CN110257427B - 无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用 - Google Patents

无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用，属于基因敲除技术领域。本发明所述无PAM限制的CRISPR/Cas9系统，所述系统包括CRISPR/xCas9NNN系统或CRISPR/ngCas9NNN系统。本发明所述系统与传统的CRISPR/spCas9系统相比，解除了NGG PAM的限制，靶标范围显著扩大。

Description

无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用
技术领域
本发明涉及基因敲除技术领域，具体涉及无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用。
背景技术
ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9打靶技术是目前研究较为成熟的几种基因组修饰技术。(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等(MultiplexGenome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guidedhuman genome engineering via Cas9.Science.2013)证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3～25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。但是，传统的CRISPR/Cas9系统识别的3’-PAM序列是NGG，这限制了它的应用范围，尤其不太适用于A、T含量丰富的基因组区域。因此，如果能够解除PAM序列的限制，CRISPR/Cas9系统的靶向范围将大大增加。
发明内容
本发明的目的在于提供无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用。本发明所述系统与传统的CRISPR/spCas9系统相比，解除了NGG PAM的限制，靶标范围显著扩大。
本发明提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统，所述系统包括CRISPR/xCas9NNN系统或CRISPR/ngCas9NNN系统；
所述CRISPR/xCas9NNN系统包括Cas9通用表达载体和pX330-xCas9NNN；所述pX330-xCas9NNN为含如SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的pX330载体；
所述CRISPR/ngCas9NNN系统包括Cas9通用表达载体和pX330-ngCas9NNN；所述pX330-ngCas9NNN为含如SEQ ID NO.2所述核苷酸序列的pX330载体；
所述Cas9通用表达载体为pCas9-sgRNA，所述pCas9-sgRNA为含如SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的pUC57载体。
本发明还提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用spCas9突变体xCas9NNN，pX330-xCas9NNN表达spCas9突变体xCas9NNN，所述xCas9NNN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用spCas9突变体ngCas9NNN，pX330-ngCas9NNN表达spCas9突变体ngCas9NNN，所述ngCas9NNN的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用向导RNA Cas9sgRNA，Cas9通用表达载体编码Cas9sgRNA，所述Cas9sgRNA的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述技术方案所述系统在哺乳动物基因敲除中的应用。
本发明提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统。本发明所述系统包括CRISPR/xCas9NNN系统或CRISPR/ngCas9NNN系统，这些系统同时表达向导RNA和spCas9突变体(依次为xCas9NNN及ngCas9NNN)，向导RNA识别细胞基因组上的20nt左右的靶基因序列并与之特异性结合，而spCas9突变体则通过向导RNA的介导特异性识别并切割靶基因位点，从而改变靶基因的序列。本发明所述系统与传统的CRISPR/spCas9系统相比，解除了NGG PAM的限制，靶标范围显著扩大。
附图说明
图1为pCas9-MSH2T3与pX330-xCas9NNN载体混合转染对人细胞系293T的敲除结果；
图2为pCas9-Tada1T3与pX330-xCas9NNN质粒混合转染对小鼠细胞系NIH/3T3的敲除结果；
图3为结果pCas9-RELAT3与pX330-xCas9NNN载体混合转染对猪细胞系PIEC的敲除；
图4为pCas9-DKK2T3与pX330-xCas9NNN载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除结果；
图5为pCas9-MSH2T4与pX330-ngCas9NNN载体混合转染对人细胞系293T的敲除结果；
图6为pCas9-Tada1T4与pX330-ngCas9NNN质粒混合转染对小鼠细胞系NIH/3T3的敲除结果；
图7为pCas9-RELAT4与pX330-ngCas9NNN载体混合转染对猪细胞系PIEC的敲除结果；
图8为pCas9-DKK2T4与pX330-ngCas9NNN载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除结果。
具体实施方式
本发明提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统，所述系统包括CRISPR/xCas9NNN系统或CRISPR/ngCas9NNN系统；
所述CRISPR/xCas9NNN系统包括Cas9通用表达载体和pX330-xCas9NNN；所述pX330-xCas9NNN为含如SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的pX330载体；
所述CRISPR/ngCas9NNN系统包Cas9通用表达载体和pX330-ngCas9NNN；所述pX330-ngCas9NNN为含如SEQ ID NO.2所述核苷酸序列的pX330载体；
所述Cas9通用表达载体为pCas9-sgRNA，所述pCas9-sgRNA为含如SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的pUC57载体。
本发明所述CRISPR/xCas9NNN系统包括Cas9通用表达载体和pX330-xCas9NNN；所述pX330-xCas9NNN为含如SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的pX330载体。在本发明中，所述pX330-xCas9NNN表达spCas9突变体xCas9NNN，所述xCas9NNN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(3947bp)。pX330-xCas9NNN载体和Cas9通用表达载体pCas9-sgRNA共同构成CRISPR/spCas9-NNG系统，它所识别并编辑的靶标3’-PAM序列是NNN(也就是任意序列，没有PAM的限制)，与传统的CRISPR/spCas9系统相比，解除了NGG PAM中第二个G、第三个G的限制，靶标范围无限扩大。
本发明所述CRISPR/ngCas9NNN系统包括Cas9通用表达载体和pX330-ngCas9NNN；所述pX330-ngCas9NNN为含如SEQ ID NO.2所述核苷酸序列的pX330载体。在本发明中，所述pX330-ngCas9NNN表达spCas9突变体ngCas9NNN，所述ngCas9NNN的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示(3947bp)。pX330-ngCas9NNN载体和Cas9通用表达载体pCas9-sgRNA共同构成CRISPR/ngCas9NNN，它所识别并编辑的靶标3’-PAM序列是NNN(也就是任意序列，没有PAM的限制)，与传统的CRISPR/spCas9系统相比，解除了NGG PAM中第二个G、第三个G的限制，靶标范围无限扩大。
本发明所述Cas9通用表达载体pCas9-sgRNA的构建如下：
本发明设计合成如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列(911bp)，插入到pUC57载体的EcoRV酶切位点，获得pCas9-sgRNA载体。
如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列(911bp)组成如下：合成序列，包含U6启动子+spacer克隆位点(两个BbsⅠ位点之间插入330bp随机序列)+sgRNA下游序列+U6终止子+转录终止信号bGH polyA。在本发明中，所述Cas9通用表达载体编码Cas9sgRNA，所述Cas9sgRNA的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用spCas9突变体xCas9NNN，pX330-xCas9NNN表达spCas9突变体xCas9NNN，所述xCas9NNN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用spCas9突变体ngCas9NNN，pX330-ngCas9NNN表达spCas9突变体ngCas9NNN，所述ngCas9NNN的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用向导RNA Cas9sgRNA，Cas9通用表达载体编码Cas9sgRNA，所述Cas9sgRNA的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述技术方案所述系统在哺乳动物基因敲除中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
Cas9通用表达载体pCas9-sgRNA的构建
向导RNA通用表达载体pCas9-sgRNA序列构成(911bp，SEQ ID NO.3)：
sgRNA表达载体(U6启动子):合成序列，包含U6启动子+spacer克隆位点(两个BbsⅠ位点之间插入330bp随机序列)+sgRNA下游序列+U6终止子+转录终止信号bGHpolyA，依次详述如下：
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatac gatacaaggc tgttagagag
ataattggaattaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga
aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaat ggactatcat
atgcttaccg taacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga
cgaaacacc(U6启动子，SEQ ID NO.33)
gggtcttcg(BbsⅠ位点，SEQ ID NO.34)
ggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagca(随机序列，SEQ ID NO.35)
agaagacct(BbsⅠ位点，SEQ ID NO.36)
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(sgRNA下游序列，SEQ ID NO.37)
tttttt(U6终止子，SEQ ID NO.38)
ctag
agctcgctgatcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc
ccccgtgccttccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga
ggaaattgcatcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca
ggacagcaag ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctgggga(转录终止信号bGHpolyA，SEQ IDNO.39)
整理后序列如SEQ ID NO.3所示(911bp)。
合成上述911bp序列，插入到pUC57载体的EcoRV酶切位点，获得pCas9-sgRNA载体。
实施例2
一、CRISPR/xCas9-NNN基因编辑系统的构建及效率验证
合成如SEQ ID NO.1所示的3947bp的DNA片段xCas9NNN3947，BglII、EcoRI双酶切插入到pX330载体(购自addgene，货号42230)中，获得pX330-xCas9NNN载体。pX330-xCas9NNN载体和Cas9通用表达载体pCas9-sgRNA共同构成CRISPR/xCas9-NNN系统，它所识别并编辑的靶标3’-PAM序列是NNN(也就是任意序列，没有PAM的限制)，与传统的CRISPR/spCas9系统相比，解除了NGG PAM中第二个G、第三个G的限制，靶标范围无限扩大。
二、CRISPR/xCas9NNN系统在人细胞系293T中的基因修饰效率
人细胞系293T，购自中国科学院上海细胞库，目录号：SCSP-502。人MSH2基因的第一外显子序列如SEQ ID NO.4所示：
选取人MSH2基因的第一外显子序列的120-190bp区段作为靶标范围，针对这一范围设计并合成1对DNA寡核苷酸(如下所示)：
MSH2T3-F(caccgagccgaaggagacgctgca(SEQ ID NO.5))、MSH2T3-R(aaactgcagcgtctccttcggctc(SEQ ID NO.6))。
MSH2T3-F与MSH2T3-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经BbsⅠ酶切，连入pCas9-sgRNA载体中，获得pCas9-MSH2T3载体。质粒均送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物PA-R的序列为5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO.7)。
将pCas9-MSH2T3与pX330-xCas9NNN载体按照1:1的比例转染人细胞系293T，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对MSH2F、MSH2R进行PCR扩增(扩增条件：95℃3min；95℃30S，60℃30S，72℃30S，30个循环；72℃5min)。MSH2F序列：ttgggtgtggtcgccgt(SEQ IDNO.8)；MSH2R序列：ccgtgcgccgtatagaagtc(SEQ ID NO.9)，对获得的258bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有5个单克隆的序列发生改变(如图1所示)。该结果表明，pCas9-MSH2T3与pX330-xCas9NNN载体混合转染对人细胞系293T的敲除效率达到25％。这一结果说明，本发明构建的CRISPR/xCas9-NNN系统效率较高，可有效识别并切割PAM序列为NNN的染色体靶标。
三、CRISPR/xCas9-NNN系统在小鼠细胞系NIH/3T3中的基因修饰效率
小鼠细胞系NIH/3T3，购自中国科学院上海细胞库，目录号：SCSP-515。
小鼠Tada1基因的第一外显子序列(SEQ ID NO.10)。
选取上述序列的200-280bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计并合成1对DNA寡核苷酸(如下)：
Tada1T3-F：CACCgtggcgacctttgtgagcga(SEQ ID NO.11)
Tada1T3-R：AAACtcgctcacaaaggtcgccac(SEQ ID NO.12)
其中Tada1T3-F与Tada1T3-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经BbsⅠ酶切，连入pCas9-sgRNA载体中，获得pCas9-Tada1T3载体。质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物PA-R的序列为5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO.7)。
将pCas9-Tada1T3与pX330-xCas9NNN载体按照1:1的质量比例转染小鼠细胞系NIH/3T3，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对Tada1F、Tada1R进行PCR扩增(Tada1F序列：cgcgttgatctttcggttgc(SEQ ID NO.13)；Tada1R序列：gcggctcttactgtttcacg(SEQID NO.14))，对获得的157bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有4个单克隆的序列发生改变(如图2所示)。该结果表明，pCas9-Tada1T3与pX330-xCas9NNN质粒混合转染对小鼠细胞系NIH/3T3的敲除效率达到20％。这一结果说明，本发明构建的CRISPR/xCas9-NNN系统效率较高，可有效识别并切割PAM序列为NNN的染色体靶标。
四、CRISPR/xCas9-NNN系统在猪细胞系PIEC中的基因修饰效率
猪血管内皮细胞系，购自中国科学院上海细胞库，目录号：GNO15。
猪RELA基因的第二外显子序列(SEQ ID NO.15)：
选取上述序列180-240bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计合成1对DNA寡核苷酸，如下：
RELAT3-F：caccggctacaagtgcgagggccg(SEQ ID NO.16)
RELAT3-R：AAACcggccctcgcacttgtagcc(SEQ ID NO.17)
其中RELAT3-F与RELAT3-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经BbsⅠ酶切，连入pCas9-sgRNA载体中，获得pCas9-RELAT3载体。质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物PA-R的序列为5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO.7)。
将pCas9-RELAT3与pX330-xCas9NNN载体按照1:1的比例转染猪细胞系PIEC，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对RELAF、RELAR进行PCR扩增(RELAF序列：ttcccctcgggtaagttgga(SEQ ID NO.18)；RELAR序列：tggggtttcacccctactga(SEQ IDNO.19))，对获得的316bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有5个单克隆的序列发生改变(如图3所示)。该结果表明，pCas9-RELAT3与pX330-xCas9NNN载体混合转染对猪细胞系PIEC的敲除效率达到25％。这一结果说明，本发明构建的CRISPR/xCas9-NNN系统效率较高，可有效识别并切割PAM序列为NNN的染色体靶标。
五、CRISPR/xCas9-NNN系统在绵羊皮肤上皮细胞系中的基因修饰效率
迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。
绵羊DKK2第一外显子440bp序列(SEQ ID NO.20):
选取上述序列200-260bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计合成1对DNA寡核苷酸，如下：
DKK2T3-F：caccgcggtgctgatggtggagag(SEQ ID NO.21)
DKK2T3-R：AAACctctccaccatcagcaccgc(SEQ ID NO.22)
其中DKK2T3-F与DKK2T3-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经BbsⅠ酶切，连入pCas9-sgRNA载体中，获得pCas9-DKK2T3载体。质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物PA-R的序列为5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO.7)。
将pCas9-DKK2T3与pX330-xCas9NNN载体按照1:1的比例转迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增(DKK2-F序列：agactgagttcacacggtgc(SEQ ID NO.23)；DKK2-R序列：cgggtccctacctcttctgg(SEQID NO.24))，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取10个单克隆菌落测序，其中有4个单克隆的序列发生改变(如图4所示)。该结果表明，pCas9-DKK2T3与pX330-xCas9NNN载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除效率达到40％。这一结果说明，本发明构建的CRISPR/xCas9-NNN系统效率较高，可高效识别并切割PAM序列为NNN的染色体靶标。
实施例3
一、CRISPR/ngCas9-NNN基因编辑系统的构建及效率验证
合成3947bp的DNA片段ngCas9NNN3947，BglII、EcoRI双酶切插入到pX330载体(购自addgene，货号42230)中，获得pX330-ngCas9NNN载体。pX330-ngCas9NNN载体和Cas9通用表达载体pCas9-sgRNA共同构成CRISPR/ngCas9NNN，它所识别并编辑的靶标3’-PAM序列是NNN(也就是任意序列，没有PAM的限制)，与传统的CRISPR/spCas9系统相比，解除了NGG PAM中第二个G、第三个G的限制，靶标范围无限扩大。
二、CRISPR/ngCas9-NNN系统在人细胞系293T中的基因修饰效率
人细胞系293T，购自中国科学院上海细胞库，目录号：SCSP-502。人MSH2基因的第一外显子序列如序列号SEQ ID NO.4所示。
选取人MSH2基因的第一外显子序列的120-190bp区段作为靶标范围，针对这一范围设计并合成1对DNA寡核苷酸(如下所示)：
MSH2T4-F(caccgcggtgcagccgaaggagac(SEQ ID NO.25))、MSH2T4-R(aaacgtctccttcggctgcaccgc(SEQ ID NO.26))。
MSH2T4-F与MSH2T4-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经BbsⅠ酶切，连入pCas9-sgRNA载体中，获得pCas9-MSH2T4载体。质粒均送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物PA-R的序列为5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO.7)。
将pCas9-MSH2T4与pX330-ngCas9NNN载体按照1:1的比例转染人细胞系293T，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对MSH2F、MSH2R进行PCR扩增(扩增条件：95℃3min；95℃30S，60℃30S，72℃30S，30个循环；72℃5min)。MSH2F序列：ttgggtgtggtcgccgt(SEQ IDNO.8)；MSH2R序列：ccgtgcgccgtatagaagtc(SEQ ID NO.9)，对获得的258bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有6个单克隆的序列发生改变(如图5所示)。该结果表明，pCas9-MSH2T4与pX330-ngCas9NNN载体混合转染对人细胞系293T的敲除效率达到30％。这一结果说明，本发明构建的CRISPR/ngCas9-NNN系统效率较高，可有效识别并切割PAM序列为NNN的染色体靶标。
三、CRISPR/ngCas9-NNN系统在小鼠细胞系NIH/3T3中的基因修饰效率
小鼠细胞系NIH/3T3，购自中国科学院上海细胞库，目录号：SCSP-515。
小鼠Tada1基因的第一外显子序列如序列号SEQ ID NO.10所示。
选取上述序列的200-280bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计并合成1对DNA寡核苷酸(如下)：
Tada1T4-F：CACCggacgcgcgctgcaatggcg(SEQ ID NO.27)
Tada1T4-R：AAACcgccattgcagcgcgcgtcc(SEQ ID NO.28)
其中Tada1T4-F与Tada1T4-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经BbsⅠ酶切，连入pCas9-sgRNA载体中，获得pCas9-Tada1T4载体。质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物PA-R的序列为5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO.7)。
将pCas9-Tada1T4与pX330-ngCas9NNN载体按照1:1的质量比例转染小鼠细胞系NIH/3T3，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对Tada1F、Tada1R进行PCR扩增(Tada1F序列：cgcgttgatctttcggttgc(SEQ ID NO.13)；Tada1R序列：gcggctcttactgtttcacg(SEQID NO.14))，对获得的157bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有5个单克隆的序列发生改变(如图6所示)。该结果表明，pCas9-Tada1T4与pX330-ngCas9NNN质粒混合转染对小鼠细胞系NIH/3T3的敲除效率达到25％。这一结果说明，本发明构建的CRISPR/ngCas9NNN系统效率较高，可有效识别并切割PAM序列为NNN的染色体靶标。
四、CRISPR/ngCas9-NNN系统在猪细胞系PIEC中的基因修饰效率
猪血管内皮细胞系，购自中国科学院上海细胞库，目录号：GNO15。
猪RELA基因的第二外显子序列如序列号SEQ ID NO.15所示。
选取上述序列180-240bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计合成1对DNA寡核苷酸，如下：
RELAT4-F：caccgctacaagtgcgagggccgc(SEQ ID NO.29)
RELAT4-R：AAACgcggccctcgcacttgtagc(SEQ ID NO.30)
其中RELAT3-F与RELAT3-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经BbsⅠ酶切，连入pCas9-sgRNA载体中，获得pCas9-RELAT3载体。质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物PA-R的序列为5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO.7)。
将pCas9-RELAT4与pX330-ngCas9NNN载体按照1:1的比例转染猪细胞系PIEC，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对RELAF、RELAR进行PCR扩增(RELAF序列：ttcccctcgggtaagttgga(SEQ ID NO.18)；RELAR序列：tggggtttcacccctactga(SEQ IDNO.19))，对获得的316bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有6个单克隆的序列发生改变(如图7所示)。该结果表明，pCas9-RELAT4与pX330-ngCas9NNN载体混合转染对猪细胞系PIEC的敲除效率达到30％。这一结果说明，本发明构建的CRISPR/ngCas9NNN系统效率较高，可有效识别并切割PAM序列为NNN的染色体靶标。
五、CRISPR/ngCas9-NNN系统在绵羊皮肤上皮细胞系中的基因修饰效率
迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。
绵羊DKK2第一外显子440bp序列如SEQ ID NO.20所示。
选取上述序列200-260bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计合成1对DNA寡核苷酸，如下：
DKK2T4-F：caccgtgctgatggtggagagctc(SEQ ID NO.31)
DKK2T4-R：AAACgagctctccaccatcagcac(SEQ ID NO.32)
其中DKK2T4-F与DKK2T4-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经BbsⅠ酶切，连入pCas9-sgRNA载体中，获得pCas9-DKK2T4载体。质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证，测序引物PA-R的序列为5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO.7)。
将pCas9-DKK2T4与pX330-ngCas9NNN载体按照1:1的比例转迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增(DKK2-F序列：agactgagttcacacggtgc(SEQ ID NO.23)；DKK2-R序列：cgggtccctacctcttctgg(SEQ ID NO.24)，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取10个单克隆菌落测序，其中有5个单克隆的序列发生改变(如图8所示)。该结果表明，pCas9-DKK2T4与pX330-ngCas9NNN载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除效率达到40％。这一结果说明，本发明构建的CRISPR/ngCas9-NNN系统效率较高，可高效识别并切割PAM序列为NNN的染色体靶标。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 无PAM限制的CRISPR/Cas9系统及其应用
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3947
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga ctggaagagt 60
ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc aacatcgtgg 120
acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag aaactggtgg 180
acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac atgatcaagt 240
tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac gtggacaagc 300
tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc atcaacgcca 360
gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga cggctggaaa 420
atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac ctgattgccc 480
tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag gataccaaac 540
tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc cagatcggcg 600
accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc ctgctgagcg 660
acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct atgatcaagc 720
tgtacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg cagcagctgc 780
ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc ggctacattg 840
acggcggaat taaacatcgc aagcgcacaa ctaaactggc cagccaggaa gagttctaca 900
agttcatcaa gcccatcctg gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga 960
acagagagga cctgctgcgg aagcagcgga ccttcgacaa cggcatcatc ccccaccaga 1020
tccacctggg agagctgcac gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga 1080
aggacaaccg ggaaaagatc gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc 1140
ctctggccag gggaaacagc agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca 1200
ccccctggaa cttcgagaag gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc 1260
ggatgaccaa cttcgataag aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc 1320
tgtacgagta cttcaccgtg tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa 1380
tgagaaagcc cgccttcctg agcggcgacc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca 1440
agaccaaccg gaaagtgacc gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt 1500
gcttcgactc cgtggaaatc tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat 1560
accacgatct gctgaaaatt atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg 1620
acattctgga agatatcgtg ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg 1680
aacggctgaa aacctatgcc cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc 1740
ggagatacac cggctggggc aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc 1800
agtccggcaa gacaatcctg gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca 1860
tccagctgat ccacgacgac agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt 1920
ccggccaggg cgatagcctg cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta 1980
agaagggcat cctgcagaca gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc 2040
acaagcccga gaacatcgtg atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac 2100
agaagaacag ccgcgagaga atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc 2160
agatcctgaa agaacacccc gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt 2220
actacctgca gaatgggcgg gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt 2280
ccgactacga tgtggaccat atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca 2340
acaaggtgct gaccagaagc gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag 2400
aggtcgtgaa gaagatgaag aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc 2460
agagaaagtt cgacaatctg accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg 2520
ccggcttcat caagagacag ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga 2580
tcctggactc ccggatgaac actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga 2640
aagtgatcac cctgaagtcc aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca 2700
aagtgcgcga gatcaacaac taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg 2760
gaaccgccct gatcaaaaag taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca 2820
aggtgtacga cgtgcggaag atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg 2880
ccaagtactt cttctacagc aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca 2940
acggcgagat ccggaagcgg cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt 3000
gggataaggg ccgggatttt gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata 3060
tcgtgaaaaa gaccgaggtg cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga 3120
ggaacagcga taagctgatc gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct 3180
tcgacagccc caccgtggcc tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt 3240
ccaagaaact gaagagtgtg aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct 3300
tcgagaagaa tcccatcgac tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc 3360
tgatcatcaa gctgcctaag tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc 3420
tggcctctgc cggcgtgctg cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga 3480
acttcctgta cctggccagc cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc 3540
agaaacagct gtttgtggaa cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca 3600
gcgagttctc caagagagtg atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct 3660
acaacaagca ccgggataag cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta 3720
ccctgaccaa tctgggagcc cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcaagcaag 3780
accggaagag gtacaccagc accaaagagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca 3840
tcaccggcct gtacgagaca cggatcgacc tgtctcagct gggaggcgac aaaaggccgg 3900
cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaagta agaattc 3947
<210> 2
<211> 3947
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga ctggaagagt 60
ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc aacatcgtgg 120
acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag aaactggtgg 180
acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac atgatcaagt 240
tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac gtggacaagc 300
tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc atcaacgcca 360
gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga cggctggaaa 420
atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac ctgattgccc 480
tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag gatgccaaac 540
tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc cagatcggcg 600
accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc ctgctgagcg 660
acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct atgatcaaga 720
gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg cagcagctgc 780
ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc ggctacattg 840
acggcggaat taaacatcgc aagcgcacaa ctaaactggc cagccaggaa gagttctaca 900
agttcatcaa gcccatcctg gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga 960
acagagagga cctgctgcgg aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga 1020
tccacctggg agagctgcac gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga 1080
aggacaaccg ggaaaagatc gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc 1140
ctctggccag gggaaacagc agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca 1200
ccccctggaa cttcgaggaa gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc 1260
ggatgaccaa cttcgataag aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc 1320
tgtacgagta cttcaccgtg tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa 1380
tgagaaagcc cgccttcctg agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca 1440
agaccaaccg gaaagtgacc gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt 1500
gcttcgactc cgtggaaatc tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat 1560
accacgatct gctgaaaatt atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg 1620
acattctgga agatatcgtg ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg 1680
aacggctgaa aacctatgcc cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc 1740
ggagatacac cggctggggc aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc 1800
agtccggcaa gacaatcctg gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca 1860
tgcagctgat ccacgacgac agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt 1920
ccggccaggg cgatagcctg cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta 1980
agaagggcat cctgcagaca gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc 2040
acaagcccga gaacatcgtg atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac 2100
agaagaacag ccgcgagaga atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc 2160
agatcctgaa agaacacccc gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt 2220
actacctgca gaatgggcgg gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt 2280
ccgactacga tgtggaccat atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca 2340
acaaggtgct gaccagaagc gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag 2400
aggtcgtgaa gaagatgaag aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc 2460
agagaaagtt cgacaatctg accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg 2520
ccggcttcat caagagacag ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga 2580
tcctggactc ccggatgaac actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga 2640
aagtgatcac cctgaagtcc aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca 2700
aagtgcgcga gatcaacaac taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg 2760
gaaccgccct gatcaaaaag taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca 2820
aggtgtacga cgtgcggaag atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg 2880
ccaagtactt cttctacagc aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca 2940
acggcgagat ccggaagcgg cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt 3000
gggataaggg ccgggatttt gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata 3060
tcgtgaaaaa gaccgaggtg cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc cggcccaaga 3120
ggaacagcga taagctgatc gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct 3180
tcgtgagccc caccgtggcc tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt 3240
ccaagaaact gaagagtgtg aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct 3300
tcgagaagaa tcccatcgac tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc 3360
tgatcatcaa gctgcctaag tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc 3420
tggcctctgc ccgcttcctg cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga 3480
acttcctgta cctggccagc cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc 3540
agaaacagct gtttgtggaa cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca 3600
gcgagttctc caagagagtg atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct 3660
acaacaagca ccgggataag cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta 3720
ccctgaccaa tctgggagcc cctcgggcct tcaagtactt tgacaccacc atcaagcaag 3780
accggaaggt gtaccggagc accaaagagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca 3840
tcaccggcct gtacgagaca cggatcgacc tgtctcagct gggaggcgac aaaaggccgg 3900
cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaagta agaattc 3947
<210> 3
<211> 911
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
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cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 780
actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 840
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<212> DNA
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<400> 4
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agacccaggg ggtgatcaag tacatggggc cggcag 336
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaactgcagc gtctccttcg gctc 24
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagtgggagt ggcacctt 18
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgtgcgccg tatagaagtc 20
<210> 10
<211> 310
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agagccgagc cgagccgagc cgagcggagc cgagccgagc cgagcggagc cgagccgagc 60
cgagccgagc cgaaccgagc cgagccgagc cgaaccgagc cgagccgagc cgagtggaat 120
cgagtcgagt cgagcctcca gcgtccggcg cgcaggcctt ccgccgcgtt gatctttcgg 180
ttgctggtgg ccgtgggccg cgcggtctac ggtcgggctg aaagacgcgc gctgcaatgg 240
cgacctttgt gagcgagctg gaggcagcca agaagaactt gagcgaggcg ctgggggaca 300
acgtgaaaca 310
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccgtggcg acctttgtga gcga 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaactcgctc acaaaggtcg ccac 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcgttgatc tttcggttgc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcggctctta ctgtttcacg 20
<210> 15
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccggccccg gcctcgggcc cctatgtgga gatcatcgag cagcccaagc agcggggcat 60
gcgcttccgc tacaagtgcg agggccgctc agccggcagt atcccgggcg agaggagcac 120
ggataccacc aagacccacc ccaccatcaa g 151
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caccggctac aagtgcgagg gccg 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaccggccc tcgcacttgt agcc 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcccctcgg gtaagttgga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggggtttca cccctactga 20
<210> 20
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agactgagtt cacacggtgc tgggccccca aagccaagtg gggttggggg aacagagtct 60
gcgagtcccg gcgccccgag tgcagggccc cgtgttgggg tcctccttcc catttgtatc 120
cgtatccttg cgggctttgc gcctccccgg gggacccctc gccgggagat ggccgcactg 180
atgcggggca aggactcctc ccgctgcctg ctcctactgg ccgcggtgct gatggtggag 240
agctcacagt tcggcagctc gcgggccaaa ctcaactcca tcaagtcctc tctgggcggg 300
gagacgcctg cccaggccgc caatcgatct gcgggcactt accaaggact ggctttcggc 360
ggcagtaaga agggcaaaaa cctggggcag gtaggaaaat acccccaata cactcttcaa 420
ccagaagagg tagggacccg 440
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccgcggtg ctgatggtgg agag 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaacctctcc accatcagca ccgc 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agactgagtt cacacggtgc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgggtcccta cctcttctgg 20
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caccgcggtg cagccgaagg agac 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaacgtctcc ttcggctgca ccgc 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caccggacgc gcgctgcaat ggcg 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaaccgccat tgcagcgcgc gtcc 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caccgctaca agtgcgaggg ccgc 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaacgcggcc ctcgcacttg tagc 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caccgtgctg atggtggaga gctc 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aaacgagctc tccaccatca gcac 24
<210> 33
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacacc 249
<210> 34
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gggtcttcg 9
<210> 35
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 60
gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 120
gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 180
cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 240
gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 300
cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca 330
<210> 36
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agaagacct 9
<210> 37
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgc 76
<210> 38
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tttttt 6
<210> 39
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60
cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 120
atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180
ggcaggacag caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg ga 232

Claims (5)

1.无PAM限制的CRISPR/Cas9系统，所述系统包括CRISPR/xCas9NNN系统或CRISPR/ngCas9NNN系统；
所述CRISPR/xCas9NNN系统包括Cas9通用表达载体和pX330-xCas9NNN；所述pX330-xCas9NNN为含如SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的pX330载体；
所述CRISPR/ngCas9NNN系统包括Cas9通用表达载体和pX330-ngCas9NNN；所述pX330-ngCas9NNN为含如SEQ ID NO.2所述核苷酸序列的pX330载体；
所述Cas9通用表达载体为pCas9-sgRNA，所述pCas9-sgRNA为含如SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的pUC57载体。
2.无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用spCas9突变体xCas9NNN，pX330-xCas9NNN表达spCas9突变体xCas9NNN，所述xCas9NNN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用spCas9突变体ngCas9NNN，pX330-ngCas9NNN表达spCas9突变体ngCas9NNN，所述ngCas9NNN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1所述无PAM限制的CRISPR/Cas9系统用向导RNA Cas9 sgRNA，Cas9通用表达载体编码Cas9 sgRNA，所述Cas9 sgRNA的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求1所述系统在哺乳动物基因敲除中的应用。
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