CN104745550B - 一种非水相催化制备(r)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的calb突变体 - Google Patents

一种非水相催化制备(r)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的calb突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN104745550B
CN104745550B CN201510179543.9A CN201510179543A CN104745550B CN 104745550 B CN104745550 B CN 104745550B CN 201510179543 A CN201510179543 A CN 201510179543A CN 104745550 B CN104745550 B CN 104745550B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant
enzyme
substrate
glutaric acid
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510179543.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104745550A (zh
Inventor
刘立明
王鸿江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201510179543.9A priority Critical patent/CN104745550B/zh
Publication of CN104745550A publication Critical patent/CN104745550A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104745550B publication Critical patent/CN104745550B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种非水相催化制备(R)‑3‑取代戊二酸单烷基酯类化合物的CALB突变体，属于生物工程技术领域。本发明以突变体酶为催化剂，以3‑取代戊二酸类化合物和有机醇为原料，在生物酶的作用下，在有机溶剂中于4‑50℃下反应制备(R)‑3‑取代戊二酸单烷基酯类化合物。本发明提供的制备方法反应条件温和，(R)‑3‑取代戊二酸单烷基酯类化合物产量可>32.8g/L，其产率>82.0％，eeR值可达>99％，并且后处理简单，原子利用度比较高，符合绿色化学的要求。应用该方法可以大大降低成本，来满足社会对(R)‑3‑取代戊二酸单烷基酯类化合物的需求。

Description

一种非水相催化制备(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的 CALB突变体
技术领域
本发明涉及一种非水相催化制备(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的CALB突变体，属于生物工程技术领域。
背景技术
手性单体(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物(I)是合成他汀及其类似物的一种重要的中间体。(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物化学结构式如下：
他汀类药物是目前治疗高血脂症的首选药物。该类药物以安全、有效、耐受性好、作用维持时间长等优点，已成为降脂药中的主流药，而在防治心血管疾病方面所获得的明显效益，以及降脂作用之外的临床新应用的相继报道，引起了医药界的兴趣和关注。他汀类药物据报道还具有抗艾滋病毒(HIV)的作用，并且还有其他潜在的应用价值备受人们的青睐，市场前景相当好，市场需求趋旺。
采用(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物化学法合成瑞舒伐他汀钙工艺流程如下：
由于(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物制备困难，其异构体(S)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物含量的控制极为严格，需要有更能确保其光学结构的制备工艺，目前制备手性(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯类化合物，主要是通过化学法合成的，常见的有手性试剂法和催化剂法。已有文献公开了以酸酐化合物为原料制备(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯的方法，但是，该方法的第一步反应产物收率低，所需手性试剂价格高，后续处理复杂，环境污染严重，一般在极端的条件下(如-70℃)进行，生产能耗大，易产生废水，不适于工业化大规模生产。
生物酶催化法具有绿色无污染，对映体选择性高，高催化效率，反应条件温和等优点，酶法生产手性化化合物应用前景广阔。南极假丝酵母首先是在南极洲分离得到的，该南极假丝酵母可以产生两种性质完全不同的脂肪酶，分别为南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)和脂肪酶B(CALB)。天然的CALB仍存在一定的缺陷，如热稳定性较差产量较低等，使其在生产实践中的应用受到一定限制，成功修饰和改造CALB使其具有更加良好的性质是一个研究的热点。
已有文献用pLE(猪肝酶)水解3-取代戊二酸二烷基酯，得到(S)-戊二酸单烷基酯类化合物，收率小于40％，且该方法需要将3-取代的戊二酸烷基酯类溶于缓冲液中，因其溶解度小，进而使得后处理比较繁索，不适合大规模工业化生产。含有研究者利用3-取代环戊酐在酶作用下醇解制备((S)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物，收率约为87％，但是ee值不高，不适合药用要求。也有报道醇解3-取代环戊酐制备手性(S)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物，但ee<80％，不符合药用要求。以上的报道中，由于酶对S型产物的选择性高，而对合成R型产物的选择性低，而脂肪酶合成R型产物的报道甚少，酶法合成R型产物主要是通过动力学拆分，但该法的理论的率仅50％，因此寻找一条新的制备方法来解决目前合成方法中存在的不足至关重要。
发明内容
本发明的目的是通过对原有的酶进行改造，提供一种以改造后的生物酶做为催化剂，其反应条件温和、产物收率高、对环境友好、使用成本较低的3-取代戊二酸或3-取代戊二酸酐类化合物与有机醇酯化制备手性单体(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的制备方法。
本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶突变体，所述突变体是由南极假丝酵母菌脂肪酶B(CALB)突变得到的。以该突变体酶为催化剂催化合成R型产物，能够解决现有酶对R性产物选择性低的问题。
所述脂肪酶突变体为来源于Pseudozyma(Candida)antarctia lipase B的突变体：A141S-A283V、CALB-Lost、S201D、A141S、S47N-Q106H、T138S-S47N中的任意一种。
所述突变体A141S-A283V、CALB-Lost、S201D、A141S、S47N-Q106H、T138S-S47N的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6所示。
所述突变体是在Pseudozyma(Candida)antarctia lipase B的基础上突变得到的。通过微调对映体选择性口袋以提高酶与r型产物的特异性(上述突变位点是距离酶活性中心5埃范围内的氨基酸残基)或者削弱酶与s型产物的亲和力(如CALB-Lost缺失了一段与S型产物亲和力相关的氨基酸)的突变方式，最终提高酶对R性产物选择性。
所述突变体，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是在毕赤酵母GS115过量表达得到的。
本发明的第二个目的是提供一种所述突变体酶在催化合成R型产物方面的应用方法。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是利用突变体酶非水相催化制备(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物，催化反应式如下：
其中：底物为3-取代戊二酸酐或是3-取代戊二酸；R1为羟基，叔丁基二甲硅醚，C1-C8的脂链，芳环，苯环，C1-C5的氟代、氯代、溴代或碘代烷基中的任意一种；R2为Cl-C8的烷基基团，Cl-C5的氟代、氯代或溴代烷基。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：将底物、辅底物、突变体酶、有机溶剂投入到反应器中进行非水相催化；所述辅底物与底物的摩尔比为1:10-10:1，底物与酶的质量比为1:6–6:1，所述有机溶剂与底物的摩尔比为2:1-300:1；所述底物为3-取代戊二酸酐或3-取代戊二酸，辅底物为有机醇。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括在体系中添加5-30％v/v的有机碱以调节体系pH、提高产物光学纯度。
所述有机碱，在本发明的一种实施方式中，为三乙胺。
所述非水相催化，在本发明的一种实施方式中，反应温度为4-80℃，反应时间为3-72h。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，酶浓度为1g/L-100g/L，底物浓度为10g/L-300g/L。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，辅底物与底物的摩尔比为1:4-5:1，底物与酶的质量比为1:1.5-6:1，酶浓度为10g/L-90g/L，底物浓度为20g/L-160g/L。
所述有机溶剂，在本发明的一种实施方式中，是以下任意一种或者多种的混合：有机醇、环己烷、正己烷、异辛烷、丙烷、乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚或异丙醚。
所述有机醇，在本发明的一种实施方式中，是以下任意一种或者多种的混合：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇。
所述酶，在本发明的一种实施方式中，是固定化生物酶或者游离酶。
所述固定化生物酶采用的固定化介质为硅藻土、海藻酸钠、高岭土、琼脂糖、明胶、阳离子树脂或阴离子树脂、大孔吸附树脂。
所述非水相催化，在本发明的一种实施方式中，反应过程中使用无水硫酸铜、分子筛、无水氯化钙、水合盐对、高分子膜或者除水设备来除去反应中生成的水。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)将3-取代戊二酸类化合物，有机醇，固定化生物酶和溶剂依次投入到反应器中；(2)控制温度于4-50℃进行反应，期间用HPLC液相色谱进行跟踪监测，直至反应基本不再进行；(3)过滤反应液，将生物酶除去，去除有机溶剂和未反应有机醇，即可得到粗制的(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物。所述固定化生物酶还可以回收以重复使用。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：在反应器中加入摩尔比为3:1有机醇和底物，其中底物浓度为60g/L，酶添加量为60g/L，在有机溶剂中，于5-25℃反应12-24h，反应结束后去除有机溶剂和未反应的有机醇。
本发明还要求保护根据上述任一方法得到的(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物，以及该化合物在制备治疗高血脂症药物方面的应用。
本发明中，突变体的命名：A141S代表第141为的A氨基酸突变为S氨基酸，T138S-S47N代表第138位和47位同时发生突变。
本发明的有益效果：得到了一系列对R性产物选择性较高的脂肪酶突变体，用于催化生产(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物具有反应条件温和、操作简便、收率高、光学纯度高的优点，收率可达80％以上、eeR值可达98.5％以上。并且后处理简单，原子利用度比较高，符合绿色化学的要求。应用本发明的方法可以大大降低成本，来满足社会对(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的需求。
附图说明
图1为单位点突变体脂肪酶催化合成(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)效果图；
图2为不同多位点突变体催化合成(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)的效果图；
图3为三乙胺浓度对催化合成(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)的eeR值的影响；
图4甲醇与底物摩尔浓度比对A141S-A283V突变体催化合成R-J6的影响；
图5为底物浓度对A141S-A283V突变体催化合成R-J6的影响；
图6为A141S-A283V突变体添加量对R-J6的影响；
图7为突变体A141S-A283V催化合成R-J6随时间的变化情况(在10℃条件下，36h)；
图8为不同CALB酶突变体催化合成R-J6效果(在5℃条件下，36h)；
图9不同样品的液相色谱图。
具体实施方式
本专利所涉及到的生物酶CALB基因来源于Pseudozyma antarctia JCM 3941，Pseudozyma antarctia JCM 3941购自Japan Collection ofMicroorganisms(JCM)。CALB突变体均为分子改造所得，其余反应物及试剂均为市场购买所得。
反应产物(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物以及其对应异构体及底物含量采用高效液相色谱法测定，液相测定条件如下：DAICEL Chiral PakAD-H 5μm(4.0×250mm)色谱柱，流动相为正己烷(n-Hexane)/异丙醇(Iso-propanol)＝96/4(0.02％三氟乙酸(v/v))，样品用0.45μm滤膜过滤，柱温为25℃，检测波长为210-360nm，进样量为10-100μl，流速为1.0-5.0ml/min。
实施例1
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)80g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为3:1，生物催化剂为CALB突变体，主要有A141S、Q106H、S201D、I189V、T138S、S47N、D134S，生物游离酶添加的质量为0.60g，加入完毕，将温度固定在25℃，反应24小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。
实验结果如图1，较对照组而言所有突变株eeR值均有提高，A141S和S201D突变体的效果最明显。A141S突变体eeR值达8.7％，(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯(R-J6)产量为9.6g/L；S201D突变体对映体选择性有了明显改变，eeR值达到27.28％，R-J6产量为14.1g/L，R-J6产物含量是S-J6产物含量的1.75倍。成功实现酶的手性选择性逆转，降低了副产物(S-J6)的产量。
实施例2
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)40g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为3:1，生物催化剂为CALB突变体，有T138S-I189V、S47N-D134S-S201D、A141S-A283V、S47N-I189V、S47N-Q106H、CALB-Lost、T138S-S47N-S201D、T138S-S47N、S47N-S201D，生物游离酶添加的质量为0.60g，加入完毕，将温度固定在25℃，反应24小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。
CALB基因多位点突变体酶催化合成R-J6效果如图2，A141S-A283V和CALB-Lost突变体对催化合成R型异构体的效果较明显，S47N-Q106H(eeR值达17％)、T138S-S47N(eeR值达15％)。其中，CALB-Lost突变酶eeR值达到25.9％，其R-J6产量为16.5g/L，其产量是对照组(6.8g/L)的2.42倍，其R-J6产率为41.3％，该突变体合成甲单酯的生产能力为1.09(g/L·h)，单酯转化率为65.56％。A141S-A283V突变酶eeR值达到35.2％，其R-J6产量为20.9g/L，其R-J6产量是对照组(6.8g/L)产量的3倍，其产率为52.2％，该酶合成甲单酯的生产能力为1.29(g/L·h)，单酯转化率为77.23％。
实施例3
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)80g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为3:1，生物催化剂为A141S-A283V突变体，生物游离酶添加的质量为0.60g，向体系中添加不同浓度(5-30％v/v)的三乙胺(有机碱)，考察有机碱对酯化反应的eeR值得影响，加入完毕，反应24小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯。添加不同体积的三乙胺对A141S-A283V催化合成R-J6的影响结果如图3所示，当添加20％(v/v)的三乙胺后，eeR达到最高，为87.2％，其R-J6产量为23.43g/L。
实施例4
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为1:4-6:1，催化剂为CALB-A141S-A283V突变体，生物游离酶添加量为60g/L，以甲基叔丁基醚为溶剂，加入完毕，反应24小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯(R-J6)。
甲醇与底物摩尔比(醇酐比)对A141S-A283V突变体催化合成R-J6的影响如图4所示。当摩尔比为1：1时，R-J6产量与eeR值分别为2.67g/L和98.5％。当摩尔比为3：1时，R-J6产量变化曲线与eeR值变化曲线发生交叉，此时，R-J6产量与eeR值分别为20.2g/L和69.7％。
实施例5
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)20-160g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为3:1，催化剂为CALB-A141S-A283V突变体，生物游离酶添加量为60g/L，以甲基叔丁基醚为溶剂，加入完毕，反应24小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯(R-J6)。
底物浓度对A141S-A283V突变体对催化反应的影响如图5所示。底物浓度对反应选择性的影响很大，当底物浓度小于80g/L时eeR值大于90％，当底物浓度小于60g/L时eeR值大于99％。
实施例6
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为3:1，催化剂为CALB-A141S-A283V突变体，生物固定化酶添加量为10g/L-90g/L，以甲基叔丁基醚为溶剂，加入完毕，反应24小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯(R-J6)。A141S-A283V突变体添加量对R-J6产量和eeR值影响如图6所示。当酶加量达到70g/L，eeR值达到99.65％。
实施例7
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为3:1，催化剂为CALB-A141S-A283V、S201D、CALB-Lost突变体，酶添加量为60g/L，以甲基叔丁基醚为溶剂，加入完毕，于10℃条件下反应24小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯(R-J6)。A141S-A283V突变体的醇解反应随时间的变化情况如图7所示。从图中可以看出，R-J6产量随时间不断增加，eeR值随时间不断降低。反应24h时，R-J6产量达到27.5g/L，eeR值降到了87％。
实施例8
将密闭的10ml的摇瓶放入恒温摇床内，加入3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸酐(底物)60g/L，甲醇与底物的摩尔浓度比为3:1，催化剂为CALB-A141S-A283V、S201D、CALB-Lost突变体，酶添加量为60g/L，以甲基叔丁基醚为溶剂，加入完毕，于5℃条件下反应24小时，期间用液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲醇，纯化处理得到无色晶体(R)-3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸单甲酯(R-J6)。
不同突变体催化合成3-叔丁基二甲基硅烷基戊二酸甲单酯结果如图8所示，以商品化酶Novozyme435为对照。Novozyme435催化可合成产物为单一构型的S-J6，S-J6产量为9.2g/L，产率达23.0％，eeS值达89.3％；S201D突变体催化可合成6.4g/L的R-J6，R-J6产率达16.02％，eeR值达70.24％；CALB-Lost突变体催化可合成R-J6的产量可达13.5g/L，R-J6产率达33.7％，eeR值达97.1％；A141S-A283V突变体催化可合成产物为单一构型(R-J6)，R-J6产量为32.8g/L，产率达82.0％，eeR值达98.47％。A141S-A283V突变体催化合成R-J6的样品中S-J6峰基本消失不见(其液相图参见图9)。
实施例9
将底物3-羟基戊二酸、辅底物叔丁醇、固定化突变体酶A141S-A283V、异丙醚投入到反应器中进行非水相催化，反应温度为4℃，反应时间为72h。其中辅底物与底物的摩尔比为1:10，底物与酶的质量比为1.4:1，所述有机溶剂与底物的摩尔比为300:1。反应后得到产物产量为3.8g/L，eeR值达86.4％。
实施例10
将底物3-乙氧基戊二酸、辅底物乙醇、固定化突变体S201D酶、异辛烷投入到反应器中进行非水相催化，反应温度为35℃，反应时间为3h。其中辅底物与底物的摩尔比为4:1，底物与酶的质量比为2.5:1。反应后得到产物71.5g/L，eeR值为33％，产率达89.4％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体是由南极假丝酵母菌脂肪酶B(CALB)突变得到的；
所述突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列；
所述突变体是通过微调对映体选择性口袋以提高酶与R型产物的特异性或者削弱酶与S型产物的亲和力的突变方式，最终提高酶对R 型产物选择性。
2.权利要求1所述突变体催化合成R型产物的方法，其特征在于，所述方法包括：将底物、辅底物、突变体酶、有机溶剂投入到反应器中进行非水相催化；所述辅底物与底物的摩尔比为1:10 - 8:1，底物与酶的质量比为1:6 - 6:1，所述有机溶剂与底物的摩尔比为2:1- 300:1；所述底物为3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸酐、3-羟基戊二酸或者3-乙氧基戊二酸，辅底物为有机醇；
所述非水相催化反应温度为4-80oC，反应时间为3-72h；
所述方法还包括在反应体系中添加5-30 % 反应系统体积的有机碱。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是以下任意一种或者多种的混合：有机醇、环己烷、正己烷、异辛烷、丙烷、乙醚、甲基叔丁基醚或异丙醚。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶是固定化生物酶或者游离酶。
5.权利要求1所述突变体在制备治疗高血脂症药物方面的应用。
CN201510179543.9A 2015-04-15 2015-04-15 一种非水相催化制备(r)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的calb突变体 Active CN104745550B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510179543.9A CN104745550B (zh) 2015-04-15 2015-04-15 一种非水相催化制备(r)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的calb突变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510179543.9A CN104745550B (zh) 2015-04-15 2015-04-15 一种非水相催化制备(r)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的calb突变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104745550A CN104745550A (zh) 2015-07-01
CN104745550B true CN104745550B (zh) 2018-05-04

Family

ID=53585810

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510179543.9A Active CN104745550B (zh) 2015-04-15 2015-04-15 一种非水相催化制备(r)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的calb突变体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104745550B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10035995B2 (en) 2015-12-07 2018-07-31 Eastman Chemical Company CALB variants
CN107384892B (zh) * 2017-07-14 2019-12-24 江南大学 一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体、改造方法及其应用
CN115595340B (zh) * 2022-11-28 2023-03-17 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 合成亚烷基二元酸单酯的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480028A (zh) * 2014-12-16 2015-04-01 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种稳定高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480028A (zh) * 2014-12-16 2015-04-01 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种稳定高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADO17904.1;Genbank;《NCBI》;20101011;全文 *
Chain A，Cystal Structure of Calb Mutant l278m From Candida Antarctica,PDB:4K6H_A;Genbank;《NCBI》;20140517;第1页 *
Two Novel Apolipoprotein A-IV Variants in Individual With Familial Combined Hyperlipidemia and Diminishied Levels of Lipoprotein Lipase Activity;S.S.Deeb，et al;《HUMAN MUTATION》;19961231;第8卷(第4期);全文 *
生物催化不对称合成β-羟基酸衍生物;马大友等;《化学进展》;20081130;第20卷(第11期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104745550A (zh) 2015-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104745550B (zh) 一种非水相催化制备(r)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物的calb突变体
CN107384892B (zh) 一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体、改造方法及其应用
CN104673870B (zh) 固定化酯酶E.coli BioH催化合成维生素A棕榈酸酯的方法
JPH03228694A (ja) 光学活性ヒドロキシラクトン類の製造方法
AU2007316715A1 (en) Cyclopentene diol monoacetate derivatives
JP6145538B2 (ja) 触媒を用いたシクロヘキサン−１，２−ジカルボン酸ジメチルの生物学的分割による（３ａＳ，７ａＲ）−ヘキサヒドロイソベンゾフラン−１（３Ｈ）−オンの製造方法
CN102686558A (zh) 光学活性3-取代戊二酸单酰胺的制造方法
US9045781B2 (en) Process for the production of optically-active esters of lactic acid and lactyllactic acid
CN109161577B (zh) 一种左旋Corey内酯二醇中间体、其制备方法及其药物应用
CN103409402A (zh) 醛缩酶突变体
Oláh Synthesis of Enantiopure Compounds Applying Continuous-Flow Chemoenzymatic Systems
JP5506658B2 (ja) 好熱性古細菌由来エステラーゼを用いた光学活性カルボン酸の製造方法
JPH02142495A (ja) 光学活性アルコールの製造方法
CN104630297A (zh) 一种酶法非水相催化合成(r)-3-tbdmso戊二酸甲单酯及其衍生物
JPH01281098A (ja) 光学活性カルボン酸及び光学活性カルボン酸エステルの製造方法
JP4196470B2 (ja) 光学活性α−ヒドロキシラクトン類の製造方法
KR100545472B1 (ko) 효소적 방법에 의한 광학활성 시스-1-r아미노-2-인다놀 및 그의 에스테르 제조방법
US5959159A (en) Method for preparing optically active 5-hydroxy-3-(4&#39;-hydroxyphenyl)-1,1,3-trimethylindane
CN1086422C (zh) 酶催化不对称水解反应制备s－(+)－萘普生的方法
JPH02227097A (ja) 光学活性第一アルコールの製造方法
JP3620872B2 (ja) 光学活性な１−フェロセニル−２，２，２−トリフルオロエタノール誘導体の製法及び新規な１−フェロセニル−２，２，２−トリフルオロエチルカルボキシラート化合物
JPH03292890A (ja) 光学活性３―アリール―３―ヒドロキシプロピオン酸アルキルの製造法
JPH02171192A (ja) （□ｄｓ）―３―ヒドロキシブタン酸エステルの製造方法
JPH03254694A (ja) 光学活性な含フッ素アルコールの製造方法
JP3950492B2 (ja) 光学活性含フッ素アルコールの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant