JP2022524435A - Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼを使用したｄｎａ構築物の組み込みプロセスの向上 - Google Patents

Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼを使用したｄｎａ構築物の組み込みプロセスの向上 Download PDF

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Abstract

遺伝子操作された細胞を開発するための、改良された、より安全な、商業的に効率的なプロセスが開示される。より詳細には、ドナーＤＮＡ構築物、ガイドＲＮＡ、およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを、形質移入されることとなる宿主細胞に導入することと、３つの構成要素を宿主細胞中に導入することとを含むプロセスが開示される。ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を、宿主細胞の定義されたゲノム部位中に挿入するために設計されたドナーＤＮＡ構築物がさらに開示される。さらに、本開示は、安全性の懸念を示し得るウイルスベクターを欠く、ＣＡＲで形質移入された宿主細胞を提供する。本開示は、Ｔ細胞を操作してＣＡＲ構築物を発現させる、より効率的かつ費用効果の高いプロセスを提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年３月１１日出願の米国仮特許出願第６２／８１６，８３６号および２０１９年９月１７日出願の米国仮特許出願第６２／９０１，７３５号に基づく優先権を主張し、これらの出願は双方ともそれらの全体が参照によって組み込まれる。
技術分野
本開示は、ｃａｓタンパク質などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを使用して、関心対象のＤＮＡ配列を宿主ゲノムなどの標的ＤＮＡ分子中に効率的に組み込むための方法および組成物を提供する。
背景
外因性ＤＮＡ配列のゲノム遺伝子座内への標的化された組み込みが非常に望まれている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム工学は、遺伝子機能をノックアウトする、または遺伝子補正もしくは遺伝子タギングのためにＤＮＡ配列を正確にノックインするための迅速かつ比較的簡単な方法である。標的化された遺伝子ノックアウトは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用してＤＮＡ中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することによって達成される。次いで、内因性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を介して、ランダムな挿入または欠失（インデル）によって、ＤＳＢは、しばしば不完全に修復される。ノックイン実験のためには、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡに加えて、ＤＮＡドナー鋳型が必要であり、ＤＳＢは、典型的には相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を介してドナー鋳型を用いて修復される。
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナーオリゴまたはドナープラスミド（ｄｓＤＮＡ）のいずれかのドナー鋳型を使用するノックインは、しばしば１～１０％の範囲の比較的低い効率を有する。したがって、ＨＤＲ媒介性ノックイン実験の成功には、重要な設計の検討および実験の最適化が必要である。短い相同アームを有する一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を使用して、いくつかのグループは、ＳＮＰ補正またはエピトープタグ付加などの正確なＤＮＡ編集を達成している。ドナープラスミド（ｄｓＤＮＡ）は、はるかに長い外因性ＤＮＡを組み込むことができるが、効率は非常に低い。いくつかのグループは、ＡＡＶ（ウイルス）ベクターを使用してＨＤＲドナーｓｓＤＮＡを提供し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせて４０～６０％の遺伝子ノックイン効率を達成した。しかしながら、これらの方法は、依然として、高力価ＡＡＶベクターを作製する必要があり、これには時間がかかり、臨床用途のためにはｃＧＭＰ製造に適合している必要がある。
ゲノム工学ツールは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなどのいくつかの細菌のＩＩ型原核生物ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的に配置された短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））適応免疫系の成分に基づいて開発されてきた。ＲＮＡ誘導型Ｃａｓヌクレアーゼ系またはより単純にＣＲＩＳＰＲと呼ばれるこの多成分系は、ガイドＲＮＡ分子と結合して、ガイドＲＮＡによって標的とされる特異的な配列においてゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断を作出する能力を有するＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。ＲＮＡ誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドがゲノム配列にハイブリッド形成するＤＮＡを切断する能力を有する。さらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られる特定の配列がゲノム中の標的配列のすぐ下流に存在する場合にのみＤＮＡを切断する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおける標準型のＰＡＭ配列は５’－ＮＧＧ－３’であり、Ｎは任意のヌクレオチドを指す。
天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系において２つの異なるＲＮＡとして通常発現される単一のキメラｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の発現は、標的ＤＮＡ配列を配列特異的に切断するようにＣａｓ９ヌクレアーゼに指示するのに十分であることが実証されている。さらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのいくつかの変異型が開発されている。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの１つの変異型はニッカーゼとして機能し、野生型Ｃａｓ９の場合のように両方の鎖ではなく、ＤＮＡの相補鎖中に切断を生成する。これにより、ＮＨＥＪではなく高忠実度経路を使用するＤＮＡ鋳型の修復が可能になり、標的遺伝子座におけるおよびおそらくはゲノム内の他の位置におけるインデルの形成が妨げられて、相同組換えを受ける能力を維持しながら、起こり得るオフターゲット／毒性作用が低減される。対になったニッキングは、細胞株においてオフターゲット活性を５０～１，５００倍低下させることができ、オンターゲット切断効率を失うことなくマウス接合子における遺伝子ノックアウトを促進することができる。
さらに、ｃａｓタンパク質は様々な細菌から単離されており、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｃａｓ９とは異なるＰＡＭ配列を使用することが明らかとなっているさらに、ｃａｓ１２ａなどのいくつかのｃａｓタンパク質は、本来は単一のＲＮＡガイドを使用する、すなわち、標的配列にハイブリッド形成するｃｒＲＮＡを使用するが、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用しない。
養子免疫療法は、エクスビボで生成された自己抗原特異的細胞の移入を含み、ウイルス感染症および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用される細胞は、抗原特異的細胞の増殖または遺伝子操作を介した細胞の再指示のいずれかによって生成することができる。
ＣＡＲは、単一の融合分子中で１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインと会合する標的化部分からなる合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は、柔軟なリンカーによって連結されたモノクローナル抗体の軽鎖および可変断片を含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も、首尾よく使用されている。第一世代ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃ受容体ガンマ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代ＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性を首尾よく再指示することが示されているが、インビボにおいて長期の増殖および抗腫瘍活性を与えることはできなかった。ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の生存を強化し、その増殖を増加させるために、単独で（第２世代）または組み合わせて（第３世代）添加されてきた。ＣＡＲは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性腫瘍由来の腫瘍細胞の表面で発現される抗原に対してＴ細胞を首尾よく再指示することを可能にした。
患者の血液からＴ細胞を取り出し、遺伝子導入によってＣＡＲを加え、遺伝子操作された細胞を体内に注入して戻すことを含むＣＡＲ（キメラ抗原受容体）細胞免疫療法は、癌を処置する上で最も有望な方法の１つである。現在、遺伝子導入技術には、ガンマ－レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用するウイルスベースの遺伝子導入方法が含まれる。ＧＭＰ（ＦＤＡが要求する優良医薬品製造基準）レベルのウイルスベクターを作製するために、ウイルスベクターは、複製不全、低遺伝毒性および低免疫原性などの臨床安全基準に適合しなければならない。これらの従来のアプローチは、使いやすさおよび合理的な発現を有するが、二次的な形質転換事象、例えば、望ましくない血液癌およびＴ細胞へのウイルスゲノムの組み込みから生じる他の事象を生じさせる可能性がある。
総説論文（Ｒｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ８（９）：６３４－６４３、２０１７）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用はいずれも、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）構築物をＴ細胞ゲノムに挿入するためのノックイン過程のためにウイルスベクターの使用を依然として伴うことを示す。「アデノウイルスおよびアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの非組込み型ウイルスによってコードされるＣＲＩＳＰＲを用いた遺伝子編集も報告されている」 さらに、２０１６年１１月４日にインターネット上で公開されたＲｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：１３００は、ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を使用し、Ｔ細胞中での遺伝子破壊がレンチウイルスおよびアデノウイルスのＣＲＩＳＰＲではあまり効率的でないことを見出した。
近年、二量体抗原受容体または「ＤＡＲ」が記載されている（国際公開第２０１９／１７３８３７号明細書）。これらの操作された受容体は、２つのポリペプチド鎖を含み、その一方は軽鎖抗体の可変領域および定常領域を含み、そして他方は重鎖抗体の可変領域および定常領域、ならびに膜貫通領域および細胞内領域を含む。ＣＡＲと同様に、ＤＡＲは、癌細胞表面抗原に結合するように操作され得る。コードする構築物が、双方のポリペプチドを共通のプロモータから発現するように構成され得る。
Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム等のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、一部の哺乳動物細胞を遺伝的に操作するための魅力的なアプローチであるように思われるが、初代細胞、特にＴ細胞におけるＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲの使用は、以下の理由でかなり困難である：（１）Ｔ細胞は、その細胞質中へのＤＮＡの導入によって悪影響を受ける：ＤＮＡベクターで細胞を形質転換すると、高い割合のアポトーシスが観察される；（２）ＣＲＩＳＰＲシステムは、細胞内でのＣａｓ９の安定した発現を必要とするが、生細胞内でのＣａｓ９の長期発現は、染色体欠損をもたらす虞がある；そして（３）現在のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの特異性は、１１ヌクレオチド（Ｎ１２～２０ＮＧＧ、ここで、ＮＧＧはＰＡＭを表す）を含む配列によってのみ決定され、これが、ゲノム内でユニークである所望の遺伝子座内の標的配列を識別することを非常に困難にする。Ｃａｓ９に加えて、他のヌクレアーゼとして、Ｃａｓ１２ａ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはＴＡＬエフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）がある。
本開示は、Ｔ細胞などの宿主細胞においてＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの操作を効率的に実施するために、これらの制限に対する解決策を提供することを目的とする。当技術分野では、ウイルスベクターによる形質導入を含まず、代わりに形質移入技術を使用することができる、キメラ抗原受容体構築物のためのより安全な形質導入技術が必要とされている。これは、患者に投与される形質導入された細胞によって潜在的に発現されるウイルス遺伝子を有するリスクを回避しながら、ＣＡＲ構築物の形質移入効率を増大させることを含む。本開示は、本分野におけるこの必要性に対処するために為された。
国際公開第２０１９／１７３８３７号
Ｒｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ８（９）：６３４－６４３、２０１７ Ｒｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：１３００
要旨
本開示は、免疫療法のための細胞を含む、遺伝子操作され、かつ形質導入された細胞を開発するための向上した、より安全な、商業的に効率的なプロセスを提供する。より詳細には、本開示のプロセスは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、およびドナーＤＮＡ構築物を宿主細胞中に導入することを含み、ガイドＲＮＡは、ｃａｓタンパク質と複合体形成されており、これを宿主ゲノムの標的部位に誘導するように操作されている。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによる標的部位でのゲノムＤＮＡの切断、およびその後の、相同アームを含むドナーフラグメントを使用した、相同組換え修復（ＨＤＲ）による二本鎖切断の修復が、相同アーム間に位置するドナーＤＮＡ分子の配列の組み込みをもたらす。当該方法を使用して、同時に、標的遺伝子座にて遺伝子をノックアウトし、かつ、破壊された遺伝子座にて、ドナーＤＮＡ分子内に提供される導入遺伝子を挿入または「ノックイン」することができる。さらに提供されるのは、第１の遺伝子座にて遺伝子構築物を挿入する方法であって、遺伝子構築物の挿入が、第１の遺伝子座にて遺伝子をノックアウトし、かつ同時に第２の遺伝子座にて遺伝子をノックアウトする方法である。ノックイン／ダブルノックアウトは、第１の遺伝子座を標的とするガイドを有する第１のＲＮＰ、および第２の遺伝子座を標的とするガイドを有する第２のＲＮＰの２つのＲＮＰを、標的細胞中に導入することによって達成される。２つのＲＮＰは、同じ（例えばＣａｓ１２ａ）または異なる（例えば、Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ９）ｃａｓタンパク質を含み得る。当該方法は、原核細胞および真核細胞が挙げられるあらゆる宿主細胞に使用することができ、そしてヒト細胞等の哺乳動物細胞に使用することができる。当該方法は、使い勝手の良さ、効率、およびゲノム改変を生成する能力において利点を有し、臨床用途が挙げられる多くの用途において、不所望の選択マーカーまたはウイルスベクターの使用を伴わない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、造血細胞、例えばＴ細胞である。
本開示はまた、真核細胞のゲノムの遺伝子座中へのドナーＤＮＡの標的化された組み込みのためのシステムを提供する。また、提供されるのは、ドナーＤＮＡ分子が、１本のドナーＤＮＡ鎖のヌクレオチドに対する１または複数の修飾を含む、ドナーＤＮＡ組成物である。ドナーＤＮＡは、宿主ゲノム中への組み込みが所望される、関心対象の配列に隣接する相同アームを含んでもよく、相同アームは、標的配列の両側に、宿主ゲノム中に存在する配列に対して相同な配列を有する。いくつかの実施形態におけるドナーＤＮＡは、二本鎖または実質的に二本鎖である。種々の実施形態において、ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡの一方の鎖の５’末端に近位である、例えば、ドナーＤＮＡの一方の鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内に存在する、１～１０個の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡの一方の鎖の５’末端の１～１０ヌクレオチドのうち、少なくとも２種類の核酸修飾を有する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡの一方の鎖の５’末端の１～１０ヌクレオチドのうち、２種類の核酸修飾を有する。修飾は、例えば、ヌクレオチド間のホスホロチオアート（ＰＳ）結合であってもよいし、ドナーＤＮＡ分子の１または複数のヌクレオチドのデオキシリボースの２’－Ｏ－メチル化であってもよい。例えば、ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖の５’末端から最初の５、最初の６、または最初の７ヌクレオチド内に１、２、３、または４個のＰＳ結合を有することができ、そしてまた、修飾された鎖の５’末端から最初の５、最初の６、または最初の７ヌクレオチド内に１、２、３、または４個の２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを有してもよい。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は二本鎖であり、一方の鎖は５’末端に修飾を含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は二本鎖であり、一方の鎖は、５’末端から最初の１０または最初の５ヌクレオチドのいずれかに２またはそれを超える修飾を有し、逆鎖は末端５’ホスファートを有する。種々の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は二本鎖であり、ドナーＤＮＡの一方の鎖上に少なくとも２つのＰＳ結合および少なくとも２つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを有し、ＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾は、修飾された鎖の５’末端から最初の５ヌクレオチド内に存在する。種々の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、二本鎖または実質的に二本鎖であり、ドナーＤＮＡの一方の鎖上に３つのＰＳ結合および３つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを有し、ＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾は、修飾された鎖の５’末端から最初の５ヌクレオチド内に存在する。これらの実施形態のいくつかの例において、逆鎖は末端５’ホスファートを含む。ドナーＤＮＡは、二本鎖または実質的に二本鎖の分子として細胞中に導入され得る。
本開示はさらに、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）またはＤＡＲ（二量体抗原受容体）を宿主細胞中に挿入するために設計されたドナーＤＮＡ構築物を提供する。ＣＡＲ構築物は、当該技術において周知であり、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓ．５：２２において概説されている。２つのポリペプチド受容体をコードするＤＡＲ構築物は、例えば国際公開第２０１９／１７３８３７号明細書に記載されている。さらに、本開示は、ウイルスベクターまたはその構成要素、例えば、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの配列を欠く、ＣＡＲで形質導入された宿主細胞を提供する。本開示は、Ｔ細胞を操作してＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物を発現させる、より効率的かつ費用効果の高いプロセスを提供する。ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物は、非限定的な例として、同時の、ＣＡＲ構築物のノックイン、およびＴＣＲ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ７、または他の遺伝子のノックアウトのために、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ－１遺伝子、ＣＤ７遺伝子、またはＴＩＭ３遺伝子に構築物を標的とする相同アームを含んでもよい。
更なる態様において、本明細書中で提供されるのは：少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子；少なくとも１つのガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸分子；およびドナーＤＮＡ分子を含むゲノム改変のためのシステムであり、ドナーＤＮＡ分子は、５’末端の２０ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、または５ヌクレオチド以内に少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、二本鎖または実質的に二本鎖であり、二本鎖ドナー分子の一方の鎖の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内に存在する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのヌクレオチド上に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの修飾を含む。修飾は、例えば、骨格修飾、例えばホスホロチオアート結合および／またはヌクレオチドの糖の２’－Ｏ－メチル化であってもよい。ドナーＤＮＡは、少なくとも２５０ｎｔまたはｂｐ長であり得、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｎｔまたはｂｐ長であり得、いくつかの実施形態において、２０００ｎｔまたはｂｐ長を超えてもよく、例えば、非限定的な例として、約０．５～４ｋｂ長、または約１ｋｂ～３．５ｋｂ長、または約１．５ｋｂ～約２．８ｋｂ長、または約１．８ｋｂ～約３ｋｂ長であってもよい。ドナーＤＮＡは、相同アーム（ＨＡ）が、ゲノム中に組み込まれることとなる関心対象の配列に隣接していてもよい。関心対象の配列は、例えば、１または複数の抗体または受容体ドメインを含む構築物を発現させるための発現カセットであってもよい。相同アームは、約５０～約５０００ヌクレオチド長、または約１００～１０００ヌクレオチド長、例えば約１２０～約８００ヌクレオチド長、または約１４０～約６００ヌクレオチド長であってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書中で提供されるシステムおよび方法に使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、ＣａｓＸ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの双方の配列を有するキメラガイドであってもよいし、ｃｒＲＮＡであってもよいし、必要に応じて、ホスホロチオアート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドが挙げられる１または複数の核酸修飾を含んでいてもよい。ガイドがｃｒＲＮＡであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがｔｒａｃｒＲＮＡを使用する場合、システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含んでもよい。例えば、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに使用することもできるし、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの構造的特徴を組み合わせたキメラガイドＲＮＡ（時折、シングルガイドまたは「ｓｇＲＮＡ」と称される）に使用することもできる。一方、Ｃａｓ１２ａは本来、ｃｒＲＮＡのみを使用し、ｔｒａｃｒＲＮＡが付随しない。種々の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡであってもキメラガイドＲＮＡであってもよい）、および、含まれる場合、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、細胞に導入されるリボ核タンパク質複合体として複合体形成されていてもよい。ドナーＤＮＡは、ＲＮＰと共に、または別個に、例えば別個のエレクトロポレーションまたは形質移入で、標的細胞中に導入されてもよい。
また、本明細書中で提供されるのは、ドナーＤＮＡを標的ＤＮＡ分子中に部位特異的に組み込む方法であって：少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子；少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡ、または操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸分子；および少なくとも１つの核酸修飾を含むドナーＤＮＡ分子を細胞中に導入することを含み；ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の標的部位配列とハイブリダイズするように設計された標的配列を含み、ドナーＤＮＡは、標的部位にて標的ＤＮＡ分子中に挿入される、方法である。ドナーＤＮＡは、例えば、少なくとも２５０ヌクレオチドもしくは塩基対長、少なくとも５００ヌクレオチドもしくは塩基対、少なくとも１０００ヌクレオチドもしくは塩基対、少なくとも１５００ヌクレオチドもしくは塩基対、少なくとも２０００ヌクレオチドもしくは塩基対、少なくとも２５００ヌクレオチドもしくは塩基対、または少なくとも３０００ヌクレオチドもしくは塩基対（ｂｐ）長であってよく、ここで、ドナーフラグメントは、二本鎖または実質的に二本鎖の分子として細胞に送達され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、タンパク質として細胞中に導入される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として細胞中に導入される。例示的な実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、および、用いられる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として細胞中に導入される。種々の例において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、Ｃａｓ１２ａの場合にはｃｒＲＮＡであるガイドＲＮＡと複合体形成したＲＮＰとして（例えばエレクトロポレーションまたはリポソーム送達によって）細胞に送達される。
さらに提供されるのは、第２の標的遺伝子座の標的化されたノックアウトと組み合わせて、第１の標的遺伝子座中にドナーＤＮＡを部位特異的に組み込む方法である。第１の遺伝子座でのノックイン／ノックアウト、および第２の遺伝子座のノックアウトは、ドナーＤＮＡ、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、および第１の遺伝子座を標的とするガイド、ならびにＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、および第２の遺伝子座を標的とするガイドを１回の形質転換で導入する単回の形質移入事象によって実行することができる。本方法は、第１の遺伝子座を標的とする第１の操作されたガイドＲＮＡと複合体形成した第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ；第２の遺伝子座を標的とする第２の操作されたガイドＲＮＡと複合体形成した第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ；およびドナーＤＮＡ分子を細胞中に同時に導入することを含み；第１のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の第１の標的部位とハイブリダイズするように設計された標的配列を含み、ドナーＤＮＡは、第１の標的部位にて標的ＤＮＡ分子中に挿入され、第２の遺伝子座は、第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによる修飾によって破壊される。ドナーＤＮＡは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つの核酸修飾を有してよく、そして例えば、少なくとも２５０ヌクレオチドもしくは塩基対長、少なくとも５００ヌクレオチドもしくは塩基対、少なくとも１０００ヌクレオチドもしくは塩基対、少なくとも１５００ヌクレオチドもしくは塩基対、少なくとも２０００ヌクレオチドもしくは塩基対、少なくとも２５００ヌクレオチドもしくは塩基対、または少なくとも３０００ヌクレオチドもしくは塩基対（ｂｐ）長であってよく、ここで、ドナーフラグメントは、二本鎖または実質的に二本鎖の分子として細胞に送達され得る。ドナーＤＮＡは、遺伝子を発現するための構築物等の関心対象の配列に隣接する相同アームを有し、相同アームは、宿主ゲノム中の第１の標的部位に近接する配列に対して相同性を有する。第２の遺伝子座は、好ましくは、ノックアウトが所望される遺伝子内の部位である。ドナーＤＮＡの、第１の遺伝子座中への組み込み、および第２の遺伝子座のノックアウトは、形質移入された細胞集団の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％において起こり得る。
本明細書中で提供されるのは、２つのＲＮＰ：第１の遺伝子座を標的とするためのガイドＲＮＡを含む第１のＲＮＰおよび第２の遺伝子座を標的とするためのガイドＲＮＡを含む第２のＲＮＰを細胞に送達することによって、哺乳動物細胞、例えば初代ヒトＴ細胞等のヒト細胞を２つの異なる遺伝子座にて遺伝子改変する方法である。第１のＲＮＰおよび第２のＲＮＰは、同じ、または異なるｃａｓタンパク質を含み得、そして同時に、または連続的に細胞に送達され得る。例えば、第１のＲＮＰはｃａｓ９タンパク質を含み得、第２のＲＮＰはｃａｓ１２ａタンパク質を含み得、またはその逆も可能である。これ以外にも、第１のＲＮＰおよび第２のＲＮＰの双方が、ｃａｓ１２ａタンパク質を含み得る。また、第１の遺伝子座用の相同アームを有するドナーＤＮＡは、第１のＲＮＰと同時に、または後もしくは前の時点で、細胞に送達され得る。ドナーＤＮＡが送達される実施形態において、本方法は、細胞の第１の遺伝子座への非天然遺伝子構築物の挿入を含み、第１の遺伝子座は、非天然遺伝子構築物の挿入によって破壊され得、細胞の第２の遺伝子座のｃａｓ媒介破壊は、第２のＲＮＰによって標的とされる。これらの方法によって改変された細胞は、非天然構築物、例えば、以下に限定されないが、ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物を発現することができ、そして第１の遺伝子座および第２の遺伝子座にて内因性遺伝子の発現の低減を示すことができる。例えば、第１の遺伝子座および第２の遺伝子座は、細胞に送達されるｃａｓタンパク質および複合体形成されたガイドＲＮＡによって変異させることができる。第１の遺伝子座および第２の遺伝子座にて遺伝子を破壊して、遺伝子発現を大幅に低減または排除（ノックアウト）することができる。ドナーＤＮＡは、本明細書中で提供されるあらゆるドナーＤＮＡであってよく、例えば少なくとも一方の鎖に少なくとも２つの核酸修飾を有する二本鎖ドナーＤＮＡである。ドナーＤＮＡは、好ましくは、遺伝子構築物（例えば、ＣＡＲまたはＤＡＲコーディング配列）に隣接する、第１の遺伝子座の配列を含む相同アームを有する。
本明細書中で提供されるシステム、組成物、および方法の種々の実施形態において、ドナーＤＮＡは、少なくとも２つの修飾されたヌクレオチドを含み、これらは同じ、または異なる修飾を有し得、好ましくは、ドナーＤＮＡの一方の鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内に存在する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは二本鎖であり、そして１または複数のヌクレオチド修飾は、ドナーＤＮＡ分子の一本鎖上に存在する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは二本鎖であり、そして１または複数のヌクレオチド修飾は、ドナーＤＮＡ分子の一本鎖上に、修飾された鎖の５’末端の２０ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、または５ヌクレオチド以内に存在する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ホスホロアミダイトまたはホスホロチオアート修飾等の骨格修飾を含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ヌクレオチドの糖部分の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは二本鎖であり、ドナーＤＮＡ分子の一本鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのホスホロチオアート修飾を含み、さらに、ドナーＤＮＡ分子の一本鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、ドナーＤＮＡは、発現カセット等の関心対象のＤＮＡ配列に隣接する相同アームを含み、相同アームは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの標的部位の両側にある標的ゲノム中の部位に対して相同性を有する。相同アームは、約５０～約２０００ｎｔ長であってよく、例えば、１００～１０００ｎｔ長、または１５０～６５０ｎｔ長、例えば、１５０～３５０ｎｔ長、または１５０～２００ｎｔ長であってよい。種々の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖上に２またはそれを超えるヌクレオチド修飾を有し、逆鎖は末端ホスファートを含む。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ｃａｓタンパク質であり得、非限定的な例として、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはＣａｓＸタンパク質があり得る。本方法の種々の実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび少なくとも１つのＲＮＡガイドは、１または複数のリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として細胞中に導入される。種々の実施形態において、第１のＲＮＰは、ｃａｓタンパク質および第１のガイドＲＮＡにより形成され、第２のＲＮＰは、ｃａｓタンパク質および第２のガイドＲＮＡの別々のインキュベーションで形成される。各ＲＮＰについてのｃａｓタンパク質は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、第１のＲＮＰがｃａｓ９により形成され、そして第２のＲＮＰがｃａｓ１２ａにより形成されてもよい。ｃａｓ９タンパク質を含む１または複数のＲＮＰは、いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含んでもよい。２つのＲＮＰ、および、必要に応じて、ドナーＤＮＡは、多部位遺伝子編集のために細胞に加えられてもよく、編集部位の少なくとも１つが、必要に応じてＤＮＡドナーを組み込む。ＲＮＰは、例えばエレクトロポレーションまたはリポソーム移入が挙げられる実行可能なあらゆる手段によって、標的細胞中に導入することができる。ドナーＤＮＡは、１または複数のＲＮＰと同時に、または別々に、細胞に送達され得る。
本方法を使用して、鳥類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる動物の細胞が挙げられる真核細胞のゲノムを改変することができる。種々の実施形態において、本明細書中で提供される方法およびシステムを使用してゲノムが操作される細胞は、哺乳動物細胞であり、ヒト細胞であってよい。本明細書中で提供される方法に使用される細胞は、細胞株のものであってもよいし、初代細胞、例えば幹細胞または造血細胞（Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる）であってもよい。
本明細書中にさらに含まれるのは、操作された初代Ｔ細胞であり、ヒト初代Ｔ細胞であってもよく、細胞は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの第１の標的部位を含む第１の遺伝子座にてゲノム中に組み込まれた非天然遺伝子構築物、およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの第２の標的部位を含む第２の遺伝子座での変異を含む。第２のゲノム遺伝子座での変異は、例えば、細胞によるｃａｓヌクレアーゼ活性および誤修復の結果として第２の標的部位にて挿入される、挿入または欠失によるノックアウト変異であり得る。第２の標的部位は、発現の低減が所望される遺伝子内にあってもよい。また、非天然遺伝子構築物を含むドナーフラグメントが挿入される第１の標的部位は、発現の低減が所望される遺伝子内にあってもよい。本明細書中で使用される「標的部位」は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列に隣接する配列を意味する。そのようなＰＡＭ隣接配列（例えば１７～２２ヌクレオチド長）は、ｃａｓ９またはｃａｓ１２ａ等のｃａｓヌクレアーゼの活性を誘導して、ゲノムＤＮＡを標的部位にて切断するための、ガイドＲＮＡ中の標的配列として使用することができる。
非天然遺伝子構築物は、本明細書中で提供されるｃａｓ媒介方法を使用して、組み込みのためにドナーフラグメント上に導入されている、細胞内に天然には存在しない遺伝子構築物である。操作された初代Ｔ細胞は、非天然遺伝子構築物を発現することができ、第２の遺伝子座の遺伝子の発現を低減させることができ、そしてまた、第１の遺伝子座の遺伝子の発現を低減させることができ、第１の遺伝子座の遺伝子は、非天然遺伝子構築物の挿入によって破壊され得る。
非天然遺伝子構築物は、１または複数の免疫グロブリンドメインを有する１または複数のポリペプチドをコードする遺伝子構築物であってもよい。いくつかの実施形態において、非天然遺伝子構築物は、ＣＡＲまたはＤＡＲをコードする構築物である。ゆえに、いくつかの実施形態において、ゲノム中に組み込まれたＣＡＲコーディング構築物またはＤＡＲコーディング構築物等の非天然遺伝子構築物を含む初代ヒトＴ細胞が提供され、細胞は、構築物を発現し（例えば、ＣＡＲ分子またはＤＡＲ分子を発現し）、そしてＣＡＲまたはＤＡＲ（または他の）構築物の挿入によって破壊された遺伝子の発現を低減させ得、細胞は、第２の遺伝子の発現の低減をもたらす第２の部位変異を有し得る。遺伝子構築物の挿入によって破壊され得る遺伝子として、ＴＣＲ、ＴＲＡＣ、ＰＤ－１、ＣＴＬ４－Ａ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＣＤ７をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＲまたはＤＡＲは、腫瘍細胞表面抗原、例えば、以下に限定されないが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、または他のあらゆる腫瘍細胞表面抗原に結合するように設計されたＣＡＲまたはＤＡＲであり得る。種々の例において、本明細書中で提供される細胞の集団の少なくとも２５％が、ＣＡＲ、ＤＡＲ、または他の導入された構築物を発現して、第２の遺伝子座での遺伝子の発現の低減を示し得る。種々の例において、本明細書中で提供される細胞集団の少なくとも２５％が、ＣＡＲ、ＤＡＲ、または他の導入された構築物を発現して、非天然構築物が導入された第１の遺伝子座での遺伝子の発現の低減を示し、かつ第２の遺伝子座での遺伝子の発現の低減を示し得る。細胞は、本明細書中で提供される方法を使用して生成され得る。
さらに別の態様において提供されるのは、本明細書で実証されるように、ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物がＣＤ７遺伝子中に挿入されたヒト初代Ｔ細胞である。ＣＤ７遺伝子中にＣＡＲ挿入またはＤＡＲ挿入を有するＴ細胞の集団は、ＣＡＲまたはＤＡＲの発現、およびＣＤ７の発現の低減を実証し得る。
図１Ａは、右側の構造において、プライマー内に存在し得ることでヌクレオチド間の結合のホスホロチオアート（ＰＳ）修飾を示す化学図を示す。左側のオリゴヌクレオチド中に示されるヌクレオチドは、（非修飾）ホスホジエステル結合を介して付着されている。図１Ｂは、最も５’側のヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド中の次のヌクレオチド「下流側」に結合させ、これが次にＰＳ結合によってオリゴヌクレオチドの次の下流のヌクレオチドに付着されている２つのＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドの化学図を示す。オリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。 図２Ａは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、続いてＣＤ８ａリーダーペプチド、続いてＣＤ２８ヒンジ－ＣＤ２８膜貫通細胞内領域、続いてＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする配列を有するオープンリーディングフレームを含むＣＡＲドナーＤＮＡ構築物の図である。コーディング配列の前にＪｅＴプロモータ（配列番号３）があり、構築物は相同アーム（ＨＡ）を含み、この場合、ヒトＴＲＡＣ遺伝子座のマッチング配列は、プロモータ＋コーディング配列に隣接する。ドナーＤＮＡ構築物の構造（上）および右側のノックインを確認するためのプライマー設計（下）を示す。これは、ドナーＤＮＡを生成するのに使用される鋳型ＤＮＡの図を示す。抗ＣＤ３８Ａ２は、標的化された組み込みを可能にするために、発現がＪｅＴプロモータによって駆動され、かつ５’側および３’側に相同アームが隣接するＣＤ３８ ＣＡＲ導入遺伝子を含有する。図２Ｂは、組み込みが、標的化された組み込み部位にある場合に、１３７１ｂｐおよび１５９１ｂｐの産物をそれぞれ生成するための、５’末端および３’末端の双方での、ＣＡＲ内に位置する１つのプライマーおよび相同アームの外側のＴＲＡＣ内の１つのプライマーによる増幅によってＣＡＲ組み込みを確認するのに使用されるＰＣＲプライマーの位置を示す同じ図を示す。 図３Ａは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物、およびＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを含むＲＮＰを含むドナーＤＮＡによる形質転換の８日後のＰＢＭＣのフローサイトメトリープロットを示す。ＣＡＲカセットは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中の組み込み標的部位に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座配列に対して相同性を有する相同アームが隣接していた。Ｙ軸は、細胞サイズを報告する。抗ＣＤ３８構築物の発現は、ｘ軸に沿う。陰性対照：ドナーＤＮＡは、標的細胞中に形質転換されなかった；非修飾ドナーＤＮＡは、化学修飾がなかった；ＰＳ修飾：３つのホスホロチオアート結合が、最も５’側の５つのヌクレオチド骨格位置内に存在した；ＰＳ＋２’－ＯＭｅ：ホスホロチオアート結合に加えて、ドナーの最も５’側の５つのヌクレオチド内の３つのヌクレオチドは、ＰＳ修飾に加えて、２’－ＯＭｅを含んでいた；ＴＣＲ ＫＯ／レトロウイルス構築物：ドナーＤＮＡが不在のＲＮＰで細胞を形質移入してＴＣＲ遺伝子をノックアウトし、そしてレトロウイルスで形質導入して抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現させた。 図３Ｂは、形質移入の１０日後に図３Ａと同じ培養物に対して実行したフローサイトメトリーの結果を示す。 図３Ｃは、形質移入の２０日後に二重修飾されたドナーＤＮＡおよび対照（ＴＲＡＣノックアウトのみ、およびレトロウイルス形質導入によるＴＲＡＣノックアウト）を受けた培養物に対して実行したフローサイトメトリーの結果を示す。 図４は、標的化されたＴＲＡＣ（エクソン１）部位でのドナーＤＮＡの組み込みを示すＰＣＲ産物のゲルを示す。初代ヒトＴ細胞を、ＴＲＡＣ ＲＮＰでのみ、またはｓｓＤＮＡと一緒にエレクトロポレーションした。ＰＣＲを使用して、エレクトロポレーションの２週後にＴＲＡＣ遺伝子座中に組み込まれた抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲ導入遺伝子の存在を確認した（レーン３および６は、５’および３’の組み込み領域由来の産物を示す）。非形質転換ＡＴＣ（レーン１および４）、またはＴＲＡＣエクソン１標的化ＲＮＰで形質転換されたがドナーＤＮＡを受け取らなかったＴ細胞（レーン２および５）では、バンドは観察されなかった。 図５は、細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである（対照としての活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ、星）、ＴＣＲノックアウトＡＴＣ、抗ＣＤ３８Ａ２レトロウイルス形質導入ＣＡＲＴ細胞（ＲＶ ＣＡＲＴ、黒線）、ＴＲＡＣノックアウトレトロウイルス形質導入ＣＡＲＴ細胞（ドット）、ホスホロチオアート修飾されたｓｓドナーＤＮＡノックインと一緒になされたＴＲＡＣノックアウト（ダッシュ）、ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾ｓｓＤＮＡノックインと一緒になされたＴＲＡＣノックアウト（ダッシュおよびドット））。プロットは、ＣＤ３８を発現しないＲＰＥ標識Ｋ５６２細胞に対して観察された細胞毒性を補正した後の、ＧＦＰ標識ＲＰＭＩ８２２６ ＣＤ３８発現細胞に対する細胞毒性パーセントを示す。 図６は、Ｋ５２細胞またはＲＰＭ１８２２６細胞と共培養した、抗ＣＤ３８ ＣＡＲＴ細胞および対照を使用したサイトカイン分泌アッセイの結果のグラフを示す。試験したＴ細胞培養物は、図５に示す通りである。 図７は、異なる長さの相同アーム（ＨＡ）を有するドナーＤＮＡを試験した結果を示す。培養物を、ＴＣＲ（ＣＤ３）発現（Ｙ軸）および抗ＣＤ３８発現（Ｘ軸）の喪失についてフローサイトメトリーによって評価した。 図８は、ドナーＤＮＡ分子の一本鎖の５’末端に近位の３つのＰＳ結合および３つの２’－Ｏ－メチルヌクレオチドの付加によって修飾された二本鎖ドナーＤＮＡを試験した結果を示す。培養物を、ＴＣＲ発現（Ｙ軸）および抗ＣＤ３８発現（Ｘ軸）の喪失についてフローサイトメトリーによって評価した。 図９は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ドナーを、ＲＮＰによる共形質移入によってＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１０は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ドナーを、ＲＮＰによる共形質移入によってＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１１は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ドナーを、ＲＮＰによる共形質移入によってＴＲＡＣエクソン３遺伝子座に向けた。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１２は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ある培養物では、ＴＲＡＣエクソン３に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン３ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座に向けた（２番目のパネル）。別の培養物では、ＴＲＡＣエクソン１に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン１ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた（２番目のパネル）。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１３は、抗Ｃ３８ ＣＡＲおよびＴＲＡＣ遺伝子またはＰＤ－１遺伝子に由来する相同アームを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ある培養物では、ＴＲＡＣエクソン１に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン１ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた（３番目のパネル）。別の培養物において、ドナーは、ＰＤ－１遺伝子座に由来する相同アームを有し、ＰＤ－１遺伝子ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によってＰＤ－１遺伝子に向けられた（４番目のパネル）。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ３８発現またはＰＤ－１発現をＹ軸上で判定する。 図１４は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物、およびＰＤ－１遺伝子由来の標的配列を有するガイドＲＮＡを含むＲＮＰによってＰＤ－１遺伝子に標的化されるＰＤ－１遺伝子由来相同アームを含む二重修飾された（ＰＳおよび２’－ＯＭｅ）ドナーフラグメントで形質移入されたＴ細胞培養物を使用した細胞毒性アッセイの結果を示す。 図１５は、Ｃａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ（パネル４）またはＣａｓ１２ａ ＲＮＰ（パネル５）と共に抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を含むドナーＤＮＡで形質移入した細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。Ｔ細胞受容体発現をＹ軸に、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の発現をＹ軸に示す。パネル２および３は、ドナーフラグメントが不在の、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２ａタンパク質をそれぞれ含むＲＮＰでＴ細胞を形質移入した結果を示す。 図１６は、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物、およびＣａｓ９ ＲＮＰまたはＣａｓ１２ａ ＲＮＰのいずれかで形質移入したＴ細胞を使用した細胞毒性アッセイの結果のグラフを示す。 図１７は、非改変活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）（左側のパネル）、Ｔｉｍ３遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞（中央のパネル）、または抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を含むドナーＤＮＡと共にＴｉｍ３遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞（右側のパネル）のフローサイトメトリーの結果を示す。 図１８は、Ｃａｓ９ ＲＮＰによるＴＲＡＣ遺伝子座中への抗ＣＤ３８ ＣＡＲの挿入中に生成されたオフターゲット変異のゲノム位置および割合を示す表である。 図１９は、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞、ならびにＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。また、示されるのは、パネルＥおよびＨにおいて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。 図２０Ａは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするがドナーＤＮＡがないＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータを示し、図２０Ｂは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよび抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータを示す。 図２１は、エフェクタ：標的細胞比の関数としての、抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物および抗ＣＥＡ ＤＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞の細胞毒性パーセントのグラフである。アッセイにおける標的細胞はＤａｕｄｉ細胞であった。 図２２は、抗原刺激後に、抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞によって分泌されたＡ）インターフェロンガンマおよびＢ）ＧＭＣＳＦの量を示す棒グラフである。Ｔ細胞をＫ５６２細胞またはＤａｕｄｉ細胞で刺激した。Ｄａｕｄｉ細胞刺激のみが、バーによって示されるように、有意な応答をもたらした。刺激されていない細胞からのサイトカイン放出は検出されなかった。 図２３は、操作されたＴ細胞によるＴ細胞受容体（ＣＤ３）および抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物の発現を評価したフローサイトメトリーの結果を示す：Ａ）ドナーフラグメントなしで、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ３（ＴＣＲ）発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；Ｂ）ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物を含むドナーフラグメントで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ３（ＴＣＲ）発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；Ｃ）ドナーフラグメントなしで、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ７発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；Ｄ）ＣＤ７遺伝子座を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物を含むドナーフラグメントで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ７発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した。 図２４は、ＣＤ７遺伝子座を標的とする抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞；およびＴＲＡＣ遺伝子座にてノックアウトされたＴ細胞を使用した細胞毒性アッセイの結果を示す。Ｘ軸は、アッセイにおけるエフェクタ対標的細胞比を示す。 図２５は、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞、およびＣＤ７遺伝子座を標的とする抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞によるＩＦＮγ分泌の棒グラフを示す。
定義
特に明記しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。加えて、本明細書中に記載される方法または材料と類似の、または等しいあらゆる方法または材料を、本開示の実施に使用することができる。本明細書中で引用される全ての刊行物は、それらの全体が参照によって組み込まれる。
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」という用語は、１つの要素を有する態様を含むのみならず、１より多い要素を有する態様も含む。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の指示をしなければ、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ」という言及は、複数のこのような細胞を含み、「ｔｈｅ ａｇｅｎｔ」という言及は、当業者に公知の１またはそれを超える作用部室への言及を含むなどである。
参照数値に関する用語「約」は、その値からプラスまたはマイナス１０％の範囲の値を含み得る。例えば、量「約１０」は、参照数値９、１０、および１１を含む９から１１の量を含む。また、参照数値に関する用語「約」は、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲の値も含み得る。
「初代細胞」という用語は、多細胞生物から直接単離された細胞を指す。初代細胞は、典型的には、極めて少ない集団倍加を経験しており、したがって、連続的な（腫瘍または人工的に不死化された）細胞株と比較して、初代細胞が由来する組織の主要な機能的成分をより多く表現する。いくつかの事例では、初代細胞は、単離された後に直ちに使用された細胞である。他の事例では、初代細胞は無限に分裂することができず、したがってインビトロで長期間培養することができない。
「ゲノム編集」という用語は、１またはそれを超えるヌクレアーゼを使用して、標的ＤＮＡ、例えば細胞のゲノムにＤＮＡが挿入され、置換され、または標的ＤＮＡ、例えば細胞のゲノムから除去される遺伝子工学の一種を指す。ヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置に特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を作出し、相同組換え修復（ＨＤＲ）（例えば、相同組換え）によってまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、誘導された切断を修復するために細胞の内因性機構を利用する。標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するために、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、これらの変異形、これらの断片、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の適切なヌクレアーゼを細胞中に導入することができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）による正確なゲノム編集の効率を向上させるために、標的ＤＮＡ配列のヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ ｍＲＮＡ）と組み合わせて本明細書に記載の修飾されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して「誘導」または「調節」（例えば、強化）することができる。
「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」という用語は、修復を誘導するために相同な鋳型を使用して二本鎖ＤＮＡ切断を正確かつ精密に修復する細胞内の機構を指す。ＨＤＲの最も一般的な形態は、２つの類似のまたは同一のＤＮＡの分子間でヌクレオチド配列が交換される遺伝的組換えの一種である、相同組換え（ＨＲ）である。
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、相同な鋳型を必要とせずに切断末端が直接連結される二本鎖ＤＮＡ切断を修復する経路を指す。
「核酸」、「ヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖、二本鎖または多重鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびこれらのポリマーを指す。本用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドまたはプリンおよび／もしくはピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、合成のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらの類似体の混合物を含むことができる。本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、および天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸も包含する。特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異形（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１またはそれを超える選択された（または全ての）コドンの三番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８，１９８５；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１－９８，（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
核酸分子の長さに言及する場合、用語ヌクレオチドおよび塩基対は、互換的に使用され得る。
「ヌクレオチド類似体」または「修飾されたヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））の中もしくは上に、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾されたリボース、修飾されたデオキシリボース、６員の糖類似体、または鎖式の糖類似体）の中もしくは上に、またはホスファートに１またはそれを超える化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。
「遺伝子」または「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡセグメントは、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の制御に関与する、コード領域に先行するおよび後続する領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために互換的に使用される。これらの用語は、１またはそれを超えるアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
「変異形」という用語は、自然に存在するものから逸脱する、生物、株（ｓｔｒａｉｎ）、遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは特徴の形態を指す。
「相補性」という用語は、伝統的なワトソン－クリックまたはその他の非伝統的な型のいずれかによって別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の残基の百分率を示す（例えば、１０個のうち５個、６個、７個、８個、９個、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれを超えるヌクレオチドの領域にわたる、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する２つの核酸を指す。
ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」という用語は、標的配列に対して相補性を有する核酸が、その条件下で、主に標的配列とハイブリッド形成し、非標的配列とは実質的にハイブリッド形成しない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に配列依存性であり、多くの要因に応じて変化する。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリッド形成する温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ １，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。
「ハイブリダイゼーション」という用語は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を表す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３またはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。
「組換え発現ベクター」は、宿主細胞中での特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定された核酸エレメントを有する、組換え的にまたは合成的に作製された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスゲノムまたは核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された転写されるべきポリヌクレオチドを含む。
「機能的に連結された」とは、コード配列の転写を指示するプロモーターなどの、エレメントの適切な生物学的機能を可能にする相対位置で配置された、ポリヌクレオチドコード配列とプロモーターなどの２またはそれを超える遺伝的エレメントを意味する。
用語「非天然」は、細胞に対して内因性でないこと、すなわち、構築物が、細胞内に天然に存在せず、当該細胞にとって非天然であることを意味する。
「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指示する核酸制御配列の整列を指す。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位付近に必要な核酸配列、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対の場所に位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも必要に応じて含む。発現ベクター中に存在し得る他のエレメントとしては、転写を増強するもの（例えば、エンハンサー）および転写を終結するもの（例えば、ターミネータ）、ならびに発現ベクターから産生された組換えタンパク質に一定の結合親和性または抗原性を付与するものが挙げられる。
「組換え」とは、遺伝的に改変されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、組織または生物を指す。例えば、組換えポリヌクレオチド（または組換えポリヌクレオチドの複製もしくは相補体）は、周知の方法を用いて操作されたものである。第２のポリヌクレオチド（例えば、コード配列）に機能的に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅｓ １－３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４－１９９８）に記載されている方法による）ヒト操作の結果として、第２のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含むことができる。組換え発現カセット（または発現ベクター）は、典型的には、天然には見出されない組み合わせでポリヌクレオチドを含む。例えば、ヒト操作された制限部位またはプラスミドベクター配列は、プロモーターに隣接し、または他の配列からプロモーターを隔てることができる。組換えタンパク質は、組換えポリヌクレオチドから発現されるものであり、組換え細胞、組織および生物は、組換え配列（ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）を含むものである。
「一塩基多型」または「ＳＮＰ」という用語は、対立遺伝子内を含むポリヌクレオチドでの単一ヌクレオチドの変化を指す。これには、１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置換、および単一ヌクレオチドの欠失または挿入が含まれ得る。最も典型的には、ＳＮＰは二対立遺伝子のマーカーであるが、三対立遺伝子のマーカーおよび四対立遺伝子のマーカーも存在し得る。非限定的な例として、ＳＮＰ Ａ＼Ｃを含む核酸分子は、多型位置にＣまたはＡを含み得る。
「培養する」、「培養している」、「増殖する」、「増殖する」、「維持する」、「維持している」、「拡大する」、「拡大している」などの用語は、細胞培養自体または培養の過程を指す場合には、細胞（例えば、初代細胞）が、制御された条件下で、例えば生存に適した条件下でその通常の環境の外において維持されることを意味するために互換的に使用され得る。培養された細胞は生存を可能にされ、培養は、細胞増殖、静止、分化または分裂をもたらし得る。一部の細胞が自然に死滅または老化する可能性があるため、この用語は、培養物中の全ての細胞が生存、増殖または分裂することを意味しない。細胞は、典型的には培地中で培養され、培地は培養の過程で交換することができる。
「対象」、「患者」および「個体」という用語は、本明細書では、ヒトまたは動物を含むように互換的に使用される。例えば、動物対象は、哺乳動物、霊長類（例えば、サル）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ）、愛玩（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、鳥）、獣医学的に重要な動物、または経済的に重要な動物であり得る。
「投与する」という用語は、対象への経口投与、局所接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、髄腔内、鼻腔内または皮下投与を含む。投与は、非経口および経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸または経皮）を含む任意の経路によるものである。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内および頭蓋内が含まれる。他の送達様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これらに限定されない。
「処置する」という用語は、治療的利益および／または予防的利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、処置中の１またはそれを超える疾患、症状または症候に対する任意の治療上適切な改善または効果を意味する。予防的利益のために、組成物は、特定の疾患、症状もしくは症候を発症するリスクがある対象、または疾患、症状もしくは症候が未だ顕在化していないかもしれないが、疾患の生理学的症候の１またはそれより多くを報告する対象に投与され得る。
「有効量」または「十分な量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、修飾されたシングルガイドＲＮＡなど）の量を指す。治療有効量は、処置されている対象および疾患症状、対象の体重および年齢、疾患症状の重症度、投与の様式などの１またはそれより多くに応じて変動し得、当業者によって容易に決定され得る。具体的な量は、選択される特定の作用物質、標的細胞の種類、対象における標的細胞の位置、従うべき投薬レジメン、他の作用物質と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、およびそれが運搬される物理的送達系の１またはそれより多くに応じて異なり得る。
「薬学的に許容され得る担体」という用語は、細胞、生物または対象への作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、修飾されたシングルガイドＲＮＡなど）の投与を補助する物質を指す。「薬学的に許容され得る担体」は、組成物または製剤中に含めることができ、患者に対して著しい有害な毒性作用を引き起こさない担体または賦形剤を指す。薬学的に許容され得る担体の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、通常の生理食塩水溶液、乳酸リンゲル液、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、香料および着色料などが挙げられる。当業者は、他の薬学的担体が本発明において有用であることを認識するであろう。
ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関する「安定性を増大させる」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の構造を安定化する修飾を指す。この用語は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の分解を減少させ、阻害し、減弱させ、または低下させる修飾を含む。
ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関する「特異性を増加させる」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の特異的な活性（例えば、オンターゲット活性）を増加させる修飾を指す。この用語は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の非特異的な活性（例えば、オフターゲット活性）を減少させ、阻害し、減弱させ、または低下させる修飾を含む。
ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関する「毒性を減少させる」という用語は、細胞、生物、対象などに対するＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の毒性効果を減少させ、阻害し、減弱させ、または低下させる修飾を指す。
ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関する、および遺伝子制御の文脈における「増強された活性」という用語は、ゲノム編集および／または遺伝子発現を誘導する、調整する、制御する、または調節する効率および／または頻度の増加または改善を指す。
本明細書中の方法および組成物は、発現が所望される遺伝子の効率的なノックアウトおよび同時ノックインのためにＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステムを使用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは現在、標的化された遺伝的変更（ゲノム改変）を誘導するのに広く使用されている。Ｃａｓ９等のｃａｓタンパク質による標的認識は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内の「種子」配列、および標的ＤＮＡ、例えば宿主細胞ゲノム内のｇＲＮＡ結合領域の上流のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有する保存されたマルチヌクレオチドを必要とする（本明細書で使用される「標的配列」は、ゲノム中のＰＡＭに隣接し、かつ（Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて）ＰＡＭの直ぐ上流にある配列である。標的配列（または実質的に同じ配列）は、ガイドＲＮＡ中に操作され、そして当該技術において時折、ガイドＲＮＡの「ガイド配列」と呼ばれる。本開示の目的のために、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：２２８１－２３０８に従って、ガイドＲＮＡの「標的配列」（またはガイド配列）は、ゲノム中の標的配列の逆鎖とハイブリダイズする）。
Ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼシステムは、永続的遺伝子破壊を誘導し、これは、ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを利用してＤＮＡ二本鎖切断を導入し、これがエラープローン修復経路をトリガーしてフレームシフト変異をもたらす。ゲノムを改変するのに使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの例が、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号明細書、米国特許第１０，０００，７７２号明細書、米国特許第９，７９０，４９０号明細書、および米国特許出願公開第２０１８／０３４６９２７号明細書（これらは全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、ＣａｓＸ、または他のＣａｓエンドヌクレアーゼを使用することもでき、以下に限定されないが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られている）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｔ７、Ｆｏｋ１、当該技術において知られている他のヌクレアーゼ、それらのホモログ、またはそれらの修飾バージョンが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子破壊は、標的遺伝子に特異的なｇＲＮＡ配列、およびＣａｓエンドヌクレアーゼが、複合体として、または複合体を形成して、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的遺伝子座にて二本鎖切断を導入することを可能にするように、細胞中に導入された場合に起こる。いくつかの例において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列および標的遺伝子に特異的なガイド核酸配列を含む、１または複数の複数の発現ベクターを含む。ガイド核酸配列は、（遺伝子中の標的配列に対する相同性によって）関心対象の遺伝子に特異的であるように設計されており、そして当該遺伝子を、ｃａｓエンドヌクレアーゼ誘導二本鎖切断のために標的とする。ゆえに、典型的にはＲＮＡ分子であり、かつ修飾されたＲＮＡ分子であってよいガイド核酸分子は、標的化された遺伝子（標的部位または標的配列）の遺伝子座内で見出されるガイド核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイド核酸配列は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、またはそれを超えるヌクレオチド長である。いくつかの例において、２つのガイドＲＮＡが、ｃａｓタンパク質、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡ、ならびにｃｒＲＮＡおよびｃａｓタンパク質と複合体形成するｔｒａｃｒＲＮＡと共に使用される。いくつかの例において、例えばＣａｓ９の場合に、キメラガイドであってもよいシングルガイドＲＮＡを使用してもよい。一部のｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ１２ａは、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用しない、すなわち、本来、シングルガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）しか使用しない。
種々の実施形態において、ｃａｓタンパク質は、細胞内で、導入された遺伝子またはＲＮＡ分子から発現され得る。また、ｃａｓタンパク質は、必要に応じて、１または複数のガイドＲＮＡと共に導入されてもよいし、ｃａｓタンパク質は、シングルガイドＲＮＡまたは２つの複合体形成されたガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）とのリボ核タンパク質複合体として導入されてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、標的細胞中に形質移入された遺伝子から発現されるか、または１もしくはそれを超えるガイドＲＮＡが、ＲＮＡ分子として細胞中に導入されてもよい。２またはそれを超える異なるガイドＲＮＡの遺伝子を、標的細胞中に、同じであるか、または異なるベクターで導入することができる。２またはそれを超えるガイドＲＮＡは、異なるガイド配列を有する（例えば、異なる遺伝子座を標的とする）ガイドＲＮＡであってもよい。本明細書中で提供される方法の種々の実施形態において、ガイドＲＮＡは、キメラガイド（ｓｇＲＮＡ）であっても、ｃｒＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、宿主細胞中に導入される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、そしてｓｇＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）、ｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ、またはｓｇＲＮＡをコードする構築物が細胞中に導入される。これ以外にも、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする構築物）が、Ｃａｓ９媒介ゲノム改変のために細胞またはＲＮＰ中に提供されてもよい。更なる実施形態、例えば、エンドヌクレアーゼとしてｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないＣａｓ１２ａを使用する実施形態において、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする構築物が、ｔｒａｃｒＲＮＡなしで導入されてもよい。ｃａｓエンドヌクレアーゼ用のガイドＲＮＡが、米国特許出願公開第２０１８／０６６２４２号明細書（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）において、そして米国特許第８，６９７，３５９号明細書、米国特許第１０，０００，７７２号明細書、米国特許第９，７９０，４９０号明細書、および米国特許出願公開第２０１８／０３４６９２７号明細書（これらは全て、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において広く論じられている。
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等のエラープローン修復経路を介して起こる変異の生成におけるそれらの使用に加えて、ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはＣａｓＸを使用して、関心対象のＤＮＡ配列を、標的化された遺伝子座に挿入することができ、そこでは、ｃａｓタンパク質および１または複数のガイドＲＮＡ、あるいはｃａｓタンパク質および／または１もしくはそれを超えるガイドＲＮＡを発現するための構築物に加えて、標的細胞はまた、相同組換え修復を介したｃａｓエンドヌクレアーゼの活性に従って、遺伝子座への挿入用のドナーＤＮＡ分子で形質移入される。種々の実施形態において、標的部位中への挿入用のＤＮＡ分子は、関心対象のＤＮＡ配列、例えば発現構築物、例えばＤＡＲ構築物を含み、宿主ゲノム中の標的部位の両側のゲノム配列に対して相同性がある配列が隣接している。そのような相同アーム（ＨＡ）は、例えば、約５０ｂｐ長～約２５００ｂｐ長、または約１００ｂｐ～約２０００ｂｐ長、または約１５０ｂｐ～約１５００ｂｐ長であり得る。本発明の組成物、方法、および細胞に使用される、本明細書中で提供されるドナーＤＮＡ分子は、例えば、約２５０ｂｐ長未満、約２００ｂｐ長未満、約１９０ｂｐ長未満、約１８０ｂｐ長未満、約１６０ｂｐ長未満、または約１５０ｂｐ長未満、例えば、約５０ｂｐ～約１５００ｂｐ長、約５０ｂｐ～約１０００ｂｐ長、約５０ｂｐ～約８００ｂｐ長、約５０ｂｐ～約６００ｂｐ長、約５０ｂｐ～約３５０ｂｐ長、約５０ｂｐ～約１８０ｂｐ長、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ長、約１４０ｂｐ～約８００ｂｐ長、約１４０ｂｐ～約６００ｂｐ長、約１００ｂｐ～約３５０ｂｐ長、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ長、約１４０ｂｐ～約８００ｂｐ長、約１４０ｂｐ～約６００ｂｐ長、約１４０ｂｐ～約３５０ｂｐ長、または約１４０ｂｐ～約２００ｂｐ長であるＨＡを有してよい。
ドナーＤＮＡは、例えば、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２２５ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１１００ヌクレオチド、少なくとも１２００ヌクレオチド、少なくとも１３００ヌクレオチド、少なくとも１４００ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１６００ヌクレオチド、少なくとも１７００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも１９００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド、少なくとも２４００ヌクレオチド、少なくとも２５００ヌクレオチド、少なくとも２６００ヌクレオチド、少なくとも２８００ヌクレオチド、少なくとも３０００ヌクレオチド、少なくとも３２００ヌクレオチド、少なくとも３４００ヌクレオチド、少なくとも３５００ヌクレオチド、少なくとも３６００ヌクレオチド、少なくとも３８００ヌクレオチド、少なくとも４０００ヌクレオチド、少なくとも４２００ヌクレオチド、少なくとも４４００ヌクレオチド、少なくとも４５００ヌクレオチド、少なくとも４６００ヌクレオチド、少なくとも４８００ヌクレオチド、少なくとも５０００ヌクレオチド、少なくとも５２００ヌクレオチド、少なくとも５４００ヌクレオチド、少なくとも５５００ヌクレオチド、少なくとも５６００ヌクレオチド、少なくとも５８００ヌクレオチド、少なくとも６０００ヌクレオチド、少なくとも６２００ヌクレオチド、少なくとも６４００ヌクレオチド、少なくとも６５００ヌクレオチド、少なくとも６６００ヌクレオチド、少なくとも６８００ヌクレオチド、少なくとも７０００ヌクレオチド、少なくとも７５００ヌクレオチド、少なくとも８０００ヌクレオチド、少なくとも８５００ヌクレオチド、少なくとも９０００ヌクレオチド、少なくとも９５００ヌクレオチド、または少なくとも１０，０００ヌクレオチドであり得る。ドナーフラグメントが二本鎖もしくは実質的に二本鎖である場合には、対応する数の塩基対（ｂｐ）長である。
本明細書中で開示される組成物、方法、およびシステムにおいて用意されるドナーＤＮＡは、一本鎖、二本鎖、または実質的に二本鎖であってよい。ドナーＤＮＡは、一本鎖または二本鎖（実質的に二本鎖の分子を含む）であり得、実質的に二本鎖のドナーＤＮＡは、逆鎖と塩基対形成されない、フラグメントの末端にて、または内部に存在し得る短い（例えば、１０もしくはそれ未満、８もしくはそれ未満、６もしくはそれ未満、または３もしくはそれ未満）ヌクレオチドのストレッチを除いた二本鎖であり得、そのような短いストレッチは、フラグメントのヌクレオチド長の５０％未満、３０％未満、１０％未満、または５％未満である。
ドナーＤＮＡ分子は、塩基部分、糖部分、またはホスホジエステル骨格にて修飾されていてもよい。典型的には相同アームが隣接している、ゲノムの標的遺伝子座中に挿入されることとなる構築物を含む鋳型のＰＣＲ増幅によって、修飾を首尾良く導入することができる。ドナー鋳型のＰＣＲ増幅は、ドナーＤＮＡ分子を生成し、増幅は、所望の修飾を有するプライマーを使用し、これはその後、ドナーＤＮＡ産物中に組み込まれる。
核酸修飾として：２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド、２’フルオロ修飾されたヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾されたヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾されたヌクレオチド、ホスホロチオアート結合を有するヌクレオチド、および５’キャップ（例えば、７－メチルグアニラートキャップ（ｍ７Ｇ））が挙げられ得るが、これらに限定されない。核酸修飾の例として、デオキシチミジンの代わりのデオキシウリジン置換、デオキシシチジンの代わりの５－メチル－２’－デオキシシチジン置換または５－ブロモ－２’－デオキシシチジン置換が挙げられ得る。糖部分の修飾として、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－アリル糖を形成するようなリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾が挙げられ得る。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについて、リン酸基が、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結されていてもよい。
ヌクレオチドは、核酸分子の「ヌクレオシド間骨格」を形成するようにヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。天然に存在するＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子は、３’～５’ホスホジエステル結合を、骨格の全体にわたって有する。デオキシリボースリン酸骨格は、モルホリノ核酸を生成するように修飾されていてもよく、各塩基部分は、６員のモルホリノ環またはペプチド核酸に連結されており、デオキシリン酸骨格は、擬似ペプチド骨格によって置き換えられており、かつ４つの塩基が保持されている。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：１８７－１９５およびＨｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈａｉｎ．４：５－２３参照。また、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオアート骨格またはホスホロジチオアート骨格、ホスホロアミダイト骨格またはアルキルホスホトリエステル骨格で置き換えられていてもよい。ホスホロチオアート（ＰＳ）結合（ｂｏｎｄ）（すなわち、ホスホロチオアート結合（ｌｉｎｋａｇｅ））は、核酸のリン酸骨格中で、硫黄原子を非架橋酸素と置換する。この修飾は、ヌクレオチド間結合を、ヌクレアーゼ分解に対して耐性にする。
修飾には、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含有する核酸が含まれる。修飾された骨格を有する核酸として、骨格中にリン原子を保持する核酸および骨格中にリン原子を有していない核酸が挙げられる。リン原子を含有する修飾されたオリゴヌクレオチド骨格の例として、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート（３’－アルキレンホスホナート、５’－アルキレンホスホナート、およびキラルホスホナートが挙げられる）、ホスフィナート、ホスホルアミダート（３’－アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートが挙げられる）、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’－５’結合を有するセレノホスファートおよびボラノホスファート、これらの２’－５’結合類似体、ならびに１または複数のヌクレオチド間結合が３’－３’、５’－５’、または２’－２’結合である逆極性を有するものが挙げられる。逆極性を有する核酸は、最も３’側のヌクレオチド間結合にて単一の３’－３’結合、すなわち、塩基性であり得る単一の逆向きヌクレオシド残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）を含む（核酸塩基は欠損しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）。
いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、１または複数のホスホロチオアート結合および／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合を含む。ＭＭＩ型ヌクレオシド間結合が、米国特許第５，４８９，６７７号明細書に開示されており、その特許の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。適切なアミドヌクレオシド間結合が、米国特許第５，６０２，２４０号明細書に開示されており、その特許の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
リン原子を含まない付加的な修飾されたポリヌクレオチド骨格が、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子、およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１もしくはそれを超える短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとして、（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）モルホリノ結合を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成部分が混合されているその他のものが挙げられる。例えば米国特許第５，０３４，５０６号明細書に記載されているようなモルホリノ骨格構造。例えば、いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、デオキシリボース環の代わりに６員モルホリノ環を有する１または複数のヌクレオチドを含んでもよい。これらの実施形態のいくつかにおいて、ホスホロジアミダートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル結合を置き換えている。
２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド（図１Ｂ参照）は、ｔＲＮＡおよび他の小さなＲＮＡ中に見出される、転写後修飾として生じるＲＮＡの天然に存在する修飾である。２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを直接合成することができる。２’フルオロ修飾されたヌクレオチド（例えば２’フルオロ塩基）は、結合親和性（Ｔｍ）を増大させ、かつある程度の相対的ヌクレアーゼ耐性も付与し得るフッ素修飾された糖を有する。
いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドである１または複数のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、２’フルオロ修飾されたヌクレオチドである１または複数のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、１または複数のＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、ｐＰＮＡヌクレオチド、またはｐＨｙｐＰＮＡヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ホスホロチオアート結合によって連結されている１または複数のヌクレオチドを有する（すなわち、ドナーＤＮＡは、１または複数のホスホロチオアート結合を有する）。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、修飾されたヌクレオチドの組合せを有する。例えば、ドナーＤＮＡは、他の修飾（例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよび／または２’フルオロ修飾されたヌクレオチドおよび／またはＬＮＡ塩基）を有する１または複数のヌクレオチドを有することに加えて、１、２、３、またはそれを超えるホスホロチオアート結合を有してもよい。当該修飾は、好ましくは、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖上にのみ、最も有利には、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖の５’末端に、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端の２０ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、または５ヌクレオチド以内に存在する。
ドナーＤＮＡの導入は、ＤＮＡを宿主細胞中に導入するあらゆる手段、例えば、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、またはリポフェクションによってよい。例示的な実施形態において、ドナーＤＮＡは、ウイルス形質導入を介して導入されない。例えば、ドナーは、選択された挿入遺伝子座を標的とするｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む１または複数のＲＮＰと共に、エレクトロポレーションされるか、または他の手段によって細胞中に形質移入される合成ＤＮＡ分子として提供され得る。標的化された挿入遺伝子座は、必要に応じて、発現構築物の挿入が遺伝子の発現を同時に消失させるような破壊（「ノックアウト」）が所望される遺伝子であってもよい。ドナーＤＮＡは、宿主ゲノムと標的部位にて相同な配列を含んでおり、ｃａｓヌクレアーゼによる標的部位の切断後にＨＤＲを促進し得る。これ以外にも、ｃａｓヌクレアーゼおよび／もしくはガイドＲＮＡ、またはｃａｓヌクレアーゼおよび／もしくはガイドＲＮＡを発現するための構築物が細胞中に導入される前または後に、ドナーＤＮＡが細胞中に導入されてもよい。
高効率の標的化された遺伝子組み込みアプローチを実現する方法を、本明細書中で提供する。当該方法は、あらゆる細胞型のゲノム操作に使用することができ、例えば、操作された細胞を患者に導入する用途に使用することができる。
第１の部位での内因性遺伝子の破壊を伴う、第１の部位での高効率の標的化された遺伝子組み込み、および第２の部位での遺伝子の同時ノックアウトを実現する方法を、本明細書中で提供する。例えば、ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物を、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座中に挿入することによって、ＴＲＡＣ遺伝子またはＴＲＢＣ遺伝子を不活化すると同時に、チェックポイント阻害剤または免疫調節因子遺伝子、例えば、非限定的な例として、ＧＭ－ＣＳＦ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＣＤ１、ＬＡＧ３等をコードする遺伝子をノックアウトすることができる。第２の遺伝子座の同時ノックアウトを伴う第１の遺伝子座でのノックアウト／ノックインの方法は：第１の遺伝子座を標的とする第１のガイドＲＮＡと複合体形成された第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む第１のＲＮＰ、第２の遺伝子座を標的とする第２のガイドＲＮＡと複合体形成された第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む第２のＲＮＰ、および本明細書中で開示されるように修飾され、かつ第１の遺伝子座のゲノム配列に対して相同性がある相同アームを有するドナーＤＮＡを、細胞中に導入することを含む。第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは双方ともｃａｓ９ヌクレアーゼである。他の例において、第１および第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは双方ともｃａｓ１２ａヌクレアーゼである。更なる例において、第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはｃａｓ９であり、第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはｃａｓ１２ａである。更なる例において、第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはｃａｓ１２ａであり、第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはｃａｓ９である。当該方法は、ドナーＤＮＡが第１の遺伝子座中に挿入され、そして第２の遺伝子座の遺伝子が破壊される細胞の改変をもたらす。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、癌を処置する構築物、例えば、例えばＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＢＣＭＡなどのいずれかに対するＣＡＲをＴ細胞中に設置するために使用することができる。遺伝子導入の効率は４０～８０％に達することができる。標的化された遺伝子組み込みを使用するこのアプローチは、自己および同種異系アプローチの両方に使用することができ、重要なことに、操作された細胞が患者内に導入されたときに二次的なおよび望ましくない細胞形質転換のリスクを伴わず、したがって現在の慣用的アプローチよりも安全である。さらなる利点としては、改変されたガイド鎖、信頼できる遺伝子組み込み、巨大な遺伝子の組み込み、ＣＡＲの遺伝子組み込み、および高発現でのＣＡＲの遺伝子組み込みが挙げられる。
実施例は、ＰＣＲによって合成されたホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾された一本鎖または二本鎖ドナーＤＮＡを使用するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集を介したＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を開示する。好ましくは、修飾された一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡは、１つのプライマーの５’末端の１０ヌクレオチドまたは５ヌクレオチド以内のヌクレオチドに３つのＰＳ結合を付加することによって作製される。本発明をいずれかの特定の機構に限定するものではないが、ＰＳ修飾は、ドナーＤＮＡの修飾された鎖のエキソヌクレアーゼ分解を阻害すると考えられる。プライマーの５’末端の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内のヌクレオチドも、ホスホロチオアート結合によって引き起こされる非特異的結合を回避するために２’－Ｏ－メチルで修飾した。ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾されたｄｓドナーＤＮＡおよびｓｓドナーＤＮＡは、ＰＣＲ、非対称ＰＣＲまたは逆転写によって作製することができる。あるいは、合成の最終ｄｓ ＤＮＡ産物をホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチルで修飾することができ、ｄｓＤＮＡは１つの鎖のみに対する修飾によって生成することができる。
ＣＡＲ構築物を含む、すなわち、宿主細胞の所定のゲノム部位中にＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を挿入するために設計された、ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチルなどの化学修飾を有するドナーＤＮＡ構築物などのドナーＤＮＡ構築物がさらに開示される。さらに、本開示は、安全性の懸念を呈し得るウイルスベクターを欠くＣＡＲで形質移入された宿主細胞を提供する。
１つの鎖上に修飾を有するドナーＤＮＡを使用するこの方法は、ノックイン効率を少なくとも２倍増加させることができ、これはウイルスベクター法と同等であり、従来のレトロウイルスまたはレンチウイルスアプローチと比較して、組み込みの部位特異性およびＴ細胞中でのＣＡＲ発現に関して非常に安定であるという利点を有する。ホスホロチオアートおよび／または２’－Ｏ－メチルによる１つのドナー鎖の少なくとも二重の修飾は、ノックイン効率を増加させることができる。この１段階ノックアウト／ノックイン法は、複数の癌治療のためのより迅速でより安価なＣＡＲ－Ｔ作製方法を提供する。二本鎖ＤＮＡを使用できること、ならびにドナー構築物のヌクレアーゼ処理および手間がかかり収率を低下させる一本鎖の回収を回避できることは、この方法の別の利点である。
本出願において、本発明者らは、ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する修飾されたｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡドナーによる長いｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ（例えば、約３ｋｂの抗ＣＤ３８ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲ）をノックインするための簡単で頑強な方法を提示する。本発明者らは、修飾された長いｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ配列が、初代Ｔ細胞中へのＣＡＲの組み込みのための極めて効率的なＨＤＲ鋳型であることを示す。さらに、本発明者らは、この方法が、従来のレトロウイルスまたはレンチウイルスアプローチと比較して、組み込みの部位特異性およびＴ細胞中でのＣＡＲ発現に関して極めて安定的という利点を有することを実証する。
本開示は、ＣＡＲ遺伝子を初代細胞内で発現させる方法であって、初代細胞中に：
（ａ）選択されたノックアウト核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ｓｇＲＮＡ配列の１または複数のヌクレオチドは、必要に応じて修飾されたヌクレオチドである、ｓｇＲＮＡと；
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／もしくはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、または修飾されたｓｇＲＮＡがノックアウト核酸の部位に誘導するＣａｓポリペプチドと；
（ｃ）５’ＨＡ配列、プロモータ配列、ＣＡＲ構築物、および３’ＨＡ配列を含むドナー標的ＤＮＡであって、好ましくは二本鎖であり、双方の鎖または好ましくは一方の鎖が、５’エキソヌクレアーゼ切断を低減するために、ドナーの５’末端の５ヌクレオチド以内で少なくとも１つのホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）結合で修飾されており、そして必要に応じて、５’末端の５ヌクレオチド以内に１、２、３、または４つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを含むドナー標的ＤＮＡと
を導入することを含む方法を提供する。好ましくは、修飾された鎖の逆鎖は５’末端ホスファートを有する。プロモータは、例えばＴ細胞であり得る初代細胞において、作動可能である。
本開示は、ＣＡＲ遺伝子の遺伝子発現を初代細胞内で誘導する方法であって、初代細胞中に：
（ａ）選択された標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡであって、ガイドＲＮＡ中の１または複数のヌクレオチドが、必要に応じて修飾されているヌクレオチドである、ｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡと；
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／もしくはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、またはｃｒＲＮＡがノックアウト核酸の部位に誘導するＣａｓポリペプチドと；（ｃ）５’ＨＡ配列、プロモータ配列、ＣＡＲ構築物、および３’ＨＡ配列を含むドナー標的ＤＮＡであって、好ましくは二本鎖であり、双方の鎖または好ましくは一方の鎖が、５’エキソヌクレアーゼ切断を低減するために、ドナーの５’末端の５ヌクレオチド以内で少なくとも１つのホスホロチオアート結合で修飾されており、そして必要に応じて、５’末端の５ヌクレオチド以内に１、２、３、または４つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを含むドナー標的ＤＮＡと
を導入することを含む方法を提供する。好ましくは、修飾された鎖の逆鎖は５’末端ホスファートを有する。プロモータは、必要に応じてＴ細胞であり得る初代細胞において、作動可能である。
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞ベースの治療用に改変されている。細胞は、非限定的な例として、幹細胞、線維芽細胞、グリア細胞、筋細胞、または造血細胞であり得、本明細書中で開示される方法を用いて改変され得、かつ患者に移され得る。細胞は、患者に対して自己由来であっても同種異系であってもよい。同種異系の場合、細胞は、１人または複数のドナーに由来し得る。
実施例は、ドナーＤＮＡにノックインして、標的化された内因性遺伝子、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子またはＰＤ－１遺伝子をノックアウトするためのウイルスベクターを使用せずに、高い形質移入効率を実現する本開示のプロセスの利点を示す。また、例示されるのは、単回の形質移入に起因する、第１の遺伝子座での同時遺伝子ノックアウトおよび遺伝子ノックイン、ならびに第２の遺伝子座での遺伝子ノックアウトである。
健康なボランティアドナー由来のバフィーコートを、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ血液バンクから得た。一部のフレッシュな全血または白血球分離産物を、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣを、３００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２（プロロイキン）入り５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＡＩＭ－Ｖ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中１００ｎｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、１０６個の細胞／ｍＬの密度にて２日間活性化した。培地を２日～３日毎に交換して、細胞を１０６個／ｍＬにて再プレーティングした。この処理は、培養物中のＴ細胞を選択的に増幅する。いくつかの実験において、細胞を、３００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）入り５％ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、１０６個の細胞／ｍＬの密度にて培養した。いくつかの実験において、製造業者の指示に従って、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＫｉｔもしくはＣＤ３陽性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する磁気陰性選択を使用して、Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。
細胞毒性アッセイにおける使用のために、ＣＤ３８を発現するＲＰＭＩ－８２２６（多発性骨髄腫細胞株）細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように形質導入し、そしてＣＤ３８を発現しないＫ５６２（ヒト不死化骨髄性白血病）細胞を、Ｒ－フィコエリトリン（ＲＰＥ）を発現するように形質導入した。双方の細胞株を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＡＴＣＣ）中で培養した。ＣＡＲプラスミドを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により生成した。ドナーフラグメントを生成するためのＰＣＲ鋳型として使用する遺伝的構築物を生成するのに、骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用した。
いくつかの実験において、レトロウイルス形質導入Ｔ細胞を、Ｃａｓ媒介ノックイン細胞と比較した。レトロウイルス構築物によるＴ細胞の形質導入は、本質的にＭａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６１：１２－２５およびＭａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７４（３）：２８６－２９６に記載されているように実行した（これらの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。手短に言えば、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ（または他の構築物）プラスミドＤＮＡを、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ）中に形質移入して、エコトロピックレトロウイルスを生成し、次いで、収穫した一過性ウイルス上清（エコトロピックウイルス）を使用して、ヒト細胞の感染用のレトロウイルスの生成のためにＧａＬＶエンベロープタンパク質を発現するＰＧ１３パッケージング細胞に形質導入した。ＰＧ１３細胞由来のウイルス上清を使用して、ＣＤ３またはＣＤ３／ＣＤ２８活性化の２～３日後に、活性化Ｔ細胞（またはＰＢＭＣ）を形質導入した。正常な健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者のマニュアルに従って、１００ｎｇ／ｍＬマウス抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｒａｒｔｉａｎ，ＮＪ）または抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８ Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｌｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、および５％ＦＢＳを補充したＡＩＭ－Ｖ増殖培地（ＧＩＢＣＯ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中３００～１０００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２で２日間活性化することによって、活性化ヒトＴ細胞を調製した。５×１０６個の活性化ヒトＴ細胞を、１０μｇ／ｍｌのレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）プレコーテッド６ウェルプレート中で３ｍｌのウイルス上清で形質導入して、１０００ｇで３２℃にて１時間遠心分離した。形質導入後、形質導入されたＴ細胞を、５％ＦＢＳおよび３００～１０００Ｕ／ｍＬ ＩＬ２を補充したＡＩＭ－Ｖ増殖培地中で増殖させた。
Figure 2022524435000001
Figure 2022524435000002
実施例１．同時の、ヒトＴ細胞におけるＴ細胞受容体遺伝子のノックアウトおよび抗ＣＤ３８ ＣＡＲのノックイン。
本実施例において、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８７５５）を、ドナーＤＮＡとしての抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物で標的とした。ゲノム中の標的配列（ＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴ（配列番号１））に隣接するＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）のおよそ１．３ｋｂのゲノムＤＮＡ配列を有するｐＡＡＶ－ＴＲＡＣ－抗ＣＤ３８構築物を設計した。標的配列を、Ｃａｓ９媒介遺伝子破壊およびドナー構築物の挿入用のＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内のＣａｓ９ ＰＡＭ（ＧＧＧ）の上流部位として識別した。抗ＣＤ３８ ＣＡＲ遺伝子構築物（配列番号２）は、ヒトＣＤ３８に特異的な一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に続く、ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジドメイン－ＣＤ２８膜貫通ドメイン－ＣＤ２８細胞内領域およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする配列を含んでいた。外因性ＪｅＴプロモータ（米国特許第６，５５５，６７４号明細書；配列番号３）を使用して、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの転写を開始した。
ドナーＤＮＡフラグメントゲノム編集を生じさせるためのＰＣＲ鋳型として使用されるｐＡＡＶ－抗ＣＤ３８Ａ２ドナープラスミドを構築するために、６５０～６６０ｂｐの相同アーム（配列番号４）を有する抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲ構築物を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成した。ＭｌｕＩおよびＢｓｔＥＩＩで二重消化したｐＡＡＶ－ＭＣＳベクター（５０ｎｇ）、相同アーム（配列番号４）が隣接している抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲフラグメント（５０ｎｇ）、１ｕｌ ５Ｘ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、およびヌクレアーゼフリー水を含有するインフュージョンクローニング反応を、室温にて実行した。反応液を少しの間ボルテックスして、遠心分離してから、５０℃にて３０分間インキュベートした。次いで、Ｓｔｅｌｌａｒ（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を、インフュージョン生成物で形質転換して、アンピシリン処理アガープレート上にプレーティングした。正確なクローンを識別するために、シーケンシングプライマーＣＴＴＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧ（配列番号５）、ＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＧＴＣＴ（配列番号６）、およびＧＧＣＴＡＣＧＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＡＧＧ（配列番号７）を使用するサンガー配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）用の複数のコロニーを選択した。正確なクローンを培養して、当該クローン由来のＤＮＡプラスミドを精製した。
ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子のＲＮＡガイド指向性標的化のために、ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（ＡＬＴ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびｃｒＲＮＡ（ＡＬＴ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡ）を、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。ここで、ｃｒＲＮＡを、ＴＲＡＣ遺伝子の第１のエクソン中のＣａｓ９ ＰＡＭ配列（ＧＧＧ）の直ぐ上流に存在する標的配列ＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴ（配列番号１）を含むように設計した。
ドナーフラグメントＤＮＡを作製するために、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）をＰＣＲ反応に使用した。上記のＡＡＶドナープラスミドｐＡＡＶ－抗ＣＤ３８Ａ２を鋳型として使用した。６６０ｎｔ（配列番号４４）および６５０ｎｔ（配列番号４５）の相同アームを有するドナーフラグメントを生成するために、フォワードプライマーは配列：ＴＧＧＡＧＣＴＡＧＧＧＣＡＣＣＡＴＡＴＴ（配列番号３６）を有し、リバースプライマーは配列：ＣＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＴＴＡ（配列番号９）を有していた。異なる相同アーム長の有効性を試験するための種々の実験において、ｐＡＡＶ－抗ＣＤ３８Ａ２構築物の相同アーム内の特定の位置にハイブリダイズする配列を有するプライマーを使用して、所望の長さの相同アームを有するドナーフラグメントをＰＣＲによって生成した。ホスホロチオアート結合（図２Ａ）を、フォワードプライマー（配列番号３６）の５’末端の３つのヌクレオチドに導入して、エキソヌクレアーゼ分解を阻害した（５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオチドの間）。また、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端から２番目、３番目、そして４番目の位置のヌクレオチドを、２’－Ｏ－メチル修飾した（図２Ｂ）（配列番号８、表１参照）。リバースプライマー（配列番号９）は、５’末端ホスファートを含んでいた。ドナーＤＮＡフラグメントを生成するために、サーモサイクラー設定は：９８℃で３０秒間の１サイクル、９８℃で１０秒間、６４～６６℃で５～１５秒間、７２℃で３０秒間の３５サイクル、および７２℃で７～１０分間の１サイクルであった。一本鎖鋳型を生成するためのストランダーゼによる消化を、製造業者の説明書（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）に従って、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ（商標）Ｌｏｎｇ ｓｓＤＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を使用して行い、そしてｓｓＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を使用して精製した。ｓｓＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｄｅｎｏｖｉｘ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）によって求めた。対照として、結果として生じるドナーフラグメントが化学修飾を有さない（ＰＳまたは２’－Ｏ－メチル基を有さない）ように、非修飾プライマーにより、またはＰＳ修飾のみを有する（２’－Ｏ－メチル基を有さない）フォワードプライマーにより、ドナーフラグメントを生成した。
ＴＣＲノックアウト／抗ＣＤ３８ ＣＡＲノックインを生じさせるために、Ｔ細胞を、ＣＤ３を培養物に加えることによって活性化した。ＣＤ３によるＴ細胞活性化を開始した約４８から７２時間後に、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０μｌまたは１００μｌチップを使用して、活性化Ｔ細胞を含むＰＢＭＣ培養物に、ＳｐＣａｓ９タンパク質（核局在化配列を含む；ＩＤＴ）＋ｃｒＲＮＡ（ガイド配列、配列番号１を含む）およびｔｒａｃｒＲＮＡを含むＳｐＣａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）をエレクトロポレーションした。手短に言うと、先ず、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡおよびＡｌｔ－Ｒ（登録商標）ｔｒａｃｒＲＮＡ（双方ともＩＤＴ製）を混合して、９５℃にて５分間加熱した。次いで、混合液を熱から外して、ベンチトップ上で室温（１５～２５℃）に約２０分間冷却して、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を形成した。形質移入毎に、１０μｇ ＳｐＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴ）を、２００ｐｍｏｌ ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖と混合して、４℃にて３０分間一緒にインキュベートして、ＲＮＰを形成した。１×１０６個の細胞をＲＮＰと混合して、１７００Ｖ、２０ｍｓパルス幅、１パルスでエレクトロポレーションした。１～２時間後、１０ｕｇの一本鎖ドナーＤＮＡを、１６００Ｖ、２０ｍｓパルス幅、１パルスで細胞中にエレクトロポレーションした。場合によっては、Ｔ細胞をＲＮＰおよびドナーＤＮＡと混合して、ＲＮＰ＋プラスドナーＤＮＡを細胞中に同時にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を培養培地中に希釈して、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
形質転換細胞のＣＡＲ発現をＦＡＣＳによって検出することによってノックイン効率を判定するために、形質移入またはレトロウイルス形質導入されたＰＢＭＣを、ＤＰＢＳ／５％ヒト血清アルブミンで洗浄してから、抗ＣＤ３－ＢＶ４２１抗体ＳＫ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ３８－Ｆｃタンパク質（Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｌｓｔｏｎ，ＭＡ）で４℃にて３０～６０分間染色した。ＣＤ３および抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現を、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ Ｃｏ．）を使用して分析した。抗ＣＤ３８構築物ノックインについての陰性対照は、ＴＲＡＣ遺伝子の第１のエクソンを標的とするハイブリダイズしたｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡと複合体形成されたＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰで形質移入したが、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーＤＮＡで形質移入しなかった細胞であった。ノックイン細胞による抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の発現についての対照として、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現ＰＢＭＣを非Ｃａｓ９法によって生成した。ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドを含むが、ドナーＤＮＡを含まないＲＮＰで形質移入したＰＢＭＣ（ＴＣＲノックアウト細胞）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化に使用するドナーフラグメントを形成するのに使用するのと同じ抗ＣＤ３８Ａ２発現カセット（配列番号２）を有するレトロウイルスベクターを含むレトロウイルスで形質導入した。
図３Ａは、形質移入の８日後に、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現用のドナーフラグメントが不在の（ＴＲＡＣ遺伝子をノックアウトするための）ＲＮＰで形質移入した細胞内で、抗ＣＤ３８構築物の発現が検出されなかったことを示す（一番左側のパネル）。一方、ＴＲＡＣノックアウトを有し、そしてその後に抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物を含むレトロウイルスで形質導入したＰＢＭＣは、形質移入の８日後に細胞の約７０％において、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現を示した（図３Ａの一番右側のパネル）。ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするＲＮＰに加えて抗ＣＤ３８ ＣＡＲ ｓｓドナーＤＮＡで形質転換した培養物について、化学修飾を有していないｓｓドナーＤＮＡを受けた集団の約１２％、およびドナーＤＮＡの５’末端付近のヌクレオチド上にＰＳ骨格修飾のみを有する（５’末端から番号付けして、ヌクレオチド１と２、２と３、そして３と４の間にＰＳ結合を有するＰＣＲプライマーを使用して導入した）ｓｓドナーＤＮＡで形質導入した培養物の約１３％が、抗ＣＤ３８構築物の発現を実証した。ＰＳ修飾を含むドナーフラグメント鎖の５’末端から２番目、３番目、そして４番目のヌクレオチドの３つのヌクレオチドの２’酸素にメチル基を付加すると（これらの修飾を含む配列番号８のプライマーを使用して、ＰＣＲによってドナーＤＮＡを生成することによる）、形質移入した集団において抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現がかなり高くなり、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現が、８日目に、「二重修飾された」（２’－Ｏ－メチルおよびＰＳ）一本鎖ドナーフラグメントを受けた細胞の約２０％において見られた。特に、ドナーＤＮＡの化学修飾は、形質移入培養物の生存率に影響を及ぼさなかった。
抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現の増大は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメント＋ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＲＮＰで形質移入した培養物において経時的に観察されたが、レトロウイルスによって形質導入した培養物では逆であった。形質移入の１０日後（図３Ｂ）、フローサイトメトリーは、全ての培養物（全てＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した）について、細胞の少なくとも８０％がＴＣＲを発現しないことを実証した。さらに、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰに加えて抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントで形質移入した培養物では、ＴＣＲを発現しない細胞の少なくとも４２％が、形質移入の１０日後に抗ＣＤ３８構築物を発現した（図３Ｂ、パネル２～４）。５’－近位ヌクレオチド上にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル基の双方を有する抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントで形質移入した培養物について、細胞の５７％が１０日目までに抗ＣＤ３８構築物を発現しており（図３Ｂ、パネル４）、あらゆる試験培養物の最高パーセンテージであった。同時に、レトロウイルスで形質導入した培養物における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現は、形質導入後８日目に、見られたものの約半分に、形質導入後１０日目に、細胞の約３４％に低減した（図３Ｂ、パネル５）。２０日目の二重修飾されたｓｓドナーで形質移入した培養物およびレトロウイルス形質導入培養物の分析（図３Ｃ）は、培養物中の抗ＣＤ３８構築物の発現が安定したことを示し、５’末端にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾の双方を有するｓｓドナーで形質移入したＣａｓ９修飾された培養物は、ＴＣＲ陰性細胞の５４％が構築物を発現していることを示し（中央のパネル）、レトロウイルスで形質導入した培養物は、ＴＣＲ陰性細胞の３１％が構築物を発現していることを示した（右側のパネル）。
ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内の標的化された遺伝子座での相同組換え修復（ＨＤＲ）の存在を確認するために、培養物から単離したＤＮＡに対してＰＣＲを実行して、ドナーフラグメントが、ガイドＲＮＡによって標的化されたＴＲＡＣ部位中に挿入されていることを確認した。ゲノムＤＮＡを、形質移入されていない活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）、ＴＲＡＣエクソン１ガイドＲＮＡを含むＲＮＰで形質転換したＴＲＡＣノックアウト細胞、ならびにＲＮＰ＋ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾ドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞から増幅して、ＴＲＡＣ遺伝子座中への抗ＣＤ３８ ＣＡＲ導入遺伝子の、標的化された挿入を検出した。ゲノム内のドナーＤＮＡの位置を確認するために、オリゴヌクレオチドプライマーを、ＴＲＡＣ相同アームの外側であるがゲノム内の相同アーム配列に隣接する（外側の）配列を標的とした。合計１×１０５個の細胞を、３０μＬのＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）中に再懸濁させて、ゲノムＤＮＡを抽出した。細胞溶解液を６５℃にて５分間、次いで９５℃にて２分間インキュベートして、－２０℃にて保存した。ゲノムＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｄｅｎｏｖｉｘ）によって求めた。ＴＲＡＣ標的部位を含有するゲノム領域を、以下のプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅した：ＴＲＡＣに対する５’ＰＣＲフォワードプライマー：ＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧ（配列番号１０）、ＣＡＲに対する５’ＰＣＲリバースプライマー：ＣＴＴＴＣＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号１１）、ＣＡＲに対する３’フォワードプライマー：ＣＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴ（配列番号１２）、ＴＲＡＣに対する３’リバースプライマー：ＧＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴ（配列番号１３）（図１Ｂ参照）。双方のプライマーセットを、相同アームの外側にアニーリングすることによってＨＤＲ鋳型の増幅を回避するように設計した。
ゲノムＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｄｅｎｏｖｉｘ）によって求めた。双方のプライマーセットを、対の一方のプライマーが相同アームの外側のゲノム内の部位にアニーリングし、そして対の他方のプライマーが構築物のコーディング領域内の部位にアニーリングする（すなわち、相同アーム内にアニーリングしない）ように設計した。ＰＣＲは、４００ｎｇのゲノムＤＮＡおよびＱ５高フィデリティ２Ｘミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有した。サーモサイクラー設定は、９８℃で２分間の１サイクル、９８℃で１０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で４５秒間の３５サイクル、および７２℃で１０分間の１サイクルからなった。ＰＣＲ産物を、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する１％アガロースゲルで精製した。次いで、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を使用して、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから溶出して単離した。ＰＣＲ産物を、サンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に付託した。図４は、ＰＣＲ産物を分離したゲルの写真を示す。構築物の５’末端および３’末端のゲノム中の相同アームに隣接するゲノム配列に隣接する抗ＣＤ３８構築物に対応する陽性バンドは、ドナーＤＮＡで形質移入した細胞においてのみ見られ（レーン３および６）、非形質移入ＡＴＣ（レーン１および４）またはＴＲＡＣノックアウトのみの細胞では見られなかった（レーン２および５）。これらのＰＣＲ産物の配列決定により、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物が予測部位に挿入されると、相同アームの領域の外側のゲノム配列にアニーリングして、構築物の５’末端および３’末端の双方にて相同アーム配列の内側の配列を構築するプライマーを使用して、組み込まれた抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物を有する細胞のゲノムＤＮＡから生成されたＰＣＲフラグメントが、標的化された部位に組み込まれた構築物の予測配列を有することが確認された。挿入遺伝子座を診断するためのプライマーを使用して生成されたＰＣＲ産物の配列決定（図１Ｂ参照）により、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中に組み込まれた抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントを実証する配列が示された。ＰＣＲ産物配列（例えば、配列番号３９および配列番号４０）は、単一のＰＣＲ産物中に、ゲノム中の相同アームに隣接する（外側の）配列、ドナーフラグメント中に存在する相同アームの配列、および抗ＣＤ３８ ＣＡＲ配列の一部を含み、予想される部位での挿入を実証した。
形質移入細胞の機能を試験するために、エレクトロポレーションの３週後、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする抗ＣＤ３８ ＣＡＲで形質移入した活性化Ｔ細胞を、一晩ＩＬ－２で欠乏状態にして（ｓｔａｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ＩＬ－２）、特異的死滅アッセイで試験した。活性化Ｔ細胞を、ＣＤ３８陽性ＲＰＭＩ－８２２６／ＧＦＰ細胞およびＣＤ３８陰性Ｋ５６２／ＲＰＥ細胞の標的細胞混合物と共培養した。インキュベーションエフェクタ対標的細胞比は、１０：１～０．０８：１に及んだ。一晩のインキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーによって分析して、ＧＦＰ陽性細胞集団およびＲＰＥ陽性細胞集団を測定して、抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲＴ細胞による特異的標的細胞死滅を判定した。図５は、ＣＤ３８発現ＲＰＭＩ８２２６細胞に対する各細胞集団の特異的細胞毒性のグラフ（ＣＤ３８を発現しないＫ５６２細胞に対する観察された細胞毒性を差し引いた後の、ＣＤ３８発現ＲＰＭＩ８２２６細胞に対する観察された細胞毒性）を示す。グラフは、非形質移入ＡＴＣ細胞が、最も高いエフェクタ対標的比にて多少の毒性を示したが、ＴＲＡＣノックアウト細胞が、エフェクタ対標的細胞比に拘わらず、実質的に死滅を示さなかったことを示す。しかしながら、抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３８陽性細胞－ＲＰＭＩ８２２６の強力かつ特異的な死滅活性を示したが、ＣＤ３８陰性細胞－Ｋ５６２の死滅活性は示さなかった（図５）。抗ＣＤ３８ ＣＡＲカセットを含む化学修飾されたドナーを組み込んだＴ細胞は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物を含むレトロウイルスで形質導入した細胞と同様に、標的細胞に対する細胞毒性を示した。
また、形質移入した活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）を、サイトカイン分泌について試験した（図６）。Ｔ細胞を、ＩＬ－２フリー培地中で一晩欠乏状態にした。次いで、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＡＴＣ対照を、ＣＤ３８陰性Ｋ５６２細胞またはＣＤ３８陽性ＲＰＭＩ８２２６細胞と共培養した。インキュベーションエフェクタ対標的細胞比は、２：１であった。一晩のインキュベーション後、製造業者の指示に従って、細胞を遠心分離して、上清を回収して、サイトカインＩＬ－２、ＩＦＮ－ガンマ、およびＴＮＦアルファ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を定量した。また、遺伝子編集されたＴＣＲノックアウト抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３８陽性腫瘍細胞（ＲＰＭＩ８２２６）と共培養した場合に、似た量のＩＦＮ－γおよび他の炎症促進性サイトカインを放出したが、ＣＤ３８陰性細胞（Ｋ５６２）では放出しなかった。
要約すると、インビトロ細胞機能研究は、特異的死滅アッセイ（図５）およびサイトカイン分泌アッセイ（図６）の双方に関して、この新規かつ効率的なプロセスによって達成されたＴＲＡＣ部位特異的組み込み抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲと、ウイルス媒介ランダム組み込み抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲとの間で、顕著な差異を何ら明らかにしなかった。
実施例２．ドナーＤＮＡの相同アームの長さの短縮
抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物のノックインのために、相同アーム（ＨＡ）の長さが異なるドナーフラグメントを生成して試験した。抗ＣＤ３８カセット＋６６０ｎｔおよび６５０ｎｔのＴＲＡＣエクソン１相同アーム（配列番号４）を含む実施例１に記載のｐＡＡＶ－ＴＲＡＣ－抗ＣＤ３８構築物を、鋳型として使用した。プライマーの第１のセット、配列番号８および配列番号９を使用して、実施例１に記載するように、この鋳型から６６０ｎｔおよび６５０ｎｔの相同アームを有するドナーフラグメントを生成した。プライマーの第２のセット、配列番号１４および配列番号１５を使用して、約３５０ｎｔ（３７５ヌクレオチドおよび３２１ヌクレオチド）の相同アームを有するドナーフラグメントを生成した。ここで、配列番号１４のプライマーは、５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオチドの間にＰＳ結合を有し、かつ２、３、および５位に２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを有していた。プライマーの第３のセット、配列番号１８および配列番号１９を使用して、約１６５ｎｔ（１７１ｎｔおよび１６１ｎｔ）の相同アームを有するドナーフラグメントを生成した。ここで、配列番号１８のプライマーは、５’末端から１番目と２番目、３番目と４番目、そして４番目と５番目のヌクレオシド間にＰＳ結合を有し、かつ３、４、および５位に２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを有していた。それぞれの場合において、フォワードプライマー（配列番号８、１４および１８）は、５’末端に最も近い５つのヌクレオチド内に（例えば、プライマーの５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、３番目と４番目、そして４番目と５番目のヌクレオシドのいずれかと、５’末端に最も近い５つのヌクレオチドのいずれかにおいて存在する３つの２’－Ｏ－メチル基との間に）３つのＰＳ結合を有するように設計した。それぞれの場合において、リバースプライマー（配列番号９、１５、および１７）は、５’末端ホスファートを有していた（表１参照）。
各プライマーセットを、鋳型としてのｐＡＡＶ ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物に使用して、ドナーの一方の鎖の５’末端の近位に複数のＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有し、ドナーの逆鎖の５’末端に５’ホスファートを有するドナーＤＮＡ分子を生成した。ＲＮＰを、実施例１に記載されるようにｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含むようにアセンブルした。ここで、ｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内で見出される配列である配列番号１の標的配列を含んでいた。ＰＣＲによってドナーＤＮＡを合成する場合、一本鎖ドナーフラグメントを生成するためのヌクレアーゼ反応、およびその後の一本鎖ＤＮＡの精製は時間がかかり、そして典型的に、形質移入用のドナーフラグメントの収率の著しい損失をもたらす。また、ヌクレアーゼ反応は、ドナーフラグメントの末端が分解され得るように制御することが困難であり得る。指向性遺伝子ノックアウトおよび抗体構築物ノックインの効率を試験する更なる実験では、ＰＣＲ合成ドナーのヌクレアーゼ消化および一本鎖精製を排除する形質移入で二本鎖ドナーＤＮＡを試験した。
ＲＮＰのエレクトロポレーション用の条件下で同じエレクトロポレーションでドナーフラグメントおよびＲＮＰを形質移入したことを除いて、実施例１に記載されるように、約６６５、３５０、および１６５塩基対長の相同アームを有する二本鎖ドナー分子を、活性化Ｔ細胞中に独立して形質移入した（Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１７００Ｖ、２０ｍｓパルス幅、１パルスを使用）。対照として、活性化Ｔ細胞を、ドナーフラグメントが不在のＲＮＰで形質移入した。これにより、ドナーＤＮＡ挿入はないが、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の発現について試験するために、実施例１に記載されるようにフローサイトメトリーを実行した。図７は、予想されるように、ＲＮＰで形質移入したＴ細胞培養物のみ、Ｔ細胞受容体の発現レベルが低く、そしてまた、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現を示さなかったことを示している。しかしながら、ＲＮＰ＋相同アームのサイズが異なるドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞は、培養物中で低レベルのＴ細胞受容体発現および良好な抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現を示し、二本鎖ドナーＤＮＡの形質移入が、標的化されたノックインに非常に有効であることを実証している。さらに、驚くべきことに、試験した最短ＨＡ長１６１／１７１ｎｔは、より長いＨＡ長よりも良好に機能し、導入された構築物を発現するノックアウト細胞のパーセンテージは、約６６５ｎｔアームについて約２４％、約３５０ｎｔアームについて約３０％、そして約１６５ｎｔアームについて約３８％であった。ゆえに、短い相同アームは、二本鎖ＤＮＡドナーを使用した標的ノックインゲノム改変に非常に効果的であることが見出されており、これは、より小さい構築物を可能にし、かつ／または追加の配列もしくはより長い配列をドナーＤＮＡ中に含めることができる構築物中のより大きな容量を可能にするという利点を有する。
実施例３．修飾された二本鎖ドナーＤＮＡ対非修飾二本鎖ドナーＤＮＡ
抗ＣＤ３８ ＣＡＲを含み、先の実施例２に記載の約１６５ｎｔのＴＲＡＣエクソン１相同アームを有するドナーＤＮＡを、ヌクレオチド修飾ありおよびなしのプライマーを使用して合成して、ＨＤＲの促進における相対的有効性を試験した。第１の場合では、プライマー配列番号１８は、１番目と２番目、３番目と４番目、そして４番目と５番目のヌクレオシド間に存在する３つのＰＳ結合、およびプライマーの５’末端の最初の５ヌクレオチド内の３つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを（ヌクレオチド位置３、４、および５に）有し、プライマー配列番号１９は、５’末端ホスファートを有していた（表１）。これらのプライマーを使用して、ＨＡがそれぞれ１７１ｂｐおよび１６１ｂｐであり、そして対応するヌクレオチド修飾（すなわち、ドナーＤＮＡ産物の第１の鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内の３つのＰＳ結合および３つの２’－Ｏ－メチル基、ならびにドナーＤＮＡ産物の第２の鎖の５’末端上のホスファート）を有するドナーＤＮＡを生成した。第２の場合では、プライマー配列番号３７は、プライマー配列番号３７が化学修飾を欠いていたことを除いて、プライマー配列番号１８と同一であった（表１参照）。配列番号３７のプライマーおよび５’末端ホスファートを欠く配列番号１９のプライマーを使用して、抗ＣＤ３８ ＣＡＲカセットを有するヌクレオチド修飾がないドナーＤＮＡを生成した。当該ドナーＤＮＡを、（ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内の）配列番号１の標的配列を含むｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含むＲＮＰと共に、二本鎖ＤＮＡ分子（いずれの鎖にも、変性もヌクレアーゼ消化もない）として、活性化Ｔ細胞中に形質移入した。ドナーとしての二本鎖ＤＮＡによるエレクトロポレーションでは、５ｕｇ ｄｓＤＮＡを使用して、１００万個の活性化Ｔ細胞に形質移入した。
実施例２のように、対照活性化Ｔ細胞を、ドナーフラグメントが不在のＲＮＰで形質移入した。これにより、構築物挿入のない、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３ ＣＡＲ構築物の発現について試験するために、本質的に実施例１に記載されるようにフローサイトメトリーを実行した。図８に示される結果は、ＲＮＰおよび修飾された二本鎖ドナーによる形質移入が、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現する一方、ＴＣＲ発現を示さない細胞を５０％超もたらし、ＲＮＰおよび非修飾二本鎖ドナーで形質移入した培養物において観察される抗ＣＤ３８構築物を発現するＴＣＲ陰性細胞のパーセンテージの少なくとも２倍（２２％）であることを示している。
実施例４．同時ＴＣＲノックアウトを伴う抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物および抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物のＨＤＲ媒介ノックイン
また、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現構築物および抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現構築物を含む追加のドナーＤＮＡを、ＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入について試験した。
Ｊｅｔプロモータ（配列番号３）およびイントロン、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物、ならびにＳＶ４０ポリＡ配列を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を、実施例１に記載される抗ＣＤ３８ ＣＡＲ ｐＡＡＶ構築物について本質的に記載されるように作製して、配列番号２０および配列番号２１のＴＲＡＣ遺伝子エクソン１相同アーム（ＨＡ）に隣接するベクター中にクローニングした。約１７０ヌクレオチドおよび１６０ヌクレオチドのＨＡを有する修飾されたドナーＤＮＡの生成をもたらす配列番号１８および配列番号１９として提供されるプライマーを使用する、実施例１に記載されるＰＣＲ反応において、ＨＡ ｐＡＡＶ構築物を有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲを鋳型として使用した（表１参照）。フォワードプライマー（配列番号１８）は、プライマーの５’末端からナンバリングした場合に、１番目と２番目、３番目と４番目、そして４番目と５番目のヌクレオシド間に３つのＰＳ結合を、そしてヌクレオチド３、４、および５に３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有し、リバースプライマー（配列番号１９）は、５’末端ホスファートを有していた（表１）。したがって、結果として生じた二本鎖ドナーＤＮＡは、対応する修飾を有する（第１鎖が、５’末端の５ヌクレオチド以内に３つのＰＳおよび３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有し、第２鎖が５’末端ホスファートを有する）ように合成されていた。
上記のプライマー配列番号１８および配列番号１９のヌクレオチド修飾が組み込まれた配列番号３８の配列を有する二本鎖の化学的に修飾されたドナー断片を使用する実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ＲＮＰのｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とする配列番号１の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。ＴＲＡＣ遺伝子座中に異なる構築物を導入する効率を評価するために、ＣＤ１９－Ｆｃ（Ｓｐｅｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）によって、続いてＡＰＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）によって抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現が検出されたことを除いて、本質的に実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを行った。結果が図９に示されており、抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、培養物中の細胞のおよそ４２％において、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現されたことが分かる。
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を、実施例１に記載される抗ＣＤ３８ ＣＡＲ ｐＡＡＶ構築物に基づいて、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを抗ＢＣＭＡ ＣＡＲで置き換えることによって作製した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲフラグメントを、ＩＤＴによって合成した。インサートの配列を、配列番号２３として提供する。約１６０～１７０ヌクレオチドのＴＲＡＣエクソン１遺伝子座ＨＡを有するドナーＤＮＡの生成をもたらす配列番号１８および配列番号１９として提供されるプライマーを使用する、実施例１に記載されるＰＣＲ反応において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を鋳型として使用した（表１参照）。フォワードプライマー（配列番号１８）は、プライマーの５’末端の５ヌクレオチド以内に３つのＰＳおよび３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有していた。リバースプライマー（配列番号１９）は、５’末端ホスファートを有していた。したがって、結果として生じた二本鎖ドナーＤＮＡは、第１鎖が、５’末端の５ヌクレオチド以内に３つのＰＳおよび３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有し、第２鎖が５’末端ホスファートを有するように合成されていた。
上記の化学的に修飾されたプライマーの取り込みによって修飾されたヌクレオチドを有する、配列番号３７の配列を有する二本鎖ドナー断片を使用して、実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ＲＮＰのｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とする配列番号１の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。ＴＲＡＣ遺伝子座中に異なる構築物を導入する効率を評価するために、ＰＥまたはＡＰＣがコンジュゲートされたＢＣＭＡ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）によって抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現が検出されたことを除いて、実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを行った。結果が図１０に示されており、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、培養物中の細胞のおよそ６６％において、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現されたことが分かる。
実施例５．ＴＲＡＣエクソン３を標的とするＨＤＲ媒介ノックイン
本明細書中で提供されるドナー挿入方法を使用して、ドナーＤＮＡを、追加の遺伝子座中に挿入する効率を試験するために、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３由来のＨＡを有するドナーＤＮＡを生成するための抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物を作製した。この場合、ＴＲＡＣエクソン１標的化構築物について、ＨＡ（５’ＨＡ配列番号２４（１８３ｎｔ）および３’ＨＡ配列番号２５（１４０ｎｔ））がエクソン３標的部位（配列番号２６）を取り囲む配列であることを除いて、本質的に実施例１に記載されるように構築物を作製した。次いで、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３相同アームを有するドナーＤＮＡとして生成したｐＡＡＶ構築物のインサートの配列を、配列番号２７として提供する。ドナーフラグメントを生成するために、フォワードプライマー（配列番号２８）は、１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオシド間のＰＳ結合を、そして５’末端から第２位、第４位、および第５位に２’－Ｏ－メチル修飾を含み、リバースプライマー（配列番号２９）は、５’末端ホスファートを有していた。プライマーを組み込んだ、結果として生じた二本鎖ドナーＤＮＡは、５’末端に最も近いヌクレオチド上に、対応するＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する第１鎖、および５’末端ホスファートを有する第２鎖を有していた。
上記プライマーの取り込みによって修飾されたヌクレオチドを有し、配列番号２７の配列を有する二本鎖ドナー断片を使用して、実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３を標的とする配列番号２６の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。さらなる対照は、非形質移入活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）であった。本質的に実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを実施した。結果が図１１に示されており、ＲＮＰまたはＲＮＰ＋ドナーＤＮＡでの形質移入により、培養物全体で８０％を超える細胞がＴＣＲ発現を喪失することが分かる。さらに、標的に誘導するＲＮＰに加えて、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３に由来するＨＡを有するドナーＤＮＡで形質移入された培養物中の細胞の約４２％において、抗ＣＤ３８ ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現された。
挿入遺伝子座を診断するように設計したプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を生成した（図２Ｂ参照）：５’－ＣＴＣＣＴＧＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡ－３’（配列番号６４、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー）および５’－ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＧＴ－３’（配列番号６５、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー）、そして反対側の接合部について、５’－ＣＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴ－３’（配列番号６６、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー）および５’－ＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＴＣＴＴＡＣＡ－３’（配列番号６７、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー）。結果として生じたＰＣＲ産物を配列決定した。ＰＣＲ産物配列（例えば、配列番号４１および配列番号４２）は、単一のＰＣＲ産物中に、ゲノム中の相同アームに隣接する配列、ドナーフラグメント中に存在する相同アーム、および抗ＣＤ３８ ＣＡＲの一部を含み、予想される挿入を実証した。
図１２は、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３およびエクソン１への抗ＣＤ１９ ＣＡＲの標的誘導を比較する。エクソン３に向けられる抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーＤＮＡは、上記実施例中に記載されている抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を含むように合成され、抗ＣＤ１９発現カセットは、上記のエクソン３遺伝子座由来の配列（配列番号２４および配列番号２５）に隣接する。（配列番号３８の配列を有する）エクソン１に向けられる抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーは実施例４に提供されている。最も５’末端にある３つのヌクレオチド上にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する修飾されたフォワードプライマーを使用してドナー断片を作製するために、これらの構築物の各々、すなわち、ＴＲＡＣエクソン１ ＨＡ（配列番号１８および配列番号１９）に隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を有する一方と、ＴＲＡＣエクソン３ ＨＡ（配列番号２４および配列番号２５）に隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を有する他方とを使用した。リバースプライマーは５’末端ホスファートを有していた。エクソン１ ＨＡに隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーを作製するためのプライマーは、配列番号１８および配列番号１９であり、配列番号１８のプライマーは、第１および第２、第３および第４、ならびに第４および第５のヌクレオシドの間にＰＳ結合と、５’末端から３、４および５の位置に２’－Ｏ－メチル基とを含んでいた。エクソン３ ＨＡに隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーを作製するためのプライマーは、配列番号２８および配列番号２９であり、配列番号２８のプライマーは、５’末端から第１および第２、第２および第３、ならびに第３および第４のヌクレオシドの間にＰＳ結合と、５’末端から２の位置、４の位置および５の位置に２’－Ｏ－メチル基とを有していた。このため、得られた二本鎖ドナーＤＮＡは、５’末端のヌクレオチド上に対応するＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する第１の鎖と、５’末端ホスファートを有する第２の鎖とを有していた。
ドナーフラグメントを、独立して、ＲＮＰで活性化Ｔ細胞中に形質移入した。実施例１に記載されるようにＲＮＰを生成し、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン１を標的とするためのｃｒＲＮＡの標的配列を配列番号１とし、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３を標的とするためのｃｒＲＮＡの標的配列を配列番号２６とした。図１２に見られるように、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのドナーフラグメントで形質移入した培養物の約４１％は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲについてＴＣＲ陰性およびＴＣＲ陽性の両方であった一方、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのドナーフラグメントで形質移入した培養物の約２０％は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲについてＴＣＲ陰性およびＴＣＲ陽性の両方であった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現カセットを含むレトロウイルスで形質導入されたＴ細胞培養物は、より高いパーセンテージの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を示したが、当該細胞はＴＣＲノックアウトがなかった。
［実施例６］ＰＤ－１遺伝子を標的とするＨＤＲ媒介性ノックイン
ＰＤ－１遺伝子座もＣＡＲ構築物で標的化した。この事例では、ドナーＤＮＡを作製するための鋳型を提供するために本質的に実施例１に記載されている方法を使用して、標的部位（配列番号３２）を取り囲むＰＤ－１遺伝子座の配列を有する相同アーム（配列番号３０および配列番号３１）に、抗ＣＤ３８ ＣＡＲカセット（配列番号２）を並置した。
５’ホスファートを含むフォワードプライマー（配列番号３４）と、５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目および３番目と４番目のヌクレオシド間のホスホロチオアート結合と、５’末端から１番目、２番目および４番目のヌクレオシド上の２’－Ｏ－メチル基とを含むリバースプライマー（配列番号３５）を使用して、本質的に実施例１に記載されているとおりにドナーＤＮＡを作製した、表１参照。
二本鎖の化学修飾されたドナーフラグメント（配列番号３３）を使用して、実施例１に記載される方法に従って生成されたＲＮＰと共に細胞を形質移入した。ここで、ｃｒＲＮＡは、ＰＤ－１遺伝子を標的とする配列番号３２の標的配列を含んでいた。対照として、活性化Ｔ細胞を、ドナーフラグメントが不在のＲＮＰで形質移入した。これにより、ＣＡＲ構築物挿入のない、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトが生じる。更なる対照は、非形質移入活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）であった。フローサイトメトリーを、本質的に実施例１に記載されるように実行して、非形質移入活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）の追加の対照を含めた。ＰＤ－１に対するＢＶ４２１コンジュゲート化抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、ＰＤ－１発現を検出した。
結果を図１３に示す。図では、ＰＤ－１を発現する細胞のパーセンテージが、ＡＴＣにおける約１９％から、ＰＤ－１遺伝子座を標的とするＲＮＰ（ＰＤ－１ ＲＮＰ）で形質移入した培養物の細胞における約４％に低下したことが分かる。ＰＤ－１標的化ＲＮＰ＋ＰＤ－１遺伝子座に対して相同性を有するＨＡを有するドナーで形質移入した培養物中の細胞の約２７％において、Ｔ細胞受容体発現の不在下で抗ＣＤ３８ ＣＡＲは発現された。比較として、ＴＣＲのエクソン１を標的とするＲＮＰ、およびＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１の配列に対して相同性を有するＨＡを有する抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントで形質移入した培養物の細胞では、約３２％であった。
挿入遺伝子座を診断するためのプライマーを使用して生成されたＰＣＲ産物の配列決定（図２Ｂ参照）により、ＰＤ－１遺伝子中に組み込まれた抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントを実証する配列が示された。接合配列を得るために、合計１×１０７個の細胞を、５００μｌのＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）中に再懸濁させて、ゲノムＤＮＡを抽出した。細胞溶解液を６５℃にて５分間、次いで９５℃にて２分間インキュベートして、－２０℃にて保存した。ゲノムＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｄｅｎｏｖｉｘ）によって求めた。標的部位を含有するゲノム領域をＰＣＲ増幅した。５’接合部および３’接合部の双方についてのプライマーセットを、相同アームの外側にアニーリングするように設計した。挿入遺伝子座を診断するように設計したプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を生成した（図２Ｂ参照）：５’－ＧＴＧＴＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧ－３’（配列番号６８、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー）および５’－ＡＣＡＣＡＣＴＴＧＣＧＡＣＣＣＡＴＴＣ－３’（配列番号６９、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー）、そして反対側の接合部について、５’－ＣＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴ－３’（配列番号７０、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー）および５’－ＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＴＧＧ－３’（配列番号７１、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー）。
ＰＣＲは、４００ｎｇのゲノムＤＮＡおよびＱ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ ＰＣＲミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有した。サーモサイクラー設定は、９８℃で２分間の１サイクル、９８℃で１０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で４５秒間の３５サイクル、および７２℃で１０分間の１サイクルからなった。ＰＣＲ産物を、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する１％アガロースゲルで精製した。ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を使用して、アガロースゲルから溶出した。ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に供した。ＰＣＲ産物配列は、単一のＰＣＲ産物中に、ゲノム中の相同アームに隣接する配列、ドナーフラグメント中に存在する相同アーム、および抗ＣＤ３８ ＣＡＲの一部を含み、予想される挿入を実証した。
図１４は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現し、かつＰＤ－１遺伝子をノックアウトした細胞の機能性を判定するために、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメント、およびＰＤ－１遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入した培養物由来のＰＢＭＣおよび単離Ｔ細胞（それぞれ「ＰＤ－１ ＫＯＫＩ ＰＢＭＣ」および「ＰＤ－１ ＫＯＫＩ Ｔ細胞」）を使用して実行した細胞毒性アッセイの結果を示す。当該改変された細胞は、アッセイにおいて、ＰＤ－１遺伝子ノックアウトを有するがＣＡＲ構築物を受けなかった対照細胞（「ＰＤ－１ ＫＯ」）、およびＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトを有するがＣＡＲ構築物を受けなかった対照細胞（「ＴＲＡＣ－１ ＫＯ」）に対して、標的細胞に対する高レベルの細胞毒性を示し、そして、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメント、およびＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰを形質移入した細胞（「ＴＲＡＣ ＫＯＫＩ」）によって、性能が幾分優れていた。これはおそらく、観察されたＰＤ－１部位でのドナーＣＡＲ構築物組み込みの効率が低いためである（図１３）。
実施例７．Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａによる、ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座中への抗ＣＤ３８二量体抗体受容体（ＤＡＲ）構築物の、標的化された挿入。
更なる実験では、合成抗体受容体の更なる構成が、Ｔ細胞において発現された。二量体抗体受容体（ＤＡＲ、例えば、国際公開第２０１９／１７３８３７号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）参照）の発現用の構築物を作製した。ＤＡＲ構築物は、単一のオープンリーディングフレームから２つのポリペプチドを生成するのに使用される「自己切断」２Ａ配列によって連結された２つのポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいた。第１のコードポリペプチドは、重鎖可変領域および第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤζの細胞質ドメインを含む重鎖ポリペプチドであった。これに、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルスＴ２Ａペプチドコーディング配列（配列番号４６）、次いで、第２のポリペプチドをコードする配列が続き、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に進んで、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）＋定常領域（ラムダ）を含んでいた。重鎖ポリペプチド配列、２Ａペプチド、および軽鎖配列をコードする核酸配列を、ＤＡＲコーディング配列の５’末端にてＪｅＴプロモータ（配列番号３）に、そしてＤＡＲコーディング配列の３’末端にてＳＶ４０ポリＡ付加配列（配列番号４７）に作動可能に連結した。抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物全体（ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤζの細胞質ドメイン、Ｔ２Ａ、軽鎖を有するＪｅＴプロモータ重鎖コーディング配列、ならびにＳＶ４０配列（配列番号４８））を、ベクター中の６６０ｂｐ（配列番号４４）と６５０ｂｐ（配列番号４５）の相同アーム間にクローニングした。相同アームは、標的配列の両側にＴＲＡＣエクソン１遺伝子座の配列を含んでいた。プライマーの５’末端からナンバリングした場合に、１番目と２番目、３番目と４番目、そして４番目と５番目のヌクレオチド間に３つのＰＳ結合を、そしてヌクレオチド３、４、および５に３つの２’－Ｏ－メチル修飾を含むフォワードプライマー（配列番号１８）、および５’末端ホスファートを含むリバースプライマー（配列番号１９）（表１）を使用するＰＣＲによって、形質移入実験に使用するためのドナーフラグメントを合成した。結果として生じたＰＣＲ産物（配列番号４９）は、抗ＣＤ３８ ＤＡＲコーディング構築物（配列番号４８）に隣接する相同アーム（配列番号２０および配列番号２１）を含み、そして配列番号１８のプライマー修飾が、第１の鎖および５’末端ホスファート中に組み込まれていたが、導入された化学修飾が、逆鎖、すなわち第２の鎖に加えられていなかった。
また、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用せずに、配列ＴＴＴＶを有するＰＡＭ（Ｖは、Ａ、Ｃ、またはＧであり、ＰＡＭは、標的部位の直ぐ上流にある）を認識するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであるＣａｓ１２ａにより、ノックアウト／ノックイン（「ＫＯＫＩ」）戦略を試験した。当該実験では、同じ抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物（配列番号４８）を相同アーム間にクローニングした。ここで、相同アーム配列（配列番号５０および配列番号５１）は、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内のＣａｓ１２ａ標的部位（配列番号５２）の両側にあるゲノム配列に対して相同性を有した。これらの相同配列に隣接する抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物（配列番号５３）を、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物について実施例１に記載されるようにベクター中にクローニングして、結果として生じたクローンを、５’末端ホスファートを含むフォワードプライマー配列番号２０、および５’末端の２’－Ｏ－メチル化（２’－Ｏ－メチルデオキシグアノシン、２’－Ｏ－メチルデオキシシチジン、および２’－Ｏ－メチルデオキシアデノシン）からの最初の３つのヌクレオチドを有する（最初の３つのヌクレオチドは、ＰＳ結合を介して次のヌクレオチドに連結されている（すなわち、５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオチドの間にＰＳ結合が存在した））リバースプライマー配列番号５４を使用するＰＣＲ反応用の鋳型として使用した（表１参照）。ＰＣＲを、隣接する相同配列（配列番号５０および配列番号５１）内でハイブリダイズして、１９２ｎｔおよび１５９ｎｔ（配列番号５５および配列番号５６）の相同アームが隣接する抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物（配列番号４８）を有する二本鎖ドナーＤＮＡ分子を生成するフォワードプライマー（配列番号２０）および修飾されたリバースプライマー（配列番号５４）を使用して、本質的に実施例１に記載されるように実行した。結果として生じた二本鎖抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡフラグメント（配列番号５７）は、サイズが３キロベースであり、リバースプライマー（配列番号５４）の２’－Ｏ－メチルおよびＰＳ修飾、ならびにフォワードプライマー（配列番号２０）の５’末端ホスファートをドナーＤＮＡ分子中に組み込んでおり、これを使用して、活性化ＰＢＭＣを、標的配列（配列番号５２）を含むｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）と複合体形成したＣａｓ１２ａタンパク質と共に二本鎖分子として形質移入した。ｃｒＲＮＡは、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入したＡｌｔＲ（登録商標）ＲＮＡであった。Ｃａｓ１２ａおよびガイドＲＮＡ ＲＮＰの形成は、ＲＮＡ種のプレハイブリダイゼーションがないようにｔｒａｃｒＲＮＡを使用しないことを除いて、本質的にＣａｓ９ ＲＮＰについて実施例１に記載されるように実行した。また、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰおよび二本鎖ドナーＤＮＡの、Ｔ細胞中へのエレクトロポレーションを、本質的に実施例１に従って実行した。対照として、あるＴ細胞集団を、ドナーフラグメントなしのＣａｓ９ ＲＮＰで形質転換し、そして別のＴ細胞集団を、ドナーフラグメントなしのＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質転換した。ドナーフラグメントの不在下では、ＲＮＰは、標的化された遺伝子を破壊すると予測されるが、発現構築物は挿入されない。したがって、形質移入細胞はノックアウト（ＫＯ）対照と称される。
形質移入の１４日後、Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋Ｃａｓ９標的部位を標的とするための相同アームを有するドナーＤＮＡ（配列番号４９）、またはＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよびＣａｓ１２ａ標的部位を標的とするための相同アームを有するドナーＤＮＡ（配列番号５７）のいずれかで形質移入したＴ細胞集団を、実施例１に記載されるように、ノックアウト対照と一緒にフローサイトメトリーによって分析した（図１５）。ドナーフラグメントが不在の、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰで形質移入した細胞集団の約３２％、およびドナーフラグメントが不在の、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入した細胞集団（「ＴＲＡＣ ＫＯ」）の約２２％のみがＴＣＲを発現した。比較すると、図１５の最も左側のパネルに示される本質的に全ての非改変活性化Ｔ細胞（活性化Ｔ細胞「ＡＴＣ」）が、ＴＣＲを発現した。予想されるように、ドナーＤＮＡを受けなかったいずれの細胞も、抗ＣＤ３８構築物について陽性でなかった（図１５、第２および第３のパネル）。一方、Ｃａｓ９ ＲＮＰまたはＣａｓ１２ａ ＲＮＰに加えて抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入したかなりのパーセンテージの細胞集団が、ＤＡＲ構築物の発現を実証した：Ｃａｓ９ ＲＮＰと共に抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入した集団の約５４％（図１５、第４のパネル）が抗ＣＤ３８ ＤＡＲを発現し、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰと共に抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入した細胞集団の約７７％（図１５、第５のパネル）が抗ＣＤ３８ ＤＡＲを発現した。
ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１のＣａｓ９標的部位中への抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の挿入、およびＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１のＣａｓ１２ａ標的部位中への抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の挿入の双方を、形質移入した双方の細胞集団から単離したゲノムＤＮＡに対して実行するＰＣＲおよび接合フラグメントの配列決定によって確認した。Ｃａｓ９媒介挿入について、５’相同アーム領域のＰＣＲは、フォワードプライマーとして配列番号７２を、そしてリバースプライマーとして配列番号７３を使用した。３’相同アーム領域のＰＣＲは、フォワードプライマーとして配列番号７４を、そしてリバースプライマーとして配列番号７５を使用した。結果として生じたＰＣＲフラグメントの配列決定により、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物が、標的化されたＣａｓ９標的部位内に挿入されていることが実証された。Ｃａｓ１２ａ媒介挿入について、５’相同アーム領域のＰＣＲは、フォワードプライマーとして配列番号７６を、そしてリバースプライマーとして配列番号７７を使用した。３’相同アーム領域のＰＣＲは、フォワードプライマーとして配列番号７８を、そしてリバースプライマーとして配列番号７９を使用した。結果として生じたＰＣＲフラグメントの配列決定により、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物が、標的化されたＣａｓ１２ａ標的部位内に挿入されていることが実証された。
ＲＰＭＩ８２２６細胞と共培養した形質移入集団による細胞毒性アッセイの結果を図１６に示し、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａシステムのいずれかを使用することによってＤＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞が、予想される生理学的挙動を有することが実証された。Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡ（配列番号４９）、そしてＣａｓ１２ａ ＲＮＰ＋抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡ（配列番号５７）で形質移入した細胞が双方とも、ＲＰＭＩ８８２２６細胞の特異的死滅を示し、これは、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入していないが、ＴＣＲ遺伝子がノックアウトされた対照集団の特異的死滅と実質的に同一であり、そしてこれよりも劇的に高かった。
実施例８．オフターゲット変異の分析。
本明細書中で提供されるＲＮＰおよびドナーフラグメントによる培養物の形質移入に起因するオフサイト変異の頻度を求めるために、実施例７に記載されるように、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするｃａｓ９ ＲＮＰ、ならびに修飾されたプライマー（配列番号１８および配列番号１９）により合成された１７１ｂｐおよび１６１ｂｐのＨＡを有する二本鎖抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡによるＰＢＭＣの形質移入由来の細胞から単離したＤＮＡを配列決定した。
ゲノムＤＮＡを、製造者の説明書に従って、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ ５１１０４）によりＴ細胞から抽出した。手短に言うと、２００μＬ ＰＢＳ中の合計５×１０６個の細胞を、２０μＬ ＱＩＡＧＥＮ Ｐｒｏｔｅａｓｅおよび２００μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬに加えて、５６℃にて１０分間インキュベートした。ゲノムＤＮＡをエタノールによって沈殿させて、ミニカラムから溶出した。ゲノムＤＮＡの濃度を、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｑｕｂｉｔ ４ Ｆｌｕｒｏｍｅｔｅｒによって求めた。
ＤＮＡサンプルの全ゲノムシーケンシングを、Ｎｏｖａｇｅｎｅ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）によって実行した。結果を、図１７および表２に要約する。合計４個のインデルが検出された。検出されたインデルはいずれも、遺伝子のコーディング領域内にあると見出されず、２つのオフサイト変異が遺伝子間領域内に見出され、そして２つのオフサイト変異がイントロン内に存在する。
Figure 2022524435000003
実施例９．Ｃａｓ１２ａによる、ＴＩＭ３遺伝子座中への抗ＣＤ３８二量体抗体受容体（ＤＡＲ）構築物の、標的化された挿入。
更なる実験において、同時に、Ｔ細胞疲弊において役割を果たし得るＴｉｍ－３遺伝子をノックアウトし、かつＣａｓ１２ａを使用して抗ＣＤ３８ ＤＡＲをノックインするために、Ｔｉｍ－３遺伝子座に由来する隣接配列間に抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物をクローニングした。ＴＩＭ３遺伝子座に由来し、かつＣａｓ１２ａ ＰＡＭ配列の直ぐ下流にあるＣａｓ１２ａ標的部位（配列番号６０）の両側に存在するＤＮＡ配列（５’フランキング配列、配列番号５８；３’フランキング配列、配列番号５９）の間に、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物（配列番号４８）をクローニングした。クローニングされたＤＡＲ構築物＋フランキング配列を、フォワードプライマー５’－ｐ－ＴＧＧＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号６０）、および、５’末端から１番目、２番目、そして３番目のヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル基を含み、そして５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオチド間にＰＳ結合を有するように修飾されたリバースプライマー：ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＡ＊ＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＡＣ（配列番号６１）を使用するＰＣＲ反応用の鋳型として使用して、リバースプライマー（配列番号６１）の修飾を一方の鎖の５’末端中に組み込んだドナーＤＮＡ分子（配列番号６２）を生成した。
Ｃａｓ１２ａ形質移入において、Ｃａｓ１２ａタンパク質をＡｌｔＲ ｃｒＲＮＡと複合体形成し、そしてｔｒａｃｒ ＲＮＡを使用しないことを除いて、実施例１で実行したようにＴ細胞の形質移入を行った。ドナーフラグメントを、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰと共にエレクトロポレーションした。また、対照として、ドナーＤＮＡが不在のＲＮＰで形質移入を行った（ＴＲＡＣノックアウト対照）。
Ｔｉｍ－３遺伝子座を標的とするＤＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞集団のフローサイトメトリー分析の結果を、図１８に示す。対照として含めた非形質転換活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）は、Ｔｉｍ－３遺伝子の発現を、形質移入細胞の約８４％実証した一方、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を発現しなかった。ノックアウト／ノックイン細胞について、集団の約１７％がＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を発現した一方、Ｔｉｍ－３遺伝子産物を発現しなかった。
実施例１０．Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａを使用した、ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子の第２の部位のノックアウトを伴う、ＴＲＡＣ遺伝子座中への抗ＣＤ３８二量体抗体受容体（ＤＡＲ）構築物の、標的化された挿入
Ｔ細胞による顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の放出は、サイトカイン放出症候群および神経毒性に寄与し得、これはＣＡＲ－Ｔ療法の治療上の利益を制限する虞がある（Ｓｔｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｂｌｏｏｄ １３２：９６１）。Ｔ細胞受容体の代わりに抗ＣＤ３８ ＤＡＲを発現し、かつＧＭ－ＣＳＦの発現が引き下げられているＴ細胞の集団を提供するために、本発明者らは、同じ細胞集団において、１）内因性Ｔ細胞受容体遺伝子をノックアウトし、かつ抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を（ＴＲＡＣ遺伝子座にて）ノックインし、そしてまた、２）ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子をノックアウトすることを試みた。
実施例７に記載される抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物をＰＣＲ用の鋳型として使用して、ＴＲＡＣノックアウトおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲ発現用のドナーフラグメントを生成した。この構築物は、ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ならびに４－１ＢＢ細胞質ドメインおよびＣＤ３ζ細胞質ドメインに続いて、２Ａペプチドを有する重鎖ポリペプチド配列、次いで軽鎖ポリペプチド配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されたＪｅＴプロモータ（配列番号３）を含み、そしてまた、ＤＡＲコーディング配列の３’末端にＳＶ４０ポリＡ付加配列を含んだ（配列番号４８として提供される抗ＣＤ３８ ＤＡＲコーディングアセンブリ）。これを、プラスミドベクターｐＡＡＶ－ＭＣＳ中で、６６０ｂｐ（配列番号４４）と６５０ｂｐ（配列番号４５）のＴＲＡＣ遺伝子座相同アーム間にクローニングした。プライマーの５’末端からナンバリングした場合に、１番目と２番目、３番目と４番目、そして４番目と５番目のヌクレオチド間に３つのＰＳ結合を、そしてヌクレオチド３、４、および５に３つの２’－Ｏ－メチル修飾を含むフォワードプライマー（配列番号１８）、および５’末端ホスファートを含むリバースプライマー（配列番号１９）（表１）を使用する、実施例７に記載されるＰＣＲによって、形質移入実験に使用するためのドナーフラグメントを合成した。結果として生じたＰＣＲ産物（配列番号４９）は、抗ＣＤ３８ ＤＡＲコーディング構築物（配列番号４８）に隣接する約１７０ｂｐおよび１６０ｂｐの相同アーム（配列番号２０および配列番号２１）を含み、そして配列番号１８のプライマー修飾が、第１の鎖および５’末端ホスファート中に組み込まれていたが、導入された化学修飾が、逆鎖、すなわち第２の鎖に加えられていなかった。
ＴＲＡＣ遺伝子座をノックアウトするためのガイドＲＮＡは、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）ｃａｓ９タンパク質に使用するために操作された２つのＲＮＡ：配列番号１の標的配列を含むＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡからなっており、これらは双方とも、Ｓｐｃａｓ９に使用するために操作し、かつＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成した「ＡｌｔＲ」ＲＮＡであった。
ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子座をノックアウトするために、ヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子に特異的なＣａｓ１２ａガイド（標的配列ＴＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧ、配列番号８０）を使用した。Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼに使用するために設計したｃｒＲＮＡを、ＩＤＴによって合成した。
ゲノムを２つの異なる部位にて改変するために、２つのＲＮＰを生成した。第１のＲＮＰは、Ｃａｓ９タンパク質を、ハイブリダイズしたＴＲＡＣ遺伝子座ガイドｃｒＲＮＡ（標的配列、配列番号１を有する）およびＣａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡとインキュベートすることによって形成されたＣａｓ９ ＲＮＰであった。Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーション、ならびにそれに続くＣａｓ９タンパク質の、ＴＲＡＣ遺伝子のハイブリダイズしたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ標的化エクソン１とのインキュベーションを、実施例１に記載されるように実行した。第２のＲＮＰは、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰであり、（タンパク質ＩＤＴのＮ末端領域およびＣ末端領域のそれぞれにＮＬＳを含む）Ｃａｓ１２ａタンパク質をＧＭ－ＣＳＦ標的化ｃｒＲＮＡ（標的配列、配列番号８０を有する）と同様にインキュベートすることによって（４℃にて３０分のインキュベーション）形成された。
抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物のノックインによるＴＣＲ受容体遺伝子のノックアウト、およびＧＭ－ＣＳＦ遺伝子のノックアウトのためのＴ細胞の単回形質移入を実行した。これは、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡおよびＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰとアセンブルしたＣａｓ９ ＲＮＰを、ＴＲＡＣ遺伝子中への挿入用のＨＡを有するドナーフラグメントと共に使用した。形質移入は、実施例１に記載されるのと同じ条件を用いたエレクトロポレーションによるものであった。
実施例７に記載されるプライマー配列番号１８および配列番号１９のヌクレオチド修飾を有する配列番号４８の配列を有する二本鎖の化学修飾されたドナーフラグメントを使用して、細胞をＲＮＰと共に形質移入した。二本鎖ドナーフラグメントは、１７１ｂｐおよび１６１ｂｐのＨＡを有していた。
３つのＴ細胞集団を生成した。最初の形質移入では、活性化Ｔ細胞を、ＴＲＡＣ遺伝子標的化Ｃａｓ９ ＲＮＰ、および抗ＣＤ３８ ＤＡＲをコードし、かつＴＲＡＣ ＨＡを有する二本鎖ドナーフラグメントで形質移入した。第２の形質移入は、ＴＲＡＣ遺伝子標的化Ｃａｓ９ ＲＮＰ、抗ＣＤ３８ ＤＡＲをコードし、かつＴＲＡＣ ＨＡを有する二本鎖ドナーフラグメント、および追加的にＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰを含んでいた。最後に、対照として、活性化Ｔ細胞を、ドナーフラグメントが不在のＴＲＡＣ特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰで形質移入した。これにより、ＤＡＲ構築物挿入のない、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。エレクトロポレーションを、実施例１に詳述されるように実行し、それぞれの場合において、３つの集団について、１）ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ドナーフラグメント、２）ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ドナーフラグメントに加えて、ＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰ；ならびに３）ＴＲＡＣノックアウトのみの対照については、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰのみをそれぞれ含む単一のエレクトロポレーションを実行した。
ＴＲＡＣ遺伝子座中に異なる構築物を導入する効率を評価するために、本質的に実施例１に記載されるようにフローサイトメトリーを実行し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，８８－８８２４－００）を使用して細胞内ＧＭ－ＣＳＦを検出して、ＰＥ－ＧＭ－ＣＳＦ抗体［ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，５０２３０６］で染色した。ＣＤ３（Ｔ細胞受容体）を抗ＣＤ３－ＢＶ４２１抗体ＳＫ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で検出し、そして抗ＣＤ３８ ＤＡＲ発現をＰＥコンジュゲート抗ＣＤ３８－Ｆｃタンパク質（Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｌｓｔｏｎ，ＭＡ）で検出した。
培養物を刺激してＧＭ－ＣＳＦ発現を誘導した場合、培養物を、ＤＭＳＯ中にホルボール－１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ、４０．５μＭ）、イオノマイシン（６６９．３μＭ）、およびブレフェルジンＡ（２．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＣｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４２３３０４）で６時間処理した。
図１９は、パネルＡおよびパネルＢにおいて、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナー構築物で形質移入したＴ細胞の約２％のみが、ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激しない場合にＧＭ－ＣＳＦを発現するが、これらの薬物により形質移入細胞を刺激すると、細胞の約５３％がＧＭ－ＣＳＦを産生することを示している。一方、パネルＣに見られるように、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナー構築物に加えてＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰで形質移入したＴ細胞の約２９％のみが、刺激直後にＧＭ－ＣＳＦを産生し、この場合、第２の遺伝子の同時ノックアウトが、４５％（５２．７８－２９．０７／５２．７８）と推定される頻度にて起こることの証拠である。
同じ細胞集団を、図１９のパネルＥ～Ｇにおいて、Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３８ ＤＡＲの発現について分析した。パネルＤは、抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントが不在のＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した場合、細胞のほぼ８０％（７８．５７％）がＴ細胞受容体を発現せず、そして予想されるように、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の発現は検出されなかったことを示す。対照的に、細胞を抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントと共にＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した場合、細胞集団のおよそ７０％が、天然Ｔ細胞受容体の発現の不在下で抗ＣＤ３８ ＤＡＲの発現を示した（パネルＥ）。最後に、第２の遺伝子標的化ＲＮＰ（ＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰ）の追加は、ＴＣＲノックアウト／ノックイン率を劇的に低下させず、ＲＮＰ（抗ＴＲＡＣおよび抗ＧＭ－ＣＳＦ）＋抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の双方で形質移入した細胞の約５０％が抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を発現した一方、内因性Ｔ細胞受容体を発現することはできなかった（パネルＦ）。これらの培養物では、高い割合（約４５％）の集団が、形質移入への抗ＧＭ－ＣＳＦ ＲＮＰの包含に起因するＧＭ－ＣＳＦノックアウトであると算出される。
実施例１１．Ｃａｓ１２ａを使用した、ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子の第２の部位のノックアウトを伴う、ＴＲＡＣ遺伝子座中への抗ＣＤ３８二量体抗体受容体（ＤＡＲ）構築物の、標的化された挿入
また、それぞれが異なるガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む２つのＣａｓ１２ａ ＲＮＰを使用して、抗ＣＤ３８ ＤＡＲの、ＴＲＡＣ遺伝子座中への二重ノックアウトおよび付随するノックインを試みた。
プライマーの５’末端からナンバリングした場合に、１番目と２番目、３番目と４番目、そして４番目と５番目のヌクレオチド間に３つのＰＳ結合を、そしてヌクレオチド３、４、および５に３つの２’－Ｏ－メチル修飾を含むフォワードプライマー（配列番号１８）、および５’末端ホスファートを含むリバースプライマー（配列番号１９）（表１）を使用して、抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントを、先の実施例７および実施例１０に記載されるように生成した。結果として生じたＰＣＲ産物（配列番号４９）は、抗ＣＤ３８ ＤＡＲコーディング構築物（配列番号４８）に隣接する約１７０ｂｐおよび１６０ｂｐの相同アーム（配列番号２０および配列番号２１）を含み、そして配列番号１８のプライマー修飾が、第１の鎖および５’末端ホスファート中に組み込まれていたが、導入された化学修飾が、逆鎖、すなわち第２の鎖に加えられていなかった。
ＴＲＡＣ遺伝子座をノックアウトするためのガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするためにＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）について操作したｃｒＲＮＡであり、配列番号２６の標的配列を含んでいた。ＴＲＡＣ遺伝子をノックアウトするためのガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするためにＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）について操作したｃｒＲＮＡであり、配列番号５２の標的配列を含んでいた。ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子をノックアウトするためのガイドＲＮＡは、配列番号８０の標的配列を含むＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）について操作したｃｒＲＮＡであった。双方のＣａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡを、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成した。
タンパク質（ＩＤＴ）のＮ末端領域およびＣ末端領域のそれぞれにＮＬＳを含むＣａｓ１２ａタンパク質により、２つのＲＮＰを生成した。Ｃａｓ１２ａタンパク質を、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とし、かつ配列番号５２の標的配列を有するｃｒＲＮＡと共にインキュベート（４℃にて３０分のインキュベーション）することによって、第１のＲＮＰを形成した。第２のＲＮＰを、同様に、Ｃａｓ１２ａタンパク質をＧＭ－ＣＳＦ標的化ｃｒＲＮＡ（標的配列、配列番号８０を有する）とインキュベートすることによって形成した。
抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物のノックインによるＴＣＲ受容体遺伝子のノックアウト、およびＧＭ－ＣＳＦ遺伝子のノックアウトのためのＴ細胞の単回形質移入を実行した。これは、２つのアセンブルしたＣａｓ１２ａ ＲＮＰを、ＴＲＡＣ遺伝子中への挿入用のＨＡを有するドナーフラグメントと共に使用した。形質移入は、実施例１に記載されるのと同じ条件を用いたエレクトロポレーションによるものであった。
実施例７に記載されるプライマー配列番号１８および配列番号１９のヌクレオチド修飾を有する配列番号４８の配列を有する二本鎖の化学修飾されたドナーフラグメントを使用して、細胞をＲＮＰと共に形質移入した。二本鎖ドナーフラグメントは、１７１ｂｐおよび１６１ｂｐのＨＡを有していた。
ＴＲＡＣ遺伝子座中に異なる構築物を導入する効率を評価するために、本質的に実施例１０に記載されるようにフローサイトメトリーを実行し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，８８－８８２４－００）を使用して細胞内ＧＭ－ＣＳＦを検出して、ＰＥ－ＧＭ－ＣＳＦ抗体［ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，５０２３０６］で染色した。ＣＤ３（Ｔ細胞受容体）を抗ＣＤ３－ＢＶ４２１抗体ＳＫ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で検出し、そして抗ＣＤ３８ ＤＡＲ発現をＰＥコンジュゲート抗ＣＤ３８－Ｆｃタンパク質（Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｌｓｔｏｎ，ＭＡ）で検出した。
図１９は、パネルＡおよびパネルＢにおいて、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナー構築物で形質移入したＴ細胞の約２％のみが、刺激しない場合にＧＭ－ＣＳＦを発現するが、これらの薬物により形質移入細胞を刺激すると、細胞の約５３％がＧＭ－ＣＳＦを産生することを示している。一方、パネルＤに見られるように、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナー構築物に加えてＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰで形質移入したＴ細胞の約１５％のみが、刺激直後にＧＭ－ＣＳＦを産生し、この場合、第２の遺伝子の同時ノックアウトが、７２％（５２．７８－１４．９／５２．７８）と推定される頻度にて起こることの証拠である。
同じ細胞集団を、図１９のパネルＨにおいて、Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３８ ＤＡＲの発現について分析した。パネルＥは、抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントが不在のＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した場合、細胞のほぼ８０％（７８．５７％）がＴ細胞受容体を発現せず、そして予想されるように、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の発現は検出されなかったことを示す。対照的に、細胞を抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントと共にＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した場合、細胞集団のおよそ７０％が、天然Ｔ細胞受容体の発現の不在下で抗ＣＤ３８ ＤＡＲの発現を示した（パネルＦ）。最後に、第２の遺伝子標的化ＲＮＰ（ＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰ）の追加は、ＴＣＲノックアウト／ノックイン率を劇的に低下させず、ＲＮＰ（抗ＴＲＡＣおよび抗ＧＭ－ＣＳＦ）＋抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の双方で形質移入した細胞の約６０％が抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を発現した一方、内因性Ｔ細胞受容体を発現することはできなかった（パネルＨ）。これらの培養物では、高い割合（約４９％）の集団が、形質移入への抗ＧＭ－ＣＳＦ ＲＮＰの包含に起因するＧＭ－ＣＳＦノックアウトであると算出される。
実施例１２．Ｃａｓ１２ａを使用した、ＴＲＡＣ遺伝子中への抗ＣＤ２０二量体抗体受容体（ＤＡＲ）構築物の、標的化された挿入。
また、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子を、ドナーＤＮＡとしての抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物で標的とした。抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物（配列番号８１）は、単一のオープンリーディングフレームから２つのポリペプチドを生成するのに使用した「自己切断」２Ａ配列によって連結された２つのポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいた。第１のコードポリペプチドは、重鎖可変領域（ＶＨ）および第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ならびに４－１ＢＢ、およびＣＤ３ζの第３のＩＴＡＭの細胞質ドメインを含む重鎖ポリペプチドであった。これに、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルスＴ２Ａペプチドコーディング配列（配列番号４６）、次いで、第２のポリペプチドをコードする配列が続き、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に進んで、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）＋定常領域（カッパ）を含んでいた。重鎖ポリペプチド配列、２Ａペプチド、および軽鎖配列をコードする核酸配列を、ＤＡＲコーディング配列の５’末端にてＪｅＴプロモータ（配列番号３）に、そしてＤＡＲコーディング配列の３’末端にてＳＶ４０ポリＡ付加配列（配列番号４７）に作動可能に連結した。抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物全体（ヒンジ、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤ３ζに続くＴ２Ａの細胞質ドメイン、軽鎖を有するＪｅＴプロモータ重鎖コーディング配列、ならびにＳＶ４０配列（配列番号４８））を、ｐＡＡＶベクター中の６４５ｂｐ（配列番号５０）と６００ｂｐ（配列番号５１）の相同アーム間にクローニングした。相同アーム（ＨＡ）は、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内の標的配列（配列番号５２）の両側のＴＲＡＣエクソン１遺伝子座の配列であった。
形質移入実験に使用するドナーフラグメントを、隣接するＴＲＡＣ ＨＡを含むｐＡＡＶ抗ＣＤ２０ ＤＡＲベクター構築物を使用して、実施例１に記載されるＰＣＲによって合成した。使用したプライマーは、５’リン酸化された配列番号８２（フォワードプライマー）、およびプライマーの最も５’側の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を、そしてプライマーの５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオチド間にホスホロチオアート結合を含む配列番号５４（リバースプライマー）であった（表１）。これらのプライマーは、ベクター構築物中の６４５ｂｐおよび６００ｂｐの相同アーム内でハイブリダイズして、ＤＡＲ構築物に隣接する１９２ｂｐおよび１５９ｂｐの相同アームを有するフラグメントを生成した。結果として生じたＰＣＲ産物、二本鎖抗ＣＤ２０ ＤＡＲドナーＤＮＡフラグメント（配列番号８３）は、サイズが２．８ｋｂであり、２．４５７ｋｂ抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物（配列番号８１）、１９２ｂｐ相同アーム（配列番号５５）、および１５９ｂｐ相同アーム（配列番号５６）（抗ＣＤ２０ ＤＡＲコーディング構築物（配列番号８１）に隣接する）を含み、リバースプライマー（配列番号５４）の２’－Ｏ－メチルおよびＰＳ修飾、ならびにフォワードプライマー（配列番号８２）の５’末端ホスファートがドナーＤＮＡ分子中に組み込まれていた。配列番号５４のプライマー修飾は、第１の鎖中に組み込まれたが、プライマーの５’末端ホスファートを含む逆鎖、または第２の鎖中には化学修飾は導入されなかった。ドナー分子を使用して、活性化Ｔ細胞を、標的配列（配列番号５２）を含むｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）と複合体形成したＣａｓ１２ａタンパク質と共に二本鎖分子として形質移入した。
ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子のＲＮＡガイド指向性標的化のために、ｃｒＲＮＡ（ＡＬＴ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡ）をＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。ここで、ｃｒＲＮＡを、ＴＲＡＣ遺伝子の第１のエクソン中のＣａｓ１２ａ ＰＡＭ配列（ＴＴＴＡ）の直ぐ下流に存在する標的配列（配列番号５２）を含むように設計した。
Ｃａｓ１２ａおよびガイドＲＮＡ ＲＮＰの形成を、本質的に実施例７に記載されるように実行した。また、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰおよび二本鎖ドナーＤＮＡの、Ｔ細胞中へのエレクトロポレーションを、本質的に実施例７に従って実行した。対照として、１つのＴ細胞集団を、ドナーフラグメントなしのＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入し、これをＴＲＡＣノックアウト（ＫＯ）対照と称した。形質移入後、Ｔ細胞を、増殖用の完全細胞培養培地に移した。
１０日後、ＣＤ２０ ＤＡＲ発現を抗リツキシマブ抗体（Ａｃｒｏ）によって検出したことを除いて、実施例１に記載されるように、ＴＲＡＣノックアウト対照集団と共に、培養物をフローサイトメトリーによって分析した（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。ドナーフラグメントが不在の、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入した細胞集団（「ＴＲＡＣ ＫＯ」）の約１６．６％のみがＴＣＲを発現した。ＣＤ２０ ＤＡＲドナーフラグメント（「ＣＤ２０ ＤＡＲ－Ｔ」）と共にＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入した細胞集団のさらに小さいパーセンテージ、約３．５％が、ＴＣＲを発現した。予想されるように、ドナーＤＮＡを受けなかったいずれの細胞も、抗ＣＤ２０構築物について陽性でなかった（図２０Ａ）。一方、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰと共に抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入した集団（図２０Ｂ）の２８．７％が、抗ＣＤ２０ ＤＡＲを発現した一方、ＴＣＲを発現しなかった。
抗ＣＤ２０ ＤＡＲ細胞を、標的としてのＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞と２日間インキュベートしたことを除いて、本質的に実施例１と同様に実行した細胞毒性アッセイで細胞を試験した。図２１は、死滅のレベルが非常に高く、０．６２５：１～５：１に及ぶエフェクタ：標的比について９０％に近づき、０．１６：１の最も低いエフェクタ：標的比でも約７０％であったことを示している。図２２は、抗ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞によって刺激された場合に、高レベルのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）およびＧＭ－ＣＳＦを分泌したことを実証している。また、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカインの分泌（実施例４参照）を示している。
実施例１３．Ｃａｓ１２ａを使用した、ＴＲＡＣ遺伝子およびＣＤ７遺伝子中への抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物の、標的化された挿入。
また、抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物を、Ｃａｓ１２ａを使用してＴＲＡＣ遺伝子中に挿入した。ＣＡＲコーディング配列の５’末端にＪｅＴプロモータ（配列番号３）を、そしてＣＡＲコーディング配列の３’末端にＳＶ４０ポリＡ付加配列（配列番号４７）を含む抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物（配列番号８４）を、ｐＡＡＶベクター中の６４５ｂｐ（配列番号５０）と６００ｂｐ（配列番号５１）の相同アーム間にクローニングした。相同アームは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内の標的配列（配列番号５２）の両側のＴＲＡＣエクソン１遺伝子座の配列であった。
形質移入実験に使用するドナーフラグメントを、実施例１に記載されるＰＣＲによって合成した。使用したプライマーは、５’リン酸化された配列番号８２（フォワードプライマー）、およびプライマーの最も５’側の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を、そしてプライマーの５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオチド間にホスホロチオアート結合を含む配列番号５４（リバースプライマー）であった（表１）。これらのプライマーは、ベクター構築物中の６４５ｂｐおよび６００ｂｐの相同アーム内でハイブリダイズして、ＤＡＲ構築物に隣接する１９２ｂｐおよび１５９ｂｐの相同アームを有する構築物を生成した。結果として生じたＰＣＲ産物、二本鎖抗ＣＥＡ ＣＡＲドナーＤＮＡフラグメント（配列番号８５）は、サイズが２．４ｋｂであり、２．０７７ｋｂの抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物（配列番号８４）、１９２ｂｐの相同アーム（配列番号５５）、および１５９ｂｐの相同アーム（配列番号５６）（抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物に隣接する）を含み、リバースプライマー（配列番号５４）の２’－Ｏ－メチルおよびＰＳ修飾、ならびにフォワードプライマー（配列番号８２）の５’末端ホスファートがドナーＤＮＡ分子中に組み込まれていた。配列番号５４のプライマー修飾は、二本鎖ドナーＤＮＡの第１の鎖中に組み込まれたが、プライマーの５’末端ホスファートを含む逆鎖、または第２の鎖中には化学修飾は導入されなかった。ドナー分子を使用して、活性化Ｔ細胞を、標的配列（配列番号５２）を含むｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）と複合体形成したＣａｓ１２ａタンパク質と共に二本鎖分子として形質移入した。
ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子のＲＮＡガイド指向性標的化のために、ｃｒＲＮＡ（ＡＬＴ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡ（ＡＬＴ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡ）をＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。ここで、ｃｒＲＮＡを、ＴＲＡＣ遺伝子の第１のエクソン中のＣａｓ１２ａ ＰＡＭ配列（ＴＴＴＡ）の直ぐ下流に存在する標的配列（配列番号５２）を含むように設計した。
Ｃａｓ１２ａおよびガイドＲＮＡ ＲＮＰの形成、ならびにＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよび二本鎖ドナーＤＮＡの、Ｔ細胞中へのエレクトロポレーションを、本質的に実施例７に従って実行した。対照として、１つのＴ細胞集団を、ドナーフラグメントなしのＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質転換し、これをＴＲＡＣノックアウト（ＫＯ）対照と称した。
別の実験において、同じ抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物を、Ｃａｓ１２ａを使用してＣＤ７遺伝子中に挿入した。この場合の抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物（配列番号８４）を、ｐＡＡＶベクター中のＣＤ７標的部位（配列番号８６）を取り囲む配列を含む相同アーム間にクローニングした。
ＣＤ７遺伝子中の標的部位を選択するために、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列の上流の２つの潜在的部位を調査した。これらは各々、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）用のオンラインガイド分析ツールを使用して、ノックアウトの達成について高いスコアを受けた。第１の標的部位（配列番号８６）を使用して、ＲＮＡガイド「ｃｒＲＮＡ－１」を設計した。この標的配列は、ヒトゲノムにおいて、標的化されたＣＤ７遺伝子座の外側に１つの部位マッチのみを有し、ゲノム中の追加の部位は、エクソン内にはなかった。ＣＤ７遺伝子において、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ部位の上流にあると識別された第２の標的配列（配列番号８７）を使用して、ガイドＲＮＡ「ｃｒＲＮＡ－２」を設計した。この部位は、ヒトゲノム中に１０３個のマッチング配列を有し、そのうち５個がエクソン内に存在した。興味深いことに、２つのガイドおよびフローサイトメトリー分析を使用したノックアウト実験（エレクトロポレーションにドナーを含めていない）は、ガイドとしてｃｒＲＮＡ－２を使用すると、形質移入された集団の約８０％がＣＤ７発現を喪失するが、ガイドとしてｃｒＲＮＡ－１を使用すると、形質移入された集団の約９６％がＣＤ７発現を喪失することを示した。したがって、標的配列（配列番号８６）に向けられるｃｒＲＮＡ－１ガイドＲＮＡを、ＣＤ７遺伝子中でのノックアウト／ノックインについて選択した。
ＣＤ７遺伝子座中への挿入用ドナーフラグメントを、実施例１に記載されるＰＣＲによって合成した。使用したプライマーは、プライマーの５’末端から１番目、３番目、および４番目のヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を、そして５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオチド間にホスホロチオアート結合を含む配列番号８８（フォワードプライマー）、ならびに５’リン酸化された配列番号８９（リバースプライマー）であった（表１）。これらのプライマーは、ＣＤ７標的部位（配列番号８６）に隣接する拡張相同アームが隣接する抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物（配列番号８４）を含むベクター構築物中の相同アーム内にハイブリダイズして、ＣＡＲ構築物に隣接する２１２ｂｐ（配列番号９０）および１７０ｂｐ（配列番号９１）の相同アームを有するドナーフラグメントを生成した。結果として生じたＰＣＲ産物、二本鎖抗ＣＥＡ ＣＡＲドナーＤＮＡフラグメント（配列番号９２）は、サイズが２．４６ｋｂであり、２．０７７ｋｂの抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物（配列番号８４）、２１２ｂｐの相同アーム（配列番号９０）、および１７０ｂｐの相同アーム（配列番号９１）を含み、フォワードプライマー（配列番号８８）の２’－Ｏ－メチルおよびＰＳ修飾、ならびにリバースプライマー（配列番号８９）の５’末端ホスファートがドナーＤＮＡ分子中に組み込まれていた。配列番号８８のプライマー修飾は、第１の鎖中に組み込まれたが、プライマーの５’末端ホスファートを含む逆鎖、または第２の鎖中には化学修飾は導入されなかった。ドナーＤＮＡを使用して、活性化Ｔ細胞を、標的配列（配列番号８７）を含むｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）と複合体形成したＣａｓ１２ａタンパク質と共に二本鎖分子として形質移入した。
ＣＤ７遺伝子のＲＮＡガイド指向性標的化のために、ｃｒＲＮＡ（ＡＬＴ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡ）をＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。ここで、ｃｒＲＮＡを、ＴＲＡＣ遺伝子の第１のエクソン中のＣａｓ１２ａ ＰＡＭ配列（ＴＴＴＡ）の直ぐ下流に存在する標的配列（配列番号８６）を含むように設計した。
Ｃａｓ１２ａおよびガイドＲＮＡ ＲＮＰの形成、ならびにＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよび二本鎖ドナーＤＮＡの、Ｔ細胞中へのエレクトロポレーションを、本質的に実施例７に従って実行した。対照として、１つのＴ細胞集団を、ドナーフラグメントなしのＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質転換し、これをＴＲＡＣノックアウト（ＫＯ）対照と称した。
形質移入した培養物を、上記のようにＴＲＡＣノックアウト対照集団と共にフローサイトメトリーによって分析した（図２３Ａ～図２３Ｄ）。図２３Ａは、ドナーＤＮＡで形質移入していない細胞ではＣＥＡ ＣＡＲの発現が検出されなかったが、ＴＲＡＣガイド－ＲＮＰでエレクトロポレーションした集団の８９％がＴＲＡＣ遺伝子の発現を失った（ノックアウト）ことを示している。しかしながら、ドナーをエレクトロポレーションに含めた場合、集団の約２８．７％が、ＴＣＲを発現することができなかった一方、抗ＣＥＡ ＣＡＲを発現した（図２３Ｂ）。抗ＣＥＡ ＣＡＲドナーおよびＣａｓ１２ａ ＲＮＰによるＣＤ７遺伝子座の標的化は、さらに効率的であった：集団の約３８％が、ノックイン／ノックアウト細胞（ＣＤ７発現の不在下での抗ＣＥＡ ＣＡＲの発現）であった（図２３Ｄ）。図２３Ｃは、ＣＤ７遺伝子座が標的とされなかった細胞（細胞を、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入した）におけるＣＤ７発現の比較の基礎となる。この集団では、ＣＤ７遺伝子座がＲＮＰで標的とされた集団の約８％のみと比較して、細胞集団の約６５％がＣＤ７を発現した（図２３Ｄ）。
ＣＥＡ陽性ＬＳ１７４Ｔ細胞を標的として使用して本質的に実施例１と同様に実行した細胞毒性アッセイで、細胞を試験した。図２４は、予想されるように、抗ＣＥＡ ＣＡＲを発現しなかったＴＲＡＣノックアウト細胞が、標的を死滅させなかったことを示す。一方、ＴＲＡＣ遺伝子座での抗ＣＥＡ ＣＡＲのＣａｓ１２ａ媒介ノックインは、エフェクタ：標的比に依存する細胞毒性をもたらし、２．５：１を超えるエフェクタ：標的比にて６０％の死滅レベルに達した。興味深いことに、ＣＤ７遺伝子座での抗ＣＥＡ ＣＡＲノックインは、とりわけ、低い標的：エフェクタ比にて、ＴＲＡＣ遺伝子座でのノックインよりも、標的を死滅させるのにはるかに効果的であり、０．６２５：１の最も低い標的対エフェクタ比でも約８０％の死滅を実証した。
図２５は、Ｃａｓ１２ａ媒介抗ＣＥＡ ＣＡＲノックイン／ＣＤ７ノックアウトＴ細胞および抗ＣＥＡ ＣＡＲノックイン／ＴＲＡＣノックアウトＴ細胞の双方が、インターフェロンガンマを分泌し、ＣＤ７ノックアウト／抗ＣＥＡ ＣＡＲノックインＴ細胞が、ＴＲＡＣノックアウト／抗ＣＥＡ ＣＡＲノックインＴ細胞よりも幾分少ないインターフェロンガンマを分泌したことを示している。
配列
配列番号１
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
ＴＲＡＣ遺伝子中の標的配列（エクソン１）
Figure 2022524435000004
 配列番号２
ＤＮＡ
人工
ＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物：ＪｅＴプロモータと、それに続くＣＤ８ａリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列と、それに続く抗ＣＤ３８ ＣＡＲ（ヒトＣＤ３８に特異的な一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））と、それに続くＣＤ２８ヒンジ膜貫通細胞内領域およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメインとを含む
Figure 2022524435000005
Figure 2022524435000006
 配列番号３
ＤＮＡ
人工
Ｊｅｔプロモータ
Figure 2022524435000007
 配列番号４
ＤＮＡ
人工
相同アームを有する抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲカセット
Figure 2022524435000008
Figure 2022524435000009
 配列番号５
ＤＮＡ
人工
ｐＡＡＶ－ＭＣＳベクター中の抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ相同アームインサートによりクローンを配列決定するためのプライマー
Figure 2022524435000010
 配列番号６
ＤＮＡ
人工
ｐＡＡＶ－ＭＣＳベクター中の抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ相同アームインサートによりクローンを配列決定するためのプライマー
Figure 2022524435000011
 配列番号７
ＤＮＡ
人工
ｐＡＡＶ－ＭＣＳベクター中の抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ相同アームインサートによりクローンを配列決定するためのプライマー
Figure 2022524435000012
 配列番号８
ＤＮＡ
人工
ｐＡＡＶ抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ構築物からドナーＤＮＡ ＰＣＲフラグメントを生成するためのフォワードプライマー（６６０ＨＡおよび６５０ＨＡ）
１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオシド間のホスホロチオアート結合；２位および３位のＧ、ならびに４位のＡは２’－Ｏ－メチル化されている
Figure 2022524435000013
 配列番号９
ＤＮＡ
人工
ｐＡＡＶ抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ構築物からドナーＤＮＡ ＰＣＲフラグメントを生成するためのリバースプライマー（６６０ＨＡおよび６５０ＨＡ）、最も５’側のヌクレオシド（Ｃ）は５’ホスファートを有する
Figure 2022524435000014
 配列番号１０
ＤＮＡ
人工
抗ＣＤ３８ ＣＡＲの部位特異的挿入を検証するための、ＴＲＡＣ遺伝子座に対して相同性を有するＰＣＲフォワードプライマー（上流接合）
Figure 2022524435000015
 配列番号１１
ＤＮＡ
人工
抗ＣＤ３８ ＣＡＲの部位特異的挿入を検証するための、ＣＡＲ構築物に対して相同性を有するＰＣＲリバースプライマー（上流接合）
Figure 2022524435000016
 配列番号１２
ＤＮＡ
人工
抗ＣＤ３８ ＣＡＲの部位特異的挿入を検証するための、ＣＡＲ遺伝子座に対して相同性を有するＰＣＲフォワードプライマー（下流接合）
Figure 2022524435000017
 配列番号１３
ＤＮＡ
人工
ＴＲＡＣ遺伝子座に対して相同性を有するＰＣＲリバースプライマー（下流接合）
Figure 2022524435000018
 配列番号１４
ＤＮＡ
人工
３００ｎｔのＨＡを有するドナーフラグメントを生成するためのフォワードプライマー
１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオシド間のホスホロチオアート結合；２位のＣ、３位のＡ、および５位のＧは２’－Ｏ－メチル化されている
Figure 2022524435000019
 配列番号１５
ＤＮＡ
人工
３００ｎｔのＨＡを有するドナーフラグメントを生成するためのリバースプライマー、最も５’側のヌクレオシド（Ｔ）は５’ホスファートを有する
Figure 2022524435000020
 配列番号１６
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
３７５ｎｔ
５’相同アーム、エクソン１ ＴＲＡＣ遺伝子
Figure 2022524435000021
 配列番号１７
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
３２１ｎｔ
３’相同アーム、エクソン１ ＴＲＡＣ遺伝子
Figure 2022524435000022
 配列番号１８
ＤＮＡ
人工
１５０ｎｔのＨＡを有するドナーフラグメントを生成するためのフォワードプライマー
１番目と２番目、３番目と４番目、そして４番目と５番目のヌクレオシド間のホスホロチオアート結合；３位のＣ、４位のＡ、および５位のＧは２’－Ｏ－メチル化されている
Figure 2022524435000023
 配列番号１９
ＤＮＡ
人工
１５０ｎｔのＨＡを有するドナーフラグメントを生成するためのリバースプライマー、最も５’側のヌクレオシド（Ｇ）は５’ホスファートを有する
Figure 2022524435000024
 配列番号２０
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
５’ １７１ｎｔ相同アーム、エクソン１ ＴＲＡＣ遺伝子
Figure 2022524435000025
 配列番号２１
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
３’ １６１ｎｔ相同アーム、エクソン１ ＴＲＡＣ遺伝子
Figure 2022524435000026
 配列番号２２
ＤＮＡ
人工
ＪｅＴプロモータを含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、イントロン、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＳＶ４０配列
Figure 2022524435000027
 配列番号２３
ＤＮＡ
人工
ＪｅＴプロモータを含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物、イントロン、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物、ＳＶ４０配列
Figure 2022524435000028
Figure 2022524435000029
 配列番号２４
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
５’相同アーム、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３、１８３ｎｔ
Figure 2022524435000030
 配列番号２５
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
３’相同アーム、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３
１４０ｎｔ
Figure 2022524435000031
 配列番号２６
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
エクソン３標的配列（ガイド配列）
Figure 2022524435000032
 配列番号２７
ＤＮＡ
人工
ドナーＤＮＡ抗ＣＤ３８ ＣＡＲ＋両端のエクソン３ ＨＡ全体
Figure 2022524435000033
 配列番号２８
人工
配列番号２７のドナーフラグメントを生成するためのフォワードプライマー
１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオシド間のホスホロチオアート結合；２位のＡ、４位のＧ、および５位のＣは２’－Ｏ－メチル化されている
Figure 2022524435000034
 配列番号２９
人工
配列番号２７のドナーフラグメントを生成するためのリバースプライマー、最も５’側のヌクレオシド（Ｔ）は５’ホスファートを有する
Figure 2022524435000035
 配列番号３０
ＤＮＡ ＰＤ－１遺伝子座５’ＨＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
３２６ｎｔ
Figure 2022524435000036
 配列番号３１
ＤＮＡ ＰＤ－１遺伝子座３’ＨＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
３８０ｎｔ
Figure 2022524435000037
 配列番号３２
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
ＰＤ－１標的部位
Figure 2022524435000038
 配列番号３３
ＤＮＡ
人工
ＰＤ－１ ＨＡが隣接するＣＤ３８カセット（配列番号２）を有するドナーＤＮＡフラグメント
Figure 2022524435000039
 配列番号３４
ＤＮＡ
人工
配列番号３３のドナーフラグメントを生成するためのフォワードプライマー、最も５’側のヌクレオシド（Ｃ）は５’ホスファートを有する
Figure 2022524435000040
 配列番号３５
ＤＮＡ
人工
配列番号３３のドナーフラグメントを生成するためのリバースプライマー、１番目と２番目、２番目と３番目、そして３番目と４番目のヌクレオシド間のホスホロチオアート結合；１位のＣ、２位のＣ、および４位のＧは２’－Ｏ－メチル化されている
Figure 2022524435000041
 配列番号３６
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
ｐＡＡＶ抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ構築物からドナーＤＮＡ ＰＣＲフラグメントを生成するためのフォワードプライマー（６６０ＨＡおよび６５０ＨＡ）
Figure 2022524435000042
 配列番号３７
ＤＮＡ
人工
５’および３’ＴＲＡＣ遺伝子エクソン１相同アームを有する、ＪｅＴプロモータ、イントロン、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物、ＳＶ４０配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物ドナーフラグメント配列
Figure 2022524435000043
Figure 2022524435000044
 配列番号３８
ＤＮＡ
人工
ＪｅＴプロモータ、イントロン、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、配列番号２０および配列番号２１の５’および３’ＴＲＡＣ遺伝子エクソン１相同アームが隣接するＳＶ４０配列を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット
Figure 2022524435000045
Figure 2022524435000046
 配列番号３９
ＤＮＡ
人工
ドナーＤＮＡの５’末端＋抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の一部および６６０ｎｔ相同アームを含む隣接ＴＲＡＣ遺伝子エクソン１ゲノム配列の配列決定されたＰＣＲ産物
Figure 2022524435000047
 配列番号４０
ＤＮＡ
人工
ドナーＤＮＡの３’末端＋抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の一部および６５０ｎｔ相同アームを含む隣接ＴＲＡＣ遺伝子エクソン１ゲノム配列の配列決定されたＰＣＲ産物
Figure 2022524435000048
Figure 2022524435000049
 配列番号４１
ＤＮＡ
人工
ドナーＤＮＡの５’末端＋抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の一部および６６０ｎｔ相同アームを含む隣接ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３ゲノム配列の配列決定されたＰＣＲ産物
エクソン３ ５ＨＡ Ｆ配列の結果：
Figure 2022524435000050
 配列番号４２
ＤＮＡ
人工
ドナーＤＮＡの３’末端＋抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の一部および６５０ｎｔ相同アームを含む隣接ゲノムＴＲＡＣ遺伝子エクソン３配列の配列決定されたＰＣＲ産物
Figure 2022524435000051
Figure 2022524435000052
 配列番号４３
ＤＮＡ
人工
ドナーＤＮＡの３’末端＋抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の一部および６６０ｎｔ相同アームを含む隣接ＰＤ－１ゲノム配列の配列決定されたＰＣＲ産物
Figure 2022524435000053
 配列番号４４
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１由来の５’相同アーム、６６０ｎｔ
Figure 2022524435000054
 配列番号４５
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１由来の３’相同アーム、６５０ｎｔ
Figure 2022524435000055
 配列番号４６
ＤＮＡ
人工
ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルスのＴ２Ａペプチド配列をコード
Figure 2022524435000056
 配列番号４７
ＤＮＡ
ＳＶ４０
ポリＡ付加配列
Figure 2022524435000057
 配列番号４８
ＤＮＡ
人工
ＣＤ３８ ＤＡＲインサート、２６５２ｎｔ
Figure 2022524435000058
Figure 2022524435000059
 配列番号４９
ＤＮＡ
人工
５’１７１ｎｔおよび３’１６１ｎｔのＴＲＡＣエクソン１相同アームが隣接するＣＤ３８ ＤＡＲインサート２６５２ｎｔ
Figure 2022524435000060
Figure 2022524435000061
 配列番号５０
ＤＮＡ
５’エクソン１ ＴＲＡＣ遺伝子相同隣接配列、６４５ｂｐ
Figure 2022524435000062
 配列番号５１
ＤＮＡ
３’エクソン１ ＴＲＡＣ遺伝子相同隣接配列、エクソン１ ＴＲＡＣ遺伝子、６００ｂｐ
Figure 2022524435000063
 配列番号５２
ＤＮＡ
ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内のＣａｓ１２ａ標的部位
Figure 2022524435000064
 配列番号５３
ＤＮＡ
人工
ＴＲＡＣ遺伝子座由来の６４５ｂｐおよび６００ｂｐの相同配列が隣接する抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物
Figure 2022524435000065
Figure 2022524435000066
 配列番号５４
ＤＮＡ
ｃａｓ１２ａを使用してＴＲＡＣエクソン１中への挿入用のドナーＤＮＡを生成するためのリバースプライマー
Figure 2022524435000067
 配列番号５５
ＤＮＡ
ＰＣＲ合成５’相同アーム、１９２ｎｔ
Figure 2022524435000068
 配列番号５６
ＤＮＡ
ＰＣＲ合成３’相同アーム、１５９ｎｔ
Figure 2022524435000069
 配列番号５７
ＤＮＡ
人工
抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡ、３０００３ヌクレオチド
Figure 2022524435000070
 配列番号５８
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
５’ＨＡ ６４５ｂｐ、Ｔｉｍ３遺伝子座
Figure 2022524435000071
 配列番号５９
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
３’ＨＡ ６００ｂｐ、Ｔｉｍ３遺伝子座
Figure 2022524435000072
 配列番号６０
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
ＴＩＭ－３ ｃａｓ１２ａ標的部位
Figure 2022524435000073
 配列番号６１
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
ドナーＤＮＡを作製するためのＴＩＭ３フォワードプライマー
Figure 2022524435000074
 配列番号６２
ＤＮＡ
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
ドナーＤＮＡを作製するためのＴＩＭ３リバースプライマー
Figure 2022524435000075
 配列番号６３
ＤＮＡ
人工
ＴＩＭ３ドナーＤＮＡ
Figure 2022524435000076
 配列番号６４
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー
Figure 2022524435000077
 配列番号６５
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー
Figure 2022524435000078
 配列番号６６
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー
Figure 2022524435000079
 配列番号６７
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー
Figure 2022524435000080
 配列番号６８
ＤＮＡ
ＰＤ－１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー
Figure 2022524435000081
 配列番号６９
ＤＮＡ
ＰＤ－１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー
Figure 2022524435000082
 配列番号７０
ＤＮＡ
ＰＤ－１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー
Figure 2022524435000083
 配列番号７１
ＤＮＡ
ＰＤ－１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー
Figure 2022524435000084
 配列番号７２
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＤＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー
Figure 2022524435000085
 配列番号７３
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＤＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー
Figure 2022524435000086
 配列番号７４
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＤＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー
Figure 2022524435000087
 配列番号７５
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＤＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー
Figure 2022524435000088
 配列番号７６
ＤＮＡ
Ｃａｓ１２ａ標的部位のＴＲＡＣエクソン１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＤＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー
Figure 2022524435000089
 配列番号７７
ＤＮＡ
Ｃａｓ１２ａ標的部位のＴＲＡＣエクソン１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＤＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー
Figure 2022524435000090
 配列番号７８
ＤＮＡ
Ｃａｓ１２ａ標的部位のＴＲＡＣエクソン１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＤＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー
Figure 2022524435000091
 配列番号７９
ＤＮＡ
ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座における抗ＣＤ３８ ＤＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー
Figure 2022524435000092
 配列番号８０
ＤＮＡ
ＧＭ－ＣＳＦ
ｃａｓ１２ａ標的部位
Figure 2022524435000093
 配列番号８１
ＤＮＡ
抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物
Figure 2022524435000094
 配列番号８２
ＤＮＡ
ドナーＤＮＡを生成するためのフォワードプライマー
５’ホスファートを含む
Figure 2022524435000095
 配列番号８３
ＤＮＡ
５’相同アーム、抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物、および３’相同アームを含む抗ＣＤ２０ ＤＡＲドナーＤＮＡ
Figure 2022524435000096
 配列番号８４
ＤＮＡ
抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物
Figure 2022524435000097
 配列番号８５
ＤＮＡ
５’相同アーム、抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物、および３’相同アームを含む抗ＣＤ２０ ＤＡＲドナーＤＮＡ
Figure 2022524435000098
Figure 2022524435000099
 配列番号８６
ＤＮＡ
ＣＤ７遺伝子座Ｃａｓ１２ａ標的部位
Figure 2022524435000100
 配列番号８７
ＤＮＡ
ＣＤ７遺伝子座Ｃａｓ１２ａ代替標的部位
Figure 2022524435000101
 配列番号８８
ＤＮＡ
ＣＤ７遺伝子座中への挿入用のドナーフラグメントを生成するフォワードプライマー
Figure 2022524435000102
 配列番号８９
ＤＮＡ
ＣＤ７遺伝子座中への挿入用のドナーフラグメントを生成するリバースプライマー
Figure 2022524435000103
 配列番号９０
ＤＮＡ
ＣＤ７遺伝子座挿入用の５’相同アーム
Figure 2022524435000104
 配列番号９１
ＤＮＡ
ＣＤ７遺伝子座挿入用の３’相同アーム
Figure 2022524435000105
さらに別の態様において提供されるのは、本明細書で実証されるように、ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物がＣＤ７遺伝子中に挿入されたヒト初代Ｔ細胞である。ＣＤ７遺伝子中にＣＡＲ挿入またはＤＡＲ挿入を有するＴ細胞の集団は、ＣＡＲまたはＤＡＲの発現、およびＣＤ７の発現の低減を実証し得る。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
２つの異なる遺伝子座にて初代ヒトＴ細胞を遺伝子改変する方法であって、初代ヒトＴ細胞中に：
第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび第１のガイドＲＮＡを含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と；
第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび第２のガイドＲＮＡを含む第２のＲＮＰと；
少なくとも２つの核酸修飾を含むドナーＤＮＡ分子と；
を導入することを含み、
前記第１のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の第１の遺伝子座の第１の標的部位とハイブリダイズするように設計された標的配列を含み、前記ドナーＤＮＡは、前記第１の標的部位にて標的ＤＮＡ分子中に挿入され、
さらに、前記第２のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の第２の遺伝子座の第２の標的部位とハイブリダイズして、前記第２の標的部位にて変異をもたらすように設計された第２の標的配列を含む、方法。
（項目２）
前記少なくとも２つの核酸修飾は、前記ドナーＤＮＡ分子の一本鎖上にある、項目１に記載の方法。
（項目３）
１または複数の核酸修飾が、前記ドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の１または複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド結合の修飾である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
１または複数の核酸修飾が骨格修飾である、項目１に記載の方法。
（項目５）
１または複数の核酸修飾が、ホスホロチオアート修飾もしくはホスホロアミダイト修飾、またはそれらの組合せである、項目４に記載の方法。
（項目６）
１または複数の核酸修飾が、核酸塩基の修飾または置換である、項目１に記載の方法。
（項目７）
１または複数の核酸修飾が、糖の修飾または置換である、項目１に記載の方法。
（項目８）
１または複数の核酸修飾が、デオキシリボースの２’－Ｏ－メチル基修飾である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ドナーＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡ分子である、項目１または２に記載の方法。
（項目１０）
前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖の逆鎖上に５’末端ホスファートを有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ドナー分子は、前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の骨格上に１個～３個のホスホロチオラート修飾を、そして前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に１個～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ドナー分子は、前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内の骨格上に１～３個のホスホロチオラート修飾を、そして前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に１～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム中への組み込み用の配列に隣接する相同アームを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
少なくとも１つの前記相同アームが、５０～２０００ヌクレオチド長である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～６６０ヌクレオチド長である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～２５０ヌクレオチド長である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖および逆鎖を含み、前記修飾された鎖は、２またはそれを超える核酸修飾を含み、前記逆鎖は末端ホスファートを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記ドナーＤＮＡは約５００～約５０００ｂｐ長である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ドナーＤＮＡは約５００～約３５００ｂｐ長である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ドナーＤＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび／または前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび／または前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ａであり、かつ前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９であり、または前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９であり、かつ前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ａである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記第１のＲＮＰおよび前記ドナーＤＮＡは、同時に導入される、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記第１のＲＮＰ、前記ドナーＤＮＡ、および前記第２のＲＮＰは、前記細胞中に同時に導入される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第１のＲＮＰおよび前記ドナーＤＮＡは、前記細胞中に同時に導入され、前記第２のＲＮＰは、前記細胞中に異なる時点にて導入される、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記ＲＮＰは、エレクトロポレーションまたはリポソーム移入によって前記細胞中に導入される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
操作された初代Ｔ細胞であって：
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの第１の標的部位を含む第１の遺伝子座にてゲノム中に組み込まれた非天然遺伝子構築物と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの第２の標的部位を含む第２の遺伝子座での変異とを含み、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法によって生成される操作された初代Ｔ細胞。
（項目３０）
遺伝子構築物で形質移入された初代ヒトＴ細胞の集団であって、前記細胞集団は、非天然遺伝子構築物が第１の遺伝子座にてゲノム中に組み込まれており、そしてさらに第２の遺伝子座の遺伝子中に変異を有する細胞を含み、前記集団の前記細胞の少なくとも２５％が前記遺伝子構築物を発現し、かつ前記第２の遺伝子座にて前記遺伝子の発現の低減を示す、初代ヒトＴ細胞の集団。
（項目３１）
前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ標的部位および前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ部位は、Ｃａｓ１２ａ標的部位である、項目３０に記載の初代ヒトＴ細胞の集団。
（項目３２）
前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ標的部位はＣａｓ１２ａ標的部位であり、前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ部位はＣａｓ９標的部位である、項目３０に記載のヒトＴ細胞の集団。
（項目３３）
前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ標的部位はＣａｓ９標的部位であり、前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ部位はＣａｓ１２ａ標的部位である、項目３０に記載のヒトＴ細胞の集団。
（項目３４）
標的ＤＮＡ分子中へのドナーＤＮＡの部位特異的組み込み方法であって：
細胞中に：
Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼおよび操作されたガイドＲＮＡを含むＲＮＰと；
少なくとも２つの核酸修飾を含むドナーＤＮＡ分子と；
を導入することを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的ＤＮＡ中の標的部位とハイブリダイズするように設計された標的配列を含み、前記ドナーＤＮＡは、前記標的部位にて前記標的ＤＮＡ分子中に挿入される、方法。
（項目３５）
前記少なくとも２つの核酸修飾は、前記ドナーＤＮＡ分子の一本鎖上にある、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
１または複数の核酸修飾が、前記ドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の１または複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド結合の修飾である、項目３４または３５に記載の方法。
（項目３７）
１または複数の核酸修飾が骨格修飾である、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
１または複数の核酸修飾が、ホスホロチオアート修飾もしくはホスホロアミダイト修飾、またはそれらの組合せである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
１または複数の核酸修飾が、核酸塩基の修飾または置換である、項目３３に記載の方法。
（項目４０）
１または複数の核酸修飾が、糖の修飾または置換である、項目３３に記載の方法。
（項目４１）
１または複数の核酸修飾が、デオキシリボースの２’－Ｏ－メチル基修飾である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ドナーＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡ分子である、項目３４に記載の方法。
（項目４３）
前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖の逆鎖上に５’末端ホスファートを有する、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記ドナー分子は、前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の骨格上に１個～３個のホスホロチオラート修飾を、そして前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に１個～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ドナー分子は、前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内の骨格上に１～３個のホスホロチオラート修飾を、そして前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に１～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム中への組み込み用の配列に隣接する相同アームを含む、項目３４に記載の方法。
（項目４７）
少なくとも１つの前記相同アームが、５０～２０００ヌクレオチド長である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～６６０ヌクレオチド長である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～２５０ヌクレオチド長である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖および逆鎖を含み、前記修飾された鎖は、２またはそれを超える核酸修飾を含み、前記逆鎖は末端ホスファートを含む、項目３４に記載の方法。
（項目５１）
前記ドナーＤＮＡは約５００～約５０００ｂｐ長である、項目３４に記載の方法。
（項目５２）
前記ドナーＤＮＡは約５００～約３５００ｂｐ長である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ドナーＤＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を含む、項目３４に記載の方法。
（項目５４）
前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡである、項目３４に記載の方法。
（項目５５）
ｔｒａｃｒ ＲＮＡを前記細胞中に導入することをさらに含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ＲＮＰは、エレクトロポレーションまたはリポソーム移入によって前記細胞中に導入される、項目３４に記載の方法。
（項目５７）
前記ドナーＤＮＡおよび前記ＲＮＰは、同時に、または別々に、前記細胞中に導入される、項目３４に記載の方法。
（項目５８）
標的遺伝子座中へのドナーＤＮＡの、標的化された組み込みのためのシステムであって、
ａ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼと；
ガイドＲＮＡと；
二本鎖ドナーＤＮＡ分子であって、二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の前記二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された一本鎖上に、１または複数のホスホロチオアート結合を含む、ドナーＤＮＡ分子と
を含むシステム。
（項目５９）
前記ドナーＤＮＡ分子はさらに、二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に、修飾された鎖の糖部分または核酸塩基の少なくとも１つの修飾を含む、項目５８に記載のシステム。
（項目６０）
前記ドナーＤＮＡは、ゲノム中への組み込み用の、関心対象の配列に隣接する相同アームを有する、項目５８に記載のシステム。
（項目６１）
二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された一本鎖上の前記１または複数のホスホロチオアート結合は、前記二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内にある、項目５８に記載のシステム。
（項目６２）
修飾された鎖の糖部分または核酸塩基の少なくとも１つの前記修飾が、二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内にある、項目６１に記載のシステム。
（項目６３）
糖部分の少なくとも１つの前記修飾が、２’－Ｏ－メチル化を含む、項目６１に記載のシステム。
（項目６４）
関心対象の前記配列は、発現カセットを含む、項目６０に記載のシステム。
（項目６５）
前記発現カセットは、１または複数の抗体または受容体ドメインを含む構築物を含む、項目６４に記載のシステム。
（項目６３）
少なくとも１つの前記相同アームが、５０～２０００ヌクレオチド長である、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～６６０ヌクレオチド長である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～２５０ヌクレオチド長である、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖および逆鎖を含み、前記修飾された鎖は、２またはそれを超える核酸修飾を含み、前記逆鎖は末端ホスファートを含む、項目６１に記載の方法。
（項目６７）
前記ドナーＤＮＡは約５００～約５０００ｂｐ長である、項目５８に記載の方法。
（項目６８）
前記ドナーＤＮＡは約５００～約３５００ｂｐ長である、項目５８に記載の方法。
（項目６９）
前記ドナーＤＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を含む、項目６４に記載の方法。
（項目７０）
前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡである、項目５８に記載のシステム。
（項目７１）
前記ガイドＲＮＡは、１または複数のホスホロチオアート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドを含む、項目５８に記載のシステム。
（項目７２）
前記ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体を含む、項目８に記載のシステム。
（項目７３）
ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物がＣＤ７遺伝子中に挿入されている、初代ヒトＴ細胞。
（項目７４）
前記ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物は、ＣＥＡ ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物である、項目７３に記載の初代ヒトＴ細胞。
（項目７５）
項目７３に記載のＴ細胞の集団。
図１Ａは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、続いてＣＤ８ａリーダーペプチド、続いてＣＤ２８ヒンジ－ＣＤ２８膜貫通細胞内領域、続いてＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする配列を有するオープンリーディングフレームを含むＣＡＲドナーＤＮＡ構築物の図である。コーディング配列の前にＪｅＴプロモータ（配列番号３）があり、構築物は相同アーム（ＨＡ）を含み、この場合、ヒトＴＲＡＣ遺伝子座のマッチング配列は、プロモータ＋コーディング配列に隣接する。ドナーＤＮＡ構築物の構造（上）および右側のノックインを確認するためのプライマー設計（下）を示す。これは、ドナーＤＮＡを生成するのに使用される鋳型ＤＮＡの図を示す。抗ＣＤ３８Ａ２は、標的化された組み込みを可能にするために、発現がＪｅＴプロモータによって駆動され、かつ５’側および３’側に相同アームが隣接するＣＤ３８ ＣＡＲ導入遺伝子を含有する。図１Ｂは、組み込みが、標的化された組み込み部位にある場合に、１３７１ｂｐおよび１５９１ｂｐの産物をそれぞれ生成するための、５’末端および３’末端の双方での、ＣＡＲ内に位置する１つのプライマーおよび相同アームの外側のＴＲＡＣ内の１つのプライマーによる増幅によってＣＡＲ組み込みを確認するのに使用されるＰＣＲプライマーの位置を示す同じ図を示す。 図２Ａは、右側の構造において、プライマー内に存在し得ることでヌクレ オチド間の結合のホスホロチオアート（ＰＳ）修飾を示す化学図を示す。左側のオリゴヌクレオチド中に示されるヌクレオチドは、（非修飾）ホスホジエステル結合を介して付着されている。図２Ｂは、最も５’側のヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド中の次のヌクレオチド「下流側」に結合させ、これが次にＰＳ結合によってオリゴヌクレオチドの次の下流のヌクレオチドに付着されている２つのＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドの化学図を示す。オリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。 図２Ａは、右側の構造において、プライマー内に存在し得ることでヌクレ オチド間の結合のホスホロチオアート（ＰＳ）修飾を示す化学図を示す。左側のオリゴヌクレオチド中に示されるヌクレオチドは、（非修飾）ホスホジエステル結合を介して付着されている。図２Ｂは、最も５’側のヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド中の次のヌクレオチド「下流側」に結合させ、これが次にＰＳ結合によってオリゴヌクレオチドの次の下流のヌクレオチドに付着されている２つのＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドの化学図を示す。オリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。 図３Ａ～３Ｅは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物、およびＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを含むＲＮＰを含むドナーＤＮＡによる形質転換の８日後のＰＢＭＣのフローサイトメトリープロットを示す。ＣＡＲカセットは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中の組み込み標的部位に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座配列に対して相同性を有する相同アームが隣接していた。Ｙ軸は、細胞サイズを報告する。抗ＣＤ３８構築物の発現は、ｘ軸に沿う。陰性対照：ドナーＤＮＡは、標的細胞中に形質転換されなかった；非修飾ドナーＤＮＡは、化学修飾がなかった；ＰＳ修飾：３つのホスホロチオアート結合が、最も５’側の５つのヌクレオチド骨格位置内に存在した；ＰＳ＋２’－ＯＭｅ：ホスホロチオアート結合に加えて、ドナーの最も５’側の５つのヌクレオチド内の３つのヌクレオチドは、ＰＳ修飾に加えて、２’－ＯＭｅを含んでいた；ＴＣＲ ＫＯ／レトロウイルス構築物：ドナーＤＮＡが不在のＲＮＰで細胞を形質移入してＴＣＲ遺伝子をノックアウトし、そしてレトロウイルスで形質導入して抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現させた。 図３Ａ～３Ｅは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物、およ びＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを含むＲＮＰを含むドナーＤＮＡによる形質転換の８日後のＰＢＭＣのフローサイトメトリープロットを示す。ＣＡＲカセットは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中の組み込み標的部位に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座配列に対して相同性を有する相同アームが隣接していた。Ｙ軸は、細胞サイズを報告する。抗ＣＤ３８構築物の発現は、ｘ軸に沿う。陰性対照：ドナーＤＮＡは、標的細胞中に形質転換されなかった；非修飾ドナーＤＮＡは、化学修飾がなかった；ＰＳ修飾：３つのホスホロチオアート結合が、最も５’側の５つのヌクレオチド骨格位置内に存在した；ＰＳ＋２’－ＯＭｅ：ホスホロチオアート結合に加えて、ドナーの最も５’側の５つのヌクレオチド内の３つのヌクレオチドは、ＰＳ修飾に加えて、２’－ＯＭｅを含んでいた；ＴＣＲ ＫＯ／レトロウイルス構築物：ドナーＤＮＡが不在のＲＮＰで細胞を形質移入してＴＣＲ遺伝子をノックアウトし、そしてレトロウイルスで形質導入して抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現させた。 図３Ｆ～３Ｊは、形質移入の１０日後に図３Ａと同じ培養物に対して実行したフローサイトメトリーの結果を示す。 図３Ｆ～３Ｊは、形質移入の１０日後に図３Ａと同じ培養物に対して 実行したフローサイトメトリーの結果を示す。 図３Ｋ～３Ｍは、形質移入の２０日後に二重修飾されたドナーＤＮＡおよび対照（ＴＲＡＣノックアウトのみ、およびレトロウイルス形質導入によるＴＲＡＣノックアウト）を受けた培養物に対して実行したフローサイトメトリーの結果を示す。 図４は、標的化されたＴＲＡＣ（エクソン１）部位でのドナーＤＮＡの組み込みを示すＰＣＲ産物のゲルを示す。初代ヒトＴ細胞を、ＴＲＡＣ ＲＮＰでのみ、またはｓｓＤＮＡと一緒にエレクトロポレーションした。ＰＣＲを使用して、エレクトロポレーションの２週後にＴＲＡＣ遺伝子座中に組み込まれた抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲ導入遺伝子の存在を確認した（レーン３および６は、５’および３’の組み込み領域由来の産物を示す）。非形質転換ＡＴＣ（レーン１および４）、またはＴＲＡＣエクソン１標的化ＲＮＰで形質転換されたがドナーＤＮＡを受け取らなかったＴ細胞（レーン２および５）では、バンドは観察されなかった。 図５は、細胞毒性アッセイの結果を示すグラフである（対照としての活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ、星）、ＴＣＲノックアウトＡＴＣ、抗ＣＤ３８Ａ２レトロウイルス形質導入ＣＡＲＴ細胞（ＲＶ ＣＡＲＴ、黒線）、ＴＲＡＣノックアウトレトロウイルス形質導入ＣＡＲＴ細胞（ドット）、ホスホロチオアート修飾されたｓｓドナーＤＮＡノックインと一緒になされたＴＲＡＣノックアウト（ダッシュ）、ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾ｓｓＤＮＡノックインと一緒になされたＴＲＡＣノックアウト（ダッシュおよびドット））。プロットは、ＣＤ３８を発現しないＲＰＥ標識Ｋ５６２細胞に対して観察された細胞毒性を補正した後の、ＧＦＰ標識ＲＰＭＩ８２２６ ＣＤ３８発現細胞に対する細胞毒性パーセントを示す。 図６Ａ～６Ｃは、Ｋ５２細胞またはＲＰＭ１８２２６細胞と共培養した、抗ＣＤ３８ ＣＡＲＴ細胞および対照を使用したサイトカイン分泌アッセイの結果のグラフを示す。試験したＴ細胞培養物は、図５に示す通りである。 図７Ａ～７Ｄは、異なる長さの相同アーム（ＨＡ）を有するドナーＤＮＡを試験した結果を示す。培養物を、ＴＣＲ（ＣＤ３）発現（Ｙ軸）および抗ＣＤ３８発現（Ｘ軸）の喪失についてフローサイトメトリーによって評価した。 図７Ａ～７Ｄは、異なる長さの相同アーム（ＨＡ）を有するドナーＤ ＮＡを試験した結果を示す。培養物を、ＴＣＲ（ＣＤ３）発現（Ｙ軸）および抗ＣＤ３８発現（Ｘ軸）の喪失についてフローサイトメトリーによって評価した。 図８Ａ～８Ｃは、ドナーＤＮＡ分子の一本鎖の５’末端に近位の３つのＰＳ結合および３つの２’－Ｏ－メチルヌクレオチドの付加によって修飾された二本鎖ドナーＤＮＡを試験した結果を示す。培養物を、ＴＣＲ発現（Ｙ軸）および抗ＣＤ３８発現（Ｘ軸）の喪失についてフローサイトメトリーによって評価した。 図９Ａ～９Ｂは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ドナーを、ＲＮＰによる共形質移入によってＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１０Ａ～１０Ｂは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ドナーを、ＲＮＰによる共形質移入によってＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１１Ａ～１１Ｃは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ドナーを、ＲＮＰによる共形質移入によってＴＲＡＣエクソン３遺伝子座に向けた。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１１Ａ～１１Ｃは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するためのカセットを 含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ドナーを、ＲＮＰによる共形質移入によってＴＲＡＣエクソン３遺伝子座に向けた。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１２Ａ～１２Ｄは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ある培養物では、ＴＲＡＣエクソン３に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン３ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座に向けた（図１２Ｂ）。別の培養物では、ＴＲＡＣエクソン１に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン１ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた（図１２Ｃ）。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１２Ａ～１２Ｄは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのカセッ トを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ある培養物では、ＴＲＡＣエクソン３に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン３ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座に向けた（図１２Ｂ）。別の培養物では、ＴＲＡＣエクソン１に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン１ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた（図１２Ｃ）。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現をＹ軸上で判定する。 図１３Ａ～１３Ｄは、抗Ｃ３８ ＣＡＲおよびＴＲＡＣ遺伝子またはＰＤ－１遺伝子に由来する相同アームを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ある培養物では、ＴＲＡＣエクソン１に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン１ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた（図１３Ｄ）。別の培養物において、ドナーは、ＰＤ－１遺伝子座に由来する相同アームを有し、ＰＤ－１遺伝子ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によってＰＤ－１遺伝子に向けられた（図１３Ｃ）。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ３８発現またはＰＤ－１発現をＹ軸上で判定する。 図１３Ａ～１３Ｄは、抗Ｃ３８ ＣＡＲおよびＴＲＡＣ遺伝子また はＰＤ－１遺伝子に由来する相同アームを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を示す。ある培養物では、ＴＲＡＣエクソン１に由来する相同アームを有するドナーを、エクソン１ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によって、ＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に向けた（図１３Ｄ）。別の培養物において、ドナーは、ＰＤ－１遺伝子座に由来する相同アームを有し、ＰＤ－１遺伝子ガイドＲＮＡを有するＲＮＰによる共形質移入によってＰＤ－１遺伝子に向けられた（図１３Ｃ）。ＴＣＲ発現をＹ軸上で判定し、抗ＣＤ３８発現またはＰＤ－１発現をＹ軸上で判定する。 図１４は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物、およびＰＤ－１遺伝子由来の標的配列を有するガイドＲＮＡを含むＲＮＰによってＰＤ－１遺伝子に標的化されるＰＤ－１遺伝子由来相同アームを含む二重修飾された（ＰＳおよび２’－ＯＭｅ）ドナーフラグメントで形質移入されたＴ細胞培養物を使用した細胞毒性アッセイの結果を示す。 図１５Ａ～１５Ｅは、Ｃａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ（図１５Ｄ）またはＣａｓ１２ａ ＲＮＰ（図１５Ｅ）と共に抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を含むドナーＤＮＡで形質移入した細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。Ｔ細胞受容体発現をＹ軸に、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の発現をＹ軸に示す。図１５Ｂおよび図１５Ｃは、ドナーフラグメントが不在の、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２ａタンパク質をそれぞれ含むＲＮＰでＴ細胞を形質移入した結果を示す。 図１５Ａ～１５Ｅは、Ｃａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ（図１５Ｄ ）またはＣａｓ１２ａ ＲＮＰ（図１５Ｅ）と共に抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を含むドナーＤＮＡで形質移入した細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。Ｔ細胞受容体発現をＹ軸に、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の発現をＹ軸に示す。図１５Ｂおよび図１５Ｃは、ドナーフラグメントが不在の、Ｃａｓ９タンパク質およびＣａｓ１２ａタンパク質をそれぞれ含むＲＮＰでＴ細胞を形質移入した結果を示す。 図１６は、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物、およびＣａｓ９ ＲＮＰまたはＣａｓ１２ａ ＲＮＰのいずれかで形質移入したＴ細胞を使用した細胞毒性アッセイの結果のグラフを示す。 図１７は、Ｃａｓ９ ＲＮＰによるＴＲＡＣ遺伝子座中への抗ＣＤ３８ ＣＡＲの挿入中に生成されたオフターゲット変異のゲノム位置および割合を示す表である。 図１８Ａ～１８Ｂは、非改変活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）（図１８Ａ）、または抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を含むドナーＤＮＡと共にＴｉｍ３遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞（図１８Ｂ）のフローサイトメトリーの結果を示す。 図１９Ａ～１９Ｈは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞、ならびにＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。また、示されるのは、図１９Ｅおよび１９Ｈにおいて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。 図１９Ａ～１９Ｈは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ Ｒ ＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞、ならびにＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。また、示されるのは、図１９Ｅおよび１９Ｈにおいて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。 図１９Ａ～１９Ｈは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ Ｒ ＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞、ならびにＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。また、示されるのは、図１９Ｅおよび１９Ｈにおいて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。 図１９Ａ～１９Ｈは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ Ｒ ＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞、ならびにＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。また、示されるのは、図１９Ｅおよび１９Ｈにおいて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよびＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入用の抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーＤＮＡに加えて、ＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータである。 図２０Ａは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするがドナーＤＮＡがないＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータを示し、図２０Ｂは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよび抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞のフローサイトメトリーデータを示す。 図２１は、エフェクタ：標的細胞比の関数としての、抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物および抗ＣＥＡ ＤＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞の細胞毒性パーセントのグラフである。アッセイにおける標的細胞はＤａｕｄｉ細胞であった。 図２２Ａおよび２２Ｂは、抗原刺激後に、抗ＣＤ２０ ＤＡＲ構築物および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞によって分泌された図２２Ａ、インターフェロンガンマおよび図２２Ｂ、ＧＭＣＳＦの量を示す棒グラフである。Ｔ細胞をＫ５６２細胞またはＤａｕｄｉ細胞で刺激した。Ｄａｕｄｉ細胞刺激のみが、バーによって示されるように、有意な応答をもたらした。刺激されていない細胞からのサイトカイン放出は検出されなかった。 図２３Ａ～２３Ｄは、操作されたＴ細胞によるＴ細胞受容体（ＣＤ３）および抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物の発現を評価したフローサイトメトリーの結果を示す：図２３Ａ）ドナーフラグメントなしで、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ３（ＴＣＲ）発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；図２３Ｂ）ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物を含むドナーフラグメントで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ３（ＴＣＲ）発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；図２３Ｃ）ドナーフラグメントなしで、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ７発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；図２３Ｄ）ＣＤ７遺伝子座を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物を含むドナーフラグメントで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ７発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した。 図２３Ａ～２３Ｄは、操作されたＴ細胞によるＴ細胞受容体（ＣＤ ３）および抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物の発現を評価したフローサイトメトリーの結果を示す：図２３Ａ）ドナーフラグメントなしで、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ３（ＴＣＲ）発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；図２３Ｂ）ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物を含むドナーフラグメントで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ３（ＴＣＲ）発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；図２３Ｃ）ドナーフラグメントなしで、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ７発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した；図２３Ｄ）ＣＤ７遺伝子座を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物を含むドナーフラグメントで形質移入したＴ細胞を、ＣＤ７発現および抗ＣＥＡ ＣＡＲ発現について評価した。 図２４は、ＣＤ７遺伝子座を標的とする抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞；およびＴＲＡＣ遺伝子座にてノックアウトされたＴ細胞を使用した細胞毒性アッセイの結果を示す。Ｘ軸は、アッセイにおけるエフェクタ対標的細胞比を示す。 図２５は、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞、およびＣＤ７遺伝子座を標的とする抗ＣＥＡ ＣＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞によるＩＦＮγ分泌の棒グラフを示す。
図３Ａ～３Ｅは、形質移入の８日後に、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現用のドナーフラグメントが不在の（ＴＲＡＣ遺伝子をノックアウトするための）ＲＮＰで形質移入した細胞内で、抗ＣＤ３８構築物の発現が検出されなかったことを示す（図３Ａ）。一方、ＴＲＡＣノックアウトを有し、そしてその後に抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物を含むレトロウイルスで形質導入したＰＢＭＣは、形質移入の８日後に細胞の約７０％において、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現を示した（図３Ｅ）。ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするＲＮＰに加えて抗ＣＤ３８ ＣＡＲ ｓｓドナーＤＮＡで形質転換した培養物について、化学修飾を有していないｓｓドナーＤＮＡを受けた集団の約１２％、およびドナーＤＮＡの５’末端付近のヌクレオチド上にＰＳ骨格修飾のみを有する（５’末端から番号付けして、ヌクレオチド１と２、２と３、そして３と４の間にＰＳ結合を有するＰＣＲプライマーを使用して導入した）ｓｓドナーＤＮＡで形質導入した培養物の約１３％が、抗ＣＤ３８構築物の発現を実証した。ＰＳ修飾を含むドナーフラグメント鎖の５’末端から２番目、３番目、そして４番目のヌクレオチドの３つのヌクレオチドの２’酸素にメチル基を付加すると（これらの修飾を含む配列番号８のプライマーを使用して、ＰＣＲによってドナーＤＮＡを生成することによる）、形質移入した集団において抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現がかなり高くなり、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現が、８日目に、「二重修飾された」（２’－Ｏ－メチルおよびＰＳ）一本鎖ドナーフラグメントを受けた細胞の約２０％において見られた。特に、ドナーＤＮＡの化学修飾は、形質移入培養物の生存率に影響を及ぼさなかった。
抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現の増大は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメント＋ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＲＮＰで形質移入した培養物において経時的に観察されたが、レトロウイルスによって形質導入した培養物では逆であった。形質移入の１０日後（図３Ｆ～３Ｊ）、フローサイトメトリーは、全ての培養物（全てＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した）について、細胞の少なくとも８０％がＴＣＲを発現しないことを実証した。さらに、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰに加えて抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントで形質移入した培養物では、ＴＣＲを発現しない細胞の少なくとも４２％が、形質移入の１０日後に抗ＣＤ３８構築物を発現した（図３Ｇ～３Ｉ）。５’－近位ヌクレオチド上にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル基の双方を有する抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントで形質移入した培養物について、細胞の５７％が１０日目までに抗ＣＤ３８構築物を発現しており（図３Ｉ）、あらゆる試験培養物の最高パーセンテージであった。同時に、レトロウイルスで形質導入した培養物における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現は、形質導入後８日目に、見られたものの約半分に、形質導入後１０日目に、細胞の約３４％に低減した（図３Ｊ）。２０日目の二重修飾されたｓｓドナーで形質移入した培養物およびレトロウイルス形質導入培養物の分析（図３Ｋ～３Ｍ）は、培養物中の抗ＣＤ３８構築物の発現が安定したことを示し、５’末端にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾の双方を有するｓｓドナーで形質移入したＣａｓ９修飾された培養物は、ＴＣＲ陰性細胞の５４％が構築物を発現していることを示し（図３Ｌ）、レトロウイルスで形質導入した培養物は、ＴＣＲ陰性細胞の３１％が構築物を発現していることを示した（図３Ｍ）。
また、形質移入した活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）を、サイトカイン分泌について試験した（図６Ａ～６Ｃ）。Ｔ細胞を、ＩＬ－２フリー培地中で一晩欠乏状態にした。次いで、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＡＴＣ対照を、ＣＤ３８陰性Ｋ５６２細胞またはＣＤ３８陽性ＲＰＭＩ８２２６細胞と共培養した。インキュベーションエフェクタ対標的細胞比は、２：１であった。一晩のインキュベーション後、製造業者の指示に従って、細胞を遠心分離して、上清を回収して、サイトカインＩＬ－２、ＩＦＮ－ガンマ、およびＴＮＦアルファ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を定量した。また、遺伝子編集されたＴＣＲノックアウト抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３８陽性腫瘍細胞（ＲＰＭＩ８２２６）と共培養した場合に、似た量のＩＦＮ－γおよび他の炎症促進性サイトカインを放出したが、ＣＤ３８陰性細胞（Ｋ５６２）では放出しなかった。
要約すると、インビトロ細胞機能研究は、特異的死滅アッセイ（図５）およびサイトカイン分泌アッセイ（図６Ａ～６Ｃ）の双方に関して、この新規かつ効率的なプロセスによって達成されたＴＲＡＣ部位特異的組み込み抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲと、ウイルス媒介ランダム組み込み抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲとの間で、顕著な差異を何ら明らかにしなかった。
ＲＮＰのエレクトロポレーション用の条件下で同じエレクトロポレーションでドナーフラグメントおよびＲＮＰを形質移入したことを除いて、実施例１に記載されるように、約６６５、３５０、および１６５塩基対長の相同アームを有する二本鎖ドナー分子を、活性化Ｔ細胞中に独立して形質移入した（Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１７００Ｖ、２０ｍｓパルス幅、１パルスを使用）。対照として、活性化Ｔ細胞を、ドナーフラグメントが不在のＲＮＰで形質移入した。これにより、ドナーＤＮＡ挿入はないが、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の発現について試験するために、実施例１に記載されるようにフローサイトメトリーを実行した。図７Ａ～７Ｄは、予想されるように、ＲＮＰで形質移入したＴ細胞培養物のみ、Ｔ細胞受容体の発現レベルが低く、そしてまた、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現を示さなかったことを示している。しかしながら、ＲＮＰ＋相同アームのサイズが異なるドナーＤＮＡで形質移入したＴ細胞は、培養物中で低レベルのＴ細胞受容体発現および良好な抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現を示し、二本鎖ドナーＤＮＡの形質移入が、標的化されたノックインに非常に有効であることを実証している。さらに、驚くべきことに、試験した最短ＨＡ長１６１／１７１ｎｔは、より長いＨＡ長よりも良好に機能し、導入された構築物を発現するノックアウト細胞のパーセンテージは、約６６５ｎｔアームについて約２４％、約３５０ｎｔアームについて約３０％、そして約１６５ｎｔアームについて約３８％であった。ゆえに、短い相同アームは、二本鎖ＤＮＡドナーを使用した標的ノックインゲノム改変に非常に効果的であることが見出されており、これは、より小さい構築物を可能にし、かつ／または追加の配列もしくはより長い配列をドナーＤＮＡ中に含めることができる構築物中のより大きな容量を可能にするという利点を有する。
実施例２のように、対照活性化Ｔ細胞を、ドナーフラグメントが不在のＲＮＰで形質移入した。これにより、構築物挿入のない、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３ ＣＡＲ構築物の発現について試験するために、本質的に実施例１に記載されるようにフローサイトメトリーを実行した。図８Ａ～８Ｃに示される結果は、ＲＮＰおよび修飾された二本鎖ドナーによる形質移入が、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現する一方、ＴＣＲ発現を示さない細胞を５０％超もたらし、ＲＮＰおよび非修飾二本鎖ドナーで形質移入した培養物において観察される抗ＣＤ３８構築物を発現するＴＣＲ陰性細胞のパーセンテージの少なくとも２倍（２２％）であることを示している。
上記のプライマー配列番号１８および配列番号１９のヌクレオチド修飾が組み込まれた配列番号３８の配列を有する二本鎖の化学的に修飾されたドナー断片を使用する実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ＲＮＰのｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とする配列番号１の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。ＴＲＡＣ遺伝子座中に異なる構築物を導入する効率を評価するために、ＣＤ１９－Ｆｃ（Ｓｐｅｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）によって、続いてＡＰＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）によって抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現が検出されたことを除いて、本質的に実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを行った。結果が図９Ａ～９Ｂに示されており、抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、培養物中の細胞のおよそ４２％において、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現されたことが分かる。
上記の化学的に修飾されたプライマーの取り込みによって修飾されたヌクレオチドを有する、配列番号３７の配列を有する二本鎖ドナー断片を使用して、実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ＲＮＰのｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とする配列番号１の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。ＴＲＡＣ遺伝子座中に異なる構築物を導入する効率を評価するために、ＰＥまたはＡＰＣがコンジュゲートされたＢＣＭＡ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）によって抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現が検出されたことを除いて、実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを行った。結果が図１０Ａ～１０Ｂに示されており、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、培養物中の細胞のおよそ６６％において、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現されたことが分かる。
上記プライマーの取り込みによって修飾されたヌクレオチドを有し、配列番号２７の配列を有する二本鎖ドナー断片を使用して、実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３を標的とする配列番号２６の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。さらなる対照は、非形質移入活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）であった。本質的に実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを実施した。結果が図１１Ａ～１１Ｃに示されており、ＲＮＰまたはＲＮＰ＋ドナーＤＮＡでの形質移入により、培養物全体で８０％を超える細胞がＴＣＲ発現を喪失することが分かる。さらに、標的に誘導するＲＮＰに加えて、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３に由来するＨＡを有するドナーＤＮＡで形質移入された培養物中の細胞の約４２％において、抗ＣＤ３８ ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現された。
挿入遺伝子座を診断するように設計したプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を生成した（図１Ｂ参照）：５’－ＣＴＣＣＴＧＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡ－３’（配列番号６４、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー）および５’－ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＧＴ－３’（配列番号６５、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー）、そして反対側の接合部について、５’－ＣＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴ－３’（配列番号６６、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー）および５’－ＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＴＣＴＴＡＣＡ－３’（配列番号６７、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー）。結果として生じたＰＣＲ産物を配列決定した。ＰＣＲ産物配列（例えば、配列番号４１および配列番号４２）は、単一のＰＣＲ産物中に、ゲノム中の相同アームに隣接する配列、ドナーフラグメント中に存在する相同アーム、および抗ＣＤ３８ ＣＡＲの一部を含み、予想される挿入を実証した。
図１２Ａ～１２Ｄは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３およびエクソン１への抗ＣＤ１９ ＣＡＲの標的誘導を比較する。エクソン３に向けられる抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーＤＮＡは、上記実施例中に記載されている抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を含むように合成され、抗ＣＤ１９発現カセットは、上記のエクソン３遺伝子座由来の配列（配列番号２４および配列番号２５）に隣接する。（配列番号３８の配列を有する）エクソン１に向けられる抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーは実施例４に提供されている。最も５’末端にある３つのヌクレオチド上にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する修飾されたフォワードプライマーを使用してドナー断片を作製するために、これらの構築物の各々、すなわち、ＴＲＡＣエクソン１ ＨＡ（配列番号１８および配列番号１９）に隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を有する一方と、ＴＲＡＣエクソン３ ＨＡ（配列番号２４および配列番号２５）に隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を有する他方とを使用した。リバースプライマーは５’末端ホスファートを有していた。エクソン１ ＨＡに隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーを作製するためのプライマーは、配列番号１８および配列番号１９であり、配列番号１８のプライマーは、第１および第２、第３および第４、ならびに第４および第５のヌクレオシドの間にＰＳ結合と、５’末端から３、４および５の位置に２’－Ｏ－メチル基とを含んでいた。エクソン３ ＨＡに隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーを作製するためのプライマーは、配列番号２８および配列番号２９であり、配列番号２８のプライマーは、５’末端から第１および第２、第２および第３、ならびに第３および第４のヌクレオシドの間にＰＳ結合と、５’末端から２の位置、４の位置および５の位置に２’－Ｏ－メチル基とを有していた。このため、得られた二本鎖ドナーＤＮＡは、５’末端のヌクレオチド上に対応するＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する第１の鎖と、５’末端ホスファートを有する第２の鎖とを有していた。
ドナーフラグメントを、独立して、ＲＮＰで活性化Ｔ細胞中に形質移入した。実施例１に記載されるようにＲＮＰを生成し、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン１を標的とするためのｃｒＲＮＡの標的配列を配列番号１とし、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３を標的とするためのｃｒＲＮＡの標的配列を配列番号２６とした。図１２Ａ～１２Ｄに見られるように、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのドナーフラグメントで形質移入した培養物の約４１％は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲについてＴＣＲ陰性およびＴＣＲ陽性の両方であった一方、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのドナーフラグメントで形質移入した培養物の約２０％は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲについてＴＣＲ陰性およびＴＣＲ陽性の両方であった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現カセットを含むレトロウイルスで形質導入されたＴ細胞培養物は、より高いパーセンテージの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を示したが、当該細胞はＴＣＲノックアウトがなかった。
結果を図１３Ａ～１３Ｄに示す。図では、ＰＤ－１を発現する細胞のパーセンテージが、ＡＴＣにおける約１９％から、ＰＤ－１遺伝子座を標的とするＲＮＰ（ＰＤ－１ ＲＮＰ）で形質移入した培養物の細胞における約４％に低下したことが分かる。ＰＤ－１標的化ＲＮＰ＋ＰＤ－１遺伝子座に対して相同性を有するＨＡを有するドナーで形質移入した培養物中の細胞の約２７％において、Ｔ細胞受容体発現の不在下で抗ＣＤ３８ ＣＡＲは発現された。比較として、ＴＣＲのエクソン１を標的とするＲＮＰ、およびＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１の配列に対して相同性を有するＨＡを有する抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントで形質移入した培養物の細胞では、約３２％であった。
挿入遺伝子座を診断するためのプライマーを使用して生成されたＰＣＲ産物の配列決定（図１Ｂ参照）により、ＰＤ－１遺伝子中に組み込まれた抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメントを実証する配列が示された。接合配列を得るために、合計１×１０７個の細胞を、５００μｌのＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）中に再懸濁させて、ゲノムＤＮＡを抽出した。細胞溶解液を６５℃にて５分間、次いで９５℃にて２分間インキュベートして、－２０℃にて保存した。ゲノムＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｄｅｎｏｖｉｘ）によって求めた。標的部位を含有するゲノム領域をＰＣＲ増幅した。５’接合部および３’接合部の双方についてのプライマーセットを、相同アームの外側にアニーリングするように設計した。挿入遺伝子座を診断するように設計したプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を生成した（図１Ｂ参照）：５’－ＧＴＧＴＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧ－３’（配列番号６８、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー）および５’－ＡＣＡＣＡＣＴＴＧＣＧＡＣＣＣＡＴＴＣ－３’（配列番号６９、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの５’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー）、そして反対側の接合部について、５’－ＣＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴ－３’（配列番号７０、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のフォワードプライマー）および５’－ＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＴＧＧ－３’（配列番号７１、ＴＲＡＣエクソン３遺伝子座内の抗ＣＤ３８ ＣＡＲの３’相同アームにわたる配列決定用のリバースプライマー）。
図１４は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現し、かつＰＤ－１遺伝子をノックアウトした細胞の機能性を判定するために、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメント、およびＰＤ－１遺伝子座を標的とするＲＮＰで形質移入した培養物由来のＰＢＭＣおよび単離Ｔ細胞（それぞれ「ＰＤ－１ ＫＯＫＩ ＰＢＭＣ」および「ＰＤ－１ ＫＯＫＩ Ｔ細胞」）を使用して実行した細胞毒性アッセイの結果を示す。当該改変された細胞は、アッセイにおいて、ＰＤ－１遺伝子ノックアウトを有するがＣＡＲ構築物を受けなかった対照細胞（「ＰＤ－１ ＫＯ」）、およびＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトを有するがＣＡＲ構築物を受けなかった対照細胞（「ＴＲＡＣ－１ ＫＯ」）に対して、標的細胞に対する高レベルの細胞毒性を示し、そして、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーフラグメント、およびＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰを形質移入した細胞（「ＴＲＡＣ ＫＯＫＩ」）によって、性能が幾分優れていた。これはおそらく、観察されたＰＤ－１部位でのドナーＣＡＲ構築物組み込みの効率が低いためである（図１３Ａ～１３Ｄ）。
形質移入の１４日後、Ｃａｓ９ ＲＮＰ＋Ｃａｓ９標的部位を標的とするための相同アームを有するドナーＤＮＡ（配列番号４９）、またはＣａｓ１２ａ ＲＮＰおよびＣａｓ１２ａ標的部位を標的とするための相同アームを有するドナーＤＮＡ（配列番号５７）のいずれかで形質移入したＴ細胞集団を、実施例１に記載されるように、ノックアウト対照と一緒にフローサイトメトリーによって分析した（図１５Ａ～１５Ｅ）。ドナーフラグメントが不在の、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰで形質移入した細胞集団の約３２％、およびドナーフラグメントが不在の、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ＲＮＰで形質移入した細胞集団（「ＴＲＡＣ ＫＯ」）の約２２％のみがＴＣＲを発現した。比較すると、図１５Ａに示される本質的に全ての非改変活性化Ｔ細胞（活性化Ｔ細胞「ＡＴＣ」）が、ＴＣＲを発現した。予想されるように、ドナーＤＮＡを受けなかったいずれの細胞も、抗ＣＤ３８構築物について陽性でなかった（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。一方、Ｃａｓ９ ＲＮＰまたはＣａｓ１２ａ ＲＮＰに加えて抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入したかなりのパーセンテージの細胞集団が、ＤＡＲ構築物の発現を実証した：Ｃａｓ９ ＲＮＰと共に抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入した集団の約５４％（図１５Ｄ）が抗ＣＤ３８ ＤＡＲを発現し、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰと共に抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物ドナーＤＮＡで形質移入した細胞集団の約７７％（図１５Ｅ）が抗ＣＤ３８ ＤＡＲを発現した。
Ｔｉｍ－３遺伝子座を標的とするＤＡＲ構築物で形質移入したＴ細胞集団のフローサイトメトリー分析の結果を、図１８Ａ～１８Ｂに示す。対照として含めた非形質転換活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）は、Ｔｉｍ－３遺伝子の発現を、形質移入細胞の約８４％実証した一方、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を発現しなかった。ノックアウト／ノックイン細胞について、集団の約１７％がＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を発現した一方、Ｔｉｍ－３遺伝子産物を発現しなかった。
図１９Ａ～１９Ｈは、図１９Ａおよび図１９Ｂにおいて、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナー構築物で形質移入したＴ細胞の約２％のみが、ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激しない場合にＧＭ－ＣＳＦを発現するが、これらの薬物により形質移入細胞を刺激すると、細胞の約５３％がＧＭ－ＣＳＦを産生することを示している。一方、図１９Ｃに見られるように、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナー構築物に加えてＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰで形質移入したＴ細胞の約２９％のみが、刺激直後にＧＭ－ＣＳＦを産生し、この場合、第２の遺伝子の同時ノックアウトが、４５％（５２．７８－２９．０７／５２．７８）と推定される頻度にて起こることの証拠である。
同じ細胞集団を、図１９Ｅ～１９Ｇにおいて、Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３８ ＤＡＲの発現について分析した。図１９Ｄは、抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントが不在のＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した場合、細胞のほぼ８０％（７８．５７％）がＴ細胞受容体を発現せず、そして予想されるように、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の発現は検出されなかったことを示す。対照的に、細胞を抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントと共にＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した場合、細胞集団のおよそ７０％が、天然Ｔ細胞受容体の発現の不在下で抗ＣＤ３８ ＤＡＲの発現を示した（図１９Ｅ）。最後に、第２の遺伝子標的化ＲＮＰ（ＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰ）の追加は、ＴＣＲノックアウト／ノックイン率を劇的に低下させず、ＲＮＰ（抗ＴＲＡＣおよび抗ＧＭ－ＣＳＦ）＋抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の双方で形質移入した細胞の約５０％が抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を発現した一方、内因性Ｔ細胞受容体を発現することはできなかった（図１９Ｆ）。これらの培養物では、高い割合（約４５％）の集団が、形質移入への抗ＧＭ－ＣＳＦ ＲＮＰの包含に起因するＧＭ－ＣＳＦノックアウトであると算出される。
図１９Ａおよび１９Ｂは、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナー構築物で形質移入したＴ細胞の約２％のみが、刺激しない場合にＧＭ－ＣＳＦを発現するが、これらの薬物により形質移入細胞を刺激すると、細胞の約５３％がＧＭ－ＣＳＦを産生することを示している。一方、図１９Ｄに見られるように、ＴＲＡＣ標的化ＲＮＰおよび抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナー構築物に加えてＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰで形質移入したＴ細胞の約１５％のみが、刺激直後にＧＭ－ＣＳＦを産生し、この場合、第２の遺伝子の同時ノックアウトが、７２％（５２．７８－１４．９／５２．７８）と推定される頻度にて起こることの証拠である。
同じ細胞集団を、図１９Ｈにおいて、Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３８ ＤＡＲの発現について分析した。図１９Ｅは、抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントが不在のＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した場合、細胞のほぼ８０％（７８．５７％）がＴ細胞受容体を発現せず、そして予想されるように、抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の発現は検出されなかったことを示す。対照的に、細胞を抗ＣＤ３８ ＤＡＲドナーフラグメントと共にＴＲＡＣ標的化ＲＮＰで形質移入した場合、細胞集団のおよそ７０％が、天然Ｔ細胞受容体の発現の不在下で抗ＣＤ３８ ＤＡＲの発現を示した（図１９Ｆ）。最後に、第２の遺伝子標的化ＲＮＰ（ＧＭ－ＣＳＦ標的化ＲＮＰ）の追加は、ＴＣＲノックアウト／ノックイン率を劇的に低下させず、ＲＮＰ（抗ＴＲＡＣおよび抗ＧＭ－ＣＳＦ）＋抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物の双方で形質移入した細胞の約６０％が抗ＣＤ３８ ＤＡＲ構築物を発現した一方、内因性Ｔ細胞受容体を発現することはできなかった（図１９Ｈ）。これらの培養物では、高い割合（約４９％）の集団が、形質移入への抗ＧＭ－ＣＳＦ ＲＮＰの包含に起因するＧＭ－ＣＳＦノックアウトであると算出される。
抗ＣＤ２０ ＤＡＲ細胞を、標的としてのＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞と２日間インキュベートしたことを除いて、本質的に実施例１と同様に実行した細胞毒性アッセイで細胞を試験した。図２１は、死滅のレベルが非常に高く、０．６２５：１～５：１に及ぶエフェクタ：標的比について９０％に近づき、０．１６：１の最も低いエフェクタ：標的比でも約７０％であったことを示している。図２２Ａ～２２Ｂは、抗ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞によって刺激された場合に、高レベルのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）およびＧＭ－ＣＳＦを分泌したことを実証している。また、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカインの分泌（実施例４参照）を示している。

Claims (78)

  1. ２つの異なる遺伝子座にて初代ヒトＴ細胞を遺伝子改変する方法であって、初代ヒトＴ細胞中に：
    第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび第１のガイドＲＮＡを含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と；
    第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび第２のガイドＲＮＡを含む第２のＲＮＰと；
    少なくとも２つの核酸修飾を含むドナーＤＮＡ分子と；
    を導入することを含み、
    前記第１のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の第１の遺伝子座の第１の標的部位とハイブリダイズするように設計された標的配列を含み、前記ドナーＤＮＡは、前記第１の標的部位にて標的ＤＮＡ分子中に挿入され、
    さらに、前記第２のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の第２の遺伝子座の第２の標的部位とハイブリダイズして、前記第２の標的部位にて変異をもたらすように設計された第２の標的配列を含む、方法。
  2. 前記少なくとも２つの核酸修飾は、前記ドナーＤＮＡ分子の一本鎖上にある、請求項１に記載の方法。
  3. １または複数の核酸修飾が、前記ドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の１または複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド結合の修飾である、請求項１または２に記載の方法。
  4. １または複数の核酸修飾が骨格修飾である、請求項１に記載の方法。
  5. １または複数の核酸修飾が、ホスホロチオアート修飾もしくはホスホロアミダイト修飾、またはそれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
  6. １または複数の核酸修飾が、核酸塩基の修飾または置換である、請求項１に記載の方法。
  7. １または複数の核酸修飾が、糖の修飾または置換である、請求項１に記載の方法。
  8. １または複数の核酸修飾が、デオキシリボースの２’－Ｏ－メチル基修飾である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ドナーＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項１または２に記載の方法。
  10. 前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖の逆鎖上に５’末端ホスファートを有する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ドナー分子は、前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の骨格上に１個～３個のホスホロチオラート修飾を、そして前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に１個～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ドナー分子は、前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内の骨格上に１～３個のホスホロチオラート修飾を、そして前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に１～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム中への組み込み用の配列に隣接する相同アームを含む、請求項１に記載の方法。
  14. 少なくとも１つの前記相同アームが、５０～２０００ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
  15. 少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～６６０ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
  16. 少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～２５０ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖および逆鎖を含み、前記修飾された鎖は、２またはそれを超える核酸修飾を含み、前記逆鎖は末端ホスファートを含む、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記ドナーＤＮＡは約５００～約５０００ｂｐ長である、請求項１に記載の方法。
  19. 前記ドナーＤＮＡは約５００～約３５００ｂｐ長である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ドナーＤＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を含む、請求項１に記載の方法。
  21. 前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび／または前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項１に記載の方法。
  22. 前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび／または前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ａであり、かつ前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９であり、または前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９であり、かつ前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ１２ａである、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記第１のＲＮＰおよび前記ドナーＤＮＡは、同時に導入される、請求項１に記載の方法。
  26. 前記第１のＲＮＰ、前記ドナーＤＮＡ、および前記第２のＲＮＰは、前記細胞中に同時に導入される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記第１のＲＮＰおよび前記ドナーＤＮＡは、前記細胞中に同時に導入され、前記第２のＲＮＰは、前記細胞中に異なる時点にて導入される、請求項１に記載の方法。
  28. 前記ＲＮＰは、エレクトロポレーションまたはリポソーム移入によって前記細胞中に導入される、請求項２７に記載の方法。
  29. 操作された初代Ｔ細胞であって：
    ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの第１の標的部位を含む第１の遺伝子座にてゲノム中に組み込まれた非天然遺伝子構築物と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの第２の標的部位を含む第２の遺伝子座での変異とを含み、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法によって生成される操作された初代Ｔ細胞。
  30. 遺伝子構築物で形質移入された初代ヒトＴ細胞の集団であって、前記細胞集団は、非天然遺伝子構築物が第１の遺伝子座にてゲノム中に組み込まれており、そしてさらに第２の遺伝子座の遺伝子中に変異を有する細胞を含み、前記集団の前記細胞の少なくとも２５％が前記遺伝子構築物を発現し、かつ前記第２の遺伝子座にて前記遺伝子の発現の低減を示す、初代ヒトＴ細胞の集団。
  31. 前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ標的部位および前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ部位は、Ｃａｓ１２ａ標的部位である、請求項３０に記載の初代ヒトＴ細胞の集団。
  32. 前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ標的部位はＣａｓ１２ａ標的部位であり、前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ部位はＣａｓ９標的部位である、請求項３０に記載のヒトＴ細胞の集団。
  33. 前記第１のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ標的部位はＣａｓ９標的部位であり、前記第２のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ部位はＣａｓ１２ａ標的部位である、請求項３０に記載のヒトＴ細胞の集団。
  34. 標的ＤＮＡ分子中へのドナーＤＮＡの部位特異的組み込み方法であって：
    細胞中に：
    Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼおよび操作されたガイドＲＮＡを含むＲＮＰと；
    少なくとも２つの核酸修飾を含むドナーＤＮＡ分子と；
    を導入することを含み、
    前記ガイドＲＮＡは、前記標的ＤＮＡ中の標的部位とハイブリダイズするように設計された標的配列を含み、前記ドナーＤＮＡは、前記標的部位にて前記標的ＤＮＡ分子中に挿入される、方法。
  35. 前記少なくとも２つの核酸修飾は、前記ドナーＤＮＡ分子の一本鎖上にある、請求項３４に記載の方法。
  36. １または複数の核酸修飾が、前記ドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の１または複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド結合の修飾である、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. １または複数の核酸修飾が骨格修飾である、請求項３４に記載の方法。
  38. １または複数の核酸修飾が、ホスホロチオアート修飾もしくはホスホロアミダイト修飾、またはそれらの組合せである、請求項３７に記載の方法。
  39. １または複数の核酸修飾が、核酸塩基の修飾または置換である、請求項３３に記載の方法。
  40. １または複数の核酸修飾が、糖の修飾または置換である、請求項３３に記載の方法。
  41. １または複数の核酸修飾が、デオキシリボースの２’－Ｏ－メチル基修飾である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ドナーＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項３４に記載の方法。
  43. 前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖の逆鎖上に５’末端ホスファートを有する、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ドナー分子は、前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の骨格上に１個～３個のホスホロチオラート修飾を、そして前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に１個～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有する、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ドナー分子は、前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内の骨格上に１～３個のホスホロチオラート修飾を、そして前記ドナー分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に１～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有する、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム中への組み込み用の配列に隣接する相同アームを含む、請求項３４に記載の方法。
  47. 少なくとも１つの前記相同アームが、５０～２０００ヌクレオチド長である、請求項４６に記載の方法。
  48. 少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～６６０ヌクレオチド長である、請求項４７に記載の方法。
  49. 少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～２５０ヌクレオチド長である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖および逆鎖を含み、前記修飾された鎖は、２またはそれを超える核酸修飾を含み、前記逆鎖は末端ホスファートを含む、請求項３４に記載の方法。
  51. 前記ドナーＤＮＡは約５００～約５０００ｂｐ長である、請求項３４に記載の方法。
  52. 前記ドナーＤＮＡは約５００～約３５００ｂｐ長である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ドナーＤＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を含む、請求項３４に記載の方法。
  54. 前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡである、請求項３４に記載の方法。
  55. ｔｒａｃｒ ＲＮＡを前記細胞中に導入することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＲＮＰは、エレクトロポレーションまたはリポソーム移入によって前記細胞中に導入される、請求項３４に記載の方法。
  57. 前記ドナーＤＮＡおよび前記ＲＮＰは、同時に、または別々に、前記細胞中に導入される、請求項３４に記載の方法。
  58. 標的遺伝子座中へのドナーＤＮＡの、標的化された組み込みのためのシステムであって、
    ａ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼと；
    ガイドＲＮＡと；
    二本鎖ドナーＤＮＡ分子であって、二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の前記二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された一本鎖上に、１または複数のホスホロチオアート結合を含む、ドナーＤＮＡ分子と
    を含むシステム。
  59. 前記ドナーＤＮＡ分子はさらに、二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に、修飾された鎖の糖部分または核酸塩基の少なくとも１つの修飾を含む、請求項５８に記載のシステム。
  60. 前記ドナーＤＮＡは、ゲノム中への組み込み用の、関心対象の配列に隣接する相同アームを有する、請求項５８に記載のシステム。
  61. 二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された一本鎖上の前記１または複数のホスホロチオアート結合は、前記二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内にある、請求項５８に記載のシステム。
  62. 修飾された鎖の糖部分または核酸塩基の少なくとも１つの前記修飾が、二本鎖ＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内にある、請求項６１に記載のシステム。
  63. 糖部分の少なくとも１つの前記修飾が、２’－Ｏ－メチル化を含む、請求項６１に記載のシステム。
  64. 関心対象の前記配列は、発現カセットを含む、請求項６０に記載のシステム。
  65. 前記発現カセットは、１または複数の抗体または受容体ドメインを含む構築物を含む、請求項６４に記載のシステム。
  66. 少なくとも１つの前記相同アームが、５０～２０００ヌクレオチド長である、請求項６０に記載の方法。
  67. 少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～６６０ヌクレオチド長である、請求項６３に記載の方法。
  68. 少なくとも１つの前記相同アームが、１４０～２５０ヌクレオチド長である、請求項６３に記載の方法。
  69. 前記ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖および逆鎖を含み、前記修飾された鎖は、２またはそれを超える核酸修飾を含み、前記逆鎖は末端ホスファートを含む、請求項６１に記載の方法。
  70. 前記ドナーＤＮＡは約５００～約５０００ｂｐ長である、請求項５８に記載の方法。
  71. 前記ドナーＤＮＡは約５００～約３５００ｂｐ長である、請求項５８に記載の方法。
  72. 前記ドナーＤＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を含む、請求項６４に記載の方法。
  73. 前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡである、請求項５８に記載のシステム。
  74. 前記ガイドＲＮＡは、１または複数のホスホロチオアート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドを含む、請求項５８に記載のシステム。
  75. 前記ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体を含む、請求項８に記載のシステム。
  76. ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物がＣＤ７遺伝子中に挿入されている、初代ヒトＴ細胞。
  77. 前記ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物は、ＣＥＡ ＣＡＲ構築物またはＤＡＲ構築物である、請求項７３に記載の初代ヒトＴ細胞。
  78. 請求項７３に記載のＴ細胞の集団。
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