聚类划分，不需要进行各个节段的拼接比对即可实现对病毒毒株重配的检测，检测结果合理高效。

Description

一种自动检测分节段RNA病毒重配的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种自动检测分节段RNA病毒重配的方法。

背景技术

病毒重配(Reassortment)是基因重组的一种过程，它是分节段RNA病毒所特有的，指的是多个病毒共感染同一宿主细胞，由于病毒基因节段重排从而产生新的基因组合后代病毒的现象。重配在几乎所有的分节段病毒家族中都可以检测到，最典型的是甲型流感病毒。重配是流感病毒实现跨宿主传播或形成大规模流行的重要进化动力。例如，病毒可以通过重配快速获得跨越宿主屏障的关键位点突变，而单纯通过突变累积获得这些宿主标记则需要漫长的进化历程。人类历史上的多次流感疫情都与不同病毒之间的重配有关。

重配与重组(recombination)虽然都涉及到基因片段之间的重新组合，但二者是不同的。重配指的是病毒之间以基因节段为单位进行的重新组合，而重组指的是基因之间以核酸片段为单位进行的插入或交换，二者存在较大差异。

重配的检测对于研究病毒的毒力增强、跨宿主传播、免疫逃逸具有重要意义。一般通过不同节段在系统发育关系上的不一致来进行重配事件的具体分析和检测，往往采用人工查看进化树分支关系的方法来进行，这种效率往往比较低。一些研究采用了自动化方法进行重配检测分析，但是这些方法往往需要把病毒基因组的不同节段进行串联，然后构建基因组进化树，通过研究串联基因组进化树的分支情况来检测重组事件。事实上，分节段病毒的不同节段在进化上是存在较大差异的，一方面不同节段受到的选择压力是不同的，另一方面不同节段的进化速率也是有很大差异的，简单把各个节段串联在一起进行进化树构建，会产生不合理的基因组进化关系，导致错误的重配检测结果。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种待测病毒基因组分节片段重配检测的方法。

本发明提供的方法，为先构建已有病毒的各个节段的系统发育树，再依据所述系统发育树中分支节点和叶节点的距离分布进行聚类划分，获得各个节段的划分类，依据现有病毒或待测病毒与划分类的映射关系，获得对病毒重配过程的溯源分析或检测。

上述方法包括如下步骤：

1)从原始数据库中获得所有完整基因组且具有全长序列的与所述待测病毒同种病毒的基因组核酸序列；对所述同种病毒不同病毒株的基因组核酸序列的每个节段的序列进行多序列比对，得到所有病毒株的每个节段的多序列比对结果，记作病毒基因组节段数据库；

2)将所述所有病毒株的每个节段的多序列比对结果均采用最大似然法分别进行系统发育树构建，得到每个节段的系统发育树；

3)步骤2)得到所有节段的系统发育树均按照如下方法分别进行分支聚类：

(1)计算进化树中内部节点下所有叶节点之间的成对距离(mpd)，然后求出整棵树所有内部节点mpd值的平均值

或确定每个划分类的最小粒度参数阈值N_min，即当某个类的叶节点数目小于该数值时不再进行进一步划分，而把该类直接确定为一个最终划分类；

所述计算进化树中内部节点下所有叶节点之间的成对距离(mpd)，然后求出整棵树所有内部节点mpd值的平均值

的方法包括如下：

(a)计算每个进化树中每个内部节点下所对应的子树中任意两个叶节点之间的距离，然后计算内部节点下所有叶节点之间的成对距离mpd，计算公式如下：

其中，n表示当前的内部节点下有n个叶节点，i，j代表叶节点，δ_i，j代表叶节点i，j之间的距离；

(b)根据每个进化树中所有内部节点的mpd值，算出进化树中所有内部节点mpd植的平均值

(2)对每颗进化树从根节点开始广度优先方法遍历整棵进化树，依次查看当前节点v的以下参考条件，当如下条件满足其中一个时，确定该节点下的叶节点集合构成一个划分类，得到每个节段的划分类：

①

②N_v≤N_min

mpd_v为当前内部节点下的叶节点之间的成对距离；N_v为当前节点下的叶子节点数目。；

4)对步骤3)得到每个划分类进行时间、地域、宿主或亚型的信息提取，得到每个划分类的具体特征，为每一个划分类进行命名标注，得到标释后的每个节段的具体划分类的进化树；

5)

若待测病毒为所述病毒基因组节段数据库中的已有病毒，则从每个节段进化树上找出所述已有病毒基因组的每个节段在各自进化树上的具体划分类，实现待测病毒基因组分节片段的重配检测；

若待测病毒不为所述病毒基因组节段数据库中的已有病毒，则将所述待测病毒每个节段的序列，与所述病毒基因组节段数据库中对应节段的所有序列进行相似性比对(可采用Blast软件方法进行)，所述待测病毒每个节段的序列与所述病毒基因组节段数据库中对应节段序列相似度最高，则所述待测病毒该节段归入所述病毒基因组节段数据库对应节段所属于的划分类，从而实现待测病毒基因组分解片段的重配检测。

上述方法中，所述多序列比对采用的软件为MAFFT软件；

上述方法中，所述最大似然法采用的程序为RaxML程序；

上述方法中，所述原始数据库为GISAID；

上述方法中，所述相似性比对采用的软件方法为Blast方法。

所述病毒为基因组分节段病毒。

上述方法中，所述基因组分节段病毒具体为流感病毒。

上述方法在待测病毒重配的回溯检测中的应用也是本发明保护的范围。

上述中，所述待测病毒为原始数据库外病毒或病毒基因组节段数据库中病毒。

本发明的实验表明，与现有技术相比，本发明的优点在于：1、不需要拼接各个节段构建基因组系统发育树，各个节段的分析相对独立，这更符合分节段病毒各个节段单独进化的基本特征。2、基于划分类对每个病毒基因组进行重定义分型可以实现对所有病毒各个节段的来源进行判断，实现对所有病毒重配过程的回溯，系统还原病毒重配历史。3、对新待分析病毒的重配检测只需要进行简单的序列相似性比对即可实现对其重配过程的检测，快速简捷。

综上所述，本发明通过构建现有分节段病毒各个节段的系统发育树并对其进行聚类划分，可实现对已有病毒及待分析病毒重配事件的全面检测，检测速度快，方法简单有效，可系统全面还原病毒重配历史过程。该发明避免了传统方法中将病毒各个节段进行拼接然后构建系统发育树的不合理性和复杂性。该方法主要体现在自动化进行重配检测，不需要人工进行进化树分析和判读即可实现重配检测分析。利用该技术优势，将为分节段病毒的重配检测及进化动力学研究提供重要技术支撑。

附图说明

图1为流感病毒PB1节段系统发育树。

图2为流感病毒PB1节段的划分类情况。

图3为流感病毒PB1节段划分类之间的关系及特征信息。

图4为毒株A/Shanghai/1/2013的重配历史。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、病毒重配检测方法

一、标释后的每个节段的具体划分类的进化树的制备

针对同种的多个病毒株，检测病毒重配的方法包括如下步骤：

1、构建病毒基因组节段数据库

从数据库中获得所有完整基因组且具有全长序列的同种病毒的基因组核酸序列，同种病毒株的基因组核酸序列分节的节段相同；

对不同病毒株的基因组核酸序列的每个节段的序列采用软件进行多序列比对，得到所有病毒株的每个节段的多序列比对结果，记作病毒基因组节段数据库。

2、构建系统发育树

将步骤1得到的所有病毒株的每个节段的多序列比对结果均采用最大似然法分别进行系统发育树构建，得到每个节段的系统发育树。1个节段对应一个系统发育树。

3、每个节段系统发育树的聚类划分

步骤2得到所有节段的系统发育树均按照如下方法分别进行分支聚类：

1)计算进化树中内部节点下所有叶节点之间的成对距离mpd，然后求出整棵树所有内部节点mpd值的平均值

或确定每个划分类的最小粒度参数阈值N_min，即当某个类的叶节点数目小于该数直时不再进行进一步划分，而把该类直接确定为一个最终划分类；

上述计算进化树中所有节点下的叶节点的成对距离(mpd)，然后求出整棵树所有内部节点mpd值的平均值

具体包括如下：

(1)计算每个进化树中每个内部节点下所对应的子树中任意两个叶节点之间的距离，然后计算内部节点下所有叶节点之间的成对距离mpd，具体计算公式如下：

其中，n表示当前的内部节点下有n个叶节点，i，j代表叶节点，δ_i，j代表叶节点i，j之间的距离。

(2)计算每个进化树中所有内部节点的mpd值，算出进化树中所有内部节点mpd值的平均值

2)将每个进化树中的所有叶节点划分为若干个划分类，对所有节段的进化树进行该聚类划分过程，得到每个分支节段的划分类；

划分过程如下：

对每颗进化树从根节点开始广度优先方法遍历整棵进化树，依次查看当前节点v的以下参考条件，当如下条件满足其中一个时，确定该节点下的叶节点集合构成一个最终划分类：

①

②N_v≤N_min

mpd_v为当前内部节点下的叶节点之间的成对距离；N_v为当前节点下的叶子节点数目。

4、对划分类命名及特征提取

对步骤3得到每个划分类进行时间、地域、宿主、亚型等信息提取，得到每个划分类的具体特征，为每一个划分类进行命名标注，如PB1_32。将原来的进化树进行依据划分类的折叠，同时对划分类进行标识。

二、重配检测

1、对已有病毒的重配分析

依据已有病毒基因组的每个节段在各自进化树上的具体划分类归属及其划分类命名，可实现对现有病毒的具体划分类定义，例如：

A/Shanghai/1/2013

PB2_160

PB1_200

PA_278

HA_252

NP_342

NA_173

MP_253

NS_225

依据该病毒对应的每个划分类的信息特征，得到病毒的重配检测结果，即可实现对该病毒重配的回溯检测。

2、对数据库外病毒的重配检测

数据库外病毒应与数据库中病毒属同种，且存在同源进化关系。

若待测病毒不为所述病毒基因组节段数据库中的已有病毒，则将所述待测病毒每个节段的序列，与所述病毒基因组节段数据库中对应节段的所有序列进行相似性比对(可采用Blast软件方法进行)，所述待测病毒每个节段的序列与所述病毒基因组节段数据库中对应节段序列相似度最高，则所述待测病毒该节段归入所述病毒基因组节段数据库对应节段所属于的划分类，从而实现待测病毒基因组分解片段的重配检测。

依据数据库外病毒某个病毒StrainX每个节段的序列，与上述一的1中的病毒基因组节段数据库中所有病毒株的每个节段的进行序列相似性比对(可采用Blast软件方法进行)，从数据库中找出与StrainX每个节段最高相似度的节段序列，将与StrainX所有节段最高相似度的节段序列组合成为一株病毒StrainXMock，并用该病毒代表数据库外病毒，该病毒的重配检测结果即视为对原病毒StrainX的重配检测结果。

对于上述分析之外的病毒株的重配检测，首先要对病毒的各个节段序列与病毒基因组节段数据库中的序列进行序列相似性比对，取得与待测病毒各个节段相似度最高的数据库内序列数据，依据该数据库内病毒节段所属划分类情况进行类似(1)中的重配检测分析。

实施例2、流感病毒重配检测

1、下载GISAID网站下载完整流感病毒基因组序列数据

登陆GISAID(http：//platform.gisaid.org)，筛选下载含有完整基因组且具有全长序列的甲型流感病毒基因组核酸序列，生成下载文件，下载文件中包含每个流感病毒基因组序列数据；剔除其中还有非法字符等数据质量低的基因组，删除其中的冗余基因组。

本实施例于2016-10-26日在GISAID网站数据库中下载的完整流感病毒基因组序列数据，数据质量控制后共18564株病毒基因组。

对不同病毒株的基因组核算序列的每个节段的序列利用MAFFT软件进行多序列比对，得到所有病毒株的每个节段的多序列比对结果，记作病毒基因组节段数据库。

2、构建系统发育树

将步骤1得到的所有病毒株的每个节段的多序列比对结果均利用RaxML程序进行最大似然树的系统发育树构建，获得流感病毒每个节段的系统发育树。

图1给出了流感病毒PB1节段对应的进化树。

3、每个节段系统发育树的聚类划分

(1)编写python脚本处理进化树文件，计算进化树中所有节点下的叶节点的成对距离(mpd)，然后求出整棵树的平均值

(2)对每颗进化树从根节点开始广度优先方法遍历整棵进化树，依次查看当前节点v的以下参考条件，当如下条件满足其中一个时，确定该节点下的叶节点集合构成一个最终划分类：

①

②N_v≤N_min

图2给出了PB1节段聚类后的进化树；图3则是将每个划分类进行折叠后的结果，体现的是划分类之间的关系。

4、对划分类命名及特征提取

对步骤3得到每个划分类进行时间、地域、宿主、亚型等信息提取，得到每个划分类的具体特征，为每一个划分类进行命名标注，如PB1_32。

表1给出了部分毒株的划分类重定义结果。

表1

毒株名字

PB2

PB1

PA

HA

NP

NA

MP

NS

A/Nicaragua/AGA2-114/2013

PB2_418

PB1_435

PA_422

HA_508

NP_442

NA_443

MP_360

NS_480

A/American_Samoa/4786/2013

PB2_419

PB1_436

PA_423

HA_509

NP_436

NA_446

MP_363

NS_471

A/swine/Nebraska/A01445765/2013

PB2_368

PB1_392

PA_343

HA_333

NP_370

NA_397

MP_210

NS_305

A/swine/Iowa/A01445788/2013

PB2_369

PB1_364

PA_343

HA_333

NP_37C

NA_406

MP_252

NS_379

A/Hangzhou/A155/2013

PB2_418

PB1_435

PA_422

HA_508

NP_446

NA_443

MP_358

NS_487

A/Shanghai/1/2013

PB2_160

PB1_200

PA_278

HA_252

NP_342

NA_173

MP_253

NS_225

A/swine/Iowa/13B092/2013

PB2_328

PB1_367

PA_323

HA_333

NP_309

NA_406

MP_210

NS_303

A/swine/Iowa/13B093/2013

PB2_328

PB1_367

PA_323

HA_333

NP_309

NA_406

MP_210

NS_303

A/Shanghai/3/2013

PB2_160

PB1_200

PA_278

HA_252

NP_353

NA_173

MP_253

NS_225

A/SRI_LANKA/27/2013

PB2_418

PB1_435

PA_422

HA_508

NP_445

NA_443

MP_363

NS_481

A/chicken/Egypt/D7436C/2013

PB2_34

PB1_42

PA_154

HA_80

NP_162

NA_90

MP_136

NS_44

二、重配检测

依据病毒各个节段对应的划分类的特征信息及划分类之间的进化关系，得出病毒重配历史。

图4给出了毒株A/Shanghai/1/2013的重配历史，结果显示该病毒的部分内部片段(PB2、PA、NP、MP、NS)来自亚洲地区禽流感病毒H9N2，而HA和NA片段则来自亚洲的H7和N9亚型禽流感病毒。

检测结果与已有文献报导结果一致，显示该发明的有效性。

此外，该实施例完成了流感病毒整个重配历史的重构，可追溯数据库中任一流感病毒毒株的重配历史。

Claims (6)

1.一种待测病毒基因组分节片段重配检测的方法，为先构建已有病毒的各个节段的系统发育树，再依据所述系统发育树中分支节点和叶节点的距离分布进行聚类划分，获得各个节段的划分类，依据现有病毒或待测病毒与划分类的映射关系，获得对病毒重配过程的溯源分析或检测；

所述病毒为基因组分节病毒；

所述方法包括如下步骤：

1)从原始数据库中获得所有完整基因组且具有全长序列的与所述待测病毒同种病毒的基因组核酸序列；对所述同种病毒不同病毒株的基因组核酸序列的每个节段的序列进行多序列比对，得到所有病毒株的每个节段的多序列比对结果，记作病毒基因组节段数据库；

2)将所述所有病毒株的每个节段的多序列比对结果均采用最大似然法分别进行系统发育树构建，得到每个节段的系统发育树；

3)步骤2)得到所有节段的系统发育树均按照如下方法分别进行分支聚类：

(1)计算进化树中内部节点下所有叶节点之间的成对距离(mpd)，然后求出整棵树所有内部节点mpd值的平均值

或确定每个划分类的最小粒度参数阈值N_min，即当某个类的叶节点数目小于该数值时不再进行进一步划分，而把该类直接确定为一个最终划分类；

所述计算进化树中内部节点下所有叶节点之间的成对距离(mpd)，然后求出整棵树所有内部节点mpd值的平均值

的方法包括如下：

(a)计算每个进化树中每个内部节点下所对应的子树中任意两个叶节点之间的距离，然后计算内部节点下所有叶节点之间的成对距离mpd，计算公式如下：

其中，n表示当前的内部节点下有n个叶节点，i，j代表叶节点，δ_i，j代表叶节点i，j之间的距离；

(b)根据每个进化树中所有内部节点的mpd值，算出进化树中所有内部节点mpd值的平均值

(2)对每颗进化树从跟节点开始广度优先方法遍历整棵进化树，依次查看当前节点v的以下参考条件，当如下条件满足其中一个时，确定该节点下的叶节点集合构成一个划分类，得到每个节段的划分类：

①

②N_v≤N_min

mpd_v为当前内部节点下的叶节点之间的成对距离；N_v为当前节点下的叶子节点数目；

4)对步骤3)得到每个划分类进行时间、地域、宿主或亚型的信息提取，得到每个划分类的具体特征，为每一个划分类进行命名标注，得到标释后的每个节段的具体划分类的进化树；

5)

若待测病毒为所述病毒基因组节段数据库中的已有病毒，则从每个节段进化树上找出所述已有病毒基因组的每个节段在各自进化树上的具体划分类，实现待测病毒基因组分节片段的重配检测；

若待测病毒不为所述病毒基因组节段数据库中的已有病毒，则将所述待测病毒每个节段的序列，与所述病毒基因组节段数据库中对应节段的所有序列进行相似性比对，所述待测病毒每个节段的序列与所述病毒基因组节段数据库中对应节段序列相似度最高，则所述待测病毒该节段归入所述病毒基因组节段数据库对应节段所属于的划分类，从而实现待测病毒基因组分解片段的重配检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多序列比对采用的软件为MAFFT软件。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述最大似然法采用的程序为RaxML程序。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述原始数据库为GISAID；

所述序列相似性比对方法为Blast软件方法。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述基因组分节病毒为流感病毒。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待测病毒为原始数据库外病毒或病毒基因组节段数据库中病毒。

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