JP6817215B2 - 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ - Google Patents
変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP6817215B2 JP6817215B2 JP2017546196A JP2017546196A JP6817215B2 JP 6817215 B2 JP6817215 B2 JP 6817215B2 JP 2017546196 A JP2017546196 A JP 2017546196A JP 2017546196 A JP2017546196 A JP 2017546196A JP 6817215 B2 JP6817215 B2 JP 6817215B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pam
- variant
- spcas9
- seq
- sacas9
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 title claims description 38
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 title description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 145
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 140
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 139
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 109
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 74
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 49
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 49
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 41
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 37
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 32
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 21
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 101710160287 Heterochromatin protein 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 claims description 8
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 102000011787 Histone Methyltransferases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010036115 Histone Methyltransferases Proteins 0.000 claims description 7
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 7
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000003584 silencer Effects 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 102220502946 Geranylgeranyl transferase type-2 subunit alpha_D10N_mutation Human genes 0.000 claims description 4
- 102000008157 Histone Demethylases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010074870 Histone Demethylases Proteins 0.000 claims description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 claims description 4
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 101000653360 Homo sapiens Methylcytosine dioxygenase TET1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030819 Methylcytosine dioxygenase TET1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000005747 Transcription Factor RelA Human genes 0.000 claims description 3
- 108010031154 Transcription Factor RelA Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 claims description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 claims 1
- 101100166144 Staphylococcus aureus cas9 gene Proteins 0.000 description 206
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 89
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 79
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 74
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 65
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 61
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 55
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 53
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 50
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 34
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 30
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 30
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 30
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 25
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 18
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 13
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 12
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 11
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 9
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 7
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 7
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 6
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 6
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 6
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- PKKBZODRBKXRRW-YFJIGQAWSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-(4-nitrophenyl)oxan-2-yl]oxy-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-3-yl]acetamide Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)C)[C@]1(C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O PKKBZODRBKXRRW-YFJIGQAWSA-N 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000009438 off-target cleavage Effects 0.000 description 4
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 description 3
- 102100030768 ETS domain-containing transcription factor ERF Human genes 0.000 description 3
- 102100030013 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102100023823 Homeobox protein EMX1 Human genes 0.000 description 3
- 101000938776 Homo sapiens ETS domain-containing transcription factor ERF Proteins 0.000 description 3
- 101001048956 Homo sapiens Homeobox protein EMX1 Proteins 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 3
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 3
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 3
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033647 Activity-regulated cytoskeleton-associated protein Human genes 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical compound OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- -1 E762Q Chemical compound 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPVPGKGADVGKTG-BQBZGAKWSA-N Ac-Asp-Glu Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O OPVPGKGADVGKTG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 238000001353 Chip-sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102220607031 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_R1015A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101710135281 DNA polymerase III PolC-type Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108091007417 HOX transcript antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000785569 Homo sapiens Zinc finger and SCAN domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000818735 Homo sapiens Zinc finger protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000782287 Homo sapiens Zinc finger protein 629 Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101100166147 Streptococcus thermophilus cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007416 X-inactive specific transcript Proteins 0.000 description 1
- 108091035715 XIST (gene) Proteins 0.000 description 1
- 102100026568 Zinc finger and SCAN domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100021112 Zinc finger protein 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100035817 Zinc finger protein 629 Human genes 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000008970 bacterial immunity Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N chlorothalonil Chemical compound ClC1=C(Cl)C(C#N)=C(Cl)C(C#N)=C1Cl CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000020175 protein destabilization Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/40—Fish
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cell Biology (AREA)
Description
優先権の主張
本出願は、２０１５年３月３日に出願された米国仮特許出願第６１／１２７，６３４号明細書；２０１５年５月２２日に出願された同第６２／１６５，５１７号明細書；２０１５年１０月９日に出願された同第６２／２３９，７３７号明細書；および２０１５年１１月２０日に出願された同第６２／２５８，４０２号明細書の利益を主張する。上記の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１５年３月３日に出願された米国仮特許出願第６１／１２７，６３４号明細書；２０１５年５月２２日に出願された同第６２／１６５，５１７号明細書；２０１５年１０月９日に出願された同第６２／２３９，７３７号明細書；および２０１５年１１月２０日に出願された同第６２／２５８，４０２号明細書の利益を主張する。上記の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金番号ＤＰ１ＧＭ１０５３７８、ＮＩＨＲ０１ＧＭ１０７４２７、およびＲ０１ＧＭ０８８０４０のもとで政府支援により作製された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金番号ＤＰ１ＧＭ１０５３７８、ＮＩＨＲ０１ＧＭ１０７４２７、およびＲ０１ＧＭ０８８０４０のもとで政府支援により作製された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、少なくとも部分的に、変更および改善されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有する遺伝子操作クラスター化等間隔短鎖回文リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼならびにゲノム遺伝子操作、エピゲノミック遺伝子操作、およびゲノム標的化におけるその使用に関する。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、広範な生物および細胞タイプにおいて効率的でカスタマイズ可能なゲノム編集を可能とする（Ｓａｎｄｅｒ＆Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，３４７−３５５（２０１４）；Ｈｓｕｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（２０１４）；Ｄｏｕｄｎａ＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ＆Ｍａｙ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３１１−３１４（２０１５））。Ｃａｓ９による標的部位認識は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１，６０２−６０７（２０１１）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２））として公知の２つの短鎖ＲＮＡにより指向され、それらは、キメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に融合させることができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ ２，ｅ００４７１（２０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３（２０１３））。ｓｇＲＮＡの５’末端（ｃｒＲＮＡに由来）は、標的ＤＮＡ部位と塩基対合し得、それによりＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体による部位特異的開裂の直接的な再プログラミングを許容する（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２））。しかしながら、Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡと塩基対合するＤＮＡに近接して存在する特異的プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も認識しなければならず（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５，７３３−７４０（２００９）；Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １０，８９１−８９９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５−９２８２（２０１１）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１−１４１２（２００８））、その要件は、配列特異的認識を開始するために必要とされるが（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２−６７（２０１４））、さらにゲノム編集のためのそれらのヌクレアーゼの標的化範囲を拘束し得る。広く使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、短鎖ＮＧＧ ＰＡＭを認識し（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（２０１３））、それは、ランダムＤＮＡ配列の８ｂｐごとに１回生じる。対照的に、これまで特徴付けされている他のＣａｓ９オルソログは、より長鎖のＰＡＭを認識し得る（Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１−１４１２（２００８）；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）；Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（２０１３）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５０，４８８−５０３（２０１３））。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）は、ウイルス送達により良好に適するいくつかのより小さいＣａｓ９オルソログの１つであり（Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１−１４１２（２００８）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５０，４８８−５０３（２０１３））、ランダムＤＮＡの３２ｂｐごとに１回生じることが予測される、より長鎖のＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを認識する。Ｃａｓ９オルソログの標的化範囲の拡大は、種々の用途、例として、小さい遺伝子エレメント（例えば、転写因子結合部位（Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．；５２７（７５７７）：１９２−７（２０１５）；Ｖｉｅｒｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２（１０）：９２７−３０（２０１５））の改変、またはＰＡＭ内の配列差異の位置決めによるアレル特異的変更（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（１）：１０８−１２（２０１５）の実施に重要である。
本明細書に記載のとおり、一般に使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）を、構造情報、細菌選択ベース指向進化、およびコンビナトリアル設計を使用して新規ＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作した。これらの変更ＰＡＭ特異性バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によってもＳａＣａｓ９によっても効率的に標的化することができないゼブラフィッシュおよびヒト細胞中の内在性遺伝子部位のロバストな編集を可能とする。さらに、本発明者らは、非カノニカルＮＡＧおよびＮＧＡ ＰＡＭを有する部位に対する低減した活性を保有する、ヒト細胞中で改善されたＰＡＭ特異性を示す別のＳｐＣａｓ９バリアントを同定および特徴付けした。さらに、本発明者らは、完全に異なるＰＡＭ特異性を有する２つのより小サイズのＣａｓ９オルソログ、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）が、本発明者らの細菌選択系およびヒト細胞中で効率的に機能することを見出し、それは、本発明者らの遺伝子操作方針を他の種からのＣａｓ９に拡張し得ることを示唆した。本発明者らの知見は、広く有用なＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９バリアントを提供し、本明細書においてそれらをまとめて「バリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）」または「そのバリアント（ｔｈｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）」と称する。
第１の態様において、本発明は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を提供する。一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異：Ｇ１１０４Ｋ；Ｓ１１０９Ｔ；Ｌ１１１１Ｈ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｎ；Ｄ１１３５Ｙ；Ｓ１１３６Ｎ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｎ１３１７Ｋ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を含む。一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異：Ｄ１１３５；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｙ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＹＲＱＲバリアント）；Ｇ１１０４Ｋ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＫＶＲＱＲバリアント）；Ｓ１１０９Ｔ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＴＶＲＱＲバリアント）；Ｌ１１１１Ｈ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＨＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｓ１１３６Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｎ１３１７Ｋ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＫＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異を含む。
一部の実施形態において、突然変異は、（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙである。
本明細書において、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５の１つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質も提供される。本明細書において、以下の位置：Ｅ７３５、Ｅ７８２、Ｋ９２９、Ｎ９６８、Ａ１０２１、Ｋ１０４４および／またはＲ１０１５の１つ、２つまたは３つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質も提供される。一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎの１つ以上を含む。一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｄ５５６、Ｈ５５７、および／またはＮ５８０における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、Ｎ５８０Ａ、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｈ５５７Ａおよび／またはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａにおける突然変異を含む。
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を含み得る。一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異の組：Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ．Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）の１つを含み得る。
本明細書に記載のＳａＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｅ７３５、Ｅ７８２、Ｋ９２９、Ｎ９６８、Ｒ１０１５、Ａ１０２１、および／またはＫ１０４４の１つ以上における突然変異を有する配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎの１つ以上を含み得る。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異の組：Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＫＨバリアント）；Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＨバリアント）；またはＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＫＨバリアント）の１つを含み得る。
本明細書において、任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている本明細書に記載の単離バリアントＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質であって、リンカーが融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質も提供される。一部の実施形態において、異種機能ドメインは転写活性化ドメインである。一部の実施形態において、転写活性化ドメインはＶＰ６４またはＮＦ−κＢ ｐ６５からのものである。一部の実施形態において、異種機能ドメインは転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である。一部の実施形態において、転写サイレンサーはヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えば、ＨＰ１αまたはＨＰ１βである。一部の実施形態において、異種機能ドメインは、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である。一部の実施形態において、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である。一部の実施形態において、ＴＥＴタンパク質はＴＥＴ１である。一部の実施形態において、異種機能ドメインは、ヒストンサブユニットを改変する酵素である。一部の実施形態において、ヒストンサブユニットを改変する酵素は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである。一部の実施形態において、異種機能ドメインは生物学的係留物である。一部の実施形態において、生物学的係留物はＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である。一部の実施形態において、異種機能ドメインはＦｏｋＩである。
本明細書において、任意選択的に、本明細書に記載のバリアントＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９タンパク質の発現のための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、本明細書に記載のバリアントＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９タンパク質をコードする単離核酸、ならびに単離核酸を含むベクターも提供される。本明細書において、本明細書に記載の核酸を含み、および任意選択的に本明細書に記載のバリアントＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９タンパク質を発現する宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞も提供される。
本明細書において、細胞中で、本明細書に記載の単離バリアントＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９タンパク質、および細胞のゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させることにより、細胞のゲノムを変更する方法も提供される。
本明細書において、細胞中で、バリアントタンパク質、および細胞のゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させることにより、細胞のゲノムを変更する、例えば、選択的に変更する方法も提供される。
細胞を、本明細書に記載のタンパク質バリアント、および細胞のゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることにより、細胞のゲノムを変更する、例えば、選択的に変更する方法も提供される。
一部の実施形態において、単離タンパク質または融合タンパク質は、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、細胞は、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物中に存在するか、または胚、例えば、哺乳動物、昆虫、もしくは魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）胚もしくは胚細胞中に存在する。
さらに、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法、例えば、インビトロ方法が提供される。本方法は、ｄｓＤＮＡ分子を、本明細書に記載のバリアントタンパク質の１つ以上、およびｄｓ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む。
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され、当技術分野において公知の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は、説明のためのものにすぎず、限定するものではない。本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照文献は、参照により全体として組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が定義を含めて優先される。
本発明の他の特徴部および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
特許または出願書類は、有色の少なくとも１つの図面を含有する。色付きの図面を有するこの特許または特許出願刊行物の複写物は、請求および必要な手数料の支払い時に省庁により提供される。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノム編集に広く使用されるが１−４、Ｃａｓ９が開裂し得る配列の範囲は、標的部位中の特異的プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についての必要性により拘束される５，６。例えば、最もロバストで、これまで広く使用されるＣａｓ９のＳｐＣａｓ９は、主にＮＧＧ ＰＡＭを認識する。結果として、種々のゲノム編集用途に必要な精度で二本鎖分解（ＤＳＢ）を標的化することが困難であり得ることが多い。さらに、Ｃａｓ９による不完全なＰＡＭ認識は、不所望なオフターゲット突然変異の作出をもたらし得る７，８。意図的に変更または改善されたＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９誘導体を進化させる能力は、それらの制限に対処するが、本発明者らの見識では、そのようなＣａｓ９バリアントは記載されていない。
伸長ＰＡＭを認識するオルソゴナルＣａｓ９の標的化範囲を改善するための潜在的方針は、それらのＰＡＭ認識特異性を変更することである。本明細書に記載のとおり、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ認識特異性は、構造ガイド設計および細菌細胞ベース選択系を用いて実施される指向進化の組合せを使用して変更することができる；実施例１および２を参照されたい。本明細書において、ＰＡＭ内のある位置についての緩和または部分的に緩和した特異性を有するように進化させたバリアントも記載される；実施例３を参照されたい。これらのバリアントは、より長いＰＡＭ配列を規定するＣａｓ９オルソログの有用性を広げる。
変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作Ｃａｓ９バリアント
本試験において遺伝子操作されたＳｐＣａｓ９バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によりアクセス可能な部位を大幅に増加させ、これは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラットフォームを使用して効率的なＨＤＲを実現する機会、ＮＨＥＪ媒介インデルを小さい遺伝子エレメントに標的化する機会、およびＰＡＭについての要求を活用して同一細胞中の２つの異なるアレルを区別する機会をさらに向上させる。変更ＰＡＭ特異性のＳｐＣａｓ９バリアントは、現在、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の両方でＳｐＣａｓ９により標的化可能でない内在性遺伝子部位を効率的に崩壊させ得、それらは種々の異なる細胞タイプおよび生物中で機能することを示唆する。重要なことに、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験は、ＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの全体プロファイルが、野生型ＳｐＣａｓ９について観察されるものと類似し、またはそれよりも良好であることを示す。さらに、本発明者らが同定および特徴付けした改善された特異性のＤ１１３５Ｅバリアントは、広く使用される野生型ＳｐＣａｓ９の優れた代替物を提供する。Ｄ１１３５Ｅは、カノニカルＮＧＧ ＰＡＭを有する部位に対して野生型ＳｐＣａｓ９と類似の活性を有するが、ミスマッチスペーサー配列およびカノニカルまたは非カノニカルＰＡＭのいずれかを担持するオフターゲット部位のゲノムワイド開裂を低減させる。
本試験において遺伝子操作されたＳｐＣａｓ９バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によりアクセス可能な部位を大幅に増加させ、これは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラットフォームを使用して効率的なＨＤＲを実現する機会、ＮＨＥＪ媒介インデルを小さい遺伝子エレメントに標的化する機会、およびＰＡＭについての要求を活用して同一細胞中の２つの異なるアレルを区別する機会をさらに向上させる。変更ＰＡＭ特異性のＳｐＣａｓ９バリアントは、現在、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の両方でＳｐＣａｓ９により標的化可能でない内在性遺伝子部位を効率的に崩壊させ得、それらは種々の異なる細胞タイプおよび生物中で機能することを示唆する。重要なことに、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験は、ＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの全体プロファイルが、野生型ＳｐＣａｓ９について観察されるものと類似し、またはそれよりも良好であることを示す。さらに、本発明者らが同定および特徴付けした改善された特異性のＤ１１３５Ｅバリアントは、広く使用される野生型ＳｐＣａｓ９の優れた代替物を提供する。Ｄ１１３５Ｅは、カノニカルＮＧＧ ＰＡＭを有する部位に対して野生型ＳｐＣａｓ９と類似の活性を有するが、ミスマッチスペーサー配列およびカノニカルまたは非カノニカルＰＡＭのいずれかを担持するオフターゲット部位のゲノムワイド開裂を低減させる。
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９バリアントの全ては、例えば、簡易な部位特異的突然変異誘発により既存および広く使用されるベクター中に迅速に取り込むことでき、それらはＰＡＭ相互作用ドメイン内に含有される少数の突然変異のみを要求するため、バリアントはまた、ＳｐＣａｓ９プラットフォームの他の既に記載の改善とともに機能するはずである（例えば、トランケートｓｇＲＮＡ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９−２８４（２０１４））、ニッカーゼ突然変異（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８３３−８３８（２０１３）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４，１３８０−１３８９（２０１３））、二量体ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合物（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５７７−５８２（２０１４）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５６９−５７６（２０１４））。
本試験において進化させたＳｐＣａｓ９バリアントは、推定上、３番目のＰＡＭ塩基位置に接触するＲ１３３５の突然変異を超え、ＳｐＣａｓ９−ＰＡＭ構造中の３番目のＰＡＭ位置への直接または間接的接触を作製するが、それら自体はＰＡＭ塩基との接触を媒介しない残基付近またはそれに隣接して全てが局在するＤ１１３５、Ｇ１２１８、およびＴ１３３７におけるアミノ酸置換を担持する（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））（図２０ａ）。これと一致して、本発明者らは、それらの位置における種々の突然変異が、ＮＧＧ ＰＡＭを担持する部位のＳｐＣａｓ９媒介開裂に影響しないと考えられることを見出した（図２０ｂ）。これらの結果は、ＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアント中のＧ１２１８およびＴ１３３７におけるアミノ酸置換の性質と一緒に、それらの２つの位置における変更が、機能獲得突然変異であり得ることを示唆する。例えば、Ｔ１３３７Ｒ突然変異が、特にＶＲＥＲバリアントの場合、バックボーンまたはＰＡＭの４番目の位置付近もしくはそれへの塩基特異的接触を形成していることが考えられる。Ｄ１１３５における突然変異の機序的役割は、不明確のままであるが、それらは、おそらく、ＰＡＭの３番目の位置のグアニンへの副溝を介する水媒介接触の作製に関与する隣接Ｓ１１３６残基の活性に影響を及ぼし得る（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））。Ｄ１１３５Ｅ突然変異は、このネットワークを崩壊させることにより特異性を改善し得、おそらく標的部位とのＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の相互作用エネルギー全体を低減させ、本発明者らが既に提案した機序は、エネルギー的に好ましくないそれらの不所望な配列の開裂を作製することによりオフターゲット効果を低減させ得る（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９−２８４（２０１４））。
本発明の結果は、変更ＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼの遺伝子操作の実行可能性を明らかに確立する。既に記載されている追加のＣａｓ９オルソログの特徴付け（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（２０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４））またはドメイン交換Ｃａｓ９キメラの生成（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１５６（５）：９３５−４９（２０１４））も、異なるＰＡＭを標的化する潜在的な手法を提供する。本明細書に記載の遺伝子操作方針は、そのようなオルソログまたは合成ハイブリッドＣａｓ９を用いて実施して標的化可能なＰＡＭの範囲をさらに多様化させることもできる。Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９に対するそれらの小さいサイズを考慮した将来の遺伝子操作の試行ならびに本発明者らの細菌選択系およびヒト細胞中のそれらのロバストなゲノム編集活性の本発明者らの実証のために特に魅力的なフレームワークをなす。
本発明者らの結果は、野生型ＳａＣａｓ９中のＲ１０１５が３番目のＰＡＭ位置のＧに接触することを強く示唆した。理論により拘束されるものではないが、Ｒ１０１５Ｈ置換は、この接触を除去し、３番目の位置における特異性を緩和させ得；しかしながら、Ｒ１０１５のＧへの接触の損失はまた、標的部位結合に関連するエネルギーを認識可能に低減させ得、それは、なぜＲ１０１５Ｈ突然変異単独が、ヒト細胞中のＮＮＮＲＲＴ部位におけるロバストな活性に十分でないかを説明し得る。Ｅ７８２ＫおよびＮ９６８Ｋ置換の両方が陽性電荷を追加するため、それらは、ＤＮＡリン酸骨格との非特異的相互作用をなしてＲ１０１５のグアニンへの接触の損失をエネルギー的に補い得ることが考えられる。
本明細書に記載の遺伝的アプローチは、構造情報を要求せず、したがって、多くの他のＣａｓ９オルソログに適用可能であるはずである。拡大ＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼを進化させるための唯一の要求は、それらが細菌ベース選択において機能することである。従来の研究が、高度に関連するＣａｓ９オルソログのＰＡＭ相互作用ドメインを交換することによりＰＡＭ認識を変更し得ることを実証した一方（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４））、依然として、この方針がより多様なオルソログを使用する場合に一般化可能であり、または有効であるか否かを決定すべきである。対照的に、本発明者らが本明細書に記載した進化方針は、天然Ｃａｓ９オルソログ内でコードされるものを超えてＰＡＭ認識特異性を遺伝子操作するために使用することができる。この全体方針は、天然に存在する多数のＣａｓ９オルソログの標的化範囲を広げ、その有用性を拡張するために用いることができる。
変更特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアント
したがって、本明細書において、ｓｐＣａｓ９バリアントが提供される。ＳｐＣａｓ９野生型配列は、以下のとおりである。
したがって、本明細書において、ｓｐＣａｓ９バリアントが提供される。ＳｐＣａｓ９野生型配列は、以下のとおりである。
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７（またはそれらに相似する位置）の１つ以上における突然変異を含み得る。一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を含む。一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％同一であり、例えば、保存的突然変異により置き換えられている、例えば、配列番号１の残基の最大５％、１０％、１５％、または２０％における差異を有する。好ましい実施形態において、バリアントは、親の所望の活性、例えば、ヌクレアーゼ活性（親がニッカーゼまたはデッドＣａｓ９である場合を除外する）、ならびに／またはガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ）と相互作用する能力を保持する。
２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、最適な比較目的のために配列をアラインする（例えば、最適なアラインメントのため、ギャップを第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方の中に導入することができ、比較目的のために、非相同配列を無視することができる）。比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態において、少なくとも９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のヌクレオチドにより占有される場合、その分子はその位置において同一である（本明細書において使用される核酸「同一性」は、核酸「相同性」に相当する）。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列により共有される同一位置の数の関数であり、それら２つの配列の最適なアラインメントのために導入が必要とされるギャップの数、およびそれぞれのギャップの長さを考慮する。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の同一性パーセントは、当技術分野の技能の範囲内の種々の手段で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４７：１９５−７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれた“ＢｅｓｔＦｉｔ”（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１））、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ，ｐｐ ３５３−３５８；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して決定する。さらに、当業者は、アラインメントを計測するための適切なパラメータ、例として、比較される配列の長さにわたり最大アラインメントを達成するために必要される任意のアルゴリズムを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸について、比較の長さは、全長以下の任意の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）であり得る。本組成物および方法の目的のため、配列の全長の少なくとも８０％は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびデフォルトパラメータを使用してアラインする。
本発明の目的のため、２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列をギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で使用して達成することができる。
保存的置換としては、典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換が挙げられる。
一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異の組：Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）の１つを含む。
一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性にするため、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減させ、または破壊する以下の突然変異：Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６およびＨ８４０またはＮ８６３の１つ、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙも含み；それらの位置における置換は、アラニン（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６，９３５−９４９（２０１４）におけるとおり）、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリン、またはアスパラギン酸、例えば、Ｅ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３Ｓ、またはＮ８６３Ｈであり得る（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット参照）。一部の実施形態において、バリアントは、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ（一本鎖ニッカーゼを作出する）における突然変異、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ（ヌクレアーゼ活性を解消する；この突然変異体は、デッドＣａｓ９またはｄＣａｓ９として公知である）における突然変異を含む。
本明細書において、ＳａＣａｓ９バリアントも提供される。ＳａＣａｓ９野生型配列は、以下のとおりである。
本明細書に記載のＳａＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５（またはそれらに相似する位置）の１つ以上における突然変異を含む。一部の実施形態において、バリアントは、以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎの１つ以上を含む。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、突然変異Ｅ７８２Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ｎ９６８Ｋ、およびＲ１０１５Ｘ（Ｘは、Ｒ以外の任意のアミノ酸である）を含む。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％同一であり、例えば、保存的突然変異により置き換えられている、例えば、配列番号２の残基の最大５％、１０％、１５％、または２０％における差異を有する。好ましい実施形態において、バリアントは、親の所望の活性、例えば、ヌクレアーゼ活性（親がニッカーゼまたはデッドＣａｓ９である場合を除外する）、ならびに／またはガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ）と相互作用する能力を保持する。
一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性にするため、ＳａＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減させ、または破壊し得る以下の突然変異：Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、Ｎ５８０Ａ、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｈ５５７Ａおよび／またはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａも含み；それらの位置における置換は、アラニン（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６，９３５−９４９（２０１４）におけるとおり）、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリン、またはアスパラギン酸であり得る。一部の実施形態において、バリアントは、Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、またはＮ５８０Ａ（一本鎖ニッカーゼを作出し得る）における突然変異、またはＤ１０Ａ／Ｈ５５７Ａおよび／もしくはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａ（ＳｐＣａｓ９と同様にヌクレアーゼ活性を解消し得；それらは、デッドＣａｓ９またはｄＣａｓ９と称される）における突然変異を含む。
本明細書において、任意選択的に、バリアントタンパク質の発現のための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されているＳｐＣａｓ９および／またはＳａＣａｓ９バリアントをコードする単離核酸、単離核酸を含むベクター、ならびにその核酸を含み、および任意選択的にバリアントタンパク質を発現する宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞も提供される。
本明細書に記載のバリアントは、細胞のゲノムを変更するために使用することができ；本方法は、一般に、細胞中でバリアントタンパク質を、細胞のゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡとともに発現させることを含む。細胞のゲノムを選択的に変更する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１８９７７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；；；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１５００４５５４６号明細書；米国特許出願公開第２０１５００３１１３４号明細書；米国特許出願公開第２０１５００２４５００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３７７８６８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３４９４００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３３５０６３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３１５９８５号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３１０８３０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３１０８２８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３０９４８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３０４８５３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９８５４７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９５５５６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９４７７３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２８７９３８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３１号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７１９８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２５６０４６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４８７０２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２７０２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２６６４号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２３４９７２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２２７７８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２１２８６９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２０１８５７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１９９７６７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８９８９６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９１９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６８４３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７９７７０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７９００６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７０７５３号明細書；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”９（６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４６７−４７７（１−２３）（Ｊｕｎ．２０１１）；Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ”４８２ Ｎａｔｕｒｅ ３３１−３３８（Ｆｅｂ．１６，２０１２）；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”１０９（３９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ Ｅ２５７９−Ｅ２５８６（Ｓｅｐ．４，２０１２）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｄｕａｌ−ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”３３７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８１６−８２１（Ａｕｇ．１７，２０１２）；Ｃａｒｒｏｌｌ，“Ａ ＣＲＩＳＰＲ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”２０（９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６５８−１６６０（Ｓｅｐ．２０１２）；２０１２年５月２５日に出願された米国特許出願第６１／６５２，０８６号明細書；Ａｌ−Ａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲｓ）：Ｔｈｅ Ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ ａｎ Ｉｎｇｅｎｉｏｕｓ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１１）ｖｏｌ．３９２，Ｉｓｓｕｅ ４，ｐｐ．２７７−２８９；Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ Ｔｈａｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｓ ＲＡＭＰ Ｍｏｄｕｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｏ Ｃｌｅａｖｅ ＲＮＡｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，（２０１２）ｖｏｌ．４５，Ｉｓｓｕｅ ３，２９２−３０２を参照されたい。
本明細書に記載のバリアントタンパク質は、上記の参照文献に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質に代えて、以下の表４によるＰＡＭ配列を有する配列を標的化するガイドＲＮＡとともに使用することができる。
さらに、本明細書に記載のバリアントは、当技術分野において公知の野生型Ｃａｓ９または他のＣａｓ９突然変異（例えば、上記のｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼ）に代えて融合タンパク質、例えば、国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに記載の異種機能ドメインを有する融合タンパク質中で使用することができる。例えば、バリアント、好ましくは、１つ以上のヌクレアーゼ低減または殺傷突然変異を含むバリアントをＣａｓ９のＮまたはＣ末端上で、転写活性化ドメインまたは他の異種機能ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤなど、例えば、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）リプレッサードメイン（ＥＲＤ）のアミノ酸４７３〜５３０、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１〜９７、またはＭａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１〜３６；Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：１４６２８−１４６３３（１９９８）参照）またはサイレンサー、例えば、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても公知）、例えば、ＨＰ１αまたはＨＰ１β；固定ＲＮＡ結合配列に融合している長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）をリクルートし得るタンパク質またはペプチド、例えば、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮタンパク質により結合されるものに融合させることができ；当技術分野において公知のＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質）；またはヒストンサブユニットを改変する酵素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基のメチル化のため）またはヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基の脱メチル化のため））を使用することもできる。多数のこのようなドメインの配列、例えば、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインが当技術分野において公知である。例示的なタンパク質としては、テンイレブントランスロケーション（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ−Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）（ＴＥＴ）１〜３ファミリー、ＤＮＡ中の５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）に変換する酵素が挙げられる。
ヒトＴＥＴ１〜３配列は当技術分野において公知であり、それを以下の表に示す。
一部の実施形態において、触媒ドメインの全長配列の全部または一部、例えば、システインリッチ伸長部および７つの高度に保存されるエキソンによりコードされる２ＯＧＦｅＤＯドメイン、例えば、アミノ酸１５８０〜２０５２を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、アミノ酸１２９０〜１９０５を含むＴｅｔ２、およびアミノ酸９６６〜１６７８を含むＴｅｔ３を含む触媒モジュールを含めることができる。３つ全てのＴｅｔタンパク質中のキー触媒残基を説明するアラインメント、および全長配列についてのその補助材料については、例えば、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．２００９ Ｊｕｎ １；８（１１）：１６９８−７１０．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ ２７の図１を参照されたい（例えば、ｓｅｑ ２ｃ参照）；一部の実施形態において、配列は、Ｔｅｔ１のアミノ酸１４１８〜２１３６またはＴｅｔ２／３中の対応領域を含む。
他の触媒モジュールは、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９において同定されたタンパク質からのものであり得る。
一部の実施形態において、異種機能ドメインは、生物学的係留物であり、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮタンパク質の全部または一部（例えば、それからのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。これらのタンパク質は、特異的ステム−ループ構造を含有するＲＮＡ分子をｄＣａｓ９ ｇＲＮＡ標的化配列により規定される場所にリクルートするための使用することができる。例えば、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮに融合しているｄＣａｓ９バリアントは、Ｃｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮ結合配列に結合している長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、例えば、ＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲをリクルートするために使用することができる；例えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １００：１２５−１３８（２００８）を参照されたい。あるいは、Ｃｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮタンパク質結合配列は、例えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，前掲に記載のとおり、別のタンパク質に結合させることができ、本明細書に記載の方法および組成物を使用してタンパク質をｄＣａｓ９バリアント結合部位に標的化させることができる。一部の実施形態において、Ｃｓｙ４は、触媒的に不活性である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９バリアント、好ましくは、ｄＣａｓ９バリアントは、国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレットに記載のとおり、ＦｏｋＩに融合している。
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９バリアントおよび異種機能ドメイン間のリンカーを含む。これらの融合タンパク質中（または連結構造の融合タンパク質間）で使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配列を含み得る。好ましい実施形態において、リンカーは、短鎖であり、例えば、２〜２０アミノ酸であり、典型的には、フレキシブルである（すなわち、高い自由度を有するアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、およびセリンを含む）。一部の実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号１８８）またはＧＧＧＧＳ（配列番号１８９）からなる１つ以上の単位、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１８８）またはＧＧＧＧＳ（配列番号１８９）単位の２、３、４つ、またはそれより多いリピートを含む。他のリンカー配列を使用することもできる。
発現系
本明細書に記載のＣａｓ９バリアントを使用するため、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましいことがある。これは、種々の手段で実施することができる。例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸を、複製および／または発現のための原核または真核細胞中への形質転換のための中間ベクター中にクローニングすることができる。中間ベクターは、典型的には、Ｃａｓ９バリアントの産生のためのＣａｓ９バリアントをコードする核酸の貯蔵または操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド、もしくはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原虫細胞への投与のための発現ベクター中にクローニングすることもできる。
本明細書に記載のＣａｓ９バリアントを使用するため、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましいことがある。これは、種々の手段で実施することができる。例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸を、複製および／または発現のための原核または真核細胞中への形質転換のための中間ベクター中にクローニングすることができる。中間ベクターは、典型的には、Ｃａｓ９バリアントの産生のためのＣａｓ９バリアントをコードする核酸の貯蔵または操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド、もしくはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原虫細胞への投与のための発現ベクター中にクローニングすることもできる。
発現を得るため、Ｃａｓ９バリアントをコードする配列は、典型的には、転写を指向するためのプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングする。好適な細菌および真核生物プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２０１０）に記載されている。遺伝子操作タンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）において利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５）。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系も、当技術分野において周知であり、それらも市販されている。
核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。例えば、強力な構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製に使用される。対照的に、Ｃａｓ９バリアントを遺伝子調節のためにインビボ投与すべき場合、Ｃａｓ９バリアントの特定の使用に応じて構成的または誘導性プロモーターのいずれかを使用することができる。さらに、Ｃａｓ９バリアントの投与に好ましいプロモーターは、弱いプロモーター、例えば、ＨＳＶ ＴＫまたは類似の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターは、トランス活性化に応答性であるエレメント、例えば、低酸素症応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびに小分子制御系、例えば、テトラサイクリン調節系およびＲＵ−４８６系も含み得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：４９１−４９６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８：１１４７−５５；およびＲｅｎｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７５７−７６１参照）。
プロモーターに加え、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいずれであれ、宿主細胞中の核酸の発現に要求される全ての追加のエレメントを含有する転写単位または発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸配列に作動可能に結合しているプロモーター、および例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に要求される任意のシグナルを含有する。カセットの追加のエレメントとしては、例えば、エンハンサー、および異種スプライシングイントロンシグナルを挙げることができる。
遺伝子情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、Ｃａｓ９バリアントの目的の使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物中などでの発現に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびに市販のタグ融合発現系、例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺが挙げられる。
真核発現ベクターでは、真核生物ウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルス由来のベクターを使用することが多い。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞中での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指向下でタンパク質の発現を可能とする他の任意のベクターが挙げられる。
Ｃａｓ９バリアントを発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミド形質移入後に哺乳動物細胞中でのＣａｓ９バリアントの発現を可能とする。
一部の発現系は、安定的に形質移入された細胞系を選択するためのマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。高収率の発現系、例えば、バキュロウイルスベクターを昆虫細胞中で、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下でｇＲＮＡコード配列とともに使用するものも好適である。
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域中のユニーク制限部位も挙げられる。
標準的な形質移入法を使用して大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞系を産生し、次いで標準的な技術を用いてそのタンパク質を精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７６１９−２２；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，１９９０）参照）。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３参照）。
宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入する公知の手順のいずれかを使用することができる。このような方法としては、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム型および組込み型の両方）およびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞内に導入する他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲参照）。唯一必要なことは、使用される特定の遺伝子操作手順が、Ｃａｓ９バリアントを発現し得る宿主細胞内に少なくとも１つの遺伝子を良好に導入し得ることである。
本発明は、ベクターおよびベクターを含む細胞を含む。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それらの実施例は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
方法
実施例１および２では、以下の材料および方法を使用した。
実施例１および２では、以下の材料および方法を使用した。
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
本試験において使用される親構築物についての概略図およびＤＮＡ配列は、図５Ａ〜Ｊおよび配列番号７〜２０に見出すことができる。陽性選択プラスミド、陰性選択プラスミド、および部位枯渇ライブラリーを生成するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列は、表１において入手可能である。本試験における全てのｇＲＮＡ標的の配列は、表２において入手可能である。Ｃａｓ９中の点突然変異は、ＰＣＲにより生成した。
本試験において使用される親構築物についての概略図およびＤＮＡ配列は、図５Ａ〜Ｊおよび配列番号７〜２０に見出すことができる。陽性選択プラスミド、陰性選択プラスミド、および部位枯渇ライブラリーを生成するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列は、表１において入手可能である。本試験における全てのｇＲＮＡ標的の配列は、表２において入手可能である。Ｃａｓ９中の点突然変異は、ＰＣＲにより生成した。
Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを別個に発現させるための２つのＴ７プロモーターを有する細菌Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）についてのＣａｓ９（ＢＰＫ７６４、ＪＤＳ２４６からサブクローニングされたＳｐＣａｓ９配列１７）、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１からのＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９についてのＣａｓ９（ＭＳＰ１６７３、既に公開された記載から改変されたＳｔ１Ｃａｓ９配列２０）、および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）についてのＣａｓ９（ＢＰＫ２１０１、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｊ７ＲＵＡ５からコドン最適化されたＳａＣａｓ９配列）のヒトコドン最適化バージョンをコードする。ＳｐＣａｓ９３４，３５およびＳｔ１Ｃａｓ９２０については、既に記載されているｓｇＲＮＡ配列を利用した一方、ＳａＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲｆｉｎｄｅｒを使用するｃｒＲＮＡリピートについてのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｃｈｉｖｅ配列ＨＥ９８０４５０の検索、および既に記載されているものと同様の生物情報学的アプローチを使用するｔｒａｃｒＲＮＡの同定により決定した３６。ｓｇＲＮＡのスペーサー相補性領域を完成させるためにアニールされるオリゴをＢｓａＩ切断ＢＰＫ７６４およびＢＰＫ２１０１、またはＢｓｐＭＩ切断ＭＳＰ１６７３中にライゲートした（５’−ＡＴＡＧをスペーサーに付加してトップオリゴを生成し、５’−ＡＡＡＣをスペーサー配列の逆相補鎖に付加してボトムオリゴを生成する）。
Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＳｐＣａｓ９の残基１０９７〜１３６８を約５．２個の置換／キロベースの率においてランダムに突然変異させて突然変異ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインライブラリーを生成した。それぞれのＰＩドメインライブラリーの理論複雑度は、得られた形質転換体の数に基づき１０７個超のクローンであると推定された。陽性および陰性選択プラスミドは、ＸｂａＩ／ＳｐｈＩまたはＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ切断ｐ１１−ｌａｃＹ−ｗｔｘ１１７中にアニールされる標的部位オリゴをそれぞれライゲートすることにより生成した。
２つのランダム化ＰＡＭライブラリー（それぞれ異なるプロトスペーサー配列を有する）は、クレノウ（−エキソ）を使用して構築し、プロトスペーサーの３’末端に直接隣接する６つのランダム化ヌクレオチドを含有するオリゴのボトム鎖をフィルインした（表１参照）。二本鎖産物をＥｃｏＲＩにより切断し、切断ｐ１１−ｌａｃＹ−ｗｔｘ１中へのライゲーションのためのＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ末端を残した。それぞれのランダム化ＰＡＭライブラリーの理論複雑度は、得られた形質転換体の数に基づき１０６個超であることが推定された。
ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９バリアントは、ＪＤＳ２４６１６に由来するベクターからヒト細胞中で発現させた。Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９について、ＭＳＰ１６７３およびＢＰＫ２１０１からのＣａｓ９ ＯＲＦをＣＡＧプロモーターベクター中にサブクローニングして、それぞれＭＳＰ１５９４およびＢＰＫ２１３９を生成した。ｓｇＲＮＡのＵ６発現のためのプラスミド（その中に、所望のスペーサーオリゴをクローニングすることができる）は、ＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ（ＢＰＫ１５２０）、Ｓｔ１Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ（ＢＰＫ２３０１）、およびＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ（ＶＶＴ１）について上記のｓｇＲＮＡ配列を使用して生成した。ｓｇＲＮＡのスペーサー相補性領域を完成させるためにアニールされるオリゴをそれらのベクターのＢｓｍＢＩオーバーハング中にライゲートした（５’−ＣＡＣＣをスペーサーに付加してトップオリゴを生成し、５’−ＡＡＡＣをスペーサー配列の逆相補鎖に付加してボトムオリゴを生成する）。
ＳｐＣａｓ９バリアントを進化させるための細菌ベース陽性選択アッセイ
陽性選択プラスミド（標的部位が埋め込まれた）を含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）２３をＣａｓ９／ｓｇＲＮＡコードプラスミドにより形質転換した。ＳＯＢ培地中の６０分間のリカバリー後、クロラムフェニコール（非選択）またはクロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース（選択）のいずれかを含有するＬＢ培地上で形質転換物をプレーティングした。陽性選択プラスミドの開裂は、生存頻度：選択プレート上のコロニー／非選択プレート上のコロニーを計算することにより推定した（図１２も参照）。
陽性選択プラスミド（標的部位が埋め込まれた）を含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）２３をＣａｓ９／ｓｇＲＮＡコードプラスミドにより形質転換した。ＳＯＢ培地中の６０分間のリカバリー後、クロラムフェニコール（非選択）またはクロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース（選択）のいずれかを含有するＬＢ培地上で形質転換物をプレーティングした。陽性選択プラスミドの開裂は、生存頻度：選択プレート上のコロニー／非選択プレート上のコロニーを計算することにより推定した（図１２も参照）。
新規ＰＡＭを開裂し得るＳｐＣａｓ９バリアントについて選択するため、標的部位＋目的のＰＡＭをコードする陽性選択プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）細胞中に、ＰＩドメイン突然変異Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドライブラリーをエレクトロポレートした。一般に、約５０，０００個のクローンをスクリーニングして５０〜１００個の生存物を得た。生存クローンのＰＩドメインをフレッシュなバックボーンプラスミド中にサブクローニングし、陽性選択において再試験した。活性についてのこの第２のスクリーンにおいて１０％超の生存率を有したクローンをシーケンシングした。シーケンシングされたクローン中で観察された突然変異を、生存クローン中のそれらの頻度、置換のタイプ、ＳｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ結晶構造（ＰＤＢ：４ＵＮ３）１４中のＰＡＭ塩基への近接性、および（一部の場合）ヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイにおける活性に基づきさらなる評価のために選択した。
Ｃａｓ９ＰＡＭ特異性をプロファイルするための細菌ベース部位枯渇アッセイ
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）を、開裂性または非開裂性標的部位を保有する陰性選択プラスミドにより形質転換した。ＳＯＢ培地中の６０分間のリカバリー後、クロラムフェニコール＋カルベニシリンを含有するＬＢ培地上で形質転換物をプレーティングした。陰性選択プラスミドの開裂は、形質転換されたＤＮＡ１μｇ当たりのコロニー形成単位を計算することにより推定した（図１３も参照）。
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）を、開裂性または非開裂性標的部位を保有する陰性選択プラスミドにより形質転換した。ＳＯＢ培地中の６０分間のリカバリー後、クロラムフェニコール＋カルベニシリンを含有するＬＢ培地上で形質転換物をプレーティングした。陰性選択プラスミドの開裂は、形質転換されたＤＮＡ１μｇ当たりのコロニー形成単位を計算することにより推定した（図１３も参照）。
陰性選択は、適切なＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドを既に保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）細胞中にそれぞれのランダム化ＰＡＭライブラリーをエレクトロポレートすることにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＰＡＭ特異性プロファイルを決定するように適合させた。８０，０００〜１００，０００個のコロニーをＬＢ＋クロラムフェニコール＋カルベニシリンプレート上で低密度スプレッドにおいてプレーティングした。Ｃａｓ９による開裂が生じない陰性選択プラスミドを含有する生存コロニーをハーベストし、プラスミドＤＮＡをマキシプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。得られたプラスミドライブラリーは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）使用するＰＣＲと、それに続くＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰクリーンアップステップ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）とにより増幅した。それぞれの部位枯渇実験についての約５００ｎｇのクリーンＰＣＲ産物から、ＫＡＰＡ ＨＴＰライブラリー調製キット（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して二重インデックス化Ｔｒｕ−Ｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングライブラリーを調製した。Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上で１５０ｂｐペアドエンドシーケンシングが実施された。
それぞれのＭｉＳｅｑランについて出力された未処理ＦＡＳＴＱファイルをＰｙｔｈｏｎプログラムにより分析して相対ＰＡＭ枯渇を決定した。プログラム（方法参照）は、以下のとおり作動する：第１に、所与の実験についての全てのＦＡＳＴＱリードファイルを選択することができるファイルダイアログを使用者に提示する。これらのファイルについて、それぞれのＦＡＳＴＱエントリーを両方の鎖上の固定スペーサー領域についてスキャンする。スペーサー領域が見出される場合、スペーサー領域をフランキングする６つの変動ヌクレオチドを捕捉し、カウンタに付加する。この検出された変動領域の組から、それぞれの考えられる位置における長さ２〜６ｎｔのそれぞれのウインドウのカウントおよび頻度を一覧にした。両方のランダム化ＰＡＭライブラリーについての部位枯渇データは、選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）：選択集団におけるＰＡＭの選択後頻度を、そのＰＡＭの選択前ライブラリー頻度により除したものを計算することにより分析した。ＰＰＤＶ分析は、６ｂｐランダム化領域中の全ての考えられる２〜６長のウインドウにわたるそれぞれの実験について実施した。ＰＡＭ優先性を可視化するために本発明者らが使用したウインドウは、野生型およびバリアントＳｐＣａｓ９実験についての２番目、３番目、および４番目のＰＡＭ位置を表す３ｎｔウインドウ、ならびにＳｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９についての３番目、４番目、５番目、６番目のＰＡＭ位置を表す４ｎｔウインドウであった。
ＰＰＤＶについての２つの有意性閾値は、１）ｄＣａｓ９対選択前ライブラリー対数リードカウント比の分布に基づく統計的有意性閾値（図１３ｃおよび１３ｄ参照）、ならびに２）ヒト細胞における枯渇値および活性間の経験的相関に基づく生物学的活性閾値に基づき決定した。統計的閾値は、ｄＣａｓ９についての平均ＰＰＤＶからの３．３６標準偏差（０．８５の相対ＰＰＤＶに相当）において設定し、それは多重比較のための調整後の０．０５の正規分布両側ｐ値に対応する（すなわち、ｐ＝０．０５／６４）。生物学的活性閾値は、５倍枯渇（０．２のＰＰＤＶに相当）において設定した。なぜなら、この枯渇のレベルがヒト細胞における活性の妥当な予測因子として機能するためである（図１４も参照）。図１４の９５％信頼区間は、平均の標準偏差を、１．９６により乗じた試料サイズの平方根により除することにより計算した。
ヒト細胞培養および形質移入
構成的に発現されるＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一インテグレートコピーを保有するＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞１５を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８が補給されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃において５％ＣＯ２を用いて培養した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのＤＮ−１００プログラムを製造業者のプロトコルに従って使用して、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミド（特に注釈のない限り）により、細胞を同時形質移入した。空のＵ６プロモータープラスミドと一緒に形質移入されるＣａｓ９プラスミドを全てのヒト細胞実験についての陰性対照として使用した。内在性遺伝子実験についての標的部位を野生型ＳｐＣａｓ９により開裂可能なＮＧＧ部位の２００ｂｐ内で選択した（図１６ａおよび表２参照）。
構成的に発現されるＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一インテグレートコピーを保有するＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞１５を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８が補給されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃において５％ＣＯ２を用いて培養した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのＤＮ−１００プログラムを製造業者のプロトコルに従って使用して、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミド（特に注釈のない限り）により、細胞を同時形質移入した。空のＵ６プロモータープラスミドと一緒に形質移入されるＣａｓ９プラスミドを全てのヒト細胞実験についての陰性対照として使用した。内在性遺伝子実験についての標的部位を野生型ＳｐＣａｓ９により開裂可能なＮＧＧ部位の２００ｂｐ内で選択した（図１６ａおよび表２参照）。
ゼブラフィッシュケアおよび注射
ゼブラフィッシュケアおよび使用は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅにより承認された。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、既に記載のとおりｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰｍｅＩ消化ＪＤＳ２４６（野生型ＳｐＣａｓ９）またはＭＳＰ４６９（ＶＱＲバリアント）により転写させた２１。本試験の全てのｓｇＲＮＡは、クローニング非依存的ｓｇＲＮＡ生成法に従って調製した２４。ｓｇＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により転写させ、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により精製し、ＲＮアーゼ不含水により溶出させた。
ゼブラフィッシュケアおよび使用は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅにより承認された。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、既に記載のとおりｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰｍｅＩ消化ＪＤＳ２４６（野生型ＳｐＣａｓ９）またはＭＳＰ４６９（ＶＱＲバリアント）により転写させた２１。本試験の全てのｓｇＲＮＡは、クローニング非依存的ｓｇＲＮＡ生成法に従って調製した２４。ｓｇＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により転写させ、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により精製し、ＲＮアーゼ不含水により溶出させた。
ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９コードｍＲＮＡを一細胞期のゼブラフィッシュ胚中に同時注射した。それぞれの胚に、３０ｎｇ／μＬのｇＲＮＡおよび３００ｎｇ／μＬのＣａｓ９ ｍＲＮＡを含有する約２〜４．５ｎＬの溶液を注射した。翌日、注射された胚を立体鏡下で正常な形態発生について精査し、ゲノムＤＮＡを５〜９つの胚から抽出した。
ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイ
ＥＧＦＰ崩壊実験を既に記載のとおり実施した１６。ＥＧＦＰ発現について、形質移入された細胞を形質移入の約５２時間後にＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。バックグラウンドＥＧＦＰ損失を全ての実験について約２．５％においてゲーティングした（赤色破線としてグラフにより表示）。
ＥＧＦＰ崩壊実験を既に記載のとおり実施した１６。ＥＧＦＰ発現について、形質移入された細胞を形質移入の約５２時間後にＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。バックグラウンドＥＧＦＰ損失を全ての実験について約２．５％においてゲーティングした（赤色破線としてグラフにより表示）。
ヌクレアーゼ誘導突然変異率を定量するためのＴ７Ｅ１アッセイ、標的化ディープシーケンシング、およびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ
Ｔ７Ｅ１アッセイは、ヒト細胞１５およびゼブラフィッシュ２１について既に記載のとおり実施した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰヒト細胞について、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してゲノムＤＮＡを形質移入細胞から形質移入の約７２時間後に抽出した。表１に列記されるプライマーを使用してゼブラフィッシュまたはヒト細胞ゲノムＤＮＡからの標的遺伝子座を増幅した。ほぼ２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を変性し、アニールし、Ｔ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により消化した。突然変異誘発頻度は、ヒト細胞１５およびゼブラフィッシュ２１について既に記載のとおりＱｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅｎ）を使用して定量した。
Ｔ７Ｅ１アッセイは、ヒト細胞１５およびゼブラフィッシュ２１について既に記載のとおり実施した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰヒト細胞について、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してゲノムＤＮＡを形質移入細胞から形質移入の約７２時間後に抽出した。表１に列記されるプライマーを使用してゼブラフィッシュまたはヒト細胞ゲノムＤＮＡからの標的遺伝子座を増幅した。ほぼ２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を変性し、アニールし、Ｔ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により消化した。突然変異誘発頻度は、ヒト細胞１５およびゼブラフィッシュ２１について既に記載のとおりＱｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅｎ）を使用して定量した。
標的化ディープシーケンシングについて、表１に列記されるプライマーを用いるＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘを使用して、既に特徴付けされたオンおよびオフターゲット部位（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９−２８４（２０１４））を増幅した。ゲノム遺伝子座は、対照条件（空のｓｇＲＮＡ）、野生型、およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９について増幅した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰクリーンアップステップ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を実施してから、ライブラリー調製のためにそれぞれの条件から約５００ｎｇのＤＮＡをプールした。ＫＡＰＡ ＨＴＰライブラリー調製キット（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して二重インデックス化Ｔｒｕ−Ｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングライブラリーを生成した。Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上で１５０ｂｐペアドエンドシーケンシングが実施された。標的化ディープシーケンシングデータの突然変異分析は、既に記載のとおり実施した（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５６９−５７６（２０１４））。簡潔に述べると、ｂｗａ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１７５４−１７６０（２００９））を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑペアドエンドリードデータをヒトゲノム参照ＧＲＣｈｒ３７にマッピングした。高品質リード（品質スコア＞＝３０）を標的またはオフターゲット部位に重複するインデル突然変異について評価した。１ｂｐインデル突然変異は、それらが予測切断点の１ｂｐ内で生じない限り、分析から除外した。Ｄ１１３５Ｅを野生型ＳｐＣａｓ９に対して比較するオンおよびオフターゲット部位における活性の変化は、両方の条件からのインデル頻度を比較することにより計算した（バックグラウンド対照アンプリコンインデルレベルを超える率について）。
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験は、既に記載のとおり実施した（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））。簡潔に述べると、リン酸化ホスホロチオエート修飾二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を上記のとおりＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドとともにＣａｓ９ヌクレアーゼとともにＵ２ＯＳ細胞中に形質移入した。ｄｓＯＤＮ特異的増幅、ハイスループットシーケンシング、およびマッピングを実施してＤＳＢ活性を含有するゲノム間隔を同定した。野生型対Ｄ１１３５Ｅ実験のため、オフターゲットリードカウントをオンターゲットリードカウントに正規化して、試料間のシーケンシング深度の差を補正した。次いで、野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９についての正規化比を比較してオフターゲット部位における活性の変化倍率を計算した。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑについての野生型およびＤ１１３５Ｅ試料が、設定標的部位における類似のオリゴタグインテグレーション率を有するか否かを決定するため、表１に列記されるプライマーを使用して１００ｎｇのゲノムＤＮＡ（上記のとおり単離）からＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘにより設定標的遺伝子座を増幅することにより制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイを実施した。ほぼ１５０ｎｇのＰＣＲ産物を２０ＵのＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により３７℃において３時間消化してから、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰキットを使用してクリーンアップした。Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅｎ）を使用してＲＦＬＰ結果を定量してオリゴタグインテグレーション率を推定した。Ｔ７Ｅ１アッセイを上記のとおり同様の目的のために実施した。
実施例１
標的化範囲の制限に対処する１つの潜在的な解決策は、新規ＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９バリアントを遺伝子操作することである。ＰＡＭ特異性を変更する従来の試行は、塩基特異的ＳｐＣａｓ９−ＰＡＭ相互作用についての構造情報を利用し、２番目および３番目のＰＡＭ位置におけるグアニンヌクレオチドに接触するアルギニン残基（Ｒ１３３３およびＲ１３３５）をそれぞれ突然変異させた（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））。両方のアルギニンのグルタミンによる置換（側鎖がアデニンと相互作用すると予測され得るもの）は、インビトロで予測ＮＡＡ ＰＡＭを保有する標的を開裂し得るＳｐＣａｓ９バリアントを生じさせ得なかった（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））。ヌクレアーゼ誘導インデルが蛍光の損失をもたらすヒト細胞ベースＵ２ＯＳ ＥＧＦＰレポーター遺伝子崩壊アッセイ（Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３））を使用して、本発明者らは、Ｒ１３３３Ｑ／Ｒ１３３５Ｑ ＳｐＣａｓ９バリアントがＮＡＡ ＰＡＭを有する標的部位を効率的に開裂し得ないことを確認した（図１ａ）。さらに、本発明者らは、単一のＲ１３３３ＱおよびＲ１３３５Ｑ ＳｐＣａｓ９バリアントが、それぞれ、それらの予測ＮＡＧおよびＮＧＡ部位をそれぞれ有する標的部位を効率的に開裂し得ないことを見出した（図１ａ）。したがって、本発明者らは、ＰＡＭ特異性の再遺伝子操作は、Ｒ１３３３およびＲ１３３５以外の位置における追加の突然変異を要求し得ることを結論付けた。例えば、入手可能な構造情報は、Ｋ１１０７およびＳ１１３６が、ＰＡＭ中の２番目および３番目の塩基への直接および間接的な副溝の接触を作ることを示す（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））。したがって、これらの位置におけるまたはその付近の追加の変更は、ＰＡＭ特異性を変更することを必要とし得ることが妥当である。
標的化範囲の制限に対処する１つの潜在的な解決策は、新規ＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９バリアントを遺伝子操作することである。ＰＡＭ特異性を変更する従来の試行は、塩基特異的ＳｐＣａｓ９−ＰＡＭ相互作用についての構造情報を利用し、２番目および３番目のＰＡＭ位置におけるグアニンヌクレオチドに接触するアルギニン残基（Ｒ１３３３およびＲ１３３５）をそれぞれ突然変異させた（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））。両方のアルギニンのグルタミンによる置換（側鎖がアデニンと相互作用すると予測され得るもの）は、インビトロで予測ＮＡＡ ＰＡＭを保有する標的を開裂し得るＳｐＣａｓ９バリアントを生じさせ得なかった（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））。ヌクレアーゼ誘導インデルが蛍光の損失をもたらすヒト細胞ベースＵ２ＯＳ ＥＧＦＰレポーター遺伝子崩壊アッセイ（Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３））を使用して、本発明者らは、Ｒ１３３３Ｑ／Ｒ１３３５Ｑ ＳｐＣａｓ９バリアントがＮＡＡ ＰＡＭを有する標的部位を効率的に開裂し得ないことを確認した（図１ａ）。さらに、本発明者らは、単一のＲ１３３３ＱおよびＲ１３３５Ｑ ＳｐＣａｓ９バリアントが、それぞれ、それらの予測ＮＡＧおよびＮＧＡ部位をそれぞれ有する標的部位を効率的に開裂し得ないことを見出した（図１ａ）。したがって、本発明者らは、ＰＡＭ特異性の再遺伝子操作は、Ｒ１３３３およびＲ１３３５以外の位置における追加の突然変異を要求し得ることを結論付けた。例えば、入手可能な構造情報は、Ｋ１１０７およびＳ１１３６が、ＰＡＭ中の２番目および３番目の塩基への直接および間接的な副溝の接触を作ることを示す（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））。したがって、これらの位置におけるまたはその付近の追加の変更は、ＰＡＭ特異性を変更することを必要とし得ることが妥当である。
ＰＡＭ特異性の改変に重要であり得る追加の位置を同定するため、本発明者らは、既に使用されている細菌選択系を、ホーミングエンドヌクレアーゼの特性を試験するように適合させた（以下、陽性選択と称する）（Ｃｈｅｎ＆Ｚｈａｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，ｅ１５４（２００５）；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２８，２４７７−２４８４（２００６））。本発明者らのこの系の適合において、誘導性毒性遺伝子をコードする陽性選択プラスミドのＣａｓ９媒介開裂により、線形化プラスミドの後続の分解および損失に起因して細胞生存が可能となる（図１ｂおよび図１２ａ）。ＳｐＣａｓ９が陽性選択系において機能し得ることを確立した後、本発明者らは、野生型およびＲ１３３５Ｑバリアントの両方を、ＮＧＡ ＰＡＭを有する標的部位を保有する選択プラスミドを開裂するそれらの能力について試験し、予測されるとおり生存を観察し得なかった（図１２ａ）。機能獲得突然変異についてスクリーニングするため、本発明者らは、１キロベース当たり５．２個の突然変異の平均率でランダムに突然変異したＰＡＭ相互作用ドメイン（アミノ酸位置１０９７〜１３６８）を担持する野生型およびＲ１３３５Ｑ ＳｐＣａｓ９ライブラリーを生成した（図１２ｂおよび方法）。ＮＧＡ ＰＡＭを有する標的部位を含有する陽性選択プラスミドを有する細菌中にこれらのライブラリーを導入し、選択培地上でプレーティングした。Ｒ１３３５Ｑベースライブラリーからの生存クローンの配列により、既存のＲ１３３５Ｑ突然変異に加わった最大頻度の置換は、Ｄ１１３５Ｖ／Ｙ／Ｎ／ＥおよびＴ１３３７Ｒであることが明らかになった（表３）。本発明者らは、野生型ＳｐＣａｓ９ベースライブラリー選択についてより少ない生存物を得たが、それらのクローンの配列もＤ１１３５Ｖ／Ｙ／ＮおよびＲ１３３５Ｑ突然変異を含んだ。次に、本発明者らは、ヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してＤ１１３５Ｖ／Ｙ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ突然変異の全ての考えられる単一、二重および三重の組合せを担持するＳｐＣａｓ９をアセンブルおよび試験した。この分析は、３つ全ての位置における置換を有するＳｐＣａｓ９バリアントが、ＮＧＡ ＰＡＭに対して最大活性を示すが、ＮＧＧ ＰＡＭに対して最小活性も示すことを示した（図１ｃ）。本発明者らは、２つのＳｐＣａｓ９バリアント、Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７ＲおよびＤ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（以下、それぞれＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアントと称する）を選択した。なぜなら、それらは、さらなる特徴付けのためのＮＧＡおよびＮＧＧ ＰＡＭ間の最大の差（図１ｃ）を有したためである。
本発明者らの新規ＳｐＣａｓ９バリアントの全体ＰＡＭ特異性プロファイルを評価するため、本発明者らは、細菌ベース陰性選択系を使用した（図１ｄおよび図１３ａ）。従来の研究は、類似タイプの選択系を使用してＣａｓ９ヌクレアーゼの開裂部位優先性を同定した（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（２０１３））。このアッセイの本発明者らの変法（本発明者らは、部位枯渇アッセイと称する）では、プロトスペーサーに隣接して配置されるランダム化６ｂｐ配列を担持するプラスミドのライブラリーを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体による開裂について試験する（図１３ｂ）。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体による開裂に耐性であるプロトスペーサー隣接配列を有するプラスミドにより、抗生物質耐性遺伝子の存在に起因して細胞生存が可能となる一方、開裂性配列を担持するプラスミドは、分解され、したがって、ライブラリーから枯渇する（図１３ｂ）。約１００，０００個の標的化可能でない配列のハイスループットシーケンシングにより、任意の所与のＰＡＭについての選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）を計算することができた。ＰＡＭ（またはＰＡＭの群）のＰＰＤＶは、選択後集団中のそのＰＡＭの頻度を選択前ライブラリー中のその頻度により除したものと定義される。この定量値は、そのＰＡＭに対するＣａｓ９活性の推定値を提供する。２つのランダム化ＰＡＭライブラリー（それぞれ異なるプロトスペーサーを有する）に対して触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）について得られたプロファイルにより、任意の所与のＰＡＭまたはＰＡＭの群についてのＰＰＤＶの統計的に有意な変化を表すものを定義することが可能となった（図１３ｃ）。次いで、本発明者らは、２つのランダム化ＰＡＭライブラリーについて得られた野生型ＳｐＣａｓ９についてのＰＰＤＶが、その既に記載された標的化可能なＰＡＭのプロファイル（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（２０１３））（図１ｅ）を再現することを実証することにより本発明者らの部位枯渇アッセイをバリデートした。
部位枯渇アッセイを使用して、本発明者らは、２つのランダム化ＰＡＭライブラリーを使用してＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアントについてのＰＡＭ特異性プロファイルを得た。ＶＱＲバリアントは、ＮＧＡＮおよびＮＧＣＧ ＰＡＭを担持する部位を強力に枯渇させ、ＮＧＧＧ、ＮＧＴＧ、およびＮＡＡＧ ＰＡＭを担持する部位をより弱く枯渇させた（図１ｆ）。対照的に、ＥＱＲバリアントは、ＮＧＡＧ ＰＡＭを強力に、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＡ、およびＮＧＣＧ ＰＡＭをより弱く枯渇させ（図１ｆ）、それは、ＶＱＲバリアントに対して潜在的により制限される標的化範囲を実証した。部位枯渇アッセイにより同定されたＰＡＭがヒト細胞中でも認識することができるか否かを試験するため、本発明者らは、ＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して標的部位に対するＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアントによる開裂を評価した。ＶＱＲバリアントは、ＮＧＡＮ ＰＡＭを担持するＥＧＦＰにおける部位をロバストに開裂し（相対効率は、ＮＧＡＧ＞ＮＧＡＴ＝ＮＧＡＡ＞ＮＧＡＣである）、およびさらにＮＧＣＧ、ＮＧＧＧ、およびＮＧＴＧ ＰＡＭを担持する部位を一般により低い効率で開裂した（図１ｇ）。ＥＱＲバリアントは、ヒト細胞において他のＮＧＡＮ ＰＡＭよりもＮＧＡＧおよびＮＧＮＧ ＰＡＭについてのその優先性も再現し、ここでも全てＶＱＲバリアントよりも低い活性であった（図１ｇ）。まとめると、ヒト細胞におけるこれらの結果は、細菌部位枯渇アッセイについて観察されたものを強力に反映し（図１４）、細菌アッセイにおける０．２のＰＰＤＶ（５倍枯渇を表す）が、ヒト細胞における活性についての妥当な予測閾値を提供することを示唆した（図１４）。
次に、本発明者らは、ＮＧＣ ＰＡＭを認識し得るＳｐＣａｓ９バリアントを同定する試行により本発明者らの遺伝子操作方針の一般化可能性を拡張することを求めた。本発明者らは、最初に、シトシンと相互作用することが予測することができるＲ１３３５のアミノ酸置換（Ｄ、Ｅ、Ｓ、またはＴ）を担持するＣａｓ９突然変異体を設計し、陽性選択系を使用してＮＧＣ ＰＡＭ部位に対する活性を見出さなかった。次いで、本発明者らは、それらの単置換ＳｐＣａｓ９バリアントのそれぞれのＰＡＭ相互作用ドメインをランダムに突然変異させたが、依然として陽性選択において生存コロニーを得ることができなかった。Ｔ１３３７Ｒ突然変異は、本発明者らのＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの活性を増加させたため（図１ｃ）、本発明者らは、この突然変異と、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、またはＶのＲ１３３５置換と組み合わせ、ここでもそれらのＰＡＭ相互作用ドメインをランダムに突然変異させた。これら６つの突然変異ライブラリーの２つ（既存のＲ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７ＲおよびＲ１３３５Ｔ／Ｔ１３３７Ｒ置換を担持する）を使用する選択により、種々の追加の突然変異を保有する生存コロニーが生じた（表３）。細菌およびヒト細胞ベースアッセイの両方を使用する種々の選択クローンの特徴付けは、特に４つの位置における置換（Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ）が、ＮＧＣ ＰＡＭの開裂に重要であると考えられることを示唆した。ＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用するこれらの突然変異の全ての潜在的な単一、二重、三重、および四重の組合せのアセンブリおよび試験は、四重ＶＲＥＲバリアントがＮＧＣＧ ＰＡＭに対する最大活性およびＮＧＧＧ ＰＡＭに対する最小活性を示すことを確立した（図１ｈ）。部位枯渇アッセイを使用するＶＲＥＲバリアントの分析により、それは、ＮＧＣＧ ＰＡＭに高度に特異的であることが明らかになった（図１ｉ）。この結果と一致して、ＶＲＥＲバリアントを用いてヒト細胞において実施されたＥＧＦＰ崩壊アッセイにより、ＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位の効率的な開裂、ＮＧＣＡ、ＮＧＣＣ、およびＮＧＣＴ ＰＡＭを有する部位の大幅に減少した不一致の開裂、ならびにＮＧＡＧ、ＮＧＴＧ、およびＮＧＧＧ ＰＡＭを有する部位に対する本質的な無活性が明らかになった（図１ｊ）。
本発明者らのＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントが、野生型ＳｐＣａｓ９により現在、改変可能でない部位を標的化し得ることを直接実証するため、本発明者らは、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の内在性遺伝子に対するそれらの活性を試験した。単細胞ゼブラフィッシュ胚において、本発明者らは、ＶＱＲバリアントが、ＮＧＡＧ ＰＡＭを担持する内在性遺伝子部位を２０〜４３％の平均突然変異誘発頻度で効率的に改変し得ること（図２ａ）、およびインデルが予測開裂部位において生じることを見出した（図１５）。ヒト細胞において、本発明者らは、ＶＱＲバリアントが、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、およびＮＧＡＡ ＰＡＭを保有する４つの異なる内在性遺伝子にわたる１６個の部位をロバストに改変することを見出した（６〜５３％の範囲、平均３３％；図２ｂおよび図１６ａ）。重要なことに、本発明者らは、野生型ＳｐＣａｓ９が、ゼブラフィッシュおよびヒト細胞中のＮＧＡＧおよびＮＧＡＴ ＰＡＭを有する同一部位のほとんどを効率的に変更し得ないことを確認したが（図１６ｂ）、ＮＧＧ ＰＡＭを担持する隣接部位を効率的に改変し得た（図１６ｂ）。同様に、３つの内在性ヒト遺伝子にわたるＮＧＣＧ ＰＡＭを有する９つの部位におけるＶＲＥＲバリアント活性を試験した場合、本発明者らはまた、ロバストな平均崩壊頻度を観察した（５〜３６％の範囲、平均２１％；図２ｄ）。本発明者らの部位枯渇データ（図１ｅおよび１ｆ）と一致して、ＶＱＲバリアントは、ＶＲＥＲバリアントについて観察されたものと同様にＮＧＣＧ ＰＡＭ部位の効率を変更した一方、野生型ＳｐＣａｓ９は変更し得なかった（図２ｄ）。参照ヒトゲノム配列のコンピュータ分析は、本発明者らのＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの追加が、野生型ＳｐＣａｓ９単独について既に考えられたものと比較して潜在的な標的部位の範囲を２倍にすることを示す（図２ｅ）。まとめると、これらの結果は、本発明者らの遺伝子操作ＳｐＣａｓ９バリアントが、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の従来アクセス不可能な内在性部位を改変し得ることによりＳｐＣａｓ９の標的化範囲を広げることを実証する。
本発明者らのＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼのゲノムワイド特異性を決定するため、本発明者らは、近年記載されたＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（シーケンシングによる二本鎖分解のゲノムワイドな偏りのない識別）法１０を使用してヒト細胞におけるそれらのＳｐＣａｓ９バリアントのオフターゲット開裂イベントをプロファイリングした。本発明者らは、設定オンターゲット部位における高い改変効率を誘導し得ること本発明者らが示した合計１３個の異なるｓｇＲＮＡ（図２ｂおよび２ｄから、それぞれＶＱＲについて８つ、およびＶＲＥＲについて５つ）を使用してＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントのゲノムワイド活性をプロファイリングした。これらのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験について、多数の重要な観察が見られた：ヒト細胞中で本発明者らのＳｐＣａｓ９バリアントにより誘導されたオフターゲットＤＳＢの数は、野生型ＳｐＣａｓ９について既に観察されたものと同等である（またはＶＲＥＲバリアントの場合、おそらくよりいっそう良好である）（図２ｆ）。本発明者らは、ＶＲＥＲについて観察された高いゲノムワイド特異性が、ＮＧＣＧ ＰＡＭについてのその制限された特異性、およびおそらくヒトゲノム中のＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位の相対枯渇の両方から生じ得たことを留意する（図２ｅ）２１。さらに、観察されたオフターゲット部位は、一般に、１塩基だけ３’に「シフトした」ＰＡＭ（図１ｆおよび１ｉからのＰＡＭを図１７の部位のものと比較する）についていくらかの寛容を含む、本発明者らの部位枯渇実験により予測される予測ＰＡＭ配列を有する。最後に、本発明者らのＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントについてのオフターゲット部位中に見出されたミスマッチの位置および数（図１７）は、それらの分布において、非反復配列に標的化されるｓｇＲＮＡについて野生型ＳｐＣａｓ９について本発明者らが既に観察したものと類似する１０。
従来の研究は、ＳｐＣａｓ９による不完全なＰＡＭ認識が、ヒト細胞中の非カノニカルＮＡＧ、ＮＧＡ、および他のＰＡＭを含有する不所望な部位の認識をもたらし得ることを示している（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７−８３２（２０１３）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８３３−８３８（２０１３）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ４，５４０５（２０１４））。したがって、本発明者らは、ＰＡＭ相互作用を媒介する残基におけるまたはその付近の突然変異が、ＳｐＣａｓ９ＰＡＭ特異性を改善し得るか否かの探索に関心を向けた。ＶＱＲバリアントの遺伝子操作の間、本発明者らは、Ｄ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９突然変異体が、野生型ＳｐＣａｓ９と比較してカノニカルＮＧＧ ＰＡＭおよび非カノニカルＮＧＡ ＰＡＭ間を良好に区別することが考えられることに留意した（図１ｃ）。この観察を考慮して、本発明者らは、本発明者らの部位枯渇アッセイを使用してＤ１１３５ＥバリアントのＰＡＭ認識プロファイルを包括的に評価した。この実験により、野生型ＳｐＣａｓ９に対してＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９について非カノニカルＮＡＧ、ＮＧＡ、およびＮＮＧＧ ＰＡＭの枯渇の減少が明らかになった（図３ａ）。興味深いことに、この効果は、本発明者らが使用した２つのプロトスペーサーの一方について、より傑出しており、それは、非カノニカルＰＡＭ認識に対するＤ１１３５Ｅ置換の影響がある程度プロトスペーサー依存的に変動し得ることを示唆した。重要なことに、本発明者らは、いかなる新たな非カノニカルＰＡＭ特異性の出現も観察しなかった。
次に、本発明者らは、Ｄ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９の改善されたＰＡＭ特異性がヒト細胞中でも観察することができるか否かを試験した。非カノニカルＮＡＧまたはＮＧＡ ＰＡＭを有する８つの標的部位に対する野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９の直接比較において、本発明者らは、それらの部位が、ＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて野生型ＳｐＣａｓ９よりもＤ１１３５Ｅにより一貫して効率的に開裂されないことを観察した（図３ｂ、１．９４の活性の平均減少倍率）。重要なことに、野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９は、両方とも４つのＥＧＦＰレポーター遺伝子部位およびカノニカルＮＧＧ ＰＡＭを有する６つの内在性ヒト遺伝子部位に対する同等の活性を示し（それぞれ図３ｂおよび３ｃ）、それは、Ｄ１１３５ＥバリアントがＮＧＧ ＰＡＭを有するオンターゲット部位の開裂にそれほど影響しないことを実証した（１０個全ての部位にわたる１．０４の活性の平均減少倍率）。本発明者らが、ヒト細胞中に形質移入されたＣａｓ９コードプラスミドの濃度を減少させたタイトレーション実験により、野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９の活性には、それらを同一部位に標的化した場合に実質的な差異がないことが明らかになり（図３ｄ）、それは、Ｄ１１３５Ｅバリアントについて観察された増加した特異性が、単にタンパク質の不安定化の結果でないことを意味した。
Ｄ１１３５Ｅの導入がＳｐＣａｓ９のオフターゲット開裂効果を低減させ得るか否かをより直接的に評価するため、本発明者らは、ディープシーケンシングを使用して３つの異なるｓｇＲＮＡの２５個の既に公知のオフターゲット部位（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７−８３２（２０１３）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３））に対して野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９により誘導された突然変異率を比較した。これらの２５個の部位は、スペーサー配列ならびにカノニカルＮＧＧおよび非カノニカルＰＡＭ中の両方の種々のミスマッチを有するオフターゲット部位を含んだ（図３ｅ）。これらのディープシーケンシング実験の結果により、Ｄ１１３５Ｅバリアントが、３つのオンターゲット部位において観察された突然変異頻度に対してバックグラウンドインデル率を超える活性を有する２２個のオフターゲット部位の１９個における低減した突然変異頻度を示すことが明らかになった（図３ｅおよび３ｆ）。興味深いことに、これらの低減したオフターゲット突然変異頻度は、カノニカルＰＡＭを有する多くの部位において観察され、それは、Ｄ１１３５Ｅによる特異性の獲得が、非カノニカルＰＡＭを有する部位にのみ制限されないことを示唆した。Ｄ１１３５Ｅに関連する特異性の改善をゲノムワイドスケールで評価するため、本発明者らは、３つの異なるｓｇＲＮＡ（そのうちの２つは、カノニカルおよび非カノニカルＰＡＭを有するオフターゲット部位を有することが既に公知であった（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７−８３２（２０１３）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３））とともに野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９を使用するＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験を実施した。本発明者らは、野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９バリアントを使用した場合、ゲノムワイド特異性の一般化した改善を観察した（図３ｇ）。本発明者らが試験した３つ全てのｓｇＲＮＡについて、カノニカルまたは非カノニカルＰＡＭを有するミスマッチスペーサーを含有するオフターゲット部位において特異性のそれらの改善が観察された（図１８）。重要なことに、これらのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験により、Ｄ１１３５Ｅ突然変異の導入が、ＳｐＣａｓ９により誘導されるオフターゲット効果の数を増加させないことが実証された。まとめると、これらの結果は、Ｄ１１３５Ｅ置換がＳｐＣａｓ９の全体特異性を増加させ得ることを示す。
上記の実験の全てはＳｐＣａｓ９を用いて実施したが、新規ＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９の特徴付けおよび遺伝子操作に魅力的な候補となり得る他の細菌からの多くのＣａｓ９オルソログが存在する（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５））。この実行可能性を探索するため、本発明者らは、２つのより小さいサイズのオルソログ、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座からのストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）（Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１３９０−１４００（２００８）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１−１４１２（２００８））および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（２０１４）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５））が、本発明者らの細菌選択アッセイにおいても機能し得るか否かを決定した。Ｓｔ１Ｃａｓ９のＰＡＭは、ＮＮＡＧＡＡ（配列番号３）として既に特徴付けされている一方（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（２０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）；Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１３９０−１４００（２００８）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１−１４１２（２００８））、既に記載されているアプローチ（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４））を使用してＳａＣａｓ９ ＰＡＭを生物情報学的に導出する本発明者らの試行は、コンセンサス配列を生じさせ得なかった（データ示さず）。したがって、本発明者らは、本発明者らの部位枯渇アッセイを使用し、ＳａＣａｓ９についておよび陽性対照としてＳｔ１Ｃａｓ９についてのＰＡＭを決定した。これらの実験は、２つの異なるプロトスペーサーおよびそれぞれプロトスペーサーについての２つの異なる相補性長さを有するｓｇＲＮＡを使用して実施し、それぞれのＣａｓ９について４つの選択をもたらした。Ｓｔ１Ｃａｓ９について、本発明者らは、既に記載されている６つのＰＡＭ（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（２０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１−１４１２（２００８））に加えて２つの新規ＰＡＭを同定した（図４ａならびに図１９ｃおよび１９ｄ、ＳａＣａｓ９ ＰＡＭ特異性の近年の定義（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５））と一致）。ＳａＣａｓ９について、主に、１つのプロトスペーサーについて観察される制限されたＰＡＭ優先性に起因する４つの選択間のＰＰＤＶ変動性が存在した。結果として、３つのＰＡＭのみが４つ全ての実験において５倍超で枯渇した：ＮＮＧＧＧＴ（配列番号４）、ＮＮＧＡＡＴ（配列番号６）、ＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）（図４ｂ）。しかしながら、本発明者らは、第２のプロトスペーサーライブラリーを有する多くのより標的化可能なＰＡＭを同定し、それは、ＳａＣａｓ９が多数の追加のＰＡＭを認識し得ることを意味した（図１８ｃおよび１８ｄ）。本発明者らの部位枯渇実験において同定されたＳｔ１Ｃａｓ９についてのＰＡＭ（ＮＮＡＧＡＡ（配列番号３）およびＳａＣａｓ９についてのＮＮＧＡＧＴ（配列番号５））を使用して、本発明者らは、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９の両方が細菌陽性選択系において効率的に機能し得ることを見出し（図４ｃ）、それは、それらのＰＡＭ特異性を突然変異誘発および選択により改変し得ることを示唆する。
全てのＣａｓ９オルソログがそれらの天然環境外で効率的に機能するわけではないため（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（２０１３））、本発明者らは、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９が、ヒト細胞中の標的部位をロバストに開裂し得るか否かを試験した。Ｓｔ１Ｃａｓ９は、ヒト細胞中でヌクレアーゼとして機能するが、数個の部位に対してのみ機能することが既に示されている（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３（２０１３））。本発明者らは、変動長さの相補性領域を有するｓｇＲＮＡを使用してＮＮＡＧＡＡ（配列番号３）ＰＡＭを保有する部位に対するＳｔ１Ｃａｓ９活性を評価し、５つの標的部位の３つにおいて高い活性を見出した（図４ｄ）。ＳａＣａｓ９について、本発明者らは、ＮＮＧＧＧＴ（配列番号４）またはＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）ＰＡＭを保有する８つの部位において効率的な活性を観察した（図４ｅ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９の両方について、活性およびスペーサー相補性の長さ間の明らかな相関は観察されなかった（図１９ｅ）。次に、本発明者らは、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９がヒト細胞中で内在性遺伝子座を効率的に改変し得るか否かを決定した。Ｓｔ１Ｃａｓ９について、４つの遺伝子にわたる１１個の部位のうちの７つが、Ｔ７Ｅ１アッセイにより判断されるとおり効率的に崩壊された一方（１〜２５％、平均１３％；図４ｆ）、ＳａＣａｓ９は、４つの遺伝子にわたる１６個の試験部位においていくぶんよりロバストな活性を示した（１％〜３７％、平均１９％；図４ｇ）。ここでも、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９についてのｓｇＲＮＡスペーサー長さを考慮した場合に区別の傾向は観察されなかった（図１９ｆ）。まとめると、本発明者らの結果は、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９が、本発明者らの細菌ベース選択およびヒト細胞の両方においてロバストに機能することを示し、それらを、新規ＰＡＭ特異性を有する追加のＳｐＣａｓ９バリアントの遺伝子操作のための魅力的な候補とする。
実施例２．黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭ特異性の遺伝子操作
本発明者らは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のいずれの残基がＰＡＭ認識に重要であるかに知得したため（Ｒ１３３３およびＲ１３３５）、本発明者らは、Ｃａｓ９オルソログのアラインメントを生成して黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩドメイン）中の相同性残基を探索した（図６参照）。本発明者らは、ＳａＣａｓ９のＰＡＭがＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）（Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｒは、ＡまたはＧである）であることを既に示した。ＰＡＭの３番目の位置におけるＧについての優先性が本発明者らのデータに基づき最も厳密な要求であると考えられるため、本発明者らは、正荷電残基、例えば、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）がその相互作用を媒介し得ることを仮定した。図６に示されるとおり、ＳｐＣａｓ９のＲ１３３３およびＲ１３３５との相同性領域中のＳａＣａｓ９中の多数の候補残基、例として、Ｋ１１０１、Ｒ１０１２、Ｒ１０１５、Ｋ１０１８、およびＫ１０２３が存在する。
本発明者らは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のいずれの残基がＰＡＭ認識に重要であるかに知得したため（Ｒ１３３３およびＲ１３３５）、本発明者らは、Ｃａｓ９オルソログのアラインメントを生成して黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩドメイン）中の相同性残基を探索した（図６参照）。本発明者らは、ＳａＣａｓ９のＰＡＭがＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）（Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｒは、ＡまたはＧである）であることを既に示した。ＰＡＭの３番目の位置におけるＧについての優先性が本発明者らのデータに基づき最も厳密な要求であると考えられるため、本発明者らは、正荷電残基、例えば、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）がその相互作用を媒介し得ることを仮定した。図６に示されるとおり、ＳｐＣａｓ９のＲ１３３３およびＲ１３３５との相同性領域中のＳａＣａｓ９中の多数の候補残基、例として、Ｋ１１０１、Ｒ１０１２、Ｒ１０１５、Ｋ１０１８、およびＫ１０２３が存在する。
本発明者らは、これら５つの位置におけるアラニン（Ａ）およびグルタミン（Ｑ）置換を生成し、突然変異クローンが依然としてカノニカルＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ（配列番号４６）を含有する部位を開裂し得るか否か、または場合により、従来、標的化可能でないＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）のＰＡＭを開裂し得るか否かを決定した（図７）。本発明者らは、選択条件下でプレーティングした場合の細菌コロニーの生存によりＣａｓ９の活性を可視化することができる本発明者らの細菌アッセイ（先行特許出願に記載）を利用した。Ｃａｓ９の相対活性は、非選択培地に対する選択培地上で増殖する細菌コロニーの比を計算することにより定量することができる。図７において、本発明者らは、Ｒ１０１５ＡおよびＲ１０１５Ｑ突然変異のみが、カノニカルＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）ＰＡＭを認識するＳａＣａｓ９の能力に影響する一方、ピーク、ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭ（ＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）またはＮＮＡＧＧＴ（配列番号４２））を標的化し得る突然変異は見られないことを示す。これらの結果は、Ｒ１０１５がＳａＣａｓ９によるＰＡＭ認識における役割を担うことを示唆した。
次いで、本発明者らは、野生型ＳａＣａｓ９、またはＲ１０１５Ｑバリアントのいずれかを選択し、ランダムに突然変異させ、ＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）またはＮＮＡＧＧＴ（配列番号４２）ＰＡＭを含有する部位に対する変更ＰＡＭ特異性クローンについて選択した（ＳｐＣａｓ９について既に記載）。本発明者らは、図８（および表６）に示されるアミノ酸配列を有する、それらのＰＡＭを標的化し得る多数の突然変異クローンを同定し、再スクリーニングし、シーケンシングした。これらの配列のまとめにおいて、多数の変化がＳａＣａｓ９の変更に極めて重要である一方（Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ）、多くの他の突然変異も寄与し得ると考えられる（Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎ）。
ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）に対するＳａＣａｓ９のＰＡＭ特異性を変更するために必須の位置および突然変異を同定した後、本発明者らは、単一、二重、および三重突然変異体組合せを作製することにより特異性変化に対する最も豊富な突然変異の寄与を評価した（表５）。本発明者らの陽性選択（既に記載）における種々のＰＡＭに対するそれらの突然変異を試験した場合、本発明者らは、多数の突然変異がカノニカルＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）および非カノニカルＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）またはＮＮＡＧＧＴ（配列番号４２）ＰＡＭの両方に対する活性を可能とする一方、野生型ＳａＣａｓ９酵素が非カノニカルＰＡＭに対する極めて低い活性を有することを観察した。具体的には、三重突然変異がＰＡＭの３番目の位置における緩和した特異性を可能とすると考えられ（ＫＫＱ、ＫＫＨ、ＧＫＱ、ＧＫＨ−Ｅ７８２／Ｎ９６８／Ｒ１０１５位の突然変異に基づき命名した）、それは、カノニカルＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）に対するＮＮＲＲＲＴ（配列番号４５）のコンセンサスＰＡＭモチーフをもたらす。ＰＡＭ要求のこの緩和は、理論的には、ＳｐＣａｓ９の標的化範囲を２倍にする。以下、バリアントは、７８２、９６８、および１０１５位におけるそれらのアイデンティティに基づき命名する。例えば、Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈは、ＳａＣａｓ９ＫＫＨバリアントと命名する。
次に、本発明者らは、ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイ（既に記載）において三重突然変異体の２つを評価して遺伝子操作バリアントがヒト細胞環境中で非カノニカルＰＡＭを標的化し得るか否かを決定した（図９）。非カノニカルＰＡＭを含有するＥＧＦＰ遺伝子内の部位を標的化し得るバリアントは、ＥＧＦＰコードフレームを崩壊させ、シグナルの損失をもたらす。この結果により、ＫＫＱおよびＫＫＨ突然変異体の両方がカノニカルＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭに対して野生型ＳａＣａｓ９と類似する活性を保持するが、ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭに対してかなり高い活性を有することが明らかになった。
全体として、本発明者らは、ＧからＲ（ＡまたはＧ）へのＰＡＭの３番目の位置における野生型酵素の優先性を緩和することが考えられるＳａＣａｓ９中の突然変異（ＫＫＱまたはＫＫＨバリアント）を同定した。これは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭ制約からＮＮＲＲＲＴ（配列番号４５）ＰＡＭにＳａＣａｓ９の標的化を効率的に緩和する。
本発明者らは、ヒト細胞中でＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭを標的化し得るバリアントを良好に誘導したため、次に、本発明者らは、ＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）またはＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）についての特異性を有するバリアントを遺伝子操作することができるか否かを追求した。これを行うため、本発明者らは、最初に、Ｒ１０１５をＥに（ＰＡＭの３番目の位置におけるＣを規定する場合）、およびＬまたはＭに（ＰＡＭの３番目の位置におけるＴを規定する場合）突然変異させ、本発明者らの細菌陽性選択アッセイ（既に記載）においてそれらの予測ＰＡＭに対してそれらを試験した（図１０）。本発明者らは、野生型ＳａＣａｓ９がＮＮＣＡＧＴ（配列番号５１１）ＰＡＭを含有する部位を非効率に開裂し得ること、Ｒ１０１５Ｅバリアントがその同一部位に対してわずかに良好な活性を有すること、ならびに野生型または他の指向突然変異のいずれも他のＰＡＭに対する活性を与えないことを観察した（図１０）。これは、本発明者らがＲ１０１５Ｑについて観察したとおり、ＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）およびＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）ＰＡＭを標的化し得るＳａＣａｓ９バリアントを遺伝子操作するために他の突然変異が必要であることを示唆した。
ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭに対するＳａＣａｓ９進化バリアントのため、ＥＲ１０１５（Ｈ／Ｑ）とともに７８２ＫおよびＮ９６８Ｋ突然変異が必要および必須であった。これらの突然変異がそれらの予測ＰＡＭに対するＲ１０１５（Ｅ／Ｌ／Ｍ）バリアントの活性を増加させるか否かを試験するため、本発明者らは、ＫＫＥ、ＫＫＬ、およびＫＫＭバリアントを生成した。図１１に示されるとおり、ＫＫＥ、ＫＫＬ、およびＫＫＭは全て、それらの予測ＰＡＭに対するロバストな活性を有した。
本発明者らは、ＫＫＱ、ＫＫＨ、ＫＫＥ、ＫＫＬ、またはＫＫＭバリアントが、ＰＡＭの３番目の位置における任意のヌクレオチドに対する緩和した特異性を有するか否かに関しても関心があったため、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する本発明者らの細菌陽性選択アッセイにおける多数の部位を調査した。図１１に示されるとおり、若干の例外はあるものの、それらのバリアントのほぼ全てが、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する全ての試験部位を開裂し得る。これは、それらがＮＮＮＲＲＴ部位を効率的に標的化し得るため、それらがＰＡＭの３番目の位置における緩和した特異性を有することを示した。これは、数個のＮＮＮＲＲＴ部位に対する極めて低い活性でＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）部位のみを効率的に標的化し得る野生型タンパク質（ＥＮＲ）とは対照的である。まとめると、ＫＫＨ（および図１１に示される他の類似の誘導体）バリアントは、細菌中でＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する部位を標的化し得、ＳａＣａｓ９の標的化範囲を効率的に４倍にする。
したがって、ＫＫＨバリアント（および図６の他のバリアントの一部）は、細菌中でＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを標的化し得、ＳａＣａｓ９の標的化範囲を効率的に４倍にする。
実施例３のための方法
以下の材料および方法を実施例３に使用した。
以下の材料および方法を実施例３に使用した。
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドを表１１に列記し、ｓｇＲＮＡ標的部位を表１２に列記し、本試験において使用されるプラスミドを表１０に列記する。
オリゴヌクレオチドを表１１に列記し、ｓｇＲＮＡ標的部位を表１２に列記し、本試験において使用されるプラスミドを表１０に列記する。
細菌Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを使用し、それぞれ別個のＴ７プロモーター下で発現されるＳａＣａｓ９のヒトコドン最適化バージョンおよびｓｇＲＮＡの両方を発現させた。選択において使用される細菌発現プラスミドは、ＢＰＫ２１０１（実施例１〜２参照）に由来した一方、部位枯渇アッセイにおいて使用されるものを改変して短縮リピート：アンチリピート配列を有するｓｇＲＮＡを発現させた（下記参照）。これらの細菌発現プラスミド中の全てのｓｇＲＮＡは、Ｔ７プロモーターからの適切な発現のためのスペーサー配列の５’末端における２つのグアニンを含んだ。
ＳａＣａｓ９バリアントのライブラリーを生成するため、Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＳａＣａｓ９のアミノ酸Ｍ６５７〜Ｇ１０５３を約５．５個の突然変異／キロベースの頻度においてランダムに突然変異させた。野生型およびＲ１０１５Ｑ ＳａＣａｓ９の両方を突然変異誘発のための出発テンプレートとして使用し、６×１０６個超のクローンの推定複雑度を有する２つのライブラリーをもたらした。
陽性選択プラスミドは、ＸｂａＩ／ＳｐｈＩ消化ｐ１１−ｌａｃＹ−ｗｔｘ１（Ｃｈｅｎ，Ｚ．＆Ｚｈａｏ，Ｈ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，ｅ１５４（２００５））中に、標的部位をコードするオリゴヌクレオチド二本鎖をライゲートすることによりアセンブルした。部位枯渇実験のため、異なるスペーサー配列を含有する２つの別個のライブラリーを生成した。それぞれのライブラリーのため、スペーサー配列に隣接する８つのランダム化ヌクレオチド（ＰＡＭに代えて）を含有するオリゴヌクレオチドをボトム鎖プライマーと複合体化させ、クレノウ（−エキソ）を使用してフィルインした（表１１参照）。得られた産物をＥｃｏＲＩにより消化し、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ消化ｐ１１−ｌａｃＹ−ｗｔｘ１中にライゲートした。２つの部位枯渇ライブラリーの推定複雑度は、４×１０６個超のクローンであった。
ヒト細胞実験のため、ＣＡＧプロモーターを含有するプラスミドからヒトコドン最適化野生型およびバリアントＳａＣａｓ９を発現させた（表１２）。ＢｓｍＢＩ消化ＶＶＴ１（実施例１〜２参照またはＢＰＫ２６６０（全長１２０ｎｔのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ ｓｇＲＮＡまたは８４ｎｔの短縮リピート：アンチリピートバージョンをそれぞれ含有する）中に、スペーサー配列をコードするオリゴヌクレオチド二本鎖をライゲートすることにより、ｓｇＲＮＡ発現プラスミド（Ｕ６プロモーターを含有する）を生成した。ヒト発現のために本試験において使用される全てのｓｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターからの適切な発現を確保するためのスペーサーの５’末端における１つのグアニンを含み、既に記載のもの（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５））と類似する短縮ｓｇＲＮＡ（図３７Ａ〜Ｂ）も使用した。
Ｃａｓ９オルソログ配列の生物情報学的分析
従来の研究（Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｕａｌ−ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）；Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５）；Ａｎｄｅｒｓ，Ｃ．，Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｏ．，Ｄｕｅｒｓｔ，Ａ．＆Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＰＡＭ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））において実施されたアラインメントと同様に、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）を使用してＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９の両方と類似するＣａｓ９オルソログをアラインした。Ｇｅｎｅｉｏｕｓバージョン８．１．６およびＥＳＰｒｉｐｔ（ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＳＰｒｉｐｔ／）を使用して、得られた系統樹およびタンパク質アラインメントを可視化した。
従来の研究（Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｕａｌ−ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）；Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５）；Ａｎｄｅｒｓ，Ｃ．，Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｏ．，Ｄｕｅｒｓｔ，Ａ．＆Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＰＡＭ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））において実施されたアラインメントと同様に、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）を使用してＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９の両方と類似するＣａｓ９オルソログをアラインした。Ｇｅｎｅｉｏｕｓバージョン８．１．６およびＥＳＰｒｉｐｔ（ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＳＰｒｉｐｔ／）を使用して、得られた系統樹およびタンパク質アラインメントを可視化した。
細菌ベース陽性選択アッセイ
細菌陽性選択アッセイは、既に記載のとおり実施した（実施例１〜２参照）。簡潔に述べると、陽性選択プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８，２４１１−２４２７（２０１０））中に、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドを形質転換した。非選択（クロラムフェニコール）および選択（クロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース）条件上の両方で形質転換物をプレーティングした。生存率：（選択プレート上のコロニーの数／非選択プレート上のコロニーの数）×１００を計算することにより、選択プラスミドのＣａｓ９開裂を推定した。代替ＰＡＭを認識し得るＳａＣａｓ９バリアントについて選択するため、ＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）、ＮＮＡＧＧＴ（配列番号４２）、ＮＮＣＡＧＴ（配列番号５１１）、ＮＮＣＧＧＴ（配列番号５１２）、ＮＮＴＡＧＴ（配列番号５１３）、またはＮＮＴＧＧＴ（配列番号５１４）ＰＡＭを有する陽性選択プラスミドを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）中に、突然変異ＰＩドメインを有する野生型およびＲ１０１５Ｑライブラリーを形質転換した。選択条件上でプレーティングすることにより、約１×１０５個のクローンをスクリーニングし、選択プラスミドを開裂することが想定されるＳａＣａｓ９バリアントを含有する生存コロニーをミニプレップした（ＭＧＨ ＤＮＡ Ｃｏｒｅ）。全てのバリアントを陽性選択アッセイにおいて個々に再スクリーニングし、約２０％超の生存率を有するものをシーケンシングして代替ＰＡＭの認識に要求される突然変異を決定した。
細菌陽性選択アッセイは、既に記載のとおり実施した（実施例１〜２参照）。簡潔に述べると、陽性選択プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８，２４１１−２４２７（２０１０））中に、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドを形質転換した。非選択（クロラムフェニコール）および選択（クロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース）条件上の両方で形質転換物をプレーティングした。生存率：（選択プレート上のコロニーの数／非選択プレート上のコロニーの数）×１００を計算することにより、選択プラスミドのＣａｓ９開裂を推定した。代替ＰＡＭを認識し得るＳａＣａｓ９バリアントについて選択するため、ＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）、ＮＮＡＧＧＴ（配列番号４２）、ＮＮＣＡＧＴ（配列番号５１１）、ＮＮＣＧＧＴ（配列番号５１２）、ＮＮＴＡＧＴ（配列番号５１３）、またはＮＮＴＧＧＴ（配列番号５１４）ＰＡＭを有する陽性選択プラスミドを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）中に、突然変異ＰＩドメインを有する野生型およびＲ１０１５Ｑライブラリーを形質転換した。選択条件上でプレーティングすることにより、約１×１０５個のクローンをスクリーニングし、選択プラスミドを開裂することが想定されるＳａＣａｓ９バリアントを含有する生存コロニーをミニプレップした（ＭＧＨ ＤＮＡ Ｃｏｒｅ）。全てのバリアントを陽性選択アッセイにおいて個々に再スクリーニングし、約２０％超の生存率を有するものをシーケンシングして代替ＰＡＭの認識に要求される突然変異を決定した。
細菌ベース部位枯渇アッセイ
部位枯渇実験は、既に記載のとおり実施した（実施例１〜２参照）。簡潔に述べると、野生型、触媒的に不活性な（Ｄ１０Ａ／Ｈ５５７Ａ）、またはＫＫＨバリアントＳａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドのいずれかを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）中に、ランダム化ＰＡＭライブラリーをエレクトロポレートした。１×１０５個超のコロニーをクロラムフェニコール／カルベニシリンプレート上でプレーティングし、生存コロニー内に含有されるＣａｓ９標的化に耐性であるＰＡＭを有する選択プラスミドをマキシプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。表１１に列記されるプライマーを使用して、スペーサー配列およびＰＡＭを含有するプラスミドの領域をＰＣＲ増幅した。ＫＡＰＡ ＨＴＰライブラリー調製キット（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用し、それぞれの部位枯渇条件からの約５００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を使用して二重インデックス化Ｔｒｕ−ｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーを生成してから、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＣｏｒｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑハイスループットシーケンシングランした。部位枯渇実験からのデータを既に記載のとおり分析し（実施例１〜２参照）、但し、スクリプトを改変して８つのランダム化ヌクレオチドを分析した。任意の所与のＰＡＭの選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）：そのＰＡＭの選択後頻度と、選択前ライブラリー頻度との比を計算することにより、ＰＡＭを認識するＣａｓ９の能力を決定した。触媒的に不活性なＳａＣａｓ９を使用する対照実験を使用して０．７９４のＰＰＤＶが、インプットライブラリーに対する統計的に有意な枯渇を表すことを確立した。
部位枯渇実験は、既に記載のとおり実施した（実施例１〜２参照）。簡潔に述べると、野生型、触媒的に不活性な（Ｄ１０Ａ／Ｈ５５７Ａ）、またはＫＫＨバリアントＳａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドのいずれかを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）中に、ランダム化ＰＡＭライブラリーをエレクトロポレートした。１×１０５個超のコロニーをクロラムフェニコール／カルベニシリンプレート上でプレーティングし、生存コロニー内に含有されるＣａｓ９標的化に耐性であるＰＡＭを有する選択プラスミドをマキシプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。表１１に列記されるプライマーを使用して、スペーサー配列およびＰＡＭを含有するプラスミドの領域をＰＣＲ増幅した。ＫＡＰＡ ＨＴＰライブラリー調製キット（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用し、それぞれの部位枯渇条件からの約５００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を使用して二重インデックス化Ｔｒｕ−ｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーを生成してから、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＣｏｒｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑハイスループットシーケンシングランした。部位枯渇実験からのデータを既に記載のとおり分析し（実施例１〜２参照）、但し、スクリプトを改変して８つのランダム化ヌクレオチドを分析した。任意の所与のＰＡＭの選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）：そのＰＡＭの選択後頻度と、選択前ライブラリー頻度との比を計算することにより、ＰＡＭを認識するＣａｓ９の能力を決定した。触媒的に不活性なＳａＣａｓ９を使用する対照実験を使用して０．７９４のＰＰＤＶが、インプットライブラリーに対する統計的に有意な枯渇を表すことを確立した。
ヒト細胞培養および形質移入
本発明者らの協力者Ｔ．Ｃａｔｈｏｍｅｎ氏（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）から入手したＵ２ＯＳ細胞、およびＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一インテグレートコピーを保有するＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞（Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２））を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で３７℃、５％のＣＯ２を用いて培養した。細胞系アイデンティティは、ＳＴＲプロファイリング（ＡＴＣＣ）およびディープシーケンシングによりバリデートし、細胞をマイコプラズマ汚染について週２回試験した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ培養培地に、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８をさらに補給した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのＤＮ−１００プログラムを製造業者の説明書に従って使用して、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミドにより、細胞を同時形質移入した。
本発明者らの協力者Ｔ．Ｃａｔｈｏｍｅｎ氏（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）から入手したＵ２ＯＳ細胞、およびＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一インテグレートコピーを保有するＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞（Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２））を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で３７℃、５％のＣＯ２を用いて培養した。細胞系アイデンティティは、ＳＴＲプロファイリング（ＡＴＣＣ）およびディープシーケンシングによりバリデートし、細胞をマイコプラズマ汚染について週２回試験した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ培養培地に、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８をさらに補給した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのＤＮ−１００プログラムを製造業者の説明書に従って使用して、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミドにより、細胞を同時形質移入した。
ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイ
ＥＧＦＰ崩壊実験は、既に記載のとおり実施した（Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３）；Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２））。形質移入の約５２時間後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して形質移入Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞中のＥＧＦＰ蛍光を計測した。Ｃａｓ９および空のＵ６プロモータープラスミドの陰性対照形質移入を使用して全ての実験について約２．５％のバックグラウンドＥＧＦＰ損失を確立した（図中に赤色破線として表す）。
ＥＧＦＰ崩壊実験は、既に記載のとおり実施した（Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３）；Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２））。形質移入の約５２時間後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して形質移入Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞中のＥＧＦＰ蛍光を計測した。Ｃａｓ９および空のＵ６プロモータープラスミドの陰性対照形質移入を使用して全ての実験について約２．５％のバックグラウンドＥＧＦＰ損失を確立した（図中に赤色破線として表す）。
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイは、既に記載のとおり実施して（Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２））ヒト細胞中の内在性遺伝子座におけるＣａｓ９誘導突然変異誘発を定量した。形質移入の約７２時間後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。表１１に列記されるプライマーを使用して約１００ｎｇのゲノムＤＮＡから、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰクリーンアップステップ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）後、約２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を変性し、ハイブリダイズしてからＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。２回目のクリーンアップステップ後、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して突然変異誘発頻度を定量した。
Ｔ７Ｅ１アッセイは、既に記載のとおり実施して（Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２））ヒト細胞中の内在性遺伝子座におけるＣａｓ９誘導突然変異誘発を定量した。形質移入の約７２時間後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。表１１に列記されるプライマーを使用して約１００ｎｇのゲノムＤＮＡから、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰクリーンアップステップ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）後、約２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を変性し、ハイブリダイズしてからＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。２回目のクリーンアップステップ後、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して突然変異誘発頻度を定量した。
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験は、既に記載のとおり実施および分析した（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））。簡潔に述べると、Ｕ２ＯＳ細胞を上記のとおり、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡプラスミド、ならびにＮｄｅＩ部位が埋め込まれた１００ｐｍｏｌのリン酸化ホスホロチオエート修飾二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）により形質移入した。制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を実施してｄｓＯＤＮタグインテグレーション頻度の頻度を決定し（実施例１〜２参照：Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））、Ｔ７Ｅ１アッセイを実施してオンターゲットＣａｓ９突然変異誘発頻度を定量した。ｄｓＯＤＮタグ特異的増幅およびライブラリー調製（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））を実施してから、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用してハイスループットシーケンシングを行った。潜在的なオフターゲット部位をマッピングした場合、オンターゲットスペーサー配列に対するアラインメントについてのカットオフを２１ヌクレオチドスペーサーについて８ミスマッチに、２２ヌクレオチドスペーサーについて９ミスマッチに、および２３ヌクレオチドスペーサーについて１０ミスマッチに設定した。潜在的なＤＮＡまたはＲＮＡバルジ（Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｖｅ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３−７４８５（２０１４））を有するオフターゲット部位をマニュアルアラインメントにより同定した。
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験は、既に記載のとおり実施および分析した（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））。簡潔に述べると、Ｕ２ＯＳ細胞を上記のとおり、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡプラスミド、ならびにＮｄｅＩ部位が埋め込まれた１００ｐｍｏｌのリン酸化ホスホロチオエート修飾二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）により形質移入した。制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を実施してｄｓＯＤＮタグインテグレーション頻度の頻度を決定し（実施例１〜２参照：Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））、Ｔ７Ｅ１アッセイを実施してオンターゲットＣａｓ９突然変異誘発頻度を定量した。ｄｓＯＤＮタグ特異的増幅およびライブラリー調製（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））を実施してから、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用してハイスループットシーケンシングを行った。潜在的なオフターゲット部位をマッピングした場合、オンターゲットスペーサー配列に対するアラインメントについてのカットオフを２１ヌクレオチドスペーサーについて８ミスマッチに、２２ヌクレオチドスペーサーについて９ミスマッチに、および２３ヌクレオチドスペーサーについて１０ミスマッチに設定した。潜在的なＤＮＡまたはＲＮＡバルジ（Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｖｅ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３−７４８５（２０１４））を有するオフターゲット部位をマニュアルアラインメントにより同定した。
実施例３．黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭ特異性の遺伝子操作
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる部位特異的ＤＮＡ開裂は、主に、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用によりガイドされるが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のＣａｓ９媒介認識も要求する。一般に使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、そのＮＧＧ ＰＡＭ内の２つのヌクレオチドを規定するが、望ましい特性を有する他のＣａｓ９オルソログは、より長鎖のＰＡＭを認識する。伸長ＰＡＭ配列は、特異性の関連から潜在的に有利である一方、ゲノム編集用途のためのＣａｓ９オルソログの標的化範囲を制限し得る。このようなＣａｓ９オルソログにより標的化可能な配列の範囲を拡大する１つの考えられる方針は、ＰＡＭ内のある位置についての緩和した特異性を有するバリアントを進化させることであり得る。ここで、本発明者らは、分子進化を使用して黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ウイルス送達を要求する用途に有用なより小さいサイズのオルソログ）のＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭ特異性を改変した。本発明者らが同定した１つのバリアントは、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９と称され、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを有する内在性ヒト標的部位におけるロバストなゲノム編集活性を示す。重要なことに、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ法を使用して、本発明者らは、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９の両方がヒト細胞中で同等数のオフターゲット効果を誘導することを示した。ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９の標的化範囲をほぼ２〜４倍だけ増加させ、それは、野生型ヌクレアーゼにより変更することができない配列の標的化を可能とした。より一般に、これらの結果は、Ｃａｓ９オルソログの標的化範囲を拡大するためのＰＡＭ特異性緩和の実行可能性を実証する。本発明者らの分子進化方針は、ＰＡＭに接触する特異的残基の構造情報も先験的知識も要求せず、したがって、広範なＣａｓ９オルソログに適用可能であるはずである。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる部位特異的ＤＮＡ開裂は、主に、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用によりガイドされるが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のＣａｓ９媒介認識も要求する。一般に使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、そのＮＧＧ ＰＡＭ内の２つのヌクレオチドを規定するが、望ましい特性を有する他のＣａｓ９オルソログは、より長鎖のＰＡＭを認識する。伸長ＰＡＭ配列は、特異性の関連から潜在的に有利である一方、ゲノム編集用途のためのＣａｓ９オルソログの標的化範囲を制限し得る。このようなＣａｓ９オルソログにより標的化可能な配列の範囲を拡大する１つの考えられる方針は、ＰＡＭ内のある位置についての緩和した特異性を有するバリアントを進化させることであり得る。ここで、本発明者らは、分子進化を使用して黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ウイルス送達を要求する用途に有用なより小さいサイズのオルソログ）のＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭ特異性を改変した。本発明者らが同定した１つのバリアントは、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９と称され、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを有する内在性ヒト標的部位におけるロバストなゲノム編集活性を示す。重要なことに、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ法を使用して、本発明者らは、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９の両方がヒト細胞中で同等数のオフターゲット効果を誘導することを示した。ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９の標的化範囲をほぼ２〜４倍だけ増加させ、それは、野生型ヌクレアーゼにより変更することができない配列の標的化を可能とした。より一般に、これらの結果は、Ｃａｓ９オルソログの標的化範囲を拡大するためのＰＡＭ特異性緩和の実行可能性を実証する。本発明者らの分子進化方針は、ＰＡＭに接触する特異的残基の構造情報も先験的知識も要求せず、したがって、広範なＣａｓ９オルソログに適用可能であるはずである。
結果
本発明者らは、構造情報を要求しない、緩和したＰＡＭ認識特異性を有するＣａｓ９バリアントを遺伝子操作するための偏りのない遺伝的アプローチを考案した。本発明者らは、本発明者らがそれらの試験を開始した時点で構造データが入手可能でないＳａＣａｓ９を使用してこの方針を試験した。初期ステップにおいて、本発明者らは、構造的に十分に特徴付けされたＳｐＣａｓ９（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１４７７−１４８１（２０１５）；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４））との配列比較によりＳａＣａｓ９についてのＰＡＭ相互作用ドメインを保守的に推定することを求めた。ＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９は、一次配列レベルにおいてかなり異なるが（図２１ａ、図２９）、１０個の追加のオルソログとのその両方のアラインメントにより、ＳａＣａｓ９についての予測ＰＡＭ相互作用ドメインを保守的に定義することが可能となった（実施例３のための方法；図２９および３０参照）。
本発明者らは、構造情報を要求しない、緩和したＰＡＭ認識特異性を有するＣａｓ９バリアントを遺伝子操作するための偏りのない遺伝的アプローチを考案した。本発明者らは、本発明者らがそれらの試験を開始した時点で構造データが入手可能でないＳａＣａｓ９を使用してこの方針を試験した。初期ステップにおいて、本発明者らは、構造的に十分に特徴付けされたＳｐＣａｓ９（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１４７７−１４８１（２０１５）；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４））との配列比較によりＳａＣａｓ９についてのＰＡＭ相互作用ドメインを保守的に推定することを求めた。ＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９は、一次配列レベルにおいてかなり異なるが（図２１ａ、図２９）、１０個の追加のオルソログとのその両方のアラインメントにより、ＳａＣａｓ９についての予測ＰＡＭ相互作用ドメインを保守的に定義することが可能となった（実施例３のための方法；図２９および３０参照）。
ＳａＣａｓ９ ＰＡＭ中の３番目の位置におけるグアニンは最も厳密に規定された塩基であるため（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５））、本発明者らは、予測ＰＩドメインをランダムに突然変異させ、本発明者らの既に記載された細菌細胞ベース法（実施例１〜２参照）を使用し、３番目のＰＡＭ位置における３つの他の考えられるヌクレオチドのそれぞれ（すなわち、ＮＮ［Ａ／Ｃ／Ｔ］ＲＲＴ ＰＡＭ（ＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４））；図３１ａ）を有する部位を開裂し得る突然変異体について選択することを試行した。ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）およびＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）ＰＡＭを含有する部位に対する選択からの生存バリアントの１つを除き全てが、Ｒ１０１５Ｈ突然変異を保有した一方、本発明者らは、ＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）ＰＡＭについての選択からいかなるバリアントも得なかった。これらの結果は、Ｒ１０１５が、ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭの３番目の位置におけるグアニンの認識に関与し得ることを強力に示唆した。実際、本発明者らのアラインメントにおいて、ＳａＣａｓ９のＲ１０１５は、ＰＡＭの３番目の塩基位置の認識に既に関与する残基のＳｐＣａｓ９ Ｒ１３３５に近接することを見出した（図３０）（（実施例１〜２参照；Ａｎｄｅｒｓ，Ｃ．，Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｏ．，Ｄｕｅｒｓｔ，Ａ．＆Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＰＡＭ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４））。これと一致して、本発明者らは、Ｒ１０１５のアラニンまたはグルタミンへの突然変異が、本発明者らの細菌選択系（図３１ｂ）において試験した場合、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを含有する標的部位に対するＳａＣａｓ９活性をかなり減少させることを見出した（図２１ｂ）。Ｒ１０１５に近接する他の正荷電残基のアラニンまたはグルタミン置換は、ＳａＣａｓ９活性に対する強力な効果を有さなかった（図２１ｂ、図３０）。
本発明者らの細菌ベース選択結果は、Ｒ１０１５Ｈ突然変異が、ＰＡＭの３番目の位置におけるＳａＣａｓ９の特異性を少なくとも部分的に緩和し得ることも示唆した。しかしながら、本発明者らは、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭの３番目の位置における任意のヌクレオチドを有する部位に対して試験した場合、Ｒ１０１５Ｈ単一突然変異体が本発明者らの既に記載されたヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイ（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３）；Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２））において準最適活性を有することを見出した（図２１ｃ）。これは、ヒト細胞中でＲ１０１５Ｈ突然変異体の活性を増加または最適化させるために追加の突然変異が要求され得ることを示唆したため、本発明者らは、Ｒ１０１５Ｑ突然変異も保有するＳａＣａｓ９の予測ＰＩドメインを包含する領域をランダムに突然変異させた。次いで本発明者らは、本発明者らの細菌選択系を使用して３つの異なるＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭのそれぞれを有する標的部位を開裂し得るこのライブラリーからのバリアントについて選択した。本発明者らは、Ｒ１０１５Ｈではなく、Ｒ１０１５Ｑを使用した。なぜなら、この突然変異体が細菌中で活性を示さなかったためである（図２１ｂ）。ＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）ＰＡＭに対して選択した場合、生存クローンはここでも観察されなかったが、ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）またはＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）に対するＲ１０１５Ｑバリアントについての選択は、Ｅ７８２、Ｋ９２９、Ｎ９６８における突然変異、および驚くべきことに、１０１５におけるＱのＨへの突然変異を生じさせた。
野生型ＳａＣａｓ９からの選択結果と組み合わせると、全ての選択にわたり同定された最も高頻度のミスセンス突然変異は、Ｅ７８２Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ｎ９６８Ｋ、およびＲ１０１５Ｈであり（図２１ｄ）、それらの突然変異の組合せが、ＳａＣａｓ９ ＰＡＭの３番目の位置におけるＡまたはＣを含有する部位の効率的な開裂を許容し得ることを示唆した。したがって、本発明者らは、ＰＡＭ（すなわち、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭ上）の３番目の位置における４つの塩基のそれぞれを保有する部位に標的化されるｓｇＲＮＡを用いるヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してそれらの突然変異の異なる組合せを含有するＳａＣａｓ９バリアントを試験した（図２１ｅ、図３２）。本発明者らは、三重突然変異体の組合せＥ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５ＨおよびＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１０１５Ｈを有するバリアントが、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを有する部位において高度に活性である一方（図２１ｅ、図３２）、４つ全ての突然変異を含有する四重突然変異バリアント（Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ）が、それらの部位に対する一般により低い活性を有することを見出した（図３２）。本発明者らは、さらなる特徴付けのためにＥ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（以下、ＫＫＨバリアントと称する）を選択し、本発明者らのヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してＫＫＨバリアントを含む３つ全ての置換が活性に要求されることを確認した（図２１ｅ）。
ＫＫＨおよび野生型ＳａＣａｓ９のＰＡＭ特異性をより包括的に定義するため、本発明者らは、本発明者らの既に記載された細菌細胞ベース部位枯渇アッセイ（実施例１〜２参照）を使用した（図３３）。この方法は、選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）として定量される、ランダム化ＰＡＭ配列を担持するＤＮＡプラスミドの相対開裂（およびしたがって細菌細胞中の枯渇）を同定することにより、Ｃａｓ９ＰＡＭ特異性プロファイルを生じさせる。本発明者らは、ＰＡＭに代えて８つのランダム化塩基をそれぞれ有する２つの異なるスペーサー配列を有するライブラリーを使用して野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９の両方を用いる部位枯渇実験を実施した（図３３）。触媒的に不活性なＳａＣａｓ９を使用する対照実験は、任意のＰＡＭ配列の枯渇をほとんど示さず（図３４ａ）、それは、統計的に有意な枯渇についての閾値を０．７９４のＰＰＤＶとして確立することを可能とした（図３４ｂ）。先行実験は、本発明者らの細菌部位枯渇アッセイにおける＜０．２のＰＰＤＶを有するＰＡＭを、本発明者らのヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて効率的に開裂し得ることを示した（実施例１〜２参照）。野生型ＳａＣａｓ９について、最も枯渇したＰＡＭ（２つのライブラリーから得られた平均ＰＰＤＶに基づく）は、予測されるとおり、４つのＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）（ＰＡＭ（図２１ｆおよび図３４ｃ）であった。興味深いことに、＜０．１の平均ＰＰＤＶを有する他のＰＡＭは、形態ＮＮＧＲＲＮ（配列番号４９）のものを含み（図３４ｄ）、それは、本発明者らの細菌ベースアッセイにおいて一部のスペーサー配列についてＰＡＭの最後の位置が、Ｔとして十分に規定され得ないことを示唆した（しかし、従来の報告は、インビトロＰＡＭ枯渇アッセイ、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ、および内在性ヒト部位の標的化によりＰＡＭの６番目の位置におけるチミンが非常に好ましいことを実証した（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５）））。対照的に、ＫＫＨバリアントについて、＜０．２の平均ＰＰＤＶを有するＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭだけでなく、４つ全てのＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）、４つ全てのＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）、および４つのＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）ＰＡＭの３つも含んだ（図２１ｆ、図３４ｃおよび３４ｅ）。これらの結果は、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９が、その野生型相当物に対して拡大したＰＡＭ標的化範囲を有すると考えられることを示唆した。
ヒト細胞中でのＫＫＨ ＳａＣａｓ９バリアントのロバストネスを評価するため、本発明者らは、種々のＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する５５個の異なる内在性遺伝子標的部位に対するその活性を試験した（図２２ａ）。ＫＫＨバリアントは、効率的な活性を示し、平均突然変異誘発頻度は全ての部位にわたり２４．７％であり、部位の８０％（５５個の部位の４４個）が、５％超の崩壊を示した。５５個全ての部位にわたるＫＫＨ ＳａＣａｓ９活性の分析により、ＰＡＭの３番目の位置（ＮＮ［Ｇ＞Ａ＝Ｃ＞Ｔ］ＲＲＴ；図２２ｂ）、およびＰＡＭの４番目／５番目の位置（ＮＮＮ［ＡＧ＞ＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡ］Ｔ；図２２ｃ）についての順序付けられた優先性が明らかになった。これと一致して、本発明者らは、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭの３番目／４番目／５番目の位置の１６個の考えられる組合せ間の差異を観察した（図３５ａ）。ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、２１〜２３ヌクレオチドに及ぶスペーサー長さ（図２２ｄ）、変動ＧＣ含有率を有するスペーサー配列（図３５ｂ）、および変動ＧＣ含有率を有するＰＡＭ（図３５ｃ）に対して効率的に機能した。低程度、中程度、および高程度の効率（それぞれ０〜１０％、１０〜３０％、および＞３０％の平均突然変異誘発頻度）で開裂された部位から導かれた配列ロゴにより、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭの４番目および５番目の位置以外の標的部位全体にわたる希少な配列優先性、およびおそらく高程度の効率で開裂された部位上の２番目のＰＡＭ位置におけるグアニンについてのわずかな優先性が明らかになった（図３５ｄ）。
ＫＫＨバリアントが、野生型ＳａＣａｓ９により標的化することができないＰＡＭの改変を可能とすることを実証するため、本発明者らは、種々のＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを担持する部位に対するヒト細胞中のそれらのヌクレアーゼの直接比較を実施した。本発明者らのＥＧＦＰ崩壊アッセイおよび１６個の内在性ヒト遺伝子標的を使用する１６個の部位の評価（それぞれ図２２ｅおよび２２ｆ）は、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９がＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを担持する標的部位をロバストに改変する一方、野生型ＳａＣａｓ９はＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを有する部位のみを効率的に標的化することを示した。ＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを有する２４個全ての部位について、ＫＫＨバリアントは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを有する８つの部位に対して、野生型ＳａＣａｓ９よりもかなり高い率の突然変異誘発を誘導し、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、野生型と比較して同等またはわずかに低いレベルの突然変異誘発を誘導した（図２２ｅおよび２２ｆ）。これらの結果は、まとめて、ＫＫＨバリアントがＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを有する部位を開裂し得、それにより、現在、ヒト細胞中で野生型ＳａＣａｓ９により効率的に変更することができないＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを有する部位の標的化が可能となることを実証する。
ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性に対するＫＫＨ突然変異の影響を評価するため、本発明者らは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（シーケンシングによるＤＳＢのゲノムワイドな偏りのない識別）法（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））を使用して野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９のオフターゲットプロファイルを同一のｓｇＲＮＡと直接比較した。ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを含有する６つの内在性ヒト遺伝子部位に標的化されるｓｇＲＮＡについて試験した場合、本発明者らは、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９が６つ全ての部位についてほぼ同一のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑタグインテグレーション率およびオンターゲット開裂頻度を誘導することを観察した（それぞれ図３６ａおよび３６ｂ）。さらに、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、６つのｓｇＲＮＡのそれぞれを有する類似数のオフターゲット部位における突然変異を誘導する（図２３ａおよび２３ｂ）。ＫＫＨバリアントについてのオフターゲット部位は、一般に、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭモチーフに付着し、野生型ＳａＣａｓ９についてのオフターゲット部位は、ＮＮＧＲＲ［Ｔ＞Ｇ］モチーフに付着した（図２２ｂ）。６つの試験ｓｇＲＮＡのうちの最大数のオフターゲット部位を誘導したｓｇＲＮＡの１つについて、本発明者らは、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９について類似数のオフターゲット部位を観察した。しかしながら、オフターゲット部位は、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９間で部分的にのみ重複し、それは、それらの異なるＰＡＭ特異性を考慮して予測することができたとおりである（図２３ｂおよび２３ｃ）。本発明者らは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを有する部位の標的化のためのＫＫＨバリアントの使用を提唱しないが（野生型ＳａＣａｓ９は、それらの部位についてＫＫＨよりも高いオンターゲット活性を示し得るため）、これらの結果は、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９が、予測ＰＡＭを有するオフターゲット部位のみを開裂し、一般に、野生型ＳａＣａｓ９について観察されるものと同等数のオフターゲット部位を誘導することを示唆する。
ＫＫＨ ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性をさらに試験するため、本発明者らは、ＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを含有する部位に標的化される５つの追加のｓｇＲＮＡを試験した（図２３ｄおよび２３ｅ）。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより検出されたオフターゲット部位は、一般に、（既に公開された実験において野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９バリアントについて観察された数と同等に数が少なく（実施例１〜２参照（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））、潜在的なＤＮＡおよびＲＮＡバルジ型オフターゲットを示し（Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｖｅ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３−７４８５（２０１４））、予測ＰＡＭ配列を含有した。まとめると、本発明者らの実験は、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性が類似することを実証し、一般に、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより判断されるとおりヒト細胞中の少ない数のオフターゲット突然変異を示す。
野生型ＳａＣａｓ９はＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭの標的化のための最適な選択を保つが、本発明者らが本明細書に記載するＫＫＨ ＳａＣａｓ９バリアントは、ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）およびＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）ＰＡＭを有する部位をロバストに標的化し得、ＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）ＰＡＭを有する部位についての妥当な良好な率を有する。したがって、本発明者らは、ＫＫＨバリアントがＳａＣａｓ９の標的化範囲をランダムＤＮＡ配列中でほぼ２〜４倍だけ増加させ、それにより、高精度の標的化を要求する種々の異なる用途におけるＳａＣａｓ９のより広い利用の見込みを改善することを保守的に推定する。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを使用して、本発明者らは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを含有する同一部位に標的化される場合、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９が、野生型ＳａＣａｓ９と類似数のオフターゲット突然変異を誘導することを実証した。さらに、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、ＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを担持する部位に標的化される場合、少数のみのオフターゲット突然変異を誘導する。ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は野生型ＳａＣａｓ９に対して改変ＰＡＭ配列を認識するが、本発明者らの知見は、プロトスペーサーおよびＰＡＭの合計の組合せ長さがＫＫＨバリアントについてヒトゲノムに妥当にオルソゴナルであるために依然として十分に長い（２４〜２６ｂｐ）ことを考慮すると完全に驚くべきことではない。さらに、ＰＡＭ認識の改変は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡのその標的部位との相互作用のエネルギー論を変更することにより特異性を改善し得ることが考えられる（トランケートｓｇＲＮＡ（Ｆｕ，Ｙ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｃａｓｃｉｏ，Ｖ．Ｍ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９−２８４（２０１４））またはＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９突然変異体（実施例１〜２参照）の改善された特異性について既に提案された機序と類似する）。
実施例４．ＳｐＣａｓ９−ＶＱＲバリアントの活性の改善
ＳｐＣａｓ９−ＶＱＲバリアントはＮＧＡＧ＞ＮＧＡＡ＝ＮＧＡＴ＞ＮＧＡＣのＮＧＡＮ ＰＡＭについての優先性を有するため、本発明者らは、ＮＧＡＨ ＰＡＭ（Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴ）に対する改善された活性を有する誘導体バリアントについて選択することを求めた。ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、またはＮＧＡＣ ＰＡＭのいずれかを有する標的部位を含有する細胞に対するＲ１３３５Ｑライブラリー（ランダムに突然変異誘発したＰＩドメインを有する）についての選択により、変更ＰＡＭ特異性を与える突然変異を含有する追加のクローンをシーケンシングすることが可能となった。これらのクローンの配列により、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、またはＮＧＡＣ ＰＡＭへのＰＡＭ特異性の変更に重要であり得る追加の突然変異が明らかになった。
ＳｐＣａｓ９−ＶＱＲバリアントはＮＧＡＧ＞ＮＧＡＡ＝ＮＧＡＴ＞ＮＧＡＣのＮＧＡＮ ＰＡＭについての優先性を有するため、本発明者らは、ＮＧＡＨ ＰＡＭ（Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴ）に対する改善された活性を有する誘導体バリアントについて選択することを求めた。ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、またはＮＧＡＣ ＰＡＭのいずれかを有する標的部位を含有する細胞に対するＲ１３３５Ｑライブラリー（ランダムに突然変異誘発したＰＩドメインを有する）についての選択により、変更ＰＡＭ特異性を与える突然変異を含有する追加のクローンをシーケンシングすることが可能となった。これらのクローンの配列により、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、またはＮＧＡＣ ＰＡＭへのＰＡＭ特異性の変更に重要であり得る追加の突然変異が明らかになった。
これらの選択の結果に基づき、ＶＱＲバリアントおよび２４個の他の誘導体バリアントを細菌中のＮＧＡＧ、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、およびＮＧＡＣ ＰＡＭ部位に対して試験した。多数のこれらの誘導体バリアントは、ＮＧＡＨ ＰＡＭ部位に対してＶＱＲバリアントよりも良好に生存し、それらの多くはＧ１２１８Ｒ突然変異を含有した（表７および図２４）。
細菌スクリーンからの結果が、それらの追加の突然変異の一部がＮＧＡＨ ＰＡＭ部位に対する活性を改善することを実証したことを考慮して、本発明者らは、ＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいてヒト細胞中で最良の候補の一部を試験した。本発明者らが観察したことは、多数のそれらのバリアント、例として、ＶＲＱＲ、ＮＲＱＲ、およびＹＲＱＲバリアントがＶＱＲバリアントよりも、ＮＧＡＨ部位の標的化において優れていることである（表８および図２５）。これらのクローンおよびＶＱＲバリアント間の主な差異は、それらがＧ１２１８Ｒ突然変異を含むことである。
ＶＲＱＲバリアントは試験したもののなかで最もロバストであると考えられるため、本発明者らは、ヒト細胞中の９つの異なる内在性部位（ＮＧＡＡ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＴ、およびＮＧＡＧ ＰＡＭについて２つの部位、ならびにＮＧＣＧ ＰＡＭについて１つの部位）に対するその活性をＶＱＲバリアントのものと比較した。このデータにより、ヒト細胞中の全ての試験部位においてＶＲＱＲバリアントがＶＱＲバリアントよりも優れていることが明らかになる（図２６）。
ＶＲＱＲバリアントがＶＱＲバリアントに対して改善された活性を有することを実証した後、本発明者らは、追加の置換の追加が活性をさらに改善し得るか否かを決定することを求めた。本発明者らは、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ相互作用ポケットに近接する選択における追加の突然変異を観察したため、それらの突然変異のサブセットをＶＱＲおよびＶＲＱＲバリアントに追加し、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、およびＮＧＡＣ ＰＡＭを含有する部位に対して細菌中でスクリーニングした（表９および図２７）。多数の誘導体バリアントは、ＮＧＡＴおよびＮＧＡＣ ＰＡＭ部位に対するより高い活性を有することが考えられるため、本発明者らは、ヒト細胞中のそれらのバリアントの試験を開始した。本発明者らは、ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて、ＶＱＲまたはＶＲＱＲバックグラウンドのいずれかへの追加の突然変異を含有する追加のバリアントを試験した。これらの実験により、ここでも、ＶＲＱＲがＶＱＲバリアントよりも、ＮＧＡＨ ＰＡＭに対するよりロバストな活性を有すること、およびＶＲＱＲバックボーンへの追加の突然変異が有益であることが明らかになった。
まとめると、これらの結果は、ＳｐＣａｓ９−ＶＱＲバリアント中で追加の突然変異を含めることは、ＮＧＡＮ ＰＡＭを含有する部位、具体的には、ＮＧＡＨ ＰＡＭを含有する部位に対する活性を改善し得ることを示唆する。
参照文献
１．Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，３４７−３５５（２０１４）．
２．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（２０１４）．
３．Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）．
４．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．＆Ｍａｙ，Ａ．Ｐ．Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３１１−３１４（２０１５）．
５．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）．
６．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，Ｓ．，Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｃ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２−６７（２０１４）．
７．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７−８３２（２０１３）．
８．Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）．
９．Ｈｏｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ｆｒｏｍ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（２０１３）．
１０．Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｕａｌ−ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）．
１１．Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（２０１３）．
１２．Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３（２０１３）．
１３．Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｌｏｃｉ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１−１４１２（２００８）．
１４．Ａｎｄｅｒｓ，Ｃ．，Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｏ．，Ｄｕｅｒｓｔ，Ａ．＆Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＰＡＭ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４）．
１５．Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２）．
１６．Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３）．
１７．Ｃｈｅｎ，Ｚ．＆Ｚｈａｏ，Ｈ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，ｅ１５４（２００５）．
１８．Ｄｏｙｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｂ．＆Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ−ＳｃｅＩ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２８，２４７７−２４８４（２００６）．
１９．Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．＆Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（２０１３）．
２０．Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３）．
２１．Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２２７−２２９（２０１３）．
２２．Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｌｅ Ｒｈｕｎ，Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．Ｔｈｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １０，７２６−７３７（２０１３）．
２３．Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ａ．Ｄ．，Ｇｌｏｏｒ，Ｇ．Ｂ．＆Ｅｄｇｅｌｌ，Ｄ．Ｒ．Ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ，ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ−ＢｍｏＩ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８，２４１１−２４２７（２０１０）．
２４．Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９，ｅ９８１８６（２０１４）．
１．Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，３４７−３５５（２０１４）．
２．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（２０１４）．
３．Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）．
４．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．＆Ｍａｙ，Ａ．Ｐ．Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３１１−３１４（２０１５）．
５．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）．
６．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，Ｓ．，Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｃ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２−６７（２０１４）．
７．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７−８３２（２０１３）．
８．Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）．
９．Ｈｏｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ｆｒｏｍ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（２０１３）．
１０．Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｕａｌ−ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）．
１１．Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（２０１３）．
１２．Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３（２０１３）．
１３．Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｌｏｃｉ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１−１４１２（２００８）．
１４．Ａｎｄｅｒｓ，Ｃ．，Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｏ．，Ｄｕｅｒｓｔ，Ａ．＆Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＰＡＭ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（２０１４）．
１５．Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２）．
１６．Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３）．
１７．Ｃｈｅｎ，Ｚ．＆Ｚｈａｏ，Ｈ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，ｅ１５４（２００５）．
１８．Ｄｏｙｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｂ．＆Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ−ＳｃｅＩ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２８，２４７７−２４８４（２００６）．
１９．Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．＆Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（２０１３）．
２０．Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３）．
２１．Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２２７−２２９（２０１３）．
２２．Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｌｅ Ｒｈｕｎ，Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．Ｔｈｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １０，７２６−７３７（２０１３）．
２３．Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ａ．Ｄ．，Ｇｌｏｏｒ，Ｇ．Ｂ．＆Ｅｄｇｅｌｌ，Ｄ．Ｒ．Ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ，ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ−ＢｍｏＩ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８，２４１１−２４２７（２０１０）．
２４．Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９，ｅ９８１８６（２０１４）．
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］
以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質。
［２］
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
［３］
以下の突然変異：Ｇ１１０４Ｋ；Ｓ１１０９Ｔ；Ｌ１１１１Ｈ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｎ；Ｄ１３３５Ｙ；Ｓ１１３６Ｎ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｎ１３１７Ｋ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
［４］
以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｅ（Ｄ１１３５Ｅバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｙ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＹＲＱＲバリアント）；Ｇ１１０４Ｋ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＫＶＲＱＲバリアント）；Ｓ１１０９Ｔ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＴＶＲＱＲバリアント）；Ｌ１１１１Ｈ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＨＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｓ１１３６Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｎ１３１７Ｋ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＫＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
［５］
Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
［６］
前記突然変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙ
である、請求項５に記載の単離タンパク質。
［７］
以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５の１つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質。
［８］
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
［９］
以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎ、Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＫＨバリアント）；Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＨバリアント）；またはＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＫＨバリアント）の１つ以上を含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
［１０］
Ｄ１０、Ｄ５５６、Ｈ５５７、および／またはＮ５８０における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
［１１］
前記突然変異が、Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、Ｎ５８０Ａ、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｈ５５７Ａおよび／またはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａである、請求項７に記載の単離タンパク質。
［１２］
任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
［１３］
前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［１４］
前記転写活性化ドメインがＶＰ６４またはＮＦ−κＢ ｐ６５からのものである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［１５］
前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［１６］
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
［１７］
前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
［１８］
前記異種機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［１９］
前記ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
［２０］
前記ＴＥＴタンパク質がＴＥＴ１である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
［２１］
前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２２］
ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２３］
前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２４］
前記生物学的係留物がＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、請求項２３に記載の融合タンパク質。
［２５］
前記異種機能ドメインがＦｏｋＩである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２６］
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
［２７］
請求項２６に記載の単離核酸を含むベクター。
［２８］
請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項２７に記載のベクター。
［２９］
請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５の１つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項２７に記載のベクター。
［３０］
請求項２６に記載の核酸を含み、および任意選択的に請求項１〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
［３１］
細胞のゲノムを変更する方法であって、前記細胞中で、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させるか、またはそれらと前記細胞を接触させることを含む方法。
［３２］
前記単離タンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む、請求項３１に記載の方法。
［３３］
前記細胞が幹細胞である、請求項３１に記載の方法。
［３４］
前記細胞が胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物中に存在するか、または胚中に存在する、請求項３３に記載の方法。
［３５］
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む方法。
［３６］
前記ｄｓＤＮＡ分子がインビトロで存在する、請求項３５に記載の方法。
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］
以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質。
［２］
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
［３］
以下の突然変異：Ｇ１１０４Ｋ；Ｓ１１０９Ｔ；Ｌ１１１１Ｈ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｎ；Ｄ１３３５Ｙ；Ｓ１１３６Ｎ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｎ１３１７Ｋ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
［４］
以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｅ（Ｄ１１３５Ｅバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｙ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＹＲＱＲバリアント）；Ｇ１１０４Ｋ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＫＶＲＱＲバリアント）；Ｓ１１０９Ｔ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＴＶＲＱＲバリアント）；Ｌ１１１１Ｈ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＨＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｓ１１３６Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｎ１３１７Ｋ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＫＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
［５］
Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
［６］
前記突然変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙ
である、請求項５に記載の単離タンパク質。
［７］
以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５の１つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質。
［８］
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
［９］
以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎ、Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＫＨバリアント）；Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＨバリアント）；またはＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＫＨバリアント）の１つ以上を含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
［１０］
Ｄ１０、Ｄ５５６、Ｈ５５７、および／またはＮ５８０における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
［１１］
前記突然変異が、Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、Ｎ５８０Ａ、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｈ５５７Ａおよび／またはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａである、請求項７に記載の単離タンパク質。
［１２］
任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
［１３］
前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［１４］
前記転写活性化ドメインがＶＰ６４またはＮＦ−κＢ ｐ６５からのものである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［１５］
前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［１６］
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
［１７］
前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
［１８］
前記異種機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［１９］
前記ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
［２０］
前記ＴＥＴタンパク質がＴＥＴ１である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
［２１］
前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２２］
ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２３］
前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２４］
前記生物学的係留物がＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、請求項２３に記載の融合タンパク質。
［２５］
前記異種機能ドメインがＦｏｋＩである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２６］
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
［２７］
請求項２６に記載の単離核酸を含むベクター。
［２８］
請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項２７に記載のベクター。
［２９］
請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５の１つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項２７に記載のベクター。
［３０］
請求項２６に記載の核酸を含み、および任意選択的に請求項１〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
［３１］
細胞のゲノムを変更する方法であって、前記細胞中で、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させるか、またはそれらと前記細胞を接触させることを含む方法。
［３２］
前記単離タンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む、請求項３１に記載の方法。
［３３］
前記細胞が幹細胞である、請求項３１に記載の方法。
［３４］
前記細胞が胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物中に存在するか、または胚中に存在する、請求項３３に記載の方法。
［３５］
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む方法。
［３６］
前記ｄｓＤＮＡ分子がインビトロで存在する、請求項３５に記載の方法。
Claims (29)
- 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含み、Ｄ１１３５にアミノ酸置換を有し、変更ＰＡＭ特異性を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質。
- 以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上におけるアミノ酸置換をさらに有する、請求項１に記載の単離タンパク質。
- 以下の突然変異：Ｇ１１０４Ｋ；Ｓ１１０９Ｔ；Ｌ１１１１Ｈ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｎ；Ｄ１３３５Ｙ；Ｓ１１３６Ｎ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｎ１３１７Ｋ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を含む、請求項２に記載の単離タンパク質。
- 以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｅ（Ｄ１１３５Ｅバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｙ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＹＲＱＲバリアント）；Ｇ１１０４Ｋ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＫＶＲＱＲバリアント）；Ｓ１１０９Ｔ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＴＶＲＱＲバリアント）；Ｌ１１１１Ｈ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＨＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｓ１１３６Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｎ１３１７Ｋ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＫＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）を含む、請求項２または３に記載の単離タンパク質。
- Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
- 前記突然変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙ
である、請求項５に記載の単離タンパク質。 - 任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項７に記載の融合タンパク質。
- 前記転写活性化ドメインがＶＰ６４またはＮＦ−κＢ ｐ６５からのものである、請求項７に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項７に記載の融合タンパク質。
- 前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
- 前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項７に記載の融合タンパク質。
- 前記ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１３に記載の融合タンパク質。
- 前記ＴＥＴタンパク質がＴＥＴ１である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項７に記載の融合タンパク質。
- ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである、請求項７に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、請求項７に記載の融合タンパク質。
- 前記生物学的係留物がＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインがＦｏｋＩである、請求項７に記載の融合タンパク質。
- 請求項１〜２０のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項２１に記載の単離核酸を含むベクター。
- 請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項２２に記載のベクター。
- 請求項２１に記載の核酸を含み、および任意選択的に請求項１〜２０のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
- 細胞のゲノムを変更するための医薬組成物であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質を含む、医薬組成物。
- 前記単離タンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項２５に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物中に存在するか、または胚中に存在する、請求項２７に記載の医薬組成物。
- 二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡとインビトロで接触させることを含む方法。
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562127634P | 2015-03-03 | 2015-03-03 | |
| US62/127,634 | 2015-03-03 | ||
| US201562165517P | 2015-05-22 | 2015-05-22 | |
| US62/165,517 | 2015-05-22 | ||
| US201562239737P | 2015-10-09 | 2015-10-09 | |
| US62/239,737 | 2015-10-09 | ||
| US201562258402P | 2015-11-20 | 2015-11-20 | |
| US62/258,402 | 2015-11-20 | ||
| PCT/US2016/020756 WO2016141224A1 (en) | 2015-03-03 | 2016-03-03 | Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020214920A Division JP7291114B2 (ja) | 2015-03-03 | 2020-12-24 | 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018506987A JP2018506987A (ja) | 2018-03-15 |
| JP6817215B2 true JP6817215B2 (ja) | 2021-01-20 |
Family
ID=56848623
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017546196A Active JP6817215B2 (ja) | 2015-03-03 | 2016-03-03 | 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ |
| JP2020214920A Active JP7291114B2 (ja) | 2015-03-03 | 2020-12-24 | 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ |
| JP2023044993A Pending JP2023082036A (ja) | 2015-03-03 | 2023-03-22 | 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020214920A Active JP7291114B2 (ja) | 2015-03-03 | 2020-12-24 | 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ |
| JP2023044993A Pending JP2023082036A (ja) | 2015-03-03 | 2023-03-22 | 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (11) | US9944912B2 (ja) |
| EP (2) | EP3265559B1 (ja) |
| JP (3) | JP6817215B2 (ja) |
| KR (2) | KR20230156800A (ja) |
| CN (1) | CN107532161A (ja) |
| AU (2) | AU2016226077B2 (ja) |
| CA (1) | CA2978314A1 (ja) |
| HK (1) | HK1249132A1 (ja) |
| WO (1) | WO2016141224A1 (ja) |
Families Citing this family (172)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013066438A2 (en) | 2011-07-22 | 2013-05-10 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| EP2841572B1 (en) | 2012-04-27 | 2019-06-19 | Duke University | Genetic correction of mutated genes |
| MX2015007550A (es) | 2012-12-12 | 2017-02-02 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas. |
| EP2931892B1 (en) | 2012-12-12 | 2018-09-12 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| WO2014204578A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-12-24 | The General Hospital Corporation | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing |
| EP3865586A1 (en) | 2013-03-15 | 2021-08-18 | The General Hospital Corporation | Increasing specificity for rna-guided genome editing |
| US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| AU2014281031B2 (en) | 2013-06-17 | 2020-05-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR-Cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components |
| WO2014204727A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof |
| WO2014204725A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| DK3011029T3 (da) | 2013-06-17 | 2020-03-16 | Broad Inst Inc | Administration, modificering og optimering af tandem-guidesystemer, fremgangsmåder og sammensætninger til sekvensmanipulering |
| DK3011031T3 (da) | 2013-06-17 | 2020-12-21 | Broad Inst Inc | Fremføring og anvendelse af crispr-cas-systemerne, vektorer og sammensætninger til levermålretning og -terapi |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| EP3079725B1 (en) | 2013-12-12 | 2019-10-16 | The Broad Institute, Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing |
| WO2015089364A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof |
| US11053481B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains |
| EP3080257A1 (en) | 2013-12-12 | 2016-10-19 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders |
| WO2015089486A2 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems |
| EP3151846A4 (en) * | 2014-06-05 | 2017-12-27 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for nuclease design |
| IL286474B2 (en) | 2014-06-23 | 2023-11-01 | Massachusetts Gen Hospital | Genome-wide random identification of DSBS assessed by sequencing (guide-sequence) |
| AU2015298571B2 (en) | 2014-07-30 | 2020-09-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| EP3215617B1 (en) | 2014-11-07 | 2024-05-08 | Editas Medicine, Inc. | Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing |
| US20170266320A1 (en) * | 2014-12-01 | 2017-09-21 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing |
| WO2016094867A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Protected guide rnas (pgrnas) |
| US10190106B2 (en) * | 2014-12-22 | 2019-01-29 | Univesity Of Massachusetts | Cas9-DNA targeting unit chimeras |
| US9944912B2 (en) | 2015-03-03 | 2018-04-17 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificity |
| CA2986310A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Editas Medicine, Inc. | Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells |
| CN106011104B (zh) * | 2015-05-21 | 2019-09-27 | 清华大学 | 利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法 |
| AU2016276702B2 (en) | 2015-06-09 | 2022-07-28 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation |
| TW202400626A (zh) * | 2015-06-18 | 2024-01-01 | 美商博得學院股份有限公司 | 降低脫靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變 |
| WO2016205759A1 (en) * | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation |
| EP3341727B1 (en) | 2015-08-25 | 2022-08-10 | Duke University | Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases |
| US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| US9926546B2 (en) | 2015-08-28 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| WO2017044843A1 (en) | 2015-09-11 | 2017-03-16 | The General Hospital Corporation | Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq) |
| EP3786294A1 (en) | 2015-09-24 | 2021-03-03 | Editas Medicine, Inc. | Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing |
| WO2017059313A1 (en) | 2015-09-30 | 2017-04-06 | The General Hospital Corporation | Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (circle-seq) |
| EP3362571A4 (en) | 2015-10-13 | 2019-07-10 | Duke University | GENOMIC ENGINEERING WITH TYPE I CRISPRISMS IN EUKARYOTIC CELLS |
| JP7109784B2 (ja) | 2015-10-23 | 2022-08-01 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質 |
| US11597924B2 (en) | 2016-03-25 | 2023-03-07 | Editas Medicine, Inc. | Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use |
| EP4047092A1 (en) | 2016-04-13 | 2022-08-24 | Editas Medicine, Inc. | Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof |
| CN110214183A (zh) | 2016-08-03 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 腺苷核碱基编辑器及其用途 |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| CA3039409A1 (en) * | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Integrated Dna Technologies, Inc. | S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same |
| SG11201903089RA (en) | 2016-10-14 | 2019-05-30 | Harvard College | Aav delivery of nucleobase editors |
| KR102662249B1 (ko) * | 2016-10-14 | 2024-05-03 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 후성적으로 조절되는 부위-특이적 뉴클레아제 |
| EP3548614A1 (en) | 2016-12-05 | 2019-10-09 | Editas Medicine, Inc. | SYSTEMS AND METHODS FOR ONE-SHOT GUIDE RNA (ogRNA) TARGETING OF ENDOGENOUS AND SOURCE DNA |
| EP3555284B1 (en) | 2016-12-16 | 2021-12-01 | The Rockefeller University | Compositions and methods using cas9 with enhanced spacer acquisition function |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| WO2018129544A1 (en) | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of altering gene expression by perturbing transcription factor multimers that structure regulatory loops |
| IT201700016321A1 (it) | 2017-02-14 | 2018-08-14 | Univ Degli Studi Di Trento | Mutanti di cas9 ad alta specificita' e loro applicazioni. |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
| IL306092A (en) | 2017-03-23 | 2023-11-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| US20210047633A1 (en) * | 2017-03-29 | 2021-02-18 | Editas Medicine, Inc. | Selection methods |
| BR112019021719A2 (pt) | 2017-04-21 | 2020-06-16 | The General Hospital Corporation | Variantes de cpf1 (cas12a) com especificidade para pam alterada |
| CN108795989A (zh) * | 2017-04-26 | 2018-11-13 | 哈尔滨工业大学 | SpyCas9的基因编辑活性抑制位点及其抑制剂 |
| WO2018201086A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Editas Medicine, Inc. | Methods and systems for analyzing guide rna molecules |
| WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| JP7324713B2 (ja) | 2017-05-25 | 2023-08-10 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 改善された精度および特異性を有する塩基エディター |
| CN110914423B (zh) * | 2017-05-31 | 2024-02-06 | 国立大学法人东京大学 | 经修饰的Cas9蛋白及其用途 |
| WO2018226855A1 (en) * | 2017-06-06 | 2018-12-13 | The General Hospital Corporation | Engineered crispr-cas9 nucleases |
| EP3635104A1 (en) | 2017-06-09 | 2020-04-15 | Editas Medicine, Inc. | Engineered cas9 nucleases |
| WO2018230976A1 (ko) * | 2017-06-15 | 2018-12-20 | 주식회사 툴젠 | 반복 확장 돌연변이에 대한 게놈 편집 시스템 |
| US9982279B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-05-29 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| US10011849B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-07-03 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| WO2019009682A2 (ko) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | 주식회사 툴젠 | 표적 특이적 crispr 변이체 |
| US11866726B2 (en) | 2017-07-14 | 2024-01-09 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
| EP3658573A1 (en) | 2017-07-28 | 2020-06-03 | President and Fellows of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace) |
| EP3672612A4 (en) | 2017-08-23 | 2021-09-29 | The General Hospital Corporation | MANIPULATED CRISPR-CAS9-NUCLEASES WITH CHANGED PAM SPECIFICITY |
| EP3676376A2 (en) | 2017-08-30 | 2020-07-08 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| CN111201317B (zh) * | 2017-09-05 | 2024-04-05 | 国立大学法人东京大学 | 经修饰的Cas9蛋白及其用途 |
| WO2019060469A2 (en) * | 2017-09-19 | 2019-03-28 | Massachusetts Institute Of Technology | CAS9 STREPTOCOCCUS CANIS AS A GENOMIC ENGINEERING PLATFORM WITH NEW PAM SPECIFICITY |
| AU2018339089A1 (en) | 2017-09-29 | 2020-04-09 | Intellia Therapeutics, Inc. | Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing |
| PL3688162T3 (pl) | 2017-09-29 | 2024-06-10 | Intellia Therapeutics, Inc. | Preparaty |
| AU2018338967A1 (en) | 2017-09-29 | 2020-05-07 | Intellia Therapeutics, Inc. | In vitro method of mRNA delivery using lipid nanoparticles |
| EP3688161A1 (en) | 2017-09-29 | 2020-08-05 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis |
| CN107630018B (zh) * | 2017-09-30 | 2018-10-12 | 深圳三智医学科技有限公司 | 一种用于编辑或修复hbb基因的试剂盒 |
| EP3694993A4 (en) | 2017-10-11 | 2021-10-13 | The General Hospital Corporation | METHOD OF DETECTING A SITE-SPECIFIC AND UNDESIRED GENOMIC DESAMINATION INDUCED BY BASE EDITING TECHNOLOGIES |
| CN111757937A (zh) | 2017-10-16 | 2020-10-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 腺苷碱基编辑器的用途 |
| CN111712566A (zh) * | 2018-02-08 | 2020-09-25 | 应用干细胞有限公司 | 用于筛选靶基因变体的方法 |
| CN109306361B (zh) * | 2018-02-11 | 2022-06-28 | 华东师范大学 | 一种新的a/t到g/c碱基定点转换的基因编辑系统 |
| EP3752647B1 (en) * | 2018-02-15 | 2022-05-25 | The Broad Institute, Inc. | Cell data recorders and uses thereof |
| US20220307001A1 (en) * | 2018-02-27 | 2022-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Evolved cas9 variants and uses thereof |
| KR102647714B1 (ko) | 2018-03-19 | 2024-03-18 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절 |
| CA3094828A1 (en) | 2018-03-23 | 2019-09-26 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Crispr/cas9-mediated exon-skipping approach for ush2a-associated usher syndrome |
| US10386703B1 (en) | 2018-04-03 | 2019-08-20 | Chandler Evans | Systems and methods for orbiting imaging |
| JP7486189B2 (ja) * | 2018-04-06 | 2024-05-17 | 国立大学法人 東京大学 | エンジニアリングされたＢｌＣａｓ９ヌクレアーゼ |
| US11898203B2 (en) | 2018-04-17 | 2024-02-13 | The General Hospital Corporation | Highly sensitive in vitro assays to define substrate preferences and sites of nucleic-acid binding, modifying, and cleaving agents |
| EP3790595A4 (en) * | 2018-05-11 | 2022-06-08 | Beam Therapeutics, Inc. | METHOD OF EDITING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM USING PROGRAMMABLE BASE EDITOR SYSTEMS |
| WO2019232069A1 (en) * | 2018-05-30 | 2019-12-05 | Emerson Collective Investments, Llc | Cell therapy |
| CA3103088A1 (en) | 2018-06-08 | 2019-12-12 | Modalis Therapeutics Corporation | Modified cas9 protein and use thereof |
| CN110684755B (zh) * | 2018-07-05 | 2021-12-31 | 清华大学 | 基于进化信息构建嵌合SaCas9用于增强和扩展PAM位点的识别 |
| US20210261957A1 (en) | 2018-07-10 | 2021-08-26 | Alia Therapeutics S.R.L. | Vesicles for traceless delivery of guide rna molecules and/or guide rna molecule/rna-guided nuclease complex(es) and a production method thereof |
| EP3830267A1 (en) | 2018-07-31 | 2021-06-09 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for hydroxyacid oxidase 1 (hao1) gene editing for treating primary hyperoxaluria type 1 (ph1) |
| US20230021641A1 (en) * | 2018-08-23 | 2023-01-26 | The Broad Institute, Inc. | Cas9 variants having non-canonical pam specificities and uses thereof |
| MX2021003457A (es) | 2018-09-28 | 2021-07-16 | Intellia Therapeutics Inc | Composiciones y métodos para la edición génica de lactato deshidrogenasa (ldha). |
| BR112021007025A2 (pt) | 2018-10-16 | 2021-08-03 | Intellia Therapeutics, Inc. | composições e métodos para imunoterapia |
| CA3116918A1 (en) | 2018-10-18 | 2020-04-23 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus |
| CN113195721A (zh) | 2018-10-18 | 2021-07-30 | 英特利亚治疗股份有限公司 | 治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物和方法 |
| MA53919A (fr) | 2018-10-18 | 2021-08-25 | Intellia Therapeutics Inc | Constructions d'acides nucléiques et procédés d'utilisation |
| CN113260701A (zh) | 2018-10-18 | 2021-08-13 | 英特利亚治疗股份有限公司 | 用于表达因子ix的组合物和方法 |
| US20210246473A1 (en) | 2018-10-24 | 2021-08-12 | Modalis Therapeutics Corporation | Modified cas9 protein, and use thereof |
| WO2020163396A1 (en) | 2019-02-04 | 2020-08-13 | The General Hospital Corporation | Adenine dna base editor variants with reduced off-target rna editing |
| US10982200B2 (en) | 2019-02-14 | 2021-04-20 | Metagenomi Ip Technologies, Llc | Enzymes with RuvC domains |
| WO2020191241A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| MX2021011690A (es) | 2019-03-28 | 2022-01-06 | Intellia Therapeutics Inc | Composiciones y métodos para la edición del gen ttr y el tratamiento de la amiloidosis attr que comprende un corticosteroide o uso de este. |
| JP2022525428A (ja) | 2019-03-28 | 2022-05-13 | インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド | Ｔｔｒガイドｒｎａと、ｒｎａガイドｄｎａ結合剤をコードするポリヌクレオチドとを含む組成物および方法 |
| MX2021011757A (es) | 2019-03-28 | 2021-12-10 | Intellia Therapeutics Inc | Polinucleótidos, composiciones y métodos para la expresión de polipéptidos. |
| JP2022528722A (ja) | 2019-04-12 | 2022-06-15 | アストラゼネカ・アクチエボラーグ | 改善された遺伝子編集のための組成物及び方法 |
| US20220204954A1 (en) * | 2019-04-25 | 2022-06-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Engineered cas9 with broadened dna targeting range |
| WO2020254872A2 (en) | 2019-06-17 | 2020-12-24 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for improved homology directed repair |
| WO2021003337A1 (en) * | 2019-07-03 | 2021-01-07 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for gene replacement |
| CN110257427B (zh) * | 2019-07-22 | 2021-01-22 | 青岛农业大学 | 无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用 |
| CN110577969B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-07-22 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SlugCas9基因编辑系统及其应用 |
| KR20220070443A (ko) | 2019-08-27 | 2022-05-31 | 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 반복성 dna와 연관된 장애의 치료용 조성물 및 방법 |
| KR20220062079A (ko) | 2019-09-13 | 2022-05-13 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 지질 나노입자에 의해 전달되는 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절 |
| DK3812472T3 (da) | 2019-10-21 | 2023-02-20 | Univ Freiburg Albert Ludwigs | Virkelig uvildig in vitro-undersøgelse til profilering af off-target-aktivitet af en eller flere målspecifikke programmerbare nukleaser i celler (abnoba-seq) |
| WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
| US10883095B1 (en) * | 2019-12-10 | 2021-01-05 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| EP4077674A1 (en) | 2019-12-18 | 2022-10-26 | Alia Therapeutics S.R.L. | Compositions and methods for treating retinitis pigmentosa |
| US20210284978A1 (en) * | 2020-01-24 | 2021-09-16 | The General Hospital Corporation | Unconstrained Genome Targeting with near-PAMless Engineered CRISPR-Cas9 Variants |
| US20210261932A1 (en) * | 2020-01-24 | 2021-08-26 | The General Hospital Corporation | Crispr-cas enzymes with enhanced on-target activity |
| GB2594339B (en) * | 2020-02-14 | 2023-02-08 | Metagenomi Inc | Enzymes with RUVC domains |
| CN115667283A (zh) * | 2020-03-03 | 2023-01-31 | 小利兰斯坦福大学董事会 | Rna指导的千碱基规模基因组重组工程 |
| EP4125348A1 (en) | 2020-03-23 | 2023-02-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
| AU2021248800A1 (en) | 2020-03-31 | 2022-10-13 | Metagenomi, Inc. | Class II, Type II CRISPR systems |
| CA3177481A1 (en) | 2020-05-08 | 2021-11-11 | David R. Liu | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| CN112159801B (zh) * | 2020-07-13 | 2022-11-15 | 复旦大学 | SlugCas9-HF蛋白、含有SlugCas9-HF蛋白的基因编辑系统及应用 |
| WO2022018638A1 (en) | 2020-07-21 | 2022-01-27 | Crispr Therapeutics Ag | Genome-editing compositions and methods to modulate faah for treatment of neurological disorders |
| JP2022037603A (ja) * | 2020-08-25 | 2022-03-09 | 国立大学法人 東京大学 | エンジニアリングされたＣｊＣａｓ９タンパク質 |
| WO2022056000A1 (en) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy |
| CA3173886A1 (en) | 2020-09-11 | 2022-03-17 | Tyson D. BOWEN | Dna modifying enzymes and active fragments and variants thereof and methods of use |
| WO2022092317A1 (ja) * | 2020-10-30 | 2022-05-05 | 国立大学法人東京大学 | エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆタンパク質 |
| US20240002839A1 (en) | 2020-12-02 | 2024-01-04 | Decibel Therapeutics, Inc. | Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof |
| CN112430613A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-02 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种宽编辑范围的SpG基因及其应用 |
| CN112553246A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-26 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体及其应用 |
| AU2021394998A1 (en) | 2020-12-11 | 2023-06-29 | Intellia Therapeutics, Inc. | Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing involving deamination |
| EP4259783A1 (en) | 2020-12-11 | 2023-10-18 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for reducing mhc class ii in a cell |
| CA3205138A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for editing beta-globin for treatment of hemaglobinopathies |
| JP2024500858A (ja) | 2020-12-23 | 2024-01-10 | インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド | 細胞中のｈｌａ－ａを低減するための組成物及び方法 |
| EP4267723A1 (en) | 2020-12-23 | 2023-11-01 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for genetically modifying ciita in a cell |
| CA3206484A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Intellia Therapeutics, Inc. | Engineered t cells |
| WO2022152746A1 (en) | 2021-01-13 | 2022-07-21 | Alia Therapeutics Srl | K526d cas9 variants and applications thereof |
| GB2617799A (en) * | 2021-02-01 | 2023-10-18 | Epsilen Bio S R L | Gene silencing |
| EP4288088A2 (en) | 2021-02-08 | 2023-12-13 | Intellia Therapeutics, Inc. | Lymphocyte activation gene 3 (lag3) compositions and methods for immunotherapy |
| EP4288089A2 (en) | 2021-02-08 | 2023-12-13 | Intellia Therapeutics, Inc. | T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 (tim3) compositions and methods for immunotherapy |
| JP2024505672A (ja) | 2021-02-08 | 2024-02-07 | インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド | 免疫療法のためのナチュラルキラー細胞受容体２ｂ４組成物及び方法 |
| AR125191A1 (es) | 2021-03-22 | 2023-06-21 | Lifeedit Therapeutics Inc | Enzimas modificadoras del adn y sus fragmentos activos y variantes y métodos de uso |
| WO2022238958A1 (en) | 2021-05-12 | 2022-11-17 | Crispr Therapeutics Ag | Multiplex gene editing |
| AU2022296523A1 (en) | 2021-06-22 | 2023-12-21 | Intellia Therapeutics, Inc. | Methods for in vivo editing of a liver gene |
| AU2022305650A1 (en) * | 2021-06-29 | 2024-01-25 | Council Of Scientific & Industrial Research | Engineered fncas9 and uses thereof |
| WO2023288247A1 (en) * | 2021-07-13 | 2023-01-19 | Duke University | Compositions for and methods of improving viral vectors |
| WO2023018637A1 (en) | 2021-08-09 | 2023-02-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Gene editing of regulatory elements |
| WO2023028471A1 (en) | 2021-08-24 | 2023-03-02 | Intellia Therapeutics, Inc. | Programmed cell death protein 1 (pd1) compositions and methods for cell-based therapy |
| CN118369110A (zh) | 2021-11-03 | 2024-07-19 | 英特利亚治疗股份有限公司 | 用于免疫疗法的cd38组合物和方法 |
| WO2023086847A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | Encodia, Inc. | Methods for barcoding macromolecules in individual cells |
| WO2023108047A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mutant myocilin disease model and uses thereof |
| WO2023159136A2 (en) | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Epitope engineering of cell-surface receptors |
| WO2023185697A2 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-05 | Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. | Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis |
| WO2023205606A1 (en) | 2022-04-18 | 2023-10-26 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Compositions and methods for enhancing aav therapy and decreasing tropism of aav to the liver |
| TW202408595A (zh) | 2022-06-16 | 2024-03-01 | 美商英特利亞醫療公司 | 用於對細胞進行遺傳修飾之方法及組合物 |
| WO2024006955A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Intellia Therapeutics, Inc. | Engineered t cells |
| WO2024042489A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-02-29 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Chemical modification of guide rnas with locked nucleic acid for rna guided nuclease-mediated gene editing |
| WO2024061296A2 (en) | 2022-09-22 | 2024-03-28 | Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. | Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease |
| WO2024095245A2 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Evolved adenine deaminases and rna-guided nuclease fusion proteins with internal insertion sites and methods of use |
| WO2024123789A1 (en) | 2022-12-07 | 2024-06-13 | Sanofi | Predicting indel frequencies |
Family Cites Families (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2336362T3 (en) | 2005-08-26 | 2019-01-21 | Dupont Nutrition Biosci Aps | USE OF CRISPR-ASSOCIATED GENES (CAS) |
| MX2009009071A (es) | 2007-03-02 | 2009-09-24 | Danisco | Cultivos con resistencia mejorada a fagos. |
| WO2010011961A2 (en) | 2008-07-25 | 2010-01-28 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Prokaryotic rnai-like system and methods of use |
| US20100076057A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
| WO2010054108A2 (en) | 2008-11-06 | 2010-05-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Cas6 polypeptides and methods of use |
| EP2367938B1 (en) | 2008-12-12 | 2014-06-11 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Genetic cluster of strains of streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation |
| US10087431B2 (en) | 2010-03-10 | 2018-10-02 | The Regents Of The University Of California | Methods of generating nucleic acid fragments |
| CA2798703A1 (en) | 2010-05-10 | 2011-11-17 | The Regents Of The University Of California | Endoribonuclease compositions and methods of use thereof |
| US20140113376A1 (en) | 2011-06-01 | 2014-04-24 | Rotem Sorek | Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes |
| GB201122458D0 (en) | 2011-12-30 | 2012-02-08 | Univ Wageningen | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof |
| US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
| GEP20217251B (en) | 2012-05-25 | 2021-04-26 | Charpentier Emmanuelle De Emanuel | Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription |
| AU2013359212B2 (en) | 2012-12-12 | 2017-01-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation |
| WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| US20140186843A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-07-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| DK2931898T3 (en) | 2012-12-12 | 2016-06-20 | Massachusetts Inst Technology | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS |
| CN105121648B (zh) | 2012-12-12 | 2021-05-07 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化 |
| EP2931899A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
| AU2013359262C1 (en) | 2012-12-12 | 2021-05-13 | Massachusetts Institute Of Technology | CRISPR-Cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| MX2015007550A (es) | 2012-12-12 | 2017-02-02 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas. |
| CA2893579A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Dow Agrosciences Llc | Dna detection methods for site specific nuclease activity |
| CN105142396A (zh) | 2013-01-14 | 2015-12-09 | 重组股份有限公司 | 缺角家畜 |
| US20140212869A1 (en) | 2013-01-25 | 2014-07-31 | Agilent Technologies, Inc. | Nucleic Acid Proximity Assay Involving the Formation of a Three-way junction |
| AU2014214719B2 (en) | 2013-02-07 | 2020-02-13 | The General Hospital Corporation | Tale transcriptional activators |
| JP6491113B2 (ja) | 2013-02-25 | 2019-03-27 | サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド | ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物 |
| CN111454951A (zh) | 2013-03-14 | 2020-07-28 | 卡里布生物科学公司 | 以核酸为靶的核酸的组合物和方法 |
| US20140349400A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Programmable Modification of DNA |
| EP3865586A1 (en) | 2013-03-15 | 2021-08-18 | The General Hospital Corporation | Increasing specificity for rna-guided genome editing |
| US20140273230A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
| US9234213B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
| WO2014204578A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-12-24 | The General Hospital Corporation | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing |
| US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| US11332719B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-05-17 | The Broad Institute, Inc. | Recombinant virus and preparations thereof |
| KR102223568B1 (ko) | 2013-04-05 | 2021-03-04 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물 |
| HUE056903T2 (hu) | 2013-04-16 | 2022-04-28 | Regeneron Pharma | Patkány genom célzott módosítása |
| CA2910427C (en) | 2013-05-10 | 2024-02-20 | Sangamo Biosciences, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
| AU2014273085B2 (en) * | 2013-05-29 | 2020-10-22 | Cellectis | New compact scaffold of Cas9 in the type II CRISPR system |
| DK3011029T3 (da) * | 2013-06-17 | 2020-03-16 | Broad Inst Inc | Administration, modificering og optimering af tandem-guidesystemer, fremgangsmåder og sammensætninger til sekvensmanipulering |
| WO2014204725A1 (en) * | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| CN105392885B (zh) | 2013-07-19 | 2020-11-03 | 赖瑞克斯生物科技公司 | 用于产生双等位基因敲除的方法和组合物 |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| WO2015089473A1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation |
| WO2015089364A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof |
| IL286474B2 (en) | 2014-06-23 | 2023-11-01 | Massachusetts Gen Hospital | Genome-wide random identification of DSBS assessed by sequencing (guide-sequence) |
| US9944912B2 (en) | 2015-03-03 | 2018-04-17 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificity |
| WO2016205759A1 (en) * | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation |
| TW202400626A (zh) | 2015-06-18 | 2024-01-01 | 美商博得學院股份有限公司 | 降低脫靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變 |
| CA2996888A1 (en) | 2015-08-28 | 2017-03-09 | The General Hospital Corporation | Engineered crispr-cas9 nucleases |
| EP3374501B1 (en) | 2015-11-11 | 2023-07-12 | Lonza Ltd | Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity |
| CN105543195A (zh) | 2016-03-01 | 2016-05-04 | 中国水稻研究所 | 植物Cas9变体蛋白VQR及其编码基因与应用 |
-
2016
- 2016-03-03 US US15/060,424 patent/US9944912B2/en active Active
- 2016-03-03 EP EP16759521.4A patent/EP3265559B1/en active Active
- 2016-03-03 CN CN201680024041.1A patent/CN107532161A/zh active Pending
- 2016-03-03 JP JP2017546196A patent/JP6817215B2/ja active Active
- 2016-03-03 US US15/060,448 patent/US10202589B2/en active Active
- 2016-03-03 AU AU2016226077A patent/AU2016226077B2/en active Active
- 2016-03-03 KR KR1020237037790A patent/KR20230156800A/ko active Application Filing
- 2016-03-03 KR KR1020177026620A patent/KR102598856B1/ko active IP Right Grant
- 2016-03-03 EP EP20216630.2A patent/EP3858990A1/en active Pending
- 2016-03-03 CA CA2978314A patent/CA2978314A1/en active Pending
- 2016-03-03 WO PCT/US2016/020756 patent/WO2016141224A1/en active Application Filing
- 2016-07-12 US US15/208,461 patent/US9752132B2/en active Active
- 2016-07-12 US US15/208,228 patent/US9926545B2/en active Active
-
2017
- 2017-07-31 US US15/664,873 patent/US10767168B2/en active Active
-
2018
- 2018-03-26 US US15/935,334 patent/US10479982B2/en active Active
- 2018-07-03 HK HK18108541.7A patent/HK1249132A1/zh unknown
-
2019
- 2019-11-18 US US16/687,396 patent/US10808233B2/en active Active
-
2020
- 2020-09-02 US US17/010,107 patent/US20200399620A1/en active Pending
- 2020-09-04 US US17/012,697 patent/US11220678B2/en active Active
- 2020-12-24 JP JP2020214920A patent/JP7291114B2/ja active Active
-
2021
- 2021-11-22 US US17/456,092 patent/US11859220B2/en active Active
-
2022
- 2022-03-19 AU AU2022201915A patent/AU2022201915B2/en active Active
-
2023
- 2023-03-22 JP JP2023044993A patent/JP2023082036A/ja active Pending
- 2023-11-13 US US18/507,709 patent/US20240150741A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6817215B2 (ja) | 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ | |
| JP6942848B2 (ja) | 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ | |
| US20230407277A1 (en) | Engineered CRISPR-Cas9 Nucleases with Altered PAM Specificity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190301 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200225 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200521 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200722 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20201208 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20201224 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6817215 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |