JP2022521787A - Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼを使用するｄｎａ組み込みのための改善された方法 - Google Patents

Abstract

遺伝子操作された細胞を開発するための改善された、より安全な、商業的に効率的な方法が開示される。より具体的には、ドナーＤＮＡ構築物と、ガイドＲＮＡと、ＲＮＡガイドヌクレアーゼとを、形質移入されるべき宿主細胞とともに導入することと、前記３つの成分を前記宿主細胞中に導入することとを含む、方法が開示される。宿主細胞の所定のゲノム部位中にＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を挿入するために設計されたドナーＤＮＡ構築物がさらに開示される。さらに、本開示は、安全性の懸念を呈し得るウイルスベクターを欠くＣＡＲで形質移入された宿主細胞を提供する。本開示は、ＣＡＲ構築物を発現させるためにＴ細胞を操作するためのより効率的で、より費用効果の高い方法を提供する。

Description

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年１１月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０８７７３５＿０１０３＿ＳＴ２５．ＴＸＴと名付けられ、サイズは５２，０００バイトである。

関連出願
本願は、２０１９年２月２７日に出願された米国特許出願第１６／２８８，０５２号明細書の優先権を主張し、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本開示は、ｃａｓタンパク質などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを使用して、関心対象のＤＮＡ配列を宿主ゲノムなどの標的ＤＮＡ分子中に効率的に組み込むための方法および組成物を提供する。

背景
外因性ＤＮＡ配列のゲノム遺伝子座内への標的化された組み込みが非常に望まれている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム工学は、遺伝子機能をノックアウトする、または遺伝子補正もしくは遺伝子タギングのためにＤＮＡ配列を正確にノックインするための迅速かつ比較的簡単な方法である。標的化された遺伝子ノックアウトは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用してＤＮＡ中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することによって達成される。次いで、内因性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を介して、ランダムな挿入または欠失（インデル）によって、ＤＳＢは、しばしば不完全に修復される。ノックイン実験のためには、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡに加えて、ＤＮＡドナー鋳型が必要であり、ＤＳＢは、典型的には相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を介してドナー鋳型を用いて修復される。

一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ドナーオリゴまたはドナープラスミド（ｄｓＤＮＡ）のいずれかのドナー鋳型を使用するノックインは、しばしば１～１０％の範囲の比較的低い効率を有する。したがって、ＨＤＲ媒介性ノックイン実験の成功には、重要な設計の検討および実験の最適化が必要である。短い相同アームを有する一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を使用して、いくつかのグループは、ＳＮＰ補正またはエピトープタグ付加などの正確なＤＮＡ編集を達成している。ドナープラスミド（ｄｓＤＮＡ）は、はるかに長い外因性ＤＮＡを組み込むことができるが、効率は非常に低い。いくつかのグループは、ＡＡＶ（ウイルス）ベクターを使用してＨＤＲドナーｓｓＤＮＡを提供し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせて４０～６０％の遺伝子ノックイン効率を達成した。しかしながら、これらの方法は、依然として、高力価ＡＡＶベクターを作製する必要があり、これには時間がかかり、臨床用途のためにはｃＧＭＰ製造に適合している必要がある。

ゲノム工学ツールは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなどのいくつかの細菌のＩＩ型原核生物ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的に配置された短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））適応免疫系の成分に基づいて開発されてきた。ＲＮＡ誘導型Ｃａｓヌクレアーゼ系またはより単純にＣＲＩＳＰＲと呼ばれるこの多成分系は、ガイドＲＮＡ分子と結合して、ガイドＲＮＡによって標的とされる特異的な配列においてゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断を作出する能力を有するＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。ＲＮＡ誘導型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドがゲノム配列にハイブリッド形成するＤＮＡを切断する能力を有する。さらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られる特定の配列がゲノム中の標的配列のすぐ下流に存在する場合にのみＤＮＡを切断する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおける標準型のＰＡＭ配列は５’－ＮＧＧ－３’であり、Ｎは任意のヌクレオチドを指す。

天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系において２つの異なるＲＮＡとして通常発現される単一のキメラｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の発現は、標的ＤＮＡ配列を配列特異的に切断するようにＣａｓ９ヌクレアーゼに指示するのに十分であることが実証されている。さらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのいくつかの変異型が開発されている。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの１つの変異型はニッカーゼとして機能し、野生型Ｃａｓ９の場合のように両方の鎖ではなく、ＤＮＡの相補鎖中に切断を生成する。これにより、ＮＨＥＪではなく高忠実度経路を使用するＤＮＡ鋳型の修復が可能になり、標的遺伝子座におけるおよびおそらくはゲノム内の他の位置におけるインデルの形成が妨げられて、相同組換えを受ける能力を維持しながら、起こり得るオフターゲット／毒性作用が低減される。対になったニッキングは、細胞株においてオフターゲット活性を５０～１，５００倍低下させることができ、オンターゲット切断効率を失うことなくマウス接合子における遺伝子ノックアウトを促進することができる。

さらに、ｃａｓタンパク質は様々な細菌から単離されており、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｃａｓ９とは異なるＰＡＭ配列を使用することが明らかとなっているさらに、ｃａｓ１２ａなどのいくつかのｃａｓタンパク質は、本来は単一のＲＮＡガイドを使用する、すなわち、標的配列にハイブリッド形成するｃｒＲＮＡを使用するが、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用しない。

養子免疫療法は、エクスビボで生成された自己抗原特異的細胞の移入を含み、ウイルス感染症および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用される細胞は、抗原特異的細胞の増殖または遺伝子操作を介した細胞の再指示のいずれかによって生成することができる。

ＣＡＲは、単一の融合分子中で１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインと会合する標的化部分からなる合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は、柔軟なリンカーによって連結されたモノクローナル抗体の軽鎖および可変断片を含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も、首尾よく使用されている。第一世代ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃ受容体ガンマ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代ＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性を首尾よく再指示することが示されているが、インビボにおいて長期の増殖および抗腫瘍活性を与えることはできなかった。ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の生存を強化し、その増殖を増加させるために、単独で（第２世代）または組み合わせて（第３世代）添加されてきた。ＣＡＲは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性腫瘍由来の腫瘍細胞の表面で発現される抗原に対してＴ細胞を首尾よく再指示することを可能にした。

患者の血液からＴ細胞を取り出し、遺伝子導入によってＣＡＲを加え、遺伝子操作された細胞を体内に注入して戻すことを含むＣＡＲ（キメラ抗原受容体）細胞免疫療法は、癌を処置する上で最も有望な方法の１つである。現在、遺伝子導入技術には、ガンマ－レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用するウイルスベースの遺伝子導入方法が含まれる。ＧＭＰ（ＦＤＡが要求する優良医薬品製造基準）レベルのウイルスベクターを作製するために、ウイルスベクターは、複製不全、低遺伝毒性および低免疫原性などの臨床安全基準に適合しなければならない。これらの従来のアプローチは、使いやすさおよび合理的な発現を有するが、二次的な形質転換事象、例えば、望ましくない血液癌およびＴ細胞へのウイルスゲノムの組み込みから生じる他の事象を生じさせる可能性がある。

総説論文（Ｒｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ８（９）：６３４－６４３、２０１７）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用はいずれも、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）構築物をＴ細胞ゲノムに挿入するためのノックイン過程のためにウイルスベクターの使用を依然として伴うことを示す。「アデノウイルスおよびアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの非組込み型ウイルスによってコードされるＣＲＩＳＰＲを用いた遺伝子編集も報告されている」 さらに、２０１６年１１月４日にインターネット上で公開されたＲｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：１３００は、ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を使用し、Ｔ細胞中での遺伝子破壊がレンチウイルスおよびアデノウイルスのＣＲＩＳＰＲではあまり効率的でないことを見出した。

Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、いくつかの哺乳動物細胞を遺伝子操作するための魅力的なアプローチであるように見受けられるが、初代細胞中での、特にＴ細胞中でのＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲの使用は、（１）Ｔ細胞は、それらの細胞質へのＤＮＡの導入によって悪影響を受ける、すなわち、ＤＮＡベクターで細胞を形質転換すると、高い割合のアポトーシスが観察される；（２）ＣＲＩＳＰＲ系は、細胞中でのＣａｓ９の安定した発現を必要とするが、生細胞中でのＣａｓ９の長期発現は、染色体の欠陥をもたらし得る；（３）現在のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの特異性は、１１ヌクレオチド（Ｎ１２－２０ＮＧＧ、ここで、ＮＧＧはＰＡＭを表す）を含む配列によってのみ決定されるので、ゲノム内において唯一である所望の遺伝子座中の標的配列を同定することが非常に困難となるので、大幅により困難である。ＣＡＳ９に加えて、他のヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。

本開示は、Ｔ細胞などの宿主細胞においてＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの操作を効率的に実施するために、これらの制限に対する解決策を提供することを目的とする。当技術分野では、ウイルスベクターによる形質導入を含まず、代わりに形質移入技術を使用することができる、キメラ抗原受容体構築物のためのより安全な形質導入技術が必要とされている。これは、患者に投与される形質導入された細胞によって潜在的に発現されるウイルス遺伝子を有するリスクを回避しながら、ＣＡＲ構築物の形質移入効率を増大させることを含む。本開示は、本分野におけるこの必要性に対処するために為された。

Ｒｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ８（９）：６３４－６４３、２０１７ Ｒｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：１３００

要旨
第１の態様によれば、ドナーＤＮＡを標的ＤＮＡ分子中に部位特異的に組み込むための方法が記載される。この方法は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子と、少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡまたは操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸分子と、少なくとも２つの核酸修飾を含むドナーＤＮＡ分子とを細胞中に導入することを含む。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の標的部位とハイブリッド形成するように設計された標的配列を含み、ドナーＤＮＡは標的部位において標的ＤＮＡ分子中に挿入される。

開示された実施のいずれにおいても、本方法は、以下の細目のいずれをもさらに含むことができ、以下の細目は、明らかに相互排他的でない限り、任意の組み合わせで互いに組み合わされ得る。
（ｉ）前記少なくとも２つの核酸修飾は、ドナーＤＮＡ分子の単一の鎖上に存在し得る；
（ｉｉ）１またはそれを超える核酸修飾は、ドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内にある１またはそれを超えるヌクレオチドまたはヌクレオチド結合の修飾であり得る；
（ｉｉｉ）１またはそれを超える核酸修飾は、骨格修飾であり得る；
（ｉｖ）１またはそれを超える核酸修飾は、ホスホロチオアート修飾もしくはホスホロアミダイト修飾、またはこれらの組み合わせであり得る；
（ｖ）１またはそれを超える核酸修飾は、核酸塩基の修飾または置換であり得る；
（ｖｉ）１またはそれを超える核酸修飾は、糖の修飾または置換であり得る；
（ｖｉｉ）１またはそれを超える核酸修飾は、デオキシリボースの２’－Ｏ－メチル基修飾であり得る；
（ｖｉｉｉ）ドナーＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡ分子であり得る；
（ｉｘ）ドナーＤＮＡ分子は、少なくとも２つの核酸修飾を含む修飾された鎖を有し得、修飾された鎖とは反対の鎖上に５’末端ホスファートを有し得る；
（ｘ）ドナー分子は、ドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の骨格に１～３個のホスホロチオラート修飾およびドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に１～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有し得る；
（ｘｉ）ドナー分子は、ドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内の骨格に１～３個のホスホロチオラート修飾およびドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に１～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を有し得る；
（ｘｉｉ）ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム中に組み込むための配列に隣接する相同アームを含み得る；
（ｘｉｉｉ）相同アームの少なくとも１つは、５０～２０００ヌクレオチド長であり得る；
（ｘｉｖ）相同アームの少なくとも１つは、１００～１０００ヌクレオチド長であり得る；
（ｘｖ）相同アームの少なくとも１つは、１５０～６５０ヌクレオチド長であり得る；
（ｘｖｉ）相同アームの少なくとも１つは、１５０～３５０ヌクレオチド長であり得る；
（ｘｖｉｉ）相同アームの少なくとも１つは、１５０～２００ヌクレオチド長であり得る；
（ｘｖｉｉｉ）ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖および反対鎖を含み得、修飾された鎖は２つまたはそれを超える核酸修飾を含み得、反対鎖は末端ホスファートを含み得る；
（ｘｉｘ）ドナーＤＮＡはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を含み得る
（ｘｘ）ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡであり得る；
（ｘｘｉ）前記方法は、ｔｒａｃｒＲＮＡを細胞中に導入することをさらに含み得る；
（ｘｘｉｉ）ガイドＲＮＡは、キメラガイドＲＮＡであり得る；
（ｘｘｉｉｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４またはＣａｓＸであり得る；
（ｘｘｉｖ）少なくとも１つのガイドＲＮＡが細胞中に導入され得る；
（ｘｘｖ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが細胞中に導入され得る；
（ｘｘｖｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として細胞中に導入され得る；
（ｘｘｖｉｉ）ＲＮＰはｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る；
（ｘｘｖｉｉｉ）ＲＮＰは、電気穿孔またはリポソーム移入によって細胞中に導入され得る；
（ｘｘｉｘ）ドナーＤＮＡとＲＮＰは、同時にまたは別個に細胞中に導入され得る；
（ｘｘｘ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子と、少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡまたは操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸分子と、ドナーＤＮＡ分子とは、細胞中に同時に導入され得る；
（ｘｘｘｉ）細胞は真核細胞であり得る；
（ｘｘｘｉｉ）細胞は哺乳動物細胞であり得る；
（ｘｘｘｉｉｉ）細胞はヒト細胞であり得る；
（ｘｘｘｉｖ）細胞は造血細胞であり得る；
（ｘｘｘｖ）細胞はＴ細胞であり得る；
（ｘｘｘｖｉ）標的部位は、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ－１遺伝子またはＴＩＭ３遺伝子から選択され得る。

第２の態様によれば、宿主細胞が記載される。宿主細胞は、本明細書に記載の標的ＤＮＡ分子中に組み込まれた本明細書に記載のドナーＤＮＡを含み、宿主細胞は、本明細書に記載の方法のいずれによっても産生され得る。

第３の態様によれば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物で形質移入された初代Ｔ細胞の集団が記載される。初代Ｔ細胞の集団は、ｃａｓ９ヌクレアーゼ標的部位においてゲノム中に組み込まれたＣＡＲ構築物を有するＴ細胞を含み、集団のＴ細胞の少なくとも２０％はＣＡＲ構築物を発現し、集団のＴ細胞は組換えウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターに由来する配列を含まない。

開示された実施態様のいずれにおいても、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を形質移入された初代Ｔ細胞の集団は、以下の細目のいずれをもさらに含み得、以下の細目は、明らかに相互排他的でない限り、任意の組み合わせで互いに組み合わされ得る。
（ｉ）ＣＡＲ構築物は少なくとも１．８ｋｂであり得る；
（ｉｉ）ＣＡＲ構築物は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物または抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物であり得る；
（ｉｉｉ）集団の細胞の少なくとも４０％はＣＡＲ構築物を発現し得る；
（ｉｖ）集団の細胞の少なくとも５０％はＣＡＲ構築物を発現し得る；
（ｖ）ＣＡＲ構築物はＴＲＡＣ遺伝子座中に挿入され得る；
（ｖｉ）集団の細胞の少なくとも２０％はＴ細胞受容体を発現しないことがあり得る；
（ｖｉｉ）ＣＡＲ構築物はＰＤ－１遺伝子座中に挿入され得る；
（ｖｉｉｉ）集団の細胞の少なくとも２０％はＰＤ－１を発現しない。

第４の態様によれば、標的遺伝子座中へのドナーＤＮＡの標的化された組み込みのための系が記載される。この系は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子と、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子と、二本鎖ドナーＤＮＡ分子とを含む。ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に１またはそれを超えるホスホロチオアート結合を有する１つの修飾された鎖を含む。

開示された実施態様のいずれにおいても、この系は、以下の細目のいずれをもさらに含むことができ、以下の細目は、明らかに相互排他的でない限り、任意の組み合わせで互いに組み合わされ得る。
（ｉ）系はＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを含み得る；
（ｉｉ）系はガイドＲＮＡを含み得る；
（ｉｉｉ）ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に修飾された鎖の糖部分または核酸塩基の少なくとも１つの修飾をさらに含み得る；
（ｉｖ）ドナーＤＮＡは、ゲノム中に組み込むための関心対象の配列に隣接する相同アームを有し得る；
（ｖ）二本鎖ＤＮＡ分子の単一の鎖上の１またはそれを超えるホスホロチオアート結合は、修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に存在し得る；
（ｖｉ）修飾された鎖の糖部分または核酸塩基の少なくとも１つの修飾は、修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に存在し得る；
（ｖｉｉ）糖部分の少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル化を含み得る；
（ｖｉｉｉ）関心対象の配列は発現カセットを含み得る；
（ｉｘ）発現カセットは、１またはそれを超える抗体または受容体ドメインを含む構築物を含み得る；
（ｘ）相同アームの少なくとも１つは、５０～５０００ヌクレオチド長であり得る；
（ｘｉ）相同アームの少なくとも１つは、１００～１０００ヌクレオチド長であり得る；
（ｘｉｉ）相同アームの少なくとも１つは、１５０～８００ヌクレオチド長であり得る；
（ｘｉｉｉ）ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、ＣａｓＸおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され得る；
（ｘｉｉｉ）ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の配列を有するキメラガイドであり得る；
（ｘｉｖ）ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡであり得る；
（ｘｖ）ガイドＲＮＡは、１またはそれを超えるホスホロチオアート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドを含み得る；
（ｘｖｉ）ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡであり得、系はｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含み得る；
（ｘｖｉｉ）ガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡであり得る；
（ｘｖｉｉｉ）系は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとを含むリボ核タンパク質複合体を含み得る。

第５の態様によれば、ドナーＤＮＡ分子を生成するための組成物が記載される。組成物は、オリゴヌクレオチドの５’末端の５ヌクレオチド以内に１またはそれを超えるホスホロチオアート結合と１またはそれを超える修飾されたヌクレオチドとを有する第１のプライマー（一本鎖デオキシオリゴヌクレオチド）と、５’末端ホスファートを有する第２のプライマー（一本鎖デオキシオリゴヌクレオチド）とを含む。

開示された実施態様のいずれにおいても、ドナーＤＮＡ分子を生成するための組成物は、以下の細目をさらに含み得る。
（ｉ）第１および第２のプライマーは、標的ゲノム中のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの標的部位の反対側の配列に相同であり得る。

第６の態様によれば、関心対象の配列を宿主ゲノムの標的部位中に組み込むように構成された二本鎖ドナーＤＮＡ分子が記載される。二本鎖ドナーＤＮＡ分子は、１本のドナーＤＮＡ鎖のヌクレオチドに対する１またはそれを超える修飾と、関心対象の配列に隣接する相同アームであって、宿主ゲノム中で標的部位の両側に存在する配列に対して相同な配列を含む相同アームと、ドナーＤＮＡの１つの鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に存在する１～１０個の修飾されたヌクレオチドとを含む。

開示された実施態様のいずれにおいても、二本鎖ドナーＤＮＡ分子は、以下の細目のいずれをもさらに含むことができ、以下の細目は、明らかに相互排他的でない限り、任意の組み合わせで互いに組み合わされ得る。
（ｉ）二本鎖ドナーＤＮＡ分子は、ドナーＤＮＡの１つの鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内にある１～５個の修飾されたヌクレオチドを含み得る；
（ｉｉ）修飾されたヌクレオチドは、１～４個のホスホロチオアート（ＰＳ）結合もしくは１～４個の２’－Ｏ－メチル化修飾またはこれらの組み合わせを含み得る；
（ｉｉｉ）二本鎖ドナーＤＮＡ分子の一方の鎖は、５’末端から最初の１０ヌクレオチドまたは最初の５ヌクレオチドのいずれかに２またはそれを超える修飾を有し得、他方の鎖は末端５’ホスファートを有する。
（ｉｖ）関心対象の配列はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を含み得る；
（ｖ）標的部位は、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ－１遺伝子またはＴＩＭ３遺伝子から選択され得る。

図１Ａは、右側の構造において、プライマー中に存在し得る、ヌクレオチド間結合のホスホロチオアート（ＰＳ）修飾を示す化学的な図を提供する。左側のオリゴヌクレオチドに示されているヌクレオチドは、（修飾されていない）ホスホジエステル結合を介して結合されている。図１Ｂは、最も５’に位置するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド中の「下流」に位置する次のヌクレオチドに連結する２つのＰＳ結合を有し、次いで、このヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの次の下流ヌクレオチドにＰＳ結合によって付着されているオリゴヌクレオチドの化学的な図を提供する。オリゴヌクレオチドの最も５’に位置するヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。 図１Ａは、右側の構造において、プライマー中に存在し得る、ヌクレオチド間結合のホスホロチオアート（ＰＳ）修飾を示す化学的な図を提供する。左側のオリゴヌクレオチドに示されているヌクレオチドは、（修飾されていない）ホスホジエステル結合を介して結合されている。図１Ｂは、最も５’に位置するヌクレオチドをオリゴヌクレオチド中の「下流」に位置する次のヌクレオチドに連結する２つのＰＳ結合を有し、次いで、このヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの次の下流ヌクレオチドにＰＳ結合によって付着されているオリゴヌクレオチドの化学的な図を提供する。オリゴヌクレオチドの最も５’に位置するヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。 図２Ａは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする配列を有するオープンリーディングフレームと、その後に続くＣＤ８ａリーダーペプチドと、その後に続くＣＤ２８ヒンジ－ＣＤ２８膜貫通細胞内領域と、その後に続くＣＤ３ζ細胞内ドメインとを含むＣＡＲドナーＤＮＡ構築物などのドナーＤＮＡ構築物の構造を示す図である。コード配列の前にはＪｅＴプロモーター（配列番号３）が先行し、構築物は、相同アーム（ＨＡ）、この事例では、プロモーター＋コード配列に隣接するヒトＴＲＡＣ遺伝子座のマッチング配列を含む。これは、ドナーＤＮＡを生成するために使用される鋳型ＤＮＡの図を提供する。抗ＣＤ３８Ａ２は、発現がＪｅＴプロモーターによって誘導され、標的化された組み込みを可能にするために５’および３’側に相同アームが隣接するＣＤ３８ ＣＡＲ導入遺伝子を含有する。図２Ｂは、ノックインを確認するためのプライマーのデザインを示し、図２Ａと同じ図を示しており、ＣＡＲ内に位置する１つのプライマーと、標的化された組み込み部位において組み込みが行われたときに、それぞれ、１３７１ｂｐおよび１５９１ｂｐの産物を生成する、５’および３’末端の両方の相同アームの外側にあるＴＲＡＣ中の１つのプライマーとによる増幅によってＣＡＲ組み込みを確認するために使用されるＰＣＲプライマーの位置も示している。 図３Ａは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物を含んだドナーＤＮＡとＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを含むＲＮＰとで形質転換した８日後のＰＢＭＣのフローサイトメトリープロットを提供する。ＣＡＲカセットは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中の組み込み標的部位に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座配列と相同性を有する相同アームに隣接していた。Ｙ軸は、細胞サイズを報告する。抗ＣＤ３８構築物の発現はｘ軸に沿っている。陰性対照：標的細胞中にドナーＤＮＡが形質転換されなかった；修飾なし－ドナーＤＮＡは化学修飾を有していなかった；ＰＳ修飾：最も５’側の５つのヌクレオチド骨格位置内に、３つのホスホロチオアート結合が存在した；ＰＳ＋２’－ＯＭｅ：ホスホロチオアート結合に加えて、ドナーの最も５’側の５つのヌクレオチド内の３つのヌクレオチドが、ＰＳ修飾に加えて２’－ＯＭｅを含んでいた；ＴＣＲ ＫＯ／レトロウイルス構築物：ＴＣＲ遺伝子をノックアウトするために、ドナーＤＮＡの非存在下で細胞にＲＮＰを形質移入し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現させるために、レトロウイルスを形質導入した。図３Ｂは、形質移入の１０日後に、図３Ａと同じ培養物に対して行われたフローサイトメトリーの結果を提供する。図３Ｃは、形質移入の２０日後に、二重修飾されたドナーＤＮＡおよび対照（ＴＲＡＣノックアウトのみおよびレトロウイルス形質導入を伴ったＴＲＡＣノックアウト）を与えられた培養物に対して行ったフローサイトメトリーの結果を提供する。 図３Ａは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物を含んだドナーＤＮＡとＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを含むＲＮＰとで形質転換した８日後のＰＢＭＣのフローサイトメトリープロットを提供する。ＣＡＲカセットは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中の組み込み標的部位に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座配列と相同性を有する相同アームに隣接していた。Ｙ軸は、細胞サイズを報告する。抗ＣＤ３８構築物の発現はｘ軸に沿っている。陰性対照：標的細胞中にドナーＤＮＡが形質転換されなかった；修飾なし－ドナーＤＮＡは化学修飾を有していなかった；ＰＳ修飾：最も５’側の５つのヌクレオチド骨格位置内に、３つのホスホロチオアート結合が存在した；ＰＳ＋２’－ＯＭｅ：ホスホロチオアート結合に加えて、ドナーの最も５’側の５つのヌクレオチド内の３つのヌクレオチドが、ＰＳ修飾に加えて２’－ＯＭｅを含んでいた；ＴＣＲ ＫＯ／レトロウイルス構築物：ＴＣＲ遺伝子をノックアウトするために、ドナーＤＮＡの非存在下で細胞にＲＮＰを形質移入し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現させるために、レトロウイルスを形質導入した。図３Ｂは、形質移入の１０日後に、図３Ａと同じ培養物に対して行われたフローサイトメトリーの結果を提供する。図３Ｃは、形質移入の２０日後に、二重修飾されたドナーＤＮＡおよび対照（ＴＲＡＣノックアウトのみおよびレトロウイルス形質導入を伴ったＴＲＡＣノックアウト）を与えられた培養物に対して行ったフローサイトメトリーの結果を提供する。 図３Ａは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物を含んだドナーＤＮＡとＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを含むＲＮＰとで形質転換した８日後のＰＢＭＣのフローサイトメトリープロットを提供する。ＣＡＲカセットは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中の組み込み標的部位に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座配列と相同性を有する相同アームに隣接していた。Ｙ軸は、細胞サイズを報告する。抗ＣＤ３８構築物の発現はｘ軸に沿っている。陰性対照：標的細胞中にドナーＤＮＡが形質転換されなかった；修飾なし－ドナーＤＮＡは化学修飾を有していなかった；ＰＳ修飾：最も５’側の５つのヌクレオチド骨格位置内に、３つのホスホロチオアート結合が存在した；ＰＳ＋２’－ＯＭｅ：ホスホロチオアート結合に加えて、ドナーの最も５’側の５つのヌクレオチド内の３つのヌクレオチドが、ＰＳ修飾に加えて２’－ＯＭｅを含んでいた；ＴＣＲ ＫＯ／レトロウイルス構築物：ＴＣＲ遺伝子をノックアウトするために、ドナーＤＮＡの非存在下で細胞にＲＮＰを形質移入し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現させるために、レトロウイルスを形質導入した。図３Ｂは、形質移入の１０日後に、図３Ａと同じ培養物に対して行われたフローサイトメトリーの結果を提供する。図３Ｃは、形質移入の２０日後に、二重修飾されたドナーＤＮＡおよび対照（ＴＲＡＣノックアウトのみおよびレトロウイルス形質導入を伴ったＴＲＡＣノックアウト）を与えられた培養物に対して行ったフローサイトメトリーの結果を提供する。 図４は、標的ＴＲＡＣ（エクソン１）部位でのドナーＤＮＡの組み込みを示すＰＣＲ産物のゲルを示している。ＴＲＡＣ ＲＮＰのみまたはｓｓＤＮＡと一緒に、初代ヒトＴ細胞を電気穿孔した。ＰＣＲを使用して、電気穿孔の２週間後に、ＴＲＡＣ遺伝子座中に組み込まれた抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲ導入遺伝子の存在を確認した（レーン３および６、５’および３’の組み込み領域からの産物を示す）。形質転換されなかったＡＴＣ（レーン１および４）またはＴＲＡＣエクソン１を標的とするＲＮＰで形質転換されたがドナーＤＮＡを与えられなかったＴ細胞（レーン２および５）ではバンドは観察されなかった。 図５は、対照としての活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ、星）、ＴＣＲノックアウトＡＴＣ、抗ＣＤ３８Ａ２レトロウイルスを形質導入されたＣＡＲＴ細胞ＲＶ ＣＡＲＴ、黒い線）、ＴＲＡＣノックアウトレトロウイルスを形質導入されたＣＡＲＴ細胞（点）、ホスホロチオアート修飾されたｓｓドナーＤＮＡノックインとともにＴＲＡＣノックアウト（破線）、ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾されたｓｓＤＮＡノックインとともにＴＲＡＣノックアウト（破線および点）を用いた細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。 図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、Ｋ５２またはＲＰＭ１８２２６細胞と共培養された抗ＣＤ３８ ＣＡＲＴ細胞および対照を使用したサイトカイン分泌アッセイの結果のグラフを提供する。試験したＴ細胞培養物は、図５に提供されているとおりである。 図７は、異なる長さの相同アーム（ＨＡ）を有するドナーＤＮＡを試験した結果を提供する。ＴＣＲ発現の喪失（Ｙ軸）および抗ＣＤ３８発現（Ｘ軸）について、フローサイトメトリーによって培養物を評価した。 図８は、ドナーＤＮＡ分子の１つの鎖の５’末端の近位への３つのＰＳ結合および３つの２’－Ｏ－メチルヌクレオチドの付加によって修飾された二本鎖ドナーＤＮＡを試験した結果を提供する。ＴＣＲ発現の喪失（Ｙ軸）および抗ＣＤ３８発現（Ｘ軸）について、フローサイトメトリーによって培養物を評価した。 図９は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を提供する。ＲＮＰとの同時形質移入によって、ドナーをＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に誘導した。ＴＣＲ発現はＹ軸上で決定され、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現はＹ軸上で決定される。 図１０は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を提供する。ＲＮＰとの同時形質移入によって、ドナーをＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に誘導した。ＴＣＲ発現はＹ軸上で決定され、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現はＹ軸上で決定される。 図１１は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を提供する。ＲＮＰとの同時形質移入によって、ドナーをＴＲＡＣエクソン３遺伝子座に誘導した。ＴＣＲ発現はＹ軸上で決定され、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現はＹ軸上で決定される。 図１２は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのカセットを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入した細胞に対するフローサイトメトリーの結果を提供する。１つの培養物では、ドナーはＴＲＡＣエクソン３に由来する相同アームを有し、エクソン３ガイドＲＮＡを有するＲＮＰとの同時形質移入によってＴＲＡＣエクソン３遺伝子座に誘導された（２番目のパネル）。別の培養物では、ドナーはＴＲＡＣエクソン１に由来する相同アームを有し、エクソン１ガイドＲＮＡを有するＲＮＰとの同時形質移入によってＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に誘導された（２番目のパネル）。ＴＣＲ発現はＹ軸上で決定され、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現はＹ軸上で決定される。 図１３は、抗Ｃ３８ ＣＡＲを発現するためのカセットとＴＲＡＣ遺伝子またはＰＤ－１遺伝子に由来する相同アームとを含むｄｓ ＰＳおよび２’－ＯＭｅ修飾ドナーＤＮＡで形質移入された細胞に対するフローサイトメトリーの結果を提供する。１つの培養物では、ドナーはＴＲＡＣエクソン１に由来する相同アームを有し、エクソン１ガイドＲＮＡを有するＲＮＰとの同時形質移入によってＴＲＡＣエクソン１遺伝子座に誘導された（３番目のパネル）。別の培養物では、ドナーはＰＤ－１遺伝子座に由来する相同アームを有し、ＰＤ－１遺伝子ガイドＲＮＡを有するＲＮＰとの同時形質移入によってＰＤ－１遺伝子に誘導された（４番目のパネル）。ＴＣＲ発現はＹ軸上で決定され、抗ＣＤ３８または抗ＰＤ－１ ＣＡＲ発現はＹ軸上で決定される。 図１４は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物とＰＤ－１遺伝子からの標的配列を有するガイドＲＮＡを含むＲＮＰによってＰＤ－１遺伝子に標的化されるＰＤ－１遺伝子由来相同アームとを含む二重修飾された（ＰＳおよび２’－ＯＭｅ）ドナー断片で形質移入されたＴ細胞培養物を使用した細胞傷害性アッセイの結果を提供する。

詳細な説明
本開示は、免疫療法のための遺伝子操作されたおよび形質導入された細胞を開発するための改善された、より安全な、商業的に効率的な方法を提供する。より具体的には、開示された方法は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡ構築物を宿主細胞中に導入することを含み、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡとともに複合体を形成しているｃａｓタンパク質を宿主ゲノムの標的部位に誘導するように操作されている。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによる標的部位におけるゲノムＤＮＡの切断および相同組換え修復（ＨＤＲ）による、相同アームを含むドナー断片を用いた二本鎖切断のその後の修復は、相同アームの間に位置するドナーＤＮＡ分子の配列の組み込みをもたらす。この方法は、標的遺伝子座において遺伝子をノックアウトし、同時に、ドナーＤＮＡ分子中に付与される導入遺伝子を破壊された遺伝子座において挿入または「ノックイン」するために使用することができる。この方法は、原核細胞および真核細胞を含む任意の宿主細胞に対して使用することができ、ヒト細胞などの哺乳動物細胞とともに使用することができる。この方法は、使用の容易さ、効率、および臨床用途を含む多くの用途において望ましくない選択マーカーまたはウイルスベクターの使用を伴わないゲノム改変を生成する能力において利点を有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、例えばＴ細胞などの造血細胞、である。

本開示は、ドナーＤＮＡ組成物であって、ドナーＤＮＡ分子が１本のドナーＤＮＡ鎖のヌクレオチドに対する１またはそれを超える修飾を含む、ドナーＤＮＡ組成物も提供する。ドナーＤＮＡは、宿主ゲノム中へのその組み込みが所望される関心対象の配列に隣接する相同アームを含むことができ、相同アームは、宿主ゲノム中で標的配列の両側に存在する配列に相同な配列を有する。いくつかの実施形態におけるドナーＤＮＡは、二本鎖である。様々な実施形態において、ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡの１つの鎖の５’末端の近位にある、例えば、ドナーＤＮＡの１つの鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内に存在する１～１０個の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡの１つの鎖の５’末端に、１～１０個のヌクレオチドの少なくとも２種類の核酸修飾を有する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ドナーＤＮＡの１つの鎖の５’末端に、１～１０個のヌクレオチドの２種類の核酸修飾を有する。修飾は、例えば、ヌクレオチド間のホスホロチオアート（ＰＳ）結合であり得、またはドナーＤＮＡ分子の１もしくはそれを超えるヌクレオチドのデオキシリボースの２’－Ｏ－メチル化であり得る。例えば、ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖の５’末端から最初の５、最初の６または最初の７ヌクレオチド以内に１つ、２つ、３つまたは４つのＰＳ結合を有することができ、修飾された鎖の５’末端から最初の５、最初の６または最初の７ヌクレオチド以内に１つ、２つ、３つまたは４つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを有することもできる。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は二本鎖であり、１つの鎖は５’末端に修飾を含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は二本鎖であり、１つの鎖は５’末端から最初の１０または最初の５ヌクレオチドのいずれかに２またはそれを超える修飾を有し、反対の鎖は末端５’ホスファートを有する。様々な実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は二本鎖であり、ドナーＤＮＡの１つの鎖上に少なくとも２つのＰＳ結合と少なくとも２つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドとを有し、ＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾は、修飾された鎖の５’末端から最初の５ヌクレオチド以内に存在する。様々な実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は二本鎖であり、ドナーＤＮＡの１つの鎖上に３つのＰＳ結合と３つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドとを有し、ＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾は、修飾された鎖の５’末端から最初の５ヌクレオチド以内に存在する。これらの実施形態のいくつかの例において、反対鎖は末端５’ホスファートを含む。ドナーＤＮＡは、二本鎖分子として細胞中に導入される。

本開示はさらに、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を宿主細胞中に挿入するために設計されたドナーＤＮＡ構築物を提供する。さらに、本開示は、ウイルスベクターを欠くＣＡＲで形質導入された宿主細胞を提供する。本開示は、ＣＡＲ構築物を発現させるためにＴ細胞を操作するためのより効率的で、より費用効果の高い方法を提供する。ＣＡＲ構築物は、非限定的な例として、ＣＡＲ構築物のノックインとＴＣＲ、ＰＤ－１またはＴＩＭ３遺伝子のノックアウトを同時に行うために、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ－１遺伝子またはＴＩＭ３遺伝子に構築物を標的化する相同アームを含むことができる。

さらなる態様において、ゲノム改変のための系であって、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子と、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子と、ドナーＤＮＡ分子とを含み、ドナーＤＮＡ分子は、５’末端の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内に少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、ゲノム改変のための系が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、二本鎖であり、二本鎖ドナーＤＮＡ分子の一本鎖の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内に存在する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのヌクレオチド上に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの修飾を含む。修飾は、例えば、ホスホロチオアート結合および／またはヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化であり得る。ドナーＤＮＡは、ゲノム中に組み込まれるべき関心対象の配列に隣接する相同アームを有することができる。関心対象の配列は、例えば、１またはそれを超える抗体または受容体ドメインを含む構築物の発現のための発現カセットであり得る。相同アームは、約５０～約５０００ヌクレオチド長、または約１００～１０００ヌクレオチド長、例えば約１５０～約８００ヌクレオチド長であり得る。ドナーＤＮＡ分子において、相同アームは、同じ長さまたは異なる長さであり得る。

いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、ＣａｓＸおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の配列を有するキメラガイドであり得、またはｃｒＲＮＡであり得、１またはそれを超えるホスホロチオアート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドを必要に応じて含むことができる。ガイドがｃｒＲＮＡであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがｔｒａｃｒＲＮＡを使用する場合には、系はｔｒａｃｒＲＮＡも含むことができる。例えば、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとともに使用することができ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの構造的特徴を組み合わせたキメラガイドＲＮＡ（シングルガイドまたは「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれることもある）とともに使用することができる。他方、Ｃａｓ１２ａは、本来、ｃｒＲＮＡのみを使用し、関連するｔｒａｃｒＲＮＡを有しない。様々な実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡまたはキメラガイドＲＮＡであり得る）、および含まれる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは、細胞に導入されるリボ核タンパク質複合体として複合体化され得る。ドナーＤＮＡは、ＲＮＰとともに、または別個に、例えば別個の電気穿孔または形質移入において標的細胞中に導入することができる。

標的ＤＮＡ分子中へのドナーＤＮＡの部位特異的組み込みのための方法であって、
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子と、
少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡまたは操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸分子と、
少なくとも１つの核酸修飾を含むドナーＤＮＡ分子と、
を細胞中に導入することを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的ＤＮＡ中の標的部位とハイブリッド形成するように設計された標的配列を含み、前記ドナーＤＮＡは、前記標的部位において前記標的ＤＮＡ分子中に挿入される、方法も本明細書において提供される。様々な実施形態において、ドナーＤＮＡは、少なくとも２つの修飾されたヌクレオチドを含み、修飾されたヌクレオチドは同一のまたは異なる修飾を有することができ、好ましくはドナーＤＮＡの１つの鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内に存在する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは二本鎖であり、１またはそれを超えるヌクレオチド修飾は、ドナーＤＮＡ分子の単一の鎖上に存在する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは二本鎖であり、１またはそれを超えるヌクレオチド修飾は、修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内のドナーＤＮＡ分子の単一の鎖上に存在する。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ホスホロアミダイトまたはホスホロチオアート（ｐｈｏｓｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）修飾などの骨格修飾を含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、ヌクレオチドの糖部分の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは二本鎖であり、ドナーＤＮＡ分子の単一の鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのホスホロチオアート修飾を含み、ドナーＤＮＡ分子の単一の鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの２’－Ｏ－メチル化されたヌクレオチドをさらに含む。様々な実施形態において、ドナーＤＮＡは、例えば発現カセットなどの関心対象のＤＮＡ配列に隣接する相同アームを含み、相同アームは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの標的部位の両側にある標的ゲノム中の部位と相同性を有する。相同アームは、約５０～約２０００ｎｔの長さであり得、例えば、１００～１０００ｎｔの長さ、または１５０～６５０ｎｔの長さ、例えば、１５０～３５０ｎｔの長さ、または１５０～２００ｎｔの長さであり得る。ドナーＤＮＡ分子において、相同アームは、同じ長さまたは異なる長さであり得る。様々な実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、修飾された鎖上に２またはそれを超えるヌクレオチド修飾を有し、反対鎖は末端ホスファートを含む。

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ｃａｓタンパク質であり得、非限定的な例として、ｃａｓ９、ｃａｓ １２ａまたはｃａｓＸタンパク質であり得る。本方法の様々な実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびＲＮＡガイドは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として細胞中に導入される。ＲＮＰは、いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含むことができる。ＲＮＰは、例えば電気穿孔またはリポソーム移入を含む任意の実行可能な手段によって標的細胞中に導入することができる。ドナーＤＮＡは、ＲＮＰと同時に、または別々に細胞に送達され得る。

ドナーＤＮＡ分子を作製する方法であって、プライマーの５’末端の最初の５ヌクレオチド以内に少なくとも２つのヌクレオチド修飾を含む第１のプライマーと、５’末端ホスファートを含む第２のプライマーとを使用して、関心対象の配列に隣接する相同アームを含む鋳型ＤＮＡを増幅することを含む方法も本明細書に含まれる。様々な実施形態において、第１のプライマーは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の修飾を含むことができ、１を超える種類の修飾を含むことができる。例えば、ドナーＤＮＡ分子を作製するためのプライマーは、プライマーの５’末端の５ヌクレオチド以内のヌクレオチドの少なくとも１つのホスホロチオアート修飾および少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル修飾を含むことができる。

第１および第２のプライマーは、標的ゲノム中のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの標的部位の反対側の配列に相同であり得る。第１のプライマーは、オリゴヌクレオチドの修飾された鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内に１またはそれを超えるホスホロチオアート結合および１またはそれを超える２’－Ｏ－メチル化されたヌクレオチドを含むことができ、例えば、第１のプライマーは、３つのホスホロチオアート結合および３つの２’－Ｏ－メチル化されたヌクレオチドを有することができる。プライマーは、例えば、１７～１００ヌクレオチド長、例えば、１７～３０オリゴヌクレオチド長であり得る。関心対象の標的部位を取り囲む配列に対して相同な隣接配列を有する構築物に基づくドナー断片が所望のヌクレオチドまたは骨格修飾を用いて作製され得るように、プライマーは、ヒト遺伝子中などのゲノム中のｃａｓ標的部位の両側のゲノム配列の反対鎖にハイブリッド形成するように設計されている。

哺乳動物ゲノム中に挿入するためのドナーＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを含む組成物がさらに含まれる。組成物は、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーと第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーとを含むことができ、第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、プライマーの５’末端の５ヌクレオチド以内のヌクレオチドの少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル修飾とプライマーの５’末端の５ヌクレオチド以内の少なくとも１つのホスホロチオアート修飾とを含む。第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーはプライマー対であり、第１および第２のプライマーは、ｃａｓヌクレアーゼの標的部位の一方の側にある少なくとも１８ヌクレオチドの配列を含む標的部位を含む配列を増幅することができ、第２のプライマーは、ｃａｓヌクレアーゼの標的部位の反対鎖側にある少なくとも１８ヌクレオチドの配列を含む。

定義
具体的に別段の記載がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。さらに、本明細書に記載されている方法または材料と類似または同等の任意の方法または材料を、本開示の実施において使用することができる。

本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」という用語は、１つの要素を有する態様を含むのみならず、１より多い要素を有する態様も含む。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の指示をしなければ、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ」という言及は、複数のこのような細胞を含み、「ｔｈｅ ａｇｅｎｔ」という言及は、当業者に公知の１またはそれを超える作用部室への言及を含むなどである。

「初代細胞」という用語は、多細胞生物から直接単離された細胞を指す。初代細胞は、典型的には、極めて少ない集団倍加を経験しており、したがって、連続的な（腫瘍または人工的に不死化された）細胞株と比較して、初代細胞が由来する組織の主要な機能的成分をより多く表現する。いくつかの事例では、初代細胞は、単離された後に直ちに使用された細胞である。他の事例では、初代細胞は無限に分裂することができず、したがってインビトロで長期間培養することができない。

「ゲノム編集」という用語は、１またはそれを超えるヌクレアーゼを使用して、標的ＤＮＡ、例えば細胞のゲノムにＤＮＡが挿入され、置換され、または標的ＤＮＡ、例えば細胞のゲノムから除去される遺伝子工学の一種を指す。ヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置に特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を作出し、相同組換え修復（ＨＤＲ）（例えば、相同組換え）によってまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、誘導された切断を修復するために細胞の内因性機構を利用する。標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するために、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、これらの変異形、これらの断片、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の適切なヌクレアーゼを細胞中に導入することができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）による正確なゲノム編集の効率を向上させるために、標的ＤＮＡ配列のヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ ｍＲＮＡ）と組み合わせて本明細書に記載の修飾されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して「誘導」または「調節」（例えば、強化）することができる。

「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」という用語は、修復を誘導するために相同な鋳型を使用して二本鎖ＤＮＡ切断を正確かつ精密に修復する細胞内の機構を指す。ＨＤＲの最も一般的な形態は、２つの類似のまたは同一のＤＮＡの分子間でヌクレオチド配列が交換される遺伝的組換えの一種である、相同組換え（ＨＲ）である。

「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、相同な鋳型を必要とせずに切断末端が直接連結される二本鎖ＤＮＡ切断を修復する経路を指す。

「核酸」、「ヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖、二本鎖または多重鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびこれらのポリマーを指す。本用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドまたはプリンおよび／もしくはピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、合成のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらの類似体の混合物を含むことができる。本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、および天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸も包含する。特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異形（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１またはそれを超える選択された（または全ての）コドンの三番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８，１９８５；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１－９８，（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。

「ヌクレオチド類似体」または「修飾されたヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））の中もしくは上に、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾されたリボース、修飾されたデオキシリボース、６員の糖類似体、または鎖式の糖類似体）の中もしくは上に、またはホスファートに１またはそれを超える化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。

「遺伝子」または「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡセグメントは、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の制御に関与する、コード領域に先行するおよび後続する領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために互換的に使用される。これらの用語は、１またはそれを超えるアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。

「変異形」という用語は、自然に存在するものから逸脱する、生物、株（ｓｔｒａｉｎ）、遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは特徴の形態を指す。

「相補性」という用語は、伝統的なワトソン－クリックまたはその他の非伝統的な型のいずれかによって別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の残基の百分率を示す（例えば、１０個のうち５個、６個、７個、８個、９個、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれを超えるヌクレオチドの領域にわたる、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する２つの核酸を指す。

ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」という用語は、標的配列に対して相補性を有する核酸が、その条件下で、主に標的配列とハイブリッド形成し、非標的配列とは実質的にハイブリッド形成しない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に配列依存性であり、多くの要因に応じて変化する。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリッド形成する温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ １，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。

「ハイブリダイゼーション」という用語は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を表す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３またはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。

「組換え発現ベクター」は、宿主細胞中での特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定された核酸エレメントを有する、組換え的にまたは合成的に作製された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスゲノムまたは核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された転写されるべきポリヌクレオチドを含む。

「機能的に連結された」とは、コード配列の転写を指示するプロモーターなどの、エレメントの適切な生物学的機能を可能にする相対位置で配置された、ポリヌクレオチドコード配列とプロモーターなどの２またはそれを超える遺伝的エレメントを意味する。

「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指示する核酸制御配列の整列を指す。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位付近に必要な核酸配列、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対の場所に位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも必要に応じて含む。発現ベクター中に存在し得る他のエレメントとしては、転写を増強するもの（例えば、エンハンサー）および転写を終結するもの（例えば、ターミネータ）、ならびに発現ベクターから産生された組換えタンパク質に一定の結合親和性または抗原性を付与するものが挙げられる。

「組換え」とは、遺伝的に改変されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、組織または生物を指す。例えば、組換えポリヌクレオチド（または組換えポリヌクレオチドの複製もしくは相補体）は、周知の方法を用いて操作されたものである。第２のポリヌクレオチド（例えば、コード配列）に機能的に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅｓ １－３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４－１９９８）に記載されている方法による）ヒト操作の結果として、第２のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含むことができる。組換え発現カセット（または発現ベクター）は、典型的には、天然には見出されない組み合わせでポリヌクレオチドを含む。例えば、ヒト操作された制限部位またはプラスミドベクター配列は、プロモーターに隣接し、または他の配列からプロモーターを隔てることができる。組換えタンパク質は、組換えポリヌクレオチドから発現されるものであり、組換え細胞、組織および生物は、組換え配列（ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）を含むものである。

「一塩基多型」または「ＳＮＰ」という用語は、対立遺伝子内を含むポリヌクレオチドでの単一ヌクレオチドの変化を指す。これには、１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置換、および単一ヌクレオチドの欠失または挿入が含まれ得る。最も典型的には、ＳＮＰは二対立遺伝子のマーカーであるが、三対立遺伝子のマーカーおよび四対立遺伝子のマーカーも存在し得る。非限定的な例として、ＳＮＰ Ａ＼Ｃを含む核酸分子は、多型位置にＣまたはＡを含み得る。

「培養する」、「培養している」、「増殖する」、「増殖する」、「維持する」、「維持している」、「拡大する」、「拡大している」などの用語は、細胞培養自体または培養の過程を指す場合には、細胞（例えば、初代細胞）が、制御された条件下で、例えば生存に適した条件下でその通常の環境の外において維持されることを意味するために互換的に使用され得る。培養された細胞は生存を可能にされ、培養は、細胞増殖、静止、分化または分裂をもたらし得る。一部の細胞が自然に死滅または老化する可能性があるため、この用語は、培養物中の全ての細胞が生存、増殖または分裂することを意味しない。細胞は、典型的には培地中で培養され、培地は培養の過程で交換することができる。

「対象」、「患者」および「個体」という用語は、本明細書では、ヒトまたは動物を含むように互換的に使用される。例えば、動物対象は、哺乳動物、霊長類（例えば、サル）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ）、愛玩（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、鳥）、獣医学的に重要な動物、または経済的に重要な動物であり得る。

「投与する」という用語は、対象への経口投与、局所接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、髄腔内、鼻腔内または皮下投与を含む。投与は、非経口および経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸または経皮）を含む任意の経路によるものである。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内および頭蓋内が含まれる。他の送達様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これらに限定されない。

「処置する」という用語は、治療的利益および／または予防的利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、処置中の１またはそれを超える疾患、症状または症候に対する任意の治療上適切な改善または効果を意味する。予防的利益のために、組成物は、特定の疾患、症状もしくは症候を発症するリスクがある対象、または疾患、症状もしくは症候が未だ顕在化していないかもしれないが、疾患の生理学的症候の１またはそれより多くを報告する対象に投与され得る。

「有効量」または「十分な量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、修飾されたシングルガイドＲＮＡなど）の量を指す。治療有効量は、処置されている対象および疾患症状、対象の体重および年齢、疾患症状の重症度、投与の様式などの１またはそれより多くに応じて変動し得、当業者によって容易に決定され得る。具体的な量は、選択される特定の作用物質、標的細胞の種類、対象における標的細胞の位置、従うべき投薬レジメン、他の作用物質と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、およびそれが運搬される物理的送達系の１またはそれより多くに応じて異なり得る。

「薬学的に許容され得る担体」という用語は、細胞、生物または対象への作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、修飾されたシングルガイドＲＮＡなど）の投与を補助する物質を指す。「薬学的に許容され得る担体」は、組成物または製剤中に含めることができ、患者に対して著しい有害な毒性作用を引き起こさない担体または賦形剤を指す。薬学的に許容され得る担体の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、通常の生理食塩水溶液、乳酸リンゲル液、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、香料および着色料などが挙げられる。当業者は、他の薬学的担体が本発明において有用であることを認識するであろう。

ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関する「安定性を増大させる」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の構造を安定化する修飾を指す。この用語は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の分解を減少させ、阻害し、減弱させ、または低下させる修飾を含む。

ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関する「特異性を増加させる」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の特異的な活性（例えば、オンターゲット活性）を増加させる修飾を指す。この用語は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の非特異的な活性（例えば、オフターゲット活性）を減少させ、阻害し、減弱させ、または低下させる修飾を含む。

ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関する「毒性を減少させる」という用語は、細胞、生物、対象などに対するＣＲＩＳＰＲ系の任意の分子成分の毒性効果を減少させ、阻害し、減弱させ、または低下させる修飾を指す。

ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関する、および遺伝子制御の文脈における「増強された活性」という用語は、ゲノム編集および／または遺伝子発現を誘導する、調整する、制御する、または調節する効率および／または頻度の増加または改善を指す。

参照した数値に関する「約」という用語は、その値からプラスまたはマイナス１０％の範囲の値を含むことができる。例えば、「約１０」の量は、９、１０および１１の参照数字を含む９～１１の量を含む。参照した数値に関する「約」という用語は、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の範囲の値も含むことができる。

ＩＶ．非ウイルス形質移入工程
高い効率の標的化された遺伝子組み込みアプローチを提供する方法が本明細書に開示されている。本方法は、任意の細胞型のゲノム工学に対して使用することができ、例えば、操作された細胞が患者内に導入される用途において使用することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、癌を処置する構築物、例えば、例えばＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、ＢＣＭＡなどのいずれかに対するＣＡＲをＴ細胞中に設置するために使用することができる。遺伝子導入の効率は４０～８０％に達することができる。標的化された遺伝子組み込みを使用するこのアプローチは、自己および同種異系アプローチの両方に使用することができ、重要なことに、操作された細胞が患者内に導入されたときに二次的なおよび望ましくない細胞形質転換のリスクを伴わず、したがって現在の慣用的アプローチよりも安全である。さらなる利点としては、改変されたガイド鎖、信頼できる遺伝子組み込み、巨大な遺伝子の組み込み、ＣＡＲの遺伝子組み込み、および高発現でのＣＡＲの遺伝子組み込みが挙げられる。

実施例は、ＰＣＲによって合成されたホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾された一本鎖または二本鎖ドナーＤＮＡを使用するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ媒介性ゲノム編集を介したＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を開示する。好ましくは、修飾された一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡは、１つのプライマーの５’末端の１０ヌクレオチドまたは５ヌクレオチド以内のヌクレオチドに３つのＰＳ結合を付加することによって作製される。本発明をいずれかの特定の機構に限定するものではないが、ＰＳ修飾は、ドナーＤＮＡの修飾された鎖のエキソヌクレアーゼ分解を阻害すると考えられる。プライマーの５’末端の１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内のヌクレオチドも、ホスホロチオアート結合によって引き起こされる非特異的結合を回避するために２’－Ｏ－メチルで修飾した。ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾されたｄｓドナーＤＮＡおよびｓｓドナーＤＮＡは、ＰＣＲ、非対称ＰＣＲまたは逆転写によって作製することができる。あるいは、合成の最終ｄｓ ＤＮＡ産物をホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチルで修飾することができ、ｄｓＤＮＡは１つの鎖のみに対する修飾によって生成することができる。

ＣＡＲ構築物を含む、すなわち、宿主細胞の所定のゲノム部位中にＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を挿入するために設計された、ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチルなどの化学修飾を有するドナーＤＮＡ構築物などのドナーＤＮＡ構築物がさらに開示される。さらに、本開示は、安全性の懸念を呈し得るウイルスベクターを欠くＣＡＲで形質移入された宿主細胞を提供する。

１つの鎖上に修飾を有するドナーＤＮＡを使用するこの方法は、ノックイン効率を少なくとも２倍増加させることができ、これはウイルスベクター法と同等であり、従来のレトロウイルスまたはレンチウイルスアプローチと比較して、組み込みの部位特異性およびＴ細胞中でのＣＡＲ発現に関して非常に安定であるという利点を有する。ホスホロチオアートおよび／または２’－Ｏ－メチルによる１つのドナー鎖の少なくとも二重の修飾は、ノックイン効率を増加させることができる。この１段階ノックアウト／ノックイン法は、複数の癌治療のためのより迅速でより安価なＣＡＲ－Ｔ作製方法を提供する。二本鎖ＤＮＡを使用できること、ならびにドナー構築物のヌクレアーゼ処理および手間がかかり収率を低下させる一本鎖の回収を回避できることは、この方法の別の利点である。

本出願において、本発明者らは、ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する修飾されたｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡドナーによる長いｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ（例えば、約３ｋｂの抗ＣＤ３８ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲ）をノックインするための簡単で頑強な方法を提示する。本発明者らは、修飾された長いｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ配列が、初代Ｔ細胞中へのＣＡＲの組み込みのための極めて効率的なＨＤＲ鋳型であることを示す。さらに、本発明者らは、この方法が、従来のレトロウイルスまたはレンチウイルスアプローチと比較して、組み込みの部位特異性およびＴ細胞中でのＣＡＲ発現に関して極めて安定的という利点を有することを実証する。

ゲノムへの標的化された組み込みのための本明細書中に提供される方法を使用したＴ細胞中へのＣＡＲ構築物の導入は、ウイルスベクター、例えば任意の組換えウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターの使用を完全に回避する。したがって、本開示は、集団の細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％がゲノムに組み込まれたＣＡＲ構築物を発現し、集団の細胞のいずれもがウイルスベクターまたはウイルスベクターに由来する任意の配列を含まない、初代ヒトＴ細胞の集団を提供する。例えば、ゲノム中に組み込まれたＣＡＲ構築物を含む本明細書中に提供されるＴ細胞の集団は、集団中で検出可能なレトロウイルス配列またはアデノウイルス配列を一切有しない。ゲノム中に組み込まれたＣＡＲ構築物は、ウイルスベクター配列またはウイルスベクターに由来する配列を含まなくてもよい。集団は、本明細書で提供される方法および／または系を使用してＣＡＲ構築物をコードするドナーＤＮＡで形質移入された集団であり得る。ＣＡＲ構築物は、ガイドＲＮＡによって標的化されるＴ細胞のゲノム内の部位中に組み込まれる。ＣＡＲ構築物は、ｃａｓ標的部位、すなわち、ｃａｓヌクレアーゼに特異的なＰＡＭに隣接する部位に組み込まれる。例えば、ＣＡＲ構築物は、ｃａｓ９ ＰＡＭに隣接するゲノム中の標的部位に組み込まれる。非限定的な例として、ＣＡＲ構築物は、Ｔ細胞受容体遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子）またはＰＤ－１遺伝子、例えば限定されないが、配列番号１、配列番号２６および配列番号３２中に組み込まれ得る。様々な実施形態において、ＴＲＡＣ遺伝子中の部位またはＰＤ－１遺伝子中の部位などのゲノム中の標的された部位中へのＣＡＲ構築物の挿入は、ＴＲＡＣ遺伝子またはＰＤ－１遺伝子のノックアウト（破壊された発現）をもたらす。したがって、本開示は、集団の細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％または少なくとも４０％が、ゲノム中に組み込まれたＣＡＲ構築物を発現し、標的化された組み込みによってノックアウトされる遺伝子（例えば、ＴＲＡＣまたはＰＤ－１遺伝子）を発現しない初代Ｔ細胞の集団であって、細胞のいずれもが、ウイルスベクターまたはウイルスベクターに由来する任意の配列を含まない、初代Ｔ細胞の集団を提供する。例えば、ゲノム中に組み込まれたＣＡＲ構築物を含む本明細書中に提供されるＴ細胞の集団は、集団中で検出可能なレトロウイルス配列またはアデノウイルス配列を一切有しない。組み込まれたＣＡＲ構築物は、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも１．７ｋｂ、少なくとも１．９ｋｂ、少なくとも２ｋｂまたは少なくとも２．１ｋｂの長さであり得る。非限定的な例では、ＣＡＲ構築物は、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２３またはＢＣＭＡのいずれかを結合するＣＡＲをコードするＣＡＲ構築物であり得る。いくつかの例示的な実施形態において、ＣＡＲ構築物は抗ＣＤ３８ ＣＡＲ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡ ＣＡＲであることができる。

本開示は、ＣＡＲ遺伝子を初代細胞中で発現させるための方法であって、
（ａ）選択されたノックアウト核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ｓｇＲＮＡ配列のヌクレオチドの１またはそれより多くが必要に応じて修飾されたヌクレオチドである、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と、
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、またはＣａｓポリペプチドであって、
修飾されたｓｇＲＮＡがＣａｓポリペプチドをノックアウト核酸の部位へ誘導する、Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、またはＣａｓポリペプチドと、（ｃ）５’ＨＡ配列と、プロモーター配列と、ＣＡＲ構築物と、３’ＨＡ配列とを含むドナー標的ＤＮＡであって、ドナー標的ＤＮＡは、好ましくは二本鎖であり、５’エキソヌクレアーゼ切断を低下させるために、前記ドナーの５’末端の５ヌクレオチド以内で少なくとも１つのホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）結合で修飾された両方の鎖または好ましくは１つの鎖を有し、５’末端の５ヌクレオチド以内に１つ、２つ、３つまたは４つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを必要に応じて含むドナー標的ＤＮＡと、を初代細胞中に導入することを含む方法を提供する。好ましくは、修飾された鎖の反対鎖は５’末端ホスファートを有する。

本開示は、初代細胞中でＣＡＲ遺伝子の遺伝子発現を誘導するための方法であって、
（ａ）選択された標的ノックアウト核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列を含む、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡであって、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ中のヌクレオチドの１またはそれより多くが必要に応じて修飾されたヌクレオチドである、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡと、
（ｂ）Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、またはＣａｓポリペプチドであって、ｃｒＲＮＡがＣａｓポリペプチドをノックアウト核酸の部位に誘導する、Ｃａｓポリペプチド、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、および／またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、またはＣａｓポリペプチドと、（ｃ）５’ＨＡ配列と、プロモーター配列と、ＣＡＲ構築物と、３’ＨＡ配列とを含むドナー標的ＤＮＡであって、ドナー標的ＤＮＡは、好ましくは二本鎖であり、５’エキソヌクレアーゼ切断を低下させるために、前記ドナーの５’末端の５ヌクレオチド以内で少なくとも１つのホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）結合で修飾された両方の鎖または好ましくは１つの鎖を有し、５’末端の５ヌクレオチド以内に１つ、２つ、３つまたは４つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを必要に応じて含むドナー標的ＤＮＡと、を初代細胞中に導入することを含む方法を提供する。好ましくは、修飾された鎖の反対鎖は５’末端ホスファートを有する。

実施例は、ドナーＤＮＡをノックインし、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＰＤ－１遺伝子などの標的内因性遺伝子をノックアウトするための、ウイルスベクターを使用せずに高い形質移入効率を提供する開示された方法の利点を示す。

健康なボランティアドナーからのバフィーコートをサンディエゴ血液バンクから入手した。一部の新鮮な全血または白血球除去産物は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓから入手した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心によって単離した。３００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）とともに５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＡＩＭ－Ｖ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中にて２日間、１００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって、１０^６細胞／ｍＬの密度で、ＰＢＭＣを活性化した。２日～３日毎に培地を交換し、１０^６個／ｍＬで細胞を再播種した。この処理は、培養物中のＴ細胞を選択的に増幅する。いくつかの実験では、３００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を加えた５％ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されたＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で、１０^６細胞／ｍＬの密度で細胞を培養した。いくつかの実験では、製造者の説明書に従ってＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞単離キットまたはＣＤ３陽性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を使用し、磁気による負の選択を使用してＰＢＭＣからＴ細胞を単離した。

細胞傷害性アッセイでの使用のために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように、ＣＤ３８を発現するＲＰＭＩ－８２２６多発性骨髄腫細胞株）細胞を形質導入した。Ｒ－フィコエリトリン（ＲＰＥ）を発現するように、ＣＤ３８を発現しないＫ５６２（ヒトの不死化された骨髄性白血病）細胞を形質導入した。１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（ＡＴＣＣ）中で、両細胞株を培養した。ＣＡＲプラスミドは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて作製した。骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＭＣＳは、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。

いくつかの実験では、レトロウイルスにより形質導入されたＴ細胞をＣａｓ媒介性ノックイン細胞と比較した。レトロウイルス構築物でのＴ細胞の形質導入は、Ｍａら、２００４ Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６１：１２－２５；およびＭａら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７４（３）：２８６－２９６、２０１４（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているとおりに本質的に実施した。簡潔に述べると、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ ＭＦＧレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡは、狭宿主性レトロウイルスを作製するために、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ）中に形質移入され、次いで、ＰＧ１３パッケージング細胞にＧａｌ－Ｖ外被を形質導入して、ヒト細胞を感染するためのレトロウイルスを作製するために、採取された一過性ウイルス上清（狭宿主性ウイルス）を使用した。次いで、ＣＤ３またはＣＤ３／ＣＤ２８活性化の２～３日後に、活性化Ｔ細胞（またはＰＢＭＣ）を形質導入するために、ＰＧ１３細胞からのウイルス上清を使用した。活性化されたヒトＴ細胞は、５％ＦＢＳが補充されたＡＩＭ－Ｖ増殖培地（ＧＩＢＣＯ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で２日間、製造業者のマニュアルのとおりに１００ｎｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｔｉａｎ、ＮＪ）または抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｌｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎ）および３００～１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ２で、正常な健康ドナー末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を活性化することによって調製した。１０μｇ／ｍＬのレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）で予め被覆された６ウェルプレート中で、３ｍＬのウイルス上清で５×１０^６個の活性化されたヒトＴ細胞を形質導入し、１０００ｇで１時間、３２℃で遠心分離した。形質導入後、５％ＦＢＳおよび３００～１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ２を補充されたＡＩＭ－Ｖ増殖培地中で、形質導入されたＴ細胞を拡大増殖した。

［実施例１］ヒトＴ細胞での同時の、Ｔ細胞受容体遺伝子ノックアウトと抗ＣＤ３８ ＣＡＲのノックイン。
本実施例では、ドナーＤＮＡとして抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物を用いて、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的化した。ゲノム中の標的配列（ＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴ（配列番号１））に隣接するＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）のおよそ１．３ｋｂのゲノムＤＮＡ配列を用いて、ｐＡＡＶ－ＴＲＡＣ－抗ＣＤ３８構築物を設計した。標的配列は、Ｃａｓ９媒介遺伝子破壊およびドナー構築物の挿入のためのＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１におけるＣａｓ９ ＰＡＭの上流部位として同定された。抗ＣＤ３８ ＣＡＲ遺伝子構築物（配列番号２）は、ヒトＣＤ３８に特異的な一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、続いてＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ－ＣＤ２８膜貫通－ＣＤ２８細胞内領域およびＣＤ３ζ細胞内ドメインをコードする配列を含んでいた。抗ＣＤ３８ ＣＡＲの転写を開始するために、外因性ＪｅＴプロモーター（米国特許第６，５５５，６６７４号明細書；配列番号３）を使用した。

ゲノム編集のためのドナー断片を作製するためのＰＣＲ鋳型として使用されるｐＡＡＶ－抗ＣＤ３８Ａ２ドナープラスミドを構築するために、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって、６５０～６６０ｂｐの相同アームを有する抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲ構築物（配列番号４）を合成した。ＭｌｕＩおよびＢｓｔＥＩＩで二重消化されたｐＡＡＶ－ＭＣＳベクター（５０ｎｇ）、隣接する相同アームを有する抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲ断片（配列番号４）（５０ｎｇ）、１ｕｌの５Ｘ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）およびヌクレアーゼを含まない水を含有するｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング反応を室温で行った。反応物を短時間渦巻き撹拌し、遠心分離した後、５０℃で３０分間インキュベートした。次いで、Ｓｔｅｌｌａｒ（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）をｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ生成物で形質転換し、アンピシリン処理された寒天プレート上に播種した。サンガー配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）のために複数のコロニーを選択し、プライマーＣＴＴＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧ（配列番号５）、ＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＧＴＣＴ（配列番号６）およびＧＧＣＴＡＣＧＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＡＧＧ（配列番号７）を使用して正しいクローンを同定した。正しいクローンを培養し、これらのクローンからのＤＮＡプラスミドを精製した。

ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子のＲＮＡガイドによって誘導される標的化のために、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＡＬＴ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ＡＬＴ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡ）をＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入し、ｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子の第１のエクソン中のｃａｓ９ ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）のすぐ上流に存在する標的配列ＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴ（配列番号１）を含むように設計された。

ドナー断片ＤＮＡを作製するために、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）をＰＣＲ反応に使用した。上記のＡＡＶドナープラスミドｐＡＡＶ－抗ＣＤ３８Ａ２を鋳型として使用した。６６０ｎｔおよび６５０ｎｔの相同アームを有するドナー断片を作製するために、フォワードプライマーは配列：ＴＧＧＡＧＣＴＡＧＧＧＣＡＣＣＡＴＡＴＴ（配列番号３６）を有し、リバースプライマーは配列：ＣＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＴＴＡ（配列番号９）を有した。異なる相同アーム長の有効性を試験するための様々な実験において、ｐＡＡＶ－抗ＣＤ３８Ａ２構築物の相同アーム内の特定の位置にハイブリッド形成する配列を有するプライマーを使用して、ＰＣＲによって所望の長さの相同アームを有するドナー断片を作製した。フォワードプライマー（配列番号３６）の５’末端の３つの末端ヌクレオチド中にホスホロチオアート結合（図２Ａ）を導入して、エキソヌクレアーゼ分解を阻害した（すなわち、５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、および３番目と４番目のヌクレオチドの間）。フォワードオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端から２番目、３番目および４番目の位置のヌクレオチドも、末端の３個のヌクレオチドのホスホロチオアート（ＰＳ）骨格によって引き起こされ得る非特異的結合を回避するために２’－Ｏ－メチル修飾された（配列番号８、図２Ｂ）。Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ（商標）Ｌｏｎｇ ｓｓＤＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）によって提供されたストランダーゼによって鎖を消化することができるように、５’末端リン酸化によってリバースプライマー（配列番号９）を修飾した。ドナーＤＮＡ断片を生成するために、サーモサイクラーの設定は：９８℃で３０秒間の１サイクル、９８℃で１０秒間、６６℃で５秒間、７２℃で３０秒間の３５サイクルおよび７２℃で１０分間の１サイクルであった。製造者の説明書（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）に従ってストランダーゼによる消化を行い、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を用いてｓｓＤＮＡを精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｄｅｎｏｖｉｘ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）によってｓｓＤＮＡの濃度を決定した。対照として、得られたドナー断片が化学修飾を有さない（ＰＳまたは２’－Ｏ－メチル基を有さない）またはＰＳ修飾のみを有する（２’－Ｏ－メチル基なし）ように、非修飾プライマーを用いてドナー断片を作製した。

ＴＣＲノックアウト／抗ＣＤ３８ ＣＡＲノックインを生成するために、ＣＤ３を培養物に加えることによってＴ細胞を活性化した。ＣＤ３によるＴ細胞活性化を開始してから約４８～７２時間後に、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０μｌチップまたは１００μｌチップを使用して、活性化Ｔ細胞を含むＰＢＭＣ培養物にＳｐＣａｓ９タンパク質＋ｃｒＲＮＡ（配列番号１のガイド配列を含む）およびｔｒａｃｒＲＮＡを電気穿孔した。簡単に説明すると、まず、Ａｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡとＡｌｔ－Ｒ ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）を混合し、９５℃で５分間加熱した。次いで、混合物を熱から取り出し、実験台上で室温（１５～２５℃）まで約２０分間冷却した。各形質移入について、１０μｇのＳｐＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴ）を２００ｐｍｏｌのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖と混合してＲＮＰを形成した。１×１０^６個の細胞をＲＮＰと混合し、１７００Ｖ、２０ｍｓパルス幅、１パルスで電気穿孔した。１～２時間後、１０ｕｇの一本鎖ドナーＤＮＡを１６００Ｖ、２０ｍｓパルス幅、１パルスで細胞中に電気穿孔した。いくつかの事例では、Ｔ細胞をＲＮＰおよびドナーＤＮＡと混合し、ＲＮＰおよびドナーを同時に電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を培養培地中に希釈し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。

Ｃａｓ媒介性ノックイン法に対する対照として、ＣＲＩＳＰＲ標的化において使用されるドナー断片を作製するために使用されたレトロウイルスベクター中に同一の抗ＣＤ３８Ａ２発現カセット（配列番号２）を含むレトロウイルスによるＴ細胞の形質導入によって、ＣＡＲ発現ＰＢＭＣを作製した。

形質転換された細胞のＣＡＲ発現をＦＡＣＳによって検出することによってノックイン効率を決定するために、形質移入または形質導入されたＰＢＭＣをＤＰＢＳ／５％ヒト血清アルブミンで洗浄し、次いで、抗ＣＤ３－ＢＶ４２１抗体ＳＫ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ３８－Ｆｃタンパク質（Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌｌｓｔｏｎ、ＭＡ）で４℃にて３０～６０分間染色した。ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ Ｃｏ．）を使用して、ＣＤ３および抗ＣＤ３８ ＣＡＲ発現を分析した。陰性対照は、ハイブリッドを形成したｔｒａｃｒＲＮＡおよびＴＲＡＣ遺伝子の第１のエクソンを標的とするｃｒＲＮＡと複合体を形成したｃａｓ９タンパク質を含むＲＮＰで形質移入されたが、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーＤＮＡで形質移入されなかった細胞であった。続いて、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドを含むＲＮＰで形質移入されたＰＢＭＣに、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物を含むレトロウイルスを上記のように形質導入し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現についても分析した。図３Ａは、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するためのドナー断片の非存在下で（ＴＲＡＣ遺伝子をノックアウトするために）ＲＮＰで形質転換された細胞において、形質移入の８日後に、抗ＣＤ３８構築物の発現が検出されなかったことを示す（最も左側のパネル）。他方、ＴＲＡＣノックアウトを有し、続いて抗ＣＤ３８ ＣＡＲを発現するための構築物を含むレトロウイルスで形質導入されたＰＢＭＣは、形質移入の８日後に、細胞の約７０％で抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現を示した（図３Ａの最も右側のパネル）。ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするＲＮＰに加えて抗ＣＤ３８ ＣＡＲ ｓｓドナーＤＮＡで形質転換された培養物について、化学修飾を有さないｓｓドナーＤＮＡを与えられた集団の約１２％およびドナーＤＮＡの５’末端付近のヌクレオチド上にＰＳ骨格修飾のみを有するｓｓドナーＤＮＡ（５’末端から付番して、ヌクレオチド１と２、２と３、および３と４の間にＰＳ結合を有するＰＣＲプライマーを用いることによって導入された）で形質導入された培養物の約１３％が、抗ＣＤ３８構築物の発現を実証した。（ＰＣＲによってドナーＤＮＡを作製するために以下の修飾を含む配列番号８のプライマーを用いることによって）ＰＳ修飾も含むドナー断片鎖の５’末端から２番目、３番目および４番目のヌクレオチドにおいて、３つのヌクレオチドの２’酸素にメチル基を付加すると、形質移入された集団において抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現が有意に高くなり、８日目に、「二重修飾された」（２’－Ｏ－メチルおよびＰＳ）一本鎖ドナー断片を与えられた細胞の約２０％で抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現が見られた。特に、ドナーＤＮＡの化学修飾は、形質移入された培養物の生存率に影響を及ぼさなかった。

抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナー断片に加えてＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＲＮＰで形質移入された培養物において、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現の増加が長時間観察された。形質移入の１０日後に、非修飾一本鎖ドナーまたは最も５’に存在する３つのヌクレオチド上にＰＳ結合を含むように修飾された一本鎖ドナーで形質移入されたＰＢＭＣ培養物のフローサイトメトリーは、ＴＲＡＣを標的とするＲＮＰで形質移入された全ての培養物のうち、細胞の少なくとも８０％がＴＣＲを発現しないことを実証した。さらに、ＴＲＡＣを標的とするＲＮＰに加えて抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナーを形質移入された培養物では、ＴＣＲを発現しなかった細胞の少なくとも４２％が抗ＣＤ３８構築物を発現した（図３Ｂ、パネル２～４）。５’－近位ヌクレオチド上にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル基の両方を有する抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナー断片を形質移入された培養物については、細胞の５７％が１０日目までに抗ＣＤ３８構築物を発現していた。同時に、レトロウイルスで形質導入された培養物における抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現は、８日目に見られたものの約半分まで、形質移入または形質導入の１０日後には細胞の約３４％まで低下した。二重修飾されたｓｓドナーを形質移入された培養物およびレトロウイルスを形質導入された培養物の２０日目での分析（図３Ｃ）は、培養物中での抗ＣＤ３８構築物の発現が安定化したことを示し、５’末端にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾の両方を有するｓｓドナーを形質移入されたｃａｓ９改変された培養物は、ＴＣＲ陰性細胞の５４％が構築物を発現していることを示し、レトロウイルスを形質導入された培養物は、ＴＣＲ陰性細胞の３１％が構築物を発現していることを示した。

ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中の標的遺伝子座において相同組換え修復（ＨＤＲ）の発生を確認するために、培養物から単離されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施して、ガイドＲＮＡによって標的とされるＴＲＡＣ部位中にドナー断片が挿入されたことを確認した。ＴＲＡＣ遺伝子座中への抗ＣＤ３８ ＣＡＲ導入遺伝子の標的化された挿入を検出するために、形質移入されていない活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）、ＴＲＡＣエクソン１ガイドＲＮＡを含むＲＮＰで形質転換されたＴＲＡＣノックアウト細胞、ならびにＲＮＰに加えて、ホスホロチオアートおよび２’－Ｏ－メチル修飾されたドナーＤＮＡで形質移入されたＴ細胞からゲノムＤＮＡを増幅した。ゲノム中でのドナーＤＮＡの位置を確認するために、ＴＲＡＣ相同アームの外側であるがゲノム中の相同アーム配列に隣接する配列にオリゴヌクレオチドプライマーを標的化した。ゲノムＤＮＡを抽出するために、３０μＬのＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）中に合計１×１０^５個の細胞を再懸濁した。６５℃で５分間、次いで９５℃で２分間、細胞溶解物をインキュベートし、－２０℃で保存した。ゲノムＤＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｄｅｎｏｖｉｘ）によって決定した。以下のプライマーセットを使用して、ＴＲＡＣ標的部位を含むゲノム領域をＰＣＲ増幅した：ＴＲＡＣ上の５’ＰＣＲフォワードプライマー：ＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧ（配列番号１０）、ＣＡＲ上の５’ＰＣＲリバースプライマー：ＣＴＴＴＣＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号１１）；ＣＡＲ上の３’フォワードプライマー：ＣＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴ（配列番号１２）、ＴＲＡＣ上の３’リバースプライマー：ＧＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴ（配列番号１３）（図１Ｂ参照）。両プライマーセットは、相同アームの外側でアニーリングすることによってＨＤＲ鋳型の増幅を回避するように設計された。

ゲノムＤＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｄｅｎｏｖｉｘ）によって決定した。両プライマーセットは、対の一方のプライマーが相同アームの外側のゲノム内の部位にアニーリングし、対の他方のプライマーが構築物のコード領域内の部位（すなわち、相同アーム内にない）にアニーリングするように設計された。ＰＣＲは、４００ｎｇのゲノムＤＮＡおよびＱ５高忠実度２Ｘミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有した。サーモサイクラーの設定は、９８℃で２分間の１サイクル、９８℃で１０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で４５秒間の３５サイクル、および７２℃で１０分間の１サイクルからなった。ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する１％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を精製した。次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから溶出し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を用いて単離した。ＰＣＲ産物をサンガー配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に供した。図４は、ＰＣＲ産物を分離するゲルの写真である。構築物の５’および３’末端のゲノム中の相同アームに隣接するゲノム配列に隣接する抗ＣＤ３８構築物に対応する陽性バンドは、ドナーＤＮＡで形質移入された細胞（レーン３および６）でのみ見られ、非形質移入ＡＴＣ（レーン１および４）またはＴＲＡＣノックアウト細胞（レーン２および５）では見られなかった。これらのＰＣＲ産物の配列決定により、これらのＰＣＲ産物が抗ＣＤ３８ ＣＡＲ配列を含むことが確認された。配列番号：

形質移入された細胞の機能を試験するために、電気穿孔の３週間後に、ＴＲＡＣ遺伝子座に標的化された抗ＣＤ３８ ＣＡＲで形質移入された活性化Ｔ細胞をＩＬ－２で一晩飢餓状態にし、特異的死滅アッセイで試験した（図５）。ＣＤ３８陽性ＲＰＭＩ－８２２６／ＧＦＰ細胞およびＣＤ３８陰性Ｋ５６２／ＲＰＥ細胞の標的細胞混合物とともに、活性化Ｔ細胞を共培養した。インキュベーションのエフェクター対標的細胞比は、１０：１～０．０８：１の範囲であった。一晩のインキュベーション後に、フローサイトメトリーによって細胞を分析してＧＦＰ陽性細胞集団およびＲＰＥ陽性細胞集団を測定し、抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲＴ細胞による特異的な標的細胞殺傷を決定した。図５は、非形質移入ＡＴＣ細胞が最高のエフェクター対標的比でいくらかの毒性を示したのに対して、ＴＲＡＣノックアウト細胞は、エフェクター対標的細胞比にかかわらず実質的に死滅を示さなかったことを示す。しかしながら、抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３８陽性細胞－ＲＰＭＩ８２２６の強力な殺傷活性を示したが、ＣＤ３８陰性細胞－Ｋ５６２の強力な殺傷活性は示さなかった（図５）。抗ＣＤ３８ ＣＡＲカセットを含む化学的に修飾されたドナーを組み込んだＴ細胞は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物を含むレトロウイルスで形質導入された細胞と同様に、標的細胞に対する細胞傷害性を示した。

形質移入された活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）は、サイトカイン分泌についても試験した（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）。ＩＬ－２非含有培地中でＴ細胞を一晩飢餓状態にした。次いで、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＡＴＣ対照を、ＣＤ３８陰性Ｋ５６２細胞またはＣＤ３８陽性ＲＰＭＩ８２２６細胞と共培養した。インキュベーションのエフェクター対標的細胞比は２：１であった。一晩のインキュベーション後、製造業者の指示書に従って、サイトカインＩＬ－２、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦα（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を定量するための上清を集めるために、細胞を遠心分離した。遺伝子編集されたＴＣＲノックアウト抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３８陽性腫瘍細胞（ＲＰＭＩ８２２６）と共培養された場合に、同様の量のＩＦＮ－γおよびその他の炎症促進性サイトカインも放出したが、ＣＤ３８陰性細胞（Ｋ５６２）と共培養された場合には放出しなかった。

要約すると、インビトロ細胞機能研究は、特異的死滅アッセイ（図５）およびサイトカイン分泌アッセイ（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）の両方に関して、この新規かつ効率的な方法によって達成されるＴＲＡＣ部位特異的に組み込まれた抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲとウイルスによって媒介される無作為に組み込まれた抗ＣＤ３８Ａ２ ＣＡＲとの間に顕著な差異を明らかにしなかった。

［実施例２］ドナーＤＮＡの相同アームの長さの短縮
ＰＣＲによってドナーＤＮＡを合成する場合、ヌクレアーゼ反応およびその結果行われる一本鎖ドナー断片の精製は時間がかかり、典型的には形質移入のためのドナー断片の収率の低下をもたらし、相同アームの長さを調節することは困難であり得る（相同性は過剰に検討され（ｏｖｅｒ－ｃｈｅｗｅｄ）得る）。指定された遺伝子ノックアウトおよび抗体構築物ノックインの効率を試験するさらなる実験では、ＰＣＲ合成されたドナーのヌクレアーゼ消化を排除するために二本鎖ドナーＤＮＡを試験した。

抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物のノックインのために、異なる長さの相同アーム（ＨＡ）を有するドナー断片を作製した。抗ＣＤ３８カセットに加えて６６０および６５０ｎｔのＴＲＡＣエクソン１相同アーム（配列番号４）を含む実施例１に記載されているｐＡＡＶ－ＴＲＡＣ－抗ＣＤ３８構築物を鋳型として使用した。プライマーの第１の組、配列番号８および配列番号９を使用して、この鋳型から６６０ｎｔおよび６５０ｎｔの相同アームを有するドナー断片を作製した。プライマーの第２の組、配列番号１４および配列番号１５を使用して、約３５０ｎｔ（３７５および３２１ヌクレオチド）の相同アームを有するドナー断片を作製し、配列番号１４のプライマーは、５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、および３番目と４番目のヌクレオチドの間にＰＳ結合を有し、２、３および５位に２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを有していた。プライマーの第３の組、配列番号１８および配列番号１９を使用して、約１６５ｎｔ（１７１および１６１ｎｔ）の相同アームを有するドナー断片を作製し、配列番号１８のプライマーは、５’末端から１番目と２番目、３番目と４番目、および４番目と５番目のヌクレオシド間にＰＳ結合を有し、３、４および５位に２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを有していた。各事例において、フォワードプライマー（配列番号８、１４および１８）は、最も５’末端側の５つのヌクレオチド内に３つのＰＳ結合（例えば、プライマーの５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目、３番目と４番目、および４番目と５番目のヌクレオシドのいずれかの間に）と、最も５’末端側の５つのヌクレオチドのいずれかに存在する３つの２’－Ｏ－メチル基とを有するように設計された。各事例において、リバースプライマー（配列番号９、１５および１７）は５’末端ホスファートを有していた（表１参照）。

各プライマーの組を使用して、ドナーの１つの鎖の５’末端付近に複数のＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有し、ドナーの反対鎖の５’末端に５’ホスファートを有するドナーＤＮＡ分子を作製した。実施例１に記載されているように、ｔｒａｃｒおよびｃｒＲＮＡを含むようにＲＮＰを構築し、ｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中に見られる配列である配列番号１の標的配列を含んでいた。ＲＮＰを電気穿孔するための条件下での同一の電気穿孔（Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１７００Ｖ、２０ｍｓパルス幅、１パルスを使用）においてドナー断片およびＲＮＰが形質移入されたことを除いて実施例１に記載されているとおりに、約６６５、３５０および１６５塩基対の長さの相同アームを有するドナー分子を活性化Ｔ細胞中に独立に形質移入した。対照として、ドナー断片の非存在下において活性化Ｔ細胞をＲＮＰで形質移入し、これにより、標的とされたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトが生じるが、ドナーＤＮＡ挿入は生じないはずである。Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物の発現を試験するために、実施例１に記載されているようにフローサイトメトリーを行った。図７は、予想どおりに、ＲＮＰのみを形質移入されたＴ細胞培養物は、Ｔ細胞受容体の低い発現レベルを有し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲの発現も示さないことを示す。しかしながら、ＲＮＰに加えて、異なるサイズの相同アームを有するドナーＤＮＡで形質移入されたＴ細胞は、培養物中で低レベルのＴ細胞受容体発現および抗ＣＤ３８ ＣＡＲの良好な発現を示し、二本鎖ＤＮＡの形質移入が標的化されたノックインに対して非常に有効であることを実証している。さらに、試験された最も短いＨＡ長である１６１／１７１ｎｔは、より長い長さと少なくとも同等に機能し、導入された構築物を発現するノックアウト細胞の百分率は、約６６５ｎｔアームでは約２４％、約３５０ｎｔアームでは約３０％、約１６５ｎｔアームでは約３８％であった。したがって、短い相同アームは、二本鎖ＤＮＡドナーを使用する標的化されたノックインゲノム改変において極めて効果的であることが見出され、より小さな構築物を許容するという利点、および／またはさらなる配列もしくはより長い配列の包含をドナーＤＮＡ中に含めることを可能にするために、構築物中により大きな収容能力を許容するという利点を有する。

［実施例３］修飾二本鎖ドナーＤＮＡ対非修飾二本鎖ドナーＤＮＡ
ヌクレオチド修飾ありおよびなしのプライマーを使用して、抗ＣＤ３８ ＣＡＲを含み、上記実施例２に記載されている約１６５ｎｔのＴＲＡＣエクソン１相同アームを有するドナーＤＮＡを合成して、ＨＤＲの促進におけるそれらの相対的有効性を試験した。第１の事例では、プライマー配列番号１８は、第１および第２、第３および第４、ならびに第４および第５のヌクレオシド間に存在する３つのＰＳ結合とプライマーの５’末端の最初の５ヌクレオチド以内に（ヌクレオチド位置２、３、および５に）３つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドとを有し、プライマー配列番号１９は、５’末端ホスファートを有していた（表１）。これらのプライマーを使用して、対応するヌクレオチド修飾（すなわち、ドナーＤＮＡ産物の第１の鎖の５’末端の５ヌクレオチド以内の、３つのＰＳ結合および３つの２’－Ｏ－メチル基、ならびにドナーＤＮＡ産物の第２の鎖の５’末端上のホスファート）を有するドナーＤＮＡを作製した。第２の事例では、プライマー配列番号３７は、プライマー配列番号３７が化学修飾を欠いていたことを除いて、プライマー配列番号１８と同一であった（表１参照）。配列番号３７のプライマーおよび５’末端ホスファートを欠く配列番号１９のプライマーを使用して、抗ＣＤ３８ ＣＡＲカセットを有するヌクレオチド修飾なしのドナーＤＮＡを作製した。ＲＮＰとともに、ｔｒａｃｒＲＮＡと（ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１内の）配列番号１の標的配列を含むｃｒＲＮＡとを含む二本鎖ＤＮＡ分子（いずれの鎖も変性またはヌクレアーゼ消化されていない）として、活性化Ｔ細胞中にこれらのドナーＤＮＡを形質移入した。ドナーとして二本鎖ＤＮＡを用いた電気穿孔では、５ｕｇのｄｓＤＮＡを使用して１００万個の活性化Ｔ細胞を形質移入した。

実施例２と同様に、対照活性化Ｔ細胞はドナー断片の非存在下においてＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物を挿入せずに、標的とされたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。Ｔ細胞受容体および抗ＣＤ３ ＣＡＲ構築物の発現を試験するために、本質的に実施例１に提供されているとおりにフローサイトメトリーを行った。図８に示される結果は、ＲＮＰおよび修飾された二本鎖ドナーによる形質移入が、ＲＮＰおよび非修飾二本鎖ドナーによる形質移入と比較して、培養物全体で抗ＣＤ３８構築物の少なくとも２倍の発現をもたらし、培養物の細胞の５０％超が抗ＣＤ３８ ＣＡＲ導入遺伝子を発現し、ＴＣＲを発現していない（ＣＤ３陰性）ことを示す。

挿入遺伝子座（図２Ｂ参照）を診断するためのプライマーを使用して産生されたＰＣＲ産物の配列決定により、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１中に組み込まれた抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナー断片を実証する配列が提供された。ＰＣＲ産物配列（配列番号３９および配列番号４０）は、ゲノム中の相同アームに隣接する配列、ドナー断片中に存在する相同アームおよび抗ＣＤ３８ ＣＡＲの一部を単一のＰＣＲ産物中に含み、予想された挿入を実証した。

［実施例４］同時ＴＣＲノックアウトを伴う抗ＣＤ１９および抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物のＨＤＲ媒介性ノックイン
抗ＣＤ１９ ＣＡＲおよび抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現構築物を含むさらなるドナーＤＮＡも、ＴＲＡＣ遺伝子座中への挿入について試験した。

本質的に、実施例１に記載の抗ＣＤ３８ ＣＡＲ ｐＡＡＶ構築物について記載されているとおりに、Ｊｅｔプロモーター（配列番号３）と、イントロンと、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物と、ＳＶ４０ポリＡ配列とを含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を作製し、配列番号２０および配列番号２１のＴＲＡＣ遺伝子エクソン１相同アーム（ＨＡ）に隣接してベクター中にクローニングした。約１７０および１６０ヌクレオチドのＨＡを有する修飾されたドナーＤＮＡの産生をもたらす配列番号１８および配列番号１９として与えられるプライマーを使用して、実施例１で提供されたＰＣＲ反応において、ＨＡ ｐＡＡＶ構築物を有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲを鋳型として使用した（表１参照）。フォワードプライマー（配列番号１８）は、プライマーの５’末端から付番すると、第１および第２、第３および第４、ならびに第４および第５のヌクレオシド間に３つのＰＳ結合と、ヌクレオチド３、４および５に３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有していた。リバースプライマー（配列番号１９）は５’末端ホスファートを有していた。したがって、得られた二本鎖ドナーＤＮＡは、対応する修飾、すなわち、５’末端の５ヌクレオチド以内に３つのＰＳと３つの２’－Ｏ－メチル修飾とを有する第１の鎖、および５’末端ホスファートを有する第２の鎖を有するように合成された。

上記のプライマー配列番号１８および配列番号１９のヌクレオチド修飾が組み込まれた配列番号３８の配列を有する二本鎖の化学的に修飾されたドナー断片を使用する実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ＲＮＰのｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とする配列番号１の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。ＴＲＡＣ遺伝子座中に異なる構築物を導入する効率を評価するために、ＣＤ１９－Ｆｃ（Ｓｐｅｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）によって、続いてＡＰＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）によって抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現が検出されたことを除いて、本質的に実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを行った。結果が図９に示されており、抗ＣＤ１９ ＣＡＲが、培養物中の細胞のおよそ４２％において、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現されたことが分かる。

実施例１に記載されている抗ＣＤ３８ ＣＡＲ ｐＡＡＶ構築物に基づくＢＣＭＡ ＣＡＲでＣＤ３８ ＣＡＲを置き換えることによって、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を作製した。ＢＣＭＡ ＣＡＲ断片をＩＤＴによって合成した。挿入物の配列は、配列番号２３として与えられる。約１６０～１７０ヌクレオチドのＨＡを有するドナーＤＮＡの産生をもたらす配列番号１８および配列番号１９として与えられるプライマーを使用する実施例１に記載されているＰＣＲ反応において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を鋳型として使用した（表１参照）。フォワードプライマー（配列番号１８）は、プライマーの５’末端の５ヌクレオチド以内に３つのＰＳおよび３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有していた。リバースプライマー（配列番号１９）は５’末端ホスファートを有していた。したがって、得られた二本鎖ドナーＤＮＡは、５’末端の５ヌクレオチド以内に３つのＰＳと３つの２’－Ｏ－メチル修飾とを有する第１の鎖、および５’末端ホスファートを有する第２の鎖を有するように合成された。

上記の化学的に修飾されたプライマーの取り込みによって修飾されたヌクレオチドを有する、配列番号３７の配列を有する二本鎖ドナー断片を使用して、実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ＲＮＰのｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とする配列番号１の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。ＴＲＡＣ遺伝子座中に異なる構築物を導入する効率を評価するために、ＰＥまたはＡＰＣがコンジュゲートされたＢＣＭＡ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）によって抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現が検出されたことを除いて、実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを行った。結果が図１０に示されており、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、培養物中の細胞のおよそ６６％において、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現されたことが分かる。

［実施例５］ＴＲＡＣエクソン３を標的とするＨＤＲ媒介性ノックイン
本明細書中に提供されるドナー挿入のための方法を使用して、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１以外の遺伝子座中にドナーＤＮＡを挿入する効率を試験するために、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３由来のＨＡを有するドナーＤＮＡを作製するための抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物を作製した。この事例では、ＨＡ（５’ＨＡ配列番号２４（１８３ｎｔ）および３’ＨＡ配列番号２５（１４０ｎｔ））がエクソン３標的部位（配列番号２６）を取り囲む配列であったことを除いて、本質的に、ＴＲＡＣエクソン１標的化構築物について実施例１で記載されているとおりに構築物を作製した。次いで、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３相同アームを有するドナーＤＮＡとして作製されたｐＡＡＶ構築物の挿入物の配列が配列番号２７として与えられる。ドナー断片を作製するために、フォワードプライマー（配列番号２８）は、第１および第２、第２および第３、ならびに第３および第４のヌクレオシド間にＰＳ結合と、５’末端から第２、第４および第５の位置に２’－Ｏ－メチル修飾とを含み、リバースプライマー（配列番号２９）は５’末端ホスファートを有していた。プライマーを取り込んだ得られた二本鎖ドナーＤＮＡは、最も５’末端のヌクレオチド上に対応するＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する第１の鎖と、５’末端ホスファートを有する第２の鎖とを有していた。

上記プライマーの取り込みによって修飾されたヌクレオチドを有し、配列番号２７の配列を有する二本鎖ドナー断片を使用して、実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３を標的とする配列番号２６の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、構築物の挿入なしに、標的化されたＴＲＡＣ遺伝子座のノックアウトがもたらされるはずである。さらなる対照は、非形質移入活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）であった。本質的に実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを実施した。結果が図１１に示されており、ＲＮＰまたはＲＮＰ＋ドナーＤＮＡでの形質移入により、培養物全体で８０％を超える細胞がＴＣＲ発現を喪失することが分かる。さらに、標的に誘導するＲＮＰに加えて、ＴＲＡＣ遺伝子エクソン３に由来するＨＡを有するドナーＤＮＡで形質移入された培養物中の細胞の約４２％において、抗ＣＤ３８ ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体発現の非存在下で発現された。

挿入遺伝子座（図２Ｂ参照）を診断するためのプライマーを使用して産生されたＰＣＲ産物の配列決定により、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３中に組み込まれた抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナー断片を実証する配列が提供された。ＰＣＲ産物配列（配列番号４１および配列番号４２）は、ゲノム中の相同アームに隣接する配列、ドナー断片中に存在する相同アームおよび抗ＣＤ３８ ＣＡＲの一部を単一のＰＣＲ産物中に含み、予想された挿入を実証した。

図１２は、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３およびエクソン１への抗ＣＤ１９ ＣＡＲの標的誘導を比較する。エクソン３に向けられる抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーＤＮＡは、上記実施例中に記載されている抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を含むように合成され、抗ＣＤ１９発現カセットは、上記のエクソン３遺伝子座由来の配列（配列番号２４および配列番号２５）に隣接する。（配列番号３８の配列を有する）エクソン１に向けられる抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーは実施例４に提供されている。最も５’末端にある３つのヌクレオチド上にＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する修飾されたフォワードプライマーを使用してドナー断片を作製するために、これらの構築物の各々、すなわち、ＴＲＡＣエクソン１ ＨＡ（配列番号１８および配列番号１９）に隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を有する一方と、ＴＲＡＣエクソン３ ＨＡ（配列番号２４および配列番号２５）に隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット（配列番号２２）を有する他方とを使用した。リバースプライマーは５’末端ホスファートを有していた。エクソン１ ＨＡに隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーを作製するためのプライマーは、配列番号１８および配列番号１９であり、配列番号１８のプライマーは、第１および第２、第３および第４、ならびに第４および第５のヌクレオシドの間にＰＳ結合と、５’末端から３、４および５の位置に２’－Ｏ－メチル基とを含んでいた。エクソン３ ＨＡに隣接する抗ＣＤ１９ ＣＡＲドナーを作製するためのプライマーは、配列番号２８および配列番号２９であり、配列番号２８のプライマーは、５’末端から第１および第２、第２および第３、ならびに第３および第４のヌクレオシドの間にＰＳ結合と、５’末端から２の位置、４の位置および５の位置に２’－Ｏ－メチル基とを有していた。このため、得られた二本鎖ドナーＤＮＡは、５’末端のヌクレオチド上に対応するＰＳおよび２’－Ｏ－メチル修飾を有する第１の鎖と、５’末端ホスファートを有する第２の鎖とを有していた。

ＲＮＰを有する活性化Ｔ細胞中に、ドナー断片を独立して形質移入した。ＴＲＡＣ遺伝子エクソン１を標的とするためにｃｒＲＮＡの標的配列が配列番号１であったこと、およびＴＲＡＣ遺伝子エクソン３を標的とするためにｃｒＲＮＡの標的配列が配列番号２６であったことを除いて、ＲＮＰは実施例１に記載されているとおりに作製された。図１２から明らかなように、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン３を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのドナー断片で形質移入された培養物の約４１％は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲについてＴＣＲ陰性および陽性の両方であったが、ＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１を標的とするＲＮＰおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するためのドナー断片で形質移入された培養物の約２０％は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲについてＴＣＲ陰性および陽性の両方であった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現カセットを含むレトロウイルスで形質導入されたＴ細胞培養物は、より高い百分率の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を示したが、これらの細胞はＴＣＲノックアウトを有さなかった。

［実施例６］ＰＤ－１遺伝子を標的とするＨＤＲ媒介性ノックイン
ＰＤ－１遺伝子座もＣＡＲ構築物で標的化した。この事例では、ドナーＤＮＡを作製するための鋳型を提供するために本質的に実施例１に記載されている方法を使用して、標的部位（配列番号３２）を取り囲むＰＤ－１遺伝子座の配列を有する相同アーム（配列番号３０および配列番号３１）に、抗ＣＤ３８ ＣＡＲカセット（配列番号２）を並置した。

５’ホスファートを含むフォワードプライマー（配列番号３４）と、５’末端から１番目と２番目、２番目と３番目および３番目と４番目のヌクレオシド間のホスホロチオアート結合と、５’末端から１番目、２番目および４番目のヌクレオシド上の２’－Ｏ－メチル基とを含むリバースプライマー（配列番号３５）を使用して、本質的に実施例１に記載されているとおりにドナーＤＮＡを作製した、表１参照。

二本鎖の化学に修飾されたドナー断片（配列番号３３）を使用して、実施例１で提供された方法に従って作製されたＲＮＰとともに細胞を形質移入し、ｃｒＲＮＡはＰＤ－１遺伝子を標的とする配列番号３２の標的配列を含んだ。対照として、ドナー断片の非存在下で活性化Ｔ細胞がＲＮＰで形質移入され、これにより、ＣＡＲ構築物の挿入なしに、標的化されたＰＤ－１遺伝子座のノックアウトを生じる。さらなる対照は、非形質移入活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）であった。非形質移入活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）のさらなる対照を含めて、本質的に実施例１に記載されているとおりにフローサイトメトリーを行った。ＰＤ－１に対する、ＢＶ４２１がコンジュゲートされた抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、ＰＤ－１発現を検出した。

結果は図１３に示されており、ＰＤ－１を発現する細胞の百分率が、ＡＴＣでの約１９％から、ＰＤ－１遺伝子座を標的とするＲＮＰ（ＰＤ－１ ＲＮＰ）で形質移入された培養物の細胞での約４％へと低下したことが明らかである。ＰＤ－１を標的とするＲＮＰに加えて、ＰＤ－１遺伝子座と相同性を有するＨＡを有するドナーで形質移入された培養物中の細胞の約２７％において、抗ＣＤ３８ ＣＡＲは、ＰＤ－１発現の非存在下で発現された。比較として、ＴＣＲのエクソン１を標的とするＲＮＰ、およびＴＲＡＣ遺伝子のエクソン１の配列と相同性を有するＨＡを有する抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナー断片で形質移入された培養物の細胞の約３２％。

挿入遺伝子座（図２Ｂ参照）を診断するためのプライマーを使用して産生されたＰＣＲ産物の配列決定により、ＰＤ－１遺伝子中に組み込まれた抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナー断片を実証する配列が提供された。ＰＣＲ産物配列（例えば、配列番号４３）は、ゲノム中の相同アームに隣接する配列、ドナー断片中に存在する相同アームおよび抗ＣＤ３８ ＣＡＲの一部を単一のＰＣＲ産物中に含み、予想された挿入を実証した。

図１４は、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナー断片およびＰＤ－１遺伝子座を標的化するＲＮＰで形質移入された培養物からのＰＢＭＣおよび単離されたＴ細胞（それぞれ「ＰＤ－１ ＫＯＫＩ ＰＢＭＣ」および「ＰＤ－１ ＫＯＫＩ Ｔ細胞」）を使用して行われた細胞傷害性アッセイの結果を提供する。これらの改変された細胞は、ＰＤ－１遺伝子ノックアウトを有するがＣＡＲ構築物を与えられなかった対照細胞（「ＰＤ－１ ＫＯ」）およびＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトを有するがＣＡＲ構築物を与えられなかった対照細胞（「ＴＲＡＣ－１ ＫＯ」）に関して、アッセイにおいて標的細胞に対する高レベルの細胞傷害性を示し、抗ＣＤ３８ ＣＡＲドナー断片およびＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするＲＮＰを形質移入された細胞（「ＴＲＡＣ ＫＯＫＩ」）より若干劣っていたが、おそらく、観察されたＰＤ－１部位でのドナーＣＡＲ構築物組み込みの効率がより低いためであろう（図１３）。

Claims (75)

1. 標的ＤＮＡ分子中へのドナーＤＮＡの部位特異的組み込みのための方法であって、
   ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子と、
   少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡまたは操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸分子と、
   少なくとも２つの核酸修飾を含むドナーＤＮＡ分子と、
   を細胞中に導入することを含み、
   前記ガイドＲＮＡは、前記標的ＤＮＡ中の標的部位とハイブリッド形成するように設計された標的配列を含み、前記ドナーＤＮＡは、前記標的部位において前記標的ＤＮＡ分子中に挿入される、方法。
2. 前記少なくとも２つの核酸修飾が、前記ドナーＤＮＡ分子の単一の鎖上に存在する、請求項１に記載の方法。
3. １またはそれを超える核酸修飾が、前記ドナーＤＮＡ分子の修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内の１またはそれを超えるヌクレオチドまたはヌクレオチド結合の修飾である、請求項１または２に記載の方法。
4. １またはそれを超える核酸修飾が骨格修飾である、請求項１に記載の方法。
5. １またはそれを超える核酸修飾が、ホスホロチオアート修飾もしくはホスホロアミダイト修飾またはこれらの組み合わせである、請求項４に記載の方法。
6. １またはそれを超える核酸修飾が核酸塩基の修飾または置換である、請求項１に記載の方法。
7. １またはそれを超える核酸修飾が糖の修飾または置換である、請求項１に記載の方法。
8. １またはそれを超える核酸修飾がデオキシリボースの２’－Ｏ－メチル基修飾である、請求項７に記載の方法。
9. 前記ドナーＤＮＡ分子が二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項１または２に記載の方法。
10. 前記ドナーＤＮＡ分子が、前記少なくとも２つの核酸修飾を含む修飾された鎖を有し、前記修飾された鎖とは反対の鎖上に５’末端ホスファートを有する、請求項９に記載の方法。
11. 前記ドナーＤＮＡ分子が、前記ドナーＤＮＡ分子の前記修飾された鎖の前記５’末端の１０ヌクレオチド以内の前記骨格上の１～３個のホスホロチオラート修飾と、前記ドナー分子の前記修飾された鎖の前記５’末端の１０ヌクレオチド以内の１～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾とを有する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ドナー分子が、前記ドナー分子の前記修飾された鎖の前記５’末端の５ヌクレオチド以内の前記骨格上の１～３個のホスホロチオラート修飾と、前記ドナー分子の前記修飾された鎖の前記５’末端の５ヌクレオチド以内の１～３個の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾とを有する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ドナーＤＮＡ分子が、前記ゲノム中に組み込むための配列に隣接する相同アームを含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記相同アームの少なくとも１つが５０～２０００ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記相同アームの少なくとも１つが１００～１０００ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記相同アームの少なくとも１つが１５０～６５０ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
17. 前記相同アームの少なくとも１つが１５０～３５０ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
18. 前記相同アームの少なくとも１つが１５０～２００ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の方法。
19. 前記ドナーＤＮＡ分子が修飾された鎖および反対鎖を含み、前記修飾された鎖は２またはそれを超える核酸修飾を含み、前記反対鎖は末端ホスファートを含む、請求項１３に記載の方法。
20. 前記ドナーＤＮＡがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を含む、請求項１に記載の方法。
21. 前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
22. ｔｒａｃｒＲＮＡを前記細胞中に導入することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ガイドＲＮＡがキメラガイドＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
24. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４またはＣａｓＸである、請求項１に記載の方法。
25. 少なくとも１つのガイドＲＮＡが前記細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
26. ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが前記細胞中に導入される、請求項１に記載の方法。
27. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として前記細胞中に導入される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＲＮＰがｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ＲＮＰが電気穿孔またはリポソーム移入によって前記細胞中に導入される、請求項２７に記載の方法。
30. 前記ドナーＤＮＡおよび前記ＲＮＰが同時にまたは別個に前記細胞中に導入される、請求項２７に記載の方法。
31. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする前記核酸分子と、前記少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡまたは操作されたガイドＲＮＡをコードする前記少なくとも１つの核酸分子と、前記ドナーＤＮＡ分子とが、前記細胞中に同時に導入される、請求項１に記載の方法。
32. 前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
33. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記細胞がヒト細胞である、請求項３２に記載の方法。
35. 前記細胞が造血細胞である、請求項３２に記載の方法。
36. 前記細胞がＴ細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記標的部位が、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ－１遺伝子またはＴＩＭ３遺伝子から選択される、請求項１に記載の方法。
38. 宿主細胞であって、
    標的ＤＮＡ分子中に組み込まれたドナーＤＮＡを含み、
    前記宿主細胞は、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法によって産生される、宿主細胞。
39. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物で形質移入された初代Ｔ細胞の集団であって、初代Ｔ細胞の前記集団は、ｃａｓ９ヌクレアーゼ標的部位において前記ゲノム中に組み込まれた前記ＣＡＲ構築物を有するＴ細胞を含み、
    前記集団の前記Ｔ細胞の少なくとも２０％が前記ＣＡＲ構築物を発現し；
    前記集団の前記Ｔ細胞は、組換えウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターに由来する配列を含まない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物で形質移入された初代Ｔ細胞の集団。
40. 前記ＣＡＲ構築物が少なくとも１．８ｋｂである、請求項３９に記載の初代Ｔ細胞の集団。
41. 前記ＣＡＲ構築物が、抗ＣＤ３８ ＣＡＲ構築物、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物または抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物である、請求項３９に記載の初代Ｔ細胞の集団。
42. 前記集団の前記細胞の少なくとも４０％が前記ＣＡＲ構築物を発現する、請求項３９に記載の初代Ｔ細胞の集団。
43. 前記集団の前記細胞の少なくとも５０％が前記ＣＡＲ構築物を発現する、請求項３９に記載の初代Ｔ細胞の集団。
44. 前記ＣＡＲ構築物が前記ＴＲＡＣ遺伝子座中に挿入されている、請求項３９に記載の初代Ｔ細胞の集団。
45. 前記集団の前記細胞の少なくとも２０％が前記Ｔ細胞受容体を発現しない、請求項４４に記載の初代Ｔ細胞の集団。
46. 前記ＣＡＲ構築物が前記ＰＤ－１遺伝子座中に挿入されている、請求項３９に記載の初代Ｔ細胞の集団。
47. 前記集団の前記細胞の少なくとも２０％がＰＤ－１を発現しない、請求項４６に記載の初代Ｔ細胞の集団。
48. 標的遺伝子座中へのドナーＤＮＡの標的化された組み込みのための系であって、
    ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸分子と、
    ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子と、
    二本鎖ドナーＤＮＡ分子であって、前記ドナーＤＮＡ分子は、前記修飾された鎖の５’末端の１０ヌクレオチド以内に１またはそれを超えるホスホロチオアート結合を有する１つの修飾された鎖を含む、二本鎖ドナーＤＮＡ分子と、を含む系。
49. 前記系がＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを含む、請求項４８に記載の系。
50. 前記系がガイドＲＮＡを含む、請求項４８に記載の系。
51. 前記ドナーＤＮＡ分子が、前記修飾された鎖の前記５’末端の１０ヌクレオチド以内に前記修飾された鎖の糖部分または核酸塩基の少なくとも１つの修飾をさらに含む、請求項４８に記載の系。
52. 前記ドナーＤＮＡが、前記ゲノム中に組み込むための関心対象の配列に隣接する相同アームを有する、請求項４８に記載の系。
53. 前記二本鎖ＤＮＡ分子の前記修飾された鎖上の前記１またはそれを超えるホスホロチオアート結合が、前記修飾された鎖の前記５’末端の５ヌクレオチド以内に存在する、請求項４８に記載の系。
54. 前記修飾された鎖の糖部分または核酸塩基の前記少なくとも１つの修飾が、前記修飾された鎖の前記５’末端の５ヌクレオチド以内に存在する、請求項５１に記載の系。
55. 糖部分の前記少なくとも１つの修飾が２’－Ｏ－メチル化を含む、請求項５１に記載の系。
56. 前記関心対象の配列が発現カセットを含む、請求項５２に記載の系。
57. 前記発現カセットが、１またはそれを超える抗体または受容体ドメインを含む構築物を含む、請求項５２に記載の系。
58. 前記相同アームの少なくとも１つが５０～５０００ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の系。
59. 前記相同アームの少なくとも１つが１００～１０００ヌクレオチド長である、請求項５８に記載の系。
60. 前記相同アームの少なくとも１つが１５０～８００ヌクレオチド長である、請求項５９に記載の系。
61. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、ＣａｓＸおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４８に記載の系。
62. 前記ガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の配列を有するキメラガイドである、請求項５０に記載の系。
63. 前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡである、請求項５０に記載の系。
64. 前記ガイドＲＮＡが、１またはそれを超えるホスホロチオアート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドを含む、請求項５０に記載の系。
65. ｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む、請求項５０に記載の系。
66. 前記ガイドＲＮＡがシングルガイドＲＮＡである、請求項５０に記載の系。
67. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと前記ガイドＲＮＡとを含むリボ核タンパク質複合体を含む、請求項４８に記載の系。
68. ドナーＤＮＡ分子を生成するための組成物であって、
    前記二本鎖ＤＮＡ分子の単一の鎖上に、前記核酸分子の前記修飾された鎖の前記５’末端の５ヌクレオチド以内に１またはそれを超えるホスホロチオアート結合および１またはそれを超える修飾されたヌクレオチドを有する第１のプライマーと、
    ５’末端ホスファートを有する第２のプライマーと、を含む組成物。
69. 前記第１および第２のプライマーが、標的ゲノム中のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの標的部位の反対側の配列に相同である、請求項６８に記載の組成物。
70. 関心対象の配列を宿主ゲノムの標的部位中に組み込むように構成された二本鎖ドナーＤＮＡ分子であって
    １つのドナーＤＮＡ鎖のヌクレオチドに対する１またはそれを超える修飾と、
    前記関心対象の配列に隣接する相同アームであって、前記宿主ゲノム中で前記標的部位の両側に存在する配列に対して相同な配列を含む相同アームと、
    前記ドナーＤＮＡの１つの鎖の前記５’末端の１０ヌクレオチド以内に存在する１～１０個の修飾されたヌクレオチドと、を含む二本鎖ドナーＤＮＡ分子。
71. 前記ドナーＤＮＡの１つの鎖の前記５’末端の５ヌクレオチド以内に存在する１～５個の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７０に記載の二本鎖ドナーＤＮＡ分子。
72. 前記修飾されたヌクレオチドが、１～４個のホスホロチオアート（ＰＳ）結合もしくは１～４個の２’－Ｏ－メチル化修飾またはこれらの組み合わせを含む、請求項７０に記載の二本鎖ドナーＤＮＡ分子。
73. １つの鎖が、前記ドナーＤＮＡの１つの鎖の前記５’末端の５ヌクレオチド以内に存在する２またはそれを超える修飾ヌクレオチドを有し、他方の鎖が末端５’ホスファートを有する、請求項７０に記載の二本鎖ドナーＤＮＡ分子。
74. 前記関心対象の配列がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を含む、請求項７０に記載の二本鎖ドナーＤＮＡ分子。
75. 前記標的部位が、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ－１遺伝子またはＴＩＭ３遺伝子から選択される、請求項７０に記載の二本鎖ドナーＤＮＡ分子。

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