BR112020004149A2 - métodos e composições para fabricar bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos - Google Patents

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Abstract

Métodos e composições para fabricar bacteriocinas são descritos em algumas modalidades aqui. Em algumas modalidades, pró-polipeptídeo compreendendo as bacteriocinas nas razões desejadas em cis e separadas por sítio de clivagem pode ser produzido por uma célula microbiana compreendendo um ácido nucleico que codifica o pró-polipeptídeo. Em algumas modalidades, dispositivos microfluídicos e métodos para fabricar misturas específicas de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas são descritos.

Description

“MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA FABRICAR BACTERIOCINAS E PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS” PEDIDOS RELACIONADOS
[001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA No 62/720.804, depositado em 21 de agosto de 2018 e Pedido Provisório dos EUA No 62/552.835, depositado em 31 de agosto de 2017. Os conteúdos dos pedidos anteriormente mencionados são expressamente incorporados aqui a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS, TABELA ou LISTAGEM DE
PROGRAMA DE COMPUTADOR
[002]O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado SYNG003WOSEQUENCE.TXT, criado e salvo por último em 29 de agosto de 2018, que é de 402.916 bytes em tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências é incorporada aqui a título de referência em sua totalidade.
Fundamentos
[003]Processos mediados por organismo microbiano podem ser usados em uma variedade de processos industriais para a fabricação de produtos de interesse, por exemplo, para a fermentação em uma matéria-prima. Adicionalmente, organismos microbianos podem ser usados para fabricar produtos em ambientes estéreis, tal como na fabricação de produtos farmacêuticos, produtos biológicos e cosméticos.
Adicionalmente, populações de organismos microbianos estão envolvidas na manutenção da saúde e funções metabólicas de organismos multicelulares, por exemplo, como culturas de flora microbiana no intestino e pele de seres humanos ou nas raízes das plantas. A eficiência e eficácia destes processos podem ser afetadas por condições de cultura, bem como pelas características fenotípicas de organismos microbianos presentes na cultura.
[004]Ajustar populações de organismos microbianos, por exemplo para reduzir ou eliminar organismos microbianos indesejados pode ser útil para manter os processos industriais e manter a saúde dos tecidos que compreendem organismos microbianos.
Campo
[005]As modalidades aqui geralmente se referem a produção de produtos genéticos para o controle do crescimento de microrganismos. Mais particularmente, algumas modalidades se referem a métodos, reagentes e dispositivos microfluídicos para fabricar bacteriocinas. As bacteriocinas podem ser produzidas em uma composição, tal como uma mistura específica de bacteriocinas, que pode ser útil para controlar o crescimento de populações de organismos microbianos. Em algumas modalidades, peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas são produzidos em razões desejadas em uma composição.
Sumário
[006]Algumas modalidades incluem um método de fabricar bacteriocinas. O método pode compreender expressar um ácido nucleico compreendendo uma sequência de codificação de bacteriocina e uma sequência de codificação de polipeptídeo secundário em uma estrutura de leitura única, em que o polipeptídeo secundário compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma bacteriocina ou molécula de sinal. O ácido nucleico pode compreender ainda sequências de codificação de sítio de clivagem dispostas entre a sequência de codificação de bacteriocina e a sequência de codificação de polipeptídeo secundário na estrutura de leitura única. Assim, um pró-polipeptídeo compreendendo a bacteriocina, polipeptídeo secundário e sítios de clivagem dispostos entre a bacteriocina e polipeptídeo secundário pode ser gerado. Em algumas modalidades, o método compreende ainda clivar o sítio de clivagem, separando assim a bacteriocina e polipeptídeo secundário um do outro.
O método pode produzir assim uma composição compreendendo a bacteriocina e o polipeptídeo secundário.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo secundário compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma bacteriocina.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo secundário compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um peptídeo antimicrobiano.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo secundário compreende,
consiste essencialmente em ou consiste na molécula de sinal.
Em algumas modalidades, a expressão é realizada por uma célula microbiana que não produz um modulador de imunidade funcional para pelo menos uma das bacteriocinas.
Em algumas modalidades, a célula microbiana não produz um modulador de imunidade funcional para qualquer uma das bacteriocinas.
Em algumas modalidades, a expressão é realizada in vitro.
Em algumas modalidades, pelo menos uma das bacteriocinas é inativa quando a mesma é parte do pró-polipeptídeo.
Em algumas modalidades, o método compreende ainda isolar o pró-polipeptídeo antes da clivagem.
Em algumas modalidades, o isolamento compreende purificação por afinidade do pró-polipeptídeo, em que a purificação por afinidade compreende ligar uma etiqueta de afinidade codificada pelo ácido nucleico.
Em algumas modalidades,
o ácido nucleico compreende três sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única.
Em algumas modalidades, pelo menos duas das bacteriocinas são diferentes uma da outra.
Em algumas modalidades, a composição compreende uma razão desejada de bacteriocinas ou uma razão desejada de moléculas de sinal e bacteriocinas.
Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da razão desejada é obtida por uma razão de sequências de codificação de bacteriocina ou sequências de codificação de bacteriocina e molécula de sinal na estrutura de leitura única do ácido nucleico.
Em algumas modalidades, a razão desejada é obtida ainda por um ácido nucleico secundário compreendendo uma razão de sequências de codificação de bacteriocinas e compreendendo ainda sítios de clivagem entre as sequências de codificação de bacteriocina.
Em algumas modalidades, a razão desejada é obtida por uma razão de sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única do ácido nucleico.
Em algumas modalidades, a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados e/ou a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma planta, uma raiz de planta e/ou solo (por exemplo, no contexto de uma raiz de planta e solo). Em algumas modalidades, a razão desejada de bacteriocinas e moléculas de sinal é selecionada para controlar desvio genético de uma célula microbiana alvo e estimular o crescimento ou produção de uma célula produtora.
Em algumas modalidades, a razão desejada compreende uma razão de uma bacteriocina primária para uma bacteriocina secundária de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 2:3, 2:5, 2:7, 2:9, 3:4, 3:5, 3:7, 3:8, 3:10, 4:5, 4:7, 4:9, 5:6, 5:7, 5:8, 5:9, 6:7, 7:8, 7:9, 7:10, 8:9 ou 9:10,
em que a bacteriocina primária é diferente da bacteriocina secundária.
Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem do tipo selvagem, variante ou sintética, tal como uma endopeptidase.
Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem selecionada do grupo consistindo em: Arg-C proteinase, Asp-N endopeptidase, BNPS-Skatol,
Caspase 1, Caspase 2, Caspase 3, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 6, Caspase 7,
Caspase 8, Caspase 9, Caspase 10, Quimiotripsina de especificidade alta, Clostripain
(Clostridiopeptidase B), CNBr, Enterocinase, Fator Xa, Ácido fórmico, Glutamil endopeptidase, Granzima B, Hidroxilamina, Ácido iodosobenzoico, LysC, Neutrófilo elastase, NTCB (ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico), Pepsina (pH 1,3), Pepsina (pH >2),
Prolina-endopeptidase, Proteinase K, Peptidase I estafilocócica, Termolisina, Tromina ou Tripsina.
Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são para uma única enzima de clivagem e em que a enzima de clivagem não cliva dentro das bacteriocinas. Em algumas modalidades, pelo menos um sítio de clivagem é for uma enzima de clivagem primária e um outro sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem secundária e nem a enzima de clivagem primária nem a secundária cliva dentro das bacteriocinas. Em algumas modalidades, a composição produzida pelo método compreende ainda uma molécula de sinal (em que o nucleotídeo compreende ainda: uma sequência de codificação para uma molécula de sinal na estrutura de leitura única) e um sequência de sítio de clivagem disposto entre a molécula de sinal e uma sequência de codificação de bacteriocina. Em algumas modalidades, a molécula de sinal é selecionada do grupo consistindo em: moléculas de quorum sensing, ligantes de receptor de transdução de sinal, fatores de crescimento, hormônios e citocinas e em que a molécula de sinal pode ser do tipo selvagem, mutante ou sintética. Em algumas modalidades, a molécula de sinal compreende, consiste em ou consiste essencialmente em um peptídeo de quorum sensing. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo tem um comprimento de não mais do que cerca de 2000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o método compreende ainda expressar um ácido nucleico secundário que codifica um pró-polipeptídeo secundário compreendendo duas bacteriocinas e sítios de clivagem dispostos entre as mesmas, em que o pró-polipeptídeo secundário é diferente do pró-polipeptídeo primário. Em algumas modalidades, a clivagem do pró-polipeptídeo compreende tratamento físico de um ligador de peptídeo compreendido pelo sítio de clivagem, em que o ligador de peptídeo é sensível a produto químico ou sensível ao pH. Em algumas modalidades, o método compreende ainda modificar quimicamente as bacteriocinas. Em algumas modalidades, as bacteriocinas são quimicamente modificadas co-traducionalmente.
Em algumas modalidades, as bacteriocinas são quimicamente modificadas a seguir da clivagem. Em algumas modalidades, um pró-polipeptídeo como descrito aqui compreende dois ou mais peptídeos antimicrobianos ao invés de bacteriocinas e após a clivagem, uma composição compreendendo peptídeos antimicrobianos é produzida.
Em algumas modalidades, um pró-polipeptídeo como descrito aqui compreende um ou mais peptídeos antimicrobianos e uma ou mais bacteriocinas e após a clivagem, uma composição compreendendo uma mistura de peptídeos antimicrobianos e bacteriocinas é produzida.
[007]Algumas modalidades incluem um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de codificação de bacteriocina e uma sequência de codificação de polipeptídeo secundário em uma estrutura de leitura única, em que o polipeptídeo secundário compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma bacteriocina ou uma molécula de sinal. O ácido nucleico isolado pode compreender sequências de codificação de sítio de clivagem dispostas entre as sequências de codificação de bacteriocina e na estrutura de leitura única. Em algumas modalidades, o polipeptídeo secundário compreende, consiste essencialmente em ou consiste na bacteriocina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo secundário compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um peptídeo antimicrobiano. Em algumas modalidades, o polipeptídeo secundário compreende, consiste essencialmente em ou consiste na molécula de sinal. Em algumas modalidades, as sequências de codificação de sítio de clivagem codificam sítios de clivagem para uma enzima de clivagem e em que as sequências de codificação de bacteriocina não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende três sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende pelo menos 5, 10, 15 ou 20 sequências de bacteriocina na estrutura de leitura única. Em algumas modalidades, uma sequência de codificação de sítio de clivagem é disposta em estrutura entre quaisquer suas sequências de codificação de bacteriocina e/ou molécula de sinal adjacentes. Em algumas modalidades, pelo menos duas das sequências de bacteriocina codificam bacteriocinas diferentes entre si. Em algumas modalidades, as três sequências de bacteriocina estão presentes em uma razão desejada ou porção de uma razão desejada.
Em algumas modalidades, a razão desejada é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados.
Em algumas modalidades, a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma planta, uma raiz de planta e/ou solo (por exemplo, no contexto de uma raiz de planta e solo). Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem do tipo selvagem, variante ou sintética, tal como uma endopeptidase.
Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem selecionada do grupo consistindo em: Arg-C proteinase, Asp-N endopeptidase, BNPS-Skatol, Caspase 1, Caspase 2, Caspase 3, Caspase 4,
Caspase 5, Caspase 6, Caspase 7, Caspase 8, Caspase 9, Caspase 10,
Quimiotripsina de especificidade alta, Clostripain (Clostridiopeptidase B), CNBr, Enterocinase, Fator Xa, Ácido fórmico, Glutamil endopeptidase, Granzima B,
Hidroxilamina, Ácido iodosobenzoico, LysC, Neutrófilo elastase, NTCB (ácido 2-nitro-
5-tiocianobenzoico), Pepsina (pH 1,3), Pepsina (pH >2), Prolina-endopeptidase,
Proteinase K, Peptidase I estafilocócica, Termolisina, Tromina ou Tripsina.
Em algumas modalidades, uma sequência de codificação de sítio de clivagem primária codifica um sítio de clivagem primária para uma enzima de clivagem primária e em que uma segunda sequência de codificação de sítio de clivagem codifica um sítio de clivagem para uma enzima de clivagem secundária que é diferente da enzima de clivagem primária e em que as bacteriocinas não compreendem um sítio de clivagem para nenhuma da enzima de clivagem primária ou secundária.
Em algumas modalidades, os sítios de clivagem compreendem um ligador sensível ao pH ou quimicamente sensível.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende ainda uma sequência de codificação para uma molécula de sinal na estrutura de leitura única, em que uma sequência de codificação de sítio de clivagem é disposta entre a sequência de codificação para molécula de sinal e uma sequência de codificação de bacteriocina adjacente. Em algumas modalidades, a molécula de sinal é selecionada do grupo consistindo em: moléculas de quorum sensing, ligantes de receptor de transdução de sinal, fatores de crescimento, hormônios e citocinas e em que a molécula de sinal pode ser do tipo selvagem, mutante ou sintética. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado como descrito aqui compreende duas ou mais sequências de codificação de peptídeo antimicrobiano ao invés de sequências de codificação de bacteriocina e codifica um pró-polipeptídeo compreendendo os peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado como descrito aqui compreende uma ou mais sequências de codificação de peptídeo antimicrobiano e uma ou mais sequências de codificação de bacteriocina e codifica um pró-polipeptídeo compreendendo um ou mais peptídeos antimicrobianos e uma ou mais bacteriocinas.
[008]Algumas modalidades incluem uma célula microbiana, compreendendo um promotor operavelmente ligado ao ácido nucleico isolado de qualquer uma das modalidades descritas aqui, em que a célula microbiana isolada não produz um modulador de imunidade funcional para uma bacteriocina codificada pelo ácido nucleico isolado. Em algumas modalidades, a célula não produz um modulador de imunidade funcional para nenhuma das bacteriocinas codificadas pelo ácido nucleico isolado.
[009]Algumas modalidades incluem um pró-polipeptídeo isolado compreendendo duas bacteriocinas e/ou uma bacteriocina e uma molécula de sinal, sítios de clivagem dispostos entre as bacteriocinas e/ou a bacteriocina e a molécula de sinal; e uma etiqueta de afinidade. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende as duas bacteriocinas. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende a bacteriocina e a molécula de sinal. Em algumas modalidades, o pró- polipeptídeo compreende três bacteriocinas. Em algumas modalidades, o pró-
polipeptídeo compreende pelo menos 5, 10, 15 ou 20 bacteriocinas. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende uma molécula de sinal. Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem e em que as sequências de codificação de bacteriocina não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem primária, em que um outro sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem secundária diferente da enzima de clivagem primária e em que as bacteriocinas não compreendem um sítio de clivagem para nenhuma das enzimas de clivagem primárias ou secundárias. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo isolado compreende ainda uma modificação co-traducional ou pós-traducional. Em algumas modalidades, um pró-polipeptídeo isolado como descrito aqui compreende dois ou mais peptídeos antimicrobianos ao invés de bacteriocinas. Em algumas modalidades, um pró-polipeptídeo isolado como descrito aqui compreende um ou mais peptídeos antimicrobianos e uma ou mais bacteriocinas.
[010]Em algumas modalidades, uma composição compreendendo duas ou mais bacteriocinas em uma razão selecionada para alvejar uma célula microbiana ou populações de célula microbianas é descrita. Cada uma das bacteriocinas da composição pode compreender, em seu término N, término C ou término N e término C, uma porção de uma sequência de clivagem que foi clivada, em que as porções de sequências de clivagem nos términos N, C ou N e C das bacteriocinas são para sítios de clivagem da mesma enzima de clivagem ou diferente. Em algumas modalidades, pelo menos algumas das bacteriocinas compreendem ainda uma etiqueta. Em algumas modalidades, a etiqueta é selecionada do grupo consistindo em etiquetas de afinidade, uma sequência de sinal ou uma etiqueta de estabilidade. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma molécula de sinal em uma razão desejada com as bacteriocinas, em que a molécula de sinal compreende, em seu término N, término C ou término N e término C, uma porção de uma sequência de clivagem que foi clivada, em que as porções de sequências de clivagem nos términos N, C ou N e C da molécula de sinal são para sítios de clivagem das mesmas enzimas de clivagem ou diferentes. Em algumas modalidades, a razão de bacteriocinas é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados. Em algumas modalidades, a razão de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma planta, uma raiz de planta e/ou solo (por exemplo, no contexto de uma raiz de planta e solo). Em algumas modalidades, a composição é formulada para administração tópica ou oral a um sujeito humano. Em algumas modalidades, a composição é para o uso em equilibrar uma população de um microbioma, por exemplo, aquele de um animal, um órgão humano (tal como um intestino ou pele), uma planta, uma raiz de planta e/ou solo. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo isolado como descrito aqui compreende um ou mais peptídeos antimicrobianos. O pró-polipeptídeo pode ser clivado e a composição pode compreender um ou mais peptídeos antimicrobianos que compreendem porções de sequências de clivagem nos términos N, C ou N e C.
[011]Algumas modalidades incluem um método para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e/ou proteínas antimicrobianas, por exemplo. O método pode compreender selecionar a mistura para compreender duas ou mais bacteriocinas e/ou proteínas antimicrobianas diferentes. O método pode compreender, em um dispositivo microfluídico compreendendo substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano ou bacteriocina: colocar substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro; incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro, gerando assim peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas codificados pelos substratos de codificação separados; e misturar os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no dispositivo microfluídico,
produzindo assim a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
Em algumas modalidades, o método compreende ainda produzir duas ou mais submisturas, cada uma compreendendo um subconjunto da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e combinar as submisturas para produzir a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
Em algumas modalidades, selecionar compreende ainda selecionar uma estequiometria dos dois ou mais peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas diferentes da mistura específica.
Em algumas modalidades, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende uma estequiometria específica e combinar as submisturas resulta na estequiometria específica.
Em algumas modalidades, os substratos de codificação separados são compreendidos dentro de câmaras separadas.
Em algumas modalidades, os substratos de codificação separados compreendem ácidos nucleicos imobilizados nestes.
Em algumas modalidades, substratos de codificação separados que codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, mas não outros substratos de codificação separados, são colocados em comunicação fluídica com a solução de transcrição/tradução in vitro.
Em algumas modalidades, incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro compreende fluir a solução de transcrição/tradução in vitro em cada câmara.
Em algumas modalidades,
a solução de transcrição/tradução in vitro compreende um reagente de transcrição in vitro e/ou um reagente de tradução in vitro.
Em algumas modalidades, colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro compreende (i) abrir as válvulas de modo a colocar uma fonte da solução de transcrição/tradução in vitro em comunicação de fluido com os substratos de codificação separados; (ii) fechar as válvulas de modo a inibir comunicação de fluido entre a fonte da solução de transcrição/tradução in vitro e os outros substratos de codificação separados ou uma combinação de (i) e (ii). Em algumas modalidades, misturar os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no dispositivo microfluídico compreende abrir uma válvula para colocar os substratos de codificação separados em comunicação de fluido com um reservatório fluídico, em que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas são misturados no reservatório fluídico. Em algumas modalidades, o método compreende ainda triar a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas in situ para um efeito desejado. Em algumas modalidades, a triagem é para a inibição do crescimento ou reprodução de um organismo microbiano patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar. Em algumas modalidades, a triagem é quanto a uma ausência de efeitos deletérios da mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas sobre um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar. Em algumas modalidades, a triagem é realizada em tempo real. Por exemplo, a triagem pode ser realizada dentro de 120 minutos, 60 minutos, 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos ou 1 minuto da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas sendo gerada. Em algumas modalidades, a triagem é quanto à estabilização de um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina ou para a destruição de um biofilme microbiano. Em algumas modalidades, um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar com atividade anti-protease.
Em algumas modalidades, a triagem é quanto ao realce do crescimento ou reprodução de um organismo microbiano não patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido,
biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral,
mucosa, conjuntiva ou trato biliar.
Em algumas modalidades, um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar que atrai o organismo microbiano não patogênico ou que realça o crescimento ou reprodução do organismo microbiano não patogênico no microbioma de um sujeito.
Em algumas modalidades, o método compreende ainda liberar a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas a um ferimento por intermédio de um tubo ou membrana, limpando ou curando desse modo o ferimento.
Em algumas modalidades,
o efeito desejado compreende atividade antimicrobiana.
Em algumas modalidades, o método compreende ainda triar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 misturas diferentes contra uma infecção microbiana.
Em algumas modalidades, o método compreende ainda liberar a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos, em combinação com um antibiótico químico e/ou um antibiótico de fago, a um sujeito.
Em algumas modalidades, a solução de transcrição/tradução in vitro é liofilizada e compreende ainda adicionar água à solução de transcrição/tradução in vitro.
Em algumas modalidades, o método compreende fabricar uma mistura específica de bacteriocinas.
Como tal, o método pode compreender, em um dispositivo microfluídico compreendendo substratos de codificação separados de modo que cada um codifique uma bacteriocina: colocar substratos de codificação separados que codificam as bacteriocinas da mistura específica em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro; incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro, gerando assim bacteriocinas codificadas pelos substratos de codificação separados; e misturar as bacteriocinas no dispositivo microfluídico, produzindo assim a mistura específica de bacteriocinas.
Em algumas modalidades, o método compreende fabricar uma mistura específica de bacteriocinas que não compreende peptídeos antimicrobianos.
Em algumas modalidades, o método compreende fabricar uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos.
Em algumas modalidades, o método compreende fabricar uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos que não compreendem bacteriocinas. Em algumas modalidades, o método compreende fabricar uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos. Será entendido que se um método, dispositivo microfluídico ou sistema como descrito aqui for para fabricar uma mistura específica de bacteriocinas que não compreende peptídeos antimicrobianos, um tal método, dispositivo microfluídico ou sistema não precisa compreender selecionar peptídeos antimicrobianos como parte de uma mistura específica, não precisa compreender substratos de codificação separados que codificam peptídeos antimicrobianos e não precisa produzir ou fluir quaisquer peptídeos antimicrobianos. Será entendido que se um método, dispositivo microfluídico ou sistema como descrito aqui for para fabricar uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos que não compreendem bacteriocinas, um tal método, dispositivo microfluídico ou sistema não precisa compreender selecionar bacteriocinas como parte de uma mistura específica, não precisa compreender substratos de codificação separados que codificam bacteriocinas e não precisa produzir ou fluir quaisquer bacteriocinas.
[012]Algumas modalidades incluem um dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. O dispositivo pode compreender substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina; uma solução de transcrição/tradução in vitro; um reservatório fluídico; e válvulas, cada uma disposta em um caminho fluídico entre um substrato de codificação separado e o reservatório fluídico, cada válvula configurada para regular o fluxo entre o substrato de codificação separado e o reservatório fluídico. O dispositivo pode ser configurado para ser colocado em comunicação de dados com um processador configurado para: com base na mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico;
permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, de modo que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica sejam produzidos; permitir o fluxo dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas através das válvulas no reservatório fluídico; e controlar o fluxo de fluido no reservatório fluídico, em que o fluxo compreende o movimento dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico,
produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico.
Em algumas modalidades, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende duas ou mais submisturas, cada uma compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em um subconjunto de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas; e o processador é configurado para permitir o fluxo de cada submistura no reservatório fluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
Em algumas modalidades, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende uma soma dos subconjuntos de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas em uma estequiometria específica e em que a combinação das submisturas produz a estequiometria específica.
Em algumas modalidades, os substratos de codificação separados são compreendidos dentro de câmaras separadas.
Em algumas modalidades, os substratos de codificação separados compreendem ácidos nucleicos imobilizados nestes.
Em algumas modalidades, os substratos de codificação separados compreendem um material ou produto selecionado do grupo consistindo em uma microplaqueta, pérola,
nanopartícula, poço, membrana, matriz, plástico, metal, vidro, polímero,
polissacarídeo e composto paramagnético.
Em algumas modalidades, a solução de transcrição/tradução in vitro compreende um reagente de transcrição in vitro e/ou um reagente de tradução in vitro. Em algumas modalidades, o dispositivo é portátil. Em algumas modalidades, um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma proteína para a estabilização de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, uma proteína com atividade anti-protease ou uma proteína para a destruição de um biofilme microbiano. Em algumas modalidades, um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar que atrai um organismo microbiano não patogênico ou que realça o crescimento ou reprodução do organismo microbiano não patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar. Em algumas modalidades, o reservatório fluídico é configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um tecido de um sujeito.
Em algumas modalidades, o tecido compreende um microbioma, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar. Em algumas modalidades, o reservatório fluídico é configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um ferimento de um sujeito. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende ainda uma passagem fluídica tal como um tubo ou membrana através dos quais o reservatório fluídico é capaz de ser colocado em comunicação de fluido com o microbioma ou ferimento, através dos quais a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas é capaz de ser liberada ao microbioma ou ferimento. Em algumas modalidades, em que cada substrato de codificação separado codifica uma bacteriocina diferente. Em algumas modalidades, um substrato de codificação separado compreende o ácido nucleico isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em um peptídeo antimicrobiano e/ou sequência de codificação de bacteriocina e uma sequência de codificação de polipeptídeo secundário em uma estrutura de leitura única, como descrito aqui. Em algumas modalidades, um substrato de codificação separado codifica um pró-polipeptídeo isolado como descrito aqui. Em modalidades, o dispositivo microfluídico compreende ainda o processador. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende ainda um reservatório de antibióticos químicos ou de fago configurado para misturar com a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende ainda um antibiótico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em antibiótico químico e/ou um antibiótico de fago. Em algumas modalidades, a solução de transcrição/tradução in vitro é liofilizada. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas. Como tal, o dispositivo pode compreender substratos de codificação separados de modo que cada um codifique uma bacteriocina; uma solução de transcrição/tradução in vitro; um reservatório fluídico; e válvulas, cada uma disposta em um caminho fluídico entre um substrato de codificação separado e o reservatório fluídico, cada válvula configurada para regular o fluxo entre o substrato de codificação separado e o reservatório fluídico. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas que não compreende peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos que não compreendem bacteriocinas. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos.
[013]Algumas modalidades incluem um sistema. O sistema pode compreender um dispositivo microfluídico descrito aqui e um processador configurado para: com base em uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas (como descrito aqui), configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico; permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, de modo que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica sejam produzidos; permitir o fluxo dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas através das válvulas no reservatório fluídico; e controlar o fluxo de fluido no reservatório fluídico, em que o fluxo compreende o movimento dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico, produzindo assim a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico.
Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é compreendido por um cartucho e o sistema compreende um acoplamento para colocar o cartucho em comunicação de dados com o processador.
Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro.
Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um reservatório de antibióticos químicos e/ou de fago configurados para misturar com a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos.
Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um antibiótico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em um antibiótico químico e/ou um fago.
Em algumas modalidades, a solução de transcrição/tradução in vitro é liofilizada.
Em algumas modalidades, o sistema é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas.
Como tal, o processador pode ser configurado para, com base em uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas (como descrito aqui), configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam as bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico; permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, de modo que as bacteriocinas da mistura específica sejam produzidas. Em algumas modalidades, o sistema é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas que não compreende peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o sistema é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o sistema é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o sistema é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos que não compreendem bacteriocinas. Em algumas modalidades, o sistema é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos.
[014]Algumas modalidades incluem um dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. O dispositivo pode compreender substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina e válvulas, cada uma disposta em um caminho fluídico conectado a um substrato de codificação separado. Cada válvula pode ser configurada para regular o fluxo para o substrato de codificação separado ou a partir do mesmo. O dispositivo pode ser configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um reservatório fluídico e/ou uma solução de transcrição/tradução in vitro. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende ainda um reservatório fluídico ou uma solução de transcrição/tradução in vitro.
Algumas modalidades incluem um dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de bacteriocinas. O dispositivo pode compreender substratos de codificação separados de modo que cada um codifique uma bacteriocina e válvulas,
cada uma disposta em um caminho fluídico para um substrato de codificação separado ou a partir do mesmo, configurado para colocar o substrato de codificação separado em comunicação de fluido com um reservatório fluídico e/ou uma solução de transcrição/tradução in vitro.
Breve Descrição dos Desenhos
[015]A FIG. 1 é um diagrama esquemático de um método convencional para fabricar uma composição compreendendo bacteriocinas. Como mostrado, existem cepas múltiplas para a produção de uma mistura de bacteriocinas. Entretanto, é considerado que existe uma probabilidade muito alta de que as diferentes bacteriocinas serão de diferentes concentrações ([A] ≠ [B] ≠ [C] ≠ [D]). Adicionalmente, é considerado que as bacteriocinas produzidas podem ser tóxicas ao hospedeiro de modo a causar problemas de produção.
[016]A FIG. 2 é um diagrama esquemático de uma modalidade de um ácido nucleico que codifica um pró-polipeptídeo compreendendo bacteriocinas e sítios de clivagem de acordo com algumas modalidades aqui. Como mostrado, uma única bactéria pode produzir um pró-polipeptídeo codificado por um gene sintético. É considerado que a razão molecular de uma bacteriocina pode ser mudada colocando- se cópias múltiplas da mesma no pró-polipeptídeo.
[017]A FIG. 3 é um diagrama esquemático de uma modalidade de uma composição compreendendo bacteriocinas e sítios de clivagem de acordo com algumas modalidades aqui.
[018]A FIG. 4A é um diagrama esquemático de uma modalidade de um pró- polipeptídeo compreendendo bacteriocinas, sítios de clivagem e uma molécula de sinal de acordo com algumas modalidades aqui.
[019]A FIG. 4B é um diagrama esquemático de uma modalidade de uma composição compreendendo bacteriocinas e uma molécula de sinal a seguir da clivagem de um pró-polipeptídeo de acordo com algumas modalidades aqui.
[020]A FIG. 5 é um diagrama esquemático representando um dispositivo microfluídico de acordo com algumas modalidades aqui.
[021]A FIG. 6 é um diagrama esquemático representando um dispositivo microfluídico de acordo com algumas modalidades aqui.
[022]A FIG. 7 é um fluxograma ilustrando um método para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas de acordo com algumas modalidades aqui.
[023]A FIG. 8 é um fluxograma ilustrando um método para fabricar peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas de acordo com algumas modalidades aqui.
Descrição Detalhada
[024]Descritos de acordo com algumas modalidades aqui são métodos e composições para fabricar bacteriocinas em uma razão desejada. Algumas modalidades incluem composições compreendendo bacteriocinas em razões ou estequiometrias precisas, que podem ser úteis para ajustar a população de organismos microbianos em várias aplicações, por exemplo em processos de fabricação de biotecnologia industrial, fabricação de produto farmacêutico, produto biológico e cosmético e aplicações médicas. Em algumas modalidades, um único pró- polipeptídeo contendo bacteriocinas múltiplas separadas por sítios de clivagem é codificado por um ácido nucleico e produzido (consultar, para exemplo, FIG. 2) por uma célula microbiana geneticamente engendrada contendo o ácido nucleico. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo pode compreender ainda moléculas de sinal que podem modular o crescimento de células microbianas e/ou células de um hospedeiro multicelular. As bacteriocinas no pró-polipeptídeo podem estar em uma forma inativa e assim a célula microbiana não requer imunidade contra estas bacteriocinas. O pró-polipeptídeo pode ser isolado, por exemplo por purificação por afinidade. Os sítios de clivagem do pró-polipeptídeo podem ser clivados (consultar, para exemplo, FIG. 3), produzindo assim uma mistura de bacteriocinas alvos.
Conceitualmente, o pró-polipeptídeo pode ser visionado como um filamento de
“espaguete”, contendo bacteriocinas de componentes múltiplos, que depois pode ser clivado nas bacteriocinas individuais.
É observado que neste Pedido, por brevidade,
um pró-polipeptídeo também pode ser referido como “espaguete”. Algumas modalidades incluem dispositivos microfluídicos e métodos para fabricar misturas específicas de bacteriocinas.
As “misturas específicas” de bacteriocinas de métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades aqui podem ser especificadas de acordo com parâmetros que incluem, mas não são limitados, à composição de bacteriocinas (de modo que compreendam bacteriocinas específicas e/ou não compreendam outras bacteriocinas), à estequiometria das bacteriocinas da mistura e opcionalmente, à presença de proteínas auxiliares.
O dispositivo microfluídico pode compreender substratos de codificação separados de modo que cada um codifique uma bacteriocina (Consultar, para exemplo, FIG. 5). Substratos de codificação separados que codificam as bacteriocinas da mistura específica podem ser colocados em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro, de modo que os substratos de codificação separados que codificam as bacteriocinas da mistura específica sejam incubados com a solução de transcrição/tradução in vitro, produzindo assim as bacteriocinas da mistura específica.
As bacteriocinas da mistura específica depois podem ser colocadas em comunicação de fluido com um reservatório fluídico do dispositivo microfluídico e as bacteriocinas se movem fluidicamente para o reservatório fluídico, produzindo assim a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico.
Em algumas modalidades,
cada substrato de codificação separado codifica uma bacteriocina diferente.
Em algumas modalidades, um substrato de codificação separado codifica duas ou mais bacteriocinas diferentes.
Em algumas modalidades, pelo menos um ou todos os substratos de codificação separados codificam um pró-polipeptídeo do tipo
“espaguete” como descrito aqui.
Opcionalmente, o substrato de codificação separado pode compreender ou codificar uma protease como descrito aqui, que pode clivar os sítios de clivagem do pró-polipeptídeo de modo que o substrato de codificação separado possa produzir duas ou mais bacteriocinas em uma estequiometria específica. O dispositivo microfluídico pode compreender uma saída, configurada para colocar a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas em comunicação fluídica com um tecido, um ferimento, um microbioma do hospedeiro ou um vaso. A mistura específica de bacteriocinas pode ser usada, por exemplo, como uma composição antimicrobiana em ponto de atendimento e/ou para testar os efeitos da mistura específica sobre um tecido do hospedeiro e/ou microbioma do hospedeiro, por exemplo um compreendendo um organismo microbiano indesejado.
[025]Vantajosamente, as quantidades relativas de diferentes bacteriocinas no pró-polipeptídeo determinarão precisamente a razão de bacteriocinas na mistura depois da clivagem e esta razão será mantida não obstante da taxa de expressão do polipeptídeo dentro das diferentes células microbianas ou entre as mesmas. Ao contrário, métodos convencionais em que bacteriocinas são traduzidas como peptídeos separados ou produzidas por diferentes células (consultar a FIG 1) podem estar sujeitos a variações na eficiência de transformação, eficiência de engenharia genética e/ou eficiência de expressão gênica (por exemplo se alguns plasmídeos que codificam bacteriocina replicam e/ou iniciam a transcrição mais eficientemente do que outros), de modo que as razões finais de bacteriocinas sejam menos precisas do que as modalidades aqui. Como uma outra vantagem, visto que cada ácido nucleico pode codificar muitas bacteriocinas, algumas modalidades aqui levam em consideração uma modificação genética muito mais eficiente de uma célula hospedeira do que abordagens convencionais que envolveriam introduzir construções múltiplas, cada uma codificando uma bacteriocina particular. Como uma outra vantagem, visto que as bacteriocinas podem ser produzidas em sua forma inativa no pró-polipeptídeo, o organismo microbiano “carro-chefe” que produz as bacteriocinas não precisa ser configurado com imunidade a todas, algumas ou qualquer uma destas bacteriocinas e assim pode ser facilmente usado para produzir misturas de qualquer uma das várias bacteriocinas diferentes. Embora em algumas modalidades, o organismo microbiano de produção possa natural ou artificialmente ser configurado com imunidade a uma ou mais ou todas as bacteriocinas incluídas no pró-polipeptídeo.
[026]Populações de organismos microbianos alvejadas por composições de bacteriocina de algumas modalidades aqui podem existir em um número em ambientes comercialmente úteis tais como culturas industriais, fermentadores, fabricação de produto farmacêutico, produto biológico e cosmético, em microbiomas, tais como órgão humanos, animais e plantas (por exemplo, nas raízes ou solo em que a planta cresce) e em produtos, tais como alimentos (para ser humano e/ou animais), produtos medicamentosos e produtos cosméticos. Sem ser limitado pela teoria, é considerado que populações de organismos microbianos em qualquer um destes ambientes não necessariamente coexistem em um estado estacionário. Por exemplo, como revisado em Jaramillo et al., Nature Microbiology 2: 17119 (2017), visto que populações de organismos microbianos interagem entre si (direta ou indiretamente), elas podem afetar uma à outra em modos positivos ou negativos, mas não são esperadas existir no estado estacionário, o que convencionalmente leva a desafios em manter uma co-cultura. Em algumas modalidades, quando certas populações de organismos microbianos atingem uma quantidade ou densidade acima de um certo limiar, uma mistura de bacteriocinas produzidas de acordo com métodos e/ou através do uso de pró-polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos e/ou células microbianas de algumas modalidades aqui pode ser adicionada ao ambiente de modo a alvejar as células microbianas desta população. Por exemplo, se uma população contém um grande excesso de organismo microbiano #1 e um menor excesso de organismo microbiano #2, de acordo com algumas modalidades, uma mistura compreendendo uma razão relativamente alta de bacteriocina #1 (alvejando o organismo microbiano
#1) para bacteriocina #2 (alvejando o organismo microbiano #2) pode ser administrada à população, de modo a reduzir o crescimento de organismos microbianos #1 e #2, com uma maior redução alvejada ao organismo microbiano #1.
Bacteriocinas e Peptídeos Antimicrobianos
[027]Como usado aqui, “bacteriocina”, e variações deste termo raiz, tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo se refere a um polipeptídeo que é secretado por uma célula hospedeira e pode neutralizar pelo menos uma célula exceto a célula hospedeira individual em que o polipeptídeo é fabricado, incluindo células clonalmente relacionadas à célula hospedeira e outras células microbianas. “Bacteriocina” também abrange uma versão isenta de célula ou quimicamente sintetizada de um tal polipeptídeo. Uma célula que expressa um “modulador de imunidade” particular (debatido em mais detalhe aqui) é imune aos efeitos neutralizantes de uma bacteriocina particular ou grupo de bacteriocinas. Como tal, bacteriocinas podem neutralizar uma célula que produz a bacteriocina e/ou outras células microbianas, contanto que estas células não produzam um modulador de imunidade apropriado.
Como tal, uma célula hospedeira pode exercer efeitos citotóxicos ou inibidores de crescimento sobre uma pluralidade de outros organismos microbianos por bacteriocinas de secreção. Descrições detalhadas de bacteriocinas, incluindo métodos e composições para usar bacteriocinas para controlar o crescimento de células microbianas podem ser encontradas, por exemplo, na Patente dos EUA No
9.333.227, que é por meio deste incorporada a título de referência em sua totalidade.
“Bacteriocina” é não limitada pela origem do polipeptídeo e por via de exemplo é considerada abranger qualquer bacteriocina, tais como bacteriocinas que ocorrem naturalmente, bacteriocinas sintéticas e variantes e combinações destas.
[028]As bacteriocinas de algumas modalidades são inicialmente produzidas em um pró-polipeptídeo, que depois podem ser clivadas como descrito aqui para produzir as bacteriocinas individuais. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo é produzido pelo mecanismo traducional (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula microbiana. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo é produzido por um sistema de expressão in vitro. O pró-polipeptídeo pode passar por clivagem (por exemplo processando por uma enzima de clivagem tal como uma protease que ocorre naturalmente ou sintética) para produzir o polipeptídeo da bacteriocina propriamente dita. Como tal, em algumas modalidades, uma bacteriocina é produzida a partir de um polipeptídeo precursor. Em algumas modalidades, uma bacteriocina compreende um polipeptídeo que passou por modificações pós-traducionais, por exemplo clivagem ou pela adição de um ou mais grupos funcionais. Em algumas modalidades, um pró- polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em bacteriocinas e sítios de clivagem como descrito aqui é quimicamente sintetizado.
[029]“Antibiótico”, e variações deste termo raiz, tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo se refere a um metabólito ou um intermediário de uma via metabólica que pode matar ou parar o crescimento de pelo menos uma célula microbiana. Alguns antibióticos podem ser produzidos por células microbianas, por exemplo, bactérias. Alguns antibióticos podem ser sintetizados quimicamente. É entendido que bacteriocinas são distintas de antibióticos, pelo menos em que as bacteriocinas se referem a produtos genéticos (que, em algumas modalidades, passam por processamento pós-traducional adicional) ou análogos sintéticos das mesmas, enquanto os antibióticos se referem a intermediários ou produtos de vias metabólicas ou análogos sintéticos dos mesmos.
[030]A atividade neutralizante de bacteriocinas pode incluir, por exemplo, a parada da reprodução microbiana ou citotoxicidade. Algumas bacteriocinas têm atividade citotóxica (por exemplo, efeitos “bacteriocidas”) e assim podem matar organismos microbianos, por exemplo bactérias, leveduras, algas, microrganismos sintéticos e semelhantes. Algumas bacteriocinas podem inibir a reprodução de organismos microbianos (por exemplo, efeitos “bacteriostáticos”), por exemplo bactérias, leveduras, algas, microrganismos sintéticos e semelhantes, por exemplo parando-se o ciclo celular. Alguma neutralização compreende, consiste em ou consiste essencialmente em parada de reprodução microbiana, inibição da reprodução de organismos microbianos e/ou citotoxicidade.
[031]Em algumas modalidades, uma atividade neutralizante particular ou faixas de atividades (por exemplo, citotoxicidade ou parada de reprodução microbiana) é selecionada com base no tipo de regulação microbiana que é desejada e nas cepas ou espécies particulares de organismos microbianos sendo alvejados.
Como tal, em algumas modalidades, bacteriocinas particulares ou combinações de bacteriocinas são selecionadas. Por exemplo, em algumas modalidades, células microbianas são engendradas para expressar bacteriocinas particulares com base nas células sendo reguladas. Em algumas modalidades, por exemplo, se células contaminantes devem ser mortas, pelo menos uma bacteriocina citotóxica é fornecida.
Em algumas modalidades, uma bacteriocina ou combinação de bacteriocinas que é eficaz contra contaminantes que comumente ocorrem em uma cultura particular ou um local geográfico particular ou um tipo particular de cultura cultivada em um local geográfico particular são selecionadas. Em algumas modalidades, por exemplo modalidades em que a regulação reversível de razões de célula microbiana é desejada, uma bacteriocina que inibe a reprodução microbiana é fornecida. Sem ser limitado por qualquer teoria particular, muitas bacteriocinas podem ter atividade neutralizante contra organismos microbianos que tipicamente ocupam o mesmo nicho ecológico como a espécie que produz a bacteriocina. Como tal, em algumas modalidades, quando um espectro particular de atividade de bacteriocina é desejado, uma bacteriocina é selecionada de uma espécie de hospedeiro que ocupa o mesmo nicho ecológico (ou similar) como o organismo ou organismos microbianos alvejados pela bacteriocina. Em algumas modalidades, uma mistura e/ou razão particulares são selecionadas para alvejar um único organismo microbiano (que pode incluir alvejar um ou mais do que um organismo microbiano deste tipo, por exemplo organismos microbianos clonalmente relacionados). Por exemplo um tipo particular de organismo microbiano pode ser alvejado mais eficientemente por uma mistura e/ou razão predeterminadas de bacteriocinas do que por uma única bacteriocina.
[032]Em algumas modalidades, uma ou mais atividades de bacteriocina são selecionadas antes do crescimento da cultura e um pró-polipeptídeo compreendendo as bacteriocinas em uma estequiometria desejada é preparado. Um polinucleotídeo que codifica o pró-polipeptídeo pode ser preparado, por exemplo usando síntese de ácido nucleico e/ou clonagem molecular e pode ser usado para produzir o pró- polipeptídeo. O polinucleotídeo pode ser transcrito (se um DNA) e traduzido usando vários sistemas adequados, por exemplo em uma célula microbiana ou em um sistema de expressão in vitro. Em algumas modalidades, bacteriocinas (e razões destas) podem ser selecionadas com base em sua capacidade de neutralizar um ou mais organismos invasores que provavelmente tentarão crescer em uma cultura particular.
Em algumas modalidades, bacteriocinas (e razões destas) podem ser selecionadas com base em sua capacidade de limitar o crescimento de cepas microbianas úteis particulares em um ambiente, por exemplo em uma matéria-prima industrial ou em um fermentador ou em um ambiente de fabricação de alimento, produto farmacêutico ou cosmético ou em um ambiente tecidual tal como um microbioma do intestino ou pele ou em manter ou ajustar uma população microbiana em uma planta, uma raiz de planta e/ou solo ou em preservar ou manter a qualidade de um produto alimentício, medicamentoso ou cosmético. Em algumas modalidades, uma ou mais atividades de bacteriocina (e/ou razões) são selecionadas com base em uma ou mais cepas microbianas ou uma população de cepas microbianas um ambiente existente. Por exemplo, em algumas modalidades, se invasores particulares são identificados em um ambiente, um painel de bacteriocinas neutralizantes (e razões destas) pode ser selecionado para neutralizar os invasores identificados. Em algumas modalidades, as bacteriocinas são selecionadas para neutralizar todas ou substancialmente todas as células microbianas em um ambiente, por exemplo para eliminar uma cultura industrial em um ambiente de cultura de modo que uma nova cultura industrial possa ser introduzida ao ambiente de cultura ou para impedir ou inibir a contaminação de um ambiente de fabricação de produto farmacêutico ou cosmético ou para impedir ou minimizar a contaminação ou deterioração de um produto alimentício, medicamentoso ou cosmético.
[033]Por exemplo, em algumas modalidades, uma atividade antifúngica (tal como atividade anti-levedura) é desejada. Várias bacteriocinas com atividade antifúngica foram identificadas. Por exemplo, bacteriocinas de Bacillus mostraram ter atividade neutralizante contra cepas de levedura (consultar Adetunji e Olaoye (2013) Malaysian Journal of Microbiology 9: 130 - 13, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade), um peptídeo de Enterococcus faecalis (WLPPAGLLGRCGRWFRPWLLWLQ SGAQY KWLGNLFGLGPK, SEQ ID NO: 1) mostrou ter atividade neutralizante contra espécies de Candida (consultar Shekh e Roy (2012) BMC Microbiology 12: 132, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade) e bacteriocinas de Pseudomonas mostraram ter atividade neutralizante contra fungos tais como Curvularia lunata, espécies de Fusarium, espécies de Helminthosporium e espécies de Biopolaris (Shalani e Srivastava (2008) The Internet Journal of Microbiology. Volume 5 Número 2. DOI:
10.5580/27dd - acessível na rede mundial em archive.ispub.com/journal/the-internet- journal-of-microbiology/volume-5-number-2/triagem-for-antifungal-activity-of- pseudomonas-fluorescens-against-phytopathogenic- fungi.html#sthash.d0Ys03UO,1DKuT1US.dpuf, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade). Por via de exemplo, botricidina AJ1316 (consultar
Zuber, P et al. (1993) Peptide Antibiotics. Em Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics ed Sonenshein et al., páginas 897 a 916, American Society for Microbiology, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade) e alirina B1 (consultar Shenin et al. (1995) Antibiot Khimioter 50: 3 - 7, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade) de B. subtilis mostraram ter atividades antifúngicas. Como tal, em algumas modalidades, por exemplo modalidades em que a neutralização de um organismo microbiano fúngico é desejado, uma bacteriocina compreende pelo menos uma de botricidina AJ1316 ou alirina B1.
[034]Por exemplo, em algumas modalidades, a atividade de bacteriocina em uma cultura de um microrganismo particular (ou coleção de diferentes microrganismos) é desejável e bacteriocinas são selecionadas em razões predeterminadas de modo a neutralizar microrganismos exceto o(s) microrganismo(s) desejado(s). Bacteriocinas tipicamente produzidas pelos microrganismos desejados podem ser selecionadas, visto que os organismos microbianos desejados já podem produzir os moduladores de imunidade relevante contra estas bacteriocinas ou podem ser facilmente engendrados para produzir os moduladores de imunidade. Como tal, as bacteriocinas selecionadas podem alvejar células microbianas indesejadas, enquanto causando pouca ou nenhuma neutralização dos organismos microbianos desejados. Por exemplo, em algumas modalidades, bacteriocinas são selecionadas em razões particulares de modo a neutralizar os organismos microbianos invasores tipicamente encontrados em um ambiente de cultura de cianobactérias, enquanto preservando as cianobactérias. Agrupamentos de polipeptídeos de bacteriocina conservados foram identificados em uma ampla variedade de espécies de cianobactérias. Por exemplo, pelo menos 145 agrupamentos genéticos de bacteriocina putativos foram identificados em pelo menos 43 espécies de cianobactérias, como relatado em Wang et al. (2011), Genome Mining Demonstrates the Widespread Occurrence of Gene Clusters Encoding Bacteriocins in Cyanobacteria. PLoS ONE 6(7): e22384, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade. Bacteriocinas de cianobactérias exemplares são mostradas na Tabela 1.2, como SEQ ID NO’s 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448 e 450.
[035]Em algumas modalidades, uma célula microbiana produz bacteriocinas.
Em algumas modalidades, bacteriocinas neutralizam células de uma diferente espécie ou cepa da célula microbiana que produziu bacteriocinas. Em algumas modalidades, bacteriocinas neutralizam células da mesma espécie ou cepa como a célula hospedeira se estas células carecem de um modulador de imunidade apropriado.
Visto que bacteriocinas podem mediar a neutralização de organismos microbianos tanto hospedeiros quanto não hospedeiros, o técnico habilitado facilmente avaliará que uma bacteriocina é distinta de sistemas de veneno-antídoto, que envolvem um mecanismo endógeno pelo qual um microrganismo hospedeiro pode neutralizar apenas a si mesmo. Em outras palavras, bacteriocinas podem neutralizar células exceto a célula em que elas são produzidas (por exemplo, bacteriocinas podem ser selecionadas e/ou engendradas para agir como um protetor de nicho ecológico), enquanto moléculas de veneno matam apenas a célula individual em que elas são produzidas (por exemplo, para agir como sistemas suicidas).
[036]Várias bacteriocinas foram identificadas e caracterizadas. Sem ser limitado pela teoria, bacteriocinas exemplares podem ser classificadas como bacteriocinas de “classe I”, que tipicamente passam por modificação pós-traducional e bacteriocinas de “classe II”, que são tipicamente não modificadas. Adicionalmente, bacteriocinas exemplares em cada classe podem ser categorizadas em vários subgrupos, como resumido na Tabela 1.1, que é adaptada a partir de Cotter, P.D. et al. “Bacteriocins- a viable alternative to antibiotics” Nature Reviews Microbiology (2013) 11: 95 - 105, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade.
[037]Sem ser limitado pela teoria, bacteriocinas podem efetuar a neutralização de uma célula microbiana alvo em uma variedade de modos. Por exemplo, uma bacteriocina pode permeabilizar uma parede celular, despolarizando assim a parede celular e interferindo com a respiração.
Tabela 1.1: Classificação das Bacteriocinas Exemplares Grupo Característica distintiva Exemplos Classe I (tipicamente modificada) É covalentemente ligada a um Bacteriocinas do tipo ácido aspártico carbóxi- MccC7-C51 MccC7-C51 terminal Peptídeos de laço Têm uma estrutura de laço MccJ25 Peptídeos lineares Possuem heterociclos mas contendo azol ou MccB17 não outras modificações azolina Nisina, planosporicina, mersacidina, Lantibióticos Possuem pontes de lantionina actagardina, mutacina 1140 Têm uma estrutura linear e Linaridinas contêm aminoácidos Cipemicina desidratados Contêm múltiplas Proteusinas hidroxilações, epimerizações Politeonamida A e metilações
Grupo Característica distintiva Exemplos
Contêm ligações enxofre-α- Subtilosina A, turicina Sactibióticos carbono CD
Cianobactinas Possuem heterociclos e semelhantes à Patelamida A passam por macrociclização patelamida
Peptídeos cíclicos consistindo Cianobactinas em aminoácidos semelhantes à Anaciclamida A10 proteinogênicos com ligações anaciclamida prenila
Contêm um anel de piridina,
diidropiridina ou piperidina Tiostrepton, nocatiacina Tiopeptídeos central bem como I, GE2270 A, filipimicina heterociclos
Contêm amidina macrocíclica, um tiazol carbóxi-terminal Botromicinas Botromicina A2 descarboxilado e aminoácidos metilados em carbono
Contêm glicopeptídeos S- Glicocinas Sublancina 168 ligados
Classe II (tipicamente não modificada ou cíclica)
Peptídeos IIa Possuem um motivo YGNGV Pediocina PA-1, (bacteriocinas conservado (em que N enterocina CRL35, semelhantes à representa qualquer carnobacteriocina BM1 pediocina PA-1) aminoácido)
Grupo Característica distintiva Exemplos Dois peptídeos não Peptídeos IIb modificados são necessários ABP118, lactacina F para a atividade Peptídeos IIc Peptídeos cíclicos Enterocina AS-48 Bacteriocinas não MccV, MccS, modificadas, lineares, não Peptídeos IId epidermicina NI01, semelhantes à pediocina, de lactococcina A peptídeo único Contêm uma região carbóxi- terminal rica em serina com Peptídeos IIe MccE492, MccM uma modificação do tipo sideróforo não ribossômica
[038]Várias bacteriocinas podem ser usadas de acordo com as modalidades aqui. Bacteriocinas exemplares são mostradas na Tabela 1.2. Em algumas modalidades, pelo menos uma bacteriocina compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de polipeptídeo da Tabela 1.2 é fornecida. Como mostrado na Tabela 1.2, algumas bacteriocinas funcionam como pares de moléculas. Como tal, será entendido que a menos que explicitamente estabelecido de outro modo, quando uma “bacteriocina” funcional ou “fornecendo uma bacteriocina” ou semelhantes é debatido aqui, pares de bacteriocina funcional são incluídos junto com bacteriocinas que funcionam individualmente. Com referência à Tabela 1.2, “organismos de origem” listados em parênteses indicam nomes alternativos e/ou informação de cepa para organismos conhecidos produzir a bacteriocina indicada. Entretanto, em algumas modalidades aqui, bacteriocinas são produzidas por um organismo microbiano desejado e assim não são limitadas aos exemplos de organismos conhecidos produzir as bacteriocinas mostradas na Tabela
1.2
[039]Modalidades aqui também incluem peptídeos e proteínas com identidade a bacteriocinas descritas na Tabela 1.2. O termo “identidade” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo destina-se a incluir homologia de sequência de ácido nucleico ou proteína ou homologia tridimensional. Como usado aqui, uma “variante” de um polipeptídeo, tal como uma bacteriocina, molécula de sinal, modulador de imunidade, etiqueta (ou qualquer outro peptídeo de componente de um pró- polipeptídeo como descrito aqui) tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. Ele será entendido como incluindo identidade como descrito aqui à sequência de referência de pelo menos cerca de 70 %, por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo, 70 % a 100 %, 75 % a 100 %, 80 % a 100 %, 85 % a 100 %, 90 % a 100 %, 95 % a 100 %, 97 % a 100 %, 99 % a 100 %, 70 % a 99 %, 75 % a 99 %, 80 % a 99 %, 85 % a 99 %, 90 % a 99 %, 95 % a 99 %, 97 % a 99 %, 70 % a 95 %, 75 % a 95 %, 80 % a 95 %, 85 % a 95 %, 90 % a 95 %, 70 % a 90 %, 75 % a 90 %, 80 % a 90 % e 85 % a 90 %. Várias técnicas existem para determinar homologia de sequência de ácido nucleico ou polipeptídeo e/ou homologia tridimensional a polipeptídeos.
Estes métodos são rotineiramente utilizados para descobrir a extensão de identidade que uma sequência, domínio ou modelo tem a uma sequência, domínio ou modelo alvos. A porcentagem de identidade pode ser determinada usando o software BLAST (Altschul, S.F., et al. (1990) “Basic local alignment search tool”. J. Mol. Biol. 215:403 - 410, acessível na rede mundial em blast.ncbi.nlm.nih.gov) com os parâmetros padrão.
[040]Uma vasta faixa de bacteriocinas funcionais pode incorporar características de bacteriocinas divulgadas aqui, assim levando em consideração um vasto grau de identidade às bacteriocinas na Tabela 1.2. Em algumas modalidades, uma bacteriocina tem pelo menos cerca de 50 % de identidade, por exemplo, pelo menos cerca de 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade a qualquer um dos polipeptídeos da Tabela 1.2, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo 70 % a 100 %, 75 % a 100 %, 80 % a 100 %, 85 % a 100 %, 90 % a 100 %, 95 % a 100 %, 97 % a 100 %, 99 % a 100 %, 70 % a 99 %, 75 % a 99 %, 80 % a 99 %, 85 % a 99 %, 90 % a 99 %, 95 % a 99 %, 97 % a 99 %, 70 % a 95 %, 75 % a 95 %, 80 % a 95 %, 85 % a 95 %, 90 % a 95 %, 70 % a 90 %, 75 % a 90 %, 80 % a 90 % e 85 % a 90 %.
[041]Em algumas modalidades, uma bacteriocina com identidade a uma bacteriocina na Tabela 1.2 é fornecida, em que a bacteriocina foi modificada para remover um ou mais sítios de clivagem que estão sendo usados em um pró- polipeptídeo como descrito aqui. Sem ser limitado pela teoria, é considerado que modificar as bacteriocinas para remover sítios de clivagem (por exemplo fazendo-se substituições conservativas, tais como aminoácido não polar pequeno a não polar pequeno, por exemplo, Leu  Ile ou aminoácido polar pequeno a polar pequeno, por exemplo, Ser  Thr) pode impedir a bacteriocina propriamente dita de ser clivada quando o pró-polipeptídeo é clivado como descrito aqui. Como tal, em algumas modalidades uma bacteriocina em um pró-polipeptídeo como descrito aqui (por exemplo, uma bacteriocina da Tabela 1.2 ou uma variante desta) não contém nenhum sítio de clivagem que é usado para separar as bacteriocinas (ou outros elementos) do pró-polipeptídeo.
Tabela 1.2: Bacteriocinas Exemplares
SEQ ID NO de SEQ ID NO de Nome Classe Organismo de origem polipeptídeo: Polinucleotídeo:
4 Acidocina 8912 Não classificada Lactobacillus acidophilus 5 classe 6 Acidocina A Lactobacillus acidophilus 7 IIA/YGNGV
8 Acidocina B (AcdB) Não classificada Lactobacillus acidophilus 9
Acidocina LF221B 10 Não classificada Lactobacillus gasseri 11 (Gassericina K7 B)
12 Aureocina A53 Não classificada Staphylococcus aureus 13 classe Enterococcus avium 14 Avicina A 15 IIA/YGNGV (Streptococcus avium)
Enterococcus faecalis 16 Bacteriocina 31 Não classificada 17 (Streptococcus faecalis)
18 Bacteriocina J46 Não classificada Lactococcus lactis 19
Enterococcus faecium 20 Bacteriocina T8 classe IIa 21 (Streptococcus faecium)
22 Boticina B Não classificada Clostridium botulinum 23
Streptococcus equinus 24 Bovicina HJ50 Lantibiótico 25 (Streptococcus bovis)
26 Brococina-c Não classificada Brochothrix campestris 27
Butirivibriocina 28 Não classificada Butyrivibrio fibrisolvens 29 AR10
Butirivibriocina 30 Lantibiótico Butyrivibrio fibrisolvens 31 OR79
Carnobacteriocina classe Carnobacterium 32 33 B2 (Carnocin CP52) IIA/YGNGV maltaromaticum
(Carnobacterium piscicola) Carnobacteriocina Carnobacterium BM1 classe maltaromaticum 34 35 (Carnobacteriocina IIA/YGNGV (Carnobacterium B1) piscicola) classe IIc, Carnobacterium bacteriocinas Carnobacteriocina- maltaromaticum 36 não 37 A (Piscicolina-61) (Carnobacterium subagrupadas piscicola) (problemático) Carnobacterium maltaromaticum 38 Carnociclina-A Não classificada 39 (Carnobacterium piscicola) Pectobacterium carotovorum subsp.
40 Carocina D Não classificada carotovorum (Erwinia 41 carotovora subsp.
carotovora) 42 Cereina 7B Não classificada Bacillus cereus 43 Cinamicina Streptoverticillium 44 Lantibiótico 45 (Lantiopeptina) griseoverticillatum Geobacillus kaustophilus 46 Circularina A Não classificada 47 (cepa HTA426) 48 Closticina 574 Não classificada Clostridium tyrobutyricum 49 50 Coagulina A Não classificada Bacillus coagulans 51
52 Colicina-10 Não classificada Escherichia coli 53
54 Colicina-E1 Não classificada Escherichia coli 55
56 Colicina-Ia Não classificada Escherichia coli 57
58 Colicina-Ib Não classificada Escherichia coli 59
60 Colicina-M Não classificada Escherichia coli 61
62 Colicina-N Não classificada Escherichia coli 63
Colicina-V 64 Não classificada Escherichia coli 65 (Microcina-V)
66 Columbicina A Lantibiótico Enterococcus columbae 67 classe 68 Curvacina-A Lactobacillus curvatus 69 IIA/YGNGV
70 Cipemicina Não classificada Streptomyces sp. 71
Bacillus halodurans (cepa
ATCC BAA-125/DSM 72 Citolisina Lantibiótico 73 18197/FERM 7344/JCM
9153/C-125)
Carnobacterium classe 74 Divercina V41 divergens (Lactobacillus 75 IIa/YGNGV divergens)
Carnobacterium
76 Divergicina 750 Não classificada divergens (Lactobacillus 77 divergens)
Carnobacterium
78 Divergicina A Classe IIc divergens (Lactobacillus 79 divergens)
80 Durancina Q Não classificada Enterococcus durans 81
82 Durancina TW-49M Não classificada Enterococcus durans 83
Streptococcus dysgalactiae subsp.
84 Disgalacticina Não classificada equisimilis 85 (Streptococcus equisimilis) Enterococcus faecalis 86 Enterocian 1071A Não classificada 87 (Streptococcus faecalis) bacteriocinas Enterocina 7A Enterococcus faecalis 88 sem sequência 89 (Enterocina L50A) (Streptococcus faecalis) líder Enterococcus faecalis 90 Enterocina 7B Não classificada 91 (Streptococcus faecalis) Enterococcus faecalis 92 Enterocina 96 Classe II (cepa ATCC 93 700802/V583) Classe IIa, IIc Enterococcus faecium 94 Enterocina A 95 (problemático) (Streptococcus faecium) Enterocina AS-48 Enterococcus faecalis 96 (BACTERIOCINA Não classificada 97 (Streptococcus faecalis) AS-48) classe IIc, bacteriocinas Enterococcus faecium 98 Enterocina B não 99 (Streptococcus faecium) subagrupadas (problemático) Enterocina CRL35 100 Classe IIa Enterococcus mundtii 101 (Mundticina KS)
Enterococcus faecalis 102 Enterocina EJ97 Não classificada 103 (Streptococcus faecalis)
Classe IIa, IIb e Enterococcus faecium 104 Enterocina P IIc 105 (Streptococcus faecium) (problemático)
Enterococcus faecium 106 Enterocina Q Classe IIc 107 (Streptococcus faecium)
Enterococcus faecalis 108 Enterocina SE-K4 Classe IIa 109 (Streptococcus faecalis)
Enterococcus faecalis 110 Enterocina W alfa Classe IIb 111 (Streptococcus faecalis)
Enterococcus faecalis 112 Enterocina W beta Classe IIb 113 (Streptococcus faecalis)
Enterococcus faecium 114 Enterocina X alfa Classe IIb 115 (Streptococcus faecium)
Enterococcus faecium 116 Enterocina X beta Classe IIb 117 (Streptococcus faecium)
Enterococcus faecalis 118 Enterolisina A classe III 119 (Streptococcus faecalis)
Staphylococcus 120 Epicidina 280 Lantibiótico 121 epidermidis
Staphylococcus 122 Epidermicina NI01 Não classificada 123 epidermidis
Staphylococcus 124 Epidermina Lantibiótico 125 epidermidis
Staphylococcus 126 Epilancina K7 Lantibiótico 127 epidermidis
Staphylococcus 128 Galidermina Lantibiótico 129 gallinarum
130 Garvicina A IId Lactococcus garvieae 131
132 Garvicina ML Não classificada Lactococcus garvieae 133
134 Gassericina A Não classificada Lactobacillus gasseri 135
Gassericina T 136 Não classificada Lactobacillus gasseri 137 (gassericina K7 B)
138 Glicocina F Não classificada Lactobacillus plantarum 139
Haloferax mediterranei
(cepa ATCC 33500/DSM
1411/JCM 8866/NBRC 140 Halocina H4 Não classificada 141 14739/NCIMB 2177/R-4)
(Halobacterium mediterranei)
142 Halocina-S8 Não classificada Haloarchaeon S8a 143
Lactobacillus helveticus
144 Helveticina-J Não classificada (Lactobacillus 145 suntoryeus)
Classe II sec- 146 Hiracina JM79 Enterococcus hirae 147 dependente
Lactobacillus johnsonii
148 Lactacina-F (lafA) classe IIB (cepa CNCM I- 149
12250/La1/NCC 533)
Lactobacillus johnsonii
150 Lactacina-F (lafX) classe IIB (cepa CNCM I- 151
12250/La1/NCC 533)
152 Lacticina 3147 A1 Lantibiótico Lactococcus lactis subsp. 153 lactis (Streptococcus lactis) Lactococcus lactis subsp.
154 Lacticina 3147 A2 Lantibiótico lactis (Streptococcus 155 lactis) Lactococcus lactis subsp. Lacticina 481 156 Lantibiótico lactis (Streptococcus 157 (Lactococcina DR) lactis) 158 Lacticina Q Não classificada Lactococcus lactis 159 160 Lacticina Z Não classificada Lactococcus lactis 161 Lactobina-A 162 classe IIB Lactobacillus amylovorus 163 (Amylovorin-L471) 164 Lactocina-S Lantibiótico Lactobacillus sakei L45 165 Lactococcus lactis subsp.
166 Lactococcina 972 Não classificada lactis (Streptococcus 167 lactis) Lactococcus lactis subsp.
168 Lactococcina-A Não classificada cremoris (Streptococcus 169 cremoris) Lactococcus lactis subsp.
170 Lactococcina-B Não classificada cremoris (Streptococcus 171 cremoris) 172 Lactociclicina Q Não classificada Lactococcus sp. QU 12 173 174 Laterosporulina Não classificada Brevibacillus sp. GI-9 175 Leuconostoc 176 Leucocina N Classe IId 177 pseudomesenteroides 178 Leucocina Q Classe IId Leuconostoc 179 pseudomesenteroides
Leucocina-A classe 180 (Leucocina A-UAL Leuconostoc gelidum 181 IIA/YGNGV 187)
Leucocina-B classe 182 (Leucocina B- Leuconostoc carnosum 183 IIA/YGNGV Ta11a)
Leuconostoc 184 Leucociclicina Q Não classificada 185 mesenteroides
Bacillus licheniformis Lantibiótico 186 Liquenicidina A1 (cepa DSM 13/ATCC 187 (dois peptídeos) 14580)
188 Linocina M18 Não classificada Brevibacterium linens 189
190 Listeriocina 743A Classe IIa Listeria innocua 191
Lantibiótico, tipo Bacillus sp. (cepa HIL- 192 Mersacidina 193 B Y85/54728)
classe Leuconostoc 194 Mesentericina Y105 195 IIA/YGNGV mesenteroides
Clavibacter
196 Michiganina-A Lantibiótico michiganensis subsp. 197 michiganensis
Microcina B17 198 Não classificada Escherichia coli 199 (MccB17)
200 Microcina C7 Não classificada Escherichia coli 201
202 Microcina E492 Não classificada Klebsiella pneumoniae 203
204 Microcina H47 Não classificada Escherichia coli 205
206 Microcina J25 Não classificada Escherichia coli 207
208 Microcina-24 Não classificada Escherichia coli 209 210 Mundticina KS Não classificada Enterococcus mundtii 211 classe 212 Mundticina L Enterococcus mundtii 213 IIA/YGNGV Mutacina 1140 214 Lantibiótico Streptococcus mutans 215 (Mutacina III) 216 Mutacina-2 Lantibiótico Streptococcus mutans 217 Lactococcus lactis subsp.
218 Nisina A Lantibiótico lactis (Streptococcus 219 lactis) 220 Nisina F Lantibiótico Lactococcus lactis 221 222 Nisina Q Lantibiótico Lactococcus lactis 223 224 Nisina U Lantibiótico Streptococcus uberis 225 Lactococcus lactis subsp.
226 Nisina Z Lantibiótico lactis (Streptococcus 227 lactis) 228 Nucacina ISK-1 Lantibiótico Staphylococcus warneri 229 Paenibacillus polimyxa 230 Paenicidina A Lantibiótico 231 (Bacillus polimyxa) Pediocina PA-1 classe 232 Pediococcus acidilactici 233 (Pediocina ACH) IIA/YGNGV Pediococcus classe 234 Penocina A pentosaceus (cepa ATCC 235 IIA/YGNGV 25745/183 - 1w) Staphylococcus 236 Pep5 Lantibiótico 237 epidermidis 238 Piscicolina 126 classe Carnobacterium 239
IIA/YGNGV maltaromaticum
(Carnobacterium piscicola)
240 Plantaricina 1.25 β Não classificada Lactobacillus plantarum 241
242 Plantaricina 423 classe IIa Lactobacillus plantarum 243
244 Plantaricina ASM1 Não classificada Lactobacillus plantarum 245
246 Plantaricina E Não classificada Lactobacillus plantarum 247
248 Plantaricina F Classe IIb Lactobacillus plantarum 249
250 Plantaricina J Classe IIb Lactobacillus plantarum 251
252 Plantaricina K Não classificada Lactobacillus plantarum 253
254 Plantaricina NC8 α Não classificada Lactobacillus plantarum 255
256 Plantaricina NC8 β Não classificada Lactobacillus plantarum 257
258 Plantaricina S α Não classificada Lactobacillus plantarum 259
260 Plantaricina S β Não classificada Lactobacillus plantarum 261
Lantibiótico 262 Plantaricina W α Lactobacillus plantarum 263 (dois peptídeos)
Lantibiótico 264 Plantaricina W β Lactobacillus plantarum 265 (dois peptídeos)
Lactobacillus plantarum
(cepa ATCC BAA- 266 Plantaricina-A Não classificada 267 793/NCIMB
8826/WCFS1)
Propionibacterium 268 Propionicina SM1 Não classificada 269 jensenii
270 Propionicina T1 Não classificada Propionibacterium thoenii 271
Propionibacterium 272 Propionicina-F Não classificada 273 freudenreichii subsp.
freudenreichii
Pseudomonas 274 Piocina S1 Não classificada 275 aeruginosa
Pseudomonas Família de aeruginosa (cepa ATCC 276 Piocina S2 colicina/piosina 277 15692/PAO1/1C/PRS nuclease 101/LMG 12228)
278 Ruminococcina-A Lantibiótico Ruminococcus gnavus 279
280 Sacacina G Classe IIa Lactobacillus sakei 281 classe 282 Sacacina-A Lactobacillus sakei 283 IIA/YGNGV
Sacacina-P classe 284 Lactobacillus sakei 285 (Sakacin 674) IIA/YGNGV
286 Salivaricina 9 lantibiótico Streptococcus salivarius 287
Streptococcus pyogenes
288 Salivaricina A Lantibiótico sorotipo M28 (cepa 289
MGAS6180)
290 Salivaricina A3 Lantibiótico Streptococcus salivarius 291
292 Salivaricina-A sa Lantibiótico Streptococcus salivarius 293
Estafilococcina C55 Lantibiótico 294 Staphylococcus aureus 295 alfa (dois peptídeos)
Estafilococcina C55 Lantibiótico 296 Staphylococcus aureus 297 beta (dois peptídeos)
298 Estreptina lantibiótico Streptococcus pyogenes 299
Estreptococcina A- 300 Lantibiótico Streptococcus pyogenes 301 FF22
302 Estreptococcina A- Lantibiótico Streptococcus pyogenes 303
M49 sorotipo M49
Bacillus subtilis (cepa 304 Sublancina 168 Lantibiótico 305 168)
306 Subtilina Lantibiótico Bacillus subtilis 307
Bacillus subtilis (cepa 308 Subtilosina Não classificada 309 168)
Bacillus subtilis (cepa 310 Subtilosina-A Não classificada 311 168)
Streptococcus 312 Termofilina 1277 Lantibiótico 313 thermophilus
Streptococcus 314 Termofilina 13 Não classificada 315 thermophilus
Streptococcus 316 Termofilina A Não classificada 317 thermophilus
Tiocilina
(Micrococcina P1)
(Micrococcina P2)
(Tiocilina I)
(Tiocilina II) Bacillus cereus (cepa 318 Não classificada 319 (Tiocilina III) ATCC 14579/DSM 31)
(Tiocilina IV)
(Antibiótico YM-
266183) (Antibiótico
YM-266184)
dois peptídeos 320 Turicina CD alfa Bacillus cereus 95/8201 321 lantibiótico
322 Turicina CD beta dois peptídeos Bacillus cereus 95/8201 323 lantibiótico 324 Turicina-17 Classe IId Bacillus thuringiensis 325 Rhizobium 326 Trifolitoxina Não classificada 327 leguminosarum bv. trifolii 328 Ubericina A Classe IIa Streptococcus uberis 329 330 Uberolisina Não classificada Streptococcus uberis 331 332 UviB Não classificada Clostridium perfringens 333 Lantibiótico, 334 Variacina Micrococcus varians 335 Tipo A Streptococcus equi 336 Zoocina A Não classificada 337 subsp. zooepidemicus 338 Fulvocina-C Não classificada Myxococcus fulvus 339 Streptomyces 340 Duramicina-C Lantibiótico 341 griseoluteus Duramicina Streptoverticillium 342 (duramicina-B) Lantibiótico B 343 griseoverticillatum (Leucopeptina) Carnobacterium sp. 344 Carnocina UI49 lantibiótico 345 (cepa UI49) Lactococcus lactis subsp.
346 Lactococcina-G α Não classificada lactis (Streptococcus 347 lactis) Lactococcus lactis subsp.
348 Lactococcina-G β Não classificada lactis (Streptococcus 349 lactis) Streptomyces sp. (cepa 350 Ancovenina Lantibiótico 351 A647P-2)
Actagardina 352 Lantibiótico Actinoplanes liguriae 353 (Gardimicina)
354 Curvaticina FS47 Não classificada Lactobacillus curvatus 355 classe 356 Bavaricina-MN Lactobacillus sakei 357 IIA/YGNGV
358 Mutacina B-Ny266 Lantibiótico Streptococcus mutans 359 classe 360 Mundticina Enterococcus mundtii 361 IIA/YGNGV classe 362 Bavaricina-A Lactobacillus sakei 363 IIA/YGNGV
364 Lactocina-705 Classe IIb Lactobacillus paracasei 365
Leuconostoc 366 Leucocina-B Não classificada 367 mesenteroides classe Leuconostoc 368 Leucocina C 369 IIA/YGNGV mesenteroides
370 LCI Não classificada Bacillus subtilis 371
372 Liquenina Não classificada Bacillus licheniformis 373
Lactococcus lactis subsp. classe 374 Lactococcina MMFII lactis (Streptococcus 375 IIA/YGNGV lactis)
376 Serracina-P Fago-Tail-Like Serratia plymuthica 377
Halobacterium sp. (cepa 378 Halocina-C8 Não classificada 379 AS7092)
380 Subpeptina JM4-B Não classificada Bacillus subtilis 381
382 Curvalicina-28a Não classificada Lactobacillus curvatus 383
384 Curvalicina-28b Não classificada Lactobacillus curvatus 385
386 Curvalicina-28c Não classificada Lactobacillus curvatus 387
Bacillus thuringiensis 388 Turicina-S Não classificada 389 subsp. entomocidus
390 Curvaticina L442 Não classificada Lactobacillus curvatus 391
Carnobacterium classe 392 Divergicina M35 divergens (Lactobacillus 393 IIa/YGNGV divergens)
394 Enterocina E-760 classe IIb Enterococcus sp. 395
Enterococcus faecium 396 Bacteriocina E50-52 Não classificada 397 (Streptococcus faecium)
Paenibacillus polimyxa 398 Penibacilina Não classificada 399 (Bacillus polimyxa)
Staphylococcus 400 Epilancina 15x Não classificada 401 epidermidis
Enterococcus faecium 402 Enterocina-HF classe IIa 403 (Streptococcus faecium)
Paenibacillus polimyxa 404 Bacilocina 602 Classe IIa 405 (Bacillus polimyxa)
406 Bacilocina 1580 Classe IIa Bacillus circulans 407
Paenibacillus polimyxa 408 Bacilocina B37 Não classificada 409 (Bacillus polimyxa)
410 Ramnosina A Não classificada Lactobacillus rhamnosus 411
Bacillus licheniformis Lantibiótico 412 Liquenicidina A2 (cepa DSM 13/ATCC 413 (dois peptídeos) 14580)
414 Plantaricina C19 Classe IIa Lactobacillus plantarum 415
416 Acidocina J1132 β Classe IIb Lactobacillus acidophilus 417
418 fator com atividade Não classificada Enterococcus faecalis 419 anti-Candida
Ava_1098
(proteína de Anabaena variabilis 420 Não classificada 421 diferenciação de ATCC 29413 heterocisto putativa)
alr2818
(proteína de 422 Não classificada Nostoc sp 7120 423 diferenciação de heterocisto putativa)
Aazo_0724
(proteína de Nostoc azollae 0708 424 Não classificada 425 diferenciação de heterocisto putativa)
AM1_4010
(proteína de Acaryochloris marina 426 Não classificada 427 diferenciação de MBIC11017 heterocisto putativa)
PCC8801_3266
(proteína de 428 Não classificada Cyanothece PCC 8801 429 diferenciação de heterocisto putativa)
Cyan8802_2855
(proteína de 430 Não classificada Cyanothece PCC 8802 431 diferenciação de heterocisto putativa)
432 PCC7424_3517 Não classificada Cyanothece PCC 7424 433
434 cce_2677(proteína Não classificada Cyanothece ATCC 51142 435
HetP putativa)
CY0110_11572
(proteína de 436 Não classificada Cyanothece CCY0110 437 diferenciação de heterocisto putativa)
Microcoleus
438 MC7420_4637 Não classificada chthonoplastes PCC 439
7420 asr1611 (proteína
440 da família de Não classificada Nostoc sp 7120 441
DUF37 putativa)
Ava_4222 (proteína Anabaena variabilis 442 da família de Não classificada 443 ATCC 29413 DUF37 putativa)
N9414_07129 Nodularia spumigena 444 (proteína da família Não classificada 445 CCY9414 de DUF37 putativa)
Aazo_0083
446 (proteína da família Não classificada Nostoc azollae 0708 447 de DUF37 putativa)
S7335_3409 Synechococcus PCC 448 (proteína da família Não classificada 449 7335 de DUF37 putativa)
P9303_21151 Prochlorococcus marinus 450 (proteína da família Não classificada 451 MIT 9303 de DUF37 putativa)
699 Curvalicina-28c Não classificada Lactobacillus curvatus 700 truicina-S Não classificada Bacillus thuringiensis 703 Lactobacillus curvatus 704 curvaticina L442 Não classificada L442 Carnobacterium 705 Bacteriocina 706 P84962 divergens (Lactobacillus divergicina M35 divergens) 707 Microbispora sp. (cepa 708 Lantibiótico 107891 P85065 107891) Enterocina E-760 709 710 (Bacteriocina E- P85147 Enterococcus sp.
760) 711 Enterococcus faecium 712 Bacteriocina E50-52 P85148 (Streptococcus faecium) 713 Lantibiótico Paenibacillus polimyxa 714 P86013 penibacilina (Bacillus polimyxa) 715 Lantibiótico Staphylococcus 716 P86047 epilancina 15X epidermidis 717 Enterococcus faecium 718 Enterocina-HF P86183 (Streptococcus faecium) 719 Bacteriocina Paenibacillus polimyxa 720 P86393 SRCAM 602 (Bacillus polimyxa) 721 Bacteriocina 722 P86394 Bacillus circulans SRCAM 1580 723 Bacteriocina Paenibacillus polimyxa 724 P86395 SRCAM 37 (Bacillus polimyxa)
Bacteriocina 725 726 ramnosina A P86526 Lactobacillus rhamnosus (Fragmento) Bacillus licheniformis (cepa ATCC 14580/DSM Lantibiótico 727 13/JCM 2505/NBRC 728 liquenicidina A2 P86720 12200/NCIMB (LchA2) (BliA2) 9375/NRRL NRS- 1264/Gibson 46) Pseudomonas aeruginosa (cepa ATCC Piocina-S2 (EC 729 15692/DSM 22644/CIP 730
3.1.-.-) (Proteína 104116/JCM 14847/LMG exterminadora) 12228/1C/PRS 101/PAO1) 731 Plantaricina C19 732 Lactobacillus plantarum (Fragmento) Lactococcus lactis subsp. 733 734 LsbB lactis (Streptococcus lactis) ACIDOCINA J1132 735 736 beta peptídeo Lactobacillus acidophilus (Fragmento) Lactobacillus salivarius Proteína não 737 cp400 738 caracterizada
[042]Como usado aqui, “polinucleotídeo de bacteriocina” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo se refere a um polinucleotídeo que codifica uma bacteriocina. Como usado aqui, “sequência de codificação de bacteriocina” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo se refere à sequência de codificação de ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA) que codifica a sequência de polipeptídeo de uma bacteriocina. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende pelo menos uma bacteriocina.
[043]Peptídeos antimicrobianos são uma classe de peptídeos que confere atividade imuni inata para matar ou parar o crescimento de organismos microbianos.
Como usado aqui “peptídeo antimicrobiano” (incluindo variações deste termo raiz) tem seu significado usual e habitual como seria entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica tendo em vista esta divulgação. Classicamente, peptídeos antimicrobianos foram descritos como peptídeos produzidos pelos sistemas imunes inatos de invertebrados e vertebrados. Assim, embora bacteriocinas tenham sido classicamente referidas como uma classe de produtos genéticos microbianos que alvejam organismos microbianos, peptídeos antimicrobianos foram classicamente referidos como uma classe de produtos genéticos invertebrados e vertebrados que alvejam organismos microbianos. Exemplos de peptídeos antimicrobianos adequados para métodos, dispositivos e sistemas microfluídicos de algumas modalidades aqui são conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em The Antimicrobial Peptide Base de dados acessível na rede mundial em aps.unmc.edu/AP/, que é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.
Mais de 1000 peptídeos antimicrobianos e variantes destes foram identificados e catalogados. The Antimicrobial Peptide Base de dados é descrita em Wang et al.
(2016), Nucleic Acids Res. 44 (Edição da base de dados): D1087-D1093, que é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade. Exemplos de peptídeos antimicrobianos incluem bacteriocinas, peptídeos antibacterianos, antivirais, anti-HIV, antifúngicos, antiparasíticos e anticancerígenos, tais como Dermaseptina-B2, Abaecina, Ct-AMP1, Andropina, Aureina 1.1, Lactoferricina B e Heliomicina. Métodos, composições, sistemas e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades compreendem peptídeos antimicrobianos que ocorrem naturalmente ou um ácido nucleico que codifica os mesmos. Métodos, composições, sistemas e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades compreendem peptídeos antimicrobianos que não ocorrem naturalmente ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos. Métodos, composições, sistemas e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades incluem peptídeos antimicrobianos que compreendem uma mutação ou variação em um peptídeo antimicrobiano que ocorre naturalmente ou um ácido nucleico que codifica o mesmo. Métodos, composições, sistemas e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades compreendem peptídeos antimicrobianos compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em sequências de peptídeo que não ocorrem naturalmente ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos.
[044]É considerado ainda que métodos, sistemas e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades aqui podem estar em combinação com peptídeos antimicrobianos que ocorrem naturalmente, variantes de peptídeos antimicrobianos que ocorrem naturalmente e/ou peptídeos antimicrobianos sintéticos. Como tal, peptídeos antimicrobianos de métodos, sistemas e dispositivo de algumas modalidades podem compreender, consistir essencialmente em ou consistir em peptídeos antimicrobianos que ocorrem naturalmente, variantes de peptídeos antimicrobianos que ocorrem naturalmente e/ou peptídeos antimicrobianos sintéticos.
Em algumas modalidades, um peptídeo antimicrobiano variante tem pelo menos cerca de 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade a um peptídeo antimicrobiano de referência (por exemplo Dermaseptina-B2, Abaecina, Ct-AMP1, Andropina, Aureina
1.1, Lactoferricina B ou Heliomicina), incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo, 70 % a 100 %, 75 % a 100 %, 80 % a 100 %, 85 % a 100 %, 90 % a 100 %, 95 % a 100 %, 97 % a 100 %, 99 % a 100 %, 70 % a 99 %, 75 % a 99 %, 80 % a 99 %, 85 % a 99 %, 90 % a 99 %, 95 % a 99 %, 97 % a 99 %, 70 % a 95 %, 75 % a 95 %, 80 % a 95 %, 85 % a 95 %, 90 % a 95 %, 70 % a 90 %, 75 % a 90 %, 80 % a 90 % e 85 % a 90 %. Sempre que as bacteriocinas são mencionadas aqui, é expressamente considerado que qualquer peptídeo antimicrobiano como descrito aqui pode ser substituído no lugar de uma, duas ou mais ou todas as bacteriocinas observadas (embora seja avaliado que em alguns contextos, tal como um par de bacteriocina-modulador de imunidade, o peptídeo antimicrobiano terá diferentes propriedades e interagirá diferentemente de uma bacteriocina). Consequentemente, algumas modalidades dos métodos e dispositivos microfluídicos descritos aqui incluem bacteriocinas apenas, algumas modalidades dos métodos e dispositivos microfluídicos descritos aqui incluem peptídeos antimicrobianos apenas e algumas modalidades dos métodos e dispositivos microfluídicos descritos aqui incluem uma combinação de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos. Consequentemente, nos métodos e composições de algumas modalidades, um pró-polipeptídeo compreende um peptídeo antimicrobiano ao invés de uma bacteriocina. Consequentemente, nos métodos e composições de algumas modalidades, um pró-polipeptídeo compreende um ou mais peptídeos antimicrobianos e uma ou mais bacteriocinas.
Moduladores de imunidade de bacteriocina
[045]Moduladores de imunidade de bacteriocina exemplares são mostrados na Tabela 2. Embora os moduladores de imunidade na Tabela 2 sejam de ocorrência natural, o técnico habilitado avaliará que variantes dos moduladores de imunidade da Tabela 2, moduladores de imunidade que ocorrem naturalmente exceto os moduladores de imunidade da Tabela 2 ou moduladores de imunidade sintéticos podem ser usados de acordo com algumas modalidades aqui. Em algumas modalidades, uma célula microbiana que produziu um pró-polipeptídeo compreendendo bacteriocinas não produz um modulador de imunidade para pelo menos uma das bacteriocinas. Sem ser limitado pela teoria, é considerado que em algumas modalidades, as bacteriocinas no pró-polipeptídeo são inativas e assim têm pouca a nenhuma capacidade de neutralizar a célula que as produziu (ou uma célula clonalmente relacionada à célula que as produziu), de modo que a célula não requeira imunidade contra estes bacteriocinas do pró-polipeptídeo.
[046]Em algumas modalidades, um modulador de imunidade particular ou combinação particular de moduladores de imunidade confere imunidade a uma bacteriocina particular, classe ou categoria particular de bacteriocinas ou combinação particular de bacteriocinas. Bacteriocinas exemplares às quais os moduladores de imunidade podem conferir imunidade são identificadas na Tabela 2. Embora a Tabela 2 identifique um “organismo de origem” para moduladores de imunidade exemplares, estes moduladores de imunidade podem ser facilmente expressados em outros microrganismos que ocorrem naturalmente, geneticamente modificados ou sintéticos para fornecer uma atividade de imunidade de bacteriocina desejada de acordo com algumas modalidades aqui. Como tal, como usado aqui “modulador de imunidade” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação e se refere não apenas às estruturas expressamente fornecidas aqui, mas também à estrutura que têm substancialmente o mesmo efeito como as estruturas de “modulador de imunidade” descritas aqui, incluindo moduladores de imunidade completamente sintéticos e moduladores de imunidade que fornecem imunidade às bacteriocinas que são funcionalmente equivalentes às bacteriocinas divulgadas aqui.
[047]Sequências de polinucleotídeo exemplares que codificam os polipeptídeos da Tabela 2 são indicadas na Tabela 2. O técnico habilitado entenderá facilmente que o código genético é degenerado e além disso, o uso do códon pode variar com base no organismo particular em que o produto genético está sendo expressado e como tal, um polipeptídeo particular pode ser codificado por mais do que um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um modulador de imunidade de bacteriocina é selecionado com base no uso do códon do organismo que expressa o modulador de imunidade de bacteriocina. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um modulador de imunidade de bacteriocina é otimizado de códon com base no organismo particular que expressa o modulador de imunidade de bacteriocina. Uma vasta faixa de moduladores de imunidade funcionais pode incorporar características de moduladores de imunidade divulgados aqui, levando em consideração assim um vasto grau de identidade aos moduladores de imunidade na Tabela 2. Em algumas modalidades, um modulador de imunidade tem pelo menos cerca de 50 % de identidade, por exemplo, pelo menos cerca de 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade a qualquer um dos polipeptídeos da Tabela 2 ou uma faixa de identidade definida por quaisquer dois dos valores precedentes.
Tabela 2: Moduladores de imunidade de bacteriocina exemplares SEQ ID NO do Organismo de SEQ ID NO do Nome polipeptídeo: origem polinucleotídeo: Modulador de imunidade MchI de 452 Escherichia coli 453 microcina H47 Modulador de imunidade de (Cadeia B de 454 colicina-E3) (ImmE3) (Modulador de Escherichia coli 455 imunidade de microcina-E3)
Modulador de imunidade de colicina-E1
456 (ImmE1) (Modulador de imunidade de Escherichia coli 457 microcina-E1)
458 Modulador de imunidade de cloacina Escherichia coli 459
Modulador de imunidade de colicina-E2
460 (ImmE2) (Modulador de imunidade de Escherichia coli 461 microcina-E2)
Modulador de imunidade de colicina-A 462 Citrobacter freundii 463 (Modulador de imunidade de microcina-A)
464 Modulador de imunidade de colicina-Ia Escherichia coli 465
466 Modulador de imunidade de colicina-Ib Escherichia coli 467
Modulador de imunidade de colicina-N 468 Escherichia coli 469 (Modulador de imunidade de microcina-N)
Modulador de imunidade de colicina-E8
470 (ImmE8) (Modulador de imunidade de Escherichia coli 471 microcina-E8)
Lactococcus lactis
Modulador de imunidade de lactococcina- subsp. lactis 472 473 A (Streptococcus lactis)
Lactococcus lactis
Modulador de imunidade de lactococcina- subsp. cremoris 474 475 A (Streptococcus cremoris)
Modulador de imunidade de colicina-D 476 Escherichia coli 477 (modulador de imunidade de microcina-D)
478 Modulador de imunidade de colicina-E5 Escherichia coli 479
(ImmE5) (Modulador de imunidade de microcina-E5)
Modulador de imunidade de colicina-E6
480 (ImmE6) (Modulador de imunidade de Escherichia coli 481 microcina-E6)
Modulador de imunidade de colicina-E8 482 Escherichia coli 483 em ColE6 (E8Imm[E6])
Modulador de imunidade de colicina-E9
484 (ImmE9) (Modulador de imunidade de Escherichia coli 485 microcina-E9)
Modulador de imunidade de colicina-M
486 (Modulador de imunidade de microcina- Escherichia coli 487
M)
Modulador de imunidade de colicina-B 488 Escherichia coli 489 (Modulador de imunidade de microcina-B)
Modulador de imunidade de colicina-V 490 Escherichia coli 491 (Modulador de imunidade de microcina-V)
Modulador de imunidade de colicina-E1*
492 (ImmE1) (Modulador de imunidade de Shigella sonnei 493 microcina-E1*)
Modulador de imunidade de colicina-E1
494 (ImmE1) (Modulador de imunidade de Escherichia coli 495 microcina-E1)
Provável modulador de imunidade de Leuconostoc 496 497 leucocina-A gelidum
Modulador de imunidade de Lactococcus lactis 498 499 Lactococcina-B subsp. cremoris
(Streptococcus cremoris)
Modulador de imunidade de Pediocina Pediococcus 500 PA-1 (Modulador de imunidade de 501 acidilactici pediocina ACH)
Carnobacterium
Modulador de imunidade de maltaromaticum 502 503 carnobacteriocina-BM1 putativo (Carnobacterium piscicola)
Carnobacterium Modulador de imunidade de maltaromaticum 504 carnobacteriocina-B2 putativo (Modulador 505 (Carnobacterium de imunidade de carnocina-CP52) piscicola)
Lactococcus lactis subsp. lactis 506 Modulador de imunidade de nisina 507 (Streptococcus lactis)
Rhizobium
508 Modulador de imunidade de trifolitoxina leguminosarum bv. 509 trifolii
Proteína de biossíntese de subtilosina de Bacillus subtilis 510 511 bacteriocina antilisterial AlbD (cepa 168)
Proteína de ligação a ATP transportadora de ABC putativa AlbC (Proteína de Bacillus subtilis 512 513 biossíntese de subtilosina de bacteriocina (cepa 168)
antilisterial AlbC)
514 Proteína de biossíntese de subtilosina de Bacillus subtilis 515 bacteriocina antilisterial AlbB (cepa 168)
Modulador de imunidade de colicina-E7
516 (ImmE7) (Modulador de imunidade de Escherichia coli 517 microcina-E7)
Pseudomonas 518 Modulador de imunidade de piocina-S1 519 aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa (cepa
520 Modulador de imunidade de piocina-S2 ATCC 521
15692/PAO1/1C/PR
S 101/LMG 12228)
522 Fator de imunidade de hiracina-JM79 Enterococcus hirae 523
Provável modulador de imunidade de Leuconostoc 524 525 mesentericina-Y105 mesenteroides
526 Modulador de imunidade de microcina-24 Escherichia coli 527
528 Modulador de imunidade de colicina-K Escherichia coli 529
Modulador de auto-imunidade MccF de 530 Escherichia coli 531 microcina C7
532 Fator de imunidade de sacacina-A Lactobacillus sakei 533
Modulador de imunidade de colicina-E5 534 Escherichia coli 535 em ColE9 (E5Imm[E9])
Proteína de biossíntese de subtilosina de 536 Bacillus subtilis 537 bacteriocina antilisterial AlbD
Proteína de ligação à ATP/permease
McjD de exportação de microcina-J25 538 Escherichia coli 539 (modulador de imunidade de microcina-
J25) (proteína de ligação a ATP McjD de secreção de microcina-J25) Modulador de imunidade de microcina Klebsiella 540 E492 541 pneumoniae Promotores
[048]Promotores são bem conhecidos na técnica. Um promotor pode ser usado para conduzir a transcrição de um ou mais genes. Em algumas modalidades, um promotor conduz a expressão do polinucleotídeo que codifica um produto genético desejado como descrito aqui. Em algumas modalidades, um promotor conduz a expressão de um polinucleotídeo que codifica um pró-polipeptídeo compreendendo duas ou mais bacteriocinas como descrito aqui. Em algumas modalidades, um promotor conduz a expressão de um polinucleotídeo modulador de imunidade como descrito aqui. Em algumas modalidades, um promotor conduz a expressão de um polinucleotídeo que codifica um pró-polipeptídeo compreendendo duas ou mais bacteriocinas em uma célula microbiana, mas a célula microbiana não expressa moduladores de imunidade para uma ou mais destas bacteriocinas (por exemplo, a célula pode carecer de um promotor que conduz a transcrição do modulador de imunidade ou pode carecer do ácido nucleico que codifica o modulador de imunidade).
Alguns promotores podem conduzir a transcrição em todos os momentos (“promotores constitutivos”). Alguns promotores podem conduzir a transcrição sob circunstâncias apenas seletas (“promotores condicionais”), por exemplo dependendo da presença ou ausência de uma condição ambiental, composto químico, produto genético, estágio do ciclo celular ou semelhantes.
[049]O técnico habilitado avaliará que dependendo da atividade de expressão desejada, um promotor apropriado pode ser selecionado e colocado em cis com uma sequência de ácido nucleico a ser expressada. Promotores exemplares com atividades exemplares e úteis em algumas modalidades aqui são fornecidos nas
Tabelas 3.1 a 3.11 aqui. O técnico habilitado avaliará que alguns promotores são compatíveis com o mecanismo transcricional particular (por exemplo, RNA polimerases, fatores de transcrição gerais e semelhantes). Como tal, embora “espécies” compatíveis sejam identificadas para alguns promotores descritos aqui, é considerado que em algumas modalidades, estes promotores possam facilmente funcionar em microrganismos exceto as espécies identificadas, por exemplo, em espécies com mecanismo transcricional endógeno compatível, espécies geneticamente modificadas compreendendo mecanismo transcricional compatível ou organismos microbianos completamente sintéticos compreendendo mecanismo transcricional compatível.
[050]Os promotores das Tabelas 3.1 a 3.11 aqui estão publicamente disponíveis da fundação Biobricks. É observado que a fundação Biobricks encoraja o uso destes promotores de acordo com BioBrick™ Public Agreement (BPA).
[051]Deve ser avaliado que qualquer um dos polinucleotídeos de “codificação” descritos aqui (por exemplo, um polinucleotídeo de bacteriocina, polinucleotídeo de imunidade ou nucleotídeo que codifica um pró-polipeptídeo compreendendo duas ou mais bacteriocinas) é geralmente passível de ser expressado sob o controle de um promotor desejado. Em algumas modalidades, um único polinucleotídeo de “codificação” está sob o controle de um único promotor. Em algumas modalidades, dois ou mais polinucleotídeos de “codificação” estão sob o controle de um único promotor, por exemplo dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez polinucleotídeos.
[052]Geralmente, a iniciação da tradução para um transcrito particular é regulada por sequências particulares em ou 5’ da extremidade 5’ da sequência de codificação de um transcrito. Por exemplo, uma sequência de codificação pode começar com um códon de início configurado para parear com um tRNA iniciador.
Embora os sistemas de tradução que ocorrem naturalmente tipicamente usem Met
(AUG) como um códon de início, será facilmente avaliado que um iniciador de tRNA pode ser engendrado para se ligar a qualquer tripleto ou tripletos desejados e consequentemente, tripletos exceto AUG também podem funcionar como códons de início em certas modalidades. Adicionalmente, sequências próximas ao códon de início podem facilitar a montagem ribossômica, por exemplo uma sequência Kozak ((gcc)gccRccAUGG, SEQ ID NO: 542, em que R representa “A” ou “G”) ou Sítio Interno de Entrada do Ribossomo (IRES) em sistemas traducionais eucarióticos típicos ou uma sequência Shine-Delgarno (GGAGGU, SEQ ID NO: 543) em sistemas de tradução procarióticos típicos. Como tal em algumas modalidades, um transcrito compreendendo uma sequência de polinucleotídeo de “codificação”, por exemplo um polinucleotídeo de bacteriocina ou polinucleotídeo de imunidade ou nucleotídeo que codifica um pró-polipeptídeo compreendendo duas ou mais bacteriocinas, compreende um códon de início e sequência de iniciação traducional apropriados. Em algumas modalidades, por exemplo se duas ou mais sequências de polinucleotídeo de “codificação” são posicionadas em cis em um transcrito, cada sequência de polinucleotídeo compreende um códon de início e sequência(s) de iniciação traducional apropriados. Em algumas modalidades, por exemplo se duas ou mais sequências de polinucleotídeo de “codificação” são posicionadas em cis em um transcrito, as duas sequências estão sob o controle de uma única sequência de iniciação da tradução e fornecem um único polipeptídeo que pode funcionar com ambos os polipeptídeos codificados em cis.
Tabela 3.1: Promotores sensíveis em metal exemplares
SEQ ID Nome Descrição NO: 544 BBa_I721001 Promotor de chumbo 545 BBa_I731004 Promotor de FecA
546 BBa_I760005 Promotor sensível em Cu 547 BBa_I765000 Promotor de Fe 548 BBa_I765007 Promotores de Fe e UV 549 BBa_J3902 PrFe (PI + PII rus operon) Tabela 3.2: Promotores responsivos à sinalização celular exemplares
SEQ ID Nome Descrição NO: 550 BBa_I1051 Promotor direito do cassete de Lux 551 BBa_I14015 P(Las) TetO 552 BBa_I14016 P(Las) CIO 553 BBa_I14017 P(Rhl) 554 BBa_I739105 Promotor duplo (LuxR/HSL, positivo/cI, negativo) 555 BBa_I746104 Promotor P2 em operon agr de S. aureus 556 BBa_I751501 Promotor híbrido de plux-cI 557 BBa_I751502 Promotor híbrido de plux-lac 558 BBa_I761011 Promotor controlado por CinR, CinL e glicose 559 BBa_J06403 Promotor de RhIR reprimível por CI 560 BBa_J102001 Promotor de Lux Reverso 561 BBa_J64000 Promotor de rhlI 562 BBa_J64010 Promotor de lasI 563 BBa_J64067 R0065 independente de LuxR+3OC6HSL Promotor induzível por LasR/LasI & reprimível por 564 BBa_J64712 RHLR/RHLI 565 BBa_K091107 Promotor híbrido de pLux/cI 566 BBa_K091117 Promotor de pLas
567 BBa_K091143 Promotor híbrido de pLas/cI 568 BBa_K091146 Promotor híbrido de pLas/Lux 569 BBa_K091156 pLux 570 BBa_K091157 Promotor híbrido de pLux/Las Promotor híbrido: ativado por HSL-LuxR, reprimido por 571 BBa_K145150 P22 C2 572 BBa_K266000 PAI+LasR -> LuxI (AI) 573 BBa_K266005 PAI+LasR -> LasI & AI+LuxR --| LasI 574 BBa_K266006 PAI+LasR -> LasI+GFP & AI+LuxR --| LasI+GFP 575 BBa_K266007 Complexo QS -> circuito de LuxI & LasI Promotor mutado na posição 3 de lux pR-3 (regulado por 576 BBa_K658006 luxR & HSL) Promotor mutado na posição 5 de lux pR-5 (regulado por 577 BBa_K658007 luxR & HSL) Promotor mutado na posição 3&5 de lux pR-3/5 578 BBa_K658008 (regulado por luxR & HSL) 579 BBa_R0061 Promotor (repressor de luxR mediado por HSL) 580 BBa_R0062 Promotor (regulado por luxR & HSL -- lux pR) 581 BBa_R0063 Promotor (regulado por luxR & HSL -- lux pL) 582 BBa_R0071 Promotor (regulado por RhlR & C4-HSL) 583 BBa_R0078 Promotor (regulado por cinR e HSL) 584 BBa_R0079 Promotor (regulado por LasR & PAI) 585 BBa_R1062 Promotor, Padrão (regulado por luxR e HSL -- lux pR) Tabela 3.3: Promotores σ70 de E. coli constitutivos exemplares
SEQ Nome Descrição
ID NO:
586 BBa_I14018 P(Bla)
587 BBa_I14033 P(Cat)
588 BBa_I14034 P(Kat)
589 BBa_I732021 Padrão para construir o membro da família de iniciador
590 BBa_I742126 Promotor regulado por lambda cI reverso
591 BBa_J01006 Promotor chave absorve 3
592 BBa_J23100 membro da família de promotor constitutivo
593 BBa_J23101 membro da família de promotor constitutivo
594 BBa_J23102 membro da família de promotor constitutivo
595 BBa_J23103 membro da família de promotor constitutivo
596 BBa_J23104 membro da família de promotor constitutivo
597 BBa_J23105 membro da família de promotor constitutivo
598 BBa_J23106 membro da família de promotor constitutivo
599 BBa_J23107 membro da família de promotor constitutivo
600 BBa_J23108 membro da família de promotor constitutivo
601 BBa_J23109 membro da família de promotor constitutivo
602 BBa_J23110 membro da família de promotor constitutivo
603 BBa_J23111 membro da família de promotor constitutivo
604 BBa_J23112 membro da família de promotor constitutivo
605 BBa_J23113 membro da família de promotor constitutivo
606 BBa_J23114 membro da família de promotor constitutivo
607 BBa_J23115 membro da família de promotor constitutivo
608 BBa_J23116 membro da família de promotor constitutivo
609 BBa_J23117 membro da família de promotor constitutivo
610 BBa_J23118 membro da família de promotor constitutivo
611 BBa_J23119 membro da família de promotor constitutivo
612 BBa_J23150 mutante de 1pb de J23107
613 BBa_J23151 mutante de 1pb de J23114
614 BBa_J44002 pBAD reverso
Promotor de NikR, uma proteína da família de fita hélice- 615 BBa_J48104 hélice de fatores de transcrição que reprimem expre
616 BBa_J54200 lacq_Promotor
617 BBa_J56015 sequência de lacIQ - promotor
Promotor de operon de sensibilização a fosfato 618 BBa_J64951 CreABCD de E.
Coli
619 BBa_K088007 Promotor de GlnRS
620 BBa_K119000 Promotor constitutivo fraco de lacZ
621 BBa_K119001 Promotor de LacZ mutado promotor constitutivo com (TA)10 entre -10 e -35 622 BBa_K137029 elementos promotor constitutivo com (TA)9 entre -10 e -35 623 BBa_K137030 elementos promotor constitutivo com (C)10 entre -10 e -35 624 BBa_K137031 elementos promotor constitutivo com (C)12 entre -10 e -35 625 BBa_K137032 elementos promotor constitutivo de repetição otimizada (TA) com 626 BBa_K137085 13 pb entre -10 e -35 elementos promotor constitutivo de repetição otimizada (TA) com 627 BBa_K137086 15 pb entre -10 e -35 elementos promotor constitutivo de repetição otimizada (TA) com 628 BBa_K137087 17 pb entre -10 e -35 elementos
629 BBa_K137088 promotor constitutivo de repetição otimizada (TA) com
19 pb entre -10 e -35 elementos promotor constitutivo de repetição otimizada (TA) com 630 BBa_K137089 21 pb entre -10 e -35 elementos promotor constitutivo de repetição otimizada (A) com 17 631 BBa_K137090 pb entre -10 e -35 elementos promotor constitutivo de repetição otimizada (A) com 18 632 BBa_K137091 pb entre -10 e -35 elementos 633 BBa_K256002 J23101:GFP 634 BBa_K256018 J23119:IFP 635 BBa_K256020 J23119:HO1 Repórter de sinal de infravermelho 636 BBa_K256033 (J23119:IFP:J23119:HO1) 637 BBa_K292000 Terminador duplo + promotor constitutivo 638 BBa_K292001 Terminador duplo + Promotor constitutivo + RBS forte 639 BBa_K418000 Cassete de promotor de Lac induzível por IPTG 640 BBa_K418002 Cassete de promotor de Lac induzível por IPTG 641 BBa_K418003 Cassete de promotor de Lac induzível por IPTG 642 BBa_M13101 Promotor do gene I de M13K07 643 BBa_M13102 Promotor do gene II de M13K07 644 BBa_M13103 Promotor do gene III de M13K07 645 BBa_M13104 Promotor do gene IV de M13K07 646 BBa_M13105 Promotor do gene V de M13K07 647 BBa_M13106 Promotor do gene VI de M13K07 648 BBa_M13108 Promotor do gene VII de M13K07 649 BBa_M13110 M13110 650 BBa_M31519 Sequência de promotor modificado de g3.
651 BBa_R1074 Promotor constitutivo I
652 BBa_R1075 Promotor constitutivo II 653 BBa_S03331 --Especificar a Lista de Partes-- Tabela 3.4: Promotores σs de E. coli constitutivos exemplares
SEQ ID Nome Descrição NO: Promotor de osmY de fase estacionária de tamanho 654 BBa_J45992 natural 655 BBa_J45993 Promotor osmY de fase estacionária mínimo Tabela 3.5: Promotores σ32 de E. coli constitutivos exemplares
SEQ ID Nome Descrição NO: 656 BBa_J45504 Promotor de choque térmico de htpG Tabela 3.6: Promotores σA de B. subtilis constitutivos exemplares
SEQ ID Nome Descrição NO: 657 BBa_K143012 Promotor veg um promotor constitutivo para B. subtilis 658 BBa_K143013 Promotor 43 um promotor constitutivo para B. subtilis 659 BBa_K780003 Promotor constitutivo forte para Bacillus subtilis 660 BBa_K823000 PliaG 661 BBa_K823002 PlepA 662 BBa_K823003 Pveg
Tabela 3.7: Promotores σB de B. subtilis constitutivos exemplares
SEQ ID Nome Descrição NO: 663 BBa_K143010 Promotor ctc para B. subtilis 664 BBa_K143011 Promotor gsiB para B. subtilis 665 BBa_K143013 Promotor 43 um promotor constitutivo para B. subtilis Tabela 3.8: Promotores exemplares constitutivos de procariotas diversos
SEQ ID Nome Descrição NO: 666 a_K112706 Pspv2 de Salmonella 667 BBa_K112707 Pspv de Salmonella Tabela 3.9: Promotores exemplares constitutivos de bacteriófago T7
SEQ ID Nome Descrição NO: 668 BBa_I712074 Promotor de T7 (promotor forte de bacteriófago T7) 669 BBa_I719005 Promotor de T7 670 BBa_J34814 Promotor de T7 671 BBa_J64997 T7 de consenso -10 e restante 672 BBa_K113010 Promotor de T7 de sobreposição 673 BBa_K113011 Promotor de T7 de mais sobreposição 674 BBa_K113012 Promotor de T7 de sobreposição enfraquecida 675 BBa_R0085 Sequência de promotor de consenso de T7 676 BBa_R0180 Promotor de T7 RNAP
677 BBa_R0181 Promotor de T7 RNAP 678 BBa_R0182 Promotor de T7 RNAP 679 BBa_R0183 Promotor de T7 RNAP 680 BBa_Z0251 Promotor forte de T7 681 BBa_Z0252 Ligação e processividade fracas de T7 682 BBa_Z0253 Promotor de ligação fraca de T7 Tabela 3.10: Promotores exemplares constitutivos de levedura
SEQ ID Nome Descrição NO: 683 BBa_I766555 Promotor de pCyc (Médio) 684 BBa_I766556 Promotor de pAdh (Forte) 685 BBa_I766557 Promotor de pSte5 (Fraco) 686 BBa_J63005 Promotor de ADH1 de levedura 687 BBa_K105027 Promotor mínimo de cyc100 688 BBa_K105028 Promotor mínimo de cyc70 689 BBa_K105029 Promotor mínimo de cyc43 690 BBa_K105030 Promotor mínimo de cyc28 691 BBa_K105031 Promotor mínimo de cyc16 692 BBa_K122000 pPGK1 693 BBa_K124000 Promotor de pCYC de levedura 694 BBa_K124002 Promotor de GPD (TDH3) de levedura 695 BBa_K319005 Promotor de ADH1 de comprimento médio de levedura Região promotora de CLB1 de levedura, específico de 696 BBa_M31201 ciclo celular de G2/M Tabela 3.11: Promotores exemplares constitutivos de diversos eucariotas
SEQ ID Nome Descrição NO: 697 BBa_I712004 Promotor de CMV 698 BBa_K076017 Promotor de Ubc
[053]Os promotores referenciados acima são fornecidos por via de exemplo não limitante apenas. O técnico habilitado facilmente reconhecerá que muitas variantes dos promotores referenciados acima e muitos outros promotores (incluindo promotores isolados de organismos naturalmente existentes, variações destes e promotores completamente sintéticos) podem ser facilmente usados de acordo com algumas modalidades aqui.
Sítios de Clivagem
[054]Como usado aqui, “sítio de clivagem” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo se refere a uma sequência de polipeptídeo que medeia a clivagem de um polipeptídeo (por exemplo por hidrólise de uma ligação peptídica) para separar um único polipeptídeo em dois ou mais polipeptídeos separados. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de polipeptídeo de consenso para clivagem por uma “enzima de clivagem”, tal como uma peptidase. Em algumas modalidades, a enzima de clivagem é uma do tipo selvagem, uma variante ou uma enzima de clivagem sintética, por exemplo uma endopeptidase do tipo selvagem, variante ou sintética. Várias enzimas de clivagem exemplares e seus sítios de clivagem correspondentes são descritas aqui. Para referência, os sítios de clivagem são descritos com referência à fórmula (I), abaixo: Pn - P4 - P3 - P2 - P1-||Clivagem||-P1’ - P2’ - P3’ - P4’ - Pm’(I) em que resíduos de aminoácido em um substrato que passa por clivagem são designados como P1, P2, P3, P4 etc. na direção N-terminal (ou “a montante”) da ligação clivada. Do mesmo modo, os resíduos na direção C-terminal (ou “a jusante”) do sítio de clivagem são designados como P1’, P2’, P3’, P4’. etc.
[055]Enzimas de clivagem exemplares e seus sítios de clivagem úteis de acordo com algumas modalidades aqui são descritas na Tabela 4, abaixo.
[056]É observado que várias enzimas de clivagem clivam em sequências de consenso e assim, uma enzima de clivagem particular pode cortar em duas ou mais sequências de polipeptídeo particulares que caem dentro do escopo de uma sequência de consenso (ou sequências de consenso) para esta enzima de clivagem.
Como tal, por conveniência aqui, a menos que explicitamente estabelecido de outro modo, dois sítios de clivagem podem ser referidos como os “mesmos” quando eles são ambos cortados pela mesma enzima de clivagem sob as mesmas condições, mesmo se eles forem duas sequências diferentes (que podem cair dentro do escopo desta(s) sequência(s) de consenso da enzima de clivagem). Por exemplo, ambas as sequências DVADL (SEQ ID NO: 739) e DVADI (SEQ ID NO: 740) podem ser referidas como o “mesmo” sítio de clivagem para os propósitos de clivagem por Caspase 2 porque ambas caem dentro do escopo da sequência de consenso para Caspase 2, ainda que estes sítios de clivagem não sejam idênticos. Por outro lado, também por conveniência aqui, a menos que explicitamente estabelecido de outro modo, dois sítios de clivagem podem ser referidos como “diferentes” quando cada um deles é cortado por enzimas de clivagem diferentes, mas não seria cortado pela mesma enzima de clivagem.
Tabela 4: Enzimas de clivagem e sítios de clivagem exemplares Nome da enzima de Sítio de clivagem (com referência à Fórmula (I)) clivagem P4 P3 P2 P1 P1’ P2’ Arg-C proteinase - - - R - - Asp-N - - - - D - endopeptidase BNPS-Skatol - - - W - - não P, E, F, W, Y ou Caspase 1 - H, A ou T D D, Q, K ou -
L
R não P, E, Caspase 2 D V A D D, Q, K ou -
R não P, E, Caspase 3 D M Q D D, Q, K ou -
R não P, E, Caspase 4 L E V D D, Q, K ou -
R Caspase 5 L ou W E H D - - Caspase 6 V E H ou I D não P, E, -
D, Q, K ou
R não P, E, Caspase 7 D E V D D, Q, K ou -
R não P, E, Caspase 8 I ou L E T D D, Q, K ou -
R Caspase 9 L E H D - - Caspase 10 I E A D - - Quimiotripsina de - - - F ou Y não P - especificidade alta - - - W não M ou P - (Term. C para - - - F, L ou Y não P - [FYW], não antes - - - W não M ou P - de P) Quimiotripsina de - - - M Não P ou Y - especificidade baixa (Term. C para não D, M, - - - H - [FYWML], não P ou W antes de P Clostripain (Clostridiopeptidase - - - R - - B) CNBr - - - M - - Enterocinase D ou E D ou E D ou E K - - A, F, G, I, Fator Xa L, T, V ou D ou E G R - -
M Ácido fórmico - - - D - - Glutamil - - - E - - endopeptidase Granzima B I E P D - Hidroxilamina - - - N G - Ácido - - - W - - iodosobenzoico LysC - - - K - - Neutrófilo elastase - - - A ou V - - NTCB (ácido 2- nitro-5- - - - - C - tiocianobenzoico) não H, K - não P não R F ou L não P ou R Pepsina (pH 1,3) não H, K - não P F ou L - não P ou R não H, K F, L, W ou - não P não R não P Pepsina (pH >2) ou R Y - não H, K não P F, L, W - não P ou R ou Y Prolina- - - H, K ou R P não P - endopeptidase A, E, F, I, Proteinase K - - - L, T, V, - - W ou Y Peptidase I - - não E E - - estafilocócica não D ou A, F, I, L, Termolisina - - - - E M ou V A, F, G, A, F, G, I, I, L, T, Não Tromina L, T, V ou P R não D ou E V, W ou DE
M
A Tripsina (observe - - K ou R não P - as exceções nas - - W K P - linhas seguintes) - - M R P - Exceções para o - - C ou D K D - sítio de consenso - - C K H ou Y - de tripsina - - C R K - observadas nas - - R R H ou R - linhas acima
[057]Informação adicional sobre os sítios de clivagem pode ser encontrada na rede mundial em web.expasy.org/peptide_cutter/peptidecutter_enzymes.html, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[058]Em algumas modalidades o sítio de clivagem compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um sítio de clivagem da Tabela 4. Como tal, em algumas modalidades, o sítio de clivagem compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um sítio de clivagem para Arg-C proteinase, Asp-N endopeptidase, BNPS-Skatol, Caspase 1, Caspase 2, Caspase 3, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 6, Caspase 7, Caspase 8, Caspase 9, Caspase 10, Quimiotripsina de especificidade alta, Clostripain (Clostridiopeptidase B), CNBr, Enterocinase, Fator Xa, Ácido fórmico, Glutamil endopeptidase, Granzima B, Hidroxilamina, Ácido iodosobenzoico, LysC, Neutrófilo elastase, NTCB (ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico), Pepsina (pH 1,3), Pepsina (pH >2), Prolina-endopeptidase, Proteinase K, Peptidase I estafilocócica, Termolisina, Tromina ou Tripsina. Como tal, nos métodos de algumas modalidades aqui, uma ou mais das enzimas listadas são usadas para clivar os sítios de clivagem.
[059]Em algumas modalidades o sítio de clivagem compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um ligador sensível a produto químico ou ao pH.
Tais ligadores podem passar por clivagem na presença de um produto químico adequado (no caso de ligadores sensíveis a produto químico) ou em um pH adequado (no caso de ligadores de pH). Em algumas modalidades, o ligador sensível ao pH passa por clivagem mediada por enzima quando o pH está em uma faixa adequada.
Por exemplo, os ligadores sensíveis ao pH tais como o dipeptídeo de valina-citrulina (vc) são clivados em uma maneira sensível ao pH por catepsina B em pH’s ácidos (por exemplo, na faixa de 4,8 a 6) (Consultar, para exemplo, Jain et al. Pharmaceutical Research, 32: 3526 - 3540, (2015)), que é por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, o ligador sensível ao pH passa por um evento de clivagem quando o pH está em uma faixa particular. Por exemplo, ligadores sensíveis ao pH ajustáveis com base em uma cadeia principal de fosforamidato também foram descritos, que podem passar por hidrólise em um pH de menos do que 7,4 são descritos na Pub. PCT No WO 2016028700, que é por meio deste incorporada a título de referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, o ligador sensível a produto químico passa por um evento de clivagem na presença de um produto químico. Por exemplo, ligadores compreendendo, consistindo essencialmente ou, consistindo em pontes de dissulfeto podem ser liberados após a introdução de glutationa (Consultar, para exemplo, Jain et al. Pharmaceutical Research, 32: 3526 - 3540, (2015)).
Moléculas de Sinal
[060]Em algumas modalidades, pró-polipeptídeos compreendem uma ou mais moléculas de sinal. Como usado aqui, uma “molécula de sinal” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo se refere a uma molécula secretada que é capaz de modular, induzir ou inibir uma atividade ou processo na célula que a produziu ou em uma célula diferente (uma célula do sujeito pode ser uma célula microbiana ou uma célula não microbiana, por exemplo uma célula de um organismo multicelular tal como um animal ou planta). Moléculas de sinal exemplares incluem, mas não são limitadas a, peptídeos de sinalização, moléculas de quorum sensing (por exemplo, peptídeos de quorum sensing), ligantes de receptor de transdução de sinal, fatores de crescimento, hormônios e citocinas. Em algumas modalidades, uma molécula de sinal compreende, consiste essencialmente em ou consiste em peptídeos de sinalização, moléculas de quorum sensing (por exemplo, peptídeos de quorum sensing), ligantes de receptor de transdução de sinal, fatores de crescimento, hormônios ou citocina. Em algumas modalidades, uma molécula de sinal compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma combinação de dois ou mais de peptídeos de sinalização, moléculas de quorum sensing (por exemplo, peptídeos de quorum sensing), ligantes de receptor de transdução de sinal, fatores de crescimento, hormônios e citocinas, que podem incluir combinações de dois ou mais do mesmo tipo de molécula (por exemplo uma combinação de dois peptídeos de sinalização ou uma combinação de dois ligantes de receptor), bem como combinações de duas classes diferentes de moléculas (por exemplo, uma combinação de uma citocina e um hormônio). Em algumas modalidades, a molécula de sinal é para diálogo entre micróbio-hospedeiro e como tal, a molécula de sinal é selecionada para alvejar uma ou mais células de um organismo hospedeiro, por exemplo uma planta ou animal. Em algumas modalidades, a molécula de sinal estimula, inibe, aumenta ou diminui a produção de bacteriocinas e/ou a taxa de crescimento de uma subpopulação de uma flora. Em algumas modalidades, a molécula de sinal compreende, consiste em ou consiste essencialmente em um peptídeo de quorum sensing ou uma variante deste como descrito aqui.
[061]Peptídeos de quorum sensing exemplares adequados para pró- polipeptídeos, métodos e/ou codificados por ácidos nucleicos de algumas modalidades incluem, mas não são limitados a, peptídeos de quorum sensing tais como os peptídeos mostrados na Tabela 5 abaixo, incluindo variantes destes peptídeos e combinações de dois ou mais de qualquer um destes peptídeos. Sem ser limitado pela teoria, é considerado que células microbianas, tais como bactérias gram- positivas usam peptídeos de quorum sensing para orquestrar a comunicação célula- a-célula. Uma revisão de peptídeos de quorum sensing pode ser encontrada em Rajput et al., PLoS One DOI:10.1371/journal.pone.0120066 17 de março de 2015, páginas 1 a 16, que é por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade. Os peptídeos de quorum sensing podem induzir a ativação de reguladores de resposta a jusante e/ou fatores de transcrição em uma célula microbiana alvo. É observado que em algumas modalidades, os reguladores de resposta a jusante ou fatores de transcrição podem ser configurados para ativar ou reprimir a transcrição de um ácido nucleico alvo de interesse. Consequentemente, em algumas modalidades, uma célula microbiana alvo é geneticamente engendrada para expressar ou reprimir a transcrição (e subsequente expressão) de um produto genético de interesse após a estimulação por um peptídeo de sinal de um pró-polipeptídeo.
[062]Em algumas modalidades, a molécula de sinal do pró-polipeptídeo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma molécula de sinal (por exemplo, uma molécula de quorum sensing tal como um peptídeo de quorum sensing), que estimula a transcrição de um ou mais polinucleotídeos de bacteriocina na célula microbiana alvo. A célula microbiana alvo pode ser geneticamente engendrada para colocar um ou mais polinucleotídeos de bacteriocina sob o controle de um fator de transcrição que responde à molécula de quorum sensing. Em algumas modalidades, a transcrição de um ou mais polinucleotídeos de bacteriocina é configurada para ser induzida por um fator de transcrição (por exemplo, um ativador transcricional) que responde à molécula de quorum sensing. Como tal, a sinalização pela molécula de sinal (por exemplo, molécula de quorum sensing) do pró-polipeptídeo pode estimular a produção de uma ou mais bacteriocinas adicionais pela célula microbiana alvo.
[063]Em algumas modalidades, a célula microbiana alvo é geneticamente modificada para colocar uma ou mais moléculas de um sistema de veneno-antídoto sob o controle de um fator de transcrição ou regulador de resposta que responde a uma molécula de sinal (por exemplo, uma molécula de quorum sensing tal como um peptídeo de quorum sensing) de modo a induzir uma resposta suicida na célula alvo após a sinalização pela molécula de sinal. Sistemas de veneno-antídoto, que são distintos de bacteriocinas, podem ser úteis para realizar uma tal resposta suicida, que, por sua vez, pode ser útil para a contenção e/ou crescimento seletivo de células microbianas. Sistemas de veneno-antídoto exemplares são descritos nas Pat. dos EUA Nos 5.910.438, 6.180.407, 7.176.029 e 7.183.097, cada uma das quais é por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um sistema de veneno-antídoto compreende um polipeptídeo citotóxico (veneno) e um polipeptídeo de antitoxina (antídoto) correspondente em uma única célula. Como usado aqui, um “polinucleotídeo de veneno” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação e pode se referir a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de veneno. Um “polinucleotídeo de antídoto” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação e pode se referir a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de antídoto. Como tal, em algumas modalidades, a célula microbiana alvo é configurada para induzir a transcrição de um polinucleotídeo de veneno em resposta a uma molécula de sinal tal como uma molécula de quorum sensing, de modo a induzir uma resposta suicida na célula microbiana alvo. Em algumas modalidades, a célula microbiana alvo é configurada para reprimir transcricionalmente um polinucleotídeo de anticorpo (enquanto continuando a expressar um polipeptídeo de veneno correspondente) em resposta a uma molécula de sinal tal como uma molécula de quorum sensing, de modo a induzir uma resposta suicida na célula microbiana alvo.
[064]Em algumas modalidades, os peptídeos de quorum sensing são de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o peptídeo de quorum sensing compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma variante de um peptídeo de quorum sensing que ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, o peptídeo de quorum sensing compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um peptídeo sintético. Informação sobre peptídeos de quorum sensing, incluindo sequências exemplares, pode ser encontrada na base de dados de quorumpeps, acessível na rede mundial em quorumpeps.ugent.be., que é por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade.
Tabela 5 SEQ ID NO: Nome Espécie (se peptídeo mostrado) phrANTH3 Bacillus anthracis - phrANTH1 Bacillus anthracis - phrANTH2 Bacillus anthracis - PapR5I Bacillus cereus - PapR5IV Bacillus cereus - PapR5II Bacillus cereus - PapR7III Bacillus cereus - PapR7IV Bacillus cereus - PapR7II Bacillus cereus - PapR5III Bacillus cereus - Bacillus cereus, Bacillus PapR7I - thuringiensis Phr0662 Bacillus halodurans - phr1988 Bacillus halodurans - ComX RO-B-2 Bacillus mojavensis - ComX RO-H-1 Bacillus mojavensis - ComX RO-C-2 Bacillus mojavensis - Phr-pPL10-1, PhrPUM Bacillus pumilus - PHRBST1 Bacillus stearothermophilus - PhrA Bacillus subtilis - ComX 168 Bacillus subtilis - Mersacidina Bacillus subtilis - PhrI Bacillus subtilis -
PhrG Bacillus subtilis - PhrK Bacillus subtilis - ComX RO-E-2 Bacillus subtilis - Subtilina Bacillus subtilis - ComX RS-B-1 Bacillus subtilis - Phr-pLS20 Bacillus subtilis - PhrF Bacillus subtilis - Phr-pTA1040 Bacillus subtilis - Phr-pPOD2000, Phr- Bacillus subtilis - pTA1060 PhrE Bacillus subtilis - BsEDF Bacillus subtilis - ComX natto Bacillus subtilis - Entianina Bacillus subtilis - Fator de Competência e Bacillus subtilis, Bacillus - Esporulação, CSF, PhrC mojavensis NprRB Bacillus thuringiensis - PisN Carnobacterium maltaromaticum - CbaX Carnobacterium maltaromaticum - Carnobacteriocina B2, Carnobacterium piscicola - CB2, CbnB2 Carnobacterium piscicola, CbnS, CS - Carnobacterium maltaromaticum AIP, peptídeo de Clostridium acetobutilicum - autoindução PHRCACET4 Clostridium acetobutilicum - PHRCACET1 Clostridium acetobutilicum - AgrD2, AIP, Peptídeo de Clostridium botulinum - autoindução AgrD2, AIP, Peptídeo de Clostridium botulinum - autoindução AgrD2, AIP, Peptídeo de Clostridium botulinum - autoindução AgrD2, AIP, Peptídeo de Clostridium botulinum - autoindução AgrD1, AIP, Peptídeo de Clostridium botulinum - autoindução AgrDCp Clostridium perfringens - WS9326A Clostridium perfringens - WS9326B Clostridium perfringens - Cochinmicina II/III Clostridium perfringens - AgrD2, AIP, Peptídeo de Clostridium sporogenes - autoindução AgrD1, AIP, Peptídeo de Clostridium sporogenes - autoindução
AgrD Clostridium thermocellum - QSP1 Cryptococcus neoformans - QSP24 Cryptococcus neoformans - QSP2 Cryptococcus neoformans - - Eikenella corodens - cAM373 Enterococcus faecalis - iCF10 Enterococcus faecalis - iPD1 Enterococcus faecalis - cPD1 Enterococcus faecalis - GBAP, Feromônio ativador de biossíntese de Enterococcus faecalis - gelatinase cAD1 Enterococcus faecalis - iAD1 Enterococcus faecalis - cCF10 Enterococcus faecalis - iAM373 Enterococcus faecalis - cOB1 Enterococcus faecalis - EntF Enterococcus faecium - EDF, Fator de morte Escherichia coli - extracelular LamD Lactobacillus plantarum - PltA Lactobacillus plantarum - Plantaricina A, PlnA Lactobacillus plantarum - IP-TX Lactobacillus sakei - IP-673 Lactobacillus sakei - Orf4 Lactobacillus sakei - Nisina A Lactococcus lactis - AIP Listeria monocytogenes - PaEDF-1 Pseudomonas aeruginosa - PaEDF-2 Pseudomonas aeruginosa - PaEDF-3 Pseudomonas aeruginosa - AIP, Peptídeo de Staphylococcus arlettae - autoindução AIP2, Peptídeo de Staphylococcus aureus - autoindução 2 AIP3, Peptídeo de Staphylococcus aureus - autoindução 3 AIP1, Peptídeo de Staphylococcus aureus - autoindução 1 AIP4, Peptídeo de Staphylococcus aureus - autoindução 4 AIP, Peptídeo de Staphylococcus auricularis - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus auricularis - autoindução
AIP, Peptídeo de Staphylococcus capitis - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus capitis - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus caprae - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus caprae - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus caprae - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus carnosus - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus cochnii subsp. - autoindução cochnii AIP, Peptídeo de Staphylococcus cochnii subsp. - autoindução ureialyticum AIP2, Peptídeo de Staphylococcus epidermidis - autoindução 2 AIP, Peptídeo de Staphylococcus epidermidis - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus epidermidis - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus epidermidis - autoindução Pep5 Staphylococcus epidermidis - AIP4, Peptídeo de Staphylococcus epidermidis - autoindução 4 AIP1, Peptídeo de Staphylococcus epidermidis - autoindução 1 AIP3, Peptídeo de Staphylococcus epidermidis - autoindução 3 AIP-II Staphylococcus epidermidis - AIP-III Staphylococcus epidermidis - AIP, Peptídeo de Staphylococcus gallinarum - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus lugdunensis - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus lugdunensis - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus simulans - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus simulans - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus simulans - autoindução AIP, Peptídeo de Staphylococcus warneri - autoindução
AIP, Peptídeo de Staphylococcus xylosus - autoindução Peptídeo Hidrofóbico Curto Streptococcus agalactiae - 3, SHP3 Peptídeo Estimulante de Streptococcus crista - Competência, CSP SilCR Streptococcus dysgalactiae - Peptídeo Estimulante de Streptococcus gordonii - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus gordonii - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus milleri - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus mitis - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus mitis - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus mitis - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus mitis - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus mitis - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus mitis - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus mitis, Streptococcus - Competência, CSP pneumoniae, Streptococcus oralis 18-CSP, Peptídeo Estimulante de Streptococcus mutans - Competência 21-CSP, Peptídeo Estimulante de Streptococcus mutans - Competência Peptídeo Hidrofóbico Streptococcus mutans - Curto, SHP1509 ComS Streptococcus mutans - Peptídeo Estimulante de Streptococcus oralis - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus oralis - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus pneumoniae - Competência, CSP Peptídeo Estimulante de Streptococcus pneumoniae - Competência, CSP Peptídeo Indutor de Streptococcus pneumoniae - Bacteriocina, BIP Peptídeo Indutor de Streptococcus pneumoniae -
Bacteriocina, BIP, BIP-2, BlpC Peptídeo Indutor de Streptococcus pneumoniae - Bacteriocina, BIP-1, BlpC Estreptina 1 Streptococcus pyogenes - XIP Streptococcus pyogenes - XIP Streptococcus pyogenes - SHP2-C10 Streptococcus pyogenes - SHP2-C9 Streptococcus pyogenes - SHP2-C7 Streptococcus pyogenes - SHP3-C10 Streptococcus pyogenes - SHP3-C9 Streptococcus pyogenes - SHP3-C7 Streptococcus pyogenes - Peptídeo Estimulante de Streptococcus pyogenes, - Competência, CSP Streptococcus pneumoniae Peptídeo Estimulante de Streptococcus sanguis - Competência, CSP STP Streptococcus thermophilus - SHP1358(15 - 23) Streptococcus thermophilus - ComS, SHP0316(18 - 24) Streptococcus thermophilus - Peptídeo Hidrofóbico Streptococcus thermophilus - Curto;SHP1299 Streptococcus thermophilus, Peptídeo Estimulante de Streptococcus constellatus, - Competência, CSP Streptococcus anginosus Siamicina I Streptomyces espécie - TM0504 Thermotoga maritima - Peptídeo de ligação a RAP Sintético (FHWWQTSPAHFS) 741 sintético, RBP Peptídeo de ligação a RAP Sintético (WPFAHWPWQYPR) 742 sintético, RBP Sintético (GDSVCASYF, ligação Ligante de AgrC sintético 743 de tiolacton entre C5 e F9) Sintético (SVCASYF, ligação de Ligante de AgrC sintético 744 tiolacton entre C3 e F7) Ligante de Cry1Aa sintético Sintético (SKADT) 745 Ligante de Cry1Aa sintético Sintético (SKPAD) 746 Sintético (benziloxicarbonil- Ligante de Fsr sintético QNSAAAFAAWA, ligação de 747 lacton entre S3 e A11) Sintético (benziloxicarbonil- Ligante de Fsr sintético QNSAAAFGQWA, ligação de 748 lacton entre S3 e A11) Sintético (YSTC(ácido alfa- AgrC1 sintético, AgrC2 aminobutírico)FIM, ligação de 749 tiolacton entre C4 e M7)
Sintético (N-4-(4- AgrC1 sintético, AgrC2 benzoilfenóxi)butiril-STCAFIM, 750 ligação de tiolacton entre C3 e M7)
[065]Citocinas são uma classe de moléculas de sinal que são tipicamente produzidas por células, tais como células do sistema imune e capazes de induzir uma resposta em outras células. Várias citocinas diferentes podem ser usadas em pró- polipeptídeos, métodos e/ou codificadas por ácidos nucleicos de algumas modalidades aqui. É considerado que um pró-polipeptídeo compreendendo uma bacteriocina e uma citocina de acordo com algumas modalidades pode ser útil para induzir a atividade antimicrobiana (pela(s) bacteriocina(s)) e uma resposta ao hospedeiro, por exemplo supressão de célula imune ou estimulação de célula imune (pela(s) citocina(s)). Em algumas modalidades, a citocina compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma citocina que ocorre naturalmente, variante de uma citocina que ocorre naturalmente ou sintética. Várias citocinas adequadas podem ser usadas em pró-polipeptídeos, métodos, composições, células ou codificadas por ácidos nucleicos de acordo com algumas modalidades aqui, incluindo, mas não limitados a IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TNF-β, TGF-β1, M-CSF, G-CSF e GM-CSF, variantes de qualquer um destes ou qualquer combinação de dois ou mais destes.
[066]Hormônios são uma classe de moléculas de sinal que são tipicamente produzidos por células de organismos multicelulares e sinalizam a outras células, frequentemente circulando através de diferentes tecidos e/ou órgãos de um organismo multicelular. Vários hormônios diferentes podem ser usados em pró-polipeptídeos, métodos e/ou ser codificados por ácidos nucleicos de algumas modalidades aqui. É considerado que um pró-polipeptídeo compreendendo uma bacteriocina e um hormônio de acordo com algumas modalidades pode ser útil para induzir a atividade antimicrobiana (pela(s) bacteriocina(s)), junto com uma resposta ao hospedeiro, por exemplo, crescimento ou proliferação celulares (pelo(s) hormônio(s)). Em algumas modalidades, a citocina compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um hormônio que ocorre naturalmente, variante de um hormônio que ocorre naturalmente ou hormônio sintético.
Hormônios exemplares adequados para pró-polipeptídeos,
métodos e/ou codificados por ácidos nucleicos de algumas modalidades incluem, mas não são limitados a, hormônios de proteína e peptídeo, por exemplo activina e inibina,
adiponectina, hormônios derivados de adipose, hormônio adrenocorticotrópico, gene agouti, peptídeo de sinalização agouti, alatostatina, amilina, família de amilina,
angiotensina, ANGPTL8, asprosina, peptídeo natriurético atrial, gastrina grande,
somatotropina bovina, bradicinina, fator neurotrófico derivado do cérebro, calcitonina,
fator neurotrófico ciliar, hormônio de liberação de corticotropina, família de neuro-
hormônio crustáceo, endotelina, enteroglucagon, eritroferrona, felutamida, FGF15,
FGF15/19, FGF19, FNDC5, hormônio folículo-estimulante, gastrina, peptídeo gastroinibitório, grelina, peptídeo-1 semelhante a glucagon, gonadotropina, inibidor de liberação de gonadotropina, hormônio liberador de gonadotropina, fator estimulante de colônia de granulócito, hormônio de crescimento, hormônio de liberação de hormônio de crescimento, hepcidina, gonadotropina coriônica humana, lactogênio placentário humano, incretina, insulina, análogo de insulina, insulina aspart, insulina degludec, insulina glargine, insulina lispro, fator de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento 1 semelhante à insulina, fator de crescimento 2 semelhante à insulina, leptina, limostatina, liraglutida, pouca gastrina I, hormônio luteinizante,
melanocortina, hormônio estimulante de melanócito, hormônio estimulante de alfa-
melanócito, hormônio estimulante de beta-melanócito, hormônio estimulante de gama-
melanócito, minigastrina, pró-hormônio N-terminal de peptídeo natriurético cerebral,
fator de crescimento de nervo, precursor VF de neuropeptídeo, neurotrofina-3,
neurotrofina-4, insulina NPH, obestatina, osteocalcina, hormônio da paratireoide,
hormônio de peptídeo, YY de peptídeo, atividade de renina plasmática, pramlintida,
pré-pró-hormônio, prolactina, relaxina, hormônios de peptídeo da família de relaxina,
renina, salcatonina, sauvagina, secretina, família de secretina, sincalida, estaniocalcina, teleost leptinas, temporina, hormônio estimulante da tireoide, hormônio de liberação de tirotropina, urocortina, urocortina II, urocortina III, peptídeo intestinal vasoativo, vitelogenina, variantes de qualquer um destes ou qualquer combinação de dois ou mais destes.
Etiquetas de afinidade
[067]Em pró-polipeptídeos, métodos e ácidos nucleicos que codificam pró- polipeptídeos de algumas modalidades aqui, um pró-polipeptídeo ou peptídeo de componente deste (por exemplo, uma bacteriocina ou molécula de sinal) compreendem uma etiqueta de afinidade. Opcionalmente, um ou mais sítios de clivagem podem ser posicionados entre a etiqueta de afinidade e o restante do pró- polipeptídeo para facilitar a remoção da etiqueta de afinidade depois da purificação por afinidade. Etiquetas de afinidade podem ser usadas na purificação, por exemplo por contato com uma molécula que se liga à etiqueta de afinidade imobilizada em uma fase sólida, tal como uma pérola. Etiquetas de afinidade exemplares adequadas para pró-polipeptídeos, métodos e de codificação por ácidos nucleicos de algumas modalidades aqui podem compreender, consistir essencialmente em ou consistir em etiquetas de His, etiquetas de glutationa-S-transferase (GST), etiquetas de FLAG, etiquetas de strep, proteína de ligação à maltose (MBP), proteína de ligação à quitina (CBP), etiquetas de myc, etiquetas de HA, etiquetas de NE e etiquetas de V5, variantes de qualquer uma destas ou qualquer combinação de duas ou mais destas.
Organismos microbianos
[068]Em algumas modalidades, microrganismos geneticamente engendrados são fornecidos. Como usado aqui, “organismo microbiano”, “microrganismo” geneticamente engendrados, e variações destes termos raízes (tais como pluralizações e semelhantes), têm seus significados usuais e habituais como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação.
Eles abrangem a modificação genética de qualquer espécie que ocorre naturalmente ou organismo unicelular procariótico ou eucariótico completamente sintético, bem como espécies de Archae. Assim, esta expressão pode se referir a células de espécies bacterianas, espécies fúngicas e algas.
[069]Microrganismos exemplares que podem ser usados de acordo com as modalidades aqui incluem, mas não são limitados a, bactérias, leveduras e algas, por exemplo microalgas fotossintéticas. Além disso, genomas de microrganismo completamente sintético podem ser sintetizados e transplantados em células microbianas únicas, para produzir microrganismos sintéticos capazes de auto- replicação contínua (consultar Gibson et al. (2010), “Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chamically Synthetized Genome”, Science 329: 52 - 56, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade). Como tal, em algumas modalidades, o microrganismo é completamente sintético. Uma combinação desejada de elementos genéticos, incluindo elementos que regulam a expressão gênica e elementos que codificam produtos genéticos (por exemplo, bacteriocinas, moduladores de imunidade, moléculas de veneno, antídoto e industrialmente úteis) pode ser montada em uma armação desejada em um microrganismo parcial ou completamente sintético. A descrição de organismos microbianos geneticamente engendrados para aplicações industriais também pode ser encontrada em Wright, et al. (2013) “Building-in biosafety for synthetic biology” Microbiology 159: 1221 - 1235.
[070]Uma variedade de espécies e cepas bacterianas pode ser usada de acordo com as modalidades aqui e variantes geneticamente modificadas ou bactérias sintéticas com base em uma “armação” de uma espécie conhecida podem ser fornecidas. Bactérias exemplares com características industrialmente aplicáveis, que podem ser usadas de acordo com as modalidades aqui incluem, mas não são limitadas a, espécies de Bacillus (por exemplo Bacillus coagulans, Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis), espécies de Paenibacillus, espécies de Streptomyces,
espécies de Micrococcus, espécies de Corynebacterium, espécies de Acetobacter, espécies de Cyanobacteria, espécies de Salmonella, espécies de Rhodococcus, espécies de Pseudomonas, espécies de Lactobacillus, espécies de Enterococcus, espécies de Alcaligenes, espécies de Klebsiella, espécies de Paenibacillus, espécies de Arthrobacter, espécies de Corynebacterium, espécies de Brevibacterium, Thermus aquaticus, Pseudomonas stutzeri, Clostridium thermocellus e Escherichia coli.
[071]Uma variedade de espécies e cepas de levedura pode ser usada de acordo com as modalidades aqui e variantes geneticamente modificadas ou levedura sintética com base em uma “armação” de uma espécie conhecida podem ser fornecidas. Leveduras exemplares com características industrialmente aplicáveis, que podem ser usadas de acordo com as modalidades aqui incluem, mas não são limitadas a espécies de Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces boulardii), espécies de Candida (por exemplo, Candida utilis, Candida krusei), espécies de Schizosaccharomyces (por exemplo Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicas), espécies de Pichia ou Hansenula (por exemplo, Pichia pastoris ou Hansenula polimorpha) e espécies de Brettanomyces (por exemplo, Brettanomyces claussenii).
[072]Uma variedade de espécies e cepas de algas pode ser usada de acordo com as modalidades aqui e variantes geneticamente modificadas ou algas sintéticas com base em uma “armação” de uma espécie conhecida podem ser criadas. Em algumas modalidades, as algas compreendem microalgas fotossintéticas. Espécies de algas exemplares que podem ser úteis para biocombustíveis e podem ser usadas de acordo com as modalidades aqui, incluem Botryococcus braunii, espécies de Chlorella, Dunaliella tertiolcta, espécies de Gracilaria, Pleurochrysis carterae e espécies de Sargassum. Adicionalmente, muitas algas podem ser úteis para produtos alimentícios, produtos fertilizantes, neutralização de resíduos, cura ambiental e fabricação de carboidrato (por exemplo, biocombustíveis).
Projeto de pró-polipeptídeos e ácidos nucleicos que codificam pró- polipeptídeos
[073]Pró-polipeptídeos compreendendo bacteriocinas selecionadas em razões desejadas de acordo com algumas modalidades aqui podem ser designadas usando uma variedade de abordagens. Por exemplo, uma opção é projetar uma sequência de codificação de ácido nucleico compreendendo as bacteriocinas, sítios de clivagem e outras características do pró-polipeptídeo tais como etiquetas de afinidade e/ou moléculas de sinal em uma estrutura de leitura aberta única. Um polinucleotídeo tendo esta sequência depois pode ser sequenciado. Adicionalmente, ferramentas computacionais estão disponíveis para facilitar o projeto de pró- polipeptídeos (e ácidos nucleicos que os codificam) de acordo com algumas modalidades. Por exemplo, como descrito em Nielsen et al., “Genetic circuit design automation” Science (2016) 352: aac7341 (por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade), um ambiente de projeto com base em computador, Cello, permite que um usuário escreva o código Verilog que é automaticamente transformado em uma sequência de DNA. Consequentemente, em algumas modalidades, a abordagem com base em texto pode ser facilmente usada para produzir um ácido nucleico que codifica os elementos desejados de um pró- polipeptídeo, tal como uma combinação e/ou razão particulares de bacteriocinas e sítios de clivagem separando as bacteriocinas e em uma maneira onde as bacteriocinas não são clivadas por uma enzima de clivagem que cliva os sítios de clivagem. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos selecionados em razões desejadas. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende peptídeos antimicrobianos selecionados em razões desejadas. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende bacteriocinas selecionadas em razões desejadas.
Modificação genética de organismos microbianos para a expressão de ácidos nucleicos
[074]Técnicas de modificar geneticamente microrganismos são bem conhecidas na técnica. Em métodos e composições de algumas modalidades, um microrganismo é geneticamente modificado para compreender a sequência de ácido nucleico que regula a expressão de e que codifica, bacteriocinas, por exemplo pró- polipeptídeos compreendendo bacteriocinas como descrito aqui. Em métodos e composições de algumas modalidades aqui, polinucleotídeos que codificam pró- polipeptídeos podem ser liberados a microrganismos e podem ser estavelmente integrados nos cromossomos destes microrganismos ou podem existir livres do genoma, por exemplo em um plasmídeo, arranjo extracromossômico, epissomo, minicromossomo ou semelhantes.
[075]Vetores exemplares para a modificação genética de células microbianas incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, vírus (incluindo bacteriófago) e elementos reversíveis. Adicionalmente, será avaliado que genomas microbianos inteiros compreendendo sequências desejadas podem ser sintetizados e montados em uma célula (consultar, para exemplo, Gibson et al. (2010), Science 329: 52 - 56).
Como tal, em algumas modalidades, um genoma microbiano (ou porção deste) é sintetizado com características desejadas tais como polinucleotídeo(s) de bacteriocina e introduzido em uma célula microbiana.
[076]Em algumas modalidades, um cassete para inserir um ou mais moduladores de imunidade de bacteriocina e/ou polinucleotídeo desejados em uma sequência de polinucleotídeo (por exemplo inserindo, em um vetor de expressão, um cassete que codifica um pró-polipeptídeo compreendendo bacteriocinas) é fornecido.
Cassetes exemplares incluem, mas não são limitados a, um cassete de Cre/lox ou cassete de FLP/FRT. Em algumas modalidades, o cassete é posicionado em um plasmídeo, de modo que um plasmídeo com o polinucleotídeo desejado que codifica o pró-polipeptídeo desejado possa ser facilmente introduzido à célula microbiana. Em algumas modalidades, o cassete é posicionado em uma posição desejada no genoma da célula microbiana.
[077]Em algumas modalidades, a conjugação do plasmídeo pode ser usada para introduzir um plasmídeo desejado de uma célula microbiana do “doador” a uma célula microbiana do receptor. Goñi-Moreno, et al. (2013) Multicellular Computing Using Conjugation for Wiring. PLoS ONE 8(6): e65986, por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a conjugação do plasmídeo pode modificar geneticamente uma célula microbiana do receptor introduzindo-se um plasmídeo de conjugação de uma célula microbiana do doador a uma célula microbiana do receptor. Sem ser limitado por qualquer teoria particular, plasmídeos de conjugação que compreendem o mesmo ou funcionalmente o mesmo conjunto de genes de replicação tipicamente não podem coexistir na mesma célula microbiana. Como tal, em algumas modalidades, a conjugação do plasmídeo “reprograma” uma célula microbiana do receptor introduzindo-se um novo plasmídeo de conjugação para suplantar um outro plasmídeo de conjugação que estava presente na célula do receptor. Em algumas modalidades, a conjugação do plasmídeo é usada para engendrar (ou reengendrar) uma célula microbiana com um ácido nucleico particular que codifica um pró-polipeptídeo ou combinação de ácidos nucleicos diferentes que codificam pró-polipeptídeo diferente. De acordo com algumas modalidades, uma variedade de plasmídeos de conjugação compreendendo ácidos nucleicos diferentes compreendendo uma variedade de pró-polipeptídeos diferentes é fornecida. Os plasmídeos podem compreender elementos genéticos adicionais como descrito aqui, por exemplo promotores, sítios traducionais de iniciação e semelhantes. Em algumas modalidades a variedade de plasmídeos de conjugação é fornecida em uma coleção de células do doador, de modo que uma célula do doador compreendendo o plasmídeo desejado possa ser selecionada para conjugação do plasmídeo. Em algumas modalidades, uma combinação e/ou razão particulares de bacteriocinas é selecionada e uma célula do doador apropriada (que codifica o pró- polipeptídeo particular) é conjugada com uma célula microbiana de interesse para introduzir um plasmídeo de conjugação compreendendo esta combinação em uma célula do receptor.
Pró-polipeptídeos
[078]Como usado aqui, “pró-polipeptídeo” tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo se refere a um polipeptídeo precursor compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em pelo menos dois peptídeos de componente em uma razão desejada (por exemplo, pelo menos uma bacteriocina e pelo menos uma molécula de sinal ou duas ou mais bacteriocinas e opcionalmente um ou mais outros peptídeos divulgados aqui (por exemplo, um peptídeo de sinalização, uma molécula de quorum sensing tal como um peptídeo de quorum sensing, um ligante de receptor de transdução de sinal, um fator de crescimento, um hormônio, uma citocina ou uma combinação de dois ou mais de qualquer um dos itens listados) e pelo menos um sítio de clivagem separando os peptídeos de componente do pró-polipeptídeo. Um pró-polipeptídeo exemplar de acordo com algumas modalidades é esquematicamente ilustrado na FIG 2. Os peptídeos de componente podem ser separados um do outro por sítios de clivagem de modo que, após a clivagem, os peptídeos de componente são separados um do outro e estão presentes em razões que são determinadas pelo número de cópias de cada peptídeo de componente no pró-polipeptídeo (Consultar a FIG 3). Em algumas modalidades, um ou mais peptídeos de componente do pró-polipeptídeo estão em uma forma inativa e se tornam ativos após a clivagem a partir de sequências de polipeptídeo adjacentes.
Sem ser limitado pela teoria, é considerado que em algumas modalidades, pelo menos algumas ou em algumas modalidades, todas as bacteriocinas são inativas quando elas são parte do pró-polipeptídeo de modo que, vantajosamente, o pró-polipeptídeo possa ser produzido e/ou modificado por células microbianas que não requerem imunidade àquelas bacteriocinas que são inativas. É expressamente considerado que os pró-polilpeptídeos descritos aqui podem ser usados em combinação com qualquer um dos métodos e kits como descrito aqui. Além disso, será avaliado que para qualquer pró-polipeptídeo descrito aqui, o polinucleotídeo ou polinucleotídeos (à medida que existam códons múltiplos possíveis) será facilmente avaliado com base no entendimento do técnico habilitado do código genético.
[079]A FIG 4A é um diagrama esquemático ilustrando um pró-polipeptídeo 100 de acordo com algumas modalidades aqui. O pró-polipeptídeo pode compreender bacteriocinas 110, 112, 114. As bacteriocinas podem ser as mesmas ou diferentes (por exemplo, todas as bacteriocinas podem ser as mesmas ou algumas bacteriocinas podem ser as mesmas enquanto outras são diferentes ou todas as bacteriocinas podem ser diferentes uma da outra). O pró-polipeptídeo pode incluir ainda um ou mais sítios de clivagem 120, 122, 124 e 126 dispostos entre as bacteriocinas e/ou outros polipeptídeos do pró-polipeptídeo. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende ainda uma etiqueta 130. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende ainda uma molécula de sinal 140 tal como descrito aqui, por exemplo uma molécula de quorum sensing tal como um peptídeo de quorum sensing. Em algumas modalidades, sítios de clivagem 120, 122, 124 e 126 são dispostos entre as bacteriocinas, etiqueta e molécula de sinal. Em algumas modalidades, a etiqueta é útil para purificar o pró-polipeptídeo. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem (por exemplo, 120, 122, 124 e 126) inclui dois ou mais sítios de consenso para uma enzima tal como uma endopeptidase. É considerado que em algumas modalidades, um sítio de clivagem contém duas ou mais sequências de clivagem de consenso (que podem ser as mesmas ou diferentes), pelo menos uma das quais está imediatamente a jusante do C-terminal de um peptídeo a montante e/ou pelo menos uma das quais está imediatamente a montante do N-terminal de um polipeptídeo a jusante, de modo que quaisquer vestígios do sítio de clivagem podem ser essencialmente eliminados ou inteiramente eliminados deste peptídeo. Em algumas modalidades, um “sítio de clivagem” inclui duas ou mais sequências de consenso, pelo menos uma das quais é configurada para estar imediatamente a montante ou a jusante de um peptídeo (por exemplo, uma bacteriocina) de modo a remover quaisquer vestígios deste sítio de clivagem do peptídeo após a clivagem. Em algumas modalidades, um “sítio de clivagem” inclui duas sequências de consenso, uma das quais é configurada para estar imediatamente a jusante de um peptídeo a montante (por exemplo, uma bacteriocina) e a outra das quais está imediatamente a montante de um peptídeo a jusante (por exemplo, uma bacteriocina) de modo a remover quaisquer vestígios deste sítio de clivagem da porção C-terminal do peptídeo a montante e da porção N-terminal do peptídeo a jusante após a clivagem de ambos os sítios de clivagem.
Opcionalmente, sítios de clivagem adicionais são posicionados entre estes dois sítios de clivagem.
[080]A FIG 4B é um diagrama esquemático ilustrando uma composição compreendendo bacteriocinas 101 fabricadas a partir do pró-polipeptídeo 100 de acordo com algumas modalidades aqui. A composição pode compreender bacteriocinas 110, 112, 114. As bacteriocinas podem ser as mesmas ou diferentes (por exemplo, todas as bacteriocinas podem ser as mesmas ou algumas bacteriocinas podem ser as mesmas enquanto outras são diferentes ou todas as bacteriocinas podem ser diferentes uma da outra). Opcionalmente, algumas das bacteriocinas 110, 112, 114, podem compreender ainda vestígios de sítios de clivagem, 121, 123, 125,
127. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma etiqueta 130 e/ou uma molécula de sinal 140 como descrito aqui. Algumas das bacteriocinas 110, 112, 114 e/ou a etiqueta 130 e/ou a molécula de sinal 140 podem compreender ainda vestígios de sítios de clivagem, 121, 123, 125, 127. Em algumas modalidades, a seguir da clivagem, uma bacteriocina compreende não mais do que 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, aminoácidos como um vestígio de um sítio de clivagem, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados. Em algumas modalidades, a bacteriocina não compreende nenhum vestígio dos sítios de clivagem. Em algumas modalidades, uma bacteriocina compreende um vestígio de um sítio de clivagem em seu N-terminal, em seu C-terminal ou em seus términos N e C. É considerado que em algumas modalidades, uma molécula de sinal e/ou etiqueta também compreende vestígios como descrito aqui. Em algumas modalidades, uma molécula de sinal e/ou etiqueta não compreende nenhum vestígio como descrito aqui.
[081]Em algumas modalidades, um pró-polipeptídeo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos uma bacteriocina, pelo menos uma molécula de sinal e um ou mais sítios de clivagem dispostos entre as bacteriocinas e moléculas de sinal, de modo que cada bacteriocina ou molécula de sinal possa ser separada do restante do pró-polipeptídeo por clivagem dos sítios de clivagem. Em algumas modalidades, a(s) bacteriocina(s) e molécula(s) de sinal estão em uma razão desejada.
[082]Em algumas modalidades, um pró-polipeptídeo compreende peptídeo de componente primário compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma bacteriocina, pelo menos um peptídeo de componente adicional (bacteriocina ou molécula de sinal) e sítios de clivagem dispostos entre os peptídeos de componente. O pró-polipeptídeo pode compreender ainda uma etiqueta de afinidade.
Em algumas modalidades, a etiqueta de afinidade é separada das bacteriocinas (e/ou outros peptídeos de componente) do pró-polipeptídeo por um sítio de clivagem, de modo que depois da purificação por afinidade do pró-polipeptídeo, a etiqueta de afinidade possa ser clivada de modo a removê-la dos pró-polipeptídeos. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos duas bacteriocinas e opcionalmente pelo menos uma molécula de sinal. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo isolado compreende três ou mais bacteriocinas, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 bacteriocinas, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo, 3 a 10, 3 a 20, 3 a 30, 3 a 50, 5 a 10, 5 a 20, 5 a 30, 5 a 50, 7 a 10, 7 a 20, 7 a 30, 7 a 50, 10 a 20, 10 a 30 ou 10 a 50 bacteriocinas. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende pelo menos cinco bacteriocinas.
[083]É considerado ainda que o pró-polipeptídeo pode incluir uma molécula de sinal, que pode facilitar a comunicação às células microbianas ou a um organismo hospedeiro. Consequentemente, em pró-polipeptídeos, métodos e ácidos nucleicos de algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende ainda uma molécula de sinal. A molécula de sinal pode ser separada de outros peptídeos de componente do pró-polipeptídeo por um sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a molécula de sinal compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma molécula de quorum sensing (por exemplo, um peptídeo de quorum sensing), uma citocina ou um hormônio como descrito aqui. Em algumas modalidades, uma célula alvo é configurada para produzir produtos genéticos adicionais, por exemplo bacteriocinas, em resposta à molécula de quorum sensing. A célula alvo pode ser geneticamente engendrada de modo que um ou mais polinucleotídeos de bacteriocina estejam sob o controle de um fator de transcrição que responde à molécula de quorum sensing, de modo que, após a sinalização pela molécula de quorum sensing, os polinucleotídeos de bacteriocina sejam transcritos e a célula alvo produza bacteriocinas adicionais.
[084]Em algumas modalidades, um ou mais sítios de clivagem são dispostos em estrutura entre quaisquer dois peptídeos de componente adjacentes (por exemplo, bacteriocinas, moléculas de sinal) do pró-polipeptídeo. Em algumas modalidades, um ou mais sítios de clivagem são dispostos em estrutura entre quaisquer duas bacteriocinas adjacentes do pró-polipeptídeo. É observado que em pró-polipeptídeos,
métodos e ácidos nucleicos de algumas modalidades, peptídeos de componente (por exemplo, bacteriocinas e/ou moléculas de sinal) ou etiquetas de afinidade posicionadas no término N ou C ou próximas do mesmo de um pró-polipeptídeo podem ser posicionados próximos de um sítio de clivagem para separá-los do restante do pró-polipeptídeo, mas eles são não flanqueados por sítios de clivagem em ambos os lados. Por exemplo, para uma bacteriocina no término N de uma bacteriocina, pode haver um sítio de clivagem na região C-terminal da bacteriocina, mas nenhum sítio de clivagem no lado N-terminal da bacteriocina. Em algumas modalidades, por exemplo, se um peptídeo de componente ou etiqueta de afinidade estiver próximo ao término N ou C do pró-polipeptídeo, mas existir sequência N- ou C-terminal adicional além do peptídeo de componente ou etiqueta de afinidade, o peptídeo de componente pode compreender sítios de clivagem em ambos os lados de modo a facilitar a remoção da sequência N- ou C-terminal adicional. Em algumas modalidades, algumas sequências N- ou C-terminais adicionais podem permanecer no polipeptídeo de componente.
[085]É observado que em algumas modalidades, os sítios de clivagem podem compreender sequências alvejadas por uma enzima de clivagem. De modo a minimizar ou evitar a clivagem das bacteriocinas ou outros peptídeos de componente (por exemplo, moléculas de sinal) do pró-polipeptídeo, é considerado que em algumas modalidades, os peptídeos de componente por si só não contêm sítios de clivagem para a(s) enzima(s) de clivagem que alvejam sítios de clivagem entre os peptídeos de componente. Como tal, em algumas modalidades, as bacteriocinas não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem ou enzimas que alvejam os sítios de clivagem entre as bacteriocinas. Em algumas modalidades, duas ou mais enzimas de clivagem são usadas para alvejar todos os sítios de clivagem entre os peptídeos de componente do pró-polipeptídeo, mas as bacteriocinas não contêm sítios de clivagem alvejados por qualquer uma destas enzimas de clivagem. Em algumas modalidades, pelo menos um sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem primária e um outro sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem secundária diferente da enzima de clivagem primária e as bacteriocinas não compreendem um sítio de clivagem para nenhuma das enzimas de clivagem primárias ou secundárias
[086]Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de sinal não compreendem os sítios de clivagem para a enzima de clivagem ou enzimas que alvejam os sítios de clivagem entre as bacteriocinas e moléculas de sinal. É observado que como em algumas modalidades, a clivagem é realizada depois da purificação por afinidade do pró-polipeptídeo. Consequentemente, pode ser aceitável que uma etiqueta de afinidade por si só compreenda um ou mais sítios de clivagem, visto que a etiqueta de afinidade pode ser dispensável no momento em que a clivagem é realizada.
[087]Em algumas modalidades, os sítios de clivagem que separam os peptídeos de componente do pró-polipeptídeo são todos alvejados pela mesma enzima de clivagem de modo que uma única enzima possa ser usada para clivar o pró-polipeptídeo em bacteriocinas separadas (e opcionalmente, outros peptídeos) nas razões desejadas. Em algumas modalidades, os sítios de clivagem que separam os peptídeos de componente do pró-polipeptídeo são coletivamente alvejados por uma combinação de enzima de clivagem de modo que o número de enzimas de clivagem seja menor do que o número de sítios de clivagem no pró-polipeptídeo. Em algumas modalidades, os sítios de clivagem que separam os peptídeos de componente do pró- polipeptídeo são coletivamente alvejados por uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez enzimas de clivagem. Em algumas modalidades, os sítios de clivagem compreendem um ligador sensível a produto químico ou ao pH. Como tal, em algumas destas modalidades, os sítios de clivagem que separam os peptídeos de componente do pró-polipeptídeo são coletivamente clivados pelas mesmas condições químicas e/ou mesmas condições de pH.
[088]Em algumas modalidades, as bacteriocinas por si só compreendem etiquetas, por exemplo etiquetas de afinidade, sequências de sinal (para secreção,
internalização, localização nuclear, etc.) ou etiquetas de estabilidade. Opcionalmente, as etiquetas podem ser cliváveis a partir dos pró-polipeptídeos. Como tal, a bacteriocina pode compreender um sítio de clivagem entre ela mesma e a etiqueta.
Pode ser útil que a etiqueta permaneça afixada à bacteriocina depois que os peptídeos de componente são clivados do pró-polipeptídeo. Como tal, em algumas modalidades, o sítio de clivagem entre a bacteriocina e a etiqueta pode ser alvejado por enzimas de clivagem diferentes (e/ou clivado sob condições químicas ou de pH diferentes) do que os sítios de clivagem que separam os peptídeos de componente um do outro.
[089]Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende ainda uma modificação pós-traducional ou co-traducional, por exemplo, glicosilação, acetilação, metilação, PEGYlação, SUMOilação, ubiquitinação ou duas ou mais de qualquer uma destas.
[090]Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende uma quantidade de dois ou mais peptídeos de componente diferentes (por exemplo, bacteriocinas e/ou moléculas de sinal) em uma razão desejada ou porção de uma razão desejada. Por exemplo, a razão de uma bacteriocina primária para uma bacteriocina secundária (diferente) ou para uma molécula de sinal pode ser cerca de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 2:3, 2:5, 2:7, 2:9, 3:4, 3:5, 3:7, 3:8, 3:10, 4:5, 4:7, 4:9, 5:6, 5:7, 5:8, 5:9, 6:7, 7:8, 7:9, 7:10, 8:9 ou 9:10. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo compreende uma quantidade de duas ou mais bacteriocinas diferentes em uma razão desejada ou porção de uma razão desejada. Em algumas modalidades, a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados. Em algumas modalidades, a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma raiz de planta e/ou solo. Em algumas modalidades, as bacteriocinas e/ou moléculas de sinal estão presentes em uma porção de uma razão desejada e a razão desejada pode ser obtida adicionando-se uma bacteriocina e/ou molécula de sinal adicional em uma razão adequada (por exemplo, se os produtos de dois pró-polipeptídeos diferente são combinados, juntos, eles podem produzir a razão desejada de polipeptídeos de componente tais como bacteriocinas e/ou moléculas de sinal).
[091]Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo tem um comprimento de não mais do que 20.000 aminoácidos, por exemplo, não mais do que 20.000, 15.000,
10.000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ou 100 aminoácidos, incluindo entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo 100 a 20.000; 100 a 10.000; 100 a 5000; 100 a 2000; 100 a 1000; 500 a 20.000; 500 a 10.000; 500 a 5000; 500 a 2000; 500 a 1000; 1000 a 20.000; 1000 a 10.000; 1000 a 5000; ou 1000 a 2000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo tem um comprimento de não mais do que 5000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo tem um comprimento de não mais do que 2000 aminoácidos.
Ácidos nucleicos
[092]Métodos, kits, células microbianas e/ou ácidos nucleicos de algumas modalidades aqui incluem um ácido nucleico que codifica um pró-polipeptídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma bacteriocina e uma molécula de sinal em uma estrutura de leitura única e codifica uma sequência de codificação de sítio de clivagem disposta entre as sequências de codificação de bacteriocina e molécula de sinal. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende duas sequências de codificação de bacteriocina em uma estrutura de leitura única. O ácido nucleico isolado pode compreender ainda sequências de codificação de sítio de clivagem dispostas entre as sequências de codificação de bacteriocina e na estrutura de leitura única. Em métodos, ácidos nucleicos, células microbianas e/ou kits de algumas modalidades aqui, um ácido nucleico codifica qualquer pró-polipeptídeo descrito aqui. Em algumas modalidades, um kit compreende um ácido nucleico compondo um ou mais pró-polipeptídeos como descrito aqui. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda uma célula microbiana capaz de expressar o pró-polipeptídeo.
[093]Como observado aqui, para ácidos nucleicos de algumas modalidades, pode ser vantajoso que as bacteriocinas (ou outros polipeptídeos) codificadas pelos ácidos nucleicos permaneçam intactas depois da clivagem. Como tal, em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica sítios de clivagem para uma enzima de clivagem e suas sequências de codificação de bacteriocina e/ou molécula de sinal codificam bacteriocinas e/ou moléculas de sinal (respectivamente) que não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem. Em algumas modalidades, as sequências de codificação de sítio de clivagem do ácido nucleico codificam sítios de clivagem para uma enzima de clivagem e as sequências de codificação de bacteriocina codificam bacteriocinas que não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem.
[094]Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende três ou mais sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única, por exemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 sequências de codificação de bacteriocina, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo, 3 a 10, 3 a 20, 3 a 30, 3 a 50, 5 a 10, 5 a 20, 5 a 30, 5 a 50, 7 a 10, 7 a 20, 7 a 30, 7 a 50, 10 a 20, 10 a 30 ou 10 a 50 sequências de codificação de bacteriocina. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende pelo menos três sequências de bacteriocina na estrutura de leitura única. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende pelo menos cinco sequências de bacteriocina na estrutura de leitura única. Em algumas modalidades, pelo menos duas das sequências de codificação de bacteriocina codificam bacteriocinas diferentes entre si.
[095]Em algumas modalidades, uma ou mais sequências de codificação de sítio de clivagem são dispostas em estrutura entre quaisquer duas sequências de codificação de bacteriocina adjacentes do ácido nucleico isolado. Como observado aqui, pode ser vantajoso que uma única enzima de clivagem seja capaz de separar vários ou todos os peptídeos de componente de um pró-polipeptídeo.
Consequentemente, em algumas modalidades, cada uma das sequências de codificação de bacteriocina (e, se presente(s), molécula(s) de sequência de sinal de codificação) é separada uma da outra por sequências de codificação de sítio de clivagem em estrutura para a mesma enzima. Como tal, após a tradução do ácido nucleico, o pró-polipeptídeo resultante pode ser clivado em seus peptídeos de componente por uma única enzima.
[096]Em algumas modalidades, uma sequência de codificação de sítio de clivagem codifica um sítio de clivagem para uma enzima de clivagem primária e uma outra sequência de codificação de sítio de clivagem codifica um outro sítio de clivagem para uma enzima de clivagem diferente. Em alguma modalidade, as bacteriocinas codificadas pelas sequências de codificação de bacteriocina não compreendem um sítio de clivagem para nenhuma das enzimas de clivagem primárias ou secundárias. Em alguma modalidade, nenhuma bacteriocina codificada pelos ácidos nucleicos isolados compreende um sítio de clivagem para qualquer uma das enzimas de clivagem que clivam os sítios de clivagem interspersos.
[097]Em algumas modalidades, todas as sequências de codificação de bacteriocina (e, se presente(s), molécula(s) de sequência de sinal de codificação) são separadas uma da outra por sequências de codificação de sítio de clivagem em estrutura, que são clivadas coletivamente por uma combinação de duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez enzimas de clivagem. Como tal, após a tradução do ácido nucleico, esta combinação de enzimas de clivagem pode ser usada para clivar o pró-polipeptídeo em seus peptídeos de componente.
[098]Em algumas modalidades, a sequência de codificação de sítio de clivagem codifica um sítio de clivagem para uma enzima de clivagem como descrito aqui, por exemplo na Tabela 4. Em algumas modalidades a sequência de codificação de sítio de clivagem codifica um sítio de clivagem que é quimicamente sensível e/ou sensível ao pH como descrito aqui.
[099]Em algumas modalidades, as sequências de codificação de peptídeo de componente (por exemplo, bacteriocina e/ou molécula de sinal) do ácido nucleico isolado estão presentes em uma razão desejada ou porção de uma razão desejada.
Em algumas modalidades, três ou mais sequências de bacteriocina estão presentes em uma razão desejada ou porção de uma razão desejada. Em algumas modalidades, a razão desejada é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados. Em algumas modalidades, a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano ou uma raiz de planta e/ou solo.
[0100]Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende ainda uma sequência de codificação para uma molécula de sinal na estrutura de leitura única. Uma sequência de codificação de sítio de clivagem pode ser disposta entre a sequência de codificação para a molécula de sinal e uma sequência ou sequências de codificação de bacteriocina adjacentes. Em algumas modalidades, a molécula de sinal compreende uma molécula de quorum sensing, um ligante de receptor de transdução de sinal, um fator de crescimento, um hormônio ou uma citocina. Em algumas modalidades, a molécula de sinal pode ser do tipo selvagem, mutante ou sintética.
Células microbianas para fabricar bacteriocinas
[0101]Métodos, kits e células microbianas de algumas modalidades compreendem uma célula microbiana compreendendo um ácido nucleico isolado como descrito aqui. Tais células microbianas podem ser úteis para produzir pró- polipeptídeos compreendendo bacteriocinas em razões desejadas como descrito aqui. A célula microbiana pode compreender um promotor como descrito aqui. O promotor pode ser operavelmente ligado ao ácido nucleico isolado. Assim, a célula microbiana pode ser configurada para transcrever o ácido nucleico isolado e traduzi- lo em um pró-polipeptídeo compreendendo bacteriocinas. Como observado aqui, as bacteriocinas do pró-polipeptídeo podem ser inativas embora elas sejam parte do pró- polipeptídeo. Consequentemente em algumas modalidades, a célula microbiana isolada não produz um modulador de imunidade funcional para uma bacteriocina codificada pelo ácido nucleico isolado. Por exemplo, a célula microbiana pode carecer de uma sequência de codificação para o modulador de imunidade ou se ela não compreender sequência de codificação para o modulador de imunidade, a sequência de codificação pode ser transcricionalmente silenciosa (por exemplo, devido à carência de um promotor) e/ou a sequência de codificação pode ser mutada de modo que qualquer modulador de imunidade produzido pela sequência de codificação não seja funcional. Em algumas modalidades, o promotor operacionalmente ligado ao ácido nucleico compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer um dos promotores das Tabelas 3.1 a 3.11. Métodos de fabricar bacteriocinas
[0102]Algumas modalidades incluem métodos de fabricar bacteriocinas. Os métodos podem ser úteis para fabricar composições compreendendo bacteriocinas (e opcionalmente, outras moléculas tais como moléculas de sinal) em uma razão desejada. Em algumas modalidades, um método de fabricar bacteriocinas compreende expressar um ácido nucleico. O ácido nucleico pode compreender duas sequências de codificação de bacteriocina em uma estrutura de leitura única ou uma bacteriocina e uma sequência de codificação de molécula de sinal em uma estrutura de leitura única (consultar, para exemplo, FIG. 8). O ácido nucleico pode compreender ainda sequências de codificação de sítio de clivagem dispostas entre as sequências de codificação de bacteriocina (ou entre as sequências de codificação de bacteriocina e molécula de sinal) e na estrutura de leitura única. O ácido nucleico pode ser expressado para gerar um pró-polipeptídeo compreendendo as bacteriocinas e sítios de clivagem dispostos entre as mesmas. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos que codificam bacteriocinas (e/ou moléculas de sinal) como descrito aqui são expressados por um sistema de expressão de gene de modo a produzir pró- polipeptídeos como descrito aqui.
[0103]Em algumas modalidades, por exemplo, quando da produção de bacteriocinas para um ambiente semicontrolado como na produção biofarmacêutica, o pró-polipeptídeo compreende uma sequência de codificação de bacteriocina, uma sequência de codificação de molécula de sinal e um sítio de clivagem dispostos entre as sequências de codificação de bacteriocina e molécula de sinal. É considerado que um tal pró-polipeptídeo pode ser usado para produzir uma composição compreendendo a bacteriocina e molécula de sinal em uma razão desejada, que pode ser útil para inibir organismos microbianos geneticamente flutuantes (por intermédio da bacteriocina; por exemplo se a imunidade dos organismos alvos for restrita à sua manutenção de um certo estado genético; esta abordagem é descrita em detalhe adicional na Pat. dos EUA No 9.333.227). Adicionalmente, a molécula de sinal pode promover o crescimento, proliferação ou produção de um produto desejado por células produtoras no ambiente (por exemplo, células microbianas geneticamente engendradas ou cultura de célula mamífera tais como células CHO ou BHK).
[0104]Em algumas modalidades, o método compreende ainda clivar o sítio de clivagem, separando assim as bacteriocinas (e/ou moléculas de sinal) uma da outra.
Após a separação das bacteriocinas (e/ou moléculas de sinal), uma composição compreendendo bacteriocinas (ou combinação de bacteriocinas e moléculas de sinal) é assim produzida. Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são clivados por uma enzima de clivagem ou combinação de enzimas de clivagem como descrito aqui, por exemplo, na Tabela 4. Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são clivados expondo-se um peptídeo compreendendo um ligador sensível ao pH ou quimicamente sensível às condições de pH ou químicas que induzem a clivagem. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo é armazenado por período de tempo antes da clivagem, por exemplo, de pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses ou 3 três meses, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados.
[0105]Em algumas modalidades, bacteriocinas são inativas quando elas são parte de um pró-polipeptídeo. Consequentemente, em algumas modalidades, a célula microbiana não produz um modulador de imunidade funcional por pelo menos uma das bacteriocinas, por exemplo, a célula microbiana pode carecer de uma sequência de codificação para o modulador de imunidade ou se ela compreender a sequência de codificação para o modulador de imunidade, a sequência de codificação pode ser transcricionalmente silenciosa (por exemplo, devido à carência de um promotor) e/ou a sequência de codificação pode ser mutada de modo que qualquer modulador de imunidade produzido pela sequência de codificação não seja funcional. Em algumas modalidades, a célula microbiana compreende E. coli ou B. subtilis.
[0106]Em algumas modalidades, pelo menos uma das bacteriocinas é inativa quando ela for parte do pró-polipeptídeo.
[0107]Em algumas modalidades, o ácido nucleico é expressado in vitro.
Sistemas de expressão isentos de célula podem ser usados para transcrever e/ou traduzir ácidos nucleicos in vitro. Em algumas modalidades, o sistema de expressão in vitro compreende, consiste em ou consiste essencialmente em extratos celulares.
Em algumas modalidades, o sistema de expressão in vitro compreende uma RNA polimerase, ribossomos, tRNAs (e os aminoácidos correspondentes), uma fonte de energia e cofatores enzimáticos. O sistema de expressão in vitro pode compreender ainda enzimas para modificação co- ou pós-traducional e/ou componentes celulares que medeiam o enovelamento de proteína tais como proteínas de choque térmico.
[0108]Em algumas modalidades, o método compreende ainda isolar o pró- polipeptídeo antes da clivagem. O pró-polipeptídeo pode ser isolado da célula microbiana ou do sistema de expressão in vitro como descrito aqui. Em algumas modalidades, o isolamento compreende purificar o pró-polipeptídeo. Em algumas modalidades, o isolamento compreende purificar por afinidade o pró-polipeptídeo. A purificação por afinidade pode ser realizada usando uma etiqueta de afinidade como descrito aqui. O ácido nucleico pode codificar uma etiqueta de afinidade no pró- polipeptídeo. A etiqueta de afinidade pode ser ligada por um agente de ligação adequado específico para a etiqueta de afinidade (por exemplo, um anticorpo anti- myc para uma etiqueta de myc ou pérolas revestidas com GSH para o GST ou níquel ou cobalto para uma etiqueta de His). O agente de ligação pode ser imobilizado em uma fase sólida, de modo que, após a ligação da etiqueta de afinidade, o pró- polipeptídeo será imobilizado na fase sólida. A fase sólida pode ser removida da célula microbiana e/ou sistema de expressão in vitro. Opcionalmente, a fase sólida pode ser lavada. O pró-polipeptídeo etiquetado por afinidade depois pode ser liberado da fase sólida. Por exemplo, o pró-polipeptídeo pode ser isolado por imunoprecipitação, cromatografia de afinidade e semelhantes.
[0109]Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende pelo menos três sequências de codificação de bacteriocina em uma estrutura de leitura única, por exemplo pelo menos cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 bacteriocinas, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo, cerca de 3 a 10, 3 a 20, 3 a 30, 3 a 50, 5 a 10, 5 a 20, 5 a 30, 5 a 50, 7 a 10, 7 a 20, 7 a 30, 7 a 50, 10 a 20, 10 a 30 ou 10 a 50 bacteriocinas. Como tal, o ácido nucleico pode produzir um pró-polipeptídeo compreendendo o número indicado de bacteriocinas.
[0110]Em algumas modalidades, pelo menos duas das bacteriocinas são diferentes uma da outra. Em algumas modalidades, duas ou mais das bacteriocinas são as mesmas. Em algumas modalidades, pelo menos duas das bacteriocinas são diferentes uma da outra e pelo menos duas das bacteriocinas são as mesmas.
[0111]Após a clivagem do pró-polipeptídeo, uma composição compreendendo bacteriocinas pode ser produzida. Em algumas modalidades, a composição compreende uma razão desejada de bacteriocinas. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da razão desejada é obtida por uma razão de sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única do ácido nucleico. Sem ser limitado pela teoria, é considerado que em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica quantidades relativas desejadas de duas ou mais sequências de codificação de bacteriocinas diferentes em cis, o pró-polipeptídeo correspondente também terá estas razões de bacteriocinas. Por exemplo, se o ácido nucleico compreender duas sequências de codificação para “bacteriocina A”, e três sequências de codificação de “bacteriocina B”, cada uma separada por sítios de clivagem, o pró-polipeptídeo resultante compreenderá uma razão de bacteriocina A para bacteriocina B de 2:3.
Após a clivagem, a solução compreenderá as bacteriocinas nestas razões. É observado que em algumas modalidades, proteínas ou polipeptídeos adicionais codificados pelo ácido nucleico também são produzidos em razões desejadas, por exemplo, moléculas de sinal. Como tal, uma solução pode ser produzida compreendendo bacteriocinas e moléculas de sinal em uma razão ou faixa de razões predeterminada. Em algumas modalidades, a razão predeterminada é obtida por uma razão de sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única do ácido nucleico.
[0112]Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica bacteriocinas (e opcionalmente peptídeos adicionais tais como moléculas de sinal) em uma porção de uma razão desejada. Componentes adicionais podem ser adicionados para obter a razão final desejada. Por exemplo, um pró-polipeptídeo secundário, diferente pode compreender bacteriocinas e/ou moléculas de sinal em uma razão secundária. Os dois polipeptídeos diferentes podem, juntos, fornecer a razão final desejada de bacteriocinas (e opcionalmente outros peptídeos, tais como moléculas de sinal) de interesse. Como tal, em algumas modalidades, a razão desejada é obtida ainda por um ácido nucleico secundário compreendendo uma razão de sequências de codificação de bacteriocina e compreendendo ainda sítios de clivagem entre as sequências de codificação de bacteriocina.
[0113]Uma razão desejada pode ser selecionada para várias aplicações. Em algumas modalidades, uma razão desejada de bacteriocinas é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados. Por exemplo, se um ambiente tal como um meio de cultura, matéria-prima, fermentador, biorreator ou microbioma contém ou está em risco de conter uma população de organismos microbianos indesejados, uma razão de bacteriocinas pode ser selecionada para alvejar aqueles organismos microbianos indesejados. Em algumas modalidades, a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal (por exemplo um cavalo, vaca, ovelha, porco, asno, cão, gato ou primata não humano), um órgão humano (por exemplo, pele ou um intestino) ou uma raiz de planta e/ou microbioma do solo ou para preservar um produto tal como um produto alimentício (animal humano ou não humano), produto farmacêutico ou cosmético. Em algumas modalidades, a razão desejada compreende uma razão entre duas bacteriocinas em um pró-polipeptídeo (por exemplo, uma primeira para segunda bacteriocina, primeira para terceira, segunda para terceira ou terceira para quarta ou quarta para quinta) de cerca de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 2:3, 2:5, 2:7, 2:9, 3:4, 3:5, 3:7, 3:8, 3:10, 4:5, 4:7, 4:9, 5:6, 5:7, 5:8, 5:9, 6:7, 7:8, 7:9, 7:10, 8:9 ou 9:10, em que a primeira
(ou segunda ou terceira ou quarta) bacteriocina é diferente da segunda (ou terceira ou quarta ou quinta) bacteriocina. É observado que diferentes pares de bacteriocinas no pró-polipeptídeo podem ter razões diferentes entre si. Portanto, é considerado que as razões de três ou mais bacteriocinas entre si podem ser determinadas pelas razões individuais (por pares) das bacteriocinas entre si. Por exemplo, uma primeira e segunda bacteriocina pode ter uma razão de 1:2 e uma segunda e terceira bacteriocina pode ter uma razão de 2:5, de modo que a razão da primeira para a segunda para a terceira bacteriocina é 1:2:5, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão desejada compreende uma razão de uma bacteriocina primária para uma bacteriocina secundária para uma bacteriocina terciária de cerca de 1:1:2, 1:2:2, 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 2:2:3 ou 2:3:3.
[0114]Como observado aqui, pode ser vantajoso que as bacteriocinas permaneçam intactas a seguir da clivagem do pró-polipeptídeo. Como tal, em algumas modalidades, as bacteriocinas do pró-polipeptídeo não contêm nenhum dos sítios de clivagem que separam as bacteriocinas (ou outros polipeptídeos opcionais tais como moléculas de sinal). Após a clivagem dos sítios de clivagem, as bacteriocinas podem permanecer intactas. Em algumas modalidades, os sítios de clivagem são para uma única enzima de clivagem e a enzima de clivagem não cliva dentro das bacteriocinas. Em algumas modalidades, pelo menos um sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem primária e um outro sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem secundária e nem a enzima de clivagem primária nem a secundária cliva dentro das bacteriocinas.
[0115]Em algumas modalidades, a composição produzida pelo método compreende uma molécula de sinal como descrito aqui. O ácido nucleico pode codificar a molécula de sinal na mesma estrutura de leitura como o(s) outro(s) componente(s) do pró-polipeptídeo (por exemplo, as bacteriocinas). Uma sequência de sítio de clivagem disposta entre a molécula de sinal e a sequência ou sequências de codificação de bacteriocina. Como tal, após a clivagem dos sítios de clivagem, a molécula de sinal pode ser separada da bacteriocina. Em algumas modalidades, a molécula de sinal compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma molécula de quorum sensing, ligante de receptor de transdução de sinal, fator de crescimento, hormônios ou citocina ou uma combinação de dois ou mais destes. Em algumas modalidades, a molécula de sinal é do tipo selvagem, mutante ou sintética.
[0116]Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo tem um comprimento de não mais do que 20.000 aminoácidos, por exemplo, não mais do que 20.000, 15.000,
10.000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ou 100 aminoácidos, incluindo entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo 100 a 20.000; 100 a 10.000; 100 a 5000; 100 a 2000; 100 a 1000; 500 a 20.000; 500 a 10.000; 500 a 5000; 500 a 2000; 500 a 1000; 1000 a 20.000; 1000 a 10.000; 1000 a 5000; ou 1000 a 2000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo tem um comprimento de não mais do que 5000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o pró-polipeptídeo tem um comprimento de não mais do que 2000 aminoácidos.
[0117]Como observado aqui, as razões das bacteriocinas (e outros polipeptídeos tais como moléculas de sinal) podem ser ajustadas ainda usando-se dois ou mais pró-polipeptídeos diferentes para obter razões particulares e/ou combinações de moléculas (por exemplo, bacteriocinas, moléculas de sinal). Em algumas modalidades, o método compreende expressar um ácido nucleico secundário que codifica um pró-polipeptídeo secundário compreendendo duas bacteriocinas e sítios de clivagem dispostos entre as bacteriocinas. O pró-polipeptídeo secundário pode ser diferente do pró-polipeptídeo primário, de modo que a clivagem do pró- polipeptídeo secundário produza uma razão diferente de bacteriocinas e/ou moléculas de sinal do que o pró-polipeptídeo primário uma vez que ele foi clivado.
[0118]Em algumas modalidades, o método compreende ainda modificar quimicamente as bacteriocinas. Modificações químicas exemplares incluem, mas não são limitadas a glicosilação, acetilação, metilação, PEGIlação, SUMOilação, ubiquitinação ou duas ou mais de qualquer uma destas. Em algumas modalidades, as bacteriocinas são quimicamente modificadas co-traducionalmente. Em algumas modalidades, as bacteriocinas são quimicamente modificadas pós-traducionalmente.
Por exemplo, a célula microbiana pode compreender ou pode ser geneticamente engendrada para compreender enzimas para a modificação co-traducional ou modificação pós-traducional. Por exemplo, o sistema de expressão in vitro pode compreender enzimas para modificação co-traducional ou pós-traducional. Por exemplo, o sistema de expressão in vitro pode compreender enzimas para modificação pós-traducional, e/ou, a seguir do isolamento do pró-polipeptídeo do sistema de expressão (célula in vitro ou microbiana), o pró-polipeptídeo pode ser contatado com enzimas que produzem a modificação pós-traducional desejada. Em algumas modalidades, bacteriocinas são quimicamente modificadas depois que o pró- polipeptídeo foi clivado.
[0119]Algumas modalidades incluem uma composição compreendendo bacteriocinas, que pode ser fabricada de acordo com os métodos de algumas modalidades aqui são mostradas na FIG 3. Em algumas modalidades, a composição é produzida pela clivagem de um pró-polipeptídeo como descrito aqui. É considerado que as bacteriocinas podem ser liberadas por clivagem do pró-polipeptídeo, por exemplo por intermédio de uma endopeptidase. O resultado pode ser uma mistura com a combinação molecular correta de acordo com um resultado predeterminado e/ou desejado em termos de morte bacteriana. Em algumas modalidades, uma cepa de célula hospedeira pode produzir uma mistura de bacteriocinas múltiplas em uma fermentação. É considerado que pode não haver nenhum efeito tóxico durante a produção (e assim, nenhuma necessidade de imunidade na célula hospedeira).
Opcionalmente, a purificação do pró-polipeptídeo (e/ou bacteriocinas “clivadas”) pode ser realizada por purificação por intermédio de uma etiqueta. Opcionalmente ajuste molecular entre as bacteriocinas pode ser realizado.
Composições compreendendo bacteriocinas
[0120]Em algumas modalidades, composições compreendendo bacteriocinas em razões desejadas são fornecidas. Opcionalmente, a composição pode compreender ainda polipeptídeos adicionais, por exemplo, moléculas de sinal, em razões desejadas com as bacteriocinas e/ou entre si.
[0121]Em algumas modalidades, uma composição compreende duas ou mais bacteriocinas em uma razão selecionada para alvejar uma célula microbiana ou populações de células microbianas. Cada uma das bacteriocinas pode compreender, em seu término N, término C ou término N e término C, uma porção de uma sequência de clivagem que foi clivada. É considerado que quando um pró-polipeptídeo compreendendo bacteriocinas múltiplas como descrito aqui é clivado em seus sítios de clivagem, pelo menos algumas das bacteriocinas compreenderão os vestígios do sítio de clivagem em seus términos N e/ou C, dependendo do sítio de clivagem. Como tal, é considerado que não apenas as bacteriocinas da composição estarão em razões desejadas com um grau muito alto de precisão, mas além disso, as bacteriocinas serão estruturalmente distintas de modo que muitas ou todas as bacteriocinas compreenderão vestígios N- e/ou C-terminais de sítios de clivagem, por exemplo, sítios de clivagem parciais. Em algumas modalidades, as porções de sequências de clivagem nos términos N, C ou N e C das bacteriocinas são para sítios de clivagem da mesma enzima de clivagem. Em algumas modalidades, as porções de sequências de clivagem nos términos N, C ou N e C das bacteriocinas são para sítios de clivagem de duas ou mais enzimas de clivagem diferentes.
[0122]Em algumas modalidades, algumas ou todas as bacteriocinas da composição compreendem ainda uma etiqueta. Em algumas modalidades, a etiqueta é selecionada do grupo consistindo em etiquetas de afinidade, uma sequência de sinal ou uma etiqueta de estabilidade. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem é disposto entre a etiqueta e a bacteriocina.
[0123]Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma molécula de sinal como descrito aqui. A molécula de sinal também pode estar na razão desejada. A molécula de sinal também pode compreender vestígios de sítios de clivagem em seus términos N e/ou C.
[0124]Em algumas modalidades, a razão de bacteriocinas na composição é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados em um ambiente, tal como um ambiente de fabricação industrial, um fermentador, um ambiente de fabricação de alimento, fármaco ou cosmético ou um produto a ser preservado (por exemplo, um produto alimentício, medicamentoso ou cosmético). Em algumas modalidades, a razão de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano ou uma raiz de planta e/ou solo ou para preservar um produto (tal como um produto alimentício, medicamentoso ou cosmético). Em algumas modalidades, a composição é formulada para administração tópica ou oral a um sujeito humano.
Substratos de codificação
[0125]De acordo com métodos e dispositivos e sistemas microfluídicos de algumas modalidades descrito aqui, substratos de codificação são fornecidos. Um substrato de codificação pode compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína ou peptídeo tal como um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina (e, opcionalmente, uma proteína auxiliar) como descrito aqui. Os substratos de codificação de métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e podem ser usados para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Os substratos de codificação podem ser distintos e capazes de serem colocados em isolamento fluídico um do outro (que podem ser referidos aqui como substratos de codificação “distintos”). Por exemplo, em um método ou dispositivo microfluídico de algumas modalidades, vários substratos de codificação separados podem ser usados para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas por via de transcrição/tradução in vitro, em que (i) apenas substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica são contatados e incubados com uma solução de transcrição/tradução in vitro, (ii) apenas substratos de codificação que produziram peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica são colocados em comunicação fluídica com um reservatório fluídico onde a mistura específica é formada ou (i) e (ii). Por exemplo,
válvulas como descrito aqui podem controlar o fluxo de solução de transcrição/tradução in vitro e/ou peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas de substratos de codificação separados (ou câmaras que alojam os substratos de codificação separados). Em métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades, substratos de codificação diferentes, que codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas diferentes um do outro podem ser alojados em câmaras separadas (de um dispositivo microfluídico como descrito aqui), cada uma das quais pode ser colocada em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro por uma válvula.
Como tal, em métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades, os substratos de codificação separados de um dispositivo microfluídico são compreendidos dentro de câmaras separadas.
Em algumas modalidades, os substratos de codificação separados compreendem,
consistem essencialmente em ou consistem em pérolas.
Por via de exemplo, pérolas que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica
(mas não pérolas que codificam outros peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas)
podem ser colocadas em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro, mecanicamente ou através da abertura e/ou fechamento da válvula para direcionar os fluidos às pérolas apropriadas. Em algumas modalidades, substratos de codificação diferentes separados codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas diferentes um do outro. Algumas modalidades compreendem um sistema compreendendo um processador. O sistema pode ser configurado para ser colocado em comunicação de fluido e/ou dados com um dispositivo microfluídico como descrito aqui. Opcionalmente, o sistema compreende uma bomba e/ou reservatórios de reagentes (por exemplo, solução de transcrição/tradução in vitro) que podem ser colocados em comunicação de fluido com o dispositivo microfluídico. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é formatado como um cartucho para inserção no sistema. Em algumas modalidades, os substratos de codificação codificam bacteriocinas, mas não peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, os substratos de codificação codificam peptídeos antimicrobianos, mas não bacteriocinas. Em algumas modalidades, os substratos de codificação codificam uma combinação de peptídeos antimicrobianos e bacteriocinas.
[0126]De acordo com os métodos e dispositivos e sistemas microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, os substratos de codificação são substratos de codificação separados. Em algumas modalidades, um substrato de codificação separado é compreendido dentro de uma câmara. Consequentemente, em algumas modalidades, substratos de codificação separados múltiplos são todos compreendidos dentro de uma câmara separada. Em algumas modalidades, dois ou mais substratos de codificação separados são compreendidos dentro da mesma câmara, de modo que uma única câmara contenha dois ou mais substratos de codificação separados e assim possa produzir uma mistura e/ou estequiometria de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, uma câmara compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 100, 1000, 5000, 10.000, 500.000, 1.000.000, 10.000.000 ou 100.000.000 substratos de codificação separados, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo 1 a 3, 1 a 5, 1 a 10, 1 a 50, 2 a 3, 2 a 5, 2 a 10, 2 a 20, 2 a 50, 2 a 100, 10 a 50, 50 a 100, 50a 500, 50 a 1000, 100 a 500, 100 a 1000, 500 a 1000, 1000 a 5000, 5000 a 10.000, 10.000 a 50.000, 50.000 a 100.000, 100.000 a 500.000, 500.000 a 1.000.000, 1.000.000 a 10.000.000, 10.000.000 a 100.000.000 ou 100.000.000 a
1.000.000.000 substratos de codificação separados.
[0127]De acordo com os métodos e dispositivos e sistemas microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, as câmaras do dispositivo microfluídico compreendendo os substratos de codificação separados são câmaras de micro- escala. Por exemplo, as câmaras podem ter todas um volume de não mais do que 1, 5, 10, 20, 50, 100, 250 ou 500 microlitros, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo, 1 a 5 microlitros, 1 a 10 microlitros, 1 a 20 microlitros, 1 a 50 microlitros, 1 a 100 microlitros, 1 a 500 microlitros, 5 a 10 microlitros, 5 a 20 microlitros, 5 a 50 microlitros, 5 a 100 microlitros, 5 a 500 microlitros, 10 a 20 microlitros, 10 a 50 microlitros, 10 a 100 microlitros, 10 a 500 microlitros, 50 a 100 microlitros ou 50 a 500 microlitros. Em algumas modalidades, as câmaras compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em um material ou produto selecionado do grupo consistindo em um poço, nanopoço, membrana, matriz, plástico, metal, vidro, polímero, polissacarídeo e composto paramagnético ou uma combinação de dois ou mais destes. De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, os substratos de codificação compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em um material ou produto selecionado do grupo consistindo em uma microplaqueta, pérola, nanopartícula, poço, nanopoço, membrana, matriz, plástico, metal, vidro, polímero, polissacarídeo e composto paramagnético ou uma combinação de dois ou mais destes. Algumas modalidades incluem um dispositivo microfluídico compreendendo microcâmaras separadas, cada uma compreendendo uma ou mais pérolas, cada uma das quais compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um substrato de codificação. Cada uma das pérolas pode compreender ácidos nucleicos que codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, o dispositivo inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10 a 50, 50 a 100, 100 a 500, 500 a 1000 ou 1000 a 5000 câmaras ou qualquer número entre os mesmos.
[0128]De acordo com os métodos e dispositivos e sistemas microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, os substratos de codificação compreendem ácidos nucleicos imobilizados nestes. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser covalentemente ligados ao substrato de codificação, hibridizados ao substrato de codificação e/ou associados com o substrato de codificação por intermédio de uma ou mais forças, tal como uma força eletrostática. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende DNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende RNA.
[0129]Em algumas modalidades, um substrato de codificação codifica ou compreende ainda uma proteína auxiliar, tal como uma proteína para a estabilização de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, uma proteína com atividade anti- protease (por exemplo uma serpentina), uma proteína para a estabilização de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, uma proteína para a destruição de um biofilme microbiano (por exemplo um quebrador de biofilme tal como Dispersina B), uma proteína de feromônio, uma proteína que atrai um organismo microbiano não patogênico ou uma proteína que realça o crescimento ou reprodução do organismo microbiano não patogênico em um microbioma de um sujeito. Sem ser limitado pela teoria é considerado que uma tal proteína auxiliar pode realçar a expressão e/ou a atividade de um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina, por exemplo, estabilizando-se o peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina em um ambiente particular, inibindo-se uma protease de um ambiente particular que degradaria um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina e/ou degradando-se as fibrilas de um biofilme microbiano para realçar o contato bacteriano pelo peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina. Em algumas modalidades, um substrato de codificação separado codifica um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina além de uma proteína auxiliar.
Em algumas modalidades, um substrato de codificação primário codifica uma proteína auxiliar e um substrato de codificação secundário codifica um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina. Em algumas modalidades, as proteínas auxiliares são selecionadas com os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Por exemplo, se uma mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas for para um ambiente compreendendo uma protease particular, por exemplo tripsina, um substrato de codificação que codifica um inibidor desta protease pode ser selecionado junto com substratos de codificação que codificam a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, um substrato de codificação codifica uma proteína auxiliar com atividade anti-protease. Em algumas modalidades, a proteína auxiliar com anti-protease é uma proteína para a estabilização de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar que atrai um organismo microbiano não patogênico ou que realça o crescimento ou a reprodução do organismo microbiano não patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar. Em algumas modalidades, a proteína auxiliar é um peptídeo de feromônio que induz um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina de um organismo microbiano desejado tal como um organismo microbiano não patogênico (embora em algumas modalidades, um organismo microbiano patogênico seja um organismo microbiano desejado). Assim, por exemplo, em algumas modalidades um substrato de codificação separado codifica uma proteína auxiliar que induz ou faz com que uma bactéria secrete um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina que inibe o crescimento ou a reprodução de uma outra bactéria. Em algumas modalidades, um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína que atrai o organismo microbiano não patogênico ou que realça o crescimento ou a reprodução do organismo microbiano não patogênico no microbioma de um sujeito. Em algumas modalidades, bacteriocinas e não peptídeos antimicrobianos são usados.
[0130]A inibição do crescimento ou da reprodução tem seu significado usual e habitual como entendido por uma pessoa de habilidade na técnica tendo em vista esta divulgação. O mesmo se refere a uma diminuição em ou parada de proliferação de organismos microbianos (ou uma diminuição na taxa de proliferação de organismos microbianos), por exemplo, parada do ciclo celular e/ou morte de organismos microbianos. Similarmente, o realce do crescimento ou da reprodução se refere a um aumento na proliferação ou na taxa de proliferação dos organismos microbianos.
Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para detectar a inibição ou o realce do crescimento ou reprodução.
Soluções de transcrição/tradução in vitro
[0131]De acordo com os métodos, sistemas e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, uma solução de transcrição/tradução pode ser usada para produzir um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina codificado por um substrato de codificação. Como tal, a solução de transcrição/tradução pode ser útil para gerar peptídeos ou peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, em um método ou dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. O termo, “solução de transcrição/tradução in vitro” abrange uma solução de transcrição in vitro e/ou uma solução de tradução in vitro suficiente para produzir um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina a partir de um substrato de codificação. Por via de exemplo, em modalidades em que o substrato de codificação compreende transcritos de RNA que codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, é considerado que uma “solução de transcrição/tradução in vitro”
compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma solução de tradução seja suficiente (visto que será entendido que o RNA já é um transcrito). Por via de exemplo, em modalidades em que o substrato de codificação compreende DNAs que codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, é considerado que uma “solução de transcrição/tradução in vitro” compreende uma solução de transcrição (para transcrever os DNAs em RNAs) e uma solução de tradução (para traduzir os RNAs em polipeptídeos). Em algumas modalidades, a solução de transcrição e tradução estão juntas em uma única solução. Em algumas modalidades, a solução de transcrição e tradução estão em soluções separadas, por exemplo em vesículas colocadas em suspensão em uma única solução e/ou em soluções separadas que são aplicadas sequencialmente. Em algumas modalidades, os componentes da solução de transcrição/tradução in vitro são liofilizados e configurados para serem reconstituídos na solução de transcrição/tradução in vitro após a adição de água. Em algumas modalidades, a solução de transcrição/tradução in vitro é reconstituída adicionando-se água aos componentes liofilizados.
[0132]Soluções de tradução podem ser úteis para traduzir ácidos nucleicos de acordo com os métodos, sistemas e/ou dispositivos microfluídicos descritos aqui.
Soluções de tradução adequadas podem compreender, consistir essencialmente em ou consistir em reagentes para a tradução in vitro (que, por conveniência, podem ser referidos aqui como “reagentes de tradução”) e como tal podem ser configuradas para a tradução in vitro de um transcrito tal como um RNA. Algumas modalidades incluem uma solução de transcrição compreendendo reagentes para transcrição (que, por conveniência, podem ser referidos aqui como “reagentes de transcrição”) e assim é configurada para a transcrição e tradução in vitro, por exemplo para transcrever e traduzir um ácido nucleico que codifica um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina ou outros peptídeos como descrito aqui. É considerado que a transcrição e a tradução in vitro em uma única solução (tal como uma solução de transcrição compreendendo ainda uma solução de tradução como descrito aqui) podem facilitar a produção in vitro eficiente de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas ou outros peptídeos de acordo com métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades. Assim, de acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, a solução de transcrição/tradução in vitro compreende um reagente de transcrição in vitro e/ou um reagente de tradução in vitro.
[0133]De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, a solução de tradução compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um ou mais reagentes de tradução ou reagentes de tradução in vitro. Exemplos de reagentes de tradução incluem, mas não são limitados a, um ribossomo, um tampão, um aminoácido, um tRNA (que pode ser conjugado a um aminoácido), um lisato ou extrato tal como um lisato de E. coli ou extrato de E. coli e um cofator ou íon metálico tal como Mg2+ ou uma combinação de dois ou mais de qualquer um dos itens listados. De acordo com os métodos, sistemas e kits de algumas modalidades descritas aqui a solução de tradução compreende ainda uma solução de transcrição e assim é configurada para a transcrição e tradução in vitro. Como descrito aqui, uma solução de transcrição compreendendo ainda uma solução de tradução considera uma única solução que é adequada para a transcrição e tradução in vitro. Como tal, uma solução de transcrição compreendendo ainda uma solução de tradução abrange uma única solução de transcrição/tradução. Será avaliado que alguns componentes de uma solução de transcrição e/ou tradução, por exemplo ribossomos, podem não ser líquidos e podem ser potencialmente isolados da solução de transcrição e/ou tradução, por exemplo por filtração e/ou centrifugação.
Soluções de tradução dos métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui (e que podem ser compreendidas por soluções de tradução como descrito aqui) podem compreender, consistir essencialmente em ou consistir em um ou mais reagentes de transcrição. Exemplos de reagentes de transcrição incluem uma RNA polimerase, um tampão, uma mistura de ácido nucleico (por exemplo, NTPs incluindo ATP, GTP, CTP e UTP), um cofator ou íon metálico tal como Mg2+, um indutor de transcrição (tal como um fator de transcrição, IPTG ou lactose), uma enzima de poliadenilação, uma enzima de capeamento, um lisato ou extrato tal como um lisato ou extrato bacteriano tal como um lisato de E. coli ou extrato de E. coli, uma SP6 polimerase, uma T3 polimerase, uma T7 RNA polimerase ou uma mistura de dois ou mais de qualquer um dos itens listados. A solução de transcrição pode ser útil para transcrever um padrão, tal como um ácido nucleico candidato como descrito aqui. Soluções de tradução de métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades incluem um ou mais reagentes de transcrição em combinação com um ou mais reagentes de tradução. Em algumas modalidades, um dispositivo e/ou sistema microfluídico compreende um reservatório compreendendo uma solução de transcrição/tradução in vitro como descrito aqui. Em algumas modalidades, o reservatório compreende uma solução de transcrição in vitro e uma solução de tradução in vitro que podem ser combinadas para produzir a solução de transcrição/tradução in vitro.
[0134]Em algumas modalidades, a solução de tradução compreende uma enzima de modificação pós-traducional. Exemplos de enzimas de modificação pós- traducional incluem, mas não são limitados a uma enzima de clivagem, uma cinase, uma fosfatase, uma glicosiltransferase ou uma mistura de quaisquer dois dos itens listados.
[0135]De acordo com os sistemas, métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, a solução de tradução é fornecida a um substrato de codificação em uma escala de microlitros. Por exemplo, a solução de tradução pode ter um volume de 1 µl a 1000 µl, 1 µl a 50 µl, 1 µl a 500 µl, 1 µl a 900 µl, 50 µl a 100 µl, 50 µl a 500 µl, 50 µl a 1000 µl, 100 µl a 200 µl, 100 µl a 500 µl, 100 µl a 1000 µl, 200 µl a 500 µl, 200 µl a 1000 µl, 500 µl a 900 µl ou 500 µl a 1000 µl.
[0136]De acordo com os sistemas, métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, a solução de transcrição/tradução in vitro é liofilizada. Em algumas modalidades, a solução de transcrição/tradução in vitro é configurada para ser reconstituída em uma solução tal como água. Como tal, um dispositivo microfluídico de algumas modalidades pode ser estavelmente armazenado por períodos de tempo na temperatura ambiente, sem impacto substancial sobre a eficácia da solução de transcrição/tradução in vitro. Consequentemente, é considerado que o dispositivo microfluídico de algumas modalidades seja adequado para tratamento em ponto de atendimento e pode ser usado para preparar misturas específicas de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas conforme necessário (por exemplo, em resposta a lesões, infecções e/ou procedimentos cirúrgicos particulares).
Dispositivos e sistemas microfluídicos
[0137]Um sistema fluídico compreendendo um dispositivo microfluídico pode ser útil para produzir misturas específicas de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas de acordo com os métodos e dispositivos e sistemas microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui. Em algumas modalidades, um sistema é configurado para receber um dispositivo microfluídico compreendendo substratos de codificação separados como descrito aqui, de modo que o sistema possa direcionar o dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas por intermédio de transcrição/tradução in vitro. Em algumas modalidades, o sistema é configurado para estar em comunicação de fluido e/ou dados com o dispositivo. Por exemplo, o cartucho descartável pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em um dispositivo microfluídico para o uso em combinação com sistemas como descrito aqui. Visto que é considerado que misturas específicas de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas podem ser adaptadas para aplicações particulares, por exemplo, para interagir com um microbioma particular de um sujeito particular ou para alvejar uma infecção particular, é considerado que dispositivos microfluídicos descartáveis de uso único podem minimizar a contaminação (por exemplo de bacteriocinas residuais) que pode interferir com a estequiometria e composição da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e podem ser úteis para manter a esterilidade para uso médico em um sujeito. Como tal, em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é estéril. Nos métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades, o dispositivo fluídico compreende um dispositivo microfluídico. Como será entendido, um “dispositivo microfluídico” é um tipo de “dispositivo fluídico”, um dispositivo microfluídico é expressamente considerado qualquer que seja um “dispositivo fluídico” mencionado aqui. Adicionalmente, a menos que expressamente estabelecido de outro modo, qualquer divulgação de um dispositivo fluídico (tal como um dispositivo microfluídico) aqui é entendida como sendo aplicável a um dispositivo microfluídico de algumas modalidades, bem como métodos compreendendo dispositivos microfluídicos como descrito aqui.
[0138]Em algumas modalidades, um dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas é fornecido.
Em algumas modalidades, o dispositivo compreende substratos de codificação separados, como descrito aqui, de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina. O dispositivo pode compreender ainda uma solução de transcrição/tradução in vitro como descrito aqui. O dispositivo pode compreender ainda um reservatório fluídico, uma ou mais válvulas e/ou pode ser configurado para ser colocado em comunicação de dados com um processador como descrito aqui. As válvulas podem regular a comunicação fluídica entre a solução de transcrição/tradução, os substratos de codificação separados e/ou o reservatório fluídico. O processador pode ser configurado para controlar as válvulas, de modo a colocar os substratos de codificação que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica em comunicação de fluido com a solução de transcrição/tradução in vitro de modo que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica sejam produzidos. O processador pode ser configurado para controlar as válvulas (e, em algumas modalidades, fluxo fluídico) no dispositivo microfluídico para colocar os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura em comunicação de fluido com o reservatório fluídico de modo que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica fluem para o reservatório fluídico, fornecendo assim a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico. Opcionalmente, os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica são ativamente misturados no reservatório fluídico. Em algumas modalidades, os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica se misturam passivamente (mas são não ativamente misturados) no reservatório fluídico. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende o processador. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico não compreendem por si só o processador, mas é configurado para ser colocado em comunicação de dados com o processador.
Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e não peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e não bacteriocinas. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos.
[0139]Algumas modalidades dos métodos e dispositivos microfluídicos descritos aqui incluem um dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. O dispositivo pode compreender: substratos de codificação separados de modo que cada um codifique uma bacteriocina e/ou um peptídeo antimicrobiano; uma solução de transcrição/tradução in vitro; um reservatório fluídico; válvulas, cada uma disposta em um caminho fluídico entre um substrato de codificação separado e o reservatório fluídico, cada válvula configurada para regular o fluxo entre o substrato de codificação separado e o reservatório fluídico. O dispositivo pode ser configurado para ser colocado em comunicação de dados com um processador configurado para: com base na mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico; permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, de modo que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica sejam produzidos; permitir o fluxo dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas através das válvulas no reservatório fluídico; e controlar o fluxo de fluido no reservatório fluídico, em que o fluxo compreende o movimento de um fluido compreendendo os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos no reservatório fluídico, produzindo assim a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende o processador. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e não peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e não bacteriocinas. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos.
[0140]De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, o dispositivo microfluídico compreende substratos de codificação separados mas não um reservatório fluídico e/ou uma solução de transcrição/tradução in vitro. Como tal, o dispositivo microfluídico pode ser colocado em comunicação de fluido e dados com um sistema como descrito aqui e o sistema pode fornecer o reservatório fluídico e/ou a solução de transcrição/tradução in vitro de modo que a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas possa ser produzida. Consequentemente, em algumas modalidades, o sistema compreende um reservatório fluídico e/ou uma solução de transcrição/tradução in vitro como descrito aqui. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico não compreende o reservatório fluídico, a solução de transcrição/tradução in vitro e/ou quaisquer outros componentes do sistema e é separado destes componentes do sistema até que ele seja colocado em comunicação de dados e/ou fluido com o sistema. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é configurado para ser ligado ao reservatório fluídico, à solução de transcrição/tradução in vitro e/ou um outro componente do sistema. Por exemplo, o dispositivo pode compreender um cartucho que é configurado para ser inserido no sistema para colocar os substratos de codificação separados do cartucho em comunicação de fluido com um exterior (ao cartucho) ao reservatório fluídico, solução de transcrição/tradução in vitro e/ou outro componente do sistema.
Em algumas modalidades, os cartuchos são consumíveis. Por exemplo, um cartucho pode compreender substratos de codificação separados, ser configurado para ser inserido no sistema descrito aqui para produzir uma mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos e depois ser descartado, depois do que um outro cartucho que inclui outros substratos de codificação separados pode ser inserido no sistema para produzir uma mistura diferente de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos. Em algumas modalidades, um cartucho é configurado para receber uma solução de transcrição/tradução in vitro do sistema, de modo que a solução de transcrição/tradução in vitro contate os substratos de codificação separados do cartucho que codificam as bacteriocinas e/ou peptídeos antimicrobianos da mistura específica. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e não peptídeos antimicrobianos.
Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e não bacteriocinas. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos.
[0141]Também consideradas são modalidades em que o sistema e/ou dispositivo microfluídico é seco. Em algumas modalidades, o sistema ou dispositivo microfluídico compreende um reagente liofilizado configurado para ser dissolvido em um fluido tal como água.
[0142]A FIG 5 é um diagrama esquemático representando um dispositivo microfluídico 500 de algumas modalidades aqui. O dispositivo microfluídico 500 pode compreender substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c (embora três substratos de codificação separados sejam mostrados por via de exemplo, é considerado que dispositivos microfluídicos das modalidades aqui podem compreender outras quantidades de substratos de codificação separados, como descrito aqui). O dispositivo pode compreender um reservatório fluídico 540, que, por via de exemplo, pode receber peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas produzidos a partir dos substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c e assim pode conter uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas como descrito aqui. As válvulas 520a, 520b, 520c e/ou 570a, 570b, 570c podem regular o fluxo fluídico aos substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c e a partir dos mesmos. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende ainda uma saída 590, que pode permitir o fluxo do reservatório fluídico 540 para fora do dispositivo microfluídico. Por exemplo, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas pode fluir através da saída 590 a um tecido, ferimento, microbioma de um sujeito e/ou vaso como descrito aqui. Em algumas modalidades, um processador 595 como descrito aqui está em comunicação de dados com o dispositivo e controles fluxo através das válvulas 520a, 520b, 520c e/ou 570a,
570b, 570c e/ou 550 e/ou 580. Em algumas modalidades, o dispositivo não compreende por si só um processador 595 e é configurado para ser colocado em comunicação de dados com um processador 595 como descrito aqui de modo a controlar o fluxo através das válvulas 520a, 520b, 520c e/ou 570a, 570b, 570c e/ou
550 e/ou 580. É considerado que de acordo com dispositivos microfluídicos e métodos de algumas modalidades aqui, a produção de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas de uma mistura específica pode ser obtida contatando-se apenas um subconjunto de substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c com uma solução de transcrição/tradução in vitro no primeiro lugar (de modo que apenas alguns substratos de codificação separados sejam usados para produzir um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina) e/ou permitindo-se apenas que um subconjunto de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas produzidos a partir de substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c entre no reservatório fluídico 540. É observado que contatar apenas um subconjunto dos substratos de codificação separados com solução de transcrição/tradução in vitro pode realçar a eficiência evitando-se o uso de solução de transcrição/tradução in vitro nos substratos de codificação que não codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica.
Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é parte de um cartucho 591 que não compreende um reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro.
O cartucho 591 pode ser configurado para colocar o dispositivo microfluídico em comunicação de dados com um sistema compreendendo um processador 595. Opcionalmente o cartucho também pode ser colocado em comunicação de fluido com o sistema.
Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é parte de um cartucho 592 que compreende um reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro 530. O cartucho 592 pode ser configurado para colocar o dispositivo microfluídico em comunicação de dados com um sistema compreendendo um processador 595. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende, consiste essencialmente ou consiste no dispositivo microfluídico 600 mostrado na FIG 6, que inclui substratos de codificação separados 610a, 610b, 610c, um canal 660 e válvulas 620a, 620b, 620c, 670a, 670b, 670c e/ou 680, similar ao dispositivo microfluídico 500 na FIG 5. O dispositivo microfluídico opcionalmente não inclui Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico 600 pode ser colocado em comunicação de fluido com um sistema compreendendo um reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro 530 ou um reservatório fluídico 540 ou em comunicação de dados com um elemento de aquecimento 555. Por exemplo, um cartucho descartável pode compreender, consistir essencialmente ou consistir no dispositivo microfluídico 600 e pode ser configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um sistema compreendendo solução de transcrição/tradução in vitro 530 e um reservatório fluídico 540. O dispositivo microfluídico 600 também pode ser colocado em comunicação de dados com um processador 595 e/ou um elemento de aquecimento 555 do sistema. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e não peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e não bacteriocinas. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos.
[0143]Em algumas modalidades, as válvulas 520a, 520b e 520c regulam o fluxo entre os substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c e o reservatório fluídico 540. As válvulas 570a, 570b e 570c são opcionais e/ou as válvulas 550 e 580 são opcionais e/ou o canal 560 é opcional. Em algumas modalidades, o reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro 530 pode estar em comunicação fluídica com o reservatório fluídico 540. Opcionalmente, a válvula 550 é disposta entre o reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro 530 e o reservatório fluídico
540 e regula o fluxo de solução de transcrição/tradução in vitro ao reservatório fluídico
540. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico 600 da FIG. 6 é parte de um cartucho.
[0144]Em algumas modalidades, por exemplo se apenas os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica são permitidos entrar no reservatório fluídico 540 a partir dos substratos de codificação 510a, 510b, 510c, as válvulas 570a, 570b e 570c regulam o fluxo entre um reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro 530 e os substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c e as válvulas 520a, 520b, 520c são opcionais e/ou a válvula 550 é opcional e/ou a válvula 580 é opcional. Um canal 560 pode conectar o reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro 530 aos substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c, com válvula de intervenção opcional 580 entre o reservatório 530 e o canal 560 e/ou válvulas de intervenção opcionais 570a, 570b, 570c entre o canal 560 e os substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c. Em algumas modalidades, as válvulas 570a, 570b e 570c regulam o fluxo entre um reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro 530 e os substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c e as válvulas 520a, 520b, 520c regulam o fluxo entre os substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c e o reservatório fluídico 540. Opcionalmente, o canal 560 pode conectar o reservatório 530 aos substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c. A válvula 580 é opcional e/ou a válvula 550 é opcional.
[0145]O dispositivo microfluídico pode compreender ainda uma saída 590. A saída 590 pode colocar o reservatório fluídico (e qualquer mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas neste) em comunicação fluídica com um tecido de um sujeito, um ferimento e/ou um microbioma de um sujeito como descrito aqui. Em algumas modalidades, a saída 590 compreende uma válvula. Em algumas modalidades, a saída 590 pode ser colocada em comunicação de fluido com um vaso para armazenar uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, por exemplo um tubo, saco ou poço de teste.
[0146]Em algumas modalidades, o reservatório com solução de transcrição/tradução in vitro 530 está em comunicação de fluido com o canal 560. A válvula opcional 580 controla do reservatório 530 ao canal 560. Em algumas modalidades, as válvulas 570a, 570b e 570c regulam o fluxo de solução de transcrição/tradução do canal 560 em substratos de codificação separados 510a, 510b, 510c. Por via de exemplo, para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreendendo peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas codificados por substratos de codificação separados 510a e 510b (mas não 510c), as válvulas 570a e 570b pode ser abertas, enquanto a válvula 570c é fechada, para permitir o fluxo de solução de transcrição/tradução 530 em substratos de codificação separados 510a e 510b, mas não 510c. Em algumas modalidades, os substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c são incubados com a solução de transcrição/tradução in vitro para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas que é liberada por intermédio das válvulas 520a, 520b e/ou 520c no reservatório fluídico 540.
[0147]Em algumas modalidades, a solução de transcrição/tradução in vitro flui para os substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c através do reservatório fluídico 540. O reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro 530 pode estar em comunicação de fluido com o reservatório fluídico 540, opcionalmente com o fluxo regulado pela válvula de intervenção 550. Opcionalmente, as válvulas 520a, 520b, 520c regulam o fluxo do reservatório fluídico 540 aos substratos de codificação separados 510a, 510b e 510c. Como tal, a solução de transcrição/tradução in vitro pode ser incubada com os substratos de codificação separados apropriados para produzir peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas depois podem fluir através das válvulas 520a, 520b e 520c ao reservatório fluídico 540. As válvulas 570a, 570b, 570c, o canal
560 e a válvula 580 podem ser opcionais. Em algumas modalidades, substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c são incubados com a solução de transcrição/tradução in vitro para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas que é liberada por intermédio das válvulas 520a, 520b e/ou 520c no reservatório fluídico 540. Em algumas modalidades, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas flui através da saída 590 a um ferimento, tecido, microbioma de um sujeito e/ou vaso como descrito aqui.
[0148]Em algumas modalidades, a válvula 550 regula o fluxo do reservatório com solução de transcrição/tradução in vitro 530 no reservatório fluídico 540 e as válvulas 520a, 520b e/ou 520c regulam o fluxo dos substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c ao reservatório fluídico 540. As válvulas 570a, 570b, 570c e 580 e o canal 560 são opcionais. Como tal, a solução de transcrição/tradução in vitro pode fluir do reservatório fluídico 540 aos substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c, pode ser incubada com os substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c para produzir peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas podem fluir para o reservatório fluídico
540. Em algumas modalidades, o processador 595 regula o fluxo da solução de transcrição/tradução in vitro através das válvulas 520a, 520b e 520c aos substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c de modo que apenas substratos de codificação separados que codificam peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica recebam a solução de transcrição/tradução in vitro. Em algumas modalidades, o processador 595 permite o fluxo da solução de transcrição/tradução in vitro do reservatório fluídico 540 aos substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica através das válvulas 520a, 520b e 520c e depois que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas foram produzidos por transcrição/tradução in vitro, o processador 595 regula as válvulas 520a, 520b, 520c, de modo que apenas os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica entrem no reservatório fluídico 540.
[0149]Pode ser avaliado que em algumas modalidades do dispositivo fluídico 500 representado na FIG 5, as válvulas 550, 570a, 570b, 570c, 580 e o canal 560, são opcionais. Por exemplo, algumas modalidades do dispositivo fluídico incluem válvulas 580, 570a, 570b e 570c e meio de fluxo 560, mas não a válvula 550. Em algumas outras modalidades, o dispositivo fluídico inclui a válvula 550, mas não as válvulas 570a, 570b, 570c ou 580 ou o meio de fluxo 560. Em algumas modalidades, o dispositivo fluídico inclui as válvulas 550, 570a, 570b, 570c e 580 e o meio de fluxo
560. Em algumas modalidades, a válvula 580 é incluída e as válvulas 570a, 570b e 570c são excluídas. Em algumas modalidades, a válvula 580 é excluída e as válvulas 570a, 570b e 570c são incluídas. Também pode ser avaliado que em algumas modalidades do dispositivo fluídico 500, a saída 590 não compreende uma válvula.
[0150]Em algumas modalidades, a saída 590 permite um fluido de lavagem no reservatório fluídico 540 e qualquer uma das outras válvulas pode ser aberta para permitir o fluxo do fluido de lavagem em qualquer outra porção fluidicamente conectada do dispositivo. Em algumas modalidades, o fluido de lavagem compreende um tampão ou um detergente. Pode ser avaliado que válvulas adicionais podem estar presentes no dispositivo microfluídico para permitir o fluxo de entrada ou o fluxo de saída de fluidos em qualquer uma das porções fluídicas do dispositivo.
[0151]Em algumas modalidades, o canal 560 compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um microcanal, tubo, cano e uma mangueira e como tal, pode conter e/ou direcionar o fluxo de um fluido. Em algumas modalidades, o canal 560 compreende material tal como borracha, plástico, metal.
[0152]De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descrito aqui, o dispositivo microfluídico é portátil. Por exemplo, algumas modalidades do dispositivo podem ser removidas de um laboratório e tomadas em um ambiente natural onde um cientista realiza testes com várias misturas de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos.
[0153]De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, o dispositivo microfluídico compreende uma saída 590 através da qual a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas é liberada a um ferimento. Por exemplo, a saída 590 pode ser conectada ao ferimento por intermédio de uma membrana ou tubo. Assim, em algumas modalidades, o dispositivo compreende um dispositivo de cura do ferimento ou de limpeza do ferimento.
[0154]Em algumas modalidades, o fluido é passivamente transferido de um componente do dispositivo para um outro. Os dispositivos microfluídicos de algumas modalidades incluem uma bomba 565 que ativamente bombeia o fluido de um componente do dispositivo para um outro.
[0155]De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, o dispositivo microfluídico compreende um elemento de aquecimento 555 tal como um bloco de aquecimento. Em algumas modalidades, o elemento de aquecimento é configurado para aquecer partes do dispositivo microfluídico, tal como o reservatório fluídico 540 e/ou os substratos de codificação separados 510a, 510b e/ou 510c para realizar a etapa de incubação. Em algumas modalidades, a etapa de incubação é em torno de pelo menos 0° C, 4° C, 25° C, 30° C, 37° C, 38° C, 40° C, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo 0 a 40° C ou 36 a 38° C ou 4 a 40° C. Em algumas modalidades, a incubação com a solução de transcrição/tradução in vitro pelo menos 1, 10, 30, 60 segundos ou pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15,20, 25 ou 30 minutos, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo 1 a 30 segundos, 30 a 60 segundos, 1 a 2 minutos, 2 a 5 minutos, 5 a 10 minutos, 10 a 15 minutos, 15 a 30 minutos ou 30 a 60 minutos, 1 a 2 horas, 2 a 5 horas, 5 a 10 horas, 10 a 15 horas, 15 a 24 horas, 24 a 48 horas ou 48 a 72 horas. Em algumas modalidades, a incubação com a solução de transcrição/tradução in vitro compreende mais do que uma temperatura em tempos diferentes.
[0156]De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, o dispositivo microfluídico compreende um reservatório de antibióticos químicos e/ou de fago configurados para misturar com a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende um antibiótico compreendendo um antibiótico químico e/ou um fago. Em algumas modalidades, o sistema compreende um reservatório de antibióticos químicos ou de fago configurados para misturar com a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos. De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, o dispositivo microfluídico compreende um antibiótico compreendendo um antibiótico químico e/ou um fago.
Reservatórios fluídicos
[0157]Em métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades aqui, o dispositivo microfluídico compreende um reservatório fluídico 540. Em algumas modalidades, o reservatório fluídico está ou é configurado para estar em comunicação de fluido com pelo menos um substrato de codificação separado (opcionalmente, separado por uma válvula como descrito aqui). Em algumas modalidades, o reservatório fluídico está em comunicação de fluido com substratos de codificação separados ou câmaras que alojam os substratos de codificação separados, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o reservatório fluídico é colocado em comunicação de fluido com os substratos de codificação separados (ou câmaras) por um canal, tubo, tubo microfluídico, membrana, malha, abertura, passagem ou dois ou mais destes. Por via de exemplo, o canal, tubo, tubo microfluídico, membrana, malha, abertura e/ou passagem de algumas modalidades podem compreender um material tal como borracha, vidro, plástico, metal, um composto orgânico ou dois ou mais destes. Em algumas modalidades, o reservatório fluídico é configurado para receber peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos podem ser misturados no reservatório fluídico, formando a mistura, por exemplo por mistura passiva e/ou por mistura ativa. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende mais do que um reservatório fluídico. Em algumas modalidades, o reservatório fluídico tem um volume de pelo menos 1 µl, por exemplo, pelo menos 1, 5, 10, 100, 500 ou 1000 µl, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados, por exemplo, 1 µl a 1000 µl, 1 µl a 50 µl, 1 µl a 500 µl, 1 µl a 900 µl, 50 µl a 100 µl, 50 µl a 500 µl, 50 µl a 1000 µl, 100 µl a 200 µl, 100 µl a 500 µl, 100 µl a 1000 µl, 200 µl a 500 µl, 200 µl a 1000 µl, 500 µl a 900 µl, 500 µl a 1000 µl, 1 ml a 1000 ml, 1 ml a 50 ml, 1 ml a 500 ml, 1 ml a 900 ml, 50 ml a 100 ml, 50 ml a 500 ml, 50 ml a 1000 ml, 100 ml a 200 ml, 100 ml a 500 ml, 100 ml a 1000 ml, 200 ml a 500 ml, 200 ml a 1000 ml, 500 ml a 900 ml, 500 ml a 1000 ml.
Válvulas
[0158]Em métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende uma ou mais válvulas. Como usado aqui, “válvula” abrange válvulas mecânicas, bem como campos eletromagnéticos, membranas de difusão condicional e outros dispositivos entendidos na técnica como permitindo e restringindo o fluxo de líquido. Em algumas modalidades, uma válvula separa o reservatório fluídico de um substrato de codificação separado e controla o fluxo de fluidos entre o substrato de codificação separado e o reservatório fluídico.
Cada válvula pode ser disposta em um caminho fluídico entre um substrato de codificação separado e o reservatório fluídico. Cada válvula pode ser configurada para regular o fluxo entre o substrato de codificação separado e o reservatório fluídico. Em algumas modalidades, cada substrato de codificação separado é separado do reservatório fluídico por uma válvula configurada para controlar o fluxo de fluido do substrato de codificação separado ao reservatório fluídico. Em algumas modalidades, uma válvula como descrito aqui compreende uma válvula hidráulica, pneumática, manual, solenoide, motorizada ou válvula de esfera oca ou uma combinação de duas ou mais destas. Em algumas modalidades, uma válvula como descrito aqui compreende uma válvula de duas portas, três portas ou quatro portas. Em algumas modalidades, uma válvula como descrito aqui compreende uma válvula microfluídica ou microválvula, tal como uma microválvula solenoide, microválvula de rosca, microválvula pneumática ou uma combinação de duas ou mais destas. Em algumas modalidades, uma válvula é binária, de modo que o fluxo através da válvula seja “ligado” ou “desligado”. Em algumas modalidades, uma válvula regula a taxa de fluxo através da válvula.
[0159]Em algumas modalidades, as válvulas 520a, 520b, 520c são dispostas entre o reservatório fluídico 540 e os substratos de codificação 510a, 510b, 510c. Por exemplo, em algumas modalidades, as válvulas são dispostas entre o reservatório fluídico e os substratos de codificação e entre os substratos de codificação e o reservatório fluídico. Uma única válvula entre o reservatório fluídico e os substratos de codificação pode ser aberta para fluir alguns ou todos os substratos de codificação com um fluido de transcrição/tradução e depois apenas válvulas entre os substratos de codificação de interesse e o reservatório são abertas depois da incubação, de modo que apenas peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas de interesse sejam incluídos em uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas são permitidos fluir no reservatório fluídico.
[0160]Em algumas modalidades, válvulas separadas são dispostas entre a solução de transcrição/tradução e os substratos de codificação separados, de modo que válvulas separadas possam ser abertas e fechadas para colocar apenas substratos de codificação separados de interesse em contato com a solução de transcrição/tradução e assim produzir uma mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos após a incubação dos substratos de codificação separados de interesse com a solução de transcrição/tradução. Tendo em vista esta divulgação, o técnico habilitado avaliará que existem caminhos múltiplos para que válvulas regulem o fluxo aos substratos de codificação separados e a partir dos mesmos de modo que apenas peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas sejam obtidos em uma mistura no reservatório fluídico 540.
[0161]Bandagens inteligentes podem compreender um processador, um sensor (tal como um sensor de pH e/ou temperatura) e uma fonte de agente terapêutico, em que o processador é configurado para controlar a administração do agente terapêutico. Por exemplo, o sensor pode detectar inflamação e o processador pode administrar quantidades de agente anti-inflamatório em resposta à inflamação detectada. Exemplos de bandagens inteligentes adequadas podem ser encontrados na rede mundial em www.cnet.com/news/this-smart-bandage-can-deliver-drugs- monitor-chronic-wounds, que é por meio deste incorporado a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico como descrito aqui compreende uma bandagem inteligente. Em algumas modalidades, o dispositivo ou sistema microfluídico é configurado para ser colocado em comunicação de fluido com uma bandagem inteligente. Por exemplo, a porta do dispositivo microfluídico pode ser colocada em comunicação de fluido com um reservatório de uma bandagem inteligente, de modo que a bandagem inteligente possa controlar a liberação da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas a um sujeito. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é compreendido por um cartucho descartável que compreende ainda uma bandagem inteligente e está em comunicação de fluido com o reservatório fluídico, de modo que uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas possa ser liberada a um sujeito por intermédio da bandagem inteligente. Opcionalmente, o cartucho descartável compreendendo a bandagem inteligente e o dispositivo microfluídico compreendem um adesivo para direcionar a aplicação a um tecido de um sujeito, por exemplo pele. Como tal, o dispositivo microfluídico de algumas modalidades é para uso médico. Em algumas modalidades, a bandagem inteligente monitora um ferimento ou sítio de inflamação e libera uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas como descrito aqui à pele ou a um sítio de ferimento.
Processadores
[0162]Um processador 595 pode regular válvulas em dispositivos microfluídicos e métodos de algumas modalidades. O processador pode ser configurado para, com base na mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico. Em algumas modalidades, o processador é configurado para permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, de modo que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos da mistura sejam produzidos. Em algumas modalidades, o processador é configurado para permitir o fluxo dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos através das válvulas no reservatório fluídico. Em algumas modalidades, o processador é configurado para controlar o fluxo de fluido no reservatório fluídico. Em algumas modalidades, o fluxo compreende o movimento de um fluido compreendendo os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos dentro do reservatório fluídico, produzindo assim a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Por exemplo, o fluxo pode misturar as bacteriocinas de substratos de codificação diferentes uma vez que elas estejam presentes no reservatório fluídico,
produzindo assim a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico compreende um processador. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico não compreende por si só um processador, mas é configurado para ser colocado em comunicação de dados com o processador.
[0163]É considerado que uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas de acordo com métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades aqui pode ser formada a partir de duas ou mais submisturas. Por exemplo, uma submistura primária de bacteriocinas A e B em uma razão de 1:1 pode ser combinada com a mesma quantidade de uma submistura secundária de bacteriocinas B e C em uma razão de 1:1, produzindo assim uma mistura de bacteriocinas A, B e C em razões de 1:2:1. De acordo com os métodos e dispositivos microfluídicos de algumas modalidades descritas aqui, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende duas ou mais submisturas, cada uma compreendendo um subconjunto de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e o processador é configurado para permitir o fluxo de cada submistura no reservatório fluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende uma soma das submisturas de bacteriocinas em uma estequiometria e combinação específicas das submisturas produz a mistura na estequiometria específica.
Métodos para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas
[0164]Em algumas modalidades, um método para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas é fornecido. O método pode incluir produzir bacteriocinas da mistura específica, mas não outras bacteriocinas, por transcrição e tradução in vitro de bacteriocinas codificadas por substratos de codificação separados e depois misturar as bacteriocinas selecionadas da transcrição e tradução in vitro para produzir a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, o método inclui produzir bacteriocinas por transcrição e tradução in vitro de bacteriocinas codificadas por substratos de codificação separados e depois misturar as bacteriocinas da mistura específica, mas não outras bacteriocinas (se alguma) para produzir a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Em algumas modalidades, o método para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas é realizado em um dispositivo microfluídico como descrito aqui. Em algumas modalidades, o método é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e não peptídeos antimicrobianos. Em algumas modalidades, o método é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e não bacteriocinas. Em algumas modalidades, o método é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos.
[0165]A FIG 7 é um fluxograma ilustrando um método para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas 700 de algumas modalidades. O método pode compreender selecionar a mistura específica para compreender duas ou mais bacteriocinas específicas diferentes 710; em um dispositivo microfluídico compreendendo substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina: colocar substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro 720; incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro, gerando assim peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas codificados pelos substratos de codificação separados 730; e misturar as bacteriocinas no dispositivo microfluídico, produzindo assim a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas 740.
[0166]Em algumas modalidades, o método de produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende ainda produzir duas ou mais submisturas, cada uma compreendendo um subconjunto da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e combinar as submisturas para produzir a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas. Por exemplo, o método pode compreender realizar (a) a (d) como segue para produzir uma submistura primária específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas: (a) selecionar uma submistura para compreender dois ou mais peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos diferentes; (b) em um dispositivo microfluídico compreendendo substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina: colocar substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da submistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro; (c) incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro, gerando desse modo peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas codificados pelos substratos de codificação separados; (d) misturar os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no dispositivo microfluídico, produzindo desse modo a submistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas; repetir (a) a (d) para produzir uma submistura secundária específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas; e combinar a submistura primária específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e a submistura secundária específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas para produzir a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
[0167]Em algumas modalidades do método de produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, a seleção compreende ainda selecionar uma estequiometria dos dois ou mais peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos diferentes. Em algumas modalidades, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende uma estequiometria específica e combinar as submisturas resulta na estequiometria específica. Por exemplo, uma submistura primária de bacteriocina “A” pode ser combinada com uma submistura secundária de bacteriocinas “A” e “B” em uma razão de 1:1, para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas “A” e “B” em uma razão de 2:1.
[0168]Em algumas modalidades do método de produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro compreende fluir a solução de transcrição/tradução in vitro a cada substrato de codificação separado que codifica uma bacteriocina da mistura. Em algumas modalidades, o método compreende colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro, compreendendo (i) abrir as válvulas de modo a colocar uma fonte da solução de transcrição/tradução in vitro em comunicação de fluido com os substratos de codificação separados; (ii) fechar as válvulas de modo a inibir a comunicação de fluido entre a fonte da solução de transcrição/tradução in vitro e os outros substratos de codificação separados ou uma combinação de (i) e (ii). Em algumas modalidades, misturar os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no dispositivo microfluídico compreende abrir uma válvula para colocar os substratos de codificação separados em comunicação de fluido com um reservatório fluídico, em que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas são misturados no reservatório fluídico.
[0169]Em algumas modalidades, o método de produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende ainda triar a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas in situ quanto a um efeito desejado. Em algumas modalidades, a triagem é para a inibição do crescimento ou reprodução de um organismo microbiano patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar. Por exemplo, as bactérias patogênicas podem ser uma bactéria rapidamente evolutiva ou uma bactéria que exibe resistência a antibiótico, por exemplo MRSA. Em algumas modalidades, a triagem é quanto a uma ausência de efeitos deletérios da mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar. Em algumas modalidades, a triagem é realizada em tempo real. Por exemplo, a triagem pode ser realizada dentro de 120 minutos, 60 minutos, 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos ou 1 minuto da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas sendo gerada. Em algumas modalidades, a triagem é quanto à estabilização de um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina ou quanto à destruição de um biofilme microbiano. Em algumas modalidades, a triagem é quanto ao realce do crescimento ou reprodução de um organismo microbiano não patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar.
[0170]Alguns organismos microbianos podem evoluir facilmente.
Vantajosamente, os métodos, dispositivos e sistemas descritos aqui podem ser usados para combater os organismos microbianos rapidamente evolutivos produzindo-se rapidamente misturas de bacteriocinas específicas que são adaptadas a uma infecção de um sujeito pelo organismo microbiano. Em algumas modalidades, o sujeito é infectado com um estafilococo tal como MRSA, vírus influenza, vírus do Nilo Ocidental ou vírus Zika. Em algumas modalidades, o sujeito é diabético e/ou tem uma infecção em uma extremidade tal como uma mão ou pé.
[0171]Também visionado é o uso de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas em combinação com antibióticos químicos e/ou antibióticos de fago convencionais. Em algumas modalidades, um método como descrito aqui inclui o tratamento de uma infecção microbiana com uma combinação de uma mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos e um antibiótico químico e/ou um fago. Algumas modalidades compreendem liberar a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos, em combinação com um antibiótico químico e/ou um antibiótico de fago, a um sujeito. Além disso, em algumas modalidades, um dispositivo e/ou sistema microfluídico como descrito aqui compreende ainda um antibiótico convencional, por exemplo, um antibiótico de fago ou um antibiótico de molécula pequena tal como um metabólito. Em algumas modalidades, o dispositivo e/ou sistema microfluídico compreende ainda um reservatório de antibiótico. O antibiótico pode ser selecionado do grupo consistindo em Amoxicilina, Amoxicilina/ácido clavulânico (amoxicilina + ácido clavulânico), Ampicilina, Benzatina benzilpenicilina, Benzilpenicilina, Cefalexina, Cefazolina, Cefixima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Cloxacilina, Penicilina, Fenoximetilpenicilina (penicilina V), Piperacilina/tazobactam, Procaína benzilpenicilina, Ceftazidimaα, Meropenemα, Aztreonamα, Imipenem/cilastatina, Amicacina, Azitromicina[, Cloranfenicol, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Doxiciclina, Eritromicina, Gentamicina, Metronidazol, Nitrofurantoina, Espectinomicina, Trimetoprim/sulfametoxazol, Trimetoprim, Vancomicina, Clofazimina, Dapsona, Rifampicina, Etambutol/isoniazida, Etambutol/isoniazida/pirazinamida/rifampicina,
Etambutol/isoniazida/rifampicina, Isoniazida, Isoniazida/pirazinamida/rifampicina, Isoniazida/rifampicina, Pirazinamida, Rifabutina, Rifampicina, Rifapentina, Amicacina, Bedaquilina, Capreomicina, Clofazimina, Ciclosserina, Delamanida, Etionamida, Canamicina, Levofloxacina, Linezolida, Moxifloxacina, ácido p-aminosalicílico, rifabutina, rifapentina, rifalazila, rifaximina. Estreptomicina, um fago ou uma combinação de dois ou mais destes antibióticos.
[0172]Algumas modalidades do método de produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreendem ainda liberar a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas a um ferimento por intermédio de um tubo ou membrana, limpando ou curando desse modo o ferimento.
Por exemplo, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas pode ser colocada em um corte ou ferida aberta e depois o corte ou a ferida podem ser fechados e/ou bandados.
[0173]Algumas modalidades do método de produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas incluem uma lavagem do dispositivo microfluídico. A lavagem pode ser com um fluido de lavagem. Por exemplo, algumas modalidades incluem uma etapa de incubação com uma solução de transcrição, seguido por uma etapa de lavagem, seguido por uma incubação separada com uma solução de tradução.
[0174]Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas a um sujeito em necessidade de tratamento. Por exemplo, o sujeito pode ter uma infecção tal como um ferimento infectado, uma incisão cirúrgica e infecção das extremidades associadas com diabete e/ou um biofilme. A mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas pode ser selecionada para alvejar o(s) organismo(s) microbiano(s) da infecção (ou selecionada como um candidato para alvejar o(s) organismo(s) microbiano(s) da infecção) e pode ser produzida em um dispositivo microfluídico como descrito aqui. A mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas pode ser administrada ao sujeito como descrito aqui, por exemplo no sítio de infecção ou próximo ao mesmo. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico propriamente dito é diretamente aplicado à infecção (por exemplo, como uma bandagem inteligente como descrito aqui). Em algumas modalidades, o método compreende ainda selecionar o sujeito como tendo uma infecção em necessidade de tratamento. O método pode compreender ainda selecionar uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas para alvejar a infecção e produzir a mistura específica em um dispositivo microfluídico como descrito aqui. Também considerados são usos médicos do dispositivo microfluídico para tratar, inibir, prevenir e/ou reduzir o risco de uma infecção. Em algumas modalidades, o método (ou uso médico) compreende administrar a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas e um antibiótico como descrito aqui (por exemplo um antibiótico de molécula pequena e/ou um fago) ao sujeito.
[0175]Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para uso veterinário, por exemplo para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas para tratar uma infecção de um animal doméstico ou um animal de criação e/ou para promover o crescimento do animal. Vantajosamente, os usos da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas em animais de criação podem evitar o uso de antibióticos na produção de alimentos. Como observado em recomendações da Organização Mundial da Saúde, isso pode reduzir o desenvolvimento e proliferação de organismo microbiano resistente a antibiótico.
[0176]Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para o uso em um fermentador pequeno (por exemplo, um fermentador menor do que ou igual a100 litros, 50 litros, 40 litros, 30 litros, 20 litros, 10 litros, 5 litros, 2 litros ou 1 litro em volume, incluindo faixas entre quaisquer dois dos valores listados), por exemplo para produzir misturas específicas de bacteriocinas para alvejar um organismo contaminante no fermentador pequeno.
[0177]Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para o uso em esterilizar dispositivos médicos. Por exemplo, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas pode ser selecionada para alvejar contaminantes, tais como MRSA no dispositivo médico e pode ser aplicada ao dispositivo médico in loco, por exemplo em um hospital. Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para o uso em pré-tratar um implante com uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, de modo a inibir ou impedir a infecção e/ou formação de biofilme.
[0178]Em algumas modalidades, o dispositivo microfluídico é para o uso na defesa contra um patógeno, por exemplo em uma epidemia ou em defesa contra o bioterrorismo. Misturas específicas de bacteriocinas dirigidas contra o patógeno (por exemplo, agente de bioterrorismo) podem ser distribuídas aos sistemas como descrito aqui manualmente ou automaticamente e as misturas específicas de bacteriocinas que alvejam o patógeno (por exemplo, agente de bioterrorismo) podem ser produzidas em dispositivos microfluídicos no sítio do patógeno ou próximo ao mesmo (por exemplo, agente de bioterrorismo).
[0179]Em algumas modalidades, o método compreende ainda misturar a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas com um outro reagente ou composto antimicrobiano para produzir uma mistura final. Por exemplo, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas pode ser combinada com um produto químico ou um fluido natural. Em algumas modalidades, a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas é combinada com um antibiótico ou fago para produzir a mistura final. Em algumas modalidades, a mistura final é parte de uma formulação para uma terapia tal como, por exemplo, uma terapia anti-dor.
Exemplo 1:
[0180]Um ácido nucleico é fornecido que codifica uma cópia da sequência de codificação da bacteriocina Subtilina, duas cópias da sequência de codificação da bacteriocina Bavaricina-MN e uma cópia da sequência de codificação para o fator de quorum sensing BsEDF todos em uma estrutura de leitura única. O ácido nucleico codifica ainda sítios de clivagem para Caspase 2 na mesma estrutura de leitura, que flanqueia cada sequência de codificação de bacteriocina e a sequência de codificação de BsEDF. Como tal, o ácido nucleico codifica um pró-polipeptídeo que compreende uma cópia de Subtilina, duas cópias de Bavaricina-MN e uma cópia de BsEDF, cada uma flanqueada por sítios de clivagem de Caspase 2. O ácido nucleico é expressado em uma célula de E. coli, que não compreende a sequência de codificação para os moduladores de imunidade para qualquer uma de Subtilosina-A ou Bavaricina-MN e assim não produz moduladores de imunidade funcionais para estas bacteriocinas. O pró-polipeptídeo é produzido pela E. coli e contém Subtilina e Bavaricina-MN em suas formas inativas. O pró-polipeptídeo é purificado por via de sua etiqueta de His usando um substrato contendo níquel. O pró-polipeptídeo purificado depois é clivado usando Caspase 2, produzindo uma composição que compreende Subtilina, Bavaricina-MN e BsEDF em uma razão de 1:2:1. A composição é adicionada a uma matéria-prima industrial para impedir a proliferação de organismos microbianos indesejados (por intermédio das bacteriocinas) e para controlar o crescimento de B. subtilis geneticamente modificada (por intermédio do BsEDF).
Exemplo 2:
[0181]É determinado que uma razão das bacteriocinas Mundticina, Serracina- P, Turicina-17 e Plantaricina J de 1:2:3:4 é útil para alvejar uma população de células microbianas indesejadas no alimento para animal durante o armazenamento. Um ácido nucleico que codifica uma cópia da sequência de codificação de Mundticina, duas cópias da sequência de codificação de Serracina-P, três cópias da sequência de codificação de Turicina-17 e quatro cópias da sequência de codificação Plantaricina J é sintetizado. Todas as sequências de codificação de bacteriocina estão em uma estrutura de leitura única e cada sequência de codificação de bacteriocina é separada das outras sequências de codificação de bacteriocina por sequências que codificam os sítios de clivagem de Granzima B. O ácido nucleico também codifica GST na extremidade 3’ da estrutura de leitura aberta e imediatamente a jusante de uma sequência de codificação de sítio de clivagem de Granzima B. Assim, o ácido nucleico codifica um pró-peptídeo compreendendo Mundticina, Serracina-P, Turicina-17, Plantaricina J em uma razão de 4:3:2:1, respectivamente, junto com uma etiqueta de GST C-terminal. O ácido nucleico é expressado em um sistema de tradução in vitro, de modo a produzir o pró-polipeptídeo. O pró-polipeptídeo é purificado usando pérolas revestidas com GSH. O pró-polipeptídeo depois é clivado pela Granzima B, produzindo uma solução compreendendo Mundticina, Serracina-P, Turicina-17 e Plantaricina J ativas em uma razão de 1:2:3:4, respectivamente. O sítio de clivagem imediatamente adjacente à etiqueta de GST também é clivado, de modo que nenhuma das bacteriocinas compreenda GST. A composição compreendendo as bacteriocinas na razão de 1:2:3:4 é adicionada ao alimento para animal, alvejando assim a população de células microbianas indesejadas no alimento para animal. Exemplo 3:
[0182]UM dispositivo microfluídico é fornecido que compreende 244 câmaras.
Cada câmara compreende um substrato de codificação separado. Cada substrato de codificação separado é uma microplaqueta, cada microplaqueta compreendendo
10.000 a 20.000 DNAs. Cada uma das moléculas, codificando uma bacteriocina da Tabela 1.2. As moléculas de DNA em cada câmara codificam bacteriocinas separadas comparadas às moléculas de DNA em cada uma das outras câmaras. Cada uma das câmaras é conectada por uma válvula a um reservatório fluídico. O reservatório fluídico também é conectado por uma válvula a uma solução de transcrição/tradução alojada em uma câmara de solução de transcrição/tradução. O dispositivo inclui um processador configurado para abrir a válvula que conecta o reservatório fluídico à solução de transcrição/tradução para permitir que a solução de transcrição/tradução flua no reservatório fluídico, fechar a válvula que conecta o reservatório fluídico à solução de transcrição/tradução para impedir que o fluido flua de volta na câmara de solução de transcrição/tradução, abrir as válvulas que conectam o reservatório fluídico às câmaras que alojam os substratos de codificação selecionados para permitir que a solução de transcrição/tradução flua do reservatório fluídico nas câmaras que alojam os substratos de codificação selecionados, incubar os substratos de codificação selecionados a 37° C produzindo desse modo bacteriocinas dos substratos de codificação selecionado e abrir uma ou mais válvulas tais como as válvulas que conectam os substratos de codificação ao reservatório fluídico, para liberar as bacteriocinas no reservatório fluídico e/ou um receptáculo.
[0183]O dispositivo é conectado eletronicamente ou sem fio a um dispositivo de entrada do usuário tal como um telefone, ecrã tátil, teclado, tecla, mouse ou computador. O processador seleciona bacteriocinas com base na entrada do usuário que entrou no dispositivo de entrada do usuário ou de acordo com um conjunto pré- programado de instruções. Exemplo 4:
[0184]Um dispositivo como descrito aqui é usado para fabricar uma mistura específica primária de bacteriocinas. As bacteriocinas são aplicadas a um emplastro transdérmico que é aplicado a um sujeito com uma queimadura. Se a queimadura no sujeito não curar, o dispositivo é usado para fabricar uma mistura específica secundária de bacteriocinas diferente da mistura específica primária de bacteriocinas.
A mistura específica secundária de bacteriocinas depois é aplicada a um novo emplastro transdérmico que é aplicado à queimadura. Variações múltiplas de misturas específicas de bacteriocinas podem ser aplicadas à queimadura ou às queimaduras de vários sujeitos, dependendo se uma formulação particular de bacteriocinas for esperada ser benéfica para a cura da queimadura ou se uma formulação particular for desejada ser testada.
Opções
[0185]Além dos itens acima, as seguintes opções são apresentadas:
1. Método de fabricar bacteriocinas, o método compreendendo expressar um ácido nucleico compreendendo: uma sequência de codificação de bacteriocina e uma sequência de codificação de polipeptídeo secundário em uma estrutura de leitura única, em que o polipeptídeo secundário é uma bacteriocina ou molécula de sinal; e sequências de codificação de sítio de clivagem dispostas entre a sequência de codificação de bacteriocina e a sequência de codificação de polipeptídeo secundário na estrutura de leitura única, gerando desse modo um pró-polipeptídeo compreendendo a bacteriocina, polipeptídeo secundário e sítios de clivagem dispostos entre os mesmos.
2. Método, de acordo com a opção 1, compreendendo ainda clivar o sítio de clivagem, separando desse modo a bacteriocina e polipeptídeo secundário um do outro e produzindo desse modo uma composição compreendendo a bacteriocina e o polipeptídeo secundário.
3. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 ou 2, em que o polipeptídeo secundário é a bacteriocina.
4. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 ou 2, em que o polipeptídeo secundário é a molécula de sinal.
5. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 4, em que a expressão é realizada por uma célula microbiana que não produz um modulador de imunidade funcional para pelo menos uma das bacteriocinas.
6. Método, de acordo com a opção 5, em que a célula microbiana não produz um modulador de imunidade funcional para qualquer uma das bacteriocinas.
7. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 4, em que a expressão é realizada in vitro.
8. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 7, em que pelo menos uma das bacteriocinas é inativa quando a mesma é parte do pró-polipeptídeo.
9. Método, de acordo com qualquer uma das opções 2 a 8, compreendendo ainda isolar o pró-polipeptídeo antes da clivagem.
10. Método, de acordo com a opção 9, em que o dito isolamento compreende purificação por afinidade do pró-polipeptídeo, em que a purificação por afinidade compreende ligar uma etiqueta de afinidade codificada pelo ácido nucleico.
11. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 8, em que o ácido nucleico compreende três sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única.
12. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 3 ou 5 a 11, em que pelo menos duas das bacteriocinas são diferentes uma da outra.
13. Método, de acordo com qualquer uma das opções 2 a 12, em que a composição compreende uma razão desejada de bacteriocinas ou uma razão desejada de moléculas de sinal e bacteriocinas.
14. Método, de acordo com a opção 13, em que pelo menos uma porção da razão desejada é obtida por uma razão de sequências de codificação de bacteriocina ou sequências de codificação de bacteriocina e molécula de sinal na estrutura de leitura única do ácido nucleico.
15. Método, de acordo com qualquer uma das opções 12 a 14, em que a razão desejada é obtida ainda por um ácido nucleico secundário compreendendo uma razão de sequências de codificação de bacteriocinas e compreendendo ainda sítios de clivagem entre as sequências de codificação de bacteriocina.
16. Método, de acordo com a opção 15, em que a razão desejada é obtida por uma razão de sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única do ácido nucleico.
17. Método, de acordo com qualquer uma das opções 12 a 16, em que a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados, e/ou em que a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma raiz de planta ou solo.
18. Método, de acordo com qualquer uma das opções 12 a 16, em que a razão desejada de bacteriocinas e moléculas de sinal é selecionada para controlar o desvio genético de uma célula microbiana alvo e estimular o crescimento ou a produção de uma célula produtora.
19. Método, de acordo com qualquer uma das opções 10 a 18, em que a razão desejada compreende uma razão de uma bacteriocina primária para uma bacteriocina secundária de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 2:3, 2:5, 2:7, 2:9, 3:4, 3:5, 3:7, 3:8, 3:10, 4:5, 4:7, 4:9, 5:6, 5:7, 5:8, 5:9, 6:7, 7:8, 7:9, 7:10, 8:9 ou 9:10, em que a bacteriocina primária é diferente da bacteriocina secundária.
20. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 18, em que os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem do tipo selvagem, variante ou sintética, tal como uma endopeptidase.
21. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 20, em que os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem selecionada do grupo consistindo em: Arg-C proteinase, Asp-N endopeptidase, BNPS-Skatol, Caspase 1, Caspase 2, Caspase 3, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 6, Caspase 7, Caspase 8, Caspase 9, Caspase 10, Quimiotripsina de especificidade alta, Clostripain (Clostridiopeptidase B), CNBr, Enterocinase, Fator Xa, Ácido fórmico, Glutamil endopeptidase, Granzima B, Hidroxilamina, Ácido iodosobenzoico, LysC, Neutrófilo elastase, NTCB (ácido 2-nitro-
5-tiocianobenzoico), Pepsina (pH 1,3), Pepsina (pH >2), Prolina-endopeptidase, Proteinase K, Peptidase I estafilocócica, Termolisina, Tromina ou Tripsina.
22. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 21, em que os sítios de clivagem são para uma única enzima de clivagem e em que a enzima de clivagem não cliva dentro das bacteriocinas.
23. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 22, em que pelo menos um sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem primária e um outro sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem secundária e em que nem a enzima de clivagem primária nem a secundária cliva dentro das bacteriocinas.
24. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 23, em que a composição compreende ainda uma molécula de sinal e em que o nucleotídeo compreende ainda: uma sequência de codificação para uma molécula de sinal na estrutura de leitura única; e uma sequência de sítio de clivagem disposta entre a molécula de sinal e uma sequência de codificação de bacteriocina.
25. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 2 ou 4 a 24, em que a molécula de sinal é selecionada do grupo consistindo em: moléculas de quorum sensing, ligantes de receptor de transdução de sinal, fatores de crescimento, hormônios e citocinas e em que a molécula de sinal pode ser do tipo selvagem, mutante ou sintética.
26. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 25, em que o pró- polipeptídeo tem um comprimento de não mais do que cerca de 2000 aminoácidos.
27. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 26, compreendendo ainda expressar um ácido nucleico secundário que codifica um pró-polipeptídeo secundário compreendendo duas bacteriocinas e sítios de clivagem dispostos entre as mesmas, em que o pró-polipeptídeo secundário é diferente do pró-polipeptídeo primário.
28. Método, de acordo com qualquer uma das opções 2 a 19 ou 24 a 27, em que a clivagem do pró-polipeptídeo compreende o tratamento físico de um ligador de peptídeo compreendido pelo sítio de clivagem, em que o ligador de peptídeo é sensível a produto químico ou sensível ao pH.
29. Método, de acordo com qualquer uma das opções 1 a 28, compreendendo ainda modificar quimicamente as bacteriocinas.
30. Método, de acordo com a opção 29, em que as bacteriocinas são quimicamente modificadas co-traducionalmente.
31. Método, de acordo com qualquer uma das opções 2 a 30, compreendendo ainda modificar quimicamente as bacteriocinas a seguir da clivagem.
32. Ácido nucleico isolado, compreendendo: uma sequência de codificação de bacteriocina e uma sequência de codificação de polipeptídeo secundário em uma estrutura de leitura única, em que o polipeptídeo secundário é uma bacteriocina ou uma molécula de sinal; e sequências de codificação de sítio de clivagem dispostas entre as sequências de codificação de bacteriocina e na estrutura de leitura única.
33. Ácido nucleico isolado, de acordo com a opção 32, em que o polipeptídeo secundário é a bacteriocina.
34. Ácido nucleico isolado, de acordo com a opção 32, em que o polipeptídeo secundário é a molécula de sinal.
35. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 a 34, em que as sequências de codificação de sítio de clivagem codificam sítios de clivagem para uma enzima de clivagem e em que as sequências de codificação de bacteriocina não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem.
35. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 a 35, em que o ácido nucleico compreende três sequências de codificação de bacteriocina na estrutura de leitura única.
36. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 a 35, em que o ácido nucleico compreende pelo menos 5, 10, 15 ou 20 sequências de bacteriocina na estrutura de leitura única.
37. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 a 36, em que uma sequência de codificação de sítio de clivagem é disposta em estrutura entre quaisquer duas sequências de codificação de bacteriocina e/ou molécula de sinal adjacentes.
38. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 a 36, em que pelo menos duas das sequências de bacteriocina codificam bacteriocinas diferentes entre si.
39. Ácido nucleico isolado, de acordo com a opção 35, em que as três sequências de bacteriocina estão presentes em uma razão desejada ou porção de uma razão desejada.
40. Ácido nucleico isolado, de acordo com a opção 39, em que a razão desejada é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados.
41. Ácido nucleico isolado, de acordo com a opção 39, em que a razão desejada de bacteriocinas é selecionado para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma raiz de planta ou solo.
42. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 a 41, em que os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem do tipo selvagem, variante ou sintética, tal como uma endopeptidase.
43. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 a 42, em que os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem selecionada do grupo consistindo em: Arg-C proteinase, Asp-N endopeptidase, BNPS-Skatol, Caspase 1, Caspase 2, Caspase 3, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 6, Caspase 7, Caspase 8,
Caspase 9, Caspase 10, Quimiotripsina de especificidade alta, Clostripain (Clostridiopeptidase B), CNBr, Enterocinase, Fator Xa, Ácido fórmico, Glutamil endopeptidase, Granzima B, Hidroxilamina, Ácido iodosobenzoico, LysC, Neutrófilo elastase, NTCB (ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico), Pepsina (pH 1,3), Pepsina (pH >2), Prolina-endopeptidase, Proteinase K, Peptidase I estafilocócica, Termolisina, Tromina ou Tripsina.
44. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 42 a 43, em que uma sequência de codificação de sítio de clivagem primária codifica um sítio de clivagem primária para uma enzima de clivagem primária e em que uma sequência de codificação de sítio de clivagem secundária codifica um sítio de clivagem para uma enzima de clivagem secundária que é diferente da enzima de clivagem primária e em que as bacteriocinas não compreendem um sítio de clivagem para nenhuma da enzima de clivagem primária ou secundária.
45. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 a 41, em que os sítios de clivagem compreendem um ligador sensível ao pH ou quimicamente sensível.
46. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32, 33 ou 35 a 44, em que o ácido nucleico isolado compreende ainda uma sequência de codificação para uma molécula de sinal na estrutura de leitura única, em que uma sequência de codificação de sítio de clivagem é disposta entre a sequência de codificação para a molécula de sinal e uma sequência de codificação de bacteriocina adjacente.
47. Ácido nucleico isolado, de acordo com qualquer uma das opções 32 ou 24 a 46, em que a molécula de sinal é selecionada do grupo consistindo em: moléculas de quorum sensing, ligantes de receptor de transdução de sinal, fatores de crescimento, hormônios e citocinas e em que a molécula de sinal pode ser do tipo selvagem, mutante ou sintética.
48. Célula microbiana, compreendendo um promotor operavelmente ligado ao ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das opções 32 a 47, em que a célula microbiana isolada não produz um modulador de imunidade funcional para uma bacteriocina codificada pelo ácido nucleico isolado.
49. Célula microbiana, de acordo com a opção 48, em que a célula não produz um modulador de imunidade funcional para qualquer uma das bacteriocinas codificadas pelo ácido nucleico isolado.
50. Pró-polipeptídeo isolado, compreendendo: duas bacteriocinas e/ou uma bacteriocina e uma molécula de sinal; sítios de clivagem dispostos entre as bacteriocinas e/ou a bacteriocina e a molécula de sinal; e uma etiqueta de afinidade.
51. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com a opção 50, em que o pró- polipeptídeo compreende as duas bacteriocinas.
52. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com a opção 50, em que o pró- polipeptídeo compreende a bacteriocina e a molécula de sinal.
53. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das opções 50 a 52, em que o pró-polipeptídeo compreende três bacteriocinas.
54. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das opções 50 a 52, em que o pró-polipeptídeo compreende pelo menos 5, 10, 15 ou 20 bacteriocinas.
55. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das opções 50, 51, 53 ou 54, em que o pró-polipeptídeo compreende uma molécula de sinal.
56. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das opções 50 a 55, em que os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem e em que as sequências de codificação de bacteriocina não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem.
57. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das opções 50 a
55, em que um sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem primária e em que um outro sítio de clivagem é para uma enzima de clivagem secundária diferente da enzima de clivagem primária e em que as bacteriocinas não compreendem um sítio de clivagem para nenhuma das enzimas de clivagem primárias ou secundárias.
58. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das opções 50 a 57, compreendendo ainda uma modificação co-traducional ou pós-traducional.
59. Composição, compreendendo duas ou mais bacteriocinas em uma razão selecionada para alvejar uma célula microbiana ou populações de células microbianas, em que cada uma das bacteriocinas compreende, em seu término N, término C ou término N e término C, uma porção de uma sequência de clivagem que foi clivada, em que as porções de sequências de clivagem nos términos N, C ou N e C das bacteriocinas são para sítios de clivagem da mesma enzima de clivagem ou diferente.
60. Composição, de acordo com a opção 59, em que pelo menos algumas das bacteriocinas compreendem ainda uma etiqueta.
61. Composição, de acordo com a opção 60, em que a etiqueta é selecionada do grupo consistindo em etiquetas de afinidade, uma sequência de sinal ou uma etiqueta de estabilidade.
62. Composição, de acordo com qualquer uma das opções 59 a 61, compreendendo ainda uma molécula de sinal em uma razão desejada com as bacteriocinas, em que a molécula de sinal compreende, em seu término N, término C ou término N e término C, uma porção de uma sequência de clivagem que foi clivada, em que as porções de sequências de clivagem nos términos N, C ou N e C da molécula de sinal são para sítios de clivagem das mesmas enzimas de clivagem ou diferentes.
63. Composição, de acordo com qualquer uma das opções 59 a 62, em que a razão de bacteriocinas é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados.
64. Composição, de acordo com qualquer uma das opções 59 a 63, em que a razão de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma raiz de planta ou solo.
65. Composição, de acordo com a opção 64, em que a composição é formulada para administração tópica ou oral a um sujeito humano.
66. Composição, de acordo com a opção 64 ou 65, em que a composição é formulada para o uso em equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma raiz de planta ou solo.
67. Método para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e/ou peptídeos antimicrobianos, o método compreendendo: selecionar a mistura para compreender duas ou mais bacteriocinas e/ou peptídeos antimicrobianos diferentes; em um dispositivo microfluídico compreendendo substratos de codificação separados de modo que cada um codifique uma bacteriocina ou peptídeo antimicrobiano: colocar substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos ou bacteriocinas da mistura específica em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro; incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro, gerando desse modo peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas codificados pelos substratos de codificação separados; e misturar os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no dispositivo microfluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
68. Método, de acordo com a opção 67, compreendendo ainda: produzir duas ou mais submisturas, cada uma compreendendo um subconjunto da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas; e combinar as submisturas para produzir a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
69. Método, de acordo com a opção 67 ou 68, em que a seleção compreende ainda selecionar uma estequiometria dos dois ou mais peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas diferentes da mistura específica.
70. Método, de acordo com qualquer uma das opções 68 a 69, em que a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende uma estequiometria específica e em que combinar as submisturas resulta na estequiometria específica.
71. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 70, em que os substratos de codificação separados são compreendidos dentro de câmaras separadas.
72. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 71, em que os substratos de codificação separados compreendem ácidos nucleicos imobilizados nestes.
73. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 72, em que os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, mas não outros substratos de codificação separados, são colocados em comunicação fluídica com a solução de transcrição/tradução in vitro.
74. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 73, em que incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro compreende fluir a solução de transcrição/tradução in vitro em cada câmara.
75. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 74, em que a solução de transcrição/tradução in vitro compreende um reagente de transcrição in vitro e/ou um reagente de tradução in vitro.
76. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 75, em que colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro compreende (i) abrir as válvulas de modo a colocar uma fonte da solução de transcrição/tradução in vitro em comunicação de fluido com os substratos de codificação separados; (ii) fechar as válvulas de modo a inibir a comunicação de fluido entre a fonte da solução de transcrição/tradução in vitro e os outros substratos de codificação separados ou uma combinação de (i) e (ii).
77. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 76, em que misturar os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no dispositivo microfluídico compreende abrir uma válvula para colocar os substratos de codificação separados em comunicação de fluido com um reservatório fluídico, em que os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas são misturados no reservatório fluídico.
78. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 77, compreendendo ainda triar a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas in situ quanto a um efeito desejado.
79. Método, de acordo com a opção 78, em que a triagem é para a inibição do crescimento ou reprodução de um organismo microbiano patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar.
80. Método, de acordo com a opção 78, em que a triagem é quanto a uma ausência de efeitos deletérios da mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas sobre um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar.
81. Método, de acordo com a opção 78, em que a dita triagem é realizada em tempo real.
82. Método, de acordo com a opção 78, em que a triagem é quanto à estabilização de um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina ou quanto à destruição de um biofilme microbiano.
83. Método, de acordo com a opção 82, em que um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar com atividade anti-protease.
84. Método, de acordo com a opção 78, em que a triagem é quanto ao realce do crescimento ou reprodução de um organismo microbiano não patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar.
85. Método, de acordo com a opção 84, em que um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar que atrai o organismo microbiano não patogênico ou que realça o crescimento ou a reprodução do organismo microbiano não patogênico no microbioma de um sujeito.
86. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 85, compreendendo ainda liberar a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas a um ferimento por intermédio de um tubo ou membrana, limpando ou curando desse modo o ferimento.
87. Dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, o dispositivo compreendendo: substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina; uma solução de transcrição/tradução in vitro; um reservatório fluídico; e válvulas, cada uma disposta em um caminho fluídico entre um substrato de codificação separado e o reservatório fluídico, cada válvula configurada para regular o fluxo entre o substrato de codificação separado e o reservatório fluídico, em que o dispositivo é configurado para ser colocado em comunicação de dados com um processador configurado para: com base na mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico; permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, por meio da qual os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica são produzidos; permitir o fluxo dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas através das válvulas no reservatório fluídico; e controlar o fluxo de fluido no reservatório fluídico, em que o fluxo compreende o movimento dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico.
88. Dispositivo microfluídico, de acordo com a opção 87, em que: a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende duas ou mais submisturas, cada uma compreendendo um subconjunto de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas; e o processador é configurado para permitir o fluxo de cada submistura no reservatório fluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
89. Dispositivo microfluídico, de acordo com a opção 88, em que a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende uma soma dos subconjuntos de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas em uma estequiometria específica e em que a combinação das submisturas produz a estequiometria específica.
90. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 89, em que os substratos de codificação separados são compreendidos dentro de câmaras separadas.
91. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 90, em que os substratos de codificação separados compreendem ácidos nucleicos imobilizado neste.
92. Dispositivo microfluídico, de acordo com a opção 91, em que os substratos de codificação separados compreendem um material ou produto selecionado do grupo consistindo em uma microplaqueta, pérola, nanopartícula, poço, membrana, matriz, plástico, metal, vidro, polímero, polissacarídeo e composto paramagnético.
93. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 92, em que a solução de transcrição/tradução in vitro compreende um reagente de transcrição in vitro e/ou um reagente de tradução in vitro.
94. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 93, em que o dispositivo é portátil.
95. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 94, em que um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar compreendendo uma proteína para a estabilização de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, uma proteína com atividade anti-protease ou uma proteína para a destruição de um biofilme microbiano.
96. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 95, em que um ou mais dos substratos de codificação separados codificam uma proteína auxiliar que atrai um organismo microbiano não patogênico ou que realça o crescimento ou a reprodução do organismo microbiano não patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar.
97. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 96, em que o reservatório fluídico é configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um tecido de um sujeito.
98. Dispositivo microfluídico, de acordo com a opção 97, em que o tecido compreende um microbioma, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva ou trato biliar.
99. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 98, em que o reservatório fluídico é configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um ferimento de um sujeito.
100. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 97 a 99, compreendendo ainda uma passagem fluídica tal como um tubo ou membrana através dos quais o reservatório fluídico está em comunicação de fluido com o microbioma ou ferimento, através dos quais a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas é capaz de ser liberada ao microbioma ou ferimento.
101. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 100, em que cada substrato de codificação separado codifica um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina diferente.
102. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 102, em que um substrato de codificação separado compreende o ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das opções 32 a 49.
103. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a
102, em que um substrato de codificação separado codifica o pró-polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma das opções 50 a 58.
104. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 103, compreendendo ainda o processador.
105. Sistema compreendendo: o dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das opções 87 a 104, e um processador configurado para: com base na mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico; permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, por meio da qual os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica são produzidos; permitir o fluxo dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas através das válvulas no reservatório fluídico; e controlar o fluxo de fluido no reservatório fluídico, em que o fluxo compreende o movimento dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico.
106. Sistema, de acordo com a opção 105, em que o dispositivo microfluídico é compreendido por um cartucho (ou é um cartucho), o sistema compreendendo um acoplamento para colocar o cartucho em comunicação de dados com o processador.
107. Sistema, de acordo com qualquer uma das opções 105 a 106,
compreendendo ainda um reservatório de solução de transcrição/tradução in vitro.
108. Dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, o dispositivo compreendendo: substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina; válvulas, cada uma disposta em um caminho fluídico conectado a um substrato de codificação separado, cada válvula configurada para regular o fluxo para o substrato de codificação separado ou a partir do mesmo e em que o dispositivo é configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um reservatório fluídico ou uma solução de transcrição/tradução in vitro.
109. Dispositivo microfluídico, de acordo com a opção 108, compreendendo ainda um reservatório fluídico ou uma solução de transcrição/tradução in vitro.
110. Método, de acordo com a opção 78, em que o efeito desejado compreende a atividade antimicrobiana.
111. Método, de acordo com a opção 110, compreendendo ainda triar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 misturas diferentes contra uma infecção microbiana.
112. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 86, compreendendo ainda liberar a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos, em combinação com um antibiótico químico e/ou um antibiótico de fago, a um sujeito.
113. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 86, em que a solução de transcrição/tradução in vitro é liofilizada e compreendendo ainda adicionar água à solução de transcrição/tradução in vitro.
114. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 104, compreendendo ainda um reservatório de antibióticos químicos ou de fago configurado para misturar com a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos.
115. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 104, compreendendo ainda um antibiótico compreendendo um antibiótico químico e/ou um fago.
116. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 104, em que a solução de transcrição/tradução in vitro é liofilizada.
117. Sistema, de acordo com qualquer uma das opções 105 a 107, compreendendo ainda um reservatório de antibióticos químicos ou de fago configurado para misturar com a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos.
118. Sistema, de acordo com qualquer uma das opções 105 a 107, compreendendo ainda um antibiótico compreendendo um antibiótico químico e/ou um fago.
119. Sistema, de acordo com a opção 107, em que a solução de transcrição/tradução in vitro é liofilizada.
120. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 86 e 110 a 113, em que o método é para fabricar uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos que não compreendem bacteriocinas.
121. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 86 e 110 a 113, em que o método é para fabricar uma mistura específica de bacteriocinas que não compreende peptídeos antimicrobianos.
122. Método, de acordo com qualquer uma das opções 67 a 86 e 110 a 113, em que o método é para fabricar uma mistura específica de bacteriocinas e peptídeos antimicrobianos.
123. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 104, 108, 109 e 114 a 116, em que o dispositivo é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas que não compreende peptídeos antimicrobianos.
124. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a
104, 108, 109 e 114 a 116, em que o dispositivo é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos que não compreendem bacteriocinas.
125. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das opções 87 a 104, 108, 109 e 114 a 116, em que o dispositivo é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e bacteriocinas.
126. Sistema, de acordo com qualquer uma das opções 105 a 107 e 117 a 119, em que o sistema é para produzir uma mistura específica de bacteriocinas que não compreende peptídeos antimicrobianos.
127. Sistema, de acordo com qualquer uma das opções 105 a 107 e 117 a 119, em que o sistema é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos que não compreendem bacteriocinas.
128. Sistema, de acordo com qualquer uma das opções 105 a 107 e 117 a 119, em que o sistema é para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e bacteriocinas.
[0186]Em pelo menos algumas das modalidades descritas aqui, um ou mais elementos usados em uma modalidade podem ser permutavelmente usados em uma outra modalidade a menos que uma tal substituição não seja tecnicamente factível.
Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que várias outras omissões, adições e modificações podem ser feitas aos métodos e estruturas descritos aqui sem divergir do escopo do assunto reivindicado. Todas as tais modificações e mudanças são intencionadas a cair dentro do escopo do assunto, como definido pelas reivindicações anexas.
[0187]Com respeito ao uso de substancialmente quaisquer termos no plural e/ou singular aqui, aqueles tendo habilidade na técnica podem traduzir do plural ao singular e/ou do singular ao plural conforme apropriado ao contexto e/ou aplicação.
As várias permutações de singular/plural podem ser expressamente apresentadas aqui para clareza.
[0188]Será entendido por aqueles dentro da técnica que, em geral, termos usados aqui e especialmente nas reivindicações anexas (por exemplo, corpos das reivindicações anexas) são geralmente intencionados como termos “abertos” (por exemplo, o termo “incluindo” deve ser interpretado como “incluindo, mas não limitado a”, o termo “tendo” deve ser interpretado como “tendo pelo menos”, o termo “inclui”
deve ser interpretado como “inclui, mas não é limitado a”, etc.). Será entendido ainda por aqueles dentro da técnica que se um número específico de uma recitação introduzida na reivindicação for intencionado, uma tal intenção será explicitamente relatada na reivindicação e na ausência de tal recitação nenhuma tal intenção está presente.
Por exemplo, como um auxílio ao entendimento, as reivindicações anexas seguintes podem conter o uso das frases introdutórias “pelo menos um” e “um ou mais” para introduzir as recitações de reivindicação.
Entretanto, o uso de tais frases não deve ser interpretado como implicando que a introdução de uma recitação de reivindicação pelos artigos indefinidos “um” ou “uma” limita qualquer reivindicação particular contendo tal recitação de reivindicação introduzida às modalidades contendo apenas uma tal recitação, mesmo quando a mesma reivindicação inclui as frases introdutórias “um ou mais” ou “pelo menos um” e artigos indefinidos tais como
“um” ou “uma” (por exemplo, “um” e/ou “uma” deve ser interpretado como significando “pelo menos um” ou “um ou mais”); o mesmo permanece verdadeiro para o uso de artigos definidos usados para introduzir recitações de reivindicação.
Além disso,
mesmo se um número específico de uma recitação de reivindicação introduzida for explicitamente relatado, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que tal recitação deve ser interpretada como significando pelo menos o número relatado (por exemplo,
a recitação básica de “duas recitações”, sem outros modificadores, significa pelo menos duas recitações ou duas ou mais recitações). Além disso, naqueles exemplos onde um análogo de convenção a “pelo menos um de A, B e C, etc”. é usado, em geral uma tal construção é intencionada no sentido de que uma pessoa tendo habilidade na técnica entenderia a convenção (por exemplo, “um sistema tendo pelo menos um de A, B e C” incluiria, mas não seria limitado aos sistemas que têm A sozinho, B sozinho, C sozinho, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos e/ou A, B e C juntos, etc.). Naqueles exemplos onde um análogo de convenção a “pelo menos um de A, B ou C, etc”. é usado, em geral uma tal construção é intencionada no sentido de que uma pessoa tendo habilidade na técnica entenderia a convenção (por exemplo, “um sistema tendo pelo menos um de A, B ou C” incluiria, mas não seria limitado aos sistemas que têm A sozinho, B sozinho, C sozinho, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos e/ou A, B e C juntos, etc.). Será entendido ainda por aqueles dentro da técnica que virtualmente qualquer palavra e/ou frase disjuntiva apresentando dois ou mais termos alternativos, se na descrição, reivindicações ou desenhos, deve ser entendida como considerando as possibilidades de incluir um dos termos, qualquer um dos termos ou ambos os termos. Por exemplo, a frase “A ou B” será entendida como incluindo as possibilidades de “A” ou “B” ou “A e B”.
[0189]Além disso, onde características ou aspectos da divulgação são descritos em termos de grupos de Markush, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a divulgação também é descrita deste modo em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.
[0190]Como será entendido por uma pessoa de habilidade na técnica, para quaisquer e todos os propósitos, tal como em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas divulgadas aqui também abrangem quaisquer e todas as subfaixas e combinações de subfaixas possíveis destes. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como suficientemente descrevendo e permitindo a mesma faixa sendo decomposta em pelo menos metades, terços, quartos, quintos, décimos iguais, etc. Como um exemplo não limitante, cada faixa debatida aqui pode ser facilmente decomposta em um terço inferior, terço médio e terço superior, etc. Como também será entendido por uma pessoa habilitada na técnica toda a linguagem tal como “até”, “pelo menos”, “maior do que”, “menor do que”, e semelhantes inclui o número relatado e se refere a faixas que podem ser subsequentemente decompostas em subfaixas como debatido aqui. Finalmente, como será entendido por uma pessoa habilitada na técnica, uma faixa inclui cada membro individual. Assim, por exemplo, um grupo tendo 1 a 3 artigos se refere a grupos tendo 1, 2 ou 3 artigos. Similarmente, um grupo tendo 1 a 5 artigos se refere a grupos tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 artigos e assim por diante.
[0191]Embora vários aspectos e modalidades tenham sido divulgados aqui, outro aspectos e modalidades serão evidentes àqueles de habilidade na técnica. Os vários aspectos e modalidades divulgados aqui são para propósitos de ilustração e não são intencionados a ser limitantes, com o escopo e espírito verdadeiros sendo indicados pelas reivindicações seguintes.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de fabricar bacteriocinas, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende expressar um ácido nucleico compreendendo: uma sequência de codificação de bacteriocina e uma sequência de codificação de polipeptídeo secundário em uma estrutura de leitura única, em que o polipeptídeo secundário é uma bacteriocina ou molécula de sinal; e sequências de codificação de sítio de clivagem dispostas entre a sequência de codificação de bacteriocina e a sequência de codificação de polipeptídeo secundário na estrutura de leitura única, gerando desse modo um pró-polipeptídeo compreendendo a bacteriocina, polipeptídeo secundário e sítios de clivagem dispostos entre os mesmos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda clivar o sítio de clivagem, separando desse modo a bacteriocina e o polipeptídeo secundário um do outro e produzindo desse modo uma composição compreendendo a bacteriocina e o polipeptídeo secundário.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão é realizada por uma célula microbiana que não produz um modulador de imunidade funcional para pelo menos uma das bacteriocinas.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das bacteriocinas é inativa quando ela é parte do pró- polipeptídeo.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende uma razão desejada de bacteriocinas, ou uma razão desejada de moléculas de sinal e bacteriocinas.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma porção da razão desejada é obtida por uma razão de sequências de codificação de bacteriocina, ou sequências de codificação de bacteriocina e molécula de sinal na estrutura de leitura única do ácido nucleico.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para alvejar um organismo microbiano indesejado ou população de organismos microbianos indesejados, e/ou em que a razão desejada de bacteriocinas é selecionada para equilibrar uma população de um microbioma de um animal, um órgão humano, uma raiz de planta, ou solo.
8. Ácido nucleico isolado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma sequência de codificação de bacteriocina e uma sequência de codificação de polipeptídeo secundário em uma estrutura de leitura única, em que o polipeptídeo secundário é uma bacteriocina ou uma molécula de sinal; e sequências de codificação de sítio de clivagem dispostas entre as sequências de codificação de bacteriocina e na estrutura de leitura única.
9. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que as sequências de codificação de sítio de clivagem codificam sítios de clivagem para uma enzima de clivagem e em que as sequências de codificação de bacteriocina não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem.
10. Célula microbiana, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um promotor operavelmente ligado ao ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, em que a célula microbiana não produz um modulador de imunidade funcional para uma bacteriocina codificada pelo ácido nucleico isolado.
11. Pró-polipeptídeo isolado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: duas bacteriocinas, e/ou uma bacteriocina e uma molécula de sinal; sítios de clivagem dispostos entre as bacteriocinas e/ou a bacteriocina e a molécula de sinal; e uma etiqueta de afinidade.
12. Pró-polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que os sítios de clivagem são para uma enzima de clivagem e em que as sequências de codificação de bacteriocina não compreendem sítios de clivagem para a enzima de clivagem.
13. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende duas ou mais bacteriocinas em uma razão selecionada para alvejar uma célula microbiana ou populações de célula microbianas, em que cada uma das bacteriocinas compreende, em seu término N, término C, ou término N e término C, uma porção de uma sequência de clivagem que foi clivada, em que as porções de sequências de clivagem nos términos N, C, ou N e C das bacteriocinas são para sítios de clivagem da mesma enzima de clivagem ou diferente.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos algumas das bacteriocinas compreendem ainda uma etiqueta.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a etiqueta é selecionada do grupo consistindo em etiquetas de afinidade, uma sequência de sinal, ou uma etiqueta de estabilidade.
16. Método para produzir uma mistura específica de bacteriocinas e/ou peptídeos antimicrobianos, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: selecionar a mistura para compreender duas ou mais bacteriocinas e/ou peptídeos antimicrobianos diferentes; em um dispositivo microfluídico compreendendo substratos de codificação separados de modo que cada um codifique uma bacteriocina ou peptídeo antimicrobiano: colocar substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos ou bacteriocinas da mistura específica em comunicação de fluido com uma solução de transcrição/tradução in vitro; incubar os substratos de codificação separados com a solução de transcrição/tradução in vitro, gerando desse modo peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas codificados pelos substratos de codificação separados; e misturar os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no dispositivo microfluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda: produzir duas ou mais submisturas, cada uma compreendendo um subconjunto da mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas; e combinar as submisturas para produzir a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que selecionar compreende ainda selecionar uma estequiometria dos dois ou mais peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas diferentes da mistura específica.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende uma estequiometria específica e em que combinar as submisturas resulta na estequiometria específica.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que os substratos de codificação separados são compreendidos dentro de câmaras separadas.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que de substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, mas não outros substratos de codificação separados, são colocados em comunicação fluídica com a solução de transcrição/tradução in vitro.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda triar a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas in situ para um efeito desejado.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a triagem é para o realce do crescimento ou reprodução de um organismo microbiano não patogênico em um microbioma de um sujeito, tal como uma pele, intestino, trato gastrointestinal, glândula mamária, placenta, tecido, biofluido, fluido seminal, útero, vagina, folículo ovariano, pulmão, saliva, cavidade oral, mucosa, conjuntiva, ou trato biliar.
24. Dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, o dispositivo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina; uma solução de transcrição/tradução in vitro; um reservatório fluídico; e válvulas, cada uma disposta em um caminho fluídico entre um substrato de codificação separado e o reservatório fluídico, cada válvula configurada para regular o fluxo entre o substrato de codificação separado e o reservatório fluídico, em que o dispositivo é configurado para ser colocado em comunicação de dados com um processador configurado para: com base na mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico;
permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, por meio da qual os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica são produzidos; permitir o fluxo dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas através das válvulas no reservatório fluídico; e controlar o fluxo de fluido no reservatório fluídico, em que o fluxo compreende o movimento dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico.
25. Dispositivo microfluídico, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que: a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende duas ou mais submisturas, cada uma compreendendo um subconjunto de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas; e o processador é configurado para permitir o fluxo de cada submistura no reservatório fluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas.
26. Dispositivo microfluídico, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas compreende uma soma dos subconjuntos de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas em uma estequiometria específica e em que a combinação das submisturas produz a estequiometria específica.
27. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que os substratos de codificação separados são compreendidos dentro de câmaras separadas.
28. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações
24 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o reservatório fluídico é configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um tecido de um sujeito.
29. Dispositivo microfluídico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda o processador.
30. Sistema, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: o dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, e um processador configurado para: com base na mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, configurar as válvulas para colocar os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura, mas não outros substratos de codificação separados, em comunicação fluídica com o reservatório fluídico; permitir a incubação da solução de transcrição/tradução in vitro com os substratos de codificação separados que codificam os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica, por meio da qual os peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas da mistura específica são produzidos; permitir o fluxo dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas através das válvulas no reservatório fluídico; e controlar o fluxo de fluido no reservatório fluídico, em que o fluxo compreende o movimento dos peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico, produzindo desse modo a mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas no reservatório fluídico.
31. Sistema, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o dispositivo microfluídico é compreendido por um cartucho, o sistema compreendendo um acoplamento para colocar o cartucho em comunicação de dados com o processador.
32. Sistema, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a solução de transcrição/tradução in vitro é liofilizada.
33. Dispositivo microfluídico para produzir uma mistura específica de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas, o dispositivo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: substratos de codificação separados de modo que cada um codifique um peptídeo antimicrobiano e/ou bacteriocina; válvulas, cada uma disposta em um caminho fluídico conectado a um substrato de codificação separado, cada válvula configurada para regular o fluxo para o substrato de codificação separado ou a partir do mesmo e em que o dispositivo é configurado para ser colocado em comunicação de fluido com um reservatório fluídico de uma solução de transcrição/tradução in vitro.
34. Dispositivo microfluídico, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um reservatório de antibióticos químicos ou de fago configurados para misturar com a mistura de peptídeos antimicrobianos e/ou bacteriocinas específicos.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3378485A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-26 Nomad Bioscience GmbH Bacteriocins for control of salmonella enterica
JP7340517B2 (ja) 2017-08-31 2023-09-07 シングロン エスエー バクテリオシン及び抗菌ペプチドを作製するための方法及び組成物
EP3728292A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Syngulon SA Fermentation process
US20210238645A1 (en) * 2018-06-06 2021-08-05 Syngulon Sa. Engineering antimicrobial peptides
CN111440247A (zh) * 2020-04-20 2020-07-24 广西南宁三思百乐生物科技有限公司 抑杀沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抗菌肽融合蛋白及其应用
EP4243844A1 (en) * 2020-11-10 2023-09-20 Syngulon SA Modulating antimicrobial peptide half-life
WO2022104320A1 (en) * 2020-11-10 2022-05-19 Syngulon Sa. Control of microorganisms in microbial communities
GB202105707D0 (en) * 2021-04-21 2021-06-02 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Production of bacteriocins
CN114478722B (zh) * 2022-02-09 2023-07-21 淮北师范大学 一种细菌素Bacin A1及其应用
CN114437187B (zh) * 2022-02-09 2023-06-20 淮北师范大学 一种细菌素Bacin A4及其应用
CN115191615B (zh) * 2022-05-17 2023-08-15 浙江工商大学 一种具有肠道微生态调节功能的乳酸菌细菌素
WO2023235682A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Syngulon Sa Bacteriocin polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use thereof
CN115124604B (zh) * 2022-06-20 2024-06-04 中国海洋大学 一种重组抗菌肽e-ej97、重组表达载体、工程菌及其应用
CN115851491A (zh) * 2022-08-31 2023-03-28 西北农林科技大学 植物乳植杆菌及其应用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7176029B2 (en) 1992-07-31 2007-02-13 Universite Libre De Bruxelles Cloning and/or sequencing vector
BE1006085A3 (fr) 1992-07-31 1994-05-10 Univ Bruxelles Vecteur de clonage.
US7183097B1 (en) 1998-05-07 2007-02-27 Universite Libre De Bruxelles Cytotoxin-based biological containment
US20040052814A1 (en) * 1998-09-28 2004-03-18 Wenyuan Shi Fusion proteins for targeted delivery of antimicrobial peptides
US7179889B2 (en) * 2001-09-24 2007-02-20 Provisage As Propionicin T1 polypeptide, a bacteriocin from Propionibacterium thoenii
US20060229244A1 (en) * 2004-09-27 2006-10-12 Robert Dorit Engineered bacteriocins and bacteriocin combinations and methods for treating bacterial based infections
CN1807645A (zh) * 2005-12-30 2006-07-26 浙江大学 乳链菌肽和蜜蜂肽的融合基因及其构建方法和用途
WO2009048673A2 (en) * 2007-07-26 2009-04-16 University Of Chicago Stochastic confinement to detect, manipulate, and utilize molecules and organisms
CA2701775A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 The University Of Alabama A novel bacteriocin from a new streptomyces species
EA023897B1 (ru) * 2009-08-26 2016-07-29 Селекта Байосайенсиз, Инк. Композиции, которые индуцируют хелперное действие т-клеток
NZ602909A (en) * 2010-04-15 2015-01-30 Marinepolymer Tech Inc Anti-bacterial applications of poly -n-acetylglucosamine nanofibers
CA2794603C (en) * 2010-04-27 2019-05-21 Lysando Ag Method of reducing biofilms
CN101974546A (zh) 2010-08-20 2011-02-16 中国农业大学 nisin-rbLF-N融合基因以及表达该融合基因的毕赤酵母工程菌
EP3424956A1 (en) * 2013-03-11 2019-01-09 Genzyme Corporation Hyperglycosylated binding polypeptides
DK3035802T3 (da) 2013-08-19 2021-10-11 Syngulon Sa Kontrolleret vækst af mikroorganismer
US9737592B1 (en) * 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
WO2016028700A1 (en) 2014-08-18 2016-02-25 Washington State University Tunable ph-sensitive linker for controlled drug release
JP7340517B2 (ja) 2017-08-31 2023-09-07 シングロン エスエー バクテリオシン及び抗菌ペプチドを作製するための方法及び組成物
US20210238645A1 (en) 2018-06-06 2021-08-05 Syngulon Sa. Engineering antimicrobial peptides

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