CN107384892A - 一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体、改造方法及其应用 - Google Patents

一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体、改造方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体、改造方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的改造方法为以CALB的结合口袋的构象动力学工程，通过分子动力学模拟，找到能使口袋构象动力学降低的关键位点，并设计最佳突变体，克服了之前的酶EF5只在较低温度下才表现出高的对映体选择性的局限，并通过实验验证。最终得到最佳突变体D223V/A281S，用于催化制备(R)‑3‑取代戊二酸烷基单酯类化合物，在工业化可接受温度(20‑55℃)下其eeR值可达>99％，产量>55g/L，产率>80.0％，时空产率可达107.54g.L‑1d‑1.大大降低了之前的低温条件带来的成本，缩短了生产周期，为(R)‑3‑取代戊二酸烷基单酯类化合物的工业化奠定了基础。

Description

一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体、改造方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体、改造方法及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
瑞舒伐他汀钙又名可定，属于第三代他汀类药物，可高效降低低密度胆固醇的浓度，降低甘油三酯和脱辅基蛋白B的含量，与此同时升高高密度胆固醇。该药物主要是通过叶立德反应将手性侧链(膦盐)与嘧啶母核缩合而得，瑞舒伐他汀钙的合成路径中，可用生物酶法替代的反应步骤有：侧链膦盐的合成；侧链羰基还原；侧链末端酯的水解。(3R)-TBDMSO戊二酸甲单酯是组装膦盐侧链的重要前体，其绝对构型影响着终产品的疗效，是瑞舒伐他汀钙制备的关键。目前，(R)-3-取代戊二酸单酯主要来源于化学合成，包括手性试剂法和催化剂法，该法常需要适宜的手性催化剂，在合成过程中，反应需在低温(-70℃)或高压等极端条件下进行，生产成本高，技术难度大。这些因素严重限制了该法的工业应用，同时导致他汀类药物市场价格昂贵。生物酶在手性戊二酸单酯类化合物制备中提供了一条新的道路。
CALB是一种丝氨酸水解酶，它的催化机理是双乒乓机制。CALB由317个氨基酸残基组成，分子量为33kD。CALB的结构是一典型的α/β水解酶类似折叠，活性位点位于蛋白结构的中心，由催化三联体Serl05-Asp187-His224、1个氧负离子洞及特异性底物结合口袋构成，活性口袋包括酰基结合口袋和醇基结合口袋。在CALB的活性位点附近具有一段保守序列Thr-x-Ser-x-Gly，与大多数脂肪酶不同的是CALB活性中心没有被螺旋片断(又称为“盖子”)埋藏，因此，CALB无界面活性。
许多酶的对映体选择性受温度的影响很大，一般情况下，低温更有利于保持高的对映体选择性。很多研究通过降低反应温度的方式来提高催化剂的对映体选择性，从而提高产物的纯度。但是，很多情况下，酶要保持高的对映体选择性，往往需要很低的温度，例如3-苯基-2H-苄基-2-甲醇的酶促拆分中，酶保持最大对映体选择性的温度为-40℃，有的甚至需要-80℃的低温才能保证好的对映体选择性。如此低的温度严重影响了酶的活性，大大降低了反应速率，延长反应时间，另外，制造低温环境同样大大增加了生产成本，不利于工业化应用。有研究通过将酶固定化在特殊材质的载体(多孔陶瓷)上，在一定程度上能提高酶的催化效率，但是不能从根本上解决问题。有研究表明通过蛋白质改造能改善温度的限制，但是具体的改造方法，有待进一步的完善。
近来，研究者越来越重视对酶的构象动力学起重要作用的构象动力学，酶的构象动力学工程已成为蛋白质进化的一个有效的策略，在解除产物抑制、促进产物释放、酶的理性设计方面取得显著成果。最近研究表明酶的构象动力学对配体的识别和结合起着关键作用，可以确定配体结合的方向，调节酶的选择性。尽管酶的对映选择性和构象动力学之间的关系没有直接的报道，但是基于对酶构象动力学工程的上述研究，有望指导对映选择性的改善。当然，将这种策略实际应用于酶的设计仍然存在重大挑战。
我们之前的研究，利用CALB催化3-取代戊二酸酐醇解制备(R)-3-取代戊二酸单酯，但是对映体选择性差，野生的CALB为S选择性，经过利用蛋白质工程手段对其进行改造，微调活性口袋，得到一株突变体EF5，在5℃条件下，其eeR为98.5％，随着温度的升高而降低。但是低温(5℃)大大延长了生产周期，增加了成本，阻碍了其工业化应用。
发明内容
本发明提供了一种室温等工业化可接受温度(20-55℃)下高对映体选择性制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物的CALB突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化3-取代戊二酸酐醇解制备(R)-3-取代戊二酸单酯。本发明利用酶的构象动力学工程将生产(R)-3-取代戊二酸单酯的温度从5℃提高至20-55℃，该方法具有极高的生产强度，高对映体选择性，减少了工业生产的生产周期、极大提高了工业化生产的生产效率。
本发明的第一个目的是提供一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体，所述突变体相对于南极假丝酵母脂肪酶B亲本，将第223位氨基酸残基突变为缬氨酸，或将第281位氨基酸残基突变为丝氨酸，或将第223位突变为缬氨酸的同时将第281位氨基酸残基突变为丝氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述南极假丝酵母脂肪酶B亲本的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体D223V，A281S，A281S/D223V的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体D223V，A281S，A281S/D223V的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17所示。
本发明的第二个目的是提供一种获得所述的突变体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)利用结构分析确定候选氨基酸残基；
2)针对所确定的氨基酸位点进行丙氨酸或丝氨酸取代的分子动力学模拟，分析残基主链碳原子的RMSF值，确定能够降低口袋构象动力学的关键氨基酸位点；
3)设计定点突变所用引物，以携带南极假丝酵母脂肪酶B亲本基因的载体为模板进行突变并构建突变体的质粒载体；
4)将突变质粒转化进宿主细胞；
5)挑选阳性克隆进行发酵培养，纯化获得南极假丝酵母脂肪酶B突变体。
本发明的第三个目的是提供一种含有编码所述突变体的氨基酸序列的重组质粒载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述突变体的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述表达所述突变体的细胞为毕赤酵母GS115。
本发明的第五个目的是提供所述的突变体在催化制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将底物、辅底物、突变体酶、有机溶剂投入到反应器中进行非水相催化；所述辅底物与底物的摩尔比为1:20-20:1，底物与酶的质量比为1:6–6:1，所述有机溶剂与底物的摩尔比为2:1-300:1；所述底物为3-取代戊二酸酐或3-取代戊二酸，辅底物为有机醇，所述有机溶剂为MTBE、乙腈、四氢呋喃中的任意一种或多种组合。
在本发明的一种实施方式中，所述有机醇是以下任意一种或者多种的混合：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括在体系中添加0.5％v/v的金属离子溶液；所述金属离子溶液为MgCl2、CaCl2或KCl。
在本发明的一种实施方式中，所述应用的反应温度为5-70℃，转化时间为2-48h，转化转速为200-500rpm，酶浓度为1g/L-100g/L，底物浓度为10g/L-300g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述应用的反应温度为10-55℃，转化时间为2-48h，转化转速为200-500rpm，酶浓度为1g/L-100g/L，底物浓度为10g/L-300g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述应用的反应温度为37℃、转化时间为12h。
在本发明的一种实施方式中，所述酶是固定化酶或者游离酶。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化酶的固定化介质为硅藻土、海藻酸钠、高岭土、琼脂糖、明胶、阳离子树脂、阴离子树脂或大孔吸附树脂。
本发明的第六个目的是提供所述突变体在制备药物方面的应用。
本发明有益效果
本发明得到了一系列在室温等工业化可接受温度下对R型产物选择性较高的脂肪酶突变体，用于催化生产(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物。本发明的突变体在5-70℃下仍具有高效的对映体选择性，大大缩短了反应时间，提高了反应效率，降低生产成本，并且反应条件温和、操作简便、收率高、光学纯度高的优点，(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物收率可达80％以上、eeR值可达99％以上。此外，本发明后处理简单，原料利用度比较高，符合绿色化学的要求。应用本发明的方法可以大大降低成本，来满足社会对(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物的需求。
附图说明
图1：突变位点选择；
图2：突变体的口袋结构变化分析；
图3：突变体高对映体选择性制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物液相检测示意图。
具体实施方式
基因来源：本专利所涉及到的生物酶CALB基因来源于Pseudozyma antarctia JCM3941，Pseudozyma antarctia JCM 3941购自Japan Collection of Microorganisms(JCM)。CALB突变体均为分子改造所得，其余反应物及试剂均为市场购买所得。
酶的构象动力学分析：采用分子动力学模拟得到的root-mean-squarefluctuation(RMSF)反映酶的构象动力学变化。分子动力学模拟是通过GROMACS 4.5.5计算，运用AMBER03力场。
酶的结构及与底物相互作用分析：酶的结构分析采用pymol可视化软件，酶与底物及R-/S-产物的分子对接采用Autodock软件进行。
对映体选择性及产量测定：反应产物(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物以及其对应异构体及底物含量采用高效液相色谱法测定，液相测定条件如下：DAICEL ChiralPakAD-H5μm(4.0×250mm)色谱柱，流动相为正己烷(n-Hexane)/异丙醇(Iso-propanol)＝96/4(0.02％三氟乙酸(v/v))，样品用0.45μm滤膜过滤，柱温为25℃，检测波长为210-360nm，进样量为10-100μl，流速为1.0-5.0ml/min。
实施例1：突变位点的选择和筛选
CALB的活性口袋主要由两部分组成：酰基结合口袋和醇基结合口袋。催化三联体Asp187-His224-Ser105位于两者中间。酰基结合口袋主要由A141、L144、V149、D134、T138和Q157组成，醇基结合口袋主要由T42、K47、W104、L278、A281和A282组成，A281、A282和I285朝向底物的醇部分，限制了通道的大小。
位点的选择：酰基口袋(D134、A148、V149、I189、V190和Q157)，醇基口袋(T42、T43、W104、A281和A282)，A281和A282因为位于通道处，所以考虑在内；另外，与催化组氨酸、天冬氨酸临近的D223和T186可能对活性口袋构象产生影响，考虑在内，如图1所示。
实施例2：实验验证模拟筛选中的氨基酸残基对对映体选择性的影响
针对模拟筛选中的氨基酸残基D134、A148、V149、I189、V190、Q157、T42、T43、W104、A281、A282、D223和T186，通过构建突变库，高通量筛选验证对对映体选择性的影响。将上述突变位点进行组合库1(A148/V149)，库2(I189/V190)，库3(Q157)，库4(T42/T43)，库5(W104)，库6(A281/A282)，库7(D223)，库8(T186)，库9(D134)，构建上述9个突变库，并通过高通量筛选，对所有突变库中的全部突变体进行筛选，验证对映体选择性的变化情况。经过筛选近7000株突变体，根据筛选结果，发现只有D223V、A281S和D223V/A281S的对映体选择性具有明显变化，另外选择A282S、W104A、Q157N进行实验验证。
实施例3：突变体的构建
利用定点突变成功构建六个突变体D223V、A281S、A282S、W104A、Q157N和D223V/A281S。首先，利用T载体上连接有亲本EF5基因的质粒为模板，分别以SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为引物，利用高保真酶PrimerStar扩增，利用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切(37℃，3h)，回收得到突变体基因。所得突变体基因与经同样的内切酶酶切回收的PGAPZαA表达载体在16℃下连接过夜，连接产物转化进JM109感受态细胞扩增。提取重组质粒，利用内切酶AVrII进行线性化处理(37℃，3h)，柱回收后电转化进GS115感受态细胞，涂布平板培养得突变体。突变体利用YPD培养基培养产相应的突变酶。
实施例4：突变体在30℃下的R-/S-产物的初始生成速率比较
本发明测定了在30℃下突变亲本EF5及突变体A281S，D223V，A281S/D223V，A282S、W104A和Q157N的R-/S-产物的初始生成速率。结果如表1所示，突变体A281S，D223V，A281S/D223V在30℃下的S-产物的初始生成速率较突变前的EF5大大降低，R-产物的初始生成速率稍微有所降低，但降低幅度不大。表明突变导致A281S，D223V对R-产物的选择性增强，S-产物的选择性减弱。而两者的组合突变，进一步加强了这种选择性。W104A的选择性变化不大，而Q157N的选择性下降。
表1 30℃下不同突变体的R-/S-产物的初始生成速率
实施例5：突变体动力学参数测定
本发明测定了突变亲本EF5及突变体A281S，D223V，A281S/D223V，A282S在30℃下的动力学参数。动力学研究的结果如表2所示。
表2 EF5及其突变体对R-/S-产物动力学分析
如表格所示，在30℃下，突变体A281S，D223V，A281S/D223V对R-产物的Kcat变大，Km变小，Kcat/Km变大，催化效率变大；而对S-产物的Kcat变小，Km变大，Kcat/Km变小，催化效率变小。其他突变体均呈现负效果或者没有效果。
实施例6：突变体转化制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物比较
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为1:1，催化剂为EF5、A281S，D223V，A281S/D223V突变体，酶添加量为60g/L，以乙腈为溶剂，加入完毕，于37℃条件下反应12小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。A281S/D223V的eeR最高，达到99％；A281S和D223V的eeR分别为93.5％、95.8％；其他突变体对映体选择性均不高。
表3 EF5及其突变体在37℃下的对映体选择性和产量
实施例7：金属离子的添加对酶对映体选择性的影响
将7个密闭的5ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为1:1，催化剂为A281S/D223V突变体，酶添加量为60g/L，以乙腈为溶剂，除对照外，分别加入0.5％(v/v)的2.4M的MgCl2、CaCl2、KCl、LiCl、NaCl和BaCl2溶液，加入完毕，于30℃条件下反应12小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。结果表明MgCl2对eeR影响最大，提高至99％，CaCl2和KCl有些许影响，LiCl、NaCl和BaCl2没有影响。
实施例8：高对映体选择性催化制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物
将4个密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为1:1，催化剂为EF5、A281S，D223V，A281S/D223V突变体，酶添加量为60g/L，以乙腈为溶剂，分别加入0.5％(v/v)的2.4M的MgCl2溶液，加入完毕，于37℃条件下反应12小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。结果显示，A281S，D223V，A281S/D223V突变体的eeR均达到99％。
实施例9：高对映体选择性催化制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物
将4个密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为1:1，催化剂为EF5、A281S，D223V，A281S/D223V突变体，酶添加量为60g/L，以乙腈为溶剂，分别加入0.5％(v/v)的2.4M的MgCl2溶液，加入完毕，于20℃条件下反应30小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。结果显示，A281S，D223V，A281S/D223V突变体的eeR均达到99％。
实施例10：高对映体选择性催化制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物
将4个密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为1:1，催化剂为EF5、A281S，D223V，A281S/D223V突变体，酶添加量为60g/L，以乙腈为溶剂，分别加入0.5％(v/v)的2.4M的MgCl2溶液，加入完毕，于55℃条件下反应8小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。结果显示，A281S，D223V，A281S/D223V突变体的eeR均达到98.5％。。
实施例11：突变体在37℃下，高对映体选择性催化制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物
将4个密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为1:1，催化剂为EF5、A281S，D223V，A281S/D223V突变体，酶添加量为60g/L，以乙腈为溶剂，分别加入0.5％(v/v)的2.4M的MgCl2溶液，加入完毕，于70℃条件下反应2小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。结果显示，A281S，D223V，A281S/D223V突变体的eeR均达到98％。。
实施例12：突变体在37℃下，高对映体选择性催化制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物
将4个密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为1:1，催化剂为EF5、A281S，D223V，A281S/D223V突变体，酶添加量为60g/L，以乙腈为溶剂，分别加入0.5％(v/v)的2.4M的MgCl2溶液，加入完毕，于5℃条件下反应48小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。结果显示，A281S，D223V，A281S/D223V突变体的eeR均达到99％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体、改造方法及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Thr Ser Pro Thr Ser Val Thr Lys
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Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gly Lys Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
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65 70 75 80
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Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
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245 250 255
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Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Val Ala Ile Ile Ala Gly
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Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
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<211> 951
<212> DNA
<213> 人工合成
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gtgcttacgt ggtctcaagg tgggctggtg gcacagtggg gtttgacctt cttccccagt 360
atcaggtcca aggtcgatcg acttatggcc tttgcgcccg actacaaggg ctccgtcctc 420
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gtgattgtcc atgcgggatc gctcacctcg cagttctcct acgtcgtcgg tcgatccgcc 720
ctgcgctcca ccacgggcca ggctcgtagt gccgactacg gaatcacgga ctgcaaccct 780
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tccggccctc tcgatgcact cgcggttagt gcaccctccg tatggcagca aaccaccggt 480
tcggcactca ccaccgcact ccgaaacgca ggtggtctga cccagatcgt gcccaccacc 540
aacctctact cggccaccga cgagatcgtt cagccccagg tgtccaactc gcccctcgac 600
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ctgcgctcca ccacgggcca ggctcgtagt gccgactacg gaatcacgga ctgcaaccct 780
cttcctgcaa atgatctgac ccccgagcaa aaggtcgccg cggcagcgct gctcgcccct 840
tcggctgtgg ccatcatcgc gggtccaaag cagaactgcg aacccgacct catgccctac 900
gcccgcccct ttgccgtcgg caagaggacc tgctccggca tcgtcacccc c 951
<210> 5
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<212> DNA
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<210> 6
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<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
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<210> 14
<211> 34
<212> DNA
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<400> 14
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<211> 317
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Thr Ser Pro Thr Ser Val Thr Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gly Lys Phe
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Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
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Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Val His
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305 310 315
<210> 16
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 17
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
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180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Asp Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
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Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ser Ala Val Ala Ile Ile Ala Gly
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290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315

Claims (10)

1.一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体，其特征在于，所述突变体相对于南极假丝酵母脂肪酶B亲本，将第223位氨基酸残基突变为缬氨酸，或将第281位氨基酸残基突变为丝氨酸，或将第223位突变为缬氨酸的同时将第281位氨基酸残基突变为丝氨酸。
2.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，所述南极假丝酵母脂肪酶B亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.15，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17所示。
4.含有编码权利要求1所述突变体核苷酸序列的重组质粒载体。
5.表达权利要求1所述突变体的细胞。
6.权利要求1所述的突变体在催化制备(R)-3-取代戊二酸烷基单酯类化合物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述应用是将底物、辅底物、突变体酶、有机溶剂投入到反应器中进行非水相催化；所述辅底物与底物的摩尔比为1:20-20:1，底物与酶的质量比为1:6–6:1，所述有机溶剂与底物的摩尔比为2:1-300:1；所述底物为3-取代戊二酸酐或3-取代戊二酸，辅底物为有机醇。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用包括在体系中添加0.5％v/v的金属离子溶液；所述金属离子溶液为MgCl2、CaCl2或KCl。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用的反应温度为5-70℃，转化时间为2-48h，转化转速为200-500rpm，酶浓度为1g/L-100g/L，底物浓度为10g/L-300g/L。
10.权利要求1所述突变体在制备药物方面的应用。
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