JP6817215B2 - 変更PAM特異性を有する遺伝子操作CRISPR−Cas9ヌクレアーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、2015年3月3日に出願された米国仮特許出願第61/127,634号明細書;2015年5月22日に出願された同第62/165,517号明細書;2015年10月9日に出願された同第62/239,737号明細書;および2015年11月20日に出願された同第62/258,402号明細書の利益を主張する。上記の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金番号DP1GM105378、NIHR01GM107427、およびR01GM088040のもとで政府支援により作製された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本試験において遺伝子操作されたSpCas9バリアントは、野生型SpCas9によりアクセス可能な部位を大幅に増加させ、これは、CRISPR−Cas9プラットフォームを使用して効率的なHDRを実現する機会、NHEJ媒介インデルを小さい遺伝子エレメントに標的化する機会、およびPAMについての要求を活用して同一細胞中の2つの異なるアレルを区別する機会をさらに向上させる。変更PAM特異性のSpCas9バリアントは、現在、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の両方でSpCas9により標的化可能でない内在性遺伝子部位を効率的に崩壊させ得、それらは種々の異なる細胞タイプおよび生物中で機能することを示唆する。重要なことに、GUIDE−seq実験は、VQRおよびVRER SpCas9バリアントの全体プロファイルが、野生型SpCas9について観察されるものと類似し、またはそれよりも良好であることを示す。さらに、本発明者らが同定および特徴付けした改善された特異性のD1135Eバリアントは、広く使用される野生型SpCas9の優れた代替物を提供する。D1135Eは、カノニカルNGG PAMを有する部位に対して野生型SpCas9と類似の活性を有するが、ミスマッチスペーサー配列およびカノニカルまたは非カノニカルPAMのいずれかを担持するオフターゲット部位のゲノムワイド開裂を低減させる。
したがって、本明細書において、spCas9バリアントが提供される。SpCas9野生型配列は、以下のとおりである。
本明細書に記載のCas9バリアントを使用するため、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましいことがある。これは、種々の手段で実施することができる。例えば、Cas9バリアントをコードする核酸を、複製および/または発現のための原核または真核細胞中への形質転換のための中間ベクター中にクローニングすることができる。中間ベクターは、典型的には、Cas9バリアントの産生のためのCas9バリアントをコードする核酸の貯蔵または操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド、もしくはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。Cas9バリアントをコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原虫細胞への投与のための発現ベクター中にクローニングすることもできる。
プロモーターに加え、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいずれであれ、宿主細胞中の核酸の発現に要求される全ての追加のエレメントを含有する転写単位または発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Cas9バリアントをコードする核酸配列に作動可能に結合しているプロモーター、および例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に要求される任意のシグナルを含有する。カセットの追加のエレメントとしては、例えば、エンハンサー、および異種スプライシングイントロンシグナルを挙げることができる。
遺伝子情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、Cas9バリアントの目的の使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物中などでの発現に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、pBR322ベースのプラスミド、pSKF、pET23Dなどのプラスミド、ならびに市販のタグ融合発現系、例えば、GSTおよびLacZが挙げられる。
真核発現ベクターでは、真核生物ウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクター、例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルス由来のベクターを使用することが多い。他の例示的な真核生物ベクターとしては、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo−5、バキュロウイルスpDSVE、およびSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞中での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指向下でタンパク質の発現を可能とする他の任意のベクターが挙げられる。
Cas9バリアントを発現させるためのベクターは、ガイドRNAの発現を駆動するRNA PolIIIプロモーター、例えば、H1、U6または7SKプロモーターを含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミド形質移入後に哺乳動物細胞中でのCas9バリアントの発現を可能とする。
一部の発現系は、安定的に形質移入された細胞系を選択するためのマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。高収率の発現系、例えば、バキュロウイルスベクターを昆虫細胞中で、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下でgRNAコード配列とともに使用するものも好適である。
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントとしては、大腸菌(E.coli)中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域中のユニーク制限部位も挙げられる。
標準的な形質移入法を使用して大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞系を産生し、次いで標準的な技術を用いてそのタンパク質を精製する(例えば、Colley et al.,1989,J.Biol.Chem.,264:17619−22;Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher,ed.,1990)参照)。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施する(例えば、Morrison,1977,J.Bacteriol.132:349−351;Clark−Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology 101:347−362(Wu et al.,eds,1983参照)。
宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入する公知の手順のいずれかを使用することができる。このような方法としては、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター(エピソーム型および組込み型の両方)およびクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞内に導入する他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる(例えば、Sambrook et al.,前掲参照)。唯一必要なことは、使用される特定の遺伝子操作手順が、Cas9バリアントを発現し得る宿主細胞内に少なくとも1つの遺伝子を良好に導入し得ることである。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それらの実施例は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1および2では、以下の材料および方法を使用した。
本試験において使用される親構築物についての概略図およびDNA配列は、図5A〜Jおよび配列番号7〜20に見出すことができる。陽性選択プラスミド、陰性選択プラスミド、および部位枯渇ライブラリーを生成するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列は、表1において入手可能である。本試験における全てのgRNA標的の配列は、表2において入手可能である。Cas9中の点突然変異は、PCRにより生成した。
陽性選択プラスミド(標的部位が埋め込まれた)を含有するコンピテント大腸菌(E.coli)BW25141(λDE3)23をCas9/sgRNAコードプラスミドにより形質転換した。SOB培地中の60分間のリカバリー後、クロラムフェニコール(非選択)またはクロラムフェニコール+10mMのアラビノース(選択)のいずれかを含有するLB培地上で形質転換物をプレーティングした。陽性選択プラスミドの開裂は、生存頻度:選択プレート上のコロニー/非選択プレート上のコロニーを計算することにより推定した(図12も参照)。
Cas9/sgRNA発現プラスミドを含有するコンピテント大腸菌(E.coli)BW25141(λDE3)を、開裂性または非開裂性標的部位を保有する陰性選択プラスミドにより形質転換した。SOB培地中の60分間のリカバリー後、クロラムフェニコール+カルベニシリンを含有するLB培地上で形質転換物をプレーティングした。陰性選択プラスミドの開裂は、形質転換されたDNA1μg当たりのコロニー形成単位を計算することにより推定した(図13も参照)。
構成的に発現されるEGFP−PESTレポーター遺伝子の単一インテグレートコピーを保有するU2OS.EGFP細胞15を、10%のFBS、2mMのGlutaMax(Life Technologies)、ペニシリン/ストレプトマイシン、および400μg/mlのG418が補給されたAdvanced DMEM培地(Life Technologies)中で、37℃において5%CO2を用いて培養した。Lonza 4D−nucleofectorのDN−100プログラムを製造業者のプロトコルに従って使用して、750ngのCas9プラスミドおよび250ngのsgRNAプラスミド(特に注釈のない限り)により、細胞を同時形質移入した。空のU6プロモータープラスミドと一緒に形質移入されるCas9プラスミドを全てのヒト細胞実験についての陰性対照として使用した。内在性遺伝子実験についての標的部位を野生型SpCas9により開裂可能なNGG部位の200bp内で選択した(図16aおよび表2参照)。
ゼブラフィッシュケアおよび使用は、Massachusetts General Hospital Subcommittee on Research Animal Careにより承認された。Cas9 mRNAは、既に記載のとおりmMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA Kit(Life Technologies)を使用してPmeI消化JDS246(野生型SpCas9)またはMSP469(VQRバリアント)により転写させた21。本試験の全てのsgRNAは、クローニング非依存的sgRNA生成法に従って調製した24。sgRNAは、MEGAscript SP6 Transcription Kit(Life Technologies)により転写させ、RNA Clean&Concentrator−5(Zymo Research)により精製し、RNアーゼ不含水により溶出させた。
EGFP崩壊実験を既に記載のとおり実施した16。EGFP発現について、形質移入された細胞を形質移入の約52時間後にFortessaフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して分析した。バックグラウンドEGFP損失を全ての実験について約2.5%においてゲーティングした(赤色破線としてグラフにより表示)。
T7E1アッセイは、ヒト細胞15およびゼブラフィッシュ21について既に記載のとおり実施した。U2OS.EGFPヒト細胞について、Agencourt DNAdvance Genomic DNA Isolation Kit(Beckman Coulter Genomics)を使用してゲノムDNAを形質移入細胞から形質移入の約72時間後に抽出した。表1に列記されるプライマーを使用してゼブラフィッシュまたはヒト細胞ゲノムDNAからの標的遺伝子座を増幅した。ほぼ200ngの精製PCR産物を変性し、アニールし、T7E1(New England BioLabs)により消化した。突然変異誘発頻度は、ヒト細胞15およびゼブラフィッシュ21について既に記載のとおりQiaxcelキャピラリー電気泳動装置(QIagen)を使用して定量した。
標的化範囲の制限に対処する1つの潜在的な解決策は、新規PAM特異性を有するCas9バリアントを遺伝子操作することである。PAM特異性を変更する従来の試行は、塩基特異的SpCas9−PAM相互作用についての構造情報を利用し、2番目および3番目のPAM位置におけるグアニンヌクレオチドに接触するアルギニン残基(R1333およびR1335)をそれぞれ突然変異させた(Anders et al.,Nature 513,569−573(2014))。両方のアルギニンのグルタミンによる置換(側鎖がアデニンと相互作用すると予測され得るもの)は、インビトロで予測NAA PAMを保有する標的を開裂し得るSpCas9バリアントを生じさせ得なかった(Anders et al.,Nature 513,569−573(2014))。ヌクレアーゼ誘導インデルが蛍光の損失をもたらすヒト細胞ベースU2OS EGFPレポーター遺伝子崩壊アッセイ(Reyon et al.,Nat Biotechnol 30,460−465(2012);Fu et al.,Nat Biotechnol 31,822−826(2013))を使用して、本発明者らは、R1333Q/R1335Q SpCas9バリアントがNAA PAMを有する標的部位を効率的に開裂し得ないことを確認した(図1a)。さらに、本発明者らは、単一のR1333QおよびR1335Q SpCas9バリアントが、それぞれ、それらの予測NAGおよびNGA部位をそれぞれ有する標的部位を効率的に開裂し得ないことを見出した(図1a)。したがって、本発明者らは、PAM特異性の再遺伝子操作は、R1333およびR1335以外の位置における追加の突然変異を要求し得ることを結論付けた。例えば、入手可能な構造情報は、K1107およびS1136が、PAM中の2番目および3番目の塩基への直接および間接的な副溝の接触を作ることを示す(Anders et al.,Nature 513,569−573(2014))。したがって、これらの位置におけるまたはその付近の追加の変更は、PAM特異性を変更することを必要とし得ることが妥当である。
本発明者らは、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)のいずれの残基がPAM認識に重要であるかに知得したため(R1333およびR1335)、本発明者らは、Cas9オルソログのアラインメントを生成して黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)のPAM相互作用ドメイン(PIドメイン)中の相同性残基を探索した(図6参照)。本発明者らは、SaCas9のPAMがNNGRRT(配列番号46)(Nは、任意のヌクレオチドであり、Rは、AまたはGである)であることを既に示した。PAMの3番目の位置におけるGについての優先性が本発明者らのデータに基づき最も厳密な要求であると考えられるため、本発明者らは、正荷電残基、例えば、リジン(K)またはアルギニン(R)がその相互作用を媒介し得ることを仮定した。図6に示されるとおり、SpCas9のR1333およびR1335との相同性領域中のSaCas9中の多数の候補残基、例として、K1101、R1012、R1015、K1018、およびK1023が存在する。
以下の材料および方法を実施例3に使用した。
オリゴヌクレオチドを表11に列記し、sgRNA標的部位を表12に列記し、本試験において使用されるプラスミドを表10に列記する。
従来の研究(Fonfara,I.et al.Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual−RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR−Cas systems.Nucleic Acids Res 42,2577−2590(2014);Ran,F.A.et al.In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.Nature 520,186−191(2015);Anders,C.,Niewoehner,O.,Duerst,A.&Jinek,M.Structural basis of PAM−dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease.Nature 513,569−573(2014))において実施されたアラインメントと同様に、ClustalW2(ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)を使用してSpCas9およびSaCas9の両方と類似するCas9オルソログをアラインした。Geneiousバージョン8.1.6およびESPript(espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)を使用して、得られた系統樹およびタンパク質アラインメントを可視化した。
細菌陽性選択アッセイは、既に記載のとおり実施した(実施例1〜2参照)。簡潔に述べると、陽性選択プラスミドを含有する大腸菌(E.coli)BW25141(λDE3)(Kleinstiver et al.,Nucleic Acids Res 38,2411−2427(2010))中に、Cas9/sgRNAプラスミドを形質転換した。非選択(クロラムフェニコール)および選択(クロラムフェニコール+10mMのアラビノース)条件上の両方で形質転換物をプレーティングした。生存率:(選択プレート上のコロニーの数/非選択プレート上のコロニーの数)×100を計算することにより、選択プラスミドのCas9開裂を推定した。代替PAMを認識し得るSaCas9バリアントについて選択するため、NNAAGT(配列番号41)、NNAGGT(配列番号42)、NNCAGT(配列番号511)、NNCGGT(配列番号512)、NNTAGT(配列番号513)、またはNNTGGT(配列番号514)PAMを有する陽性選択プラスミドを含有するコンピテント大腸菌(E.coli)BW25141(λDE3)中に、突然変異PIドメインを有する野生型およびR1015Qライブラリーを形質転換した。選択条件上でプレーティングすることにより、約1×105個のクローンをスクリーニングし、選択プラスミドを開裂することが想定されるSaCas9バリアントを含有する生存コロニーをミニプレップした(MGH DNA Core)。全てのバリアントを陽性選択アッセイにおいて個々に再スクリーニングし、約20%超の生存率を有するものをシーケンシングして代替PAMの認識に要求される突然変異を決定した。
部位枯渇実験は、既に記載のとおり実施した(実施例1〜2参照)。簡潔に述べると、野生型、触媒的に不活性な(D10A/H557A)、またはKKHバリアントSaCas9/sgRNAプラスミドのいずれかを含有するコンピテント大腸菌(E.coli)BW25141(λDE3)中に、ランダム化PAMライブラリーをエレクトロポレートした。1×105個超のコロニーをクロラムフェニコール/カルベニシリンプレート上でプレーティングし、生存コロニー内に含有されるCas9標的化に耐性であるPAMを有する選択プラスミドをマキシプレップ(Qiagen)により単離した。表11に列記されるプライマーを使用して、スペーサー配列およびPAMを含有するプラスミドの領域をPCR増幅した。KAPA HTPライブラリー調製キット(KAPA BioSystems)を使用し、それぞれの部位枯渇条件からの約500ngの精製PCR産物を使用して二重インデックス化Tru−seq Illuminaシーケンシングライブラリーを生成してから、Dana−Farber Cancer Institute Molecular Biology CoreにおいてIllumina MiSeqハイスループットシーケンシングランした。部位枯渇実験からのデータを既に記載のとおり分析し(実施例1〜2参照)、但し、スクリプトを改変して8つのランダム化ヌクレオチドを分析した。任意の所与のPAMの選択後PAM枯渇値(PPDV):そのPAMの選択後頻度と、選択前ライブラリー頻度との比を計算することにより、PAMを認識するCas9の能力を決定した。触媒的に不活性なSaCas9を使用する対照実験を使用して0.794のPPDVが、インプットライブラリーに対する統計的に有意な枯渇を表すことを確立した。
本発明者らの協力者T.Cathomen氏(Freiburg)から入手したU2OS細胞、およびEGFP−PESTレポーター遺伝子の単一インテグレートコピーを保有するU2OS.EGFP細胞(Reyon,D.et al.FLASH assembly of TALENs for high−throughput genome editing.Nat Biotechnol 30,460−465(2012))を、10%のFBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、および2mMのGlutaMAX(Life Technologies)を有するAdvancedDMEM培地(Life Technologies)培地中で37℃、5%のCO2を用いて培養した。細胞系アイデンティティは、STRプロファイリング(ATCC)およびディープシーケンシングによりバリデートし、細胞をマイコプラズマ汚染について週2回試験した。U2OS.EGFP培養培地に、400μg/mLのG418をさらに補給した。Lonza 4D−nucleofectorのDN−100プログラムを製造業者の説明書に従って使用して、750ngのCas9プラスミドおよび250ngのsgRNAプラスミドにより、細胞を同時形質移入した。
EGFP崩壊実験は、既に記載のとおり実施した(Fu,Y.et al.High−frequency off−target mutagenesis induced by CRISPR−Cas nucleases in human cells.Nat Biotechnol 31,822−826(2013);Reyon,D.et al.FLASH assembly of TALENs for high−throughput genome editing.Nat Biotechnol 30,460−465(2012))。形質移入の約52時間後、Fortessaフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して形質移入U2OS.EGFP細胞中のEGFP蛍光を計測した。Cas9および空のU6プロモータープラスミドの陰性対照形質移入を使用して全ての実験について約2.5%のバックグラウンドEGFP損失を確立した(図中に赤色破線として表す)。
T7E1アッセイは、既に記載のとおり実施して(Reyon,D.et al.FLASH assembly of TALENs for high−throughput genome editing.Nat Biotechnol 30,460−465(2012))ヒト細胞中の内在性遺伝子座におけるCas9誘導突然変異誘発を定量した。形質移入の約72時間後、Agencourt DNAdvance Genomic DNA Isolation Kit(Beckman Coulter Genomics)を使用してゲノムDNAを単離した。表11に列記されるプライマーを使用して約100ngのゲノムDNAから、標的遺伝子座をPCR増幅した。Agencourt Ampure XPクリーンアップステップ(Beckman Coulter Genomics)後、約200ngの精製PCR産物を変性し、ハイブリダイズしてからT7E1(New England Biolabs)により消化した。2回目のクリーンアップステップ後、Qiaxcelキャピラリー電気泳動装置(Qiagen)を使用して突然変異誘発頻度を定量した。
GUIDE−seq実験は、既に記載のとおり実施および分析した(Tsai,S.Q.et al.GUIDE−seq enables genome−wide profiling of off−target cleavage by CRISPR−Cas nucleases.Nat Biotechnol 33,187−197(2015))。簡潔に述べると、U2OS細胞を上記のとおり、Cas9およびsgRNAプラスミド、ならびにNdeI部位が埋め込まれた100pmolのリン酸化ホスホロチオエート修飾二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(dsODN)により形質移入した。制限断片長多型(RFLP)分析を実施してdsODNタグインテグレーション頻度の頻度を決定し(実施例1〜2参照:Tsai,S.Q.et al.GUIDE−seq enables genome−wide profiling of off−target cleavage by CRISPR−Cas nucleases.Nat Biotechnol 33,187−197(2015))、T7E1アッセイを実施してオンターゲットCas9突然変異誘発頻度を定量した。dsODNタグ特異的増幅およびライブラリー調製(Tsai,S.Q.et al.GUIDE−seq enables genome−wide profiling of off−target cleavage by CRISPR−Cas nucleases.Nat Biotechnol 33,187−197(2015))を実施してから、Illumina MiSeq Sequencerを使用してハイスループットシーケンシングを行った。潜在的なオフターゲット部位をマッピングした場合、オンターゲットスペーサー配列に対するアラインメントについてのカットオフを21ヌクレオチドスペーサーについて8ミスマッチに、22ヌクレオチドスペーサーについて9ミスマッチに、および23ヌクレオチドスペーサーについて10ミスマッチに設定した。潜在的なDNAまたはRNAバルジ(Lin,Y.et al.CRISPR/Cas9 systems have off−target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences.Nucleic Acids Res 42,7473−7485(2014))を有するオフターゲット部位をマニュアルアラインメントにより同定した。
CRISPR−Cas9ヌクレアーゼによる部位特異的DNA開裂は、主に、RNA−DNA相互作用によりガイドされるが、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)のCas9媒介認識も要求する。一般に使用される化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9は、そのNGG PAM内の2つのヌクレオチドを規定するが、望ましい特性を有する他のCas9オルソログは、より長鎖のPAMを認識する。伸長PAM配列は、特異性の関連から潜在的に有利である一方、ゲノム編集用途のためのCas9オルソログの標的化範囲を制限し得る。このようなCas9オルソログにより標的化可能な配列の範囲を拡大する1つの考えられる方針は、PAM内のある位置についての緩和した特異性を有するバリアントを進化させることであり得る。ここで、本発明者らは、分子進化を使用して黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)(ウイルス送達を要求する用途に有用なより小さいサイズのオルソログ)のNNGRRT(配列番号46)PAM特異性を改変した。本発明者らが同定した1つのバリアントは、KKH SaCas9と称され、NNNRRT PAMを有する内在性ヒト標的部位におけるロバストなゲノム編集活性を示す。重要なことに、GUIDE−seq法を使用して、本発明者らは、野生型およびKKH SaCas9の両方がヒト細胞中で同等数のオフターゲット効果を誘導することを示した。KKH SaCas9は、SaCas9の標的化範囲をほぼ2〜4倍だけ増加させ、それは、野生型ヌクレアーゼにより変更することができない配列の標的化を可能とした。より一般に、これらの結果は、Cas9オルソログの標的化範囲を拡大するためのPAM特異性緩和の実行可能性を実証する。本発明者らの分子進化方針は、PAMに接触する特異的残基の構造情報も先験的知識も要求せず、したがって、広範なCas9オルソログに適用可能であるはずである。
本発明者らは、構造情報を要求しない、緩和したPAM認識特異性を有するCas9バリアントを遺伝子操作するための偏りのない遺伝的アプローチを考案した。本発明者らは、本発明者らがそれらの試験を開始した時点で構造データが入手可能でないSaCas9を使用してこの方針を試験した。初期ステップにおいて、本発明者らは、構造的に十分に特徴付けされたSpCas9(Jiang et al.,Science 348,1477−1481(2015);Anders et al.,Nature 513,569−573(2014);Jinek et al.,Science(2014);Nishimasu et al.,Cell(2014))との配列比較によりSaCas9についてのPAM相互作用ドメインを保守的に推定することを求めた。SpCas9およびSaCas9は、一次配列レベルにおいてかなり異なるが(図21a、図29)、10個の追加のオルソログとのその両方のアラインメントにより、SaCas9についての予測PAM相互作用ドメインを保守的に定義することが可能となった(実施例3のための方法;図29および30参照)。
SpCas9−VQRバリアントはNGAG>NGAA=NGAT>NGACのNGAN PAMについての優先性を有するため、本発明者らは、NGAH PAM(H=A、C、またはT)に対する改善された活性を有する誘導体バリアントについて選択することを求めた。NGAA、NGAT、またはNGAC PAMのいずれかを有する標的部位を含有する細胞に対するR1335Qライブラリー(ランダムに突然変異誘発したPIドメインを有する)についての選択により、変更PAM特異性を与える突然変異を含有する追加のクローンをシーケンシングすることが可能となった。これらのクローンの配列により、NGAA、NGAT、またはNGAC PAMへのPAM特異性の変更に重要であり得る追加の突然変異が明らかになった。
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本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は、以下の態様を含み得る。
[1]
以下の位置:G1104、S1109、L1111、D1135、S1136、G1218、N1317、R1335、T1337の1つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)タンパク質。
[2]
配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を含む、請求項1に記載の単離タンパク質。
[3]
以下の突然変異:G1104K;S1109T;L1111H;D1135V;D1135E;D1135N;D1335Y;S1136N;G1218R;N1317K;R1335E;R1335Q;およびT1337Rの1つ以上を含む、請求項1に記載の単離タンパク質。
[4]
以下の突然変異:D1135E(D1135Eバリアント);D1135V/R1335Q/T1337R(VQRバリアント);D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(VRQRバリアント);D1135E/R1335Q/T1337R(EQRバリアント);D1135N/G1218R/R1335Q/T1337R(NRQRバリアント);D1135Y/G1218R/R1335Q/T1337R(YRQRバリアント);G1104K/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(KVRQRバリアント);S1109T/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(TVRQRバリアント);L1111H/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(HVRQRバリアント);D1135V/S1136N/G1218R/R1335Q/T1337R(VNRQRバリアント);D1135V/G1218R/N1317K/R1335Q/T1337R(VRKQRバリアント);またはD1135V/G1218R/R1335E/T1337R(VRERバリアント)を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[5]
D10、E762、D839、H983、またはD986;およびH840またはN863における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる1つ以上の突然変異をさらに含む、請求項1に記載の単離タンパク質。
[6]
前記突然変異が、
(i)D10AまたはD10N、および
(ii)H840A、H840N、またはH840Y
である、請求項5に記載の単離タンパク質。
[7]
以下の位置:E782、N968、および/またはR1015の1つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)タンパク質。
[8]
配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を含む、請求項7に記載の単離タンパク質。
[9]
以下の突然変異:R1015Q、R1015H、E782K、N968K、E735K、K929R、A1021T、K1044N、E782K/N968K/R1015H(KKHバリアント);E782K/K929R/R1015H(KRHバリアント);またはE782K/K929R/N968K/R1015H(KRKHバリアント)の1つ以上を含む、請求項7に記載の単離タンパク質。
[10]
D10、D556、H557、および/またはN580における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる1つ以上の突然変異をさらに含む、請求項7に記載の単離タンパク質。
[11]
前記突然変異が、D10A、D556A、H557A、N580A、例えば、D10A/H557Aおよび/またはD10A/D556A/H557A/N580Aである、請求項7に記載の単離タンパク質。
[12]
任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている請求項1〜11のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
[13]
前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項12に記載の融合タンパク質。
[14]
前記転写活性化ドメインがVP64またはNF−κB p65からのものである、請求項12に記載の融合タンパク質。
[15]
前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項12に記載の融合タンパク質。
[16]
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス(KRAB)ドメイン、ERFリプレッサードメイン(ERD)、またはmSin3A相互作用ドメイン(SID)である、請求項15に記載の融合タンパク質。
[17]
前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)である、請求項15に記載の融合タンパク質。
[18]
前記異種機能ドメインが、DNAのメチル化状態を改変する酵素である、請求項12に記載の融合タンパク質。
[19]
前記DNAのメチル化状態を改変する前記酵素がDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)またはTETタンパク質である、請求項18に記載の融合タンパク質。
[20]
前記TETタンパク質がTET1である、請求項19に記載の融合タンパク質。
[21]
前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項12に記載の融合タンパク質。
[22]
ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)、またはヒストンデメチラーゼである、請求項12に記載の融合タンパク質。
[23]
前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、請求項12に記載の融合タンパク質。
[24]
前記生物学的係留物がMS2、Csy4またはラムダNタンパク質である、請求項23に記載の融合タンパク質。
[25]
前記異種機能ドメインがFokIである、請求項12に記載の融合タンパク質。
[26]
請求項1〜25のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
[27]
請求項26に記載の単離核酸を含むベクター。
[28]
請求項21に記載の単離核酸が、以下の位置:G1104、S1109、L1111、D1135、S1136、G1218、N1317、R1335、T1337の1つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)タンパク質を発現させるための1つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項27に記載のベクター。
[29]
請求項21に記載の単離核酸が、以下の位置:E782、N968、および/またはR1015の1つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)タンパク質を発現させるための1つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項27に記載のベクター。
[30]
請求項26に記載の核酸を含み、および任意選択的に請求項1〜25のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
[31]
細胞のゲノムを変更する方法であって、前記細胞中で、請求項1〜25のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドRNAを発現させるか、またはそれらと前記細胞を接触させることを含む方法。
[32]
前記単離タンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および/または親和性タグの1つ以上を含む、請求項31に記載の方法。
[33]
前記細胞が幹細胞である、請求項31に記載の方法。
[34]
前記細胞が胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物中に存在するか、または胚中に存在する、請求項33に記載の方法。
[35]
二本鎖DNA(dsDNA)分子を変更する方法であって、前記dsDNA分子を、請求項1〜25のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記dsDNA分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドRNAと接触させることを含む方法。
[36]
前記dsDNA分子がインビトロで存在する、請求項35に記載の方法。
Claims (29)
- 配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一である配列を含み、D1135にアミノ酸置換を有し、変更PAM特異性を有する単離膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)タンパク質。
- 以下の位置:G1104、S1109、L1111、S1136、G1218、N1317、R1335、T1337の1つ以上におけるアミノ酸置換をさらに有する、請求項1に記載の単離タンパク質。
- 以下の突然変異:G1104K;S1109T;L1111H;D1135V;D1135E;D1135N;D1335Y;S1136N;G1218R;N1317K;R1335E;R1335Q;およびT1337Rの1つ以上を含む、請求項2に記載の単離タンパク質。
- 以下の突然変異:D1135E(D1135Eバリアント);D1135V/R1335Q/T1337R(VQRバリアント);D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(VRQRバリアント);D1135E/R1335Q/T1337R(EQRバリアント);D1135N/G1218R/R1335Q/T1337R(NRQRバリアント);D1135Y/G1218R/R1335Q/T1337R(YRQRバリアント);G1104K/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(KVRQRバリアント);S1109T/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(TVRQRバリアント);L1111H/D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R(HVRQRバリアント);D1135V/S1136N/G1218R/R1335Q/T1337R(VNRQRバリアント);D1135V/G1218R/N1317K/R1335Q/T1337R(VRKQRバリアント);またはD1135V/G1218R/R1335E/T1337R(VRERバリアント)を含む、請求項2または3に記載の単離タンパク質。
- D10、E762、D839、H983、またはD986;およびH840またはN863における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる1つ以上の突然変異をさらに含む、請求項1に記載の単離タンパク質。
- 前記突然変異が、
(i)D10AまたはD10N、および
(ii)H840A、H840N、またはH840Y
である、請求項5に記載の単離タンパク質。 - 任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記転写活性化ドメインがVP64またはNF−κB p65からのものである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス(KRAB)ドメイン、ERFリプレッサードメイン(ERD)、またはmSin3A相互作用ドメイン(SID)である、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)である、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが、DNAのメチル化状態を改変する酵素である、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記DNAのメチル化状態を改変する前記酵素がDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)またはTETタンパク質である、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 前記TETタンパク質がTET1である、請求項14に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項7に記載の融合タンパク質。
- ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)、またはヒストンデメチラーゼである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記生物学的係留物がMS2、Csy4またはラムダNタンパク質である、請求項18に記載の融合タンパク質。
- 前記異種機能ドメインがFokIである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜20のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項21に記載の単離核酸を含むベクター。
- 請求項21に記載の単離核酸が、以下の位置:G1104、S1109、L1111、D1135、S1136、G1218、N1317、R1335、T1337の1つ以上における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)タンパク質を発現させるための1つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項22に記載のベクター。
- 請求項21に記載の核酸を含み、および任意選択的に請求項1〜20のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
- 細胞のゲノムを変更するための医薬組成物であって、請求項1〜20のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質を含む、医薬組成物。
- 前記単離タンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および/または親和性タグの1つ以上を含む、請求項25に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項25に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物中に存在するか、または胚中に存在する、請求項27に記載の医薬組成物。
- 二本鎖DNA(dsDNA)分子を変更する方法であって、前記dsDNA分子を、請求項1〜20のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記dsDNA分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドRNAとインビトロで接触させることを含む方法。
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