JP2023134670A - Crispr系組成物及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、CRISPR系における使用のための修飾された組成物、及びそれらの使用方法を提供する。【解決手段】本発明は、長さ修飾及び化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAが、CRIPSR系のCas9との相互作用のための再構成ガイドRNAとしての使用に関して説明されている。結果として得られる長さ修飾及び化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAは、経済的に製造され、CRIPSR Cas9エンドヌクレアーゼ系の状況において、それらの生化学活性及び生物活性に関連する固有の特性を有するように調整され得る。【選択図】図10
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条の下、2014年12月18日及び2015年10月9日出願の「CRISPR-BASED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE」と題する、通し番号62/093,588及び62/239,546を持つ米国仮特許出願への優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第119条の下、2014年12月18日及び2015年10月9日出願の「CRISPR-BASED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE」と題する、通し番号62/093,588及び62/239,546を持つ米国仮特許出願への優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2015年12月18日作成のこのASCIIコピーは、IDT01-008-US_ST25.txtという名称であり、177,163バイトサイズである。
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2015年12月18日作成のこのASCIIコピーは、IDT01-008-US_ST25.txtという名称であり、177,163バイトサイズである。
本発明は、CRISPR系における使用のための修飾された組成物、及びそれらの使用方法に関する。
部位特異的DNA切断のための、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列(CRISPR)及び関連Casタンパク質(CRISPR-Cas系)の使用は、多くの生物学的用途に対する優れた可能性を示してきた。CRISPRは、ゲノム編集、内在性遺伝子に対する転写抑制因子(CRISPRi)及び活性因子(CRISPRa)のゲノムスケール特異的標的、及びCas酵素によるRNA指向型DNA標的の他の用途に使用されている。
CRISPR-Cas系は、細菌及び古細菌に天然であり、ウイルス及びプラスミドに対する適応免疫を提供する。試験及び治療試薬に潜在的に適応され得るCRISPR-Cas系の3つのクラスが存在するが、II型CRISPR系は、標的DNAの二本鎖切断を媒介するために、単一CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼ(具体的に、Cas9)を、適切なガイドRNA、CRISPR活性化RNA:トランス活性化crRNA(crRNA:tracrRNA)対を含む細菌内の天然複合体と同様の2部RNA系、または人工キメラ単一ガイドRNA(sgRNA)のいずれかとの複合体中で用いることにおける望ましい特徴を有する。哺乳類系において、これらのRNAは、RNA転写を駆動するRNA Pol IIIプロモーター(U6またはH1等)、ウイルスベクター、及びインビトロ転写に続く一本鎖RNAを含有するDNAカセットの形質移入によって導入されてきた(Xu,T.,et al.,Appl Environ Microbiol,2014.80(5):p.1544-52を参照されたい)。
CRISPR-Cas9系において、例えば、化膿性連鎖球菌に存在する系を例として使用すると(S.py.またはSpy)、天然crRNAは、約42bp長であり、標的配列に相補的な約20塩基の5′領域(プロトスペーサー配列とも称される)、及びtracrRNA配列の相補性領域に対応する典型的に約22塩基長の3′領域を含む。天然tracrRNAは、約85~90塩基長であり、crRNAに相補的な領域を含む5′領域、ならびに5′上流の約10塩基領域を有する。tracrRNAの残りの3′領域は、二次構造(本明細書では「tracrRNA 3′テール」と称される)を含む。
Jinekらは、CRISPR-Cas9系の正常機能に必要なcrRNA及びtracrRNAの部分を多角的に調査した(Science,2012.337(6096):p.816-21)。彼らは、CRISPR-Cas9において依然として機能し得る切断されたcrRNA:tracrRNA断片を考案し、crRNAは、野生型42個のヌクレオチドであり、tracrRNAは、75個のヌクレオチドに切断されていた。彼らはまた、crRNA及びtracrRNAが、リンカーループで連結され、単一ガイドRNA(sgRNA)を形成する実施形態を開発し、異なる実施形態では、99~123個のヌクレオチドの間で異なる。天然2部crRNA:tracrRNA複合体の構成を図1に示し、人工sgRNA単一ガイドの99個のヌクレオチド実施形態を図2に示す。
少なくとも2つのグループが、化膿性連鎖球菌Cas9(SpyCas9)の結晶構造を解明してきた。Jinek,Mらにおいて、この構造は、ガイドRNAまたは標的DNAのいずれかとの複合体中でヌクレアーゼを示さなかった。彼らは、分子モデリング実験を実行してRNA及びDNAとの複合体中のタンパク質間の予測的相互作用を明らかにした(Science,2014.343,p.1215,DOI:10.1126/science/1247997)。
Nishimasu,Hらにおいて、SpyCas9の結晶構造は、sgRNA及びその標的DNAとの複合体において2.5Å解像度で示される(Cell,2014.156(5):p.935-49、その全体が本明細書に組み込まれる)。この結晶構造は、Cas9酵素に対する2つのローブ、認識ローブ(REC)、及びヌクレアーゼローブ(NUC)を特定した。sgRNA:標的DNAヘテロ二重鎖(負の電荷を持つ)は、2つのローブ間の正の電荷を持つ溝内にある。既知のタンパク質との構造的類似性を示さず、したがってCas9特異的機能ドメインのようなRECローブは、互いに相補的なcrRNA及びtracrRNAの部分と相互作用する。
別のグループ、Brinerら(Mol Cell,2014.56(2):p.333-9、その全体が本明細書に組み込まれる)は、天然crRNA:tracrRNA二重鎖及びsgRNA内の6つの保存モジュールを特定し、特徴付けを行った。
CRISPR-Cas9系は、ゲノム工学において以下の通り用いられる。crRNAの一部分は、標的配列にハイブリダイズする。tracrRNAの一部分は、crRNAの一部分にハイブリダイズする。Cas9ヌクレアーゼは、構築体全体に結合し、切断を指向する。このCas9は、エンドヌクレアーゼHNH及びRuvCに相同的な2つのドメインを含み、HNHドメインは、crRNAに相補的なDNA鎖を切断し、RuvC様ドメインは、非相補鎖を切断する。これは、ゲノムDNAにおいて二本鎖破断をもたらす。非相同末端結合(NHEJ)によって修復された場合、この切断は、典型的に1つ以上の塩基だけシフトし、天然DNA配列の崩壊につながり、多くの場合、この事象がタンパク質をコードする遺伝子のコード化エキソン内で起こる場合、フレームシフト突然変異につながる。この破断はまた、相同性依存的組み換え(HDR)によって修復され、新たな遺伝子材料の、実験操作を介した、Cas9切断によって創出された切断部位への挿入を許す。
哺乳類細胞へのガイドRNA送達のための現在の方法のうちの一部には、内在性転写のためのRNA Pol IIIプロモーターを含有する二本鎖DNA(dsDNA)の形質移入、ウイルス送達、インビトロ転写(IVT)産物としてのRNAの形質移入、またはIVT産物の微量注入が含まれる。これらの方法には各々短所がある。哺乳類細胞に導入された非修飾外因性RNAは、Toll様受容体(TLR)、RIG-I、OASI、及び病原体関連分子パターン(PAMP)を認識する他の受容体による認識を介して自然免疫応答を開始することが知られている。しかしながら、大部分の公表された試験において、T7 RNAポリメラーゼによってインビトロ転写された(IVT)RNAが、細胞に送達される。このタイプのRNAペイロードは、自然免疫応答のトリガーであることが示されてきた。上記の代替送達方法の各々は、それら独自の短所も同様に有する。例えば、dsDNAカセットは、統合につながり得、RNA Pol IIプロモーターによって内因的に駆動されるガイドRNA転写は、構成的に持続し得、転写されるRNAの量は制御不可能である。
RNAは、血清中及び細胞中に存在するヌクレアーゼによって速やかに分解される。IVT方法または化学合成によって作製された非修飾CRISPR RNAトリガー(crRNA、tracrRNA、及びsgRNA)は、哺乳類細胞への送達中または送達後に速やかに分解される。RNAが、ヌクレアーゼ耐性を得るように化学修飾された場合、より優れた活性が認識される。血清中及び細胞中に存在する最も強力な分解活性は、3′エキソヌクレアーゼである(Eder et al.,Antisense Research and Development 1:141-151,1991)。故に、合成オリゴヌクレオチドを「末端ブロッキングすること」は、多くの場合、ヌクレアーゼ安定性を改善する。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)及び二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)の化学修飾は、十分に研究されてきており、現在では良好なアプローチが実施されている(レビューについては、Kurreck,Eur.J.Biochem.,270:1628-1644,2003、Behlke,Oligonucleotides,18:305-320,2008、Lennox et al.,Gene Therapy,18:1111-1120,2011を参照されたい)。したがって、CRISPR/CasのRNA構成要素と共に使用するための化学修飾戦略を考案することが望ましい。入手可能な化学修飾の基本的ツールボックスは、当業者には周知であるが、RNA種及びエフェクタータンパク質の相互作用に対して部位特異的修飾が有する効果は容易に予測されず、有効な修飾パターンは、通常は経験的に決定されなければならない。場合によって、RNAの配列は、修飾パターンの有効性に影響を及ぼし得、異なる配列構成に用いられる修飾パターンの調整を必要とし、かかる方法の実地応用をより困難にする。
したがって、細胞へのその毒性を低減し、哺乳細胞内での寿命及び機能性を拡張する一方で、依然としてCRISPR/Cas系におけるそれらの意図された目的を果たすようにガイドRNAを修飾する必要性が存在する。本明細書に記載される本発明の方法及び組成物は、CRISPR-Cas系における使用のためのRNA及び修飾RNAオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のこれら及び他の利点、ならびに追加の発明の特徴は、本明細書に提供される本発明の説明から明らかとなるであろう。
Xu,T.,et al.,Appl Environ Microbiol,2014.80(5):p.1544-52
Science,2012.337(6096):p.816-21
Science,2014.343,p.1215,DOI:10.1126/science/1247997
Cell,2014.156(5):p.935-49
Mol Cell,2014.56(2):p.333-9
Eder et al.,Antisense Research and Development 1:141-151,1991
Kurreck,Eur.J.Biochem.,270:1628-1644,2003
Behlke,Oligonucleotides,18:305-320,2008
Lennox et al.,Gene Therapy,18:1111-1120,2011
本発明は、CRISPR系における使用のための修飾された組成物、及びそれらの使用方法に関する。これらの組成物は、修飾されたヌクレオチド間結合、ならびにCRISPR-Cas系のガイド鎖(crRNA:tracrRNAまたはsgRNA)として機能する2′-O-アルキル及び2′-O-フルオロ修飾されたRNAオリゴヌクレオチドを含む。組成物はまた、エキソヌクレアーゼ攻撃を妨げる反転dT塩基または他の非ヌクレオチド修飾因子(例えば、プロパンジオール基(C3スペーサー)、ナフチル-アゾ修飾因子、または他の当該技術分野において周知であるようなもの)等の末端修飾を含む。
第1の態様において、長さ修飾された形態の配列番号18を含む単離されたtracrRNAが提供される。単離されたtracrRNAは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)エンドヌクレアーゼ系において活性を示す。
第2の態様において、長さ修飾された形態の式(I)を含む単離されたcrRNAが提供され、
第3の態様において、化学修飾された形態の配列番号2、18、30~33、及び36~39のうちの1つを含む単離されたtracrRNAが提供される。単離されたtracrRNAは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)エンドヌクレアーゼ系において活性を示す。
第4の態様において、化学修飾された形態の式(I)を含む単離されたcrRNAが提供され、
本発明の態様は、CRISPR系における使用のための修飾された組成物、及びそれらの使用方法に関する。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、ポリリボヌクレオチド(D-リボースを含有する)、及びプリンまたはピリミジン塩基のNグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドを指す(単一ヌクレオチドは、「塩基」または「残基」とも称される)。「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」という用語間で意図される長さの区別はなく、これらの用語は、交換可能に使用され得る。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。故に、これらの用語には、二本鎖及び一本鎖DNA、ならびに二本鎖及び一本鎖RNAが含まれる。本発明における使用のために、オリゴヌクレオチドは、塩基、糖、またはリン酸塩骨格が修飾されるヌクレオチド類似体、ならびに非プリン若しくは非ピリミジンヌクレオチド類似体を含むこともできる。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド(例えば、2′修飾を持つヌクレオチド、合成塩基類似体等)、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
本発明の組成物は、自然免疫系の活性化を潜在的に低減する任意の修飾を含む。修飾は、従来のホスホジエステル結合において、リボース糖において、またはRNAの核酸塩基において配置または置換され得る。かかる組成物は、例えば、2′-O-メチル修飾されたRNA等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。
より広義には、「修飾されたヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環、またはリン酸基に対する1つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾されたヌクレオチドは、アデノシン一リン酸塩、グアノシン一リン酸塩、ウリジン一リン酸塩、及びシチジン一リン酸塩を含有するリボヌクレオチド、ならびにデオキシアデノシン一リン酸塩、デオキシグアノシン一リン酸塩、デオキシチミジン一リン酸塩、及びデオキシシチジン一リン酸塩を含有するデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾には、メチルトランスフェラーゼ等のヌクレオチドを修飾する酵素による修飾から生じる、天然に存在するものが含まれる。修飾されたヌクレオチドは、合成または非天然に存在するヌクレオチドも含む。修飾は、塩基類似体及びユニバーサル塩基も含む。ヌクレオチドにおける合成または非天然に存在する修飾には、2′修飾を有するもの、例えば、2′-O-アルキル(2′-O-メチルを含む)、2′-フルオロ、2′-メトキシエトキシ、2′-アリル、2′-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、4′-チオ、二環式核酸、4′-CH2-O-2′-架橋、4′-(CH2)2-O-2′-架橋、2′-LNA、及び2′-O-(N-メチルカルバメート)、または塩基類似体を含むものが挙げられる。かかる修飾基は、例えば、Ecksteinらの米国特許第5,672,695号、及びMatulic-Adamicらの米国特許第6,248,878号に記載されている。
2′-O-メチルの使用は、siRNA文献(Behlke,M.A.,Oligonucleotides,2008.18(4):p.305-19を参照されたい)ならびにmRNA送達(Sahin,U.et al.,Nat Rev Drug Discov,2014.13(10):p.759-80を参照されたい)に記録されている。Sahinらは、2′-OMe修飾及び「非免疫原性」mRNAを超えて拡張するmRNA治療薬の修飾を説明している。
「リボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成、非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、及び/またはオリゴヌクレオチド内のリボヌクレオチド間の結合への変化が含まれる。
「Cas9タンパク質」という用語は、好適なガイドRNA(例えば、sgRNAまたは二重crRNA:tracrRNA組成物)と複合されて活性CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系を形成する場合に生化学活性及び生物活性を有する野生型及び突然変異型のCas9を包含する。これには、本発明における実施例として用いられる化膿性連鎖球菌Cas9からの異なるアミノ酸配列を有するオルソログ及びCas9変異型が含まれる。
「長さ修飾された」という用語は、その用語がRNAを修飾する場合、短縮または切断された形態のヌクレオチド配列を欠いている基準RNA、または追加のヌクレオチド配列を含む細長い形態の基準RNAを指す。
「化学修飾された」という用語は、その用語がRNAを修飾する場合、化学修飾されたヌクレオチドを含有する基準RNAの形態、またはそのRNAに共有結合された非ヌクレオチド化学基を指す。本明細書に記載される、化学修飾されたRNAは、概して、オリゴヌクレオチド合成手順を使用して調製された合成RNAを指し、修飾されたヌクレオチドは、RNAオリゴヌクレオチドの合成中に組み込まれる。しかしながら、化学修飾されたRNAはまた、合成後に好適な修飾剤で修飾された合成RNAオリゴヌクレオチドを含む。
出願人は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)エンドヌクレアーゼ系において頑強な活性を示す、新規のcrRNA及びtracrRNAオリゴヌクレオチド組成物を発見した。このオリゴヌクレオチド組成物には、長さ修飾された形態のcrRNA及びtracrRNA、ならびに化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAが含まれる。長さ修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAは、費用効果があり、効率的なオリゴヌクレオチド合成プロトコルが日常的に入手可能である、これらのRNAの活性形態を調製するのを可能にする。化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAは、細胞状況及びインビボ状況において、改善された安定性等のある特定の特性で調整可能な活性剤を提供する。長さ修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAは、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系状況において活性を有する広範囲の組成物にアクセスするのを可能にする修飾も含み得る。これらのオリゴヌクレオチド組成物及びCRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系におけるそれらの特性が後述される。
長さ修飾された形態のcrRNA及びtracrRNA
図1は、野生型化膿性連鎖球菌crRNA:tracrRNA複合体の表示を示し、例示的な単離されたcrRNA(配列番号46)は、単離されたtracrRNA(配列番号18)と対合される。第1の態様において、長さ修飾された形態の配列番号18を含む単離されたtracrRNAが提供される。単離されたtracrRNAは、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において活性を示す。一態様において、単離されたtracrRNAは、欠失された配列情報を有する長さ修飾された形態の配列番号18ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、長さ修飾された形態の配列番号18には、短縮または切断された形態の配列番号18が含まれ、配列番号18は、5′末端で1~20個のヌクレオチド、及び3′末端で1~10個のヌクレオチドだけ短縮され得る。かかる短縮または切断された形態の配列番号18は、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において機能的に競合するcrRNAと対合される場合に活性を保持する。tracrRNAの5′末端の短縮が行われ、crRNAの3′末端と対合する配列へと延びる場合、これらのドメインにおいて結合親和性を増強する化学修飾を使用して、改善された活性が得られ得る。crRNAの3′末端の短縮が行われ、tracrRNAの5′末端と対合する配列へと延びる場合、これらのドメインにおいて結合親和性を強化する化学修飾を使用して、改善された活性が得られ得る。短縮または切断された形態を有する長さ修飾された形態の配列番号18の好ましい実施例には、配列番号2、30~33、及び36~39が含まれる。短縮または切断された形態を有する長さ修飾された形態の配列番号18の非常に好ましい実施例には、配列番号2が含まれる。各々の短縮または切断された形態を有する前述の例示的な長さ修飾された形態の配列番号18の場合、配列番号2、30~33、及び36~69は、化学的に非修飾のヌクレオチドからなる。
第2の態様において、長さ修飾された形態の式(I)を含む単離されたcrRNAが提供され、
標的特異的プロトスペーサードメイン(式(I)のXドメイン)は、典型的に、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系によって標的されたDNAの領域に対して相補性を有する約20個のヌクレオチドを含む。tracrRNA結合ドメイン(式(I)のZドメイン)は、典型的に、大部分のCRISPRエンドヌクレアーゼ系において約20個のヌクレオチドを含む(天然S.py.バージョンにおいて、このドメインは、22個のヌクレオチドである)。単離されたcrRNAは、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において活性を示す。
一態様において、単離されたcrRNAは、欠失された配列情報を有する長さ修飾された形態の式(I)を含む。一部の実施形態において、長さ修飾された形態の式(I)には、短縮または切断された形態の式(I)が含まれ、式(I)は、Zドメインの3′末端で1~8個のヌクレオチドだけ短縮され得る。長さ修飾された形態の式(I)は、17、18、19、または20個のヌクレオチドを有する標的特異的プロトスペーサードメインに対応するためにXドメインの5′末端で短縮され得る。かかる長さ修飾された形態の式(I)の非常に好ましい実施例には、19または20個のヌクレオチドを有する標的特異的プロトスペーサードメインが含まれる。17~20個のヌクレオチドの長さであり、かつ/またはZドメインの3′末端で1~8個のヌクレオチドを欠いている、標的特異的プロトスペーサー(Xドメイン)を持つ短縮または切断された形態を有する例示的な長さ修飾された形態の式(I)は、化学的に非修飾のヌクレオチドからなり得る。
かかる短縮または切断された形態の式(I)は、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において競合するtracrRNAと対合される場合に活性を保持する。長さ修飾された形態の式(I)を有する式(I)の単離されたcrRNAの好ましい実施形態には、化学的に非修飾のヌクレオチド及び化学修飾されたヌクレオチドが含まれ得る。
化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNA
第3の態様において、化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化学修飾因子を含む単離されたtracrRNAが提供される。単離されたtracrRNAは、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において活性を示す。一態様において、単離されたtracrRNAは、リボース修飾、末端修飾基、及びヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する、化学修飾されたヌクレオチドを含む。例示的なリボース修飾には、2′O-アルキル(例えば、2′OMe)、2′F、二環式核酸、及びロックされた核酸(LNA)が含まれる。例示的な末端修飾基には、プロパンジオール(C3)スペーサー及びナフチル-アゾ修飾因子(N,N-ジエチル-4-(4-ニトロナフタレン-1-イルアゾ)-フェニルアミン、または「ZEN」)、ならびに反転dT残基が含まれる。例示的なヌクレオチド間修飾結合には、ホスホロチオエート修飾が含まれる。一態様において、化学修飾された形態を有する単離されたtracrRNAには、配列番号46及びその長さ修飾された形態、例えば、短縮または切断された形態の配列番号46が含まれる。化学修飾されたヌクレオチドを有する好ましい短縮または切断された形態の配列番号46には、化学修飾されたヌクレオチドを有する配列番号2、30~33、及び36~39が含まれる。CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において頑強な活性を持つ化学修飾されたヌクレオチドを有する単離されたtracrRNAの更に他の例を、実施例において提示する。
第4の態様において、化学修飾されたヌクレオチドを含む単離されたcrRNAが提供される。単離されたcrRNAは、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において活性を示す。一態様において、単離されたcrRNAは、リボース修飾、末端修飾基、及びヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する、化学修飾されたヌクレオチドを含む。例示的なリボース修飾には、2′O-アルキル(例えば、2′OMe)、2′F、二環式核酸、及びロックされた核酸(LNA)が含まれる。例示的な末端修飾基には、プロパンジオール(C3)スペーサー及びナフチル-アゾ修飾因子(N,N-ジエチル-4-(4-ニトロナフタレン-1-イルアゾ)-フェニルアミン、または「ZEN」)、ならびに反転dT残基が含まれる。例示的なヌクレオチド間修飾結合には、ホスホロチオエート修飾が含まれる。一態様において、化学修飾された形態を有する単離されたcrRNAには、式(I)のcrRNA及びその長さ修飾された形態が含まれる。好ましい短縮または切断された形態の、化学修飾されたヌクレオチドを有する式(I)のcrRNAは、配列番号429~439を含む。化学修飾されたヌクレオチドを有する単離されたcrRNAの非常に好ましい実施例には、配列番号434及び435が含まれる。これらの特定の単離されたcrRNA種は、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系においてコンピテントtracrRNAと複合された場合に高い活性を示す化学修飾されたヌクレオチドを有する「ユニバーサル」crRNAを表す。CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において頑強な活性を持つ化学修飾されたヌクレオチドを有する単離されたcrRNAの更に他の例を、実施例において提示する。
前述の単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAは、好ましくは2′-OH基(例えば、特に2′OMe、2′F、二環式核酸、ロックされた核酸)での化学修飾、及び末端ブロッキング修飾(例えば、ZEN、C3スペーサー、反転dT)を含む。両方のタイプの一般修飾の使用は、単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAに、生物学的状況における単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAの生化学的安定性及び免疫寛容を提供する。
前述の単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAは、異なる組み合わせで混合されて、活性crRNA:tracrRNAをCas9のガイドRNAとして形成することができる。例えば、単離され、長さ修飾されたtracrRNAは、単離され、化学修飾されたcrRNAと組み合わせて、活性crRNA:tracrRNAをCas9のガイドRNAとして形成することができる。実施例は、活性crRNA:tracrRNAをCas9のガイドRNAとしてもたらす、単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAの異なる組み合わせの例証を提供する。
単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAの一方(または両方)に含まれる特定の化学修飾されたヌクレオチドを必要とする程度は、結果として生じる活性crRNA:tracrRNAが、Cas9のガイドRNAとして機能する用途に依存する。CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系のある特定の生化学アッセイにおいて、特にヌクレアーゼが最小または不在であり得る場合、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系のCas9の結果として得られるガイドRNAの頑強な活性を生じるために、広範囲に化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAを必要としない場合がある。これは、ヌクレアーゼへの耐性を付与する化学修飾されたヌクレオチドが、ヌクレアーゼが最小または不在である場合に必須でないという事実に寄与する。ある特定の生物学的(インビボ)状況において、crRNA及びtracrRNAを含む混合物は、リポソームナノ粒子等の担体ビヒクル内の細胞に送達され、単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAは、血流に直接送達されるか、または単離された「裸の」RNA混合物として臓器系に注入されるcrRNA及びtracrRNAの混合物より広範囲でない化学修飾されたヌクレオチドを必要とし得る。化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAに存在する化学修飾の程度は、インビボでの(すなわち、関連生物学的状況における、例えば、血流中または細胞内の)関連RNA分子の半減期を既定し得る。したがって、化学修飾されたcrRNA及びtracrRNAの修飾プロファイルを使用して、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系におけるCas9のガイドRNAとして結果として得られるcrRNA:tracrRNA二重鎖の生化学活性及び生物活性を微調整することができる。
先行技術は、Cas9がsgRNAと相互作用するため、Cas9の構造に焦点を当てているが、本明細書に記載の開示される設計パターンは、前述のcrRNA:tracrRNA二重RNA系を企図する。一本鎖ガイドRNAは、治療設計の簡素性等のいくつかの利得を提供する。しかしながら、標準固相ホスホルアミダイトRNA合成は、長さが増加するにつれてオリゴヌクレオチドの収率の低下を示し、この問題は、長さが60~70塩基を超えるとより明らかになる。これは、特に一部の商用または治療用途に必要とされる、より大きな規模での、一部のtracrRNAならびにキメラsgRNAの頑強な費用効果のある合成を妨げる。この理由から、本発明は、sgRNAだけでなく、代替二重crRNA:tracrRNAの、Cas9のガイドRNAとしての実施形態を企図する。しかしながら、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系においてCas9と複合された場合に頑強な活性を有する単離されたガイドRNAは、本明細書に提供される単離された、長さ修飾された、及び化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAに基づいて、適切なcrRNA及びtracrRNAの、人工単分子sgRNAとしての結合または合成によって操作され得る。このタイプの長い単一ガイドは、より短い鎖の直接合成によるか、または合成後化学共役によって得ることができる。
長さ修飾された、及び化学修飾されたtracrRNA組成物の設計は、長さが80個超のヌクレオチドであるtracrRNAオリゴヌクレオチドと関連付けられた潜在的合成問題に取り組んでいる。2′-OMe修飾されたRNAモノマーのカップリング効率(2′-OH上に保護基を有効に含有する)は、RNAモノマーのカップリングより優れている。2′-OMe修飾されたRNAを組み込むことは、いくつかの利点を提供する。第1に、より長いオリゴヌクレオチドが、完全2′-OMeまたはRNA/2′-OMe混合オリゴヌクレオチドのいずれかとして合成されるのを可能にする。第2に、本発明の方法及び組成物は、crRNA:tracrRNAの合成及び形質移入につながり、免疫系による検出を回避し得る。外来性の非修飾RNAが、哺乳類細胞ならびに全動物において自然免疫応答を誘起することも周知である。2′OMe修飾されたオリゴヌクレオチドを使用することは、ヌクレアーゼに対するRNA安定性(第3の利点)を付与するとともに、免疫原性トリガーと関連付けられる細胞死及び毒性を低減することができる。異なる化学部分を有する他の開示される修飾ヌクレオチド(例えば、2′F、他の2′O-アルキル、LNA、及び他の二環式ヌクレオチド)が、ヌクレアーゼへの耐性を付与することに関して同様の利得及び利点をもたらし得るため、これらの利点は、2′-OMe修飾自体に固有ではない。
別の実施形態において、crRNAに相補的なtracrRNA部分は、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含有し、更なる実施形態において、crRNAに相補的なtracrRNA部分は、10%超の修飾された残基で構成され、更なる実施形態において、crRNAに相補的でないtracrRNA部分は、50%超の修飾された残基で構成され、更なる実施形態、crRNAに相補的でないtracrRNA部分は、90%超の修飾された残基で構成される。
別の実施形態において、crRNA部分は、非修飾であり、tracrRNA部分は、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドで構成される。更なる実施形態において、crRNA部分は、非修飾であり、tracrRNA部分は、10%超の修飾された塩基で構成される。
別の実施形態において、式(I)の単離されたcrRNAは、経験的に決定される修飾を用いて設計される。図7及び10に描かれる通り、Zドメイン(tracrRNA結合ドメイン)の3′末端における12個のヌクレオチド及びXドメイン(プロトスペーサードメイン内)の5′末端における10~12個のヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドでの置換を受けやすいユニバーサルヌクレオチドを表し、結果として得られるRNAは、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系において頑強な活性を保持する。Zドメイン(tracrRNA結合ドメイン)の5′末端内の更に他のヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドでの置換に不寛容である(図7)。しかし、式(I)の単離されたcrRNA内の他の部位が、化学修飾されたヌクレオチドを許容し、CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系における活性を保持する能力は、主に経験的に決定される。crRNAのtracrRNA結合ドメイン(Zドメイン)は、定常であり(すなわち、標的部位が異なっても配列が変化しない)、そのため本明細書に記載される修飾パターンは、標的部位に関係なく全てのcrRNAに対してユニバーサルであり、広く適用され得る。crRNAのプロトスペーサー(Xドメイン)は、標的により異なり、このドメイン内の塩基位置のうちのいくつかの、化学修飾への寛容は、配列構成により異なり、部位の最大化学修飾が望まれる場合、経験的最適化から利得を享受し得る。しかしながら、標的特異的プロトスペーサー(X)ドメイン内の残基の一部は、配列構成への考慮なく修飾され得る。このドメインの5′末端における10~12個の残基は、修飾されたcrRNAの完全活性が維持されるという予想とともに、2′修飾された残基で置換され得る。プロトスペーサー(X)ドメインの3′末端に向かう残りの8~10個の塩基は、配列構成に応じて、修飾に寛容である場合とそうでない場合がある。完全活性を維持しながら、プロトスペーサー(X)ドメインの20個の塩基のうちの17個が修飾され得る1つの配列構成を図7に示す。部位が修飾により低下された活性であったことを示す。
Cas9系ツールの用途は多く、異なる。それらには、植物遺伝子編集、酵母遺伝子編集、ノックアウト/ノックイン動物系の急速生成、疾患状態の動物モデルの生成、疾患状態の補正、レポーター遺伝子の挿入、及び全ゲノム機能性スクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実用性は、Cas9のD10A及びH840a二重突然変異体等のCas酵素の突然変異体バージョンを、転写活性因子(CRISPRa)及び抑制因子(CRISPRi)との融合タンパク質として含めることによって更に拡大される(Xu,T.,et al.,Appl Environ Microbiol,2014.80(5):p.1544-52を参照されたい)。Cas9-sgRNA複合体を使用して、一本鎖mRNAを同様に標的とすることもできる(O′Connell,M.R.,et al.,Nature,516:263,2014を参照されたい)。dsDNAを標的とするのと同じ方法で、crRNA:tracrRNAをPAMmer DNAオリゴヌクレオチドと共に使用して、Cas9切断を標的mRNAに指向するか、またはそれをO′Connellにより説明されるmRNA捕捉アッセイにおいて使用することができる。
CRISPR/Cas9用途に合成RNAオリゴヌクレオチドを送達するアプローチを用いることにより、1)質量分光法を使用して別個のRNA配列を確認すること、2)2′-OMe修飾されたRNAを十分に寛容される位置に選択的に挿入して、安定性を付与し、免疫原性を回避する一方で機能有効性を付与すること、3)制御された過渡効果のために細胞に導入されるRNAの量を特異的に制御すること、及び4)RNAに内在的に転写されるが、相同性指向型修復経路、または統合事象をもたらす非相同性末端接合のいずれかにおいて基質にもなり得るdsDNAを導入することに関する懸念を排除することを可能にする。これらの統合事象は、crRNAまたはtracrRNA要素の長期の望まれない発現につながり得る。更に、統合は、他の遺伝子をランダムかつ予測不能な様式で崩壊し得、細胞の遺伝子材料を、望まれない、潜在的に有害な方法で変更する。したがって、本発明は、一過性であり、crRNAガイドにより指向されると意図されるあらゆる改変以外のゲノムの永続する証拠または変化を残さないように、細胞内のCRISPR経路の要素の一過性発現を導入する手段として望ましい。
CRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系
コンピテントCRISPR-Casエンドヌクレアーゼ系は、単離されたCas9タンパク質、ならびに二重crRNA:tracrRNAの組み合わせ及びキメラsgRNAのうちの1つから選択される単離されたガイドRNAで形成されたリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体を含む。一部の実施形態において、単離された、長さ修飾された、及び/または化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAは、精製されたCas9タンパク質(例えば、配列番号407~410)、Cas9タンパク質をコードする単離されたmRNA(例えば、配列番号413)、またはCas9タンパク質をコードする遺伝子(例えば、配列番号411及び412)と発現ベクター内で複合される。ある特定のアッセイにおいて、単離された、長さ修飾された、及び/または化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAは、Cas9遺伝子をコードする内在性発現カセットからCas9タンパク質を安定して発現する細胞株に導入され得る。他のアッセイにおいて、長さ修飾された及び/または化学修飾された形態のcrRNA及びtracrRNAの混合物は、Cas9 mRNAまたはCas9タンパク質のいずれかとの組み合わせで細胞に導入され得る。
実施例1
本実施例は、化学修飾及び切断されたガイドRNAの、インビトロCas9 DNA切断アッセイにおける機能性を説明する。
本実施例は、化学修飾及び切断されたガイドRNAの、インビトロCas9 DNA切断アッセイにおける機能性を説明する。
示されるようにWT配列に対して様々な化学修飾及び切断を有するCrRNA及びtracrRNAオリゴヌクレオチドを合成した(表1)。
crRNAは、好適な「NGG」PAM部位に隣接したヒトHPRT1遺伝子内の部位にマッチする19塩基プロトスペーサーガイド配列を含有していた。ヒトHPRT1遺伝子からの938塩基対領域を、pCR-Bluntベクター(Life Technologies)にクローン化した。Cas9切断アッセイにおいて使用する前に、制限エンドヌクレアーゼXmaI(New England BioLabs)での消化によりプラスミドを系統化した。HPRT1標的断片の配列を以下に示す。標的PAM部位は、太字で示され、プロトスペーサーガイド配列結合部位は下線が引かれている。
crRNA及びtracrRNA対を、組み換えSpy Cas9(New England BioLabs)によるヒトHPRT1遺伝子のクローン化断片を含有する系統化されたプラスミドDNAの分解を指向する能力について試験した。crRNA:tracrRNAを、Duplex Buffer(30mM HEPES pH7.5、100mM酢酸カリウム)中、150nM濃度でアニールした。Spy Cas9(15nM)を、crRNA:tracrRNAで10分間、37℃で1:1モル比でプレインキュベートした。後次に、3nMの系統化された標的プラスミドを添加し、37℃で1時間インキュベートした。反応産物を、1%アガロースゲル上で125Vで1時間分離した。製造元のプロトコルに従い、GelRed(Biotium)後染色によりバンドを可視化した。ゲルをUVトランスイルミネーター上で撮像し、結果を上の表1に要約する。
天然の野生型(WT)CRISPR RNAは、5′末端に19~20塩基プロトスペーサードメイン(標的核酸に結合するガイド)、及び3′末端にtracrRNAに結合する22塩基ドメインを有する。故に、WT crRNAは、41~42塩基長である。WT tracrRNAは、89塩基長である。WT型crRNA:tracrRNA対が、標的DNAの完全切断を支持していたことを観察した(cr/tracrRNA対2D)。追加として、67塩基tracrRNAと対合された35塩基crRNA(19塩基プロトスペーサー及び16塩基tracrRNA結合ドメイン)を持つ切断されたバージョンの試薬が、標的RNAの完全切断を支持していたことを観察した(cr/tracrRNA対1A)。crRNA tracrRNA結合領域は、3′末端の切断された6塩基であった(配列番号1)。tracrRNAを、両末端で切断した(配列番号2)。短いcrRNAと長いtracrRNAとの対合組は、長いcrRNAと短いtracrRNAとの対合組と同様の切断を示した(対2A)。これらの発見は、Cas9標的認識及び切断を指向するための短いRNA構成要素の使用を許すため重要である。より短いRNAオリゴヌクレオチドは、より安価で化学合成があまり困難でなく、精製の必要が少なく、長いRNAオリゴヌクレオチドより高い収率を付与する。
天然のcrRNA及びtracrRNA(図1)の一部の要素を欠失させて機能的sgRNA(図2)を作製した。しかしながら、sgRNA内でcrRNAをtracrRNAに結合する二重鎖核酸の量は、11塩基対に限定され、これは典型的に、生物学的塩条件における二重鎖形成には短すぎる。複合体は、単分子ヘアピン構造に起因してsgRNAフォーマットで安定しているが、2つのRNAに分裂した同じ配列は不安定となる。したがって、どの長さの二重鎖ドメインが、最小だが機能的な2分子(2部)CRISPR複合体を作製する必要があるかどうか、またはこの複合体がCas9による標的切断を指向するように機能するかどうかは不明であった。本実施例は、わずか15塩基を塩基対合させることが、crRNAプロトスペーサードメイン(配列番号1及び2)に相補的な標的に対してCas9ヌクレアーゼ活性を指向する、2部crRNA:tracrRNA複合体の機能を可能にすることを実証する。
2′OMe RNAによるcrRNAの完全化学修飾は寛容でなかった(対3A及び対5A)。更に、crRNAの22塩基tracrRNA結合ドメインの完全2′OMe修飾は、標的切断を支持せず(対4A、対6A)、プロトスペーサーガイドドメインの完全2′OMe修飾は、切断を支持しなかった(対7A)。2′OMe RNAでのtracrRNAの完全化学修飾も寛容でなかった(対1B、1C、及び対2B、2C)。
重要なことに、両方のCRISPR RNA種の一部の高度に2′OMe修飾されたバージョンは、切断を支持した。対1Kは、3′末端に29個の2′OMe残基を有するtracrRNAによる高度な切断活性を示す(配列番号11)。対1Lは、5′末端の9個の2′OMe残基、及び3′末端の29個の2′OMe残基による高度な切断活性を示す(配列番号13)。故に、短いバージョンのtracrRNAにおける67個のRNA残基のうちの38個は、インビトロ切断アッセイにおいて、活性の喪失なく2′OMe RNAに変換され得る(57%)。
対14Aは、crRNAの3′末端における11塩基(22塩基tracrRNA結合ドメインの50%)が、2′OMe RNAで修飾され、標的切断を支持できることを実証する(配列番号14)。修飾されたcrRNAは、修飾されたtracrRNAと対合される場合に完全な活性を保持する(対14L、配列番号13及び14)。crRNAの5′末端に向かう11塩基の修飾(ガイド、プロトスペーサードメイン、塩基2~12個における)は、標的切断を支持し(対15A)、この修飾は、修飾されたtracrRNAと対合される場合にも機能的である(対15L、配列番号13及び15)。crRNAの5′末端及び3′末端に向かう2′OMe修飾は、修飾されたtracrRNAと対合される場合でも(対16L、配列番号13及び16)、35個の残基のうちの22個が修飾され(63%)、依然として切断を支持するように(対16A)複合され得る(配列番号16)。
上述されるcrRNA:tracrRNA対は全て、2′OMe RNAを修飾因子として用いた。追加の試験は、2′F修飾がまた、Cas9により寛容であり、標的DNAの切断を可能にしたことを示した。対9Aは、全てのピミジン塩基に2′F修飾を持つcrRNA(配列番号23)を用い、この設計は、完全標的切断を支持した。同様に、crRNAの完全2′F修飾は、完全標的切断を支持した(対10A、配列番号24)。2′OMe及び2′F修飾の併用は、crRNA及びtracrRNAの両方の完全修飾を可能にし得る。本実施例における試験は、インビトロ生化学解析で用いられる。性能は、配列が細胞核環境で機能する必要がある哺乳類遺伝子編集の状況において異なり得る。
実施例2
この実施例は、哺乳類細胞内でSpy Cas9ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、切断されたtracrRNAの機能を実証する。
この実施例は、哺乳類細胞内でSpy Cas9ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、切断されたtracrRNAの機能を実証する。
機能的Cas9ヌクレアーゼ及びRNAトリガーの両方(単一sgRNAまたは二重crRNA:tracrRNA対)は、CRISPRゲノム編集が起こるように哺乳類細胞の核内に存在しなければならない。Cas9を発現する大きなプラスミドベクターの形質移入は不十分であり、実験的結果に変化性を加える。crRNA及びtracrRNAの長さ及び化学組成物の変化が、他の変数の不在下で哺乳類細胞内で及ぼす影響を正確に評価するために、Spy Cas9を安定して発現する細胞株が構築された。
G418下で安定したベクター統合及び選択を持つSpyCas9(ヒトコドン最適化された)の構成的発現を有するHEK293細胞株を、下記の通り発達させた。ヒト最適化されたSpy Cas9は、pcDNA3.1発現ベクターに結紮され(Life Technologies)、リポフェクタミン2000(Life Technologies)を使用してHEK293に形質移入された。形質移入された細胞を、ネオマイシンを使用して選択的圧力下に置かれる前に2日間成長させた。7日後、限界希釈技法を使用して、細胞を単一コロニーに播種した。モノクローナルコロニーを、Cas9活性についてスクリーニングし、最高レベルの発現を有するクローンをその後の試験に使用した。Cas9の単一コピー統合事象は、液滴デジタルPCR(ddPCR)を使用して決定した。抗Cas9抗体を使用するウェスタンブロットは、低いが一定のCas9タンパク質の発現を示した。この細胞株は、以降「HEK-Cas9」と称される。
このHEK-Cas9細胞株を後次試験に用いた。逆形質移入フォーマットにおいて、抗HPRT1 crRNA:tracrRNA複合体を、リポフェクタミンRNAiMAX(Life Technologies)と混合し、HEK-Cas9細胞に形質移入した。96ウェルプレートフォーマットにおいて1ウェル当たり40,000個の細胞を用いて形質移入を行った。0.75μLの脂質試薬中30nMの最終濃度でRNAを導入した。細胞を37℃で48時間インキュベートした。QuickExtract溶液(Epicentre)を使用して、ゲノムDNAを単離した。ゲノムDNAは、KAPA HiFi DNAポリメラーゼ(Roche)及び関心対象のHPRT領域を標的とするプライマー(HPRT順方向プライマー:AAGAATGTTGTGATAAAAGGTGATGCT(配列番号28)、HPRT逆方向プライマー:ACACATCCATGGGACTTCTGCCTC(配列番号29))で増幅させた。PCR産物を溶解し、NEB緩衝液2(New England BioLabs)中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて2単位のT7エンドヌクレアーゼ1(T7EI、New England BioLabs)で1時間、37℃で消化した。消化された産物を、断片アナライザー(Advanced Analytics)上で可視化した。標的されたDNAの切断パーセントは、切断産物の平均モル濃度/(切断産物の平均モル濃度+未切断バンドのモル濃度)×100として計算した。
5′末端、3′末端、内部、またはそれらの組み合わせに欠失を有するtracrRNA(表2)を合成した。tracrRNAを、5′末端にHPRT1を標的とする19塩基プロトスペーサードメイン、及び3′末端に16塩基tracrRNA結合ドメインを有する、非修飾切断抗HPRT1 crRNA配列番号1(表1)と複合した。対合されたcrRNA:tracrRNA RNAオリゴヌクレオチドを、HEK-Cas9細胞に形質移入し、上記の通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、HPRT1遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。野生型化膿性連鎖球菌crRNA:tracrRNA複合体の表示を図1に示す(crRNA配列番号46をtracrRNA配列番号18と対合させる)。本実施例において試験されたtracrRNA内の欠失の相対位置を、配列アラインメントフォーマットで図3に示す。
この実施例は、哺乳類細胞における遺伝子編集の目的のために、tracrRNAが、5′末端及び3′末端の両方からの著しい欠失を寛容し、完全な機能性を保持し得ることを実証する。5′末端からの18塩基の欠失は、十分に寛容された。5′末端からの20塩基の欠失は、恐らくcrRNAの結合の低い親和性に起因して、低減した活性につながった。この低減した長さまたは更に短い長さは、Tm強化修飾を用いて短い二重鎖形成領域を安定させる場合に機能的である可能性がある。3′末端から最大10個の塩基の欠失は、十分に寛容された。追加の欠失は、活性の喪失をもたらした。ヘアピン要素またはヘアピン要素間の間隔を中断した内部欠失は、機能的でなかった。
要するに、この実施例は、野生型(WT、配列番号18)の89塩基長から67塩基長(配列番号2)、または62塩基長(配列番号38)、または61塩基長(配列番号39)へのtracrRNAの切断は、高い機能的活性を保持したことを実証する。この種の短縮されたtracrRNAの使用は、より安価かつWT89塩基RNAよりも容易に化学的方法により製造される。切断された種(配列番号2、配列番号38、及び配列番号39)の一部は、89塩基WT tracrRNAにわたって増加した機能的活性を示した。したがって、より安価かつ容易に化学的方法により製造されることに加えて、本発明の短縮されたtracrRNAは、改善された活性を示した。
実施例3
実施例1及び2は、それぞれ42塩基及び89塩基のWT長より短いcrRNA:tracrRNA複合体が、哺乳類遺伝子編集においてより高い機能的活性を示し得ることを実証した。本実施例は、これらのRNA種の長さの更なる最適化を示す。
実施例1及び2は、それぞれ42塩基及び89塩基のWT長より短いcrRNA:tracrRNA複合体が、哺乳類遺伝子編集においてより高い機能的活性を示し得ることを実証した。本実施例は、これらのRNA種の長さの更なる最適化を示す。
示される通り異なる長さを有する、一連のcrRNA及びtracrRNA(表3)を合成した。crRNAの3′末端、tracrRNAの5′末端、及び/またはtracrRNAの3′末端において切断を行った。crRNA及びtracrRNAを、表3に示される通り対合した。crRNAは全て、5′末端及び可変長3′末端でHPRT1を標的とする20塩基プロトスペーサードメイン(tracrRNA結合ドメイン)を用いた。本実施例において試験されたcrRNA及びtracrRNA配列のアラインメントを図4に示し、各機能的ドメインに対する切断の位置を明らかにする。
対合されたcrRNA:tracrRNA RNAオリゴヌクレオチドを、HEK-Cas9細胞に形質移入し、実施例2に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、HPRT1遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。結果を表3に示す。欠失の相対位置を、配列アラインメントフォーマットで図4に示す。
試験された化合物の全てが、HEK-Cas9細胞内のHPRT1遺伝子座におけるCRISPR/Cas編集を指向した。効率は、6%~57%まで広く異なっていた。最も有効なcrRNA+tracrRNAの組み合わせは、36塩基crRNA(配列番号48)と67mer tracrRNA(配列番号2)であった。切断され、最適化されたcrRNA:tracrRNA複合体の概略表示を図5に示す。この場合、crRNAのtracrRNA結合ドメインは、WT22塩基配列から16塩基に切断された(3′末端)。これは、tracrRNAの5′末端においてcrRNA結合ドメインにハイブリダイズする。tracrRNAは、5′末端で18塩基、及び3′末端で4塩基が切断されて活性67塩基産物を生成した。この対の場合、tracrRNAの5′末端によるcrRNAの3′末端のハイブリダイゼーション時に丸い末端が形成される。70塩基tracrRNA(配列番号51)と対合された42塩基(WT)crRNA(配列番号46)を含む他のバージョンもまた、高い活性を示した。
試験された最短crRNAは、34塩基長(配列番号49)であり、一般に長い変異型よりも低い活性を示した。この変異型とtracrRNAとの間で形成されたより短い二重鎖ドメインは、36塩基crRNA変異型と比較して低減された結合親和性(Tm)を有し、34塩基複合体は、37℃で不安定であった。2′OMe RNA、2′F RNA、またはLNA残基等の結合親和性(Tm)を増加させる化学修飾の使用は、この短い二重鎖ドメインの安定性を増加させ、改善された活性につながり、この設計の非常に短いcrRNAの使用を可能にする。Tm強化修飾の広範囲の使用は、crRNAにおいて、用いられる修飾残基の種類及び数に応じて、例えば、13塩基、または12塩基、または11塩基、または10塩基、または9塩基、または8塩基、またはそれより短い、更に短いtracrRNA結合ドメインの使用を可能にする。
実施例4
実施例1、2、及び3は、それぞれ42塩基及び89塩基のWT長より短いcrRNA:tracrRNA複合体が、哺乳類遺伝子編集においてより高い機能的活性を示し得ることを実証した。そのような実施例において、全ての切断は、RNAのユニバーサルドメインにおいて行われた。本実施例は、切断が、ガイドcrRNAの標的特異的プロトスペーサードメインに対して有する効果を試験する。
実施例1、2、及び3は、それぞれ42塩基及び89塩基のWT長より短いcrRNA:tracrRNA複合体が、哺乳類遺伝子編集においてより高い機能的活性を示し得ることを実証した。そのような実施例において、全ての切断は、RNAのユニバーサルドメインにおいて行われた。本実施例は、切断が、ガイドcrRNAの標的特異的プロトスペーサードメインに対して有する効果を試験する。
示される通り、20、19、18、または17塩基のプロトスペーサードメイン長を有する一連のcrRNA(表4)を合成した。16merユニバーサルtracrRNA結合配列を3′末端で使用し、crRNAの5′末端で切断を行った。crRNAを、非修飾67mer tracrRNA(配列番号2)と対合させた。crRNAは、ヒトHPRT1遺伝子の同じエキソン内で4つの異なる部位を標的とした。
対合されたcrRNA:tracrRNA RNAオリゴヌクレオチドを、HEK-Cas9細胞に形質移入し、実施例2に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、HPRT1遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。結果を表4に示す。
試験された4つの部位のうち、1つ(部位38087)は、4つのcrRNA全てに関して高い活性を示し、プロトスペーサードメインが短縮されても変化がなかった。部位38285は、20及び19塩基プロトスペーサーcrRNA(配列番号48及び1)に関して同様の有効性、18塩基バージョン(配列番号54)に関してわずかな減少、及び17塩基バージョン(配列番号55)に関して大幅な減少。部位38094は、20及び19塩基プロトスペーサーcrRNA(配列番号64及び65)に関して同様の有効性、18塩基バージョン(配列番号66)に関して中度の減少を示し、17塩基バージョン(配列番号67)に関して活性を示さなかった。部位38358は、20塩基バージョン(配列番号60)に関して良好な活性、19塩基バージョン(配列番号61)に関して低い活性、18塩基バージョン(配列番号62)に関して更に低い活性を示し、17塩基バージョン(配列番号63)に関して活性を示さなかった。
短縮された17塩基プロトスペーサーガイドドメインの使用は、野生型20塩基ドメインと比較して、望まれないオフターゲット事象の発生を低下させることができる(Fu et al.,Nature Biotechnol.,32:279,2014)。オンターゲット有効性が、配列構成特異的に異なること、及び20塩基及び19塩基プロトスペーサーガイドドメインが一般に有効であるが、18塩基プロトスペーサードメインが使用される場合に活性が減少し始め、17塩基プロトスペーサードメインが使用される場合に活性が著しく減少することを観察する。したがって、望ましいオンターゲット効率を維持するために、20及び19塩基標的特異的プロトスペーサーガイドドメインの使用が本明細書で用いられる。プロトスペーサーガイドドメインの著しい切断は、多くの場合、Cas9エンドヌクレアーゼによるDNA標的のオンターゲット切断を低下させる。Tmを強化する(標的DNA配列に対するcrRNAのプロトスペーサー標的特異的ドメインの結合親和性を増加させる)化学修飾の使用は、より短い配列の使用を可能にし得、それにより、17塩基プロトスペーサーガイドは、非修飾20塩基プロトスペーサーガイドドメインと同様のオンターゲット有効性を示し得る。
実施例5
本実施例は、切断されたcrRNA:tracrRNA複合体が、複数部位において改善された遺伝子編集活性を示すことを実証する。先の実施例は、ヒトHRPT1遺伝子内の単一部位での哺乳類細胞におけるCRISPR遺伝子編集のトリガーとしての、切断されたRNAの有効性を試験した。部位/配列特異的効果が存在し得る。本実施例は、ヒトHPRT1遺伝子のエキソン内の12部位において、本発明の切断された種の改善された性能を実証する。
本実施例は、切断されたcrRNA:tracrRNA複合体が、複数部位において改善された遺伝子編集活性を示すことを実証する。先の実施例は、ヒトHRPT1遺伝子内の単一部位での哺乳類細胞におけるCRISPR遺伝子編集のトリガーとしての、切断されたRNAの有効性を試験した。部位/配列特異的効果が存在し得る。本実施例は、ヒトHPRT1遺伝子のエキソン内の12部位において、本発明の切断された種の改善された性能を実証する。
3′末端に16merユニバーサルtracrRNA結合配列を持つヒトHPRT1遺伝子内の12部位に特異的な20塩基のプロトスペーサードメイン長を有する、一連のcrRNA(表5)を合成した。crRNAを、非修飾67mer tracrRNA(配列番号2)と対合させた。WT長さcrRNA:tracrRNA複合体を使用して、同じ12部位を試験し、crRNAは、WT89mer tracrRNA(配列番号18)と複合された3′末端に22merユニバーサルtracrRNA結合配列を持つ20塩基プロトスペーサーガイドを含んでいた。
対合されたcrRNA:tracrRNA RNAオリゴヌクレオチドを、HEK-Cas9細胞に形質移入し、実施例2に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、HPRT1遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。結果を表5に示す。
HEK-Cas9細胞におけるCRISPR媒介型遺伝子編集の相対効率は、配列構成により異なっていた。しかしながら、全ての場合において、より短い最適化されたRNAガイド(36mer crRNA及び67mer tracrRNA)は、WT RNA(42mer crRNA及び89mer tracrRNA)より高い効率を示した。本発明の短縮された、最適化されたガイドRNAの使用は、WT RNAに対して標的されたDNAのCas9切断を改善し、遺伝子編集率を改善する。
実施例6
実施例1は、インビトロ生化学標的DNA切断アッセイにおいて、Cas9で機能化された化学修飾パターンについて説明した。この実施例は、哺乳類細胞内でSpy Cas9ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、化学修飾されたtracrRNAの機能を実証する。最適な修飾パターンは、インビトロ用途とインビボ用途との間で異なる。
実施例1は、インビトロ生化学標的DNA切断アッセイにおいて、Cas9で機能化された化学修飾パターンについて説明した。この実施例は、哺乳類細胞内でSpy Cas9ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、化学修飾されたtracrRNAの機能を実証する。最適な修飾パターンは、インビトロ用途とインビボ用途との間で異なる。
リボース修飾2′OMe RNA及びLNA;末端修飾基プロパンジオールスペーサー及びナフチル-アゾ修飾因子(N,N-ジエチル-4-(4-ニトロナフタレン-1-イルアゾ)-フェニルアミン、または「ZEN」);及びホスホロチオエート修飾を持つ選択ヌクレオチド間結合を含む、様々な化学修飾を有する一連のtracrRNA(表6)を合成した。ナフチル-アゾ修飾された構造、及びエキソヌクレアーゼ攻撃を遮断するための末端基として使用するためのナフチル-アゾ修飾因子及びプロパンジオール修飾因子の使用については、Lennox et al.,Molecular Therapy Nucleic Acids 2:e117 2013を参照されたい。表6に列挙されるtracrRNAを、5′末端にHPRT1を標的とする19塩基プロトスペーサードメイン、及び3′末端に16塩基tracrRNA結合ドメインを有する、非修飾切断抗HPRT1 crRNA配列番号1(表1)と複合した。対合されたcrRNA:tracrRNA RNAオリゴヌクレオチドを、HEK-Cas9細胞に形質移入し、上記の通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、HPRT1遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。
修飾は、通常、非修飾オリゴヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在に起因して、合成核酸が細胞内環境で良好に機能するために必須である。オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ耐性を付与する、広範囲の修飾が説明されてきた。所与の適用に功を奏する修飾の正確な組み合わせ及び用いる順序は、配列構成及び生物学的機能に必要なタンパク質相互作用の性質により異なり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド(RNase H1と相互作用する)及びsiRNA(DICER、AGO2、及び他のタンパク質と相互作用する)の化学修飾に関する広範囲の先行研究が行われてきた。化学修飾は、CRISPR crRNA:tracrRNA複合体の機能を改善することが予想される。しかしながら、修飾の種類及び/または修飾のパターンがCas9との合成RNAの機能的複合と適応するかを予測することは不可能である。本発明は、哺乳類細胞においてCas9媒介型遺伝子編集を指向する高レベルの機能を保持する、tracrRNAの最小、中度、及び広範囲の化学修飾パターンを定義する。
表6の結果は、広範囲の修飾が、tracrRNAの5′及び3′末端ドメイン全体で寛容されることを実証する。tracrRNAの内部ドメインの修飾は、恐らく折り畳まれたRNAの変化した構造及び/または2′OMe修飾による重要なRNA残基の2′-OHとのタンパク質接点の遮断に起因して、低減された活性を示した。例えば、化合物配列番号100は、39/67残基を2′OMe RNAで修飾させ(58%)、非修飾配列と比較して完全な活性を保持する。配列番号134は、46/67残基を2′OMe RNAで修飾させ(69%)、非修飾配列と比較してほぼ完全な活性を保持する(図6)。配列番号134は、tracrRNAの切断された67mer変異型である。配列番号134をモデルとして使用し、2′OMe RNAによる5′ドメイン内の11個の連続残基の修飾は、活性の喪失なく寛容された。2′OMe RNAによる3′ドメイン内の35個の連続残基の修飾は、活性の喪失なく寛容された。3′ドメインに存在する2つのヘアピン構造は、これらの特徴のいずれかの欠失が活性の喪失をもたらすため、機能に必須であるが(実施例2、図3)、これらのドメインの両方が、機能を低下させることなく2′OMe RNAにより完全に修飾され得ることは記録に値する。配列番号134及び100の両方が、5′末端及び3′末端にホスホロチオエート(PS)修飾されたヌクレオチド間結合も有し、これがエキソヌクレアーゼ攻撃に対して追加の保護を提供することに留意されたい。
修飾された場合に活性の大幅な低減または完全な喪失につながる特定の残基が特定された。67塩基tracrRNA(例えば、配列番号134)を基準として使用し、残基U12、A15、G26、U27、G30、U31、及びU32における天然RNAの2′OMe RNAの配列置換の5′末端から開始することは、活性の実質的な喪失につながった(図6)。修飾された場合に、小さいが著しい活性の低減につながる特定の残基も特定された。67塩基tracrRNA(例えば、配列番号134)を基準として使用し、残基U13、U18、C23、U24、及びC28における天然RNAの2′OMe RNAの配列置換の5′末端から開始することは、活性の低減につながった(図6)。この試験は、2′OMe RNAを使用して行った。これらの位置における2′F、LNA、DNA等の他の修飾の使用は、より良好に寛容され得る。配列番号134における非修飾RNAの中央21残基ドメインを、2′-F RNAで完全に(配列番号141)または部分的に(配列番号142及び143)修飾した。これらの変異型は機能的でなかった。配列番号134における非修飾RNAの中央21残基ドメインを、DNAで完全に(配列番号138)または部分的に(配列番号139及び140)修飾した。これらの変異型は機能的でなかった。このドメイン内の単離された残基の修飾は機能し得るが、このドメイン内の修飾の大きな連続ブロックが、tracrRNAの活性を低減する。
tracrRNAの中央ドメイン内で2′OMe RNAを使用して、どの個々の残基が修飾され得るかを更に調査するために、単一塩基修飾2′OMe RNA「ウォーク」を行った(配列番号144~162)。このシリーズ内で、残基A14、A19、A20、G21、G22、A25、及びC29としての修飾は、活性の喪失を示さず、修飾の候補である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全なPS修飾を使用して作製され、全てのヌクレオチド結合がホスホロチオエート修飾される。タンパク質エフェクター分子RNase H1(ASO指向型mRNA分解を媒介する)が、機能的基質/酵素複合体を形成する場合に、ASO内のPS修飾を寛容するため、この広範なレベルの修飾が可能である。一方で、siRNAは、完全PS修飾を寛容せず、広範なPS修飾は、エフェクタータンパク質AGO2(siRNA指向型mRNA分解を媒介する)との生産的相互作用を妨げる。内部RNAループ内のtracrRNAの広範囲のPS修飾は、Cas9との機能的相互作用を妨げる(配列番号133、29PS修飾)。限定されたPS末端修飾は、活性の喪失なく行われ得る(配列番号98及び101、各末端の2~3PP結合)。広範囲でないPS修飾は、中央ドメイン内で寛容され得る。特に、RNase切断マッピング(一連の血清または細胞抽出希釈におけるtracrRNAのインキュベーションを使用して、RNase攻撃に最も感受性のある部位を見出す)を使用して、1つのみまたはいくつかの結合のPS修飾が機能を妨げることなくRNAを安定させ得る重要な部位を特定することができる。
PS修飾が化学毒性に寄与する適用が存在する。この場合、エキソヌクレアーゼ攻撃を遮断する他の方法の使用が望ましい。選択肢には、反転dT等の末端修飾因子、またはdスペーサー、C3スペーサー(プロパンジオール)、ZEN(ナフチル-アゾ修飾因子)等の塩基脱落基が含まれる。かかる末端修飾基の配置は、末端PSヌクレオチド間結合の必要性を排除し得る。
実施例7
実施例1は、インビトロ生化学標的DNA切断アッセイにおいて、Cas9で機能化された化学修飾パターンについて説明した。この実施例は、哺乳類細胞内でSpy Cas9ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、化学修飾されたcrRNAの機能を実証する。最適な修飾パターンは、インビトロ用途とインビボ用途との間で異なる。
実施例1は、インビトロ生化学標的DNA切断アッセイにおいて、Cas9で機能化された化学修飾パターンについて説明した。この実施例は、哺乳類細胞内でSpy Cas9ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、化学修飾されたcrRNAの機能を実証する。最適な修飾パターンは、インビトロ用途とインビボ用途との間で異なる。
リボース修飾2′OMe RNA、2′F、及びLNA;末端修飾基プロパンジオールスペーサー及びナフチル-アゾ修飾因子(N,N-ジエチル-4-(4-ニトロナフタレン-1-イルアゾ)-フェニルアミン、または「ZEN」)、及び反転dT残基;ならびにホスホロチオエート修飾を持つ選択ヌクレオチド間結合を含む、様々な化学修飾を有する一連のcrRNA(表7)を合成した。ナフチル-アゾ修飾された構造、及びエキソヌクレアーゼ攻撃を遮断するための末端基として使用するためのナフチル-アゾ修飾因子及びプロパンジオール修飾因子の使用については、Lennox et al.,Molecular Therapy Nucleic Acids 2:e117 2013を参照されたい。crRNAは、5′末端でHPRT1を標的とする19塩基プロトスペーサードメイン(配列番号1、9、10、14~16、22~24、163~173)または3′末端に16塩基tracrRNA結合ドメインを持つ同じ部位を標的とする20塩基プロトスペーサードメイン(配列番号48、174~237)のいずれかを有していた。表7に列挙されるcrRNAを、非修飾切断(67塩基)tracrRNA配列番号2(表1)または化学修飾された切断(67塩基)tracrRNA配列番号100(表6)と複合した。2つのtracrRNAの使用は、修飾されたtracrRNAと対合された場合、化学修飾されたcrRNAの機能が異なるかどうかの決定を可能にする。対合されたcrRNA:tracrRNA RNAオリゴヌクレオチドを、HEK-Cas9細胞に形質移入し、前述の通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、HPRT1遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。
一部の種類の化学修飾は、通常、非修飾オリゴヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在に起因して、合成核酸が細胞内環境で良好に機能するために必須である。オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ耐性を付与する、広範囲の修飾が説明されてきた。所与の適用に功を奏する修飾の正確な組み合わせ及び用いる順序は、配列構成、及び生物学的機能に必要なタンパク質相互作用の性質により異なり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド(RNase H1と相互作用する)及びsiRNA(DICER、AGO2、及び他のタンパク質と相互作用する)の化学修飾に関する広範囲の先行研究が行われてきた。化学修飾は、CRISPR crRNA:tracrRNA複合体の機能を改善することが予想される。しかしながら、修飾の種類及び/または修飾のパターンが、RNAの、Cas9との機能的関連付けと適応するかを予測することは不可能である。本発明は、哺乳類細胞においてCas9媒介型遺伝子編集を指向する高レベルの機能を保持する、crRNAの最小、中度、及び広範囲の化学修飾パターンを定義する。実施例7における調査は、ヒトHPRT1遺伝子内の単一部位を標的として行った。良好に機能するcrRNAの20塩基5′末端プロトスペーサーガイドドメインの修飾パターンが、配列構成により異なり得ることに留意されたい。しかしながら、本明細書で定義される、良好に機能する3′末端tracrRNA結合ドメインの修飾パターンは、異なる部位が標的とされる場合に隣接したプロトスペーサードメインの配列が変化すると影響を受けるため、ここで示される3′ドメイン修飾は、「ユニバーサル」となる可能性がある。
表7の結果は、広範囲の修飾が、crRNAの5′及び3′末端全体で寛容されることを実証する。crRNAの内部ドメイン内のある特定の選択位置の修飾は、恐らく折り畳まれたRNAの変化した構造及び/または2′OMe修飾による重要なRNA残基の2′-OHとのタンパク質接点の遮断に起因して、低減された活性または活性の全体遮断につながる。例えば、化合物配列番号204は、21/36残基を2′OMe RNAで修飾させ(58%)、非修飾配列と比較して完全な活性を保持する。化合物配列番号239は、2′OMe RNAで修飾された30/36残基を有し(83%)、非修飾配列と比較して完全な活性を保持する。これらの化合物の両方は、5′末端及び3′末端に3つのホスホロチオエート(PS)修飾されたヌクレオチド間結合も有し、これがエキソヌクレアーゼ攻撃に対して追加の保護を提供する。対照的に、配列番号165は、4/36残基(11%)のみを2′OMe RNAで修飾させるが、活性の全喪失を有する。
配列の大きなブロックは、crRNAの5′末端及び3′末端において2′OMe修飾に寛容であったが、分子の中央部分におけるある特定の残基の修飾は、不活化につながった。crRNAの中央ドメイン内で2′OMe RNAを使用して、どの個々の残基が修飾され得るかを更に調査するために、単一塩基修飾2′OMe RNA「ウォーク」を行った(配列番号272~286)。活性の大幅な低減または完全な喪失につながる特定の残基(crRNA内の位置)が特定された。36塩基crRNA配列番号239をモデルとして使用し、配列の5′末端から番号を付けて、残基U15及びU16の天然RNAの2′OMe RNAの置換は、活性の実質的な喪失につながり、残基U19は、中度の活性の喪失につながった(図7)。これら3つの部位は、標的特異的プロトスペーサーガイドドメイン内にあるため、配列は標的により異なる(残基15、16、及び19、図7)。ある特定の配列構成において、これらの部位は、修飾に寛容となることが可能である。ユニバーサルtracrRNA結合ドメイン(残基21~36)内で、残基U22、U23、及びU24の天然RNAに対する2′OMe RNAの置換は、実質的な活性の喪失につながった。このドメインが配列構成により変化しないとすると、これらの部位は、標的配列が変化するにつれて修飾寛容が異ならない可能性がある。20塩基標的特異的プロトスペーサーガイドドメイン内の修飾の配列特異的効果は、実施例10において更に詳細に試験される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全なPS修飾を用いて作製され、全てのヌクレオチド結合がホスホロチオエート修飾される。タンパク質エフェクター分子RNase H1が、機能的基質/酵素複合体を形成する場合に、ASO内のPS修飾を寛容するため、この広範囲のレベルの修飾が可能である。一方で、siRNAは、完全PS修飾を寛容せず、広範囲のPS修飾は、エフェクタータンパク質AGO2との生産的相互作用を妨げる。crRNAの限定されたPS末端修飾は、活性の喪失なく行われ得る(配列番号177、178、239等は、各末端で3PS結合を有する)。末端修飾は、これがエキソヌクレアーゼ攻撃からの追加の保護を加えるため望ましい。選択内部部位のPS修飾が寛容されてもよく、エンドヌクレアーゼ攻撃からの追加の保護を提供し得る。配列番号264を塩基修飾パターンとして使用し、内部結合を、tracrRNA結合ドメイン(配列番号265)内、プロトスペーサーガイドドメインの3′末端内(種領域)(配列番号266)、または両方の領域(配列番号267)でPS修飾した。増加レベルのPS修飾は、低減された機能的活性につながり、配列番号267は、修飾の少ない配列番号264変異型の活性の約50%を有する。配列番号267は、修飾された35個のヌクレオチド間結合のうちの21個を有し、ヌクレアーゼ曝露に対して安定となる。高ヌクレアーゼ環境への曝露が必要とされる場合(研究または治療適用のための直接IV投与等)、この高度に修飾された変異型は、実際に修飾の少ない変異型よりも高い活性を示し、より速やかに分解される。
PS修飾が化学毒性に寄与する実験的設定が存在する。この場合、エキソヌクレアーゼ攻撃を遮断する他の方法の使用が望ましい。crRNAは、エキソヌクレアーゼ攻撃を遮断するように5′末端及び3′末端のいずれかまたは両方に配置されたC3スペーサー(プロパンジオール修飾因子)またはZEN(ナフチル-アゾ修飾因子)を有し、PS修飾の必要性を省く。この戦略は、PS末端ブロック修飾を排除するために用いられ得る(配列番号179~186を参照されたい)。この戦略を使用して、より高度に修飾されたcrRNA変異型のPS含有量を低減することができる。配列番号271は、配列番号267と同じパターンでPS修飾された内部プロトスペーサードメイン及びtracrRNA結合ドメインを有するが、(21個ではなく)15個のPSヌクレオチド間結合のみを用い、改善された活性を示す。したがって、内部PS修飾を持つ非塩基末端ブロックの組み合わせを使用して、高い活性を維持しながらヌクレアーゼを増加させることができる。
実施例8
以下の実施例は、本発明の修飾されたCRISPR crRNA及びtracrRNAの改善された能力を実証する。実施例2~7は、crRNA:tracrRNA複合体の、30nM濃度でのヒトHEK-Cas9細胞への形質移入を用いた。実験的試験は、この用量が、用量応答曲線の上肩部を表し、それにより、高用量のRNAを使用することが、遺伝子編集効率を改善しなかったが、低用量の使用が低い遺伝子編集効率をもたらしたことを以前に示していた。それらの測定は、非修飾RNAを使用して行った。本実施例は、非修飾RNAと比較して、本発明の新たな最適化された化学修飾RNAの用量応答を再審査し、化学修飾(すなわち、ヌクレアーゼ安定化)が、低用量で使用され得る、より強力な化合物をもたらすことを実証する。
以下の実施例は、本発明の修飾されたCRISPR crRNA及びtracrRNAの改善された能力を実証する。実施例2~7は、crRNA:tracrRNA複合体の、30nM濃度でのヒトHEK-Cas9細胞への形質移入を用いた。実験的試験は、この用量が、用量応答曲線の上肩部を表し、それにより、高用量のRNAを使用することが、遺伝子編集効率を改善しなかったが、低用量の使用が低い遺伝子編集効率をもたらしたことを以前に示していた。それらの測定は、非修飾RNAを使用して行った。本実施例は、非修飾RNAと比較して、本発明の新たな最適化された化学修飾RNAの用量応答を再審査し、化学修飾(すなわち、ヌクレアーゼ安定化)が、低用量で使用され得る、より強力な化合物をもたらすことを実証する。
実施例5は、本発明の切断されたガイドRNAが、ヒトHPRT1遺伝子内の12部位においてWT RNAよりも優れて機能したことを実証した。これらの部位のうちの4つ(38087、38231、38133、及び38285)を、本実施例において、非修飾と修飾RNAとの比較のために選択した。非修飾crRNAを、非修飾tracrRNA(配列番号2)と1:1モル比で対合させた。非修飾crRNAを、修飾されたtracrRNA(配列番号100)と1:1モル比で対合させた。修飾されたcrRNAを、修飾されたtracrRNA(配列番号100)と1:1モル比で対合させた。配列を表8に示す。RNAを、前述のとおり、30nM、10nM、及び3nM濃度でHEK-Cas9細胞に形質移入した。細胞を37℃で48時間インキュベートし、次いで、DNAに関して処理し、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ活性におけるHPRT1遺伝子座での切断率を比較することにより、遺伝子編集活性の証拠について試験し、産物の定量的測定は、前述の通り、断片アナライザーを使用して行った。結果を表8に示す。
一般に、crRNA及びtracrRNAの修飾は、RNAが過剰に存在する場合、RNAが高用量で形質移入されると遺伝子編集効率にわずかな影響を及ぼした。より低い用量で、修飾された試薬は、改善された能力を示し、場合によっては顕著に能力を改善した。改善の程度は、部位により異なっていた。非常に有能な部位38087は、試験された全てのcrRNA/tracrRNA変異型により30nM及び10nM用量で非常に効率的な遺伝子編集を示し、3nMの修飾されたtracrRNAの使用(crRNAのいずれかと共に)、改善された活性を示した。38231等の低能力部位は、修飾されたRNAを使用して試験された最高用量(30nM)においても改善された遺伝子編集効率を示した。tracrRNA単独の修飾は、単独で利得を示したが、crRNA及びtracrRNAの両方が修飾された場合に最も優れた利得が認識された。図8は、HPRT1部位38285に特異的な修飾tracrRNA(配列番号100)と対合された1つの有効な修飾crRNA(配列番号178)の概略を示す。図9もまた、HPRT1部位38285に特異的な修飾tracrRNA(配列番号134)と対合された高度に機能的なcrRNA(配列番号239)である、より高度に修飾された対の概略を示す。
本実施例は、crRNA:tracrRNA複合体の、HEK-Cas9細胞への形質移入を用い、Cas9タンパク質が構成的に発現される。したがって、形質移入されたRNAは、Cas9タンパク質に即時結合することができ、ヌクレアーゼによる細胞質中の分解の危険性を最小限に抑える。crRNA及び/またはtracrRNAの化学修飾の利得は、Cas9タンパク質が作製されている間、形質移入されたRNAが細胞ヌクレアーゼへの曝露から生き残らなければならない場合により優れていることが期待される。Cas9 mRNAまたはCas9発現ベクターが標的RNAと共形質移入されるプロトコルを使用する場合に起こり、それによりCas9は、既に細胞内で発現しないようにすることが期待される。RNAは、血清(IV投与後)及び細胞性細胞質ヌクレアーゼに存在する両方のヌクレアーゼに曝露され得る場合、高度に修飾されたRNAを使用する利得は、インビボ適用(医学的治療等)に関して最大となるであろう。
実施例9
実施例2~8は、Cas9を構成的に発現する哺乳類細胞内でCas9媒介ゲノム編集を誘起する、切断及び/または化学修飾されたCRISPR crRNA及び/またはtracrRNAの活性を実証する。本実施例は、本発明の切断された修飾RNA組成物は、Cas9タンパク質に結合することができ、この複合体は、ヒト細胞に形質移入され得ること、更にリボヌクレアタンパク質(RNA)複合体の形質移入が、非常に効率的なゲノム編集を誘起するのに十分であることを実証する。
実施例2~8は、Cas9を構成的に発現する哺乳類細胞内でCas9媒介ゲノム編集を誘起する、切断及び/または化学修飾されたCRISPR crRNA及び/またはtracrRNAの活性を実証する。本実施例は、本発明の切断された修飾RNA組成物は、Cas9タンパク質に結合することができ、この複合体は、ヒト細胞に形質移入され得ること、更にリボヌクレアタンパク質(RNA)複合体の形質移入が、非常に効率的なゲノム編集を誘起するのに十分であることを実証する。
ヒトHPRT1部位38285に特異的な試薬を、本実施例に用いられた。非修飾crRNAを、非修飾tracrRNAと1:1モル比で対合させた。修飾crRNAを、修飾tracrRNAと1:1モル比で対合させた。修飾crRNAを、修飾tracrRNAと1:1モル比で対合させた。配列を表9に示す。増加量のRNAiMAX脂質形質移入試薬を使用して(1.2μL、HEK-Cas9細胞内の30nM RNA単独形質移入の場合、96ウェルフォーマットで100μL形質移入当たりに使用される0.75μL量にわたって増加した)、Cas9タンパク質(Caribou Biosciences)のcrRNA:tracrRNAとの1:1複合体を10nM濃度で用いたことを除いて上記の通り、RNAを非修飾HEK293細胞に形質移入した。細胞を37℃で48時間インキュベートし、次いで、DNAに関して処理し、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ活性におけるHPRT1遺伝子座での切断率を比較することにより、遺伝子編集活性の証拠について試験し、産物の定量的測定は、前述の通り、断片アナライザーを使用して行った。結果を表9に示す。
3つのCRISPR RNA複合体の全ては、哺乳類ゲノム編集のためのRNP形質移入プロトコルにおいて良好に機能した。非修飾crRNA+非修飾tracrRNA対(配列番号48及び2)ならびに非修飾crRNA+修飾tracrRNA対(配列番号48及び100)は、HEK-Cas9プロトコルよりもRNPプロトコルにおいて、10nM用量で2.5倍良好に機能し、細胞質または核内のCas9タンパク質との形質移入と結果として起こる複合との間で悪化を起こす修飾RNAが少ないことと一致する。故に、非修飾RNAには高用量が必要とされ、一部の設定において、非修飾RNAがいかなるゲノム編集活性も指向できない可能性がある。一方、修飾crRNA+修飾tracrRNA(配列番号178及び100)は、両方のプロトコルにおいて高い効率で機能した。
本発明の修飾された切断CRISPR RNAは、直接Cas9 RNP形質移入方法により良好に機能する。
実施例10
実施例6及び7において行われた化学修飾最適化試験は、様々な修飾パターンを有するtracrRNAと対合された様々な修飾パターンを有するcrRNAの活性を試験した。tracrRNAは、ユニバーサルであり、同じ配列を全ての標的部位で用いる。tracrRNAの様々な修飾パターンの性能は、異なる標的部位間で同様であることが予想される。しかしながら、crRNAは、異なる標的部位間で配列が異なる。実施例7及び8で試験された最適化バージョンにおいて、crRNAの5′-20塩基は、標的特異的であり(すなわち、「プロトスペーサードメイン」)、3′-16塩基はユニバーサルである(すなわち、「tracrRNA結合ドメイン」)。tracrRNAのように、crRNAのユニバーサル16塩基3′ドメイン内の様々な修飾パターンの性能は、全ての標的部位において同様であると予想される。しかしながら、異なる修飾パターンの性能は、5′-20塩基標的特異的ドメイン内に存在する配列構成によって影響され得る可能性がある。
実施例6及び7において行われた化学修飾最適化試験は、様々な修飾パターンを有するtracrRNAと対合された様々な修飾パターンを有するcrRNAの活性を試験した。tracrRNAは、ユニバーサルであり、同じ配列を全ての標的部位で用いる。tracrRNAの様々な修飾パターンの性能は、異なる標的部位間で同様であることが予想される。しかしながら、crRNAは、異なる標的部位間で配列が異なる。実施例7及び8で試験された最適化バージョンにおいて、crRNAの5′-20塩基は、標的特異的であり(すなわち、「プロトスペーサードメイン」)、3′-16塩基はユニバーサルである(すなわち、「tracrRNA結合ドメイン」)。tracrRNAのように、crRNAのユニバーサル16塩基3′ドメイン内の様々な修飾パターンの性能は、全ての標的部位において同様であると予想される。しかしながら、異なる修飾パターンの性能は、5′-20塩基標的特異的ドメイン内に存在する配列構成によって影響され得る可能性がある。
低分子干渉RNA(siRNA)に有効な修飾パターンは、配列環境によって影響されることは十分に確立されている(Behlke,Oligonucleotides 18:305-320,2008)。siRNAの場合、ある特定の「限定修飾」パターンは、全ての部位に適用され得るが、「重い修飾」の場合、どのパターンが所与の配列に対して機能的であり、経験的試験が必須であるかを予測することは不可能である。本実施例は、配列構成がcrRNAに及ぼす効果を試験し、5′-20塩基標的特異的ドメイン内の異なる修飾パターンを異なる部位で試験する。
実施例6及び7における修飾試験は、ヒトHPRT1遺伝子において単一crRNA PAMを用いた。本試験は、異なる修飾パターンの機能的性能を比較して、以前に調べた部位を含む、ヒトHPRT1遺伝子内の12部位を調べ、全ての部位において良好な結果で用いられ得る単一修飾パターンを確立する。これら12部位に関する他の試験については、実施例5を参照されたい。
3′末端に16merユニバーサルtracrRNA結合配列を持つヒトHPRT1遺伝子内の12部位に特異的な20塩基のプロトスペーサードメイン長を有する、一連のcrRNA(表10)を合成した。crRNAは、リボース修飾2′OMe RNA、末端修飾基プロパンジオールスペーサー及びナフチル-アゾ修飾因子(N,N-ジエチル-4-(4-ニトロナフタレン-1-イルアゾ)-フェニルアミン、または「ZEN」)、反転dT残基;及びホスホロチオエート修飾を持つ選択ヌクレオチド間結合を含む、様々な化学修飾を使用して作製した。用いられた異なる修飾の概略表示を図10に示す。
crRNAを、高度に修飾された67mer tracrRNA(配列番号100)と対合された。対合されたcrRNA:tracrRNA RNAオリゴヌクレオチドを、HEK-Cas9細胞に形質移入し、実施例2に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、HPRT1遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。結果を表10及び図11に示す。
修飾されたcrRNAは、ユニバーサルであり、tracrRNAに結合する16塩基3′末端ドメイン内で固定された修飾パターンを用いた。異なる修飾パターンを、標的特異的である(すなわち、配列が標的部位により異なる)5′末端ドメイン内で試験/比較した。試験設定は、5′末端で開始して3′末端に向かって進む0、3、4、6、8、10、12、13、または14個の連続2′OMe RNA残基を有する変異型を含んでいた。これらの修飾パターンは、crRNAの機能的性能を低減することが以前に実証された位置を回避した(実施例7)。非塩基修飾因子末端基(C3スペーサー、またはZEN)の使用も(追加の修飾なしに)試験した。この調査において、機能的活性を12部位全てにわたって比較した場合、試験された全ての部位は、5′末端における0~10個のRNA残基が2′OMe RNA残基で置換された場合に完全な活性を示した。1/12部位のみが、修飾された12残基により活性のわずかな低減を示したが、13残基が修飾された場合に3/12部位が活性の低減を示し、14残基が修飾された場合に4/12部位が活性の低減を示した。末端修飾因子(C3、ZEN)は、全ての部位において完全な活性を示した。
試験された全ての部位で完全な活性を示した最高レベルのcrRNA修飾は、修飾パターン6及び7を含んでいた(図10)。これは、それぞれ2′OMe RNAで修飾されたcrRNA内の塩基の61%及び67%を表す。
本実施例におけるデータはまた、個々の部位が最高レベルで修飾され、能力を保持し得ることを実証する。例えば、試験された12部位のうちの8部位は、修飾された残基の72%を有する修飾パターン8を使用して、完全な活性を示した。更に、実施例7は、HPRT1のcrRNA標的部位38285(配列番号239)が、完全な活性を有し、修飾された30/36残基を有する(83%、6個の非修飾RNA残基のみが残る)。修飾パターン6または修飾パターン7等の塩基修飾パターンを、試験の開始点として使用し、活性が喪失する前に特定の配列が修飾され得る程度を経験的に確認することができる。図12は、修飾パターン6 crRNAが高度に修飾されたtracrRNA配列番号134と対合される概略を示す。
実施例11
本明細書における実施例は、化膿性連鎖球菌由来のCas9エンドヌクレアーゼを用いる。S.py.Cas9(SpyCas9)の天然アミノ酸配列を以下に示す(配列番号407)。
本明細書における実施例は、化膿性連鎖球菌由来のCas9エンドヌクレアーゼを用いる。S.py.Cas9(SpyCas9)の天然アミノ酸配列を以下に示す(配列番号407)。
天然Cas9 DNA配列を、大腸菌内の発現のためにコドン最適化され、哺乳類核局在化(ヌクレアーゼ局在化シグナル)、及びタンパク質精製補助(Hisタグ)のために添加された要素を有していた。組み換えタンパク質の最終アミノ酸配列を示す(配列番号408)。大腸菌内で組み換えタンパク質を発現させるために用いられるDNA配列を示す(配列番号409)。
天然Cas9 DNA配列を、ヒト細胞内の発現のためにコドン最適化し、追加される抗体認識(V5エピトープ)及び哺乳類核局在化(ヌクレアーゼ局在化シグナル、NLS)のために要素を追加させた。最終アミノ酸配列(配列番号410)、続いてDNA配列(配列番号411)を示す。
天然S.py Cas9 DNA配列コドンを、ヒト細胞内の発現のために最適化し、T7 RNAポリメラーゼ発現カセット(配列番号412)として組み立てた。この配列は、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、V5エピトープタグ、核局在化シグナル、コドン最適化されたCas9配列、第2の核局在化シグナル、及びポリアデニル化シグナルを持つBGH(ウシ成長ホルモン)遺伝子3′UTR要素を含む。この発現カセットから作製されたmRNAの配列を示す(配列番号413)。
S.py.Cas9アミノ酸配列(配列番号407)。
実施例12
以下の実施例は、非修飾IVT sgRNAと比較した場合に、本発明の切断され、化学修飾されたcrRNA:tracrRNA複合体により哺乳類細胞内の自然免疫系の低減された刺激を実証する。
以下の実施例は、非修飾IVT sgRNAと比較した場合に、本発明の切断され、化学修飾されたcrRNA:tracrRNA複合体により哺乳類細胞内の自然免疫系の低減された刺激を実証する。
哺乳類細胞は、抗ウイルス免疫の一部として外来RNAを特定し、応答することが意図される種々の受容体を有する。これには、TLR-3、TLR-7、TLR8、RIG-I、MDA5、OAS、PKR等の受容体が含まれる。広義には、短いかまたは哺乳類細胞に存在する化学修飾を含有するRNA(2′OMe RNA等)は、検出を回避するか、または長い非修飾RNAより低い刺激性である。本実施例は、商用IVT sgRNA(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)を用いて、哺乳類HEK293細胞が、本発明の切断された非修飾または切断された修飾crRNA:tracrRNA複合体で形質移入される場合の、2つの免疫応答関連遺伝子(IFIT1及びIFITM1)の刺激のレベルを比較する。
ヒトHPRT1部位38285に特異的なCRISPRガイドRNAを用いた。配列を以下の表11に示す。非修飾crRNA:tracrRNA複合体(配列番号48及び2)、修飾されたcrRNA:tracrRNA複合体(配列番号178及び100)、ならびにsgRNA(配列番号414)を、上記実施例2に概説される通り、HEK-Cas9細胞に30nM濃度で形質移入した。SV96全RNA単離キット(Promega,Madison,WI)を使用して、形質移入の24時間後にRNAを調製した。ランダム六量体及びオリゴ-dTプライミングの両方を使用し、製造元の指示に従って、SuperScript(商標)-II逆転写酵素(Invitrogen,Carlsbad,CA)と共に150ngの全RNAを使用することによりcDNAを合成した。形質移入実験は、全て最低3回行った。
Immolase(商標)DNAポリメラーゼ(Bioline,Randolph,MA)、200nMプライマー、及び200nMプローブを用い、10μL反応当たり10ngのcDNAを使用して、定量的リアルタイムPCRを行った。用いられたサイクル条件は、以下の通りであった。95℃で10分間、続いて95℃で15秒間及び60℃で1分間の2ステップpCRを40サイクル。ABI Prism(商標)7900配列検出器(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)を使用して、PCR及び蛍光測定を行った。全ての反応は、2色多重化を使用して3回行った。発現データを、2つの内在性コントロール遺伝子の平均に対して正規化した。コピー数標準を線形化し、全てのアッセイに関して増幅産物をクローン化した。不明なものは、標準に対して外挿法によって推定し、絶対定量測定を確立した。ハウスキーピング内在性コントロール正規化アッセイは、HPRT1(プライマー及びプローブ配列番号415~417)及びSFRS9(プライマー及びプローブ配列番号418~420)であった。免疫活性化経路アッセイは、IFITM1(プライマー及びプローブ配列番号421~423)、IFIT1(プライマー及びプローブ配列番号424~426)であった。ベースラインとして非形質移入細胞を使用して、これらの結果を正規化し、図13に示す。
2化合物IIは、配列番号420-(ZEN)-配列番号442という式を有するオリゴヌクレオチドである。
3化合物IIIは、配列番号423-(ZEN)-配列番号443という式を有するオリゴヌクレオチドである。
4化合物IVは、配列番号426-(ZEN)-配列番号444という式を有するオリゴヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチド配列の5′~3′を示す。大文字=DNA;小文字=RNA;下線=2′-O-メチルRNA;*=ホスホロチオエートヌクレオチド間結合;ppp=三リン酸塩;ZEN=ナフチル-アゾ修飾因子、暗色失活剤;FAM=6-カルボキシフルオレセイン;HEX=ヘキサクロロフルオレセイン。
非修飾または化学修飾され、切断されたcrRNA:tracrRNA複合体による処置は、ベースラインを超えるIFIT1またはIFITM1発現の検出可能な増加につながらなかった。対照的に、より長いIVT sgRNAによる処置は、45倍のIFITM1の誘導及び220倍のIFIT1の誘導につながった。故に、sgRNAを使用して、自然免疫系の著しい刺激が起こり、これは、本発明の短いcrRNA:tracrRNA複合体を使用すると不在であった。
実施例13
以下の実施例は、哺乳類CRISPRゲノム編集適用において高い効率で実行する、新たな高度に修飾されたcrRNA及びtracrRNA組成物を実証するために特に有効であると実施例6及び7で特定された修飾パターンを組み合わせる。
以下の実施例は、哺乳類CRISPRゲノム編集適用において高い効率で実行する、新たな高度に修飾されたcrRNA及びtracrRNA組成物を実証するために特に有効であると実施例6及び7で特定された修飾パターンを組み合わせる。
示される通り、化学修飾を有する一連のcrRNA及びtracrRNA(表12)を合成した。crRNAは、3′末端の16塩基tracrRNA結合ドメインと共に、5′末端でヒトHPRT1遺伝子(38285)内の同じ部位を標的とする20塩基プロトスペーサードメインを用いた。67個のヌクレオチドまたは62個のヌクレオチドが切断されたバージョンのtracrRNA配列を使用して、示される通り、化学修飾を有するtracrRNAを合成した。表12に列挙されたcrRNA及びtracrRNAを、示される通り対合させて、30nMの濃度でHEK-Cas9細胞に形質移入し、前述の実施例に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、T7EIミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、HPRT1遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。
オリゴヌクレオチド配列の5′~3′を示す。小文字=RNA、下線=2′-O-メチルRNA、小文字斜体=2′F RNA;*=ホスホロチオエートヌクレオチド間結合。各複合体の相対機能的活性は、試験された各用量に関して、T7EIヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断%により示される。
crRNA:tracrRNA対#1及び#2は、高度に2′F RNA修飾されたcrRNA(配列番号448、22/36残基が修飾された、若しくは61%)は、非修飾tracrRNA(配列番号2)、または高度に2′OMe修飾されたtracrRNA(配列番号100)のいずれかと対合された場合、高度に機能的であることを示す。crRNA:tracrRNA対#3及び#4は、中レベル(配列番号450、19/67残基が修飾された、若しくは28%)、または高レベル(配列番号449、46/67残基が修飾された、若しくは69%)の2′F RNA修飾は、高度に機能的であることを示す。実施例6(特に、2′OMe「ウォーク」、配列番号144~162)から得られた情報を使用して、tracrRNAの内部ドメイン内で修飾され得る特定の残基を特定した(図6を参照されたい)。crRNA:tracrRNA対#5は、この場合、切断された62ヌクレオチド設計(配列番号451、51/62残基が2′OMe RNAで修飾された、若しくは82%)であった極めて高度に修飾されたtracrRNAが、哺乳類細胞内でCRISPRゲノム編集を誘起することにおいて高い能力を有することを実証する。したがって、元の89RNAヌクレオチド野生型tracrRNAが、本明細書において、わずか11個のRNA残基が残る(11/62)形態に最適化され、それにより、哺乳類自然免疫系のRNA系活性化の危険性を著しく低減し、tracrRNAのヌクレアーゼ感受性RNA含有量を最低レベルに低減する。
本明細書において引用される刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、個々にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を説明する文脈における(特に以下の特許請求の範囲の文脈における)「a」及び「an」及び「the」という用語、ならびに同様の指示語の使用は、本明細書において別途指示しない限りまたは、文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むものと解釈される。「含む(comprising)」、「有する」、「含む(including)」、及び「含有する」という用語は、別途記載されない限り、変更可能な用語として解釈される(すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する)。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別途指示されない限り、その範囲内に含まれる各別個の値を個々に言及することの簡易方法として役立つことが意図されるにすぎず、各別個の値は、それが本明細書において個々に列挙されるように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別途指示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、いずれかの適切な順序で行われ得る。本明細書において提供されるいずれの及び全ての実施例、または例示的な言語(例えば、「等」)の使用は、本発明をより良く解明することが意図されているにすぎず、別途要求されない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書におけるいかなる文言も、請求されていないいずれの要素が本発明の実施に必須であるとして示すものと解釈されるべきではない。
本発明を実行するために発明者らに既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。そのような好ましい実施形態の変型は、前述の説明を読むことで当業者には明らかとなり得る。発明者らは、当業者がこのような変型を適切に用いることを期待し、発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載方法とは異なる方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法により許可される通り、本明細書に添付される特許請求の範囲内に列挙される主題の全ての修正及び同等物を含む。更に、上記要素の、それらの全ての可能な変型におけるいずれの組み合わせは、本明細書において別途指示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
Claims (23)
- 長さ修飾された形態の配列番号18を含む単離されたtracrRNAであって、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)エンドヌクレアーゼ系において活性を示す、単離されたtracrRNA。
- 前記長さ修飾された形態の配列番号18が、短縮形態の配列番号18からなる、請求項1に記載の単離されたtracrRNA。
- 前記短縮形態の配列番号18が、
5′末端で1~20個のヌクレオチドを欠いている配列番号18、
3′末端で1~10個のヌクレオチドを欠いている配列番号18、ならびに
5′末端で1~20個のヌクレオチド、及び3′末端で1~10個のヌクレオチドを欠いている配列番号18
からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項2に記載の単離されたtracrRNA。 - 前記短縮形態の配列番号18が、配列番号2、30~33、及び36~39からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項2に記載の単離されたtracrRNA。
- 前記短縮形態の配列番号18が、配列番号2または38からなる、請求項2に記載の単離されたtracrRNA。
- 少なくとも1個の化学修飾されたヌクレオチドを更に含む、請求項1に記載の単離されたtracrRNA。
- 前記長さ修飾された形態の式(I)が、短縮形態の式(I)からなる、請求項7に記載の単離されたcrRNA。
- 前記短縮形態の式(I)が、
前記Zドメインの3′末端で1~8ヌクレオチドを欠いている式(I)、及び
17、18、19、または20個のヌクレオチドを有する標的特異的プロトスペーサードメインに対応するために前記Xドメインの5′末端でヌクレオチドを欠いている式(I)
からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項8に記載の単離されたcrRNA。 - 少なくとも1個の化学修飾されたヌクレオチドを更に含む、請求項7に記載の単離されたcrRNA。
- 前記長さ修飾された形態の式(I)が、配列番号429~439からなる、請求項10に記載の単離されたcrRNA。
- 化学修飾された形態の配列番号2、18、30~33、及び36~39のうちの1つを含む、単離されたtracrRNAであって、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)エンドヌクレアーゼ系において活性を示す、単離されたtracrRNA。
- 前記化学修飾された形態の配列番号2、18、30~33、及び36~39のうちの1つが、リボース修飾、末端修飾基、及びヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する、化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項12に記載の単離されたtracrRNA。
- 修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、2′OMe、2′F、二環式核酸、及びロックされた核酸(LNA)からなる群から選択されるリボース修飾からなる、請求項13に記載の単離されたtracrRNA。
- 修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、プロパンジオール(C3)スペーサー、N,N-ジエチル-4-(4-ニトロナフタレン-1-イルアゾ)-フェニルアミン(「ZEN」)、及び反転dT残基からなる群から選択される末端修飾基からなる、請求項13に記載の単離されたtracrRNA。
- 修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、ホスホロチオエート修飾からなるヌクレオチド間修飾結合からなる、請求項13に記載の単離されたtracrRNA。
- 前記単離されたtracrRNAが、配列番号100、129、130、131、132、134、136、449、及び551からなる群から選択される、請求項13に記載の単離されたtracrRNA。
- 前記化学修飾された形態の式(I)が、リボース修飾、末端修飾基、及びヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する、化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項18に記載の単離されたcrRNA。
- 修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、2′OMe、2′F、二環式核酸、及びロックされた核酸(LNA)からなる群から選択されるリボース修飾からなる、請求項19に記載の単離されたcrRNA。
- 修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、プロパンジオール(C3)スペーサー、N,N-ジエチル-4-(4-ニトロナフタレン-1-イルアゾ)-フェニルアミン(「ZEN」)、及び反転dT残基からなる群から選択される末端修飾基からなる、請求項19に記載の単離されたcrRNA。
- 修飾を有する化学修飾された前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエート修飾からなるヌクレオチド間修飾結合からなる、請求項19に記載の単離されたtracrRNA。
- 前記化学修飾された形態の式(I)が、配列番号429~439から選択される、請求項19に記載の単離されたtracrRNA。
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