KR20210134000A - Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 dna 통합을 위한 개선된 방법 - Google Patents
Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 dna 통합을 위한 개선된 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210134000A KR20210134000A KR1020217030805A KR20217030805A KR20210134000A KR 20210134000 A KR20210134000 A KR 20210134000A KR 1020217030805 A KR1020217030805 A KR 1020217030805A KR 20217030805 A KR20217030805 A KR 20217030805A KR 20210134000 A KR20210134000 A KR 20210134000A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- nucleotides
- donor dna
- cells
- cell
- strand
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 title claims description 46
- 230000010354 integration Effects 0.000 title claims description 35
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 title description 34
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 226
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 198
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 321
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 308
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 192
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 167
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 111
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 111
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 92
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 66
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 63
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 59
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 59
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 44
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 34
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 34
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 33
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 32
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 claims description 26
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 24
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 9
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims description 6
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 claims description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 claims 12
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 claims 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 111
- 101000634853 Homo sapiens T cell receptor alpha chain constant Proteins 0.000 description 104
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 69
- 102100029452 T cell receptor alpha chain constant Human genes 0.000 description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 40
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 26
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 26
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 24
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 24
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 24
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 21
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 19
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 19
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 17
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 17
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 13
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 12
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 11
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 8
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 8
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 8
- WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydropyrimidin-4-amine Chemical class N=C1NCNC=C1 WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 6
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 6
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical class C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 4
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 4
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- -1 OX-40 (CD134) Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000582254 Homo sapiens Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000003568 cytokine secretion assay Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000052645 human CD38 Human genes 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 2
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000010442 DNA editing Methods 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100022132 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 108091010847 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000711567 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF125 Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- SAZUGELZHZOXHB-UHFFFAOYSA-N acecarbromal Chemical compound CCC(Br)(CC)C(=O)NC(=O)NC(C)=O SAZUGELZHZOXHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 230000008519 endogenous mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000008316 intracellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009712 regulation of translation Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003290 ribose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464416—Receptors for cytokines
- A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464426—CD38 not IgG
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
- C12N2310/3521—Methyl
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/70—Vectors containing special elements for cloning, e.g. topoisomerase, adaptor sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
유전학적으로 가공된 세포를 개발하기 위해 개선되고, 보다 안전하고 효율적인 공정이 기재된다. 보다 구체적으로, 공여자 DNA 작제물, 가이드 RNA, 및 RNA 가이드된 뉴클레아제를 형질감염될 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 상기 3개의 성분들을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 기재된다. CAR (키메라 항원 수용체)를 숙주 세포의 한정된 게놈 부위로 삽입하기 위해 디자인된 공여자 DNA 작제물이 추가로 기재된다. 추가로, 본원의 개시내용은 안전성 문제가 존재할 수 있는 바이러스 벡터가 부재인 CAR로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 본원의 개시내용은 CAR 작제물을 발현하도록 T 세포를 가공하기 위해 보다 효율적이고 보다 저렴한 방법을 제공한다.
Description
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전문이 참조로 인용된다. 2019년 11월 12일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 파일명이 087735_0103_ST25.TXT이며, 크기가 52,000 바이트이다.
관련 출원
본 출원은 2019년 2월 27일자에 출원된 미국 특허 출원 제16/288,052호의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본원의 개시내용은 cas 단백질과 같은, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용하여, 관심 대상의 DNA 서열을 표적 DNA 분자. 예를 들어, 숙주 게놈에 효율적으로 통합시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
외인성 DNA 서열의 게놈 유전자좌로의 표적화된 통합은 매우 요구되고 있다. CRISPR-Cas 게놈 가공은 유전자 기능을 녹아웃시키거나 유전자 보정 또는 유전자 태그 부착(tagging)을 위해 DNA 서열을 정확하게 녹-인(knock-in)시키기 위한 신속하고 상대적으로 단순한 방법이다. 표적화된 유전자 녹아웃은 Cas9 뉴클레아제 및 가이드RNA (gRNA)을 사용한, DNA 내 이중 가닥 절단 (DSB)의 생성을 통해 성취된다. DSB는 이어서 흔히 내인성 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 복구 경로를 통한 무작위 삽입 또는 결실 (삽입-결실)에 의해 불완전하게 복구된다. 녹-인 실험을 위하여, Cas9 뉴클레아제 및 gRNA에 추가로, DNA 공여자 주형이 요구되고 DSB는 전형적으로 상동성-지시된 복구 (HDR) 경로를 통해 공여자 주형을 사용하여 복구된다.
단일 가닥 DNA (ssDNA) 공여자 올리고 또는 공여자 플라스미드 (dsDNA)인 공여자 주형을 사용한 녹-인은 흔히 1 내지 10% 범위의 상대적으로 낮은 효율을 갖는다. 따라서, 성공적인 HDR-매개된 녹-인 실험은 중요한 디자인 고려 및 실험 최적화를 필요로 한다. 짧은 상동성 아암을 갖는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 사용하여, 여러 그룹은 SNP 보정 또는 에피토프 태그 첨가와 같은 정확한 DNA 편집을 성취하였다. 공여자 플라스미드(dsDNA)는 보다 긴 외인성 DNA를 통합시킬 수 있지만 효율은 매우 낮다. 여러 그룹은 AAV (바이러스) 벡터를 사용하여 HDR 공여자 ssDNA를 제공하고 CRISPR/Cas9와 조합하여 40-60%의 유전자 녹-인 효율을 성취하였다. 그러나, 이들 방법은 여전히 시간 소모적이고 임상적 적용을 위해 cGMP 생성과 양립할 필요가 있는 고역가의 AAV 벡터를 생성할 필요가 있다.
에스. 피오게네스(S. Pyogenes)와 같은 일부 세균의 II형 원핵 CRISPR(클러스터링된 정기적 상호 공간 이격된 짧은 팔린드롬 반복체) 후천성 면역계의 성분을 기반으로 하는 게놈 가공 도구가 개발되었다. RNA-가이드된 Cas 뉴클레아제 시스템으로서 또는 보다 단순하게 CRISPR로서 언급되는 상기 다중-성분 시스템은 가이드 RNA에 의해 표적화된 특정 서열에서 게놈 DNA 내 이중 가닥 절단을 생성하는 능력을 갖는 가이드 RNA 분자와 커플링된 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. RNA-가이드된 Cas 엔도뉴클레아제는 DNA를 절단하는 능력을 갖고, 여기서, 상기 RNA 가이드는 게놈 서열에 하이브리드화한다. 추가로, Cas9 뉴클레아제는 단지 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)로서 공지된 특정 서열이 게놈 내 표적 서열의 바로 다운스트림에 존재하는 경우 DNA를 절단한다. 에스. 피오게네스(S. Pyogenes)) 내 카노니칼 PAM 서열은 5′-NGG-3′이고, 여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드를 언급한다.
본래의 II형 CRISPR 시스템에서 정상적으로 2개의 상이한 RNA로서 발현되는 단일 키메라 crRNA:tracrRNA 전사체의 발현이 Cas9 뉴클레아제가 표적 DNA 서열을 서열 특이적으로 절단하도록 지시하기에 충분한 것으로 입증되었다. 추가로, 여러 돌연변이체 형태의 Cas9 뉴클레아제가 개발되었다. 예를 들어, 하나의 돌연변이체 형태의 Cas9 뉴클레아제는 닉카제로서 기능하여 야생형 Cas9과 같이 2개의 가닥 보다는 DNA의 상보적 가닥에서 절단을 생성한다. 이것은 NHEJ 보다는 고충실도 경로를 사용한 DNA 주형의 복구를 가능하게 하여 표적화된 유전자좌에서 및 능히 게놈 내 다른 위치에서 삽입-결실의 형성을 차단하여 상동성 재조합을 진행하는 능력을 유지하면서 가능한 오프-표적/독성 효과를 감소시킨다. 쌍 형성 닉킹은 세포주에서 50- 내지 1,500-배까지 오프-표적 활성을 감소시킬 수 있고 온-표적 절단 효율을 상실시키는 것 없이 마우스 접합자에서 유전자 녹아웃을 촉진시킬 수 있다.
추가로, cas 단백질은 다양한 세균으로부터 단리되었고, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) cas9와는 상이한 PAM 서열을 사용하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, cas12a와 같은 일부 cas 단백질은 천연적으로 단일 RNA 가이드를 사용하고-, 즉, 이들은 표적 서열에 하이브리드화하는 crRNA를 사용하지만 tracrRNA를 사용하지 않는다.
입양 면역치료요법은 생체외 생성된 자가 항원-특이적 세포의 전달을 포함하고, 바이러스 감염 및 암을 치료하기 위해 전망있는 전략이다. 입양 면역치료요법을 위해 사용되는 세포는 항원-특이적 세포의 확장 또는 유전학적 가공을 통한 세포의 재지시에 의해 생성될 수 있다.
CAR은 단일 융합 분자 내 하나 이상의 신호전달 도메인과 연합된 표적화 모이어티로 이루어진 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커에 의해 연결된 모노클로날 항체의 경쇄 및 가변 단편을 포함하는, 단일쇄 항체 (scFv)의 항원-결합 도메인으로 이루어진다. 수용체 또는 리간드 도메인을 기반으로 하는 결합 모이어티는 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 제1 세대 CAR을 위한 신호전달 도메인은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마쇄의 세포질 영역으로부터 유래한다. 제1 세대 CAR은 T 세포 세포독성을 성공적으로 재지시하는 것으로 나타났지만, 이들은 생체내 장기적 확장 및 항-종양 활성을 제공하지 못하였다. CD28, OX-40 (CD134), 및 4-1BB (CD137)을 포함하는 동시 자극 분자로부터의 신호전달 도메인은 단독으로 부가되거나 (제2 세대) 조합되어 (제3 세대) CAR 변형된 T 세포의 생존율을 증진시키고 이의 증식을 증가시켰다. CAR은 성공적으로 T 세포가 림프종 및 고체 종양을 포함하는 다양한 악성종양으로부터의 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원에 대해 재지시되도록 하였다.
CAR (키메라 항원 수용체) 세포 면역치료요법은 환자의 혈액으로부터 T-세포를 제거하는 단계, 유전자 전달을 통해 CAR을 첨가하는 단계 및 유전학적으로 가공된 세포를 다시 체내로 주입하는 단계를 포함하고 암을 치료하는데 가장 전망있는 방법 중 하나이다. 현재, 유전자 전달 기술은 감마-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용한 바이러스 기반 유전자 전달 방법을 포함한다. GMP(FDA 요구 우수 제조 관리 기준) 수준의 바이러스 벡터가 되기 위해서는 바이러스 벡터가 복제 불능, 낮은 유전자 독성, 및 낮은 면역원성과 같은 임상 안전 기준을 준수해야 한다. 이들 통상적인 접근법은 사용이 간편하고 합리적인 발현을 갖지만 T 세포로의 바이러스 게놈 통합으로 인한 원치 않는 혈액암 및 기타 이벤트(event)와 같은 2차 형질전환 이벤트를 일으킬 수 있다.
검토 논문(Ren and Zhao, Protein Cell 8(9):634-643, 2017)은 CRISPR/Cas9의 임의의 사용이 여전히 CAR (키메라 항원 수용체) 작제물을 T 세포 게놈으로 삽입하기 위한 녹킹인 공정을 위한 바이러스 벡터의 용도를 포함함을 지적한다. “비-통합 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 및 아데노바이러스-연합된 바이러스 (AAV)에 의해 암호화된 CRISPR을 사용한 유전자 편집이 또한 보고되었다.” 추가로, 2016년 11월 4일자로 온라인에 공개된 문헌(참조: Ren et al., Clin. Cancer Res. 16:1300)은 CD19 CAR 작제물을 사용하였고, T 세포에서 유전자 파괴가 렌티바이러스 및 아데노바이러스 CRISPR을 사용해서는 매우 효율적이지 않음을 밝혔다.
RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9/CRISPR 시스템은 일부 포유동물 세포를 유전학적으로 가공하기 위해 매력적인 접근법인 것으로 보이지만, 1차 세포에서, 특히 T 세포에서 Cas9/CRISPR의 사용은 하기 이유 때문에 유의적으로 보다 어렵다: (1) T-세포는 이들의 세포질 내 DNA의 도입에 의해 악영향을 미치고: 높은 비율의 아폽토시스는 세포를 DNA 벡터로 형질전환시키는 경우 관찰되고; (2) CRISPR 시스템은 세포에서 Cas9의 안정한 발현을 필요로 하지만 생존 세포에서 Cas9의 지속적인 발현은 염색체 결함을 유도할 수 있고; (3) 현재 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제의 특이성은 단지 11개 뉴클레오타이드를 포함하는 서열 (N12-20NGG, 여기서, NGG는 PAM을 나타낸다)에 의해서만 결정되고, 이는 게놈 내 특유한 목적하는 유전자좌에서 표적 서열을 동정하기가 매우 어렵게 한다. CAS9에 추가로 다른 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 TAL 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)이다.
본원의 개시내용은 숙주 세포, 예를 들어, T 세포에서 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 효율적으로 수행하기 위해 이들 한계에 대한 해결책을 제공하는 것을 목적으로 한다. 당업계에서는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 포함하지 않지만 대신 형질감염 기술을 사용할 수 있는 키메라 항원 수용체 작제물에 대해 보다 안전한 형질도입 기술이 요구된다. 이것은 환자에게 투여되는 형질도입된 세포에 의해 잠재적으로 표현되는 바이러스 유전자를 갖는 위험을 회피하면서, CAR 작제물 형질감염 효율을 증가시킴을 포함한다. 본원의 개시내용은 당업계에서 상기 필요성을 해결하기 위해 이루어졌다.
발명의 개요
제1 양상에 따라, 공여자 DNA의 표적 DNA 분자로의 부위 특이적 통합을 위한 방법이 기재된다. 상기 방법은 세포에 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 분자; 적어도 하나의 가공된 가이드 RNA 또는 가공된 가이드 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자; 및 적어도 2개의 핵산 변형을 포함하는 공여자 DNA 분자를 도입하는 단계를 포함한다. 가이드 RNA는 표적 DNA 내 표적 부위와 하이브리드화하도록 디자인된 표적 서열을 포함하고 공여자 DNA는 표적 부위에서 표적 DNA 분자에 삽입된다.
임의의 기재된 수행에서, 상기 방법은 임의의 하기의 세부 사항을 추가로 포함할 수 있고, 이것은 명백하게 상호 배타적이지 않는 경우 서로 임의의 조합으로 조합될 수 있다:
(i) 적어도 2개의 핵산 변형은 공여자 DNA 분자의 단일 가닥 상에 있을 수 있고;
(ii) 하나 이상의 핵산 변형은 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 연결의 변형일 수 있고;
(iii) 하나 이상의 핵산 변형은 골격 변형일 수 있고;
(iv) 하나 이상의 핵산 변형은 포스포로티오에이트 변형 또는 포스포르아미디트 변형 또는 이의 조합일 수 있고;
(v) 하나 이상의 핵산 변형은 핵염기의 변형 또는 치환일 수 있고;
(vi) 하나 이상의 핵산 변형은 당(sugar)의 변형 또는 치환일 수 있고;
(vii) 하나 이상의 핵산 변형은 데옥시리보스의 2’-O-메틸 그룹 변형일 수 있고;
(viii) 공여자 DNA 분자는 이중 가닥 DNA 분자일 수 있고;
(ix) 공여자 DNA 분자는 적어도 2개의 핵산 변형을 포함하는 변형된 가닥을 가질 수 있고 변형된 가닥 반대편의 가닥 상에 5’ 말단 포스페이트를 가질 수 있고;
(x) 공여자 분자는 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 골격 상에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 변형 및 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 1 내지 3개의 2’-O-메틸 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있고;
(xi) 공여자 분자는 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 골격 상에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 변형 및 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 1 내지 3개의 2’-O-메틸 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있고;
(xii) 공여자 DNA 분자는 게놈으로의 통합을 위한 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함할 수 있고;
(xiii) 상동성 아암의 적어도 하나는 50 내지 2000개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고;
(xiv) 상동성 아암의 적어도 하나는 100 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고;
(xv) 상동성 아암의 적어도 하나는 150 내지 650개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고;
(xvi) 상동성 아암의 적어도 하나는 150 내지 350개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고;
(xvii) 상동성 아암의 적어도 하나는 150 내지 200개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고;
(xiii) 공여자 DNA 분자는 변형된 가닥 및 반대편 가닥을 포함할 수 있고, 상기 변형된 가닥이 2개 이상의 핵산 변형을 포함할 수 있고, 상기 반대편 가닥이 말단 포스페이트를 포함할 수 있고;
(xix) 공여자 DNA는 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물을 포함할 수 있고;
(xx) 가이드 RNA는 crRNA일 수 있고;
(xxi) 방법은 tracr RNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있고;
(xxii) 가이드 RNA는 키메라 가이드 RNA일 수 있고;
(xxiii) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas13, Cas14, 또는 CasX일 수 있고;
(xxiv) 적어도 하나의 가이드 RNA는 세포에 도입될 수 있고;
(xxv) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 세포에 도입될 수 있고;
(xxvi) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA는 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNP)로서 세포에 도입될 수 있고;
(xxvii) RNP는 tracr RNA를 포함할 수 있고;
(xxviii) RNP는 전기천공 또는 리포좀 전달에 의해 세포에 도입될 수 있고;
(xxix) 공여자 DNA 및 RNP는 동시에 또는 별도로 세포에 도입될 수 있고;
(xxx) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 분자, 적어도 하나의 가공된 가이드 RNA 또는 가공된 가이드 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자, 및 공여자 DNA 분자는 세포에 동시에 도입될 수 있고;
(xxxi) 세포는 진핵 세포일 수 있고;
(xxxii) 세포는 포유동물 세포일 수 있고;
(xxxiii) 세포는 사람 세포일 수 있고;
(xxxiv) 세포는 조혈 세포일 수 있고;
(xxxv) 세포는 T 세포일 수 있고;
(xxxvi) 표적 부위는 T 세포 수용체 유전자, PD-1 유전자 또는 TIM3 유전자로부터 선택될 수 있다.
제2 양상에 따라, 숙주 세포가 기재된다. 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같이 표적 DNA 분자에 통합된 본원에 기재된 바와 같은 공여자 DNA를 포함하고, 여기서, 상기 숙주 세포는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
제3 양상에 따라, 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물로 형질감염된 1차 T 세포의 집단이 기재된다. 1차 T 세포의 집단은 cas9 뉴클레아제 표적 부위에서 게놈으로 통합된 CAR 작제물을 갖는 T 세포를 포함하고, 여기서, 상기 집단의 T 세포의 적어도 20%는 CAR 작제물을 발현하고 상기 집단의 T 세포는 재조합 바이러스 벡터 또는 이로부터 유래된 서열을 포함하지 않는다.
임의의 기재된 수행에서, 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물로 형질감염된 1차 T 세포의 집단은 임의의 하기의 세부 사항을 추가로 포함할 수 있고, 이것은 명백하게 상호 배타적이지 않는 경우 서로 임의의 조합으로 조합될 수 있다:
(i) CAR 작제물은 적어도 1.8 kb일 수 있고;
(ii) CAR 작제물은 항-CD38 CAR 작제물, 항-CD19 CAR 작제물 또는 항-BCMA CAR 작제물일 수 있고;
(iii) 집단 중 상기 세포의 적어도 40%는 CAR 작제물을 발현할 수 있고;
(iv) 집단 중 상기 세포의 적어도 50%는 CAR 작제물을 발현할 수 있고;
(v) CAR 작제물은 TRAC 유전자좌에 삽입될 수 있고;
(vi) 집단 중 상기 세포의 적어도 20%는 T 세포 수용체를 발현할 수 없고;
(vii) CAR 작제물은 PD-1 유전자좌에 삽입될 수 있고;
(viii) 집단 중 상기 세포의 적어도 20%는 PD-1을 발현하지 않는다.
제4 양상에 따라, 공여자 DNA의 표적 유전자좌로의 표적화된 통합을 위한 시스템이 기재된다. 시스템은 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 분자; 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자; 및 이중 가닥 공여자 DNA 분자를 포함한다. 공여자 DNA 분자는 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 하나의 변형된 가닥을 포함한다.
임의의 기재된 수행에서, 상기 시스템은 임의의 하기의 세부 사항을 추가로 포함할 수 있고, 이것은 명백하게 상호 배타적이지 않는 경우 서로 임의의 조합으로 조합될 수 있다:
(i) 시스템은 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있고;
(ii) 시스템은 가이드 RNA를 포함할 수 있고;
(iii) 공여자 DNA 분자는 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 변형된 가닥의 당 모이어티 또는 핵염기의 적어도 하나의 변형을 추가로 포함할 수 있고;
(iv) 공여자 DNA는 게놈으로의 통합을 위한 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 가질 수 있고;
(v) 이중 가닥 DNA 분자의 단일 가닥 상에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합은 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있을 수 있고;
(vi) 변형된 가닥의 당 모이어티 또는 핵염기의 적어도 하나의 변형은 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있을 수 있고;
(vii) 당 모이어티의 적어도 하나의 변형은 2’-O 메틸화를 포함할 수 있고;
(viii) 관심 대상의 서열은 발현 카세트를 포함할 수 있고;
(ix) 발현 카세트는 하나 이상의 항체 또는 수용체 도메인을 포함하는 작제물을 포함할 수 있고;
(x) 상동성 아암의 적어도 하나는 50 내지 5000개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고;
(xi) 상동성 아암의 적어도 하나는 100 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고;
(xii) 상동성 아암의 적어도 하나는 150 내지 800개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고;
(xiii) 뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, CasX, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고;
(xiii) 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA 둘다의 서열을 갖는 키메라 가이드일 수 있고;
(xiv) 가이드 RNA는 crRNA일 수 있고;
(xv) 가이드 RNA는 하나 이상의 포스포로티오에이트 (PS) 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있고;
(xvi) 가이드 RNA는 crRNA일 수 있고 시스템은 추가로 tracrRNA를 포함할 수 있고;
(xvii) 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA일 수 있고;
(xviii) 시스템은 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체를 포함할 수 있다.
제5 양상에 따라, 공여자 DNA 분자를 생성하기 위한 조성물이 기재된다. 조성물은 올리고뉴클레오타이드의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합 및 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 갖는 제1 프라이머(단일 가닥 데옥시올리고뉴클레오타이드); 및 5’ 말단 포스페이트를 갖는 제2 프라이머 (단일 가닥 데옥시올리고뉴클레오타이드)를 포함한다.
임의의 기재된 수행에서, 공여자 DNA 분자를 생성하기 위한 조성물은 하기의 세부사항을 추가로 포함할 수 있다:
(i) 제1 및 제2 프라이머는 표적 게놈에서 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위의 반대편 상의 서열과 상동성일 수 있다.
제6 양상에 따라, 관심 대상의 서열이 숙주 게놈의 표적 부위로 통합되도록 구성된 이중 가닥 공여자 DNA 분자가 기재된다. 이중 가닥 공여자 DNA 분자는 하나의 공여자 DNA 가닥의 뉴클레오타이드에 대한 하나 이상의 변형; 표적 부위의 어느 한 측면 상에 숙주 게놈에 존재하는 서열과 상동성인 서열을 포함하는, 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암; 및 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 존재하는 1 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
임의의 기재된 수행에서, 이중 가닥 공여자 DNA 분자는 임의의 하기의 세부 사항을 추가로 포함할 수 있고, 이것은 명백하게 상호 배타적이지 않는 경우 서로 임의의 조합으로 조합될 수 있다:
(i) 이중 가닥 공여자 DNA 분자는 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있는 1 내지 5개 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고;
(ii) 변형된 뉴클레오타이드는 1 내지 4개의 포스포로티오에이트 (PS) 연결, 또는 1 내지 4개의 2’-O-메틸화 변형 또는 이의 조합을 포함할 수 있고;
(iii) 이중 가닥 공여자 DNA 분자의 하나의 가닥은 5’ 말단으로부터 임의의 처음 10개 또는 처음 5개 뉴클레오타이드 상에 2개 이상의 변형을 가질 수 있고 다른 가닥은 말단 5’ 포스페이트를 갖고;
(iv) 관심 대상의 서열은 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물을 포함할 수 있고;
(v) 표적 부위는 T 세포 수용체 유전자, PD-1 유전자 또는 TIM3 유전자로부터 선택될 수 있다.
도 1a는 우측 구조에서 이들이 프라이머에 존재할 수 있는 바와 같이 뉴클레오타이드 간 결합의 포스포로티오에이트 (PS) 변형을 보여주는 화학적 도식을 제공한다. 좌측 상에 올리고뉴클레오타이드에서 보여주는 뉴클레오타이드는 (비변형된) 포스포디에스테르 결합을 통해 부착된다. 도 1b는 2개의 PS 결합을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 화학적 도식을 제공하고, 상기 결합은 5’-최외곽 뉴클레오타이드를 상기 올리고뉴클레오타이드 내 “다운스트림”의 다음 뉴클레오타이드에 연결시키고, 이는 이어서 PS 결합에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드의 이어지는 다운스트림 뉴클레오타이드에 부착된다. 올리고뉴클레오타이드의 5’-최외곽 뉴클레오타이드는 2’ O-메틸 변형을 포함한다.
도 2a는 단일쇄 가변 단편 (scFv)에 이어서 CD8a 리더 펩타이드에 이어서 CD28 힌지-CD28 막관통-세포내 영역에 이어서 CD3 제타 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 갖는 개방 판독 프레임을 포함하는 CAR 공여자 DNA 작제물과 같은 공여자 DNA 작제물의 구조를 보여주는 다이아그램이다. 암호화 서열은 JeT 프로모터(서열번호 3)에 이어지고 작제물은 이 경우에 프로모터 및 암호화 서열을 플랭킹하는, 사람 TRAC 유전자좌의 서열과 매칭하는 상동성 아암(HA)을 포함한다. 이것은 공여자 DNA를 생성하기 위해 사용되는 주형 DNA의 다이아그램을 제공한다. 항-CD38A2는 CD38 CAR 전이유전자를 함유하고, 이의 발현은 JeT 프로모터에 의해 구동되고 5’ 및 3’ 측면 상에서 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있어 표적화된 통합을 가능하게 한다. 도 2b는 녹-인을 확인하기 위한 프라이머 디자인을 보여주고, 이는 도 2a에서와 같은 동일한 다이아그램을 보여주고 또한 CAR내 위치한 하나의 프라이머 및 5’ 및 3’ 말단 둘다에서 상동성 아암의 외부의 TRAC 내 하나의 프라이머를 사용한 증폭에 의한 CAR 통합에 의해 각각의 통합이 표적화된 통합 부위에 있는 경우 1371-bp 및 1591-bp 생성물을 생성시키는지를 확인하기 위해 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 지적한다.
도 3a는 항-CD38 CAR, 및 TRAC 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP를 발현하기 위한 작제물을 포함하는 공여자 DNA로 형질감염시킨 후 8일째 PBMC의 유동 세포측정 플롯을 제공한다. CAR 카세트는 TRAC 유전자의 엑손 1에서 통합 표적 부위를 플랭킹하는 TRAC 유전자좌 서열과 상동성을 갖는 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있다. Y 축은 세포 크기를 보여준다. 항-CD38 작제물 발현은 x 축에 따른다. 음성 대조군: 어떠한 공여자 DNA로 표적 세포가 형질전환되지 않음; 변형 부재- 공여자 DNA는 어떠한 화학적 변형을 갖지 않음; PS 변형: 3개의 포스포로티오에이트 결합이 5’ 최외곽 5개의 뉴클레오타이드 골격 위치 내에 존재함; PS + 2’-OMe: 포스포로티오에이트 결합에 추가로, 공여자의 5’ 최외곽 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 뉴클레오타이드는 PS 변형 외에 2’-OMe를 포함함; TCR Ko/레트로바이러스 작제물: 세포는 공여자 DNA의 부재하에 RNP로 형질감염시켜 TCR 유전자를 녹아웃시키고 레트로바이러스를 형질도입하여 항-CD38 CAR을 발현함. 도 3b는 형질감염 후 10일째에 도 3a 에서와 동일한 배양물에 대해 수행된 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 도 3c는 형질감염 후 20일째에 이중으로 변형된 공여자 DNA 및 대조군 (단지 TRAC 녹아웃 및 레트로바이러스 형질도입을 사용한 TRAC 녹아웃)을 제공받은 배양물에 대해 수행된 유동 세포측정의 결과를 제공한다.
도 4는 표적화된 TRAC (엑손1) 부위에서 공여자 DNA의 통합을 보여주는 PCR 생성물의 겔을 보여준다. 1차 사람 T 세포는 단독으로 또는 ssDNA와 함께 TRAC RNP를 사용하여 전기천공하였다. PCR을 사용하여 전기천공 2주 후에 TRAC 유전자좌에서 통합된 항-CD38A2 CAR 전이유전자의 존재를 확인하였다(5’ 및 3’ 통합 영역으로부터의 생성물을 도시하는, 레인 3 및 6). 어떠한 밴드도 형질전환되지 않은 ATC (레인 1 및 4) 또는 RNP를 표적화하는 TRAC 엑손 1으로 형질전환되었지만 공여자 DNA를 제공받지 않은 T 세포 (레인 2 및 5)에서 관찰되지 않았다.
도 5는 대조군으로서 활성화된 T 세포 (ATC, 별표), TCR 녹아웃 ATC, 항-CD38A2 레트로바이러스 형질도입된 CART 세포 RV CART(검정선), TRAC 녹아웃 레트로바이러스 형질도입된 CART 세포(점), 포스포로티오에이트 변형된 ss 공여자 DNA 녹-인과 함께 TRAC 녹아웃(점선), 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형된 ssDNA 녹-인과 함께 TRAC 녹아웃 (점선 및 점)을 사용한 세포독성 검정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 항-CD38 CART 세포, 및 K52 또는 RPMI18226 세포와 함께 동시 배양된 대조군을 사용한 사이토킨 분비 검정 결과의 그래프를 제공한다. 시험된 T 세포 배양물은 도 5에 제공된 바와 같다.
도 7은 상이한 길이의 상동성 아암 (HA)을 갖는 공여자 DNA를 시험한 결과를 제공한다. 배양물은 TCR 발현 (Y 축) 및 항-CD38 발현 (X 축)의 상실에 대한 유동 세포측정에 의해 평가하였다.
도 8은 공여자 DNA 분자의 하나의 가닥의 5’ 말단에 인접하게 3개의 PS 결합 및 3개의 2’O 메틸 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 변형된 이중 가닥 공여자 DNA를 시험한 결과를 제공한다. 배양물은 TCR 발현 (Y 축) 및 항-CD38 발현 (X 축)의 상실에 대한 유동 세포측정에 의해 평가하였다.
도 9는 항-CD19 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD19 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 10은 항-BCMA CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-BCMA CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 11는 항-CD38 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 3 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD38 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 12는 항-CD19 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 하나의 배양물에서, TRAC 엑손 3으로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 3 가이드 RNA (2번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 3 유전자좌로 지시되었다. 또 다른 배양물에서, TRAC 엑손 1로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 1 가이드 RNA (2번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD19 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 13은 항-C38 CAR을 발현하기 위한 카세트 및 TRAC 유전자 또는 PD-1 유전자로부터 유래된 상동성 아암을 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 하나의 배양물에서, TRAC 엑손 1으로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 1 가이드 RNA (3번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. 또 다른 배양물에서, 공여자는 PD-1 유전자좌로부터 유래된 상동성 아암을 갖고 PD-I 유전자 가이드 RNA (4번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 PD-1 유전자로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD38 또는 항-PD-1 CAR 발현에 대해 결정된다.
도 14는 항-CD38 CAR 작제물을 포함하는 이중으로 변형된 (PS 및 2’-OMe) 공여자 단편으로 형질감염된 T 세포 배양물을 사용한 세포독성 검정의 결과를 제공하고 PD-1 유전자-유래된 상동성 아암은 PD-1 유전자로부터의 표적 서열을 갖는 가이드 RNA를 포함하는 RNP에 의해 PD-1 유저자에 표적화되었다.
도 2a는 단일쇄 가변 단편 (scFv)에 이어서 CD8a 리더 펩타이드에 이어서 CD28 힌지-CD28 막관통-세포내 영역에 이어서 CD3 제타 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 갖는 개방 판독 프레임을 포함하는 CAR 공여자 DNA 작제물과 같은 공여자 DNA 작제물의 구조를 보여주는 다이아그램이다. 암호화 서열은 JeT 프로모터(서열번호 3)에 이어지고 작제물은 이 경우에 프로모터 및 암호화 서열을 플랭킹하는, 사람 TRAC 유전자좌의 서열과 매칭하는 상동성 아암(HA)을 포함한다. 이것은 공여자 DNA를 생성하기 위해 사용되는 주형 DNA의 다이아그램을 제공한다. 항-CD38A2는 CD38 CAR 전이유전자를 함유하고, 이의 발현은 JeT 프로모터에 의해 구동되고 5’ 및 3’ 측면 상에서 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있어 표적화된 통합을 가능하게 한다. 도 2b는 녹-인을 확인하기 위한 프라이머 디자인을 보여주고, 이는 도 2a에서와 같은 동일한 다이아그램을 보여주고 또한 CAR내 위치한 하나의 프라이머 및 5’ 및 3’ 말단 둘다에서 상동성 아암의 외부의 TRAC 내 하나의 프라이머를 사용한 증폭에 의한 CAR 통합에 의해 각각의 통합이 표적화된 통합 부위에 있는 경우 1371-bp 및 1591-bp 생성물을 생성시키는지를 확인하기 위해 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 지적한다.
도 3a는 항-CD38 CAR, 및 TRAC 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP를 발현하기 위한 작제물을 포함하는 공여자 DNA로 형질감염시킨 후 8일째 PBMC의 유동 세포측정 플롯을 제공한다. CAR 카세트는 TRAC 유전자의 엑손 1에서 통합 표적 부위를 플랭킹하는 TRAC 유전자좌 서열과 상동성을 갖는 상동성 아암에 의해 플랭킹되어 있다. Y 축은 세포 크기를 보여준다. 항-CD38 작제물 발현은 x 축에 따른다. 음성 대조군: 어떠한 공여자 DNA로 표적 세포가 형질전환되지 않음; 변형 부재- 공여자 DNA는 어떠한 화학적 변형을 갖지 않음; PS 변형: 3개의 포스포로티오에이트 결합이 5’ 최외곽 5개의 뉴클레오타이드 골격 위치 내에 존재함; PS + 2’-OMe: 포스포로티오에이트 결합에 추가로, 공여자의 5’ 최외곽 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 뉴클레오타이드는 PS 변형 외에 2’-OMe를 포함함; TCR Ko/레트로바이러스 작제물: 세포는 공여자 DNA의 부재하에 RNP로 형질감염시켜 TCR 유전자를 녹아웃시키고 레트로바이러스를 형질도입하여 항-CD38 CAR을 발현함. 도 3b는 형질감염 후 10일째에 도 3a 에서와 동일한 배양물에 대해 수행된 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 도 3c는 형질감염 후 20일째에 이중으로 변형된 공여자 DNA 및 대조군 (단지 TRAC 녹아웃 및 레트로바이러스 형질도입을 사용한 TRAC 녹아웃)을 제공받은 배양물에 대해 수행된 유동 세포측정의 결과를 제공한다.
도 4는 표적화된 TRAC (엑손1) 부위에서 공여자 DNA의 통합을 보여주는 PCR 생성물의 겔을 보여준다. 1차 사람 T 세포는 단독으로 또는 ssDNA와 함께 TRAC RNP를 사용하여 전기천공하였다. PCR을 사용하여 전기천공 2주 후에 TRAC 유전자좌에서 통합된 항-CD38A2 CAR 전이유전자의 존재를 확인하였다(5’ 및 3’ 통합 영역으로부터의 생성물을 도시하는, 레인 3 및 6). 어떠한 밴드도 형질전환되지 않은 ATC (레인 1 및 4) 또는 RNP를 표적화하는 TRAC 엑손 1으로 형질전환되었지만 공여자 DNA를 제공받지 않은 T 세포 (레인 2 및 5)에서 관찰되지 않았다.
도 5는 대조군으로서 활성화된 T 세포 (ATC, 별표), TCR 녹아웃 ATC, 항-CD38A2 레트로바이러스 형질도입된 CART 세포 RV CART(검정선), TRAC 녹아웃 레트로바이러스 형질도입된 CART 세포(점), 포스포로티오에이트 변형된 ss 공여자 DNA 녹-인과 함께 TRAC 녹아웃(점선), 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형된 ssDNA 녹-인과 함께 TRAC 녹아웃 (점선 및 점)을 사용한 세포독성 검정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 항-CD38 CART 세포, 및 K52 또는 RPMI18226 세포와 함께 동시 배양된 대조군을 사용한 사이토킨 분비 검정 결과의 그래프를 제공한다. 시험된 T 세포 배양물은 도 5에 제공된 바와 같다.
도 7은 상이한 길이의 상동성 아암 (HA)을 갖는 공여자 DNA를 시험한 결과를 제공한다. 배양물은 TCR 발현 (Y 축) 및 항-CD38 발현 (X 축)의 상실에 대한 유동 세포측정에 의해 평가하였다.
도 8은 공여자 DNA 분자의 하나의 가닥의 5’ 말단에 인접하게 3개의 PS 결합 및 3개의 2’O 메틸 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 변형된 이중 가닥 공여자 DNA를 시험한 결과를 제공한다. 배양물은 TCR 발현 (Y 축) 및 항-CD38 발현 (X 축)의 상실에 대한 유동 세포측정에 의해 평가하였다.
도 9는 항-CD19 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD19 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 10은 항-BCMA CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-BCMA CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 11는 항-CD38 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 공여자는 RNA로 동시 형질감염에 의해 TRAC 엑손 3 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD38 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 12는 항-CD19 CAR을 발현하기 위한 카세트를 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 하나의 배양물에서, TRAC 엑손 3으로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 3 가이드 RNA (2번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 3 유전자좌로 지시되었다. 또 다른 배양물에서, TRAC 엑손 1로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 1 가이드 RNA (2번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD19 CAR 발현에 대해 결정되었다.
도 13은 항-C38 CAR을 발현하기 위한 카세트 및 TRAC 유전자 또는 PD-1 유전자로부터 유래된 상동성 아암을 포함하는, ds PS 및 2’-OMe-변형된 공여자 DNA로 형질감염된 세포에 대한 유동 세포측정의 결과를 제공한다. 하나의 배양물에서, TRAC 엑손 1으로부터 유래된 상동성 아암을 갖는 공여자는 엑손 1 가이드 RNA (3번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 TRAC 엑손 1 유전자좌로 지시되었다. 또 다른 배양물에서, 공여자는 PD-1 유전자좌로부터 유래된 상동성 아암을 갖고 PD-I 유전자 가이드 RNA (4번째 패널)를 갖는 RNP로 동시형질감염시킴에 의해 PD-1 유전자로 지시되었다. TCR 발현은 Y 축 및 Y 축 상의 항-CD38 또는 항-PD-1 CAR 발현에 대해 결정된다.
도 14는 항-CD38 CAR 작제물을 포함하는 이중으로 변형된 (PS 및 2’-OMe) 공여자 단편으로 형질감염된 T 세포 배양물을 사용한 세포독성 검정의 결과를 제공하고 PD-1 유전자-유래된 상동성 아암은 PD-1 유전자로부터의 표적 서열을 갖는 가이드 RNA를 포함하는 RNP에 의해 PD-1 유저자에 표적화되었다.
본원의 개시내용은 면역치료요법을 위해 유전학적으로 가공되고 형질도입된 세포에 대해 개선되고, 보다 안전하고 상업적으로 효율적인 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 방법은 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA, 및 공여자 DNA 작제물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 가이드 RNA는 이것이 복합체화된 cas 단백질을 숙주 게놈의 표적화된 부위로 지시하도록 가공된다. RNA-가이드된 엔도뉴클레아제에 의한 표적 부위에서 게놈 DNA의 절단, 및 상동성-지시된 복구 (HDR)에 의해 상동성 아암을 포함하는 공여자 단편을 사용한 이중 가닥 절단의 후속적 복구는 상동성 아암 사이에 위치한 공여자 DNA 분자의 서열의 통합을 유도한다. 상기 방법을 사용하여 동시에, 표적 유전자좌에서 유전자를 녹아웃시키고 붕괴된 유전자좌에서 공여자 DNA 분자에 제공된 전이유전자를 삽입하거나 “녹-인”시킬 수 있다.. 상기 방법은 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 임의의 세포에 대해 사용될 수 있고, 사람 세포와 같은 포유동물 세포와 함께 사용될 수 있다. 상기 방법은 사용의 용이함, 효율 및 임상 적용을 포함하는 많은 적용에서 바람직하지 않을 수 있는 선택가능한 마커 또는 바이러스 벡터의 사용을 필요로 하지 않는 게놈 변형을 생성하는 능력에서의 이점을 갖는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 예를 들어, T 세포와 같은 조혈 세포이다.
본원의 개시내용은 또한 공여자 DNA 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 공여자 DNA 분자는 하나의 공여자 DNA 가닥의 뉴클레오타이드에 대해 하나 이상의 변형을 포함한다. 공여자 DNA는 숙주 게놈으로의 이의 통합이 요구되는 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 상동성 아암은 표적 서열의 어느 측면 상에서 숙주 게놈내 존재하는 서열과 상동성인 서열을 갖는다. 일부 구현예에서 공여자 DNA는 이중 가닥이다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA는 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단에 인접한, 예를 들어, 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 또는 5개 뉴클레오타이드 내에 존재하는 1 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단에서 1 내지 10개 뉴클레오타이드의 적어도 2개 유형의 핵산 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단에서 1 내지 10개 뉴클레오타이드의 2개 유형의 핵산 변형을 갖는다. 변형은 예를 들어, 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 (PS) 연결일 수 있거나, 공여자 DNA 분자의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 데옥시리보스의 2’-O-메틸화일 수 있다. 예를 들어, 공여자 DNA 분자는 변형된 가닥의 5’ 말단으로부터 처음 5개, 처음 6개 또는 처음 7개 뉴클레오타이드 내에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 PS 결합을 가질 수 있고 또한 변형된 가닥의 5’ 말단으로부터 처음 5개, 처음 6개 또는 처음 7개 뉴클레오타이드 내에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 2’-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이고 하나의 가닥은 5’말단에 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이고 하나의 가닥은 5’말단으로부터 임의의 처음 10개 또는 처음 5개 뉴클레오타이드 상에 2개 이상의 변형을 갖고, 반대 가닥은 말단 5’ 포스페이트를 갖는다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이고, 공여자 DNA의 하나의 가닥 상에 적어도 2개의 PS 결합 및 적어도 2개의 2’O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 갖고, 여기서, 상기 PS 및 2’-O 메틸 변형은 변형된 가닥의 5’ 말단으로부터 처음 5개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 이중 가닥이고, 공여자 DNA의 하나의 가닥 상에 3개의 PS 결합 및 3개의 2’O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 갖고, 여기서, 상기 PS 및 2’-O 메틸 변형은 변형된 가닥의 5’ 말단으로부터 처음 5개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 이들 구현예의 일부 예에서, 반대 가닥은 말단 5’ 포스페이트를 포함한다. 공여자 DNA는 이중 가닥 분자로서 세포에 도입된다.
본원의 개시내용은 추가로 CAR (키메라 항원 수용체)를 숙주 세포에 삽입하기 위해 디자인된 공여자 DNA 작제물을 제공한다. 추가로, 본원의 개시내용은 바이러스 벡터가 부재인 CAR로 형질도입된 숙주 세포를 제공한다. 본원의 개시내용은 CAR 작제물을 발현하도록 T 세포를 가공하기 위해 보다 효율적이고 보다 저렴한 방법을 제공한다. CAR 작제물은 상기 작제물을, 비제한적인 예로서 CAR 작제물의 녹-인 및 TCR, PD-1 또는 TIM3 유전자의 녹아웃을 동시에 수행하기 위해 T 세포 수용체 유전자, PD-1 유전자, 또는 TIM3 유전자에 표적화하는 상동성 아암을 포함할 수 있다.
추가의 양상에서, 본원에서는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산; 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자; 및 공여자 DNA 분자를 포함하는, 게놈 변형을 위한 시스템이 제공되고, 여기서, 상기 공여자 DNA 분자는 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 또는 5개 뉴클레오타이드 내에 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 이중 가닥이고, 이중 가닥 공여자 DNA 분자의 하나 가닥의 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내 존재하는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 뉴클레오타이드 상에 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 변형을 포함한다. 상기 변형은 예를 들어, 뉴클레오타이드의 포스포로티오에이트 결합 및/또는 2’-O 메틸화일 수 있다. 공여자 DNA는 게놈으로 통합될 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 가질 수 있다. 관심 대상의 서열은 예를 들어, 하나 이상의 항체 또는 수용체 도메인을 포함하는 작제물의 발현을 위한 발현 카세트일 수 있다. 상동성 아암은 약 50 내지 약 5000개 뉴클레오타이드 길이, 또는 약 100 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 약 150 내지 약 800개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 공여자 DNA 분자에서, 상동성 아암은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레아제는 Cas9, Cas12a, Cas12b, CasX, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA 둘다의 서열을 갖는 키메라 가이드일 수 있거나 crRNA일 수 있고, 임의로 하나 이상의 포스포로티오에이트 (PS) 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 가이드가 crRNA이고, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제가 tracrRNA를 사용하는 경우, 상기 시스템은 또한 tracrRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas9은 crRNA 및 tracrRNA와 함께 사용될 수 있거나, crRNA와 tracrRNA의 구조적 특성을 조합한 키메라 가이드 RNA (때로는 단일 가이드 또는 “sgRNA”로 불리우는)와 함께 사용될 수 있다. 한편, Cas12a는 천연적으로 crRNA 만을 사용하고 연합된 tracrRNA를 갖지 않는다. 다양한 구현예에서, RNA-가이드 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA (crRNA 또는 키메라 가이드 RNA일 수 있는) 및 포함되는 경우, tracr RNA는 세포에 도입된 리보뉴클레오단백질 복합체로서 복합체화될 수 있다. 공여자 DNA는 RNA와 함께, 또는 별도로, 예를 들어, 별도의 전기천공 또는 형질감염으로 표적 세포에 도입될 수 있다.
또한 본원에서는 공여자 DNA의 표적 DNA 분자로의 부위-특이적 통합을 위한 방법이 제공되고, 여기서, 상기 방법은 세포에 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 분자; 적어도 하나의 가공된 가이드 RNA 또는 가공된 가이드 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자; 및 적어도 하나의 핵산 변형을 포함하는 공여자 DNA 분자를 도입함을 포함하고; 여기서, 상기 가이드 RNA는 표적 DNA에서 표적 부위와 하이브리드화하도록 디자인된 표적 서열을 포함하고, 공여자 DNA는 표적 부위에서 표적 DNA 분자로 삽입된다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA는 적어도 2개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 이는 동일하거나 상이한 변형을 가질 수 있고 바람직하게 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 이중 가닥이고, 하나 이상의 뉴클레오타이드 변형은 공여자 DNA 분자의 단일 가닥 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 이중 가닥이고, 하나 이상의 뉴클레오타이드 변형은 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내의 공여자 DNA 분자의 단일 가닥 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 포스포르아미디트 또는 포스포로티오에이트 변형과 같은 골격 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 뉴클레오타이드의 당 모이어티의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 이중 가닥이고, 공여자 DNA 분자의 단일 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 포스포로티오에이트 변형을 포함하고 추가로 공여자 DNA 분자의 단일 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 2’-O-메틸화된 뉴클레오타이드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA는 예를 들어, 발현 카세트와 같은 관심 대상의 DNA 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함하고, 여기서, 상기 상동성 아암은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 표적 부위의 어느 한 측면 상의 표적 게놈 내 부위와 상동성을 갖는다. 상동성 아암은 약 50 내지 약 2000 nt 길이일 수 있고, 예를 들어, 100 내지 1000개 nt 길이 또는 150 내지 650 nt 길이, 예를 들어, 150 내지 350 nt 길이 또는 150 내지 200 nt 길이일 수 있다. 공여자 DNA 분자에서, 상동성 아암은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. 다양한 구현예에서, 공여자 DNA 분자는 변형된 가닥 상에 2개 이상의 뉴클레오타이드 변형을 갖고 반대 가닥은 말단 포스페이트를 포함한다.
RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 cas 단백질일 수 있고 비제한적인 예로서 cas9, cas12a, 또는 casX 단백질일 수 있다. 상기 방법의 다양한 구현예에서, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 RNA 가이드는 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNP)로서 세포에 도입된다. RNP는 일부 구현예에서 추가로 tracr RNA를 포함할 수 있다. RNP는 예를 들어, 전기천공 또는 리포좀 전달을 포함하는 임의의 실행가능한 수단에 의해 표적 세포에 도입될 수 있다. 공여자 DNA는 RNP와 동시에 또는 별도로 세포에 전달될 수 있다.
또한, 본원에서는 공여자 DNA 분자를 제조하는 방법이 포함되고, 여기서, 상기 방법은 프라이머의 5’ 말단의 처음 5개 뉴클레오타이드 내에 적어도 2개의 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 제1 프라이머, 및 5’ 말단 포스페이트를 포함하는 제2 프라이머를 사용한 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함하는 주형 DNA를 증폭시키는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 제1 프라이머는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 변형을 포함할 수 있고, 하나 초과 유형의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 공여자 DNA 분자를 제조하기 위한 프라이머는 프라이머의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 포스포로티오에이트 변형 및 적어도 하나의 2’O-메틸 변형을 포함할 수 있다.
제1 및 제2 프라이머는 표적 게놈에서 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위의 반대편 상의 서열과 상동성일 수 있다. 제1 프라이머는 올리고뉴클레오타이드의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합 및 하나 이상의 2’-O-메틸화된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 제1 프라이머는 3개의 포스포로티오에이트 연결 및 3개의 2’-O-메틸화된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 프라이머는 예를 들어, 17 내지 100개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 17 내지 30개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 프라이머는 게놈 내, 예를 들어, 사람 유전자 내 cas 표적 부위의 어느 한 측면 상의 게놈 서열의 반대 가닥과 하이브리드화하도록 디자인되어, 관심 대상의 표적 부위 주변의 서열과 상동성인 플랭킹 서열을 갖는 작제물을 기반으로 하는 공여자 단편은 목적하는 뉴클레오타이드 또는 골격 변형과 함께 생성될 수 있다.
추가로 포유동물 게놈내로 삽입하기 위한 공여자 DNA 단편의 증폭을 위한 프라이머를 포함하는 조성물이 포함된다. 상기 조성물은 제1 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 제2 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함할 수 있고, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 각각은 상기 프라이머의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 2’O-메틸 변형 및 상기 프라이머의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 하나의 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 프라이머 쌍이고, 상기 제1 및 제2 프라이머는 표적 부위를 포함하는 서열을 증폭시킬 수 있고, 상기 제1 프라이머는 cas 뉴클레아제에 대한 표적 부위의 한 측면 상에 있는 적어도 18개의 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 제2 프라이머는 cas 뉴클레아제에 대한 표적 부위의 반대 가닥 측면상에 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
정의
달리 구체적으로 지적되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 추가로, 본원에 기재된 방법 또는 물질과 유사하거나 균등한 임의의 방법 또는 물질은 본원의 개시내용의 수행에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "a," "an," 또는 "the"는 하나의 구성원과의 양상 뿐만 아니라 하나 초과의 구성원과의 양상을 포함한다. 예를 들어, 단수형(“a,” “an” 및 “the”)은, 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형의 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포 (a cell)"에 대한 언급은 복수의 상기 세포를 포함하고 “상기 제제(The agent)”에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 제제 등에 대한 언급을 포함한다.
용어 “1차 세포”는 다중세포 유기체로부터 직접적으로 단리된 세포를 언급한다. 1차 세포는 전형적으로 집단 증가가 거의 일어나지 않고, 따라서 연속 (종양 또는 인공적으로 불멸화된) 세포주와 비교하여, 이들이 유래된 조직의 주요 기능성 성분을 보다 잘 나타낸다. 일부 경우에, 1차 세포는 단리되고 이어서 즉시 사용되는 세포이다. 다른 경우에, 1차 세포는 무한으로 분열할 수 없고 따라서 시험관내에서 장기간 동안 배양될 수 없다.
용어 "게놈 편집"은 하나 이상의 뉴클레아제를 사용하여, DNA가 삽입되거나, 대체되거나 표적 DNA, 예를 들어, 세포의 게놈으로부터 제거된 유전학적 가공의 하나의 유형을 언급한다. 뉴클레아제는 게놈 내 목적하는 위치에서 특이적 이중 가닥 절단(DSB)을 생성하고, 세포의 내인성 기전을 사용하여 상동성-지시된 복구 (DHR) (예를 들어, 상동성 재조합)에 의해 또는 비상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 유도된 절단을 복구한다. 임의의 적합한 뉴클레아제는 세포에 도입되어 CRISPR-연합된 단백질 (Cas) 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 다른 엔도- 또는 엑소-뉴클레아제, 이의 변이체, 이의 단편 및 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표적 DNA 서열의 게놈 편집을 유도할 수 있다. 표적 DNA 서열의 뉴클레아제-매개된 게놈 편집은 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 폴리펩타이드 또는 Cas9 mRNA)와 조합된 본원에 기재된 변형된 단일 가닥 RNA (sgRNA)를 사용하여 상동성-지시된 복구 (HDR)를 통한 정확한 게놈 편집의 효율을 개선시키기 위해 “유도된” 또는 “조절된"일 수 있다.
용어 "상동성-지시된 복구" 또는 "HDR"은 복구를 가이드하기 위한 상동성 주형을 사용하여 이중 가닥 DNA 절단을 정밀하게 및 정확하게 복구하기 하기 위한 세포 내 기전을 언급한다. 가장 통상적인 형태의 HDR은 뉴클레오타이드 서열이 2개의 유사하거나 동일한 DNA 분자 간에 교환되는 일종의 유전학적 재조합인 상동성 재조합(HR)이다.
용어 "비상동성 말단 연결” 또는 “NHEJ”는 절단된 말단이 상동성 주형에 대한 필요 없이 직접적으로 연결되는 이중 가닥 DNA 절단을 복구하는 경로를 언급한다.
용어 "핵산", "뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA) 및 이의 중합체를 언급한다. 상기 용어는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-DNA 하이브리드 또는 퓨린 및/또는 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비-천연, 합성 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA, RNA 및 이의 유사체의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 참조 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 이의 변이체 (예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오톨로그, 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 및 상보성 서열 및 명백하게 지적된 서열을 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 대체된 서열을 생성함에 의해 성취될 수 있다(문헌참조: Batzer et al, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "뉴클레오타이드 유사체" 또는 "변형된 뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드의 질소성 염기(예를 들어, 시토신 (C), 티민 (T) 또는 우라실 (U), 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)) 내 또는 이의 상에, 뉴클레오사이드의 당 모이어티(예를 들어, 리보스, 데옥시리보스, 변형된 리보스, 변형된 데옥시리보스, 6원 당 유사체 또는 개방쇄 당 유사체), 또는 포스페이트 내 또는 이의 상에 하나 이상의 화학적 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 뉴클레오타이드를 언급한다.
용어 “유전자” 또는 “폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 폴리펩타이드 쇄를 생성하는데 관여하는 DNA의 분절을 의미한다. DNA 분절은 유전자 생성물의 전사/해독 및 전사/해독의 조절에 관여하는 암호화 영역 (리더 및 트레일러), 및 개별 암호화 분절 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론)의 전방 및 후방 영역을 포함할 수 있다.
용어 “폴리펩타이드,” “펩타이드” 및 “단백질”은 아미노산 잔기들의 중합체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-천연적으로 존재하는 아미노산 중합체 뿐만 아니라 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 인공 화학적 모사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 전장 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 잔기는 공유 펩타이드 결합에 의해 연결된다.
용어 "변이체"는 천연에 존재하는 것으로부터 이탈한 유기체, 균주, 유전자, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 특징의 형태를 언급한다.
용어 "상보성"은 통상적인 왓슨-클릭 또는 다른 비-통상적인 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 언급한다. 퍼센트 상보성은 제2 핵산 서열과 수소 결합을 형성(예를 들어, 왓슨-클릭 염기쌍 형성)할 수 있는 핵산 분자 내 잔기의 퍼센트 (예를 들어, 10개중 5, 6, 7, 8, 9, 10개로서 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100%의 상보성)를 지적한다. "완벽하게 상보성"은 핵산 서열의 모든 연속 잔기가 제2 핵산 서열 내 동일한 수의 연속 잔기와 수소 결합함을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 상보성"은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%인 상보성 정도를 언급한다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오타이드의 영역 상에 97%, 98%, 99%, 또는 100%는 엄중 조건하에서 하이브리드화하는 2개의 핵산을 언급한다.
하이브리드화에 대한 용어 "엄중 조건"은 표적 서열과 상보성을 갖는 핵산이 대부분 표적 서열과 하이브리드화하고 실질적으로 비-표적 서열과는 하이브리드화하지 않는 조건을 언급한다. 엄중 조건은 일반적으로 서열-의존성이고 다수의 인자에 의존하여 다양하다. 일반적으로, 서열이 길면 길수록 서열이 특이적으로 이의 표적 서열에 하이브리드화하는 온도는 보다 높아진다. 엄중 조건의 비제한적인 예는 문헌(참조: Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology -Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.)에 상세히 기재되어 있다.
용어 "하이브리드화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여 뉴클레오타이드 잔기의 염기 간에 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 언급한다. 수소 결합은 왓슨 클릭 염기쌍 형성에 의해, 후그슈타인 결합 (Hoogstein binding)에 의해 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 일어날 수 있다. 상기 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥의 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-하이브리드화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
"재조합 발현 벡터"는 숙주 세포에서 특정 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 작제물이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 게놈 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 연결된, 전사될 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
"작동적으로 연결된"은 암호화 서열의 전사를 지시하는 프로모터와 같은 요소들의 적당한 생물학적 기능을 허용하는 상대적 위치에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 암호화 서열 및 프로모터와 같은 2개 이상의 유전학적 요소를 의미한다.
용어 "프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열의 어레이를 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 프로모터는 폴리머라제 II형 프로모터의 경우에서와 같이 전사의 개시 부위 근처에 필요한 핵산 서열, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 전사의 개시부위로부터 수천개의 염기쌍 정도의 원거리에 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 리프레서를 임의로 포함한다. 발현 벡터에 존재할 수 있는 다른 요소들은 발현 벡터로부터 생성된 재조합 단백질에 대한 특정 결합 친화성 또는 항원성을 부여하는 것들뿐만 아니라 전사를 증진시키고 (예를 들어, 인핸서) 전사를 종결시키는 (예를 들어, 터미네이터) 것들을 포함한다.
“재조합체"는 유전학적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 세포, 조직, 또는 유기체를 언급한다. 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오타이드(또는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 카피 또는 상보체)는 널리 공지된 방법을 사용하여 조작된 것이다. 제2 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 암호화 서열)에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 카세트는 사람 조작 (예를 들어, 문헌(참조: Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)에 기재된 방법에 의해)의 결과로서 제2 폴리뉴클레오타이드와 이종성인 프로모터를 포함할 수 있다. 재조합 발현 카세트 (또는 발현 벡터)는 전형적으로 천연에서 발견되지 않는 조합의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 사람 조작된 제한 부위 또는 플라스미드 벡터 서열은 다른 서열로부터 프로모터를 플랭킹하거나 분리할 수 있다. 재조합 단백질은 재조합 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 것이고, 재조합 세포, 조직 및 유기체는 재조합 서열 (폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드)를 포함하는 것들이다.
용어 "단일 뉴클레오타이드 다형태" 또는 "SNP"는 대립유전자 내에 포함하는 폴리뉴클레오타이드에서 단일 뉴클레오타이드의 변화를 언급한다. 이것은 단일 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입 뿐만 아니라 하나의 뉴클레오타이드의 또 다른 뉴클레오타이드로의 대체를 포함할 수 있다. 대부분 전형적으로, SNP는 트리- 및 테트라-대립유전자 마커가 또한 존재할 수 있지만 바이대립유전자 마커이다. 비-제한적인 예로서, SNP A\C를 포함하는 핵산 분자는 다형태 위치에서 C 또는 A를 포함할 수 있다.
용어 “배양한다”, “배양하는”, “성장한다”, “성장하는”, “유지한다”, “유지하는”, “확장한다”, “확장하는” 등은 세포 배양 자체를 언급하거나 배양 공정을 언급하는 경우, 세포 (예를 들어, 1차 세포)가 제어된 조건하에서, 예를 들어, 생존을 위해 적합한 조건하에서 이의 정상 환경 외부에서 유지되는 것을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 배양된 세포는 생존하도록 방치하고 배양은 세포 성장, 정지, 분화 또는 분열을 유도할 수 있다. 용어는 배양물 중에 모든 세포가 생존하거나, 성장하거나 분열함을 의미하지 않고 일부는 천연적으로 죽거나 뇌쇠할 수 있다. 세포는 전형적으로 배지에서 배양하고, 상기 배지는 배양 과정 동안에 갈아줄 수 있다.
용어 "대상체", "환자" 및 "개체"는 본원에서 사람 또는 동물을 포함하도록 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 동물 대상체는 포유류, 영장류(예를 들어, 몽키), 가축 동물(예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 또는 염소), 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이), 연구 시험 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 기니아 피그, 새), 수의학적으로 중요한 동물 또는 경제적으로 중요한 동물일 수 있다.
용어 "투여하는"은 경구 투여, 국소 접촉, 좌제로서의 투여, 대상체에게 정맥내, 복막내, 근육내, 병변내, 척수강내, 비강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 비경구 및 경점막 (예를 들어, 협측, 설하, 구개, 잇몸, 비강, 질, 직장 또는 경피)을 포함하는 임의의 경로에 의한 것이다. 비경구 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피내, 피하, 복막내, 뇌실내, 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포좀 제형의 사용, 정맥내 주입, 경피 패치 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "치료하는"은 치료학적 이득 및/또는 예방학적 이득을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이로운 또는 목적하는 결과를 수득하기 위한 접근법을 언급한다. 치료학적 이득이란 치료 하의 하나 이상의 질환, 병태 또는 증상에서의 임의의 치료학적 관련 개선 또는 이에 대한 효과를 의미한다. 예방학적 이득을 위해, 조성물은 특정 질환, 병태 또는 증상을 발병할 위험에 처한 대상체에게 또는 질환, 병태 또는 증상이 아직 나타나지 않을 수 있지만 질환의 생리학적 증상 중 하나 이상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 “유효량” 또는 “충분한 양”은 이롭거나 목적하는 결과를 수행하기에 충분한 제제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 변형된 단일 가이드 RNA 등)의 양을 언급한다. 치료학적 유효량은 치료 중인 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 의존하여 다양할 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특정 양은 선택된 특정 제제, 표적 세포 유형, 대상체 내 표적 세포의 위치, 후속 투여 용법, 이것이 다른 제제와 조합하여 투여될 지의 여부, 투여 시기 및 이것이 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 의존하여 다양할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 제제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 변형된 단일 가이드 RNA 등)의 세포, 유기체 또는 대상체로의 투여를 보조하는 물질을 언급한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 조성물 또는 제형에 포함될 수 있고, 환자에 대해 어떠한 유의적인 독성학적 효과를 유발하지 않는 담체 또는 부형제를 언급한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예는 물, NaCl, 정규 식염수 용액, 락테이트화된 링거, 정규 슈크로스, 정규 글루코스, 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅, 감미제, 향제 및 색제 등을 포함한다. 당업자는 다른 약제학적 담체가 본 발명에 유용함을 인지할 것이다.
CRISPR 시스템의 성분과 관련하여 용어 "증가하는 안정성"은 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 구조를 안정화시키는 변형을 언급한다. 상기 용어는 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 분해를 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나 저하시키는 변형을 포함한다.
CRISPR 시스템과 관련된 용어 "증가하는 특이성"은 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 특이적 활성 (예를 들어, 온-표적 활성)을 증가시키는 변형을 언급한다. 상기 용어는 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 비-특이적 활성(예를 들어, 오프-표적 활성)을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나 저하시키는 변형을 포함한다.
CRISPR 시스템의 성분과 관련하여 용어 "감소하는 독성"은 세포, 유기체, 대상체 등에 대한 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 독성 효과를 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나 저하시키는 변형을 언급한다.
CRISPR 시스템의 성분과 관련하여 및 유전자 조절 관점에서 용어 “증진된 활성”은 게놈 편집 및/또는 유전자 발현을 유도하거나, 조정하거나, 조절하거나 제어하는 효율 및/또는 빈도에서의 증가 또는 개선을 언급한다.
참조 수치와 관련하여 용어 "약"은 상기 값으로부터 + 또는 - 10%의 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 10"의 양은 9, 10 및 11의 참조 수치를 포함하는, 9 내지 11의 양을 포함한다. 참조 수치와 관련하여 용어 "약"은 또한 상기 값으로부터 + 또는 - 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 값의 범위를 포함할 수 있다. IV.
비-바이러스 형질감염 공정
본원에서는 높은 효율의 표적화된 유전자 통합 접근법을 제공하는 공정이 기재된다. 상기 방법은 임의의 세포 유형의 게놈 가공을 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, 가공된 세포가 환자에게 도입되는 적용에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 예를 들어, 임의의 CD38, CD19, CD20, CD123, BCMA 등에 대한 암 치료 작제물, 예를 들어, CAR을 T 세포에 적용하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 전달의 효율은 40-80%에 도달할 수 있다. 표적화된 유전자 통합을 사용한 상기 접근법은 자가 및 동종이계 접근법 둘다를 위해 사용될 수 있고, 중요하게는 가공된 세포가 환자에게 도입되는 경우 2차 및 원치 않는 세포 형질전환 위험을 갖지 않음에 따라서 현재의 통상적인 접근법 보다 안전하다. 추가의 이점은 변형된 가이드 가닥, 신뢰할 수 있는 유전자 통합, 대형 유전자의 통합, CAR의 유전자 통합, 및 높은 발현과 함께 CAR의 유전자 통합을 포함한다.
실시예는 포스포로티오에이트, 및 PCR에 의해 합성된 2’ O-메틸 변형된 단일-가닥 또는 이중-가닥 공여자 DNA를 사용하는 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집을 통해 CAR-T 세포를 제조하는 것을 기재한다. 바람직하게, 상기 변형된 단일-가닥 (ss) 또는 이중 가닥 (ds) DNA는 3개의 PS 결합을 하나의 프라이머의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드에 부가함에 의해 생성된다. 본 발명을 임의의 특정 기전으로 제한하는 것 없이, 상기 PS 변형은 공여자 DNA의 변형된 가닥의 엑소뉴클레아제 분해를 억제하는 것으로 사료된다. 프라이머의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 또는 5개 뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드는 또한 2’ O-메틸로 변형시켜 포스포로티오에이트 결합에 의해 유발되는 비-특이적 결합을 회피한다. 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형된 ds 공여자 DNA 및 ss 공여자 DNA는 PCR, 비대칭 PCR 또는 역 전사를 통해 제조될 수 있다. 대안적으로, 합성의 최종 ds DNA 생성물은 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸로 변형시킬 수 있고 dsDNA는 하나의 가닥 상에서만 변형을 갖도록 제조될 수 있다.
추가로, 즉, CAR (키메라 항원 수용체)를 숙주 세포의 한정된 게놈 부위로 삽입하기 위해 디자인된 CAR 작제물을 포함하는 포스포로티오에이트 및 2’O-메틸과 같은 화학적 변형을 갖는 공여자 DNA 작제물과 같은 공여자 DNA 작제물이 기재된다. 추가로, 본원의 개시내용은 안전성 문제가 존재할 수 있는 바이러스 벡터가 부재인 CAR로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
하나의 가닥 상에 변형을 갖는 공여자 DNA를 사용한 상기 공정은 녹-인(knock-in) 효율을 적어도 2배 증가시킬 수 있고, 이는 바이러스 벡터 방법에 상응하고, 통합의 부위 특이성을 위해 이점을 갖고 통상적인 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 접근법과 비교하여 T 세포에서 CAR 발현을 위해 매우 안정하다. 포스포로티오에이트 및/또는 2’ O-메틸을 사용한 하나의 공여자 쇄의 적어도 이중 변형은 녹-인 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 1단계 녹-아웃/녹-인 방법은 다중 암 치료요법을 위한 보다 신속하고 보다 저렴한 CAR-T 생성 공정을 제공한다. 이중 가닥 DNA를 사용하고 노동적이고 수율을 감소시키는, 공여자 작제물의 뉴클레아제 처리 및 단일 가닥의 회수를 회피하는 능력은 상기 방법의 또 다른 이득이다.
상기 적용에서, 본원 발명자는 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형을 갖는 변형된 dsDNA 또는 ssDNA 공여자에 의해 긴 dsDNA 또는 ssDNA (예를 들어, ~3kb 항-CD38 CAR 및 CD19 CAR)를 녹-인시키기 위한 단순하고 강력한 방법을 제공한다. 본원 발명자는 변형된 긴 dsDNA 및 ssDNA 서열이 CAR의 1차 T 세포로의 통합을 위해 고도로 효율적인 HDR 주형임을 보여준다. 추가로, 본원 발명자는 상기 방법이 통합의 부위 특이성에 대한 이점을 갖고 통상적인 레트로바이러스 또는 렌티-바이러스 접근법과 비교하여 T 세포에서 CAR 발현을 위해 매우 안정함을 입증한다.
게놈으로의 표적화된 통합을 위해 본원에 제공된 방법을 사용한 CAR 작제물의 T 세포로의 도입은 전반적으로 바이러스 벡터, 예를 들어, 임의의 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 사용을 회피한다. 따라서, 본원의 개시내용은 1차 사람 T 세포의 집단을 제공하고 여기서, 상기 집단의 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%는 게놈으로 통합된 CAR 작제물을 발현하고, 상기 집단의 어느 세포도 바이러스 벡터 또는 이로부터 유래된 임의의 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 게놈으로 통합된 CAR 작제물을 포함하는 본원에 제공된 T 세포 집단은 상기 집단에서 검출될 수 있는 임의의 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 서열을 갖지 않는다. 게놈으로 통합된 CAR 작제물은 어떠한 바이러스 벡터 서열 또는 이로부터 유래된 서열을 포함할 수 없다. 상기 집단은 본원에 제공된 방법 및/또는 시스템을 사용하여 CAR 작제물을 암호화하는 공여자 DNA로 형질감염된 집단일 수 있다. CAR 작제물은 가이드 RNA에 의해 표적화된 T 세포의 게놈 내 부위로 통합된다. CAR 작제물은 cas 표적 부위, 즉, cas 뉴클레아제에 특이적인 PAM에 인접한 부위에 통합된다. 예를 들어, CAR 작제물은 cas9 PAM에 인접한 게놈 내 표적 부위에 통합된다. 비제한적인 예로서, CAR 작제물은 T 세포 수용체 유전자(예를 들어, TRAC 유전자) 또는 PD-1 유전자, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 서열번호 1, 서열번호 26, 및 서열번호 32의 유전자에 통합될 수 있다. 다양한 구현예에서, CAR 작제물의 게놈 내 표적화된 부위, 예를 들어, TRAC 유전자 내 부위 또는 PD-1 유전자 내 부위로의 삽입은 TRAC 유전자 또는 PD-1 유전자의 녹아웃 (붕괴된 발현)을 유도한다. 따라서, 본원의 개시내용은 1차 T 세포 집단을 제공하고, 여기서, 상기 집단의 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 40%는 게놈으로 통합된 CAR 작제물을 발현하고, 표적화된 통합에 의해 녹아웃된 유전자 (예를 들어, TRAC 또는 PD-1 유전자)를 발현하지 않고, 여기서, 세포의 어느 것도 바이러스 벡터 또는 이로부터 유래된 임의의 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 게놈으로 통합된 CAR 작제물을 포함하는 본원에 제공된 T 세포 집단은 상기 집단에서 검출될 수 있는 임의의 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 서열을 갖지 않는다. 통합된 CAR 작제물은 적어도 1.5 kb, 적어도 1.7 kb, 적어도 1.9 kb, 적어도 2 kb, 또는 적어도 2.1 kb 길이일 수 있다. 비제한적인 예에서, CAR 작제물은 임의의 CD38, CD19, CD20, CD123, 또는 BCMA에 결합하는 CAR을 암호화하는 CAR 작제물일 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, CAR 작제물은 항-CD38 CAR, 항-CD19 CAR, 또는 항-BCMA CAR일 수 있다.
본원의 개시내용은 1차 세포에서 CAR 유전자를 발현하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 1차 세포에 (a) 선택된 녹아웃 핵산에 상보적인 제1 뉴클레오타이드 서열 및 CRISPR-연합된 단백질 (Cas) 폴리펩타이드와 상호작용하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)로서, 상기 sgRNA 서열의 뉴클레오타이드의 하나 이상이 임의로 변형된 뉴클레오타이드인, 단일 가이드 RNA; 및 (b) Cas 폴리펩타이드, Cas 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터, 또는 상기 변형된 sgRNA가 Cas 폴리펩타이드를 녹아웃 핵산의 부위로 가이드하는 Cas 폴리펩타이드, 및 (c) 5’ HA 서열, 프로모터 서열, CAR 작제물, 및 3’ HA 서열을 포함하는 공여자 표적 DNA로서, 상기 공여자 표적 DNA가 바람직하게 이중 가닥이고, 5’ 엑소뉴클레아제 절단을 감소시키기 위해 공여자의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 하나의 포스포티오에이트 결합으로 변형된 2개의 가닥 또는 바람직하게 하나의 가닥을 갖고, 임의로 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 1개, 2개, 3개 또는 4개의 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 공여자 표적 DNA를 도입하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 변형된 가닥에 대한 반대 가닥은 5’ 말단 포스페이트를 갖는다.
본원의 개시내용은 1차 세포에서 CAR 유전자의 유전자 발현을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 1차 세포에 (a) 선택된 표적 녹아웃 핵산에 상보적인 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 tracrRNA 및 crRNA로서, 상기 tracrRNA 및 crRNA 내 뉴클레오타이드의 하나 이상이 임의로 변형된 뉴클레오타이드인, tracrRNA 및 crRNA; 및 (b) Cas 폴리펩타이드, Cas 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 (여기서, 상기 crRNA는 Cas 폴리펩타이드를 녹아웃 핵산의 부위로 가이드한다), 및 (c) 5’ HA 서열, 프로모터 서열, CAR 작제물, 및 3’ HA 서열을 포함하는 공여자 표적 DNA로서, 상기 공여자 표적 DNA가 바람직하게 이중 가닥이고, 5’ 엑소뉴클레아제 절단을 감소시키기 위해 공여자의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 적어도 하나의 포스포티오에이트 결합으로 변형된 2개의 가닥 또는 바람직하게 하나의 가닥을 갖고, 임의로 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 1개, 2개, 3개 또는 4개의 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 공여자 표적 DNA를 도입하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 변형된 가닥에 대한 반대 가닥은 5’ 말단 포스페이트를 갖는다.
실시예
실시예는 공여자 DNA를 녹킹인하고 T 세포 수용체 (TCR)와 같은 표적화된 내인성 유전자 또는 PD-1 유전자를 녹킹 아웃하기 위해 바이러스 벡터를 사용하지 않고 높은 형질감염 효율을 제공하는 기재된 공정의 이점을 보여준다.
건강한 자원 봉사자 공여자의 버피 코트는 샌디에고 혈액 은행으로부터 수득하였다. 일부 새로운 전혈 또는 백혈구 성분채집 제품은 StemCell Technologies로부터 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. PBMC는 mL 당 106 세포의 밀도로, 300 U/mL의 IL-2 (Proleukin)와 함께 5% 태아 소 혈청 (Sigma, St. Louis, Mo)이 보충된 AIM-V 배지(ThermoFisher Scientific, Waltham, Ma)에서 2일 동안 CD3 항체(BioLegend, San Diego, CA) 100ng/mL로 활성화시켰다. 배지는 2 내지 3일마다 갈아주고 세포는 mL 당 106으로 재분주하였다. 상기 처리는 배양물 중에서 T 세포를 선택적으로 증폭시킨다. 일부 실험에서, 세포는 mL 당 106 세포의 밀도로, 300 U/mL의 IL-2 (Proleukin)와 함께 5% CTS™ 면역 세포 SR (Thermofisher scientific)이 보충된 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM (ThermoFisher)에서 배양하였다. 일부 실험에서, T 세포는 제조업자의 지침에 따라 EasySep™ 사람 T 세포 단리 키트 또는 CD3 양성 선택적 키트(Stemcell Technology Inc.)를 사용한 자기 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리하였다.
세포독성 검정에 사용하기 위해, RPMI-8226(다중 골수종 세포주) 세포는 CD38을 발현하고, 녹색 형광성 단백질 (GFP)을 발현하도록 형질도입하였다. K562 (사람 불멸화된 골수성 백혈병) 세포는 CD38을 발현하지 않고 R-피코에리트린(RPE)을 발현하도록 형질도입하였다. 세포주 둘다는 10% 태아 소 혈청(Sigma)이 보충된 RPMI1640 배지(ATCC)에서 배양하였다. CAR 플라스미드는 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Takara Bio USA, Inc, Mountain View, CA)를 사용하여 생성하였다. 골격 플라스미드 pAAV-MCS는 연구소(Cell Biolabs) (San Diego, Ca)로부터 입수하였다.
일부 실험에서, 레트로바이러스-형질도입된 T 세포는 cas-매개된 녹-인 세포와 비교하였다. 레트로바이러스 작제물을 사용한 T 세포의 형질도입은 필수적으로 문헌(참조: Ma et al., 2004 The Prostate 61:12-25; and Ma et al., The Prostate 74(3):286-296, 2014, 이의 개시내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 항-CD38 CAR MFG 레트로바이러스 벡터 플라스미드 DNA로 FuGene 시약(Promega, Madison, Wi)을 사용하여 Phoenix-Eco 세포주 (ATCC)를 형질감염시켜 에코트로픽 레트로바이러스를 생섬함에 이어서 수거된 일과성 바이러스 상등액 (에코트로픽 바이러스)을 사용하여 Gal-V 외피를 갖는 PG13 팩키징 세포를 형질도입하여 사람 세포를 감염시키기 위해 레트로바이러스를 생성하였다. 이어서 PG13 세포로부터의 바이러스 상등액을 사용하여 CD3 또는 CD3/CD28 활성화 후 2 내지 3일에 활성화된 T 세포 (또는 PBMC)를 형질도입하였다. 활성화된 사람 T 세포는 2일 동안 제조업자의 매뉴얼로서 및 5% FBS가 보충된 AIM-V 성장 배지(GIBCO-Thermo Fisher scientific, Waltham, MA) 중 300-1000 U/ml IL-2로서 정상의 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 100 ng/ml의 마우스 항-사람 CD3 항체 OKT3 (Orth Biotech, Rartian, NJ) 또는 항-CD3, 항-CD28 TransAct (Miltenly Biotech, German)로 활성화시킴에 의해 생성하였다. 5×106 활성화된 사람 T 세포에는 10 mg/ml 레트로넥틴 (Takara Bio USA) 사전-코팅된 6-웰 플레이트에서 3 ml 바이러스 상등액으로 형질도입하고 32℃에서 1시간 동안 1000g에서 원심분리하였다. 형질도입 후, 형질도입된 T 세포는 5% FBS 및 300-1000 U/ml IL-2가 보충된 AIM-V 성장 배지에서 확장시켰다.
[표 1]
이중 가닥의 공여자 DNA를 생성하기 위해 사용되는 프라이머:
별표는 포스포로티오에이트 (PS) 연결; Am, 2’-O-메틸화된 데옥시아데노신;
Cm, 2’-O-메틸화된 데옥시시토신; Gm, 2’-O-메틸화된 데옥시구아노신을 지적한다.
실시예 1. 사람 T 세포에서 동시에 T-세포 수용체 유전자의 녹아웃 및 항-CD38 CAR의 녹-인.
본 실시예에서, T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 유전자는 공여자 DNA로서 항-CD38 CAR 작제물로 표적화하였다. pAAV-TRAC-항-CD38 작제물은 게놈 내에서 표적 서열(CAGGGTTCTGGATATCTGT (서열번호1))을 플랭킹하는 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC)의 대략 1.3kb의 게놈 DNA 서열과 함께 디자인하였다. 표적 서열은 Cas9-매개된 유전자 붕괴 및 공여자 작제물의 삽입을 위한 TRAC 유전자의 엑손 1에서 Cas9 PAM의 업스트림 부위로서 동정하였다. 항-CD38 CAR 유전자 작제물(서열번호 2)은 사람 CD38에 특이적인 단일쇄 가변 단편 (scFv)에 이어서 CD8 및 CD28 힌지-CD28 막관통-CD28 세포내 영역 및 CD3 제타 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 포함하였다. 외인성 JeT 프로모터 (미국 특허 제6,555,6674호; 서열번호 3)를 사용하여 항-CD38 CAR의 전사를 개시하였다.
게놈 편집을 위해 공여자 단편을 생성하기 위한 PCR 주형으로서 사용된 pAAV-항-CD38A2 공여자 플라스미드를 작제하기 위해, 650-660 bp 상동성 아암을 갖는 항-CD38A2 CAR 작제물(서열번호 4)은 통합된 DNA 기술(IDT, Coralville, IA)에 의해 합성하였다. 인-융합 클로닝 반응은 실온에서 수행하였고, MluI 및 BstEII (50 ng)로 이중으로 분해된 pAAV-MCS 벡터, 플랭킹 상동성 아암을 갖는 항-CD38A2 CAR 단편(서열번호 4) (50ng), 1ul 5X 인-융합 HD 효소 프레믹스 (Takara Bio), 및 뉴클레아제 부재 물을 함유한다. 반응은 간략하게 와동시키고 50℃에서 30분동안 항온처리하기 전에 원심분리하였다. 이어서, Stellar™ 컴피턴트 세포(Takara Bio USA)는 인-융합 생성물로 형질전환시키고 앰피실린-처리된 한천 플레이트 상에 분주하였다. 다중 콜로니는 생거 서열분석(Genewiz, South Plainfield, Nj)을 위해 선택하여 프라이머 CTTAGGCTGGGCATTAGCAG (서열번호 5), CATGGAATGGTCATGGGTCT (서열번호 6), 및 GGCTACGTATTCGGTTCAGG (서열번호 7)을 사용하여 올바른 클론을 동정하였다. 올바른 클론을 배양하고 이들 클론으로부터의 DNA 플라스미드를 정제하였다.
TCR 알파 (TRAC) 유전자의 RNA 가이드-지시된 표적화를 위해, tracr RNA (ALT-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA) 및 crispr RNA (ALT-R® CRISPR-Cas9 crRNA)는 IDT (Coralville, IA)로부터 구입하였고, 여기서, 상기 crRNA는 TRAC 유전자의 제1 엑손 내 cas9 PAM 서열 (NGG)의 바로 업스트림에 존재하는 표적 서열 CAGGGTTCTGGATATCTGT (서열번호 1)을 포함하도록 디자인하였다.
공여자 단편 DNA를 제조하기 위해, PrimeSTAR 맥스 프레믹스 (Takara Bio USA)는 PCR 반응을 위해 사용하였다. 상기된 AAV 공여자 플라스미드 pAAV-항-CD38A2는 주형으로서 사용하였다. 660nt 및 650nt의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하기 위해, 정배향 프라이머 서열은 TGGAGCTAGGGCACCATATT (서열번호 36)의 서열을 갖고, 역배향 프라이머 서열은 CAACTTGGAGAAGGGGCTTA (서열번호 9)의 서열을 갖는다. 상이한 상동성 아암 길이의 효과를 시험하기 위한 다양한 실험에서, pAAV-항-CD38A2 작제물의 상동성 아암 내 특정 위치에 하이브리드화하는 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 목적하는 길이의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였다. 포스포로티오에이트 결합(도 2a)은 정배향 프라이머 (서열번호 36)의 5’ 말단에서 말단 3개의 뉴클레오타이드에 도입하여 엑소뉴클레아제 분해 (즉, 5; 말단으로부터 첫번째와 두번째, 두번째와 세번째, 및 세번째와 네번째 뉴클레오타이드 사이에)를 억제하였다. 정배향 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 5’ 말단으로부터 두번째, 세번째 및 네번째 위치에서 뉴클레오타이드는 또한 잠재적으로 말단 3개의 뉴클레오타이드의 포스포로티오에이트 (PS) 골격 (서열번호 8, 도 2b)에 의해 유발된 비-특이적 결합을 회피하도록 변형된 2’-O-메틸이었다. 역배향 프라이머(서열번호 9)는 5’ 말단 인산화에 의해 변형되어, 상기 가닥은 Guide-it™ Long ssDNA 생성 시스템 키트 (Takara Bio USA)에 의해 제공된 스트랜다제에 의해 분해될 수 있다. 공여자 DNA 단편을 생성하기 위해, 열순환기 세팅은 다음과 같다: 30s 동안 98℃의 1회 사이클, 10s 동안 98℃, 5s 동안 66℃, 30s 동안 72℃의 35회 사이클 및 10분동안 72℃의 1회 사이클. 스트랜다제를 사용한 분해는 제조업자의 지침 (Takara Bio USA)에 따라 수행하였고, ssDNA는 NucleoSpin 겔 및 PCR 클린-업 키트(Takara Bio USA)를 사용하여 정제하였다. ssDNA의 농도는 NanoDrop (Denovix, Wilmington, De)에 의해 결정하였다. 대조군으로서, 공여자 단편은 변형되지 않은 프라이머로 제조하여 수득한 공여자 단편이 어떠한 화학적 변형을 갖지 않도록 (PS 또는 2’-O-메틸 그룹 부재) 또는 단지 PS 변형을 갖도록 (2’-O-메틸 그룹 부재)하였다.
TCR 녹아웃/항-CD38 CAR 녹-인을 생성하기 위해, T 세포는 CD3을 배양물에 첨가함에 의해 활성화시켰다. CD3을 사용한 T-세포 활성화 개시 후 약 48 내지 72시간에, 활성화된 T 세포를 포함하는 PBMC 배양물을 Neon® 형질감염 시스템(ThermoFisher Scientific) 및 10-μl의 팁 또는 100-μl 팁을 사용하여 SpCas9 단백질 + crRNA(가이드 서열 서열번호 1을 함유하는)과 함께 전기천공하였다. 간략하게, Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 및 Alt-R tracrRNA (IDT)는 먼저 혼합하고 95℃에서 5분동안 가열하였다. 혼합물을 이어서 가열로부터 제거하고 약 20분동안 벤치 탑 (bench top) 상에서 실온(15-25℃)으로 냉각되도록 방치한다. 각각의 형질감염을 위해, 10 μg의 SpCas9 단백질 (IDT)를 200 pmol의 crRNA:tracrRNA 듀플렉스와 혼합하여 RNP를 형성하였다. 1 x 106 세포를 RNP와 혼합하고 1700 V, 20 ms 펄스 폭, 1 펄스로 전기천공하였다. 1 내지 2시간 후에, 10ug의 단일-가닥의 공여자 DNA를 1600 V, 20ms 펄스 폭, 1 펄스로 세포에 전기천공하였다. 일부 경우에, T 세포는 RNP 및 공여자 DNA와 혼합하고 RNP 및 공여자를 동시에 전기천공하였다. 전기천공 후, 세포는 배양 배지에 희석시키고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다.
Cas-매개된 녹-인 방법을 위한 대조군으로서, CAR-발현 PBMC는 CRISPR 표적화에 사용되는 공여자 단편을 제조하기 위해 사용된 레트로바이러스 벡터 내 동일한 항-CD38A2 발현 카세트(서열번호 2)를 포함하는 레트로바이러스를 사용하여 T 세포에 형질도입함에 의해 생성하였다.
FACS에 의한 형질전환된 세포의 CAR 발현을 검출함에 의한 녹-인 효율을 결정하기 위해, 형질감염되거나 형질도입된 PBMC는 DPBS/5% 사람 혈청 알부민으로 세척하고, 이어서 항-CD3-BV421 항체 SK7 (BioLegend) 및 PE 접합된 항-CD38-Fc 단백질(Chimerigen Laboratories, Allston, MA)로 4℃에서 30 내지 60분 동안 염색시켰다. CD3 및 항-CD38 CAR 발현은 iQue 스크리너 플러스 (Intellicyte Co.)를 사용하여 분석하였다. 음성 대조군은 TRAC 유전자의 제1 엑손을 표적화하는 하이브리드화된 tracrRNA 및 crRNA와 복합체화된 cas9 단백질을 함유하는 RNP로 형질감염되었지만 항-CD38 CAR 공여자 DNA로 형질감염되지 않은 세포이다. TRAC 유전자좌를 표적화하는 가이드를 함유하는 RNP로 형질감염된 PBMC에는 후속적으로 상기된 바와 같은 항-CD38 CAR 작제물을 포함하는 레트로바이러스를 형질도입하고 또한 항-CD38 CAR의 발현에 대해 분석하였다. 도 3a는 형질감염 후 8일째에 항-CD38 작제물의 발현이 항-CD38 CAR의 발현을 위한 공여자 단편의 부재하에 RNP (TRAC 유전자를 녹킹아웃하기 위해) RNP로 형질전환된 세포에서 검출되지 않았다(최좌측 패널). 한편, TRAC 녹아웃을 갖고 후속적으로 항-CD38 CAR을 발현하기 위해 작제물을 포함하는 레트로바이러스가 형질도입된 PBMC는 형질감염 후 8일째에 세포의 약 70%에서 항-CD38 CAR의 발현을 보여주었다(도 3a의 최우측 패널). TRAC 유전자의 RNP 표적화 엑손 1에 추가로 항-CD38 CAR ss 공여자 DNA로 형질전환된 배양물에 대해, 어떠한 화학적 변형을 갖지 않은 ss 공여자 DNA를 수용한 집단의 대략 12% 및 공여자 DNA의 5’ 말단 근처의 뉴클레오타이드 상에 PS 골격 변형만을 갖는 (5’ 말단으로부터 넘버링되는 뉴클레오타이드 1과 2, 2와 3 및 3과 4 사이에 PS 결합을 갖는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 도입된) ss 공여자 DNA가 형질도입된 배양물의 대략 13%는 항-CD38 작제물의 발현을 입증하였다. 또한 PS 변형을 포함하는 (PCR에 의해 공여자 DNA를 생성하기 위해 이들 변형을 포함하는 서열번호 8의 프라이머를 사용함에 의해) 공여자 단편 가닥의 5’말단으로부터 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드에서 3개 뉴클레오타이드의 2’산소로의 메틸 그룹의 부가는 형질감염된 집단에서 항-CD38 CAR의 유의적으로 보다 높은 발현을 유도하였고, 여기서, 항-CD38 CAR의 발현은 8일째에 ‘이중 변형된 (2’-O-메틸 및 PS) 단일 가닥의 공여자 단편을 수용한 세포의 대략 20%에서 나타났다. 현저하게, 공여자 DNA의 화학적 변형은 형질감염된 배양물의 생존률에 영향을 미치지 않았다.
항-CD38 CAR의 증가된 발현은 항-CD38 CAR 공여자 단편 + 상기 TRAC 유전자를 표적화하는 RNP로 형질감염된 배양물에서 시간 경과에 따라서 관찰되었다. 형질감염 후 10일째에, 비변형된 단일 가닥의 공여자 또는 5’ 최외곽 3개의 뉴클레오타이드 상에 PS 연결을 포함하도록 변형된 단일 가닥 공여자로 형질감염된 PBMC 배양물의 유동 세포측정은 TRAC-표적화 RNP로 형질감염된 모든 배양물 중에서 상기 세포의 적어도 80%가 TCR을 발현하지 않았음을 입증하였다. 더욱이, TRAC-표적화 RNP에 추가로 항-CD38 CAR 공여자로 형질감염된 배양물에서, TCR을 발현하지 않은 세포의 적어도 42%는 항-CD38 작제물을 발현하였다(도 3b, 패널 2-4). 5’-근접 뉴클레오타이드 상에 PS 및 2’-O-메틸 그룹 둘다를 갖는 항-CD38 CAR 공여자 단편으로 형질감염된 배양물에 대해, 세포의 57%는 10일까지 항-CD38 작제물을 발현한다. 동시에, 레트로바이러스가 형질도입된 배양물 중에 항-CD38 CAR의 발현은 8일째에 나타났던 것의 약 절반으로, 형질감염 또는 형질도입 후 10일째에 세포의 대략 34%까지 떨어졌다. 20일째에 이중으로 변형된 ss 공여자로 형질감염된 배양물 및 레트로바이러스 형질도입된 배양물의 분석(도 3c)은 배양물 중에 항-CD38 작제물의 발현이 안정화되고, 5’ 말단에서 PS 및 2’-O-메틸 변형 둘다를 갖는 ss 공여자로 형질감염된 cas9-변형된 배양물은 TCR-음성 세포의 54%가 작제물을 발현함을 입증하고 레트로바이러스가 형질도입된 배양물은 TCR-음성 세포의 31%가 작제물을 발현함을 입증한다.
TRAC 유전자의 엑손 1에서 표적화된 유전자좌에서 상동성 지시된 복구 (HDR)의 존재를 확인하기 위해, PCR은 공여자 단편이 가이드 RNA에 의해 표적화된 TRAC 부위로 삽입되었는지를 입증하기 위해 배양물로부터 단리된 DNA에 대해 수행하였다. 게놈 DNA는 비-형질감염된 활성화된 T 세포(ATC), TRAC 엑손 1 가이드 RNA를 포함한 RNP로 형질감염된 TRAC 녹아웃 세포, 및 RNP + 포스포로티오에이트 및 2’ O-메틸 변형된 공여자 DNA로 형질감염된 T 세포로부터 증폭시켜 TRAC 유전자좌로의 항-CD38 CAR 전이유전자의 표적화된 삽입체를 검출하였다. 게놈 내 공여자 DNA의 위치를 확인하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 TRAC 상동성 아암의 외부이지만 게놈 내 상동성 아암 서열에 인접한 서열에 표적화하였다. 총 1 x 105 세포를 30 μL의 퀵 추출 용액(Quick Extraction solution) (Epicenter)에 재현탁시켜 게놈 DNA를 추출하였다. 세포 용해물을 5분동안 65 ℃에서 및 이어서 2분동안 95 ℃에서 항온처리하고 -20 ℃에서 저장하였다. 게놈 DNA의 농도는 NanoDrop (Denovix)에 의해 결정하였다. TRAC 표적 부위를 함유하는 게놈 영역은 하기의 프라이머 세트를 사용하여 PCR-증폭시켰다: TRAC 상에 5’ PCR 정배향 프라이머: CTGCTTTCTGAGGGTGAAG (서열번호 10), CAR 상의 5’ PCR 역배향 프라이머: CTTTCGACCAACTGGACCTG (서열번호 11); CAR 상의 3’ 정배향 프라이머: CGTTCTGGGTACTCGTGGTT (서열번호 12), TRAC 상에 3’ 역배향 프라이머: GAGAGCCCTTCCCTGACTTT (서열번호 13) (도 1b 참조). 프라이머 세트 둘다는 상동성 아암의 외부를 어닐링함에 의해 HDR 주형의 증폭을 회피하도록 디자인하였다.
게놈 DNA의 농도는 NanoDrop (Denovix)에 의해 결정하였다. 프라이머 세트 둘다는 쌍의 하나의 프라이머가 상동성 아암의 외부의 게놈 내 부위에 어닐링하도록 하고 상기 쌍의 다른 프라이머가 작제물의 암호화 영역 (즉, 상동성 아암에서의 영역이 아닌) 내 부위로 어닐링하도록 디자인하였다. PCR은 400ng의 게놈 DNA 및 Q5 고 충실도 2X 믹스 (New England Biolabs)를 함유하였다. 열순환기 세팅은 2분동안 98℃에서 1 사이클, 10s 동안 98℃에서, 15s 동안 65℃에서, 45s 동안 72℃에서 35 사이클 및 10분동안 72℃에서 1 사이클로 이루어졌다. PCR 생성물은 SYBR Safe를 함유하는 1% 아가로스 겔 (Life Technologies) 상에서 정제하였다. PCR 생성물은 이어서 아가로스 겔로부터 용출시키고 NucleoSpin® 겔 및 PCR 클린-업 키트(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. Kg)를 사용하여 단리하였다. PCR 생성물은 생거 서열분석 (Genewiz)을 받게 하였다. 도 4는 겔 분리 PCR 생성물의 사진을 제공한다. 작제물의 5’ 및 3’ 말단에서 게놈 내 상동성 아암에 인접한 게놈 서열에 인접한 항-CD38 작제물에 상응하는 양성 밴드는 공여자 DNA로 형질감염된 세포 (레인 3 및 6)에서 나타났고 비-형질감염된 ATC (레인 1 및 4) 또는 TRAC 녹아웃 세포 (레인 2 및 5)에서 나타나지 않았다. 이들 PCR 생성물의 서열분석은 이들이 항- CD38 CAR 서열을 포함함을 확인하였다. 서열번호
형질감염된 세포의 기능에 대해 시험하기 위해, 전기천공 3주 후에, TRAC 유전자좌에 표적화된 항-CD38 CAR로 형질감염된 활성화된 T 세포는 밤새 IL-2로 단식시키고, 특이적 사멸 검정에서 시험하였다(도 5). 활성화된 T 세포는 CD38 양성 RPMI-8226/GFP 세포 및 CD38 음성 K562/RPE 세포의 표적 세포 혼합물과 동시 배양하였다. 항온처리 이펙터-대-표적 세포 비율은 10:1 내지 0.08:1 범위였다. 밤새 항온처리 후, 세포는 유동 세포측정에 의해 분석하여 GFP-양성 및 RPE-양성 세포 집단을 측정하여 항-CD38A2 CART 세포에 의한 특이적 표적 세포 사멸을 결정하였다. 도 5는 비-형질감염된 ATC 세포는 최고의 이펙터 대 표적 비율에서 일부 독성을 보여주었지만, TRAC 녹아웃 세포는 이펙터 대 표적 세포 비율에 상관 없이 실질적으로 어떠한 사멸을 보여주지 않음을 보여준다. 항-CD38A2 CART 세포는 그러나 CD38 양성 세포- RPMI8226에 대해 강력한 사멸 활성을 나타냈지만 CD38 음성 세포 - K562에 대해서는 활성이 나타나지 않았다(도 5). 항-CD38 CAR 카세트를 함유한 화학적으로 변형된 공여자를 통합한 T 세포는 항-CD38 CAR 작제물을 포함하는 레트로바이러스가 형질도입된 세포의 것과 유사하게 표적 세포에 대한 세포독성을 입증하였다.
형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)는 또한 사이토킨 분비에 대해 시험하였다(도 6a, 도 6b, 및 도 6c). T 세포는 밤새 IL-2 부재 배지에서 단식시켰다. 항-CD38 CAR-T 세포 또는 ATC 대조군은 이어서 CD38 음성 K562 또는 CD38 양성 RPMI8226 세포와 동시 배양하였다. 항온처리 이펙터 대 표적 세포 비율은 2:1이었다. 밤새 항온처리 후, 세포는 제조업자의 지침에 따라 원심분리하고 상등액을 수거하여 사이토킨 IL-2, IFN-감마 및 TNF 알파(Affymetrix eBioscience)를 정량하였다. 유전자-편집된 TCR 녹아웃 항-CD38A2 CART 세포는 또한 CD38 음성 세포 (K562)가 아닌 CD38 양성 종양 세포 (RPMI8226)와 동시 배양하는 경우 유사한 양의 IFN-γ 및 다른 염증 촉진 사이토킨을 방출하였다.
요약하면, 시험관내 세포 기능성 연구는 특이적 사멸 검정 (도 5) 및 사이토킨 분비 검정(도 6a, 도 6b, 및 도 6c) 둘다의 측면에서, 상기 신규 및 효율적인 공정에 의해 성취된 TRAC-부위-특이적 통합된 항-CD38A2 CAR과 바이러스-매개된 무작위로 통합된 항-CD38A2 CAR 간에 임의의 현저한 차이를 밝히지 못했다.
실시예 2. 공여자 DNA의 상동성 아암의 길이의 감소
PCR에 의해 공여자 DNA를 합성하는 경우, 뉴클레아제 반응 및 이에 따른 단일 가닥 공여자 단편의 정제는 시간 소모적이고, 전형적으로 형질감염을 위한 공여자 단편의 수율 상실을 유도하고 상동성 아암의 길이를 제어하기가 어려울 수 있다(상동성은 지나치게 분해(chewed)될 수 있다). 지시된 유전자 녹아웃 및 항체 작제물 녹-인의 효율을 시험하는 추가의 실험에서, 이중 가닥 공여자 DNA는 PCR 합성된 공여자의 뉴클레아제 분해를 제거하기 위해 시험하였다.
항-CD38 CAR 작제물의 녹-인을 위해, 상이한 길이의 상동성 아암 (HA)을 갖는 공여자 단편을 생성하였다. 항-CD38 카세트 + 660과 650nt의 TRAC 엑손 1 상동성 아암을 포함한 실시예 1에서 기재된 pAAV-TRAC-항-CD38 작제물(서열번호 4)은 주형으로서 사용하였다. 제1 세트의 프라이머, 서열번호 8 및 서열번호 9를 사용하여 상기 주형으로부터 660 nt 및 650 nt의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였다. 제2 세트의 프라이머, 서열번호 14 및 서열번호 15를 사용하여 대략 350nt (375 및 321 뉴클레오타이드)의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였고, 여기서, 서열번호 14의 프라이머는 5’ 말단으로부터 제1과 제2, 제2와 제3, 및 제3과 제4 뉴클레오타이드 사이에 PS 연결을 갖고 위치 2, 3, 및 5에서 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 가졌다. 제3 세트의 프라이머, 서열번호 18 및 서열번호 19를 사용하여 대략 165nt (171 및 161nt)의 상동성 아암을 갖는 공여자 단편을 생성하였고, 여기서, 서열번호 18의 프라이머는 5’ 말단으로부터 제1과 제2, 제3과 제4, 및 제4와 제5 뉴클레오타이드 사이에 PS 연결을 갖고 위치 3, 4 및 5에서 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 가졌다. 각각의 경우에, 정배향 프라이머 (서열번호 8, 14, 및 18)는 5’말단 최외곽 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 연결 (예를 들어, 프라이머의 5’ 말단으로부터 임의의 제1과 제2, 제2와 제3, 제3과 제4, 및 제4와 제5 뉴클레오타이드 사이에) 및 임의의 5개의 5’ 말단 최외곽 뉴클레오타이드에 존재하는 3개의 2’-O-메틸 그룹을 갖도록 디자인하였다. 각각의 경우에, 역배향 프라이머(서열번호 9, 15, 및 17)는 5’ 말단 포스페이트를 가졌다(표 1 참조).
프라이머 세트 각각을 사용하여 공여자의 하나의 말단의 5’ 말단에 근접한 다중 PS 및 2’-O 메틸 변형 및 공여자의 반대 가닥의 5’ 말단에서 5’ 포스페이트를 갖는 공여자 DNA 분자를 생성하였다. RNP는 실시예 1에 기재된 바와 같은 tracr 및 crRNA를 포함하도록 어셈블리하였고, 여기서, 상기 crRNA는 TRAC 유전자의 엑손 1에 발견된 서열인 서열번호 1의 표적 서열을 포함하였다. 길이가 대략 665, 350 및 165 염기쌍인 상동성 아암을 갖는 공여자 분자를 독립적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 활성화된 T 세포에 형질감염시켰고, 단, 공여자 단편 및 RNP는 RNP를 전기천공시키기 위한 (Neon® 형질감염 시스템(ThermoFisher Scientific) 1700 V, 20 ms 펄스 폭, 1 펄스) 조건하에서 동일한 전기천공으로 형질감염시켰다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 공여자 DNA 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. T 세포 수용체 및 항-CD38 CAR 작제물의 발현에 대해 시험하기 위해, 유동 세포측정은 실시예 1에 제공된 바와 같이 수행하였다. 도 7은 예상된 바와 같이, 단지 RNP로 형질감염된 T 세포 배양물이 T 세포 수용체의 저수준의 발현을 가짐을 보여주고 또한 항-CD38 CAR이 발현되지 않음을 입증한다. RNP + 상이한 크기의 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA로 형질감염된 T 세포는 그러나 배양물에서 저수준의 T 세포 수용체 발현 및 항-CD38 CAR의 양호한 발현을 보여주고, 이는 이중 가닥 DNA의 형질감염이 표적화된 녹-인을 위해 매우 효과적임을 입증한다. 추가로, 보다 긴 길이 뿐만 아니라 시험된 최단 HA 길이 161/171 nt는 적어도 작동했고, 도입된 작제물을 발현하는 녹아웃 세포의 퍼센트는 대략 665 nt 아암에 대해 대략 24%, 대략 350nt 아암에 대해 대략 30% 및 대략 165 nt 아암에 대해 대략 38%이다. 짧은 상동성 아암은 따라서 이중 가닥 DNA 공여자를 사용한 표적화된 녹-인 게놈 변형에 매우 효과적인 것으로 밝혀졌고, 이는 보다 작은 작제물을 가능하고/하거나 작제물 내 보다 높은 용량을 가능하게 하여 공여자 DNA에 포함될 추가의 또는 보다 긴 서열의 내포를 가능하게 한다는 이득을 갖는다.
실시예 3. 변형된 것 대 비-변형된 이중 가닥 공여자 DNA
항-CD38 CAR을 포함하고 상기 실시예 2에 제시된 바와 같이 대략 165 nt TRAC 엑손 1 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA는 HDR을 촉진시키는데 이들의 상대적 효과를 시험하기 위해 뉴클레오타이드 변형의 존재 및 부재하에 프라이머를 사용하여 합성하였다. 첫번째의 경우에, 프라이머 서열번호 18은 프라이머(뉴클레오타이드 위치 2, 3 및 5에서)의 5' 말단의 처음 5개 뉴클레오타이드 내 제1과 제2, 제3과 제4 및 제4와 제5의 뉴클레오사이드, 및 3개의 2’-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드 사이에 존재하는 3개의 PS 연결을 갖고, 프라이머 서열번호 19는 5’ 말단 포스페이트를 갖는다(표 1). 이들 프라이머를 사용하여 상응하는 뉴클레오타이드 변형 (즉, 공여자 DNA 생성물의 제1 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 연결 및 3개의 2’-O-메틸 그룹, 및 공여자 DNA 생성물의 제2 가닥의 5’ 말단 상에 포스페이트)을 갖는 공여자 DNA를 생성하였다. 제2의 경우에, 프라이머 서열번호 37은 프라이머 서열번호 18과 동일하고, 단, 프라이머 서열번호 37은 화학적 변형이 부재이다(표 1 참조). 5’ 말단 포스페이트가 부재인 서열번호 37 프라이머 및 서열번호 19 프라이머를 사용하여 항-CD38 CAR 카세트를 갖는 어떠한 뉴클레오타이드 변형을 갖지 않는 공여자 DNA를 생성하였다. 이들 공여자 DNA는 활성화된 T 세포에 서열번호 1의 표적 서열 (TRAC 유전자의 엑손 1 내)을 포함하는 tracr RNA 및 crRNA를 포함하는 RNP와 함께 이중 가닥 DNA 분자 (어느 한 가닥의 변성 또는 뉴클레아제 분해가 없음)로 형질감염시켰다. 공여자로서 이중 가닥의 DNA를 사용한 전기 천공에서, 5ug의 dsDNA를 사용하여 100만개의 활성화된 T 세포를 형질감염시켰다.
실시예 2에서와 같이, 대조군 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP를 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. T 세포 수용체 및 항-CD3 CAR 작제물의 발현에 대해 시험하기 위해, 유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 제공된 바와 같이 수행하였다. 도 8에 나타낸 결과는 RNP 및 변형된 이중 가닥 공여자를 사용한 형질감염이 RNP 및 비변형된 이중 가닥 공여자를 사용한 형질감염과 비교하여 배양물에 걸쳐 항-CD38 작제물의 적어도 2배의 발현을 유도함을 보여주고, 항-CD38 CAR 전이유전자를 발현하고 TCR (CD3 음성)을 발현하지 않는 배양물의 세포의 50% 초과를 유도한다.
삽입 유전자좌를 진단하기 위해 프라이머를 사용하여 생성된 PCR 생성물의 서열분석(도 2b 참조)은 TRAC 유전자의 엑손 1에 통합된 항-CD38 CAR 공여자 단편을 입증하는 서열을 제공하였다. PCR 생성물 서열(서열번호 39 및 서열번호 40)은 게놈 내 공여자 단편내에 존재하는 상동성 아암에 인접한 서열 및 단일 PCR 생성물 내 항-CD38 CAR의 일부를 포함하였고, 이는 예상된 삽입을 입증한다.
실시예 4. 동시 TCR 녹아웃과 함께 항-CD19 및 항-BCMA CAR 작제물의 HDR-매개된 녹-인
항-CD19 CAR 및 항-BCMA CAR 발현 작제물을 포함한 추가의 공여자 DNA는 또한 TRAC 유전자좌로의 삽입에 대해 시험하였다.
Jet 프로모터 (서열번호 3), 및 인트론, 항-CD19 CAR 작제물 및 SV40 폴리A 서열을 포함하는 항-CD19 CAR 카세트 (서열번호 22)을 포함하는 항-CD19 CAR 작제물은 필수적으로 실시예 1에 기재된 항-CD38 CAR pAAV 작제물에 대해 기재된 바와 같이 제조하였고, 서열번호 20 및 서열번호 21의 TRAC 유전자 엑손 1 상동성 아암(HA)에 의해 플랭킹된 벡터에 클로닝하였다. HA pAAV 작제물을 갖는 항-CD19 CAR은 대략 170개 및 160개 뉴클레오타이드의 HA를 갖는 변형된 공여자 DNA의 생성을 유도하는 서열번호 18 및 서열번호 19로서 제공된 프라이머를 사용하여 실시예 1에 제공된 바와 같은 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다(표 1 참조). 정배향 프라이머 (서열번호 18)는 제1과 제2, 제3과 제4, 제4와 제5 뉴클레오사이드 사이에 3개의 PS 결합 및 프라이머의 5’ 말단으로부터 넘버링하는 경우 뉴클레오타이드 3, 4 및 5에서 3개의 2’-O-메틸 변형을 가졌다. 역배향 프라이머 (서열번호 19)는 5’ 말단 포스페이트를 가졌다. 따라서, 수득한 이중 가닥 공여자 DNA는 상응하는 변형을 갖도록 합성하였고, 제1 가닥은 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 및 3개의 2’-O-메틸 변형을 가졌고, 제2 가닥은 5’ 말단 포스페이트를 가졌다.
도입된 상기된 프라이머 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 변형을 갖는 서열번호 38의 서열을 갖는 이중 가닥의 화학적으로 변형된 공여자 단편을 사용하여 실시예 1에 제공된 방법에 따라 생성된 RNP와 함께 세포를 형질감염시키고, 여기서, 상기 RNP의 crRNA는 TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하는 서열번호 1의 표적 서열을 포함하였다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. 유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하여 상이한 작제물의 TRAC 유전자좌로의 도입 효율을 평가하였고, 단, 항-CD19 CAR 발현은 CD19-Fc (Speed Biosystem)에 이어서 APC 항-사람 IgG Fcγ (Jackson Immunoresearch)에 의해 검출하였다. 상기 결과는 도 9에 나타내고, 여기서, 항-CD19 CAR이 배양물 중의 세포의 대략 42%에서 T 세포 수용체 발현의 부재하에 발현됨을 알 수 있다.
항-BCMA CAR 작제물은 CD38 CAR을, 실시예 1에 기재된 항-CD38 CAR pAAV 작제물을 기초로 하는 BCMA CAR로 대체함에 의해 생성하였다. BCMA CAR 단편은 IDT에 의해 합성하였다. 삽입체의 서열은 서열번호 23으로서 제공된다. 항-BCMA CAR 작제물은 대략 160개 -170개 뉴클레오타이드의 HA를 갖는 공여자 DNA의 생성을 유도하는 서열번호 18 및 서열번호 19로서 제공된 프라이머를 사용하여 실시예 1에 제시된 바와 같은 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다(표 1 참조). 정배향 프라이머(서열번호 18)는 프라이머의 5’-말단의 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 및 3개의 2’-O-메틸 변형을 가졌다. 역배향 프라이머 (서열번호 19)는 5’ 말단 포스페이트를 가졌다. 따라서, 수득한 이중 가닥 공여자 DNA는 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 3개의 PS 및 3개의 2’-O-메틸 변형을 갖는 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트를 갖는 제2 가닥을 갖도록 합성하였다.
상기 제공된 바와 같은 화학적으로 변형된 프라이머의 도입에 의해 변형된 뉴클레오타이드를 갖는 서열번호 37의 서열을 갖는 이중 가닥의 공여자 단편을 사용하여 실시예 1에 제공된 방법에 따라 생성된 RNP와 함께 세포를 형질감염시키고, 여기서, 상기 RNP의 crRNA는 TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하는 서열번호 1의 표적 서열을 포함하였다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. 유동 세포측정은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하여 상이한 작제물의 TRAC 유전자좌로의 도입 효율을 평가하였고, 단, 항-BCMA CAR 발현은 PE 또는 APC 접합된 BCMA-Fc (R&D)에 의해 검출하였다. 상기 결과는 도 10에 나타내고, 여기서, 항-BCMA CAR이 배양물 중의 세포의 대략 66%에서 T 세포 수용체 발현의 부재하에 발현됨을 알 수 있다.
실시예 5. TRAC 엑손 3을 표적화하는 HDR 매개된 녹-인
본원에 제공된 공여자 삽입을 위한 방법을 사용하여 TRAC 유전자의 엑손 1 이외의 다른 유전자좌에 공여자 DNA를 삽입하는 효율을 시험하기 위해, 항-CD38 CAR 작제물은 TRAC 유전자의 엑손 3으로부터의 HA를 갖는 공여자 DNA를 생성하기 위해 제조하였다. 상기 경우에, 작제물은 필수적으로 TRAC 엑손 1 표적화 작제물에 대해 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였고, 단, HA (5’ HA 서열번호 24 (183 nt) 및 3’ HA 서열번호 25 (140 nt))는 엑손 3 표적 부위 주변의 서열 (서열번호 26)이다. 이어서 TRAC 유전자 엑손 3 상동성 아암을 갖는 공여자 DNA로서 생성된 pAAV 작제물의 삽입체의 서열은 서열번호 27로서 제공된다. 공여자 단편을 생성하기 위해, 정배향 프라이머 (서열번호 28)는 제1과 제2, 제2와 제3, 제3과 제4 뉴클레오타이드 사이에 PS 연결, 및 5’ 말단으로부터 제2, 제4 및 제5 위치 상에 2’-O-메틸 변형을 포함하였고, 역배향 프라이머(서열번호 29)는 5’-말단 포스페이트를 가졌다. 프라이머가 혼입된 수득한 이중 가닥 공여자 DNA는 5’ 말단 최외곽 뉴클레오타이드 상에 상응하는 PS 및 2’-O-메틸 변형을 갖는 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트를 갖는 제2 가닥을 가졌다.
상기 프라이머의 도입에 의해 변형된 뉴클레오타이드를 갖고 서열번호 27의 서열을 갖는 이중 가닥의 공여자 단편을 사용하여 실시예 1에 제공된 방법에 따라 생성된 RNP와 함께 세포를 형질감염시키고, 여기서, crRNA는 TRAC 유전자의 엑손 3을 표적화하는 서열번호 26의 표적 서열을 포함하였다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 작제물 삽입 없이 표적화된 TRAC 유전자좌의 녹아웃을 유도해야만 하였다. 추가의 대조군은 비-형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)였다. 유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 상기 결과는 도 11에 나타내고, RNP 또는 RNP + 공여자 DNA를 사용한 형질감염이 배양물에 걸쳐 80% 초과의 세포가 TCR 발현을 상실함을 알 수 있다. 추가로, 항-CD38 CAR은 표적화 RNA + TRAC 유전자 엑손 3으로부터 유래된 HA를 갖는 공여자 DNA로 형질감염된 배양물에서 세포의 대략 42%에서 T 세포 수용체 발현의 부재하에 발현되었다.
삽입 유전자좌를 진단하기 위해 프라이머를 사용하여 생성된 PCR 생성물의 서열분석(도 2b 참조)은 TRAC 유전자의 엑손 3에 통합된 항-CD38 CAR 공여자 단편을 입증하는 서열을 제공하였다. PCR 생성물 서열(서열번호 41 및 서열번호 42)은 게놈 내 공여자 단편내에 존재하는 상동성 아암에 인접한 서열 및 단일 PCR 생성물 내 항-CD38 CAR의 일부를 포함하였고, 이는 예상된 삽입을 입증한다.
도 12는 항-CD19 CAR의 TRAC 유전자의 엑손 3 및 엑손 1로의 표적화를 비교한다. 엑손 3으로 지시된 항-CD19 CAR 공여자 DNA는 상기 실시예에 제시된 바와 같이 항-CD19 CAR 카세트 (서열번호 22)를 포함하도록 합성하였고, 여기서, 상기 항-CD19 발현 카세트는 상기 제시된 바와 같이 엑손 3 유전자좌로부터의 서열 (서열번호 24 및 서열번호 25)에 의해 플랭킹된다. 엑손 1 (서열번호 38의 서열을 갖는)로 지시된 항-CD19 CAR 공여자는 실시예 4에 제공된다. 이들 작제물 각각 - TRAC 엑손 1 HA (서열번호 18 및 서열번호 19)에 의해 플랭킹된 항-CD19 CAR 카세트 (서열번호 22)를 갖는 작제물 및 TRAC 엑손 3 HA (서열번호 24 및 서열번호 25)에 의해 플랭킹된 항-CD19 CAR 카세트 (서열번호 22)를 갖는 다른 작제물을 사용하여 3개의 5’ 말단의 최외곽 뉴클레오타이드 상에 PS 및 2’-O-메틸 변형을 갖는 변형된 정배향 프라이머를 사용한 공여자 단편을 생성하였다. 역배향 프라이머는 5’-말단 포스페이트를 가졌다. 엑손 1 HA에 의해 플랭킹된 항-CD19 CAR 공여자를 제조하기 위한 프라이머는 서열번호 18 및 서열번호 19이고, 여기서, 서열번호 18 프라이머는 제1과 제2, 제3과 제4, 및 제4와 제5 뉴클레오사이드 사이에 PS 연결 및 5’ 말단으로부터 위치 3, 위치 4 및 위치 5에 2’-O 메틸 그룹을 포함하였다. 엑손 3 HA에 의해 플랭킹된 항-CD19 CAR 공여자를 제조하기 위한 프라이머는 서열번호 28 및 서열번호 29이고, 여기서, 서열번호 28 프라이머는 5’ 말단으로부터 제1과 제2, 제2와 제3, 및 제3과 제4 뉴클레오사이드 사이에 PS 연결 및 5’ 말단으로부터 위치 2, 위치 4 및 위치 5에 2’-O 메틸 그룹을 가졌다. 따라서 수득한 이중 가닥 공여자 DNA는 5’ 말단 뉴클레오타이드 상에 상응하는 PS 및 2’-O-메틸 변형을 갖는 제1 가닥 및 5’ 말단 포스페이트를 갖는 제2 가닥을 가졌다.
공여자 단편을 독립적으로 RNP와 함께 활성화된 T 세포에 형질감염시켰다. RNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였고, 단, TRAC 유전자 엑손 1을 표적화하기 위한 crRNA의 표적 서열은 서열번호 1이고, TRAC 유전자 엑손 3을 표적화하기 위한, crRNA의 표적 서열은 서열번호 26이었다. 도 12에서 알수 있는 바와 같이, TRAC 유전자의 엑손 3을 표적화하는 RNP 및 항-CD19 CAR을 발현시키기 위한 공여자 단편으로 형질감염된 배양물의 대략 41%는 둘다 항-CD19 CAR에 대해 TCR 음성 및 양성이었고, TRAC 유전자의 엑손 1을 표적화하는 RNP 및 항-CD19 CAR을 발현하기 위한 공여자 단편으로 형질감염된 배양물의 대략 20%는 둘다 항-CD19 CAR에 대해 TCR 음성 및 양성이었다. 항-CD19 CAR 발현 카세트를 포함하는 레트로바이러스가 형질도입된 T 세포 배양물은 보다 높은 퍼센트의 항-CD19 CAR 발현 세포를 입증하였지만, 이들 세포는 TCR 녹아웃을 갖지 않았다.
실시예 6. PD-1 유전자를 표적화하는 HDR 매개된 녹-인
PD-1 유전자좌는 또한 CAR 작제물로 표적화하였다. 이 경우에, 항-CD38 CAR 카세트 (서열번호 2)는 공여자 DNA를 생성하기 위한 주형을 제공하기 위해 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 부위 (서열번호 32)를 둘러싸는 PD-1 유전자좌의 서열을 갖는 상동성 아암(서열번호 30 및 서열번호 31)에 바로 인접해있다.
공여자 DNA는 5’ 포스페이트를 포함하는 정배향 프라이머 (서열번호 34) 및 5’ 말단으로부터 제1, 제2 및 제4 뉴클레오사이드 (서열번호 35) 상에 2’-O-메틸 그룹 뿐만 아니라 5’ 말단으로부터 제1과 제2, 제2와 제3, 및 제3과 제4 뉴클레오사이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 역배향 프라이머를 사용하여 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다. 표 1을 참조한다.
상기 이중 가닥의 화학적으로 변형된 공여자 단편 (서열번호 33)을 사용하여 실시예 1에 제공된 방법에 따라 생성된 RNP와 함께 세포를 형질감염시키고, 여기서, crRNA는 PD-1 유전자를 표적화하는 서열번호 32의 표적 서열을 포함하였다. 대조군으로서, 활성화된 T 세포에는 공여자 단편의 부재하에 RNP로 형질감염시키고, 이는 CAR 작제물 삽입 없이 표적화된 PD-1 유전자좌의 녹아웃을 생성한다. 추가의 대조군은 비-형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)였다. 유동 세포측정은 필수적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였고, 여기서, 비형질감염된 활성화된 T 세포 (ATC)의 추가의 제어가 포함되었다. PD-1에 대한 BV421-접합된 항체(EH12.2H7, BioLegend)를 사용하여 PD-1 발현을 검출하였다.
상기 결과는 도 13에 나타내고, 여기서, PD-1을 발현하는 세포의 퍼센트는 ATC에서 대략 19%로부터 PD-1 유전자좌를 표적화하는 RNP (PD-1 RNP)로 형질감염된 배양물의 세포에서 대략 4%로 하강함을 알 수 있다. 항-CD38 CAR은 PD-1 표적화 RNA + PD-1 유전자좌와 상동성을 갖는 HA를 갖는 공여자로 형질감염된 배양물에서 세포의 대략 27%에서 PD-1 발현의 부재하에 발현되었다. 비교로서, 배양물의 세포의 약 32%는 TCR의 엑손 1을 표적화하는 RNP 및 TRAC 유전자의 엑손 1의 서열과 상동성을 갖는 HA를 갖는 항-CD38 CAR 공여자 단편으로 형질감염시켰다.
삽입 유전자좌를 진단하기 위해 프라이머를 사용하여 생성된 PCR 생성물의 서열분석(도 2b 참조)은 PD-1 유전자에 통합된 항-CD38 CAR 공여자 단편을 입증하는 서열을 제공하였다. PCR 생성물 서열(예를 들어, 서열번호 43)은 공여자 단편에 존재하는 게놈 내 상동성 아암에 인접한 서열 및 단일 PCR 생성물 내 항-CD38 CAR의 일부를 포함하였고, 이는 예상된 삽입을 입증한다.
도 14는 PBMC, 및 항-CD38 CAR 공여자 단편 및 PD-1 유전자좌를 표적화하는 RNP로 형질감염된 배양물로부터 단리된 T 세포(각각 “PD-1 KOKI PBMC” 및 “PD-1 KOKI T세포”)를 사용하여 수행된 세포독성 검정의 결과를 제공한다. 이들 변형된 세포는 PD-1 유전자 녹아웃을 갖지만 CAR 작제물을 수용하지 않은 대조군 세포(“PD-1 KO”) 및 TRAC 유전자 녹아웃을 갖지만 CAR 작제물을 수용하지 않은 대조군 세포 (“TRAC-1 KO”)와 관련하여 검정에서 표적 세포에 대해 고수준의 세포독성을 보여주었고 어느정도 관찰된 PD-1 부위에서 능히 공여자 CAR 작제물 통합의 보다 낮은 효율로 인해 항-CD38 CAR 공여자 단편 및 TRAC 유전자좌를 표적화하는 RNP(“TRAC KOKI”)로 형질감염된 세포에 의해 능가되었다(도 13).
SEQUENCE LISTING
<110> DING, Beibei
GUO, Wenzhong
ZHANG, Yanliang
<120> IMPROVED PROCESS FOR DNA INTEGRATION USING RNA-GUIDED
ENDONUCLEASES
<130> 087735.0103
<140> US 16/288,052
<141> 2019-02-27
<150> US 62/635,702
<151> 2018-02-27
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Target sequence in TRAC gene
<400> 1
cagggttctg gatatctgt 19
<210> 2
<211> 2119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-CD38 CAR Construct for insertion into TRAC locus
<220>
<221> misc_feature
<223> JeT promoter, DNA sequence encoding CD8a leader peptide,
anti-CD38 CAR (single chain variable fragment (scFv) specific for
human CD38), CD28 hinge-transmembrane-intracellular regions and
CD3 zeta intracellular domain
<400> 2
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180
gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 240
ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 300
ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggaatg 360
gtcatgggtc tttctctttt ttctcagcgt gaccaccgga gtccactccc aggtagagca 420
gaaattgatc tctgaggaag acctgcaggt ccagttggtc gaaagtggcg gcggattggt 480
gaaaccaggc ggatctttga ggcttagttg cgcggcttcc ggatttacgt tcagtgatga 540
ctacatgagc tggataaggc aagcacctgg taagggcctg gaatgggtcg caagtgtgtc 600
taatggaagg cccactacct actatgctga ttccgtccgc ggacgcttta ctatttcaag 660
agataatgct aagaatagtc tgtacctgca gatgaacagt ctgcgcgcgg aagataccgc 720
agtatattac tgtgcacgag aggattgggg tggggagttc acggattggg gcaggggaac 780
tcttgtaacg gtgtctagcg gaggaggtgg gtcaggtgga ggtggcagtg gaggtggagg 840
ctctcaggcc ggcttgaccc aaccgccatc tgcgtcagga acatcaggcc agagggtgac 900
tatcagttgt tctggcagtt catccaatat tgggatcaat ttcgtgtact ggtatcagca 960
cctgccaggt accgcgccga agctgctgat ctataagaat aatcaacgcc catcaggcgt 1020
tccagatagg ttcagtggga gcaagtccgg aaactccgcg tcactcgcga tctcaggtct 1080
gcggtctgag gatgaagctg attattactg cgcggcgtgg gatgattctc tgtcaggcta 1140
cgtattcggt tcagggacta aggtaactgt gttggcgaaa ccgaccacga caccggctcc 1200
aagacctccg acgccagctc caacgatagc gtcacagcca ttgtctctcc gccctgaagc 1260
ctgccggccc gctgcgggcg gcgcggttca tacccgggga ttggactttg cccccagaaa 1320
gatagaggtg atgtaccctc ccccctactt ggacaacgaa aagtctaatg gcactatcat 1380
tcacgtaaag ggcaaacacc tttgtccaag tcctttgttc ccaggcccat ctaagccgtt 1440
ctgggtactc gtggttgtgg ggggcgtgct cgcttgttac tcactgctgg tgacggtggc 1500
ctttattatt ttctgggttc gatctaagcg aagccgcttg ttgcattctg actacatgaa 1560
tatgacgcca agacggccag ggccaacaag aaagcattac caaccgtacg cccccccgcg 1620
agacttcgcg gcctaccgca gcagggtaaa atttagcagg tctgcagatg cgcctgcgta 1680
tcaacagggt cagaatcagc tctataatga gctgaacctc gggcggcggg aagagtatga 1740
tgttctcgat aaaaggagag gacgagaccc cgaaatgggc ggcaaaccga gacgcaaaaa 1800
tcctcaggag gggctctaca atgaacttca aaaagacaaa atggccgaag catactcaga 1860
aatcggaatg aaaggggaga ggagacgcgg gaagggccat gatggactgt atcagggact 1920
ttccacggcc accaaggaca cctatgacgc tctccacatg caggcgctgc cgcctagatg 1980
ataaaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2040
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2100
aactcatcaa tgtatctta 2119
<210> 3
<211> 195
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Jet promoter
<400> 3
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180
gatcgtcagt tgaca 195
<210> 4
<211> 3429
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-CD38A2 CAR cassette with homology arms
<400> 4
ggcaccatat tcattttgca ggtgaaattc ctgagatgta aggagctgct gtgacttgct 60
caaggcctta tatcgagtaa acggtagtgc tggggcttag acgcaggtgt tctgatttat 120
agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta atgtgataga tttcccaact 180
taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc cagcctaagt tggggagacc 240
actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg cctgccttta 300
ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa aagaataagc 360
agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag gcctggccgt 420
gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 480
tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 540
cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 600
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 660
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 720
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 780
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 840
gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 900
ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 960
ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggaatg 1020
gtcatgggtc tttctctttt ttctcagcgt gaccaccgga gtccactccc aggtagagca 1080
gaaattgatc tctgaggaag acctgcaggt ccagttggtc gaaagtggcg gcggattggt 1140
gaaaccaggc ggatctttga ggcttagttg cgcggcttcc ggatttacgt tcagtgatga 1200
ctacatgagc tggataaggc aagcacctgg taagggcctg gaatgggtcg caagtgtgtc 1260
taatggaagg cccactacct actatgctga ttccgtccgc ggacgcttta ctatttcaag 1320
agataatgct aagaatagtc tgtacctgca gatgaacagt ctgcgcgcgg aagataccgc 1380
agtatattac tgtgcacgag aggattgggg tggggagttc acggattggg gcaggggaac 1440
tcttgtaacg gtgtctagcg gaggaggtgg gtcaggtgga ggtggcagtg gaggtggagg 1500
ctctcaggcc ggcttgaccc aaccgccatc tgcgtcagga acatcaggcc agagggtgac 1560
tatcagttgt tctggcagtt catccaatat tgggatcaat ttcgtgtact ggtatcagca 1620
cctgccaggt accgcgccga agctgctgat ctataagaat aatcaacgcc catcaggcgt 1680
tccagatagg ttcagtggga gcaagtccgg aaactccgcg tcactcgcga tctcaggtct 1740
gcggtctgag gatgaagctg attattactg cgcggcgtgg gatgattctc tgtcaggcta 1800
cgtattcggt tcagggacta aggtaactgt gttggcgaaa ccgaccacga caccggctcc 1860
aagacctccg acgccagctc caacgatagc gtcacagcca ttgtctctcc gccctgaagc 1920
ctgccggccc gctgcgggcg gcgcggttca tacccgggga ttggactttg cccccagaaa 1980
gatagaggtg atgtaccctc ccccctactt ggacaacgaa aagtctaatg gcactatcat 2040
tcacgtaaag ggcaaacacc tttgtccaag tcctttgttc ccaggcccat ctaagccgtt 2100
ctgggtactc gtggttgtgg ggggcgtgct cgcttgttac tcactgctgg tgacggtggc 2160
ctttattatt ttctgggttc gatctaagcg aagccgcttg ttgcattctg actacatgaa 2220
tatgacgcca agacggccag ggccaacaag aaagcattac caaccgtacg cccccccgcg 2280
agacttcgcg gcctaccgca gcagggtaaa atttagcagg tctgcagatg cgcctgcgta 2340
tcaacagggt cagaatcagc tctataatga gctgaacctc gggcggcggg aagagtatga 2400
tgttctcgat aaaaggagag gacgagaccc cgaaatgggc ggcaaaccga gacgcaaaaa 2460
tcctcaggag gggctctaca atgaacttca aaaagacaaa atggccgaag catactcaga 2520
aatcggaatg aaaggggaga ggagacgcgg gaagggccat gatggactgt atcagggact 2580
ttccacggcc accaaggaca cctatgacgc tctccacatg caggcgctgc cgcctagatg 2640
ataaaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2700
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2760
aactcatcaa tgtatcttag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga 2820
ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt 2880
gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc 2940
tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc 3000
aaacgccttc aacaacagca ttattccaga ggacaccttc ttccccagcc caggtaaggg 3060
cagctttggt gccttcgcag gctgtttcct tgcttcagga atggccaggt tctgcccaga 3120
gctctggtca atgatgtcta aaactcctct gattggtggt ctcggcctta tccattgcca 3180
ccaaaaccct ctttttacta agaaacagtg agccttgttc tggcagtcca gagaatgaca 3240
cgggaaaaaa gcagatgaag agaaggtggc aggagagggc acgtggccca gcctcagtct 3300
ctccaactga gttcctgcct gcctgccttt gctcagactg tttgcccctt actgctcttc 3360
taggcctcat tctaagcccc ttctccaagt tgcctctcct tatttctccc tgtctgccaa 3420
aaaatcttt 3429
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: primer for sequencing clones with anti-CD38 CAR-TRAC
homology arms insert in pAAV-MCS vector
<400> 5
cttaggctgg gcattagcag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: primer for sequencing clones with anti-CD38 CAR-TRAC
homology arms insert in pAAV-MCS vector
<400> 6
catggaatgg tcatgggtct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: primer for sequencing clones with anti-CD38 CAR-TRAC
homology arms insert in pAAV-MCS vector
<400> 7
ggctacgtat tcggttcagg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer for generating donor DNA PCR fragment
from pAAV anti-CD38 CAR-TRAC construct (660 & 650 HAs)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> 2'-O-methylated deoxyguanosine
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(4)
<223> 2'-O-methylated deoxyadenosine
<400> 8
tggagctagg gcaccatatt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Reverse primer for generating donor DNA PCR fragment
from pAAV anti-CD38 CAR-TRAC construct (660 & 650 HAs), the
5-most nucleoside (C) has a 5 phosphate
<400> 9
caacttggag aaggggctta 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: PCR forward primer with homology to TRAC locus for
verifying site-specific insertion of anti-CD38 CAR (upstream
junction)
<400> 10
ctgctttctg agggtgaag 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: PCR reverse primer with homology to CAR construct for
verifying site-specific insertion of anti-CD38 CAR (upstream
junction)
<400> 11
ctttcgacca actggacctg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: PCR forward primer with homology to CAR locus for
verifying site-specific insertion of anti-CD38 CAR (downstream
junction)
<400> 12
cgttctgggt actcgtggtt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: PCR reverse primer with homology to TRAC locus
(downstream junction)
<400> 13
gagagccctt ccctgacttt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer for generating donor fragment with 300
nt HAs
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(2)
<223> 2-O-methylated deoxycytosine
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-methylated deoxyadenosine
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(5)
<223> 2'-O-methylated deoxyguanosine
<400> 14
ccatgcctgc ctttactctg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Reverse primer for generating donor fragment with 300
nt HAs, the 5-most nucleoside (T) has a 5 phosphate
<400> 15
tcctgaagca aggaaacagc 20
<210> 16
<211> 375
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(375)
<223> 5 homology arm, exon 1 TRAC gene
<400> 16
ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat attgctgggg ttttgaagaa gatcctatta 60
aataaaagaa taagcagtat tattaagtag ccctgcattt caggtttcct tgagtggcag 120
gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt 180
gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg 240
tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg 300
catctggact ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctga 360
tcctcttgtc ccaca 375
<210> 17
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(321)
<223> 3 homology arm, exon 1 TRAC gene
<400> 17
gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 60
tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 120
gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 180
agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc 240
attattccag aggacacctt cttccccagc ccaggtaagg gcagctttgg tgccttcgca 300
ggctgtttcc ttgcttcagg a 321
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer for generating donor fragment with 150
nt HAs
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(3)
<223> 2-O-methylated deoxycytosine
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(5)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(4)
<223> 2'-O-methylated deoxyadenosine
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(5)
<223> 2-O-methylated deoxycytosine
<400> 18
atcacgagca gctggtttct 20
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Reverse primer for generating donor fragment with 150
nt HAs, the 5-most nucleoside (G) has a 5 phosphate
<400> 19
gacctcatgt ctagcacagt tttg 24
<210> 20
<211> 171
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(171)
<223> 5 171 nt homology arm, exon 1 TRAC gene
<400> 20
atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60
ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120
ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac a 171
<210> 21
<211> 161
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(161)
<223> 3 161 nt homology arm, exon 1 TRAC gene
<400> 21
gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 60
tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 120
gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt c 161
<210> 22
<211> 2080
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-CD19 CAR cassette including JeT promoter, intron,
anti-CD19 CAR, SV40 sequence
<400> 22
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180
gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 240
ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 300
ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggaatg 360
gtcatgggtc tttctctttt ttctcagcgt gaccaccgga gtccactccg atatccagat 420
gacacagacc accagcagcc tgagcgccag cctgggcgac cgagtgacta tcagctgccg 480
ggcatcccag gatatttcta agtatctgaa ctggtaccag cagaagcccg acggcactgt 540
caaactgctg atctaccaca ccagtagact gcattcaggg gtgcctagca ggttctccgg 600
atctggcagt gggactgact actccctgac catctctaac ctggagcagg aagatattgc 660
cacctatttc tgccagcagg gcaatacact gccttacact tttggcgggg gaacaaagct 720
ggagatcact ggcggaggag gatctggagg aggaggaagt ggaggaggag gatcagaggt 780
gaaactgcag gaaagcggac caggactggt cgcaccttca cagagcctgt ccgtgacatg 840
tactgtctcc ggagtgtctc tgcccgatta cggcgtctct tggatccggc agccccctag 900
aaagggactg gagtggctgg gcgtgatctg gggaagtgaa actacctact ataatagtgc 960
tctgaaatca agactgacca tcattaagga caactctaaa agtcaggtgt ttctgaagat 1020
gaattccctg cagaccgacg atacagcaat ctactattgc gccaaacact actattacgg 1080
cgggagctat gccatggatt actgggggca gggaacttcc gtcaccgtga gcagcgctaa 1140
gccgaccacg acaccggctc caagacctcc gacgccagct ccaacgatag cgtcacagcc 1200
attgtctctc cgccctgaag cctgccggcc cgctgcgggc ggcgcggttc atacccgggg 1260
attggacttt gcccccagaa agatagaggt gatgtaccct cccccctact tggacaacga 1320
aaagtctaat ggcactatca ttcacgtaaa gggcaaacac ctttgtccaa gtcctttgtt 1380
cccaggccca tctaagccgt tctgggtact cgtggttgtg gggggcgtgc tcgcttgtta 1440
ctcactgctg gtgacggtgg cctttattat tttctgggtt cgatctaagc gaagccgctt 1500
gttgcattct gactacatga atatgacgcc aagacggcca gggccaacaa gaaagcatta 1560
ccaaccgtac gcccccccgc gagacttcgc ggcctaccgc agcagggtaa aatttagcag 1620
gtctgcagat gcgcctgcgt atcaacaggg tcagaatcag ctctataatg agctgaacct 1680
cgggcggcgg gaagagtatg atgttctcga taaaaggaga ggacgagacc ccgaaatggg 1740
cggcaaaccg agacgcaaaa atcctcagga ggggctctac aatgaacttc aaaaagacaa 1800
aatggccgaa gcatactcag aaatcggaat gaaaggggag aggagacgcg ggaagggcca 1860
tgatggactg tatcagggac tttccacagc caccaaggac acctatgacg ctctccacat 1920
gcaggcgctg ccgcctagat gataaaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 1980
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 2040
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 2080
<210> 23
<211> 2083
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-BCMA CAR construct including JeT promoter,
intron, anti-BCMA CAR construct, SV40 sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1057)..(1057)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1098)..(1098)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1120)..(1120)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 23
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180
gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 240
ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 300
ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggagtg 360
gtcctgggtg ttcctgttct ttctgtccgt gaccaccggt gtccactctc aggtgcagct 420
ggtggagtct gggggaggct tggtaaagcc tggggggtcc cttagactct cctgtgcagc 480
ctctggattc acttccagta ccgcctggat gagctgggtc cgccaggctc cagggaaggg 540
gctggagtgg gttggccgta ttaaaagcaa aagtgatggt gggacaacag actacgctgc 600
acccgtgaaa ggcagattca ccatctcaag agatgattca aaaaacacgc tgtttctgca 660
aatgaacagc ctgaaaaccg aggacacagc cgtgtattac tgtgccaagg gaggcgggac 720
ctacggctac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tccggcggcg gcggcagcgg 780
tggcggtggc tcaggtggtg gtggttcttc ctatgtgctg actcagcctg cctccgtgtc 840
tgggtctcct ggacagtcag tcaccatctc ctgcactgga accagcagtg atggtggtgg 900
tcacacctat gtctcctggt accaacagca cccaggcaaa gcccccaaac tcatgattta 960
tgatgtcagt aatcggccct catgggtttc taatcgcttc tctggctcca agtctggcaa 1020
cacggcctcc ctgaccatct ctgggctcca ggctgangac gaggctgatt attactgcgg 1080
ctcatataca agcagcgnct cttatgtctt cggaactggn accaagctga ccgtcctggc 1140
taagcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca 1200
gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag 1260
ggggctggac ttcgccccta ggaaaattga agttatgtat cctcctcctt acctagacaa 1320
tgagaagagc aatggaacca ttatccatgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccct 1380
atttcccgga ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg 1440
ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag 1500
gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca 1560
ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccagag tgaagttcag 1620
caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa 1680
tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat 1740
ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga 1800
taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg 1860
gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca 1920
catgcaggcc ctgccgccta gatgataaaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 1980
ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 2040
tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc tta 2083
<210> 24
<211> 183
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(183)
<223> 5 homology arm, TRAC gene exon 3, 183 nt
<400> 24
tatgcacaga agctgcaagg gacaggaggt gcaggagctg caggcctccc ccacccagcc 60
tgctctgcct tggggaaaac cgtgggtgtg tcctgcaggc catgcaggcc tgggacatgc 120
aagcccataa ccgctgtggc ctcttggttt tacagatacg aacctaaact ttcaaaacct 180
gtc 183
<210> 25
<211> 140
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(140)
<223> 3 homology arm, TRAC gene exon 3
<400> 25
agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg tttaatctgc tcatgacgct 60
gcggctgtgg tccagctgag gtgaggggcc ttgaagctgg gagtggggtt tagggacgcg 120
ggtctctggg tgcatcctaa 140
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> Exon 3 target sequence (guide sequence)
<400> 26
ttcggaaccc aatcactgac 20
<210> 27
<211> 2442
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Entire donor DNA anti-CD38 CAR plus exon 3 HAs on both
ends
<400> 27
tatgcacaga agctgcaagg gacaggaggt gcaggagctg caggcctccc ccacccagcc 60
tgctctgcct tggggaaaac cgtgggtgtg tcctgcaggc catgcaggcc tgggacatgc 120
aagcccataa ccgctgtggc ctcttggttt tacagatacg aacctaaact ttcaaaacct 180
gtcgaattcg ggcggagtta gggcggagcc aatcagcgtg cgccgttccg aaagttgcct 240
tttatggctg ggcggagaat gggcggtgaa cgccgatgat tatataagga cgcgccgggt 300
gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc ggttcttgtt tgtggatccc 360
tgtgatcgtc acttgacagt aagtcactga ctgtctatgc ctgggaaagg gtgggcagga 420
gatggggcag tgcaggaaaa gtggcactat gaaccctgca gccctaggaa tgcatctaga 480
caattgtact aaccttcttc tctttcctct cctgacaggc ctcgaggccg ccaccatgga 540
atggtcatgg gtctttctct tttttctcag cgtgaccacc ggagtccact cccaggtaga 600
gcagaaattg atctctgagg aagacctgca ggtccagttg gtcgaaagtg gcggcggatt 660
ggtgaaacca ggcggatctt tgaggcttag ttgcgcggct tccggattta cgttcagtga 720
tgactacatg agctggataa ggcaagcacc tggtaagggc ctggaatggg tcgcaagtgt 780
gtctaatgga aggcccacta cctactatgc tgattccgtc cgcggacgct ttactatttc 840
aagagataat gctaagaata gtctgtacct gcagatgaac agtctgcgcg cggaagatac 900
cgcagtatat tactgtgcac gagaggattg gggtggggag ttcacggatt ggggcagggg 960
aactcttgta acggtgtcta gcggaggagg tgggtcaggt ggaggtggca gtggaggtgg 1020
aggctctcag gccggcttga cccaaccgcc atctgcgtca ggaacatcag gccagagggt 1080
gactatcagt tgttctggca gttcatccaa tattgggatc aatttcgtgt actggtatca 1140
gcacctgcca ggtaccgcgc cgaagctgct gatctataag aataatcaac gcccatcagg 1200
cgttccagat aggttcagtg ggagcaagtc cggaaactcc gcgtcactcg cgatctcagg 1260
tctgcggtct gaggatgaag ctgattatta ctgcgcggcg tgggatgatt ctctgtcagg 1320
ctacgtattc ggttcaggga ctaaggtaac tgtgttggcg aaaccgacca cgacaccggc 1380
tccaagacct ccgacgccag ctccaacgat agcgtcacag ccattgtctc tccgccctga 1440
agcctgccgg cccgctgcgg gcggcgcggt tcatacccgg ggattggact ttgcccccag 1500
aaagatagag gtgatgtacc ctccccccta cttggacaac gaaaagtcta atggcactat 1560
cattcacgta aagggcaaac acctttgtcc aagtcctttg ttcccaggcc catctaagcc 1620
gttctgggta ctcgtggttg tggggggcgt gctcgcttgt tactcactgc tggtgacggt 1680
ggcctttatt attttctggg ttcgatctaa gcgaagccgc ttgttgcatt ctgactacat 1740
gaatatgacg ccaagacggc cagggccaac aagaaagcat taccaaccgt acgccccccc 1800
gcgagacttc gcggcctacc gcagcagggt aaaatttagc aggtctgcag atgcgcctgc 1860
gtatcaacag ggtcagaatc agctctataa tgagctgaac ctcgggcggc gggaagagta 1920
tgatgttctc gataaaagga gaggacgaga ccccgaaatg ggcggcaaac cgagacgcaa 1980
aaatcctcag gaggggctct acaatgaact tcaaaaagac aaaatggccg aagcatactc 2040
agaaatcgga atgaaagggg agaggagacg cgggaagggc catgatggac tgtatcaggg 2100
actttccacg gccaccaagg acacctatga cgctctccac atgcaggcgc tgccgcctag 2160
atgataaaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 2220
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 2280
ccaaactcat caatgtatct taagtgattg ggttccgaat cctcctcctg aaagtggccg 2340
ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg aggtgagggg ccttgaagct 2400
gggagtgggg tttagggacg cgggtctctg ggtgcatcct aa 2442
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer for generating donor fragment of SEQ ID
NO:27
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(2)
<223> 2'-O-methylated deoxyadenosine
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(4)
<223> 2'-O-methylated deoxyguanosine
<220>
<221> modified_base
<222> (5)..(5)
<223> 2-O-methylated deoxycytosine
<400> 28
tatgccacag aagctgcaag g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Reverse primer for generating donor fragment of SEQ ID
NO: 27
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5-most nucleoside (T) has a 5 phosphate
<400> 29
ttaggatgca cccagagacc 20
<210> 30
<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(326)
<223> PD-1 locus 5 HA
<400> 30
ctccccatct cctctgtctc cctgtctctg tctctctctc cctcccccac cctctcccca 60
gtcctacccc ctcctcaccc ctcctccccc agcactgcct ctgtcactct cgcccacgtg 120
gatgtggagg aagagggggc gggagcaagg ggcgggcacc ctcccttcaa cctgacctgg 180
gacagtttcc cttccgctca cctccgcctg agcagtggag aaggcggcac tctggtgggg 240
ctgctccagg catgcagatc ccacaggcgc cctggccagt cgtctgggcg gtgctacaac 300
tgggctggcg gccaggatgg ttctta 326
<210> 31
<211> 380
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(380)
<223> PD-1 locus 3 HA
<400> 31
ggtaggtggg gtcggcggtc aggtgtccca gagccagggg tctggaggga ccttccaccc 60
tcagtccctg gcaggtcggg gggtgctgag gcgggcctgg ccctggcagc ccaggggtcc 120
cggagcgagg ggtctggagg gacctttcac tctcagtccc tggcaggtcg gggggtgctg 180
tggcaggccc agccttggcc cccagctctg ccccttaccc tgagctgtgt ggctttgggc 240
agctcgaact cctgggttcc tctctgggcc ccaactcctc ccctggccca agtcccctct 300
ttgctcctgg gcaggcagga cctctgtccc ctctcagccg gtccttgggg ctgcgtgttt 360
ctgtagaatg acgggtcagg 380
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> PD-1 target site
<400> 32
ggccaggatg gttcttaggt 20
<210> 33
<211> 2825
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Donor DNA fragment having CD38 cassette (SEQ ID NO:2)
flanked by PD-1 HAs
<400> 33
ctccccatct cctctgtctc cctgtctctg tctctctctc cctcccccac cctctcccca 60
gtcctacccc ctcctcaccc ctcctccccc agcactgcct ctgtcactct cgcccacgtg 120
gatgtggagg aagagggggc gggagcaagg ggcgggcacc ctcccttcaa cctgacctgg 180
gacagtttcc cttccgctca cctccgcctg agcagtggag aaggcggcac tctggtgggg 240
ctgctccagg catgcagatc ccacaggcgc cctggccagt cgtctgggcg gtgctacaac 300
tgggctggcg gccaggatgg ttcttagaat tcgggcggag ttagggcgga gccaatcagc 360
gtgcgccgtt ccgaaagttg ccttttatgg ctgggcggag aatgggcggt gaacgccgat 420
gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt 480
cgcggttctt gtttgtggat ccctgtgatc gtcacttgac agtaagtcac tgactgtcta 540
tgcctgggaa agggtgggca ggagatgggg cagtgcagga aaagtggcac tatgaaccct 600
gcagccctag gaatgcatct agacaattgt actaaccttc ttctctttcc tctcctgaca 660
ggcctcgagg ccgccaccat ggaatggtca tgggtctttc tcttttttct cagcgtgacc 720
accggagtcc actcccaggt agagcagaaa ttgatctctg aggaagacct gcaggtccag 780
ttggtcgaaa gtggcggcgg attggtgaaa ccaggcggat ctttgaggct tagttgcgcg 840
gcttccggat ttacgttcag tgatgactac atgagctgga taaggcaagc acctggtaag 900
ggcctggaat gggtcgcaag tgtgtctaat ggaaggccca ctacctacta tgctgattcc 960
gtccgcggac gctttactat ttcaagagat aatgctaaga atagtctgta cctgcagatg 1020
aacagtctgc gcgcggaaga taccgcagta tattactgtg cacgagagga ttggggtggg 1080
gagttcacgg attggggcag gggaactctt gtaacggtgt ctagcggagg aggtgggtca 1140
ggtggaggtg gcagtggagg tggaggctct caggccggct tgacccaacc gccatctgcg 1200
tcaggaacat caggccagag ggtgactatc agttgttctg gcagttcatc caatattggg 1260
atcaatttcg tgtactggta tcagcacctg ccaggtaccg cgccgaagct gctgatctat 1320
aagaataatc aacgcccatc aggcgttcca gataggttca gtgggagcaa gtccggaaac 1380
tccgcgtcac tcgcgatctc aggtctgcgg tctgaggatg aagctgatta ttactgcgcg 1440
gcgtgggatg attctctgtc aggctacgta ttcggttcag ggactaaggt aactgtgttg 1500
gcgaaaccga ccacgacacc ggctccaaga cctccgacgc cagctccaac gatagcgtca 1560
cagccattgt ctctccgccc tgaagcctgc cggcccgctg cgggcggcgc ggttcatacc 1620
cggggattgg actttgcccc cagaaagata gaggtgatgt accctccccc ctacttggac 1680
aacgaaaagt ctaatggcac tatcattcac gtaaagggca aacacctttg tccaagtcct 1740
ttgttcccag gcccatctaa gccgttctgg gtactcgtgg ttgtgggggg cgtgctcgct 1800
tgttactcac tgctggtgac ggtggccttt attattttct gggttcgatc taagcgaagc 1860
cgcttgttgc attctgacta catgaatatg acgccaagac ggccagggcc aacaagaaag 1920
cattaccaac cgtacgcccc cccgcgagac ttcgcggcct accgcagcag ggtaaaattt 1980
agcaggtctg cagatgcgcc tgcgtatcaa cagggtcaga atcagctcta taatgagctg 2040
aacctcgggc ggcgggaaga gtatgatgtt ctcgataaaa ggagaggacg agaccccgaa 2100
atgggcggca aaccgagacg caaaaatcct caggaggggc tctacaatga acttcaaaaa 2160
gacaaaatgg ccgaagcata ctcagaaatc ggaatgaaag gggagaggag acgcgggaag 2220
ggccatgatg gactgtatca gggactttcc acggccacca aggacaccta tgacgctctc 2280
cacatgcagg cgctgccgcc tagatgataa aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc 2340
ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 2400
actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttaggtag gtggggtcgg 2460
cggtcaggtg tcccagagcc aggggtctgg agggaccttc caccctcagt ccctggcagg 2520
tcggggggtg ctgaggcggg cctggccctg gcagcccagg ggtcccggag cgaggggtct 2580
ggagggacct ttcactctca gtccctggca ggtcgggggg tgctgtggca ggcccagcct 2640
tggcccccag ctctgcccct taccctgagc tgtgtggctt tgggcagctc gaactcctgg 2700
gttcctctct gggccccaac tcctcccctg gcccaagtcc cctctttgct cctgggcagg 2760
caggacctct gtcccctctc agccggtcct tggggctgcg tgtttctgta gaatgacggg 2820
tcagg 2825
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer for generating donor fragment of SEQ ID
NO:33
<220>
<221> misc_feature
<223> 5-most nucleoside (C) has a 5 phosphate
<400> 34
ctccccatct cctctgtctc 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Reverse primer for generating donor fragment of SEQ ID
NO:33
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 2-O-methylated deoxycytosine
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(2)
<223> 2-O-methylated deoxycytosine
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (4)..(4)
<223> 2'-O-methylated deoxyguanosine
<400> 35
cctggacccg tcattctaca g 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> Forward primer for generating donor DNA PCR fragment from pAAV
anti-CD38 CAR-TRAC construct (660 & 650 HAs)
<400> 36
tggagctagg gcaccatatt 20
<210> 37
<211> 2415
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-BCMA CAR construct donor fragment sequence,
including JeT promoter, intron, anti-BCMA CAR construct, SV40
sequence, with 5 and 3 TRAC gene exon 1 homology arms
<220>
<221> misc_feature
<222> (1228)..(1228)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1269)..(1269)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1291)..(1291)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 37
atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60
ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120
ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agaattcggg 180
cggagttagg gcggagccaa tcagcgtgcg ccgttccgaa agttgccttt tatggctggg 240
cggagaatgg gcggtgaacg ccgatgatta tataaggacg cgccgggtgt ggcacagcta 300
gttccgtcgc agccgggatt tgggtcgcgg ttcttgtttg tggatccctg tgatcgtcac 360
ttgacagtaa gtcactgact gtctatgcct gggaaagggt gggcaggaga tggggcagtg 420
caggaaaagt ggcactatga accctgcagc cctaggaatg catctagaca attgtactaa 480
ccttcttctc tttcctctcc tgacaggcct cgaggccgcc accatggagt ggtcctgggt 540
gttcctgttc tttctgtccg tgaccaccgg tgtccactct caggtgcagc tggtggagtc 600
tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc tcctgtgcag cctctggatt 660
cacttccagt accgcctgga tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg 720
ggttggccgt attaaaagca aaagtgatgg tgggacaaca gactacgctg cacccgtgaa 780
aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg ctgtttctgc aaatgaacag 840
cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtgccaag ggaggcggga cctacggcta 900
ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctccggcggc ggcggcagcg gtggcggtgg 960
ctcaggtggt ggtggttctt cctatgtgct gactcagcct gcctccgtgt ctgggtctcc 1020
tggacagtca gtcaccatct cctgcactgg aaccagcagt gatggtggtg gtcacaccta 1080
tgtctcctgg taccaacagc acccaggcaa agcccccaaa ctcatgattt atgatgtcag 1140
taatcggccc tcatgggttt ctaatcgctt ctctggctcc aagtctggca acacggcctc 1200
cctgaccatc tctgggctcc aggctganga cgaggctgat tattactgcg gctcatatac 1260
aagcagcgnc tcttatgtct tcggaactgg naccaagctg accgtcctgg ctaagcccac 1320
cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc 1380
cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga 1440
cttcgcccct aggaaaattg aagttatgta tcctcctcct tacctagaca atgagaagag 1500
caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg 1560
accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt 1620
gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca 1680
cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc 1740
ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc 1800
agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg 1860
aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa 1920
gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc 1980
ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg 2040
cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc 2100
cctgccgcct agatgataaa attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 2160
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 2220
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttagatatc cagaaccctg accctgccgt 2280
gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc tgcctattca ccgattttga 2340
ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg tatatcacag acaaaactgt 2400
gctagacatg aggtc 2415
<210> 38
<211> 2217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-CD19 CAR cassette including JeT promoter, intron,
anti-CD19 CAR, SV40 sequence flanked by 5 and 3 TRAC gene exon 1
homology arms of SEQ ID NO:20 and SEQ ID NO:21
<400> 38
atcacgagca gctggtttct aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg 60
ccagccccac agagccccgc ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg 120
ggcaaagagg gaaatgagat catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agtaagtcac 180
tgactgtcta tgcctgggaa agggtgggca ggagatgggg cagtgcagga aaagtggcac 240
tatgaaccct gcagccctag gaatgcatct agacaattgt actaaccttc ttctctttcc 300
tctcctgaca ggcctcgagg ccgccaccat ggaatggtca tgggtctttc tcttttttct 360
cagcgtgacc accggagtcc actccgatat ccagatgaca cagaccacca gcagcctgag 420
cgccagcctg ggcgaccgag tgactatcag ctgccgggca tcccaggata tttctaagta 480
tctgaactgg taccagcaga agcccgacgg cactgtcaaa ctgctgatct accacaccag 540
tagactgcat tcaggggtgc ctagcaggtt ctccggatct ggcagtggga ctgactactc 600
cctgaccatc tctaacctgg agcaggaaga tattgccacc tatttctgcc agcagggcaa 660
tacactgcct tacacttttg gcgggggaac aaagctggag atcactggcg gaggaggatc 720
tggaggagga ggaagtggag gaggaggatc agaggtgaaa ctgcaggaaa gcggaccagg 780
actggtcgca ccttcacaga gcctgtccgt gacatgtact gtctccggag tgtctctgcc 840
cgattacggc gtctcttgga tccggcagcc ccctagaaag ggactggagt ggctgggcgt 900
gatctgggga agtgaaacta cctactataa tagtgctctg aaatcaagac tgaccatcat 960
taaggacaac tctaaaagtc aggtgtttct gaagatgaat tccctgcaga ccgacgatac 1020
agcaatctac tattgcgcca aacactacta ttacggcggg agctatgcca tggattactg 1080
ggggcaggga acttccgtca ccgtgagcag cgctaagccg accacgacac cggctccaag 1140
acctccgacg ccagctccaa cgatagcgtc acagccattg tctctccgcc ctgaagcctg 1200
ccggcccgct gcgggcggcg cggttcatac ccggggattg gactttgccc ccagaaagat 1260
agaggtgatg taccctcccc cctacttgga caacgaaaag tctaatggca ctatcattca 1320
cgtaaagggc aaacaccttt gtccaagtcc tttgttccca ggcccatcta agccgttctg 1380
ggtactcgtg gttgtggggg gcgtgctcgc ttgttactca ctgctggtga cggtggcctt 1440
tattattttc tgggttcgat ctaagcgaag ccgcttgttg cattctgact acatgaatat 1500
gacgccaaga cggccagggc caacaagaaa gcattaccaa ccgtacgccc ccccgcgaga 1560
cttcgcggcc taccgcagca gggtaaaatt tagcaggtct gcagatgcgc ctgcgtatca 1620
acagggtcag aatcagctct ataatgagct gaacctcggg cggcgggaag agtatgatgt 1680
tctcgataaa aggagaggac gagaccccga aatgggcggc aaaccgagac gcaaaaatcc 1740
tcaggagggg ctctacaatg aacttcaaaa agacaaaatg gccgaagcat actcagaaat 1800
cggaatgaaa ggggagagga gacgcgggaa gggccatgat ggactgtatc agggactttc 1860
cacagccacc aaggacacct atgacgctct ccacatgcag gcgctgccgc ctagatgata 1920
aaattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 1980
tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 2040
tcatcaatgt atcttagata tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc 2100
taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt gattctcaaa caaatgtgtc 2160
acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact gtgctagaca tgaggtc 2217
<210> 39
<211> 1001
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequenced PCR product of 5 end of donor DNA plus
adjacent TRAC gene exon 1 genomic sequence that included portion
of anti-CD38 CAR construct and 660 nt homology arm
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (790)..(792)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (925)..(925)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (931)..(931)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (933)..(934)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1001)..(1001)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 39
nnnnnnnnnn nnnnngcnng actcactagc actctatcac ggccatattc tggcagggtc 60
agtggctcca actaacattt gtttggtact ttacagttta ttaaatagat gtttatatgg 120
agaagctctc atttctttct cagaagagcc tggctaggaa ggtggatgag gcaccatatt 180
cattttgcag gtgaaattcc tgagatgtaa ggagctgctg tgacttgctc aaggccttat 240
atcgagtaaa cggtagcgct ggggcttaga cgcaggtgtt ctgatttata gttcaaaacc 300
tctatcaatg agagagcaat ctcctggtaa tgtgatagat ttcccaactt aatgccaaca 360
taccataaac ctcccattct gctaatgccc agcctaagtt ggggagacca ctccagattc 420
caagatgtac agtttgcttt gctgggcctt tttcccatgc ctgcctttac tctgccagag 480
ttatattgct ggggttttga agaagatcct attaaataaa agaataagca gtattattaa 540
gtagccctgc atttcaggtt tccttgagtg gcaggccagg cctggccgtg aacgttcact 600
gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata gcttgtgcct gtccctgagt cccagtccat 660
cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt cccgtataaa gcatgagacc gtgacttgcc 720
agccccacag agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg gactccagcc tgggttgggg 780
caaagagggn nngagatcat gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga attcgggcgg 840
agttagggcg gagccaatca gcgtgcgccg ttccgaaagt tgccttttat ggctgggcgg 900
agaatgggcg gtgaacgccg atgantatat nannacgcgc cgggtgtggc acagctagtt 960
ccgtcgcagc cgggatttgg gtcgcggttc ttgtttgtgg n 1001
<210> 40
<211> 1015
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequenced PCR product of 3 end of donor DNA plus
adjacent TRAC gene exon 1 genomic sequence that included portion
of anti-CD38 CAR construct and 650 nt homology arm
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (988)..(988)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 40
nnnnnnnnnn nnnnnnttct gctctacctg ggagtggact ccggtggtca cgctgagaaa 60
aaagagaaag acccatgacc attccatggt ggcggcctcg aggcctgtca ggagaggaaa 120
gagaagaagg ttagtacaat tgtctagatg cattcctagg gctgcagggt tcatagtgcc 180
acttttcctg cactgcccca tctcctgccc accctttccc aggcatagac agtcagtgac 240
ttactgtcaa gtgacgatca cagggatcca caaacaagaa ccgcgaccca aatcccggct 300
gcgacggaac tagctgtgcc acacccggcg cgtccttata taatcatcgg cgttcaccgc 360
ccattctccg cccagccata aaaggcaact ttcggaacgg cgcacgctga ttggctccgc 420
cctaactccg cccgaattct gtgggacaag aggatcaggg ttaggacatg atctcatttc 480
cctctttgcc ccaacccagg ctggagtcca gatgccagtg atggacaagg gcggggctct 540
gtggggctgg caagtcacgg tctcatgctt tatacgggaa atagcatctt agaaaccagc 600
tgctcgtgat ggactgggac tcagggacag gcacaagcta tcaatcttgg ccaagaggcc 660
atgatttcag tgaacgttca cggccaggcc tggcctgcca ctcaaggaaa cctgaaatgc 720
agggctactt aataatactg cttattcttt tatttaatag gatcttcttc aaaaccccag 780
caatataact ctggcagagt aaaggcaggc atgggaaaaa ggcccagcaa agcaaactgt 840
acatcttgga atctggagtg gtctccccaa cttaggctgg gcattagcag aatgggaggt 900
ttatggtatg ttggcattaa gttgggaaat ctatcacatt accaggagat tgctctctca 960
ttgatagagg ttttgaacta taaatcanaa cacctgcgtc taagccccag cgcta 1015
<210> 41
<211> 1035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequenced PCR product of 5 end of donor DNA plus
adjacent TRAC gene exon 3 genomic sequence that included portion
of the anti-CD38 CAR construct and 660 nt homology arm; Exon3 5HA
F sequence results
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(21)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1030)..(1030)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1032)..(1035)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nctttgagga ngagtttcta gcttcaatag accaaggact 60
ctctcctagg cctctgtatt cctttcaaca gctccactgt caagagagcc agagagagct 120
tctgggtggc ccagctgtga aatttctgag tcccttaggg atagccctaa acgaaccaga 180
tcatcctgag gacagccaag aggttttgcc ttctttcaag acaagcaaca gtactcacat 240
aggctgtggg caatggtcct gtctctcaag aatcccctgc cactcctcac acccaccctg 300
ggcccatatt catttccatt tgagttgttc ttattgagtc atccttcctg tggtagcgga 360
actcactaag gggcccatct ggacccgagg tattgtgatg ataaattctg agcacctacc 420
ccatccccag aagggctcag aaataaaata agagccaagt ctagtcggtg tttcctgtct 480
tgaaacacaa tactgttggc cctggaagaa tgcacagaat ctgtttgtaa ggggatatgc 540
acagaagctg caagggacag gaggtgcagg agctgcaggc ctcccccacc cagcctgctc 600
tgccttgggg aaaaccgtgg gtgtgtcctg caggccatgc aggcctggga catgcaagcc 660
cataaccgct gtggcctctt ggttttacag atacgaacct aaactttcaa aacctgtcga 720
attcgggcgg agttagggcg gagccaatca gcgtgcgccg ttccgaaagt tgccttttat 780
ggctgggcgg agaatgggcg gtgaacgccg atgattatat aaggacgcgc cgggtgtggc 840
acagctagtt ccgtcgcagc cgggatttgg gtcgcggttc ttgtttgtgg atccctgtga 900
tcgtcacttg acagtaagtc actgactgtc tatgcctggg aaagggtggg caggagatgg 960
ggcagtgcag gaaaagtggc actatgaacc ctgcagccct aggaatgcat ctagacaatt 1020
gtactaaccn tnnnn 1035
<210> 42
<211> 1030
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequenced PCR product of 3 end of donor DNA plus
adjacent genomic TRAC gene exon 3 sequence that included portion
of the anti-CD38 CAR construct and 650 nt homology arm
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (952)..(952)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1007)..(1007)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1030)..(1030)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
nnnnnnnnnn nnnnnnnngc tgcacaggag agtctcaggg accctccagg cttgaccaag 60
cctcccccag actccaccag ctgcacctga gagtggacac cggtggtcac ggacagaaag 120
aacaggaaca cccaggacca ctccatggtg gcggcctcga ggcctgtcag gagaggaaag 180
agaagaaggt tagtacaatt gtctagatgc attcctaggg ctgcagggtt catagtgcca 240
cttttcctgc actgccccat ctcctgccca ccctttccca ggcatagaca gtcagtgact 300
tactgtcaag tgacgatcac agggatccac aaacaagaac cgcgacccaa atcccggctg 360
cgacggaact agctgtgcca cacccggcgc gtccttatat aatcatcggc gttcaccgcc 420
cattctccgc ccagccataa aaggcaactt tcggaacggc gcacgctgat tggctccgcc 480
ctaactccgc ccgaattcga caggttttga aagtttaggt tcgtatctgt aaaaccaaga 540
ggccacagcg gttatgggct tgcatgtccc aggcctgcat ggcctgcagg acacacccac 600
ggttttcccc aaggcagagc aggctgggtg ggggaggcct gcagctcctg cacctcctgt 660
cccttgcagc ttctgtgcat atccccttac aaacagattc tgtgcattct tccagggcca 720
acagtattgt gtttcaagac aggaaacacc gactagactt ggctcttatt ttatttctga 780
gcccttctgg ggatggggta ggtgctcaga atttatcatc acaatacctc gggtccagat 840
gggcccctta gtgagttccg ctaccacagg aaggatgact caataagaac aactcaaatg 900
gaaatgaata tgggcccagg gtgggtgtga ggagtggcag gggattcttg anagacagga 960
ccattgccca cagcctatgt gagtactgtt gcttgtcttg aaagaangca aaacctcttg 1020
gctgtcctcn 1030
<210> 43
<211> 1015
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequenced PCR product of 3 end of donor DNA plus
adjacent PD-1 genomic sequence that included portion of the
anti-CD38 CAR construct and 660 nt homology arm
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (925)..(926)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (930)..(930)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (935)..(936)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (943)..(943)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (947)..(947)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (960)..(961)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (971)..(971)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (974)..(976)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (978)..(978)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (983)..(985)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (990)..(991)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (999)..(999)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1012)..(1013)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1015)..(1015)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 43
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt cntgctggtg anggtggcct ttattatttt ctgggttcga 60
tctaagcgaa gccgcttgtt gcattctgac tacatgaata tgacgccaag acggccaggg 120
ccaacaagaa agcattacca accgtacgcc cccccgcgag actacgcggc ctaccgcagc 180
agggtaaaat ttagcaggtc tgcagatgcg cctgcgtatc aacagggtca gaatcagctc 240
tataatgagc tgaacctcgg gcggcgggaa gagtatgatg ttctcgataa aaggagagga 300
cgagaccccg aaatgggcgg caaaccgaga cgcaaaaatc ctcaggaggg gctctacaat 360
gaacttcaaa aagacaaaat ggccgaagca tactcagaaa tcggaatgaa aggggagagg 420
agacgcggga agggccatga tggactgtat cagggacttt ccacagccac caaggacacc 480
tatgacgctc tccacatgca ggcgctgccg cctagatgat aaaattgttg ttgttaactt 540
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 600
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaggt 660
aggtggggtc ggcggtcagg tgtcccagag ccaggggtct ggagggacct tccaccctca 720
gtccctggca ggtcgggggg tgctgaggcg ggcctggccc tggcagccca ggggtcccgg 780
agcgaggggt ctggagggac ctttcactct cagtccctgg caggtcgggg ggtgctgtgg 840
caggcccagc cttggccccc agctctgccc cttaccctga gctgtgtggc tttgggcagc 900
tcaaactcct gggttcctct ctggnncccn actcnncccc tgncccnagt cccctctttn 960
ntcctgggca ngcnnnanct ctnnnccctn ncagccggnc cttggggctg cnngn 1015
Claims (75)
- 공여자 DNA의 표적 DNA 분자로의 부위-특이적 통합을 위한 방법으로서, 상기 방법이 세포에
RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 분자;
적어도 하나의 가공된 가이드 RNA 또는 가공된 가이드 RNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자; 및
적어도 2개의 핵산 변형을 포함하는 공여자 DNA 분자
를 도입하는 단계를 포함하고;
여기서, 상기 가이드 RNA가 상기 표적 DNA에서 표적 부위와 하이브리드화하도록 디자인된 표적 서열을 포함하고, 상기 공여자 DNA가 상기 표적 부위에서 상기 표적 DNA 분자로 삽입되는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 핵산 변형이 상기 공여자 DNA 분자의 단일 가닥 상에 있는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 상기 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 연결의 변형인, 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 골격 변형인, 방법.
- 제4항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 포스포로티오에이트 변형 또는 포스포르아미디트 변형 또는 이의 조합인, 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 핵염기의 변형 또는 치환인, 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 당의 변형 또는 치환인, 방법.
- 제7항에 있어서, 하나 이상의 핵산 변형이 데옥시리보스의 2’-O-메틸 그룹 변형인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 이중 가닥 DNA 분자인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 상기 적어도 2개의 핵산 변형을 포함하는 변형된 가닥을 갖고, 상기 변형된 가닥의 반대편의 가닥 상에 5’ 말단 포스페이트를 갖는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 상기 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 골격 상에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 변형 및 상기 공여자 DNA 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 1 내지 3개의 2’-O-메틸 뉴클레오타이드 변형을 갖는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 공여자 분자가 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 골격 상에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 변형 및 상기 공여자 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내 1 내지 3개의 2’-O-메틸 뉴클레오타이드 변형을 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 게놈으로의 통합을 위한 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 50 내지 2000개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 100 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 150 내지 650개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 150 내지 350개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 150 내지 200개 뉴클레오타이드 길이인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 변형된 가닥 및 반대편 가닥을 포함하고, 상기 변형된 가닥이 2개 이상의 핵산 변형을 포함하고, 상기 반대편 가닥이 말단 포스페이트를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 crRNA인, 방법.
- 제21항에 있어서, tracrRNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 키메라 가이드 RNA인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas13, Cas14, 또는 CasX인, 방법.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 가이드 RNA가 상기 세포에 도입되는, 방법.
- 제1항에 있어서, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제가 상기 세포에 도입되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA가 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNP)로서 상기 세포에 도입되는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 RNP가 tracr RNA를 추가로 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 RNP가 전기천공 또는 리포좀 전달에 의해 상기 세포에 도입되는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 공여자 DNA 및 상기 RNP가 동시에 또는 별도로 상기 세포에 도입되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 상기 핵산 분자, 상기 적어도 하나의 가공된 가이드 RNA 또는 가공된 가이드 RNA를 암호화하는 상기 적어도 하나의 핵산 분자, 및 상기 공여자 DNA 분자가 상기 세포에 동시에 도입되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 세포가 포유 동물 세포인, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 세포가 사람 세포인, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 세포가 조혈 세포인, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 세포가 T 세포인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 부위가 T 세포 수용체 유전자, PD-1 유전자 또는 TIM3 유전자로부터 선택되는, 방법.
- 표적 DNA 분자에 통합된 공여자 DNA를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포가 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는, 숙주 세포.
- 키메라 항원 수용체(CAR)로 형질감염된 1차 T 세포의 집단으로서, 상기 1차 T 세포 집단이 cas9 뉴클레아제 표적 부위에서 게놈으로 통합된 CAR 작제물을 갖는 T 세포를 포함하고, 여기서,
상기 집단의 T 세포의 적어도 20%가 CAR 작제물을 발현하고;
상기 집단의 T 세포가 재조합 바이러스 벡터 또는 이로부터 유래된 서열을 포함하지 않는, 1차 T 세포의 집단. - 제39항에 있어서, 상기 CAR 작제물이 적어도 1.8 kb인, 1차 T 세포의 집단.
- 제39항에 있어서, 상기 CAR 작제물이 항-CD38 CAR 작제물, 항-CD19 CAR 작제물, 또는 항-BCMA CAR 작제물인, 1차 T 세포의 집단.
- 제39항에 있어서, 상기 집단의 세포의 적어도 40%가 상기 CAR 작제물을 발현하는, 1차 T 세포의 집단.
- 제39항에 있어서, 상기 집단의 세포의 적어도 50%가 상기 CAR 작제물을 발현하는, 1차 T 세포의 집단.
- 제39항에 있어서, 상기 CAR 작제물이 TRAC 유전자좌로 삽입된, 1차 T 세포의 집단.
- 제44항에 있어서, 상기 집단의 세포의 적어도 20%가 상기 T 세포 수용체를 발현하지 않는, 1차 T 세포의 집단.
- 제39항에 있어서, 상기 CAR 작제물이 PD-1 유전자좌로 삽입된, 1차 T 세포의 집단.
- 제46항에 있어서, 상기 집단의 세포의 적어도 20%가 PD-1을 발현하지 않는, 1차 T 세포의 집단.
- 공여자 DNA의 표적 유전자좌로의 표적화된 통합을 위한 시스템으로서, 상기 시스템이
RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 분자;
가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자; 및
이중 가닥의 공여자 DNA 분자를 포함하고, 여기서, 상기 공여자 DNA 분자가 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 하나의 변형된 가닥을 상기 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내에 포함하는, 시스템. - 제48항에 있어서, 상기 시스템이 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 포함하는, 시스템.
- 제48항에 있어서, 상기 시스템이 가이드 RNA를 포함하는, 시스템.
- 제48항에 있어서, 상기 공여자 DNA 분자가 상기 변형된 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 상기 변형된 가닥의 당 모이어티 또는 핵염기의 적어도 하나의 변형을 추가로 포함하는, 시스템.
- 제48항에 있어서, 상기 공여자 DNA가 게놈으로의 통합을 위한 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 갖는, 시스템.
- 제48항에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 분자의 변형된 가닥 상의 상기 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이 상기 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있는, 시스템.
- 제51항에 있어서, 상기 변형된 가닥의 당 모이어티 또는 핵염기의 상기 적어도 하나의 변형이 상기 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있는, 시스템.
- 제51항에 있어서, 당 모이어티의 상기 적어도 하나의 변형이 2’-O 메틸화를 포함하는, 시스템.
- 제52항에 있어서, 상기 관심 대상의 서열이 발현 카세트를 포함하는, 시스템.
- 제52항에 있어서, 상기 발현 카세트가 하나 이상의 항체 또는 수용체 도메인을 포함하는 작제물을 포함하는, 시스템.
- 제52항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 50 내지 5000개 뉴클레오타이드 길이인, 시스템.
- 제58항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 100 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이인, 시스템.
- 제59항에 있어서, 상기 상동성 아암의 적어도 하나가 150 내지 800개 뉴클레오타이드 길이인, 시스템.
- 제48항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 Cas9, Cas12a, Cas12b, CasX, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 시스템.
- 제50항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA 둘다의 서열을 갖는 키메라 가이드인, 시스템.
- 제50항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 crRNA인, 시스템.
- 제50항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 하나 이상의 포스포로티오에이트 (PS) 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 시스템.
- 제50항에 있어서, tracrRNA를 추가로 포함하는, 시스템.
- 제50항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 단일 가이드 RNA인, 시스템.
- 제48항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 상기 가이드 RNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체를 포함하는, 시스템.
- 이중 가닥의 DNA 분자의 단일 가닥 상에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합 및 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 상기 핵산 분자의 변형된 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 갖는 제1 프라이머; 및
5’ 말단 포스페이트를 갖는 제2 프라이머
를 포함하는, 공여자 DNA 분자를 생성하기 위한 조성물. - 제68항에 있어서, 상기 제1 및 제2 프라이머가 표적 게놈에서 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위의 반대편 상의 서열과 상동성인, 조성물.
- 숙주 게놈의 표적 부위로 관심 대상의 서열을 통합하도록 구성된 이중 가닥 공여자 DNA 분자로서, 상기 이중 가닥 공여자 DNA 분자가
하나의 공여자 DNA 가닥의 뉴클레오타이드에 대한 하나 이상의 변형;
상기 표적 부위의 어느 한 측면 상에 숙주 게놈에 존재하는 서열과 상동성인 서열을 포함하는, 관심 대상의 서열을 플랭킹하는 상동성 아암; 및
상기 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단의 10개 뉴클레오타이드 내 존재하는 1 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 이중 가닥 공여자 DNA 분자. - 제70항에 있어서, 상기 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있는 1 내지 5개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 이중 가닥 공여자 DNA 분자.
- 제70항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드가 1 내지 4개의 포스포로티오에이트 (PS) 연결, 또는 1 내지 4개의 2’-O-메틸화 변형 또는 이의 조합을 포함하는, 이중 가닥 공여자 DNA 분자.
- 제70항에 있어서, 하나의 가닥이 상기 공여자 DNA의 하나의 가닥의 5’ 말단의 5개 뉴클레오타이드 내에 있는 2개 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 갖고, 다른 가닥이 말단 5' 포스페이트를 갖는, 이중 가닥 공여자 DNA 분자.
- 제70항에 있어서, 상기 관심 대상의 서열이 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물을 포함하는, 이중 가닥 공여자 DNA 분자.
- 제70항에 있어서, 상기 표적 부위가 T 세포 수용체 유전자, PD-1 유전자 또는 TIM3 유전자로부터 선택되는, 이중 가닥 공여자 DNA 분자.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862635702P | 2018-02-27 | 2018-02-27 | |
| US16/288,052 US20200224160A1 (en) | 2018-02-27 | 2019-02-27 | Process for dna integration using rna-guided endonucleases |
| US16/288,052 | 2019-02-27 | ||
| PCT/US2020/020121 WO2020176740A1 (en) | 2018-02-27 | 2020-02-27 | Improved process for dna integration using rna-guided endonucleases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210134000A true KR20210134000A (ko) | 2021-11-08 |
Family
ID=71516309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217030805A KR20210134000A (ko) | 2018-02-27 | 2020-02-27 | Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 dna 통합을 위한 개선된 방법 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20200224160A1 (ko) |
| EP (1) | EP3931322A1 (ko) |
| JP (1) | JP2022521787A (ko) |
| KR (1) | KR20210134000A (ko) |
| CN (1) | CN113906136A (ko) |
| AU (1) | AU2020229848A1 (ko) |
| CA (1) | CA3131588A1 (ko) |
| IL (1) | IL285842A (ko) |
| MX (1) | MX2021010322A (ko) |
| SG (1) | SG11202109332RA (ko) |
| WO (1) | WO2020176740A1 (ko) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220073890A1 (en) | 2018-12-14 | 2022-03-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel crispr-cas systems for genome editing |
| AU2020289591A1 (en) | 2019-06-07 | 2021-12-23 | Scribe Therapeutics Inc. | Engineered CasX systems |
| WO2021217083A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Memory dimeric antigen receptors |
| WO2022015956A1 (en) | 2020-07-15 | 2022-01-20 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Improved process for dna integration using rna-guided endonucleases |
| WO2022103878A1 (en) * | 2020-11-11 | 2022-05-19 | Monsanto Technology Llc | Methods to improve site-directed integration frequency |
| WO2022215978A1 (ko) * | 2021-04-05 | 2022-10-13 | 주식회사 셀렌진 | Pdcd-1 유전자에 상보적인 가이드 rna 및 이의 용도 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6010907A (en) * | 1998-05-12 | 2000-01-04 | Kimeragen, Inc. | Eukaryotic use of non-chimeric mutational vectors |
| US6556674B1 (en) | 1998-11-19 | 2003-04-29 | Legerity, Inc. | Signal detector with matched filter coefficient |
| US9957515B2 (en) * | 2013-03-15 | 2018-05-01 | Cibus Us Llc | Methods and compositions for targeted gene modification |
| WO2017070429A1 (en) * | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods involving editing polynucleotides that encode t cell receptor |
| WO2017205650A1 (en) * | 2016-05-27 | 2017-11-30 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for enhancing homologous recombination |
| US20200299729A1 (en) * | 2017-09-08 | 2020-09-24 | Life Technologies Corporation | Methods for improved homologous recombination and compositions thereof |
-
2019
- 2019-02-27 US US16/288,052 patent/US20200224160A1/en active Pending
-
2020
- 2020-02-27 SG SG11202109332RA patent/SG11202109332RA/en unknown
- 2020-02-27 JP JP2021549970A patent/JP2022521787A/ja active Pending
- 2020-02-27 US US17/434,209 patent/US20220169984A1/en active Pending
- 2020-02-27 WO PCT/US2020/020121 patent/WO2020176740A1/en unknown
- 2020-02-27 EP EP20715999.7A patent/EP3931322A1/en active Pending
- 2020-02-27 CN CN202080031829.1A patent/CN113906136A/zh active Pending
- 2020-02-27 AU AU2020229848A patent/AU2020229848A1/en active Pending
- 2020-02-27 CA CA3131588A patent/CA3131588A1/en active Pending
- 2020-02-27 MX MX2021010322A patent/MX2021010322A/es unknown
- 2020-02-27 KR KR1020217030805A patent/KR20210134000A/ko unknown
-
2021
- 2021-08-24 IL IL285842A patent/IL285842A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3131588A1 (en) | 2020-09-03 |
| JP2022521787A (ja) | 2022-04-12 |
| IL285842A (en) | 2021-10-31 |
| MX2021010322A (es) | 2022-01-06 |
| CN113906136A (zh) | 2022-01-07 |
| US20200224160A1 (en) | 2020-07-16 |
| WO2020176740A1 (en) | 2020-09-03 |
| US20220169984A1 (en) | 2022-06-02 |
| SG11202109332RA (en) | 2021-09-29 |
| AU2020229848A1 (en) | 2021-10-14 |
| EP3931322A1 (en) | 2022-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20210134000A (ko) | Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 dna 통합을 위한 개선된 방법 | |
| KR20210149734A (ko) | Rna-가이드된 엔도뉴클레아제를 사용한 dna 작제물의 통합을 위한 개선된 방법 | |
| JP6788573B6 (ja) | メトトレキサートによる選択と組み合わせたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンによる遺伝子改変Ｔ細胞の製造 | |
| KR20210008502A (ko) | 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 | |
| AU2020230334A1 (en) | Compositions and methods for immunooncology | |
| CA3036926C (en) | Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same | |
| CN116322716A (zh) | Regnase-1和/或TGFBRII被破坏的基因工程化T细胞具有改善的功能性和持久性 | |
| KR20170096999A (ko) | 신규한 cho 통합 부위 및 이의 용도 | |
| NZ333201A (en) | Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides | |
| KR20210089712A (ko) | 항-cd33 면역세포 암 치료법 | |
| WO2021197391A1 (zh) | 一种制备经修饰的免疫细胞的方法 | |
| KR20200122306A (ko) | 저항원성 세포의 제조 방법 | |
| CA3166430A1 (en) | Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes | |
| US20210017518A1 (en) | Modified tracrrnas grnas, and uses thereof | |
| KR20210005922A (ko) | 형질 세포 고갈을 위한 항-bcma car-t-세포 | |
| KR20210089707A (ko) | 항-liv1 면역세포 암 치료법 | |
| KR20230029603A (ko) | 필수 유전자 녹-인에 의한 선택 | |
| WO2023010125A1 (en) | Multiplex base editing of primary human natural killer cells | |
| KR20230147109A (ko) | Her2 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 | |
| WO2022015956A1 (en) | Improved process for dna integration using rna-guided endonucleases | |
| WO2021170089A1 (en) | Engineering immune cells via simultaneous knock-in and gene disruption | |
| AU2022386792A1 (en) | Systems and methods for trans-modulation of immune cells by genetic manipulation of immune regulatory genes | |
| CA3223311A1 (en) | Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes | |
| WO2023183434A2 (en) | Compositions and methods for generating cells with reduced immunogenicty | |
| WO2023225035A2 (en) | Compositions and methods for engineering cells |