CN105154376A - 一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株及其液体发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌及其液体发酵方法。所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌(Bacillus？licheniformis)M6-X3，菌株保藏编号为：CGMCC？NO.10785。地衣芽孢杆菌诱变株CGMCC？NO.10785液体发酵产耐酸性高温α-淀粉酶的方法发酵活力在3.8万-4.2万u/mL。所产的耐酸性高温α-淀粉酶在95℃保温3h后剩余酶活力为95％，最适反应温度范围96-100℃，最适反应pH4.0-4.5，具有良好的耐高温性和耐酸性，可广泛应用在淀粉加工、啤酒酿造、发酵及纺织等多个行业。

Description

一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株及其液体发酵方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产高温淀粉酶的菌株及其液体发酵方法。

背景技术：

α-淀粉酶是工业生产中应用最广泛的酶制剂之一，国内市场常用的淀粉酶一般为中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶，其适用pH在6-7之间，大部分存在热稳定性差和pH范围窄的缺陷，对酸性条件下的淀粉深加工工艺存在局限性。

淀粉产品深加工一般包括两个过程：液化及糖化。首先液化需要在105℃条件下糊化形成淀粉糊，再经淀粉酶液化，之后在50℃-60℃温度范围内由葡萄糖淀粉酶作用下糖化；除了作用温度不同外，在液化和糖化两个过程中所需的两种酶：α-淀粉酶和糖化酶的作用pH也有显著差异。耐酸性高温α-淀粉酶可以省去淀粉糊化到液化的冷却过程，减少大量的能源消耗，提高液化速度，方便从液化到糖化过程的pH调节，简化工序，降低生产成本。

耐酸性高温α-淀粉酶是在酸性和高温条件下将淀粉水解的酶类，其在酸性和高温条件下具有良好的酶学稳定性，可广泛应用于食品加工、酿酒、纺织等多个行业。

中国专利CN102363761A公开了一种产耐高温α-淀粉酶菌种的优化方法，采用地衣芽孢杆菌10181从菌种活化、菌种扩培到发酵提取整个过程进行优化，该菌种所产的耐高温α-淀粉酶其酶活一般在2500u/ml,耐受温度为95℃；中国专利CN101838635A公开了一种耐高温淀粉酶的制备方法，将地衣芽孢杆菌进行菌种复壮培养、种子培养，经液体深层发酵而成的耐高温α-淀粉酶其酶活力高达20000-22000u/ml,耐受温度高达110℃；中国专利CN100415879C公开了耐酸耐高温的α-淀粉酶及其制备方法，用重组DNA技术定点突变前体α-淀粉酶，从微生物特别是地衣芽孢杆菌中分离前体α-淀粉酶基因，对其L134及S320的氨基酸残基进行突变，并在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等细菌中高效表达α-淀粉酶突变体，较适宜在枯草芽孢杆菌中表达，使耐酸pH4.0-4.5、且高温70-90℃的α-淀粉酶得以高效表达，α-淀粉酶突变体具有良好的酸稳定性，更适于工业化应用，为耐酸性、耐高温α-淀粉酶的工业化大生产提供了一条可行途径。

如上所述，随着生物技术的发展，会有更多的分离菌、诱变菌、基因工程菌及其组合会应用到耐高温α-淀粉酶的生产中来，以满足日益增长的工业化生产需求。

为了降低生产成本、拓展作用条件及范围，满足市场需求，需要开发或者优化出一株产酶活力高、生产稳定性好、适应强的生产菌株。

发明内容：

本发明的目的是提供一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株及其液体发酵方法。

本发明提供的高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株具体为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)突变株M6-X3。该菌株已于2015年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCCNO.10785。

所述地衣芽孢杆菌突变株CGMCCNO.10785采用地衣芽孢杆菌B307进行常压室温等离子体(ARTP)诱变选育获得。地衣芽孢杆菌B307的液体发酵酶活最高为16000u/mL，突变株M6-X3的液体发酵酶活力可达到26860u/mL，经发酵条件优化，平均发酵液酶活力可达到42470u/mL。

地衣芽孢杆菌突变株CGMCCNO.10785为革兰氏阳性菌，兼性好氧，生长温度为25℃-50℃，细胞形态呈杆状，单生，牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈白色，圆形，表面粗糙，不透明。明胶液化、淀粉水解和VP试验均为阳性。

地衣芽孢杆菌B307液体发酵周期长，菌体浓度低，为得到一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株，对其进行多轮常压室温等离子体诱变，直到选育出一株代谢旺盛，生长繁殖速度快，适宜高密度培养，高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株。

地衣芽孢杆菌CGMCCNO.10785液体发酵产耐酸性高温α-淀粉酶的方法，包括如下步骤：

种子培养：pH在6.0-6.5，培养温度34℃-40℃，培养时间11-16小时；

种子培养基组成：麦芽糊精3-4％，酵母粉0.2-0.3％，氯化钙0.2-0.3％，硫酸铵0.8-1.0％，蛋白胨0.5-0.6％，磷酸氢二钠0.4-0.5％，pH6.0-6.5。

液体发酵：

接种量3-5％接种于发酵培养基，培养条件为：pH6.0-6.5，培养温度35-40℃，罐压0.07MPa，溶氧在30％-40％，转速200-800rpm，发酵期间pH高于6.5开始补料，补料控制pH在6.0-6.5，菌体自溶严重时发酵结束，培养周期130-160小时。

发酵培养基组成：木薯淀粉6-8％，豆饼粉6-7％，玉米浆1-3％，磷酸氢二铵0.1-0.3％，氯化钙0.5-1.0％，pH6.0-6.5。

补料培养基组成：麦芽糖30-40％，磷酸二氢钠0.5-1.0％，氯化钙0.5-1.0％，pH在5.0-5.5。

有益效果：

本发明通过对原始菌株进行常压室温等离子体诱变，再经发酵工艺优化和发酵培养基优化，建立了液体发酵生产耐酸性高温α-淀粉酶的方法，发酵酶活力在3.8万-4.2万u/ml。生产的耐酸性高温α-淀粉酶的最适pH为4.0-5.0，最适温度反应为96-100℃，在95℃的条件保温3h，剩余酶活力为95％，具有稳定的耐酸和耐高温特性，可广泛用于淀粉加工、啤酒酿造、酒精、发酵及纺织等多个行业。

附图说明：

图1不同pH下的相对酶

图2不同温度下的相对酶活

图395℃保温处理的相对酶活

具体实施方式：

以下通过具体实施案例对本发明做详细说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1菌株的选育

1.菌悬液的制备

吸取地衣芽孢杆菌B307种子液10mL于离心管，8000rpm离心5min，弃上清，菌体以10mL生理盐水清洗。相同条件离心2次，沉淀的菌体以2mL无菌水重悬即为菌悬液，菌悬液浓度在10⁷个/mL。

2.常压室温等离子体诱变

吸取10μL菌悬液于载片上，用镊子将载片放于常压室温等离子体系统操作室旋转台上，缓慢调节升降台旋钮(参考升降台标尺)将载片与发生器间距约为2mm，诱变照射时间选择30s、35s、40s。诱变完成后，将载片移至分装有1mL生理盐水的EP管中，用漩涡振荡器摇匀后进行适当稀释。取100μL涂布于淀粉筛选板上，30℃培养36h，长出单菌落后挑取菌落HC值(HC值＝水解圈直径/菌落直径)高的菌株，分别是M6-X3、M6-22、M6-37。

3.诱变菌株的摇瓶筛选

将筛选的3株诱变菌株进行摇瓶发酵，摇瓶配方为：葡萄糖3％，酵母粉1.5％，玉米浆3.5％，氯化钙0.12％，氯化钠1.5％，磷酸二氢钠1.2％，碳酸钙3％。培养温度35℃，培养时间120h，转速200rpm。3株诱变菌株摇瓶实验的酶活力如下：

菌株	三次平均酶活力
		M6-X3	5427
M6-22	3350
		M6-37	3708

实施例2液体发酵生产耐酸性高温α-淀粉酶

斜面培养：将所述地衣芽孢杆菌突变株M6-X3取一接种环接种于LB固体斜面，34℃下恒温培养36h。

摇瓶培养：取一接种环斜面种子菌苔，接入LB液体培养基中，在初始pH6.6、36℃、摇床转速250rpm条件下培养10h。

种子罐培养：将摇瓶培养的种子液按照接种量的4％接入种子罐，在初始pH6.3、发酵温度34℃、转速250rpm条件下培养13h。

种子罐培养基配方为：麦芽糊精3％，酵母粉0.2％，氯化钙0.25％，硫酸铵0.8％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钠0.5％，pH6.3。

发酵罐培养：按照发酵罐培养基体积的5％进行接种，培养温度35℃，罐压0.07MPa，转速800rpm，溶氧在30-40％，发酵过程中pH高于6.5开始补料，补料控制pH在6.2-6.3，菌体自溶严重时结束发酵，培养周期150h。

发酵培养基配方为：木薯淀粉8％，豆饼粉6％，玉米浆1％，磷酸氢二铵0.3％，氯化钙0.5％，pH6.3。

补料配方为：麦芽糖40％，磷酸二氢钠0.5％，氯化钙0.5％，pH在5.0。

下表是进行6批发酵的发酵周期和发酵酶活力，平均发酵酶活力为：42470u/mL。

批次	发酵周期(h)	发酵酶活力(u/mL)
			1	152	40151
2	162	43780
			3	148	42916
4	155	41884
			5	147	42965
6	161	43125

实施例3所产耐酸性高温α-淀粉酶的基本性质

以酶活力41518u/mL的耐酸性高温α-淀粉酶为基准，分别在不同温度和不同pH下进行酶活测定实验，该菌株所产酶的最适反应温度为96-100℃，最适pH范围为4.0-5.0。在95℃保温处理3h，剩余酶活力为95％。

另本发明耐酸性高温α-淀粉酶酶活定义及测定方法如下：

(1)酶活定义：

在70℃、pH6.0的条件下，1min液化1mg可溶性淀粉所需的酶量即为一个酶活力单位，以u/mL(u/g)表示。

(2)试剂和溶液：

原碘液：称取22.0g碘化钾和11.0g碘，用少量水完全溶解，定容至500mL，贮于棕色瓶中。

稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加入20.0g碘化钾，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶。

20g/L可溶性淀粉溶液：称取2.000g可溶性淀粉(以绝干计)，精确至0.0001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，搅拌加热直至完全透明，冷却定容至100mL。溶液现配现用。

磷酸缓冲液(pH＝6.0)：称取45.23g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·2H₂O)、8.07g柠檬酸(C₆H₈0₇·H₂O)，用水溶解并定容至1000mL，配好后用pH计校正。

盐酸溶液[c(HCl)＝0.1mol/L]，按GB601配制。

(3)待测酶液的制备

准确吸取酶液1mL，用少量磷酸缓冲液(pH6.0)充分溶解，样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液(pH6.0)定容至刻度，摇匀，四层纱布过滤，滤液待用。稀释的酶液浓度在60u/mL-65u/mL范围内。

(4)测定方法：

吸取20g/L的可溶性淀粉溶液20.0mL和磷酸缓冲液(pH＝6.0)5.0mL于试管中，混合均匀，在70℃恒温水浴中预热平衡8min。加入稀释好的待测酶液1.00mL，立即计时，摇匀，准确反应5min。反应结束立即吸取反应液1.00mL，加到预先盛有0.1mol/L盐酸0.5mL和稀碘液5.00mL的试管中，摇匀。以0.1mol/L盐酸0.5mL和稀碘液5.00mL的混合液作试剂空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表(表格详见GB8275-2009)，求得测试酶液的浓度。

耐酸性高温α-淀粉酶酶活计算公式：

X＝C×N×16.67

式中：

X——样品酶活力，u/mL；

C——测试酶样的浓度，u/mL；

N——样品稀释倍数；

16.67——根据酶活力定义计算的换算系数。

Claims (6)

1.一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株具体为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)M6-X3，菌株保藏编号为：CGMCCNO.10785。

2.根据权利要求1所述的高产耐酸性高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌菌株具有高产耐酸性高温α-淀粉酶特性，液体发酵活力在3.8-4.2万u/mL。

3.如权利要求1所述的高产耐酸性高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述耐酸性高温α-淀粉酶的最适pH为4.0-5.0，最适反应温度为96-100℃，在95℃的条件保温3h，剩余酶活力为95％。

4.一种利用权利要求1所述地衣芽孢杆菌生产酸性高温α-淀粉酶的方法，包括如下步骤：

种子罐培养条件：接种量3％-6％，培养温度34℃-40℃，培养时间11-16小时，pH在6.0-6.5；

种子罐培养基组成：麦芽糊精3-4％，酵母粉0.2-0.3％，氯化钙0.2-0.3％，硫酸铵0.8-1.0％，蛋白胨0.5-0.6％，磷酸氢二钠0.4-0.5％，pH6.0-6.5。

液体发酵：接种量3-5％接种于发酵培养基，培养条件为：pH6.0-6.5，培养温度35-40℃，罐压0.07MPa，溶氧在30％-40％，转速200-800rpm，发酵期间pH高于6.5开始补料，补料控制pH在6.0-6.5，菌体自溶严重时发酵结束，培养周期130-160小时。

5.根据权利要求4所述一种利用地衣芽孢杆菌生产酸性高温α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：木薯淀粉6-8％，豆饼粉6-7％，玉米浆1-3％，磷酸氢二铵0.1-0.3％，氯化钙0.5-1.0％，pH6.0-6.5。

6.根据权利要求4所述一种利用地衣芽孢杆菌生产酸性高温α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述补料的培养基组成为：麦芽糖30-40％，磷酸二氢钠0.5-1.0％，氯化钙0.5-1.0％，pH在5.0-5.5。