KR20190103135A - 유산균 및 박테리아 생물막의 형성을 방지, 저해 및/또는 저감 처리하기 위한 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 속에 속하는 선택된 박테리아 균주 및 이의 용도로서, 박테리아 생물막의 처리, 특히 박테리아 생물막의 형성을 저해 및/또는 줄이기 위한 예방적 처리에 사용하기 위한, 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LMC1 (DSM 32252), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC3 (DSM 32253), 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC4 (DSM 32254), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC5 (DSM 32255), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC6 (DSM 32256), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC7 (DSM 32257), 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC8 (DSM 32258), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC9 (DSM 32259) 및 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC10 (DSM 32260)를 포함하거나 또는 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 락토바실러스 속에 속하는 박테리아 균주 및 이것의 용도로서, 박테리아 생물막의 처리, 특히 박테리아 생물막의 형성을 저해 및/또는 줄이기 위한 예방적 처리에 사용하기 위한, 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 박테리아 생물막의 처리, 특히 박테리아 생물막의 형성을 저해 및/또는 줄이기 위한 예방적 처리에 사용하기 위한, 전술한 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 혼합물, 및 선택적으로 약제 또는 식품 등급의 기술적 첨가제 및/또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물, 의료 기구용 조성물 또는 식이 보충제용 조성물에 관한 것이다.

Description

유산균 및 박테리아 생물막의 형성을 방지, 저해 및/또는 저감 처리하기 위한 이의 용도
본 발명은 락토바실러스 (Lactobacillus) 속에 속하는 선택된 박테리아 균주 및 이것의 용도로서, 박테리아 생물막을 처리하기 위한, 특히 박테리아 생물막의 형성을 저해 및/또는 저감하기 위한 목적으로 예방 처리하기 위한 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LMC1 (DSM 32252), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC3 (DSM 32253), 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC4 (DSM 32254), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC5 (DSM 32255), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC6 (DSM 32256), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC7 (DSM 32257), 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC8 (DSM 32258), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC9 (DSM 32259) 및 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC10 (DSM 32260)를 포함하거나 또는 이들로 구성된 군으로부터 선택되는, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속에 속하는 박테리아 균주 및 이것의 용도로서, 박테리아 생물막을 처리하기 위한, 특히 박테리아 생물막의 형성을 저해 및/또는 저감하기 위한 목적으로 예방 처리하기 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전술한 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 혼합물, 및 선택적으로 약제 또는 식품 등급의 기술적 첨가제 및/또는 부형제를 포함하는, 박테리아 생물막을 처리하기 위한, 특히 박테리아 생물막의 형성을 저해 및/또는 저감하기 위한 목적으로 예방 처리하기 위한, 약학적 조성물, 의료 기구용 조성물 또는 식이 보충제용 조성물에 관한 것이다.
생의학적 맥락에서, 소위 생물막은 생물적 또는 무-생물적 표면에 고착되어 세포외 엑소다당류 (exopolysaccharide) 매트릭스에 병합/봉입된 미생물 커뮤니티로 구성된다 (1). (생물막 생산을 담당하는 특정 박테리아 유전자의 조절 하에 발생하는) 생물막 형성은 다세포 유기체에서의 세포 분화와 비교되어 온 프로세스이다. 생물막의 전형적인 예는, 박테리아가 생물적 또는 비-생물적 표면에 부착하여 자신을 표면에 고착시키고, 증식 및 분열하여 폴리머성 물질, 특히 다당류로 된 세포외 기질로 이루어진 2개의 코딩 층을 형성할 때 만들어지는 것이다. 생물막 내에 병합된 박테리아의 표면 상의 이들 세포외 매트릭스는, 예를 들어, 항생제와 같은 외부 물질의 작용으로부터 자신을 효과적으로 보호한다 (2). 많은 실험들에서, 생물막이 플랑크톤 형태의 동일 박테리아와 비교해 항미생물제에 대한 미생물 내성을 100배 이상 증가시킬 수 있다는 사실이 입증되었으며 (3, 4); 따라서, 이러한 생물학적 구조를 효과적으로 침투할 수 있는 분자가 현재 조재하지 않기 때문에, 생물막 내 박테리아를 제거하기가 매우 어렵다. 전세계 미생물들 중 약 80%가 생물막 상태로 존재하고, 전술한 미생물 생물막은 인간에서 발견될 수 있는 전체 미생물 감염의 75% 이상을 차지하는 감염 원인으로 추정된다 (5). 박테리아 생물막은 살아있는 유기체 (예, 인간 또는 동물)에서 또는 유기체의 근처에서, 또는 완전히 무균하지는 않은 환경과 관련된 다양한 타입의 병변으로 인해, 예를 들어 보형물의 경우에서와 같이, 외부 표면에 또는 내부에 형성될 수 있다. 또한, 박테리아 생물막은 완벽하게 소독되지 않은 무생물적 표면, 예를 들어, 혈관내 카테터 및 보형 임플란트 (6) 또는 예를 들어, 뼈, 뼈 조직 및 뼈 조직내 보형물 삽입체의 경우에 그 표면 위에 형성될 수 있다. 이러한 인공 표면 상의 생물막내 미생물은 종종 디바이스 삽입 또는 이식 중에 의료인 또는 환자 자신의 피부 미생물총으로부터 유래된다. 단지 비-제한적인 예로서, 주로 발견되는 미생물로는 특히 혈관내 카테터에서의, 코어굴라제-음성의 스타필로콕사이 (Coagulase-Negative Staphylococci), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 다양한 종들, 즉 슈도모나스 (Pseudomonas), 엔테로코커스 (Enterococcus), 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 및 칸디다 (Candida); 뇨 카테터에서의, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 클렙시엘라 (Klebsiella), 엔테로박터 (Enterobacter), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 및 칸디다 (Candida); 및 고관절 치환 임플란트에서의 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미티스 (Staphylococcus emidermitis) 및 프로피오니박테리움 아크네 (Propionibacterium acnes) 등이 있다 (6).
이러한 타입의 임플란트는 흔히 장기간 환자의 체내에 잔류하기 때문에, 이들 유해 미생물에 의한 생물막 형성은 예를 들어, 뼈 및 골수에 동시에 침범하는 감염성 프로세스인 골수염과 같이, 박멸하기 어려운 심각한 국소 및/또는 전신 감염을 야기할 수 있다 (6). 구강의 생물막은 또한 구강 감염으로부터 단리된 다양한 타입의 생물막에 의해 입증된 바와 같이, 일시적인 균혈증 (bacteraemia)을 통해 전파할 수 있는 미생물 번식의 토대가 된다 (7). 생물막에 존재하는 박테리아의 탈착 및 그로 인한 혈액 매개 전파는 감염성 심내막염, 급성 세균성 심근염, 뇌 농양, 간 농양, 폐 농양 및 해면정맥동의 혈전 등의 일부 형태와 관련되어 있다 (8-13). 구강의 생물막이 전신 건강에 중요할 수 있다는 가설은, 치주염 환자에서 전신성 염증 마커의 농도 증가가 보고된 단면 조사 연구에 의해 뒷받침된다 (14, 15). 설득력있는 증거는 치주염과 심혈관 질환 및 뇌혈관 질환 및 진성 당뇨병 간의 전신-구강 연계성을 뒷받침해주며, 이들 모두 염증성 병인을 가지고 있다. 아울러, 치주염과 심혈관 질환 간의 연관성은, 흡연, 나이, 교육, 체질량 지수 및 생활 습관과 같은 인자와 같은 일반적인 위험 인자와 무관하게, 입증되어 있다 (16).
그러나, 전술한 바와는 대조적으로, 위장 및 여성의 비뇨생식기에는, 그 구조 (생물막)가 유기체에서 이들 박테리아의 지속성 및 영역의 장기간 군락화를 촉진하므로 유기체에서 보호 역할을 수행할 수 있는 락토바실러스 및 스트렙토코커스 서모필러스 (Streptococcus thermophilus)와 같이 유익한 미생물을 포함하는, 자연적으로 존재하는 생물막도 존재한다는 것에 주목하여야 한다 (17).
특히 항생제의 효능 저하와 관련있는 병원성 박테리아에 의해 생산되는 박테리아 미생물 생물막이 인간 건강에 미치는 부정적인 효과는, 따라서, 이의 형성을 저해 (예방 작용)하거나 및/또는 증식/발생을 차단 및/또는 감소 (치료 작용)시켜, 필요한/바람직한 항미생물/항세균 처리 (예, 항생제)의 최적 적용을 달성할 수 있는, 항-생물막제로서 효과적으로 작용할 수 있는 새로운 생물학적 활성 산물에 대한 탐구를 촉구하고 있다.
그러나, 출원인이 인지하는 한, 완전히 만족스러운 방식으로 상기한 과제를 달성할 수 있는 산물은 아직까지 동정/생산된 바 없다.
이에, 본 기술 분야의 종사자들에게는 생물막 형성을 저해하거나 및/또는 이의 증식/발생을 차단 및/또는 감소시켜, 필요한/바람직한 항세균 처리 (예, 항생제)의 최적 적용을 달성하기 위해, 항-생물막제로서 효과적으로 작용할 수 있는 생물막 제거용 제품, 조성물 및 제형에 대한 강력한 요구가 계속 존재하고 있다.
Beikler T, Flemming T. Oral biofilm-associated diseases: trends and implications for quality of life, systemic health and expenditures. Periodontology 2000. 2011; 55:87-103. Bjarnsholt T. The role of bacterial biofilms in chronic infections. APMIS Suppl. 2013;136:1-51. Olson ME, Ceri H, Stremick, et al. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res. 2002;66:86-92. Ceri H, Olson ME, Morck DW, et al. The MBEC assay system: Multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Meth Enzymol. 2001;337:377-384. Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2003;2:114-122. Hung CS, Henderson JP. Emerging Concepts of Biofilms in Infectious Diseases. Mo Med. 2009;106:292-296. Li X, Kolltveit KM, Tronstad L, et al. Systemic diseases caused by oral infection. Clin Microbiol Rev. 2000;13:547-558. Bartzokas CA, Johnson R, Jane M, et al. 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본 발명의 과제는 전술한 기술적인 문제에 대해 적절한 대응책을 제공하는 것이다.
이제 본 출원인은 인간 기원의 선택된 특정 락토바실러스 적정 그룹이 전술한 기술적인 문제에 대한 바람직한 대응을 제공할 수 있다는 것을 예상치못하게도 발견하게 되었다.
본 발명의 과제는 첨부된 독립항에 기술된 바와 같이 락토바실러스 속에 속하는 인간 기원의 하나 이상의 박테리아 균주이다.
본 발명의 다른 과제는 첨부된 청구항에 기술된 바와 같이 박테리아 생물막의 처리에 사용하기 위한, 특히 박테리아 생물막의 형성 저해 및/또는 저감을 목적으로 하는 예방적 처리를 위한 락토바실러스 속에 속하는 인간 기원의 하나 이상의 박테리아 균주이다.
본 발명의 또 다른 과제는, 첨부된 독립항에 기술된 바와 같이, 전술한 하나 이상의 박테리아 균주 및 선택적으로 약학 또는 식품 등급의 기술적 첨가제 및/또는 부형제를 포함하거나 또는 다른 예로 이들로 구성되는 혼합물을 포함하는, 약학적 조성물 또는 의료 기구용 조성물 또는 식이 보충제용 조성물이다.
본 발명의 다른 과제는, 첨부된 독립항에 기술된 바와 같이, 박테리아 생물막의 처리에 사용하기 위한, 특히 박테리아 생물막의 형성을 저해 및/또는 낮추는 것으로 목적으로 하는 예방적 처리를 위한, 전술한 하나 이상의 박테리아 균주 및 선택적으로 약학 또는 식품 등급의 기술적 첨가제 및/또는 부형제를 포함하거나 또는 다른 예로 이들로 구성되는 혼합물을 포함하는, 약학적 조성물 또는 의료 기구용 조성물 또는 식이 보충제용 조성물이다.
본 발명의 다른 과제는 첨부된 청구항에 기술된 바와 같이 전술한 락토바실러스의 용도이다. 특히, 본 발명의 과제는, 유해 박테리아 균주, 바람직하게는 칸디다 (Candida), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테오스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 및 프로피오니박테리움 아크네 (ropionibacterium acnes), 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 중에서 선택되는 균주에 의한 생물막 형성 및 생물막 형성과 관련된 장애 또는 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 하기 균주들 중 하나 이상에 속하는 미생물을 포함하는 조성물이다:
락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 기탁번호 DSM 32252 LMC1으로도 지칭됨];
락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 기탁번호 DSM 32254 [LMC4로도 지칭됨];
락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 기탁번호 DSM 32256 [LMC6로도 지칭됨];
락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 기탁번호 DSM 32257 [LMC7으로도 지칭됨];
락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 기탁번호 DSM 32258 [LMC8으로도 지칭됨].
본 발명의 바람직한 구현예는 첨부된 종속항에 기술된다.
후술한 상세한 설명에 기술된 본 발명의 바람직한 구현예들은 단지 예로서, 그리고 당해 기술 분야의 당업자에게 즉각적으로 자명하게 보이는 본 발명의 넒은 범위를 제한하지 않는 방식으로 예시된다.
표 1은 본 발명의 락토바실러스를 이용해 달성된 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus)에 의한 생물막 형성의 저해 %를 나타낸다.
상층액 저해 %
LMC1 84
LMC4 82
LMC6 54
LMC7 62
LMC8 87
도 1은 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) (대조군)의 상층액 내 생물막의 3D 이미지이다. 생물막을 FilmTracerTM LIVE/DEAD® 생물막 생존성 키트로 염색하였으며; 녹색 염색 (SYTO9)은 살아있는 세포를 표시하고; 적색 염색 (프로피듐 요오드화물)은 죽은 세포를 표시한다.
도 2는 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) (대조군)의 상층액에서 생물막의 횡단면 사진이다.
도 3은 LMC8의 상층액에서 인큐베이션한 후 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus)에 의해 생성된 생물막의 단면 사진으로; 생물학의 생성이 실질적으로 거의 없거나 전혀 없다.
락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) (DSM 32252) 균주의 특징
균주: 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)
국제 식별 번호 - ID: ID 1952
프로바이오티칼 커머셜 코드: LMC-1
DSMZ 국제 기탁 기관에서의 기탁번호: DSM 32252
균주 특징
기원
균주 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)을 단리하여, Biolab Research srl, Mofin Alce Group의 자회사, Probiotical S.p.A.의 계열사의 실험실에서 분석하였다.
생화학적 특징
1) 표 2는 당 발효 프로파일을 나타낸다 (API 50 CHL, bioMerieux)
N. 당류 결과 N. 당류 결과
0 대조군 - 25 에스쿨린 패릭 사이트레이트 +
1 글리세롤 - 26 살리신 +
2 에리트리톨 - 27 D-셀로바이오스 +
3 D-아라비노스 - 28 D-말토스 +
4 L-아라비노스 + 29 D-락토스 +
5 D-리보스 + 30 D-멜리바이오스 +
6 D-자일로스 - 31 D-슈크로스 +
7 L-자일로스 - 32 D-트레할로스 +
8 아도니톨 - 33 이뉼린 -
9 메틸-βD-자일로피라노시드 - 34 D-멜레지토스 +
10 D-갈락토스 + 35 D-라피노스 +
11 D-글루코스 + 36 스타치 -
12 D-프럭토스 + 37 글리코겐 -
13 D-만노스 + 38 자일리톨 -
14 L-소르보스 - 39 겐티오비오스 +
15 L-람노스 + 40 D-투라노스 +
16 둘시톨 - 41 D-릭소스 -
17 이노시톨 - 42 D-타가토스 -
18 D-만니톨 + 43 D-푸코스 -
19 D-소르비톨 + 44 L-푸코스 -
20 메틸-αD-만노피라노시드 - 45 D-아라비톨 -
21 메틸-αD-글루코피라노시드 - 46 L-아라비톨 -
22 N-아세틸-글루코사민 + 47 포타슘 글루코네이트 +
23 아미그달린 + 48 포타슘 2-케토글루코네이트 -
24 아르부틴 + 49 포타슘 5-케토글루코네이트 -
2) 표 3은 효소 프로파일을 나타낸다 (API Zym, bioMerieux)
N. 기질 분석 효소 효소 타입 활성
(나노몰)
1 음성 대조군 - - -
2 2-나프틸-포스페이트 알카라인 포스파타제 포스파타제 5
3 2-나프틸 부티레이트 에스테라제 (C 4) 리파제 5
4 2-나프틸 카프릴레이트 에스테라제 리파제 (C 8) 5
5 2-나프틸 미리스테이트 리파제 (C 14) -
6 L-루실-2-나프틸아미드 루신 아릴아미다제 프로테아제 ≥40
7 L-발릴-2-나프틸아미드 발린 아릴아미다제 30
8 L-시스틸-2-나프틸아미드 시스틴 아릴아미다제 ≥40
9 N-벤조일-DL-아르기닌-2-나프틸아미드 트립신 -
10 N-글루타릴-페닐알라닌-2-나프틸아미드 α-키모트립신 -
11 2-나프틸-포스페이트 산 포스파타제 포스파타제 30
12 나프톨-AS-BI-포스페이트 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라제 10
13 6-Br-2-나프틸-αD-갈락토피라노시드 α-갈락토시다제 옥시다제 10
14 2-나프틸-βD- 갈락토피라노시드 β-갈락토시다제 ≥40
15 나프톨-AS-BI-βD-글루코로니드 β-글루쿠로니다제 -
16 2-나프틸-αD-글루코피라노시드 α-글루코시다제 20
17 6-Br-2-나프틸-βD-글루코피라노시드 β-글루코시다제 20
18 1-나프틸-N-아세틸-βD-글루코스아미니드 N-아세틸-β-글루코스아미니다제 ≥40
19 6-Br-2-나프틸-αD-만노피라노시드 α-만노시다제 -
20 2-나프틸-αL-푸코피라노시드 α-푸코시다제 -
3) 단백질 프로파일 (폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동)
도 4는 대상 균주의 단백질 프로파일 (폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동)을 도시한 것이다.
1-2번 레인은 균주의 마스터 세포 은행 배양물의 단백질 프로파일을 나타낸 것이고; (레인 참조); 1-2 및 3번 레인의 경우, 균주의 프로파일은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 종의 특징이다 (화살표 참조). 4 및 1-2번 레인의 경우, 균주의 단백질 프로파일에 다른 종에 속하는 균주 (락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) DSM 32258; 십자 표시 참조)에서 수득된 단백질 프로파일과의 차이가 확인된다.
분자 특징
종-특이적인 분류:
4) 프라이머 PLAN-F/P-REV를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)
도 5는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)에 대한 양성 반응 결과를 도시한 것으로, 도에서
1. PCR 마커: Sigma 50-2000 bp
2. 블랭크: DNA 무첨가
3. 음성 대조군: 락토바실러스 파라카세이 DSM 5622
4. 양성 대조군: 락토바실러스 파라카세이 DSM 20174
5. 균주: 락토바실러스 플란타룸 LMC-1 ID 1952
6. 균주: 락토바실러스 플란타룸 LMC-1 ID 1952
5) 16S rDNA 유전자 서열분석
결과는 Blast 프로그램 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)으로 수득하였다.
Figure pct00001
스코어: 동정체의 생물학적 관련성을 평가하기 위해 사용된 번호. 서열 정렬에서, 스코어는 정렬의 전체 품질을 나타내는 숫자 값이다. 숫자가 클수록 유사성이 높다.
E-값 (예상 값): 연구자가 정확하게 해석할 경우, 2개의 생물학적 서열들 간의 상관관계를 나타내는 스코어의 가능성을 나타내는 값. E-값이 낮을수록, 스코어의 유의성은 커진다.
핑거프린팅 프로파일
6) 도 6 및 7은 NotI 효소 (도 6) 및 SfiI 효소 (도 7)를 이용한 펄스-장 전기영동 (pulsed-field electrophoresis, PFGE)의 결과를 도시한 것이다:
1. 마커: Sigma 50-1,000 kb
2. 락토바실러스 플란타룸 LMC-1 ID 1952 - 기원 - 마스터 세포 은행
3. 락토바실러스 플란타룸 LMC-1 ID 1952 - 6차 서브-배양 - 마스터 세포 은행
생물학적 특징
7) 표 4는 항생제 내성 프로파일을 나타낸다 (E-검사, ABBiodisk)
항생제 클래스 MIC*
㎍/ml		 박테리아 균주
락토바실러스 플란타룸
LMC-1 ID 1952
DSM 32252		 시판 락토바실러스^ 시판 비피도박테리움 ^ EFSA Limit 2012
아미노글리코시드 젠타마이신 4 6 48 16
스트렙토마이신 16 12 64 n.r
카나마이신 64 128 n.d. 64
퀴놀론 시프로플록사신 >32 1 4 -
글리코펩타이드 반코마이신 >256 >256 0.38 n.r
린코스아미드 클린다마이신 2 0.50 0.047 2
마크롤라이드 아지트로마이신 2 0.38 0.75 -
클라리트로마이신 0.25 0.047 0.032 -
에리트로마이신 0.75 0.032 0.094 1
옥사졸리디논** 리네졸리드 1.5 2 0.38 4
리파미신 리팜피신 0.25 0.094 0.094 -
스트레포그라민*** 퀴누프리스틴/달포프리스틴 0.38 1 0.25 4
테트라사이클린 클로람페니콜 2 3 0.75 8
테트라사이클린 12 0.50 8 32
β-락탐 아목시실린 0.19 0.50 0.064 -
암피실린 0.032 0.50 0.016 2
세폭시틴 64 >256 1 -
세푸록심 0.064 1.5 0.25 -
이미페넴 0.047 2 0.25 -
^ 시판 균주 (commercial strain)를 대조군으로 사용하였다. 이 균주는 윤리적인 이유로 본 문헌에서 동정하지 않는다. 데이타는 요청시 입수가능하다.
* E 검사 스트립 (ABBiodisk)을 이용한 아가에서의 저해 루프 MIC (최소 저해 농도) 평가.
n.r. 불필요 / n.d. 측정안됨.
** EFSA 2005에 포함됨.
*** EFSA 2008에 포함됨.
8) 표 5는 생물 체액에 대한 내성을 나타낸다 (인공 위액, 인공 췌장액 및 담즙염).
균주 생물 체액 여러가지 접촉 시간 후 (분)^ 배지 내 담즙 존재^^
5' 30' 60'
락토바실러스 플란타룸
LMC-1 ID 1952
DSM 32252		 인공 위액 0.2 0 0
인공 췌장 분비액 98 93 89
담즙염 100
시판 락토바실러스* 인공 위액 90 30 19
인공 췌장 분비액 88 80 73
담즙염 55
시판 비피도박테리움* 인공 위액 90 65 25
인공 췌장 분비액 88 65 40
담즙염 4
* 시판 균주를 대조군으로 사용하였다. 이 균주는 윤리적인 이유로 본 문헌에서 동정하지 않는다. 데이타는 요청시 입수가능하다.
^ 표 5는 37℃에서 여러가지 접촉 시간 (5분, 30분 및 60분) 경과 후 2가지 서로 다른 타입의 생물 체액, 즉 인공 위액 및 인공 췌장 분비액에서 프로바이오틱 균주의 생존성 %를 나타낸다.
^^ 담즙 분비물의 존재 하의 생존성 결과는 담즙염을 "첨가" 및 "무첨가"한 특정 배지에서 증식한 콜로니의 수를 비교하여 수득하였다.
균주 락토바실러스 파라카세이 ( Lactobacillus paracasei ) (DSM 32254)의 특징
균주: 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei)
국제 식별 번호 - ID: ID 1953
프로바이오티칼 커머셜 코드: LMC-4
DSMZ 국제 기탁 기관에서의 기탁번호: DSM 32254
균주 특징
기원
균주 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei)를 단리하여, Biolab Research srl, Mofin Alce Group의 자회사, Probiotical S.p.A.의 계열사의 실험실에서 분석하였다.
생화학적 특징
1) 표 6은 당 발효 프로파일을 나타낸다 (API 50 CHL, bioMerieux).
N. 당류 결과 N. 당류 결과
0 대조군 - 25 에스쿨린 패릭 사이트레이트 +
1 글리세롤 - 26 살리신 +
2 에리트리톨 - 27 D-셀로바이오스 +
3 D-아라비노스 - 28 D-말토스 +
4 L-아라비노스 - 29 D-락토스 +
5 D-리보스 + 30 D-멜리바이오스 -
6 D-자일로스 - 31 D-슈크로스 +
7 L- 자일로스 - 32 D-트레할로스 +
8 아도니톨 - 33 이뉼린 -
9 메틸-βD-자일로피라노시드 - 34 D-멜레지토스 +
10 D-갈락토스 + 35 D-라피노스 -
11 D-글루코스 + 36 스타치 -
12 D-프럭토스 + 37 글리코겐 -
13 D-만노스 + 38 자일리톨 -
14 L-소르보스 + 39 겐티오비오스 +
15 L-람노스 - 40 D-투라노스 +
16 둘시톨 - 41 D-릭소스 -
17 이노시톨 - 42 D-타가토스 +
18 D-만니톨 + 43 D-푸코스 -
19 D-소르비톨 + 44 L-푸코스 -
20 메틸-αD-만노피라노시드 - 45 D-아라비톨 -
21 메틸-αD-글루코피라노시드 - 46 L-아라비톨 -
22 N-아세틸-글루코스아민 + 47 포타슘 글루코네이트 +
23 아미그달린 + 48 포타슘 2-케토글루코네이트 -
24 아르부틴 + 49 포타슘 5-케토글루코네이트 -
2) 표 7은 효소 프로파일을 나타낸다 (API Zym, bioMerieux).
N. 기질 분석 효소 효소 타입 활성
(나노몰)
1 음성 대조군 - - -
2 2-나프틸-포스페이트 알카라인 포스파타제 포스파타제 5
3 2-나프틸 부티레이트 에스테라제 (C 4) 리파제 5
4 2-나프틸 카프릴레이트 에스테라제 리파제 (C 8) 10
5 2-나프틸 미리스테이트 리파제 (C 14) -
6 L-루실-2-나프틸아미드 루신 아릴아미다제 프로테아제 ≥40
7 L-발릴-2-나프틸아미드 발린 아릴아미다제 ≥40
8 L-시스틸-2-나프틸아미드 시스틴 아릴아미다제 10
9 N-벤조일-DL-아르기닌-2-나프틸아미드 트립신 -
10 N-글루타릴-페닐알라닌-2-나프틸아미드 α-키모트립신 10
11 2-나프틸-포스페이트 산 포스파타제
포스파타제		 ≥40
12 나프톨-AS-BI-포스페이트 나프톨-AS-BI- 포스포하이드롤라제 ≥40
13 6-Br-2-나프틸-αD-갈락토피라노시드 α-갈락토시다제 옥시다제 -
14 2-나프틸-βD- 갈락토 β-갈락토시다제 ≥40
15 나프톨-AS-BI-βD-글루코로니드 β-글루쿠로니다제 -
16 2-나프틸-αD-글루코피라노시드 α-글루코시다제 ≥40
17 6-Br-2-나프틸-βD-글루코피라노시드 β-글루코시다제 20
18 1-나프틸-N-아세틸-βD-글루코스아미니드 N-아세틸-β-글루코스아미니다제 -
19 6-Br-2-나프틸-αD-만노피라노시드 α-만노시다제 -
20 2-나프틸-αL-푸코피라노시드 α-푸코시다제 5
3) 도 8은 단백질 프로파일 (폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동)을 도시한다:
1. 음성 대조군: 락토바실러스 플란타룸 LP01 - LMG P-21021
2. 균주: 락토바실러스 파라카세이 LMC-4 (ID 1953) - 마스터 세포 은행 (기원)
3. 균주: 락토바실러스 파라카세이 LMC-4 (ID 1953) - 마스터 세포 은행 (서브-배양 13#6)
4. 양성 대조군: 락토바실러스 파라카세이 LPC 01 - CNCM I-1390
2-3번 레인은 균주의 마스터세포 은행 배양물의 단백질 프로파일이고 (레인 참조); 1번 및 2-3번 레인은 종 락토바실러스 파라카세이의 특징적인 균주 프로파일 (화살표시)이다. 4번 레인 및 2-3번 레인의 경우, 균주의 단백질 프로파일에서 다른 종에 속하는 균주에서 수득한 단백질 프로파일과의 차이가 확인된다 (락토바실러스 플란타룸 LMG P-21021; 십자 표시).
분자 특징
종-특이 분류:
4) 도 9는 프라이머 W2/Y2를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 결과를 도시한 것이다. 반응은 락토바실러스 파라카세이에 양성이다:
1. PCR 마커: Sigma 50-2000 bp
2. 블랭크: DNA 무첨가
3. 음성 대조군: 락토바실러스 카세이 DSM 20011
4. 양성 대조군: 락토바실러스 파라카세이 DSM 5622
5. 균주: 락토바실러스 파라카세이 LMC-4 ID 1953
6. 균주: 락토바실러스 파라카세이 LMC-4 ID 1953
5) 16S rDNA 유전자 서열분석
결과는 Blast 프로그램을 이용해 수득하였다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Figure pct00002
스코어: 동정물의 생물학적 관련성을 평가하기 위해 사용된 숫자. 서열 정렬에서, 스코어는 정렬의 전체 품질을 나타내는 수치 값이다. 숫자가 높을수록 유사성이 높다.
E-값 (예상 값): 연구자에 의해 정확하게 해석되는 경우, 값은 2개의 생물학적 서열 간의 상관관계를 표시하는 스코어의 가능성을 표시할 것이다. E-값이 낮을수록 스코어의 유의성은 커진다.
핑거프린팅 프로파일
6) 도 10 및 11은 NotI 효소 (도 10) 및 SfiI 효소 (도 11)를 이용한 펄스-장 전기영동 (PFGE) 결과를 도시한 것이다:
1. 락토바실러스 파라카세이 LMC-4 (ID 1953) - 배양 기원 - 마스터 세포 은행
2. 락토바실러스 파라카세이 LMC-4 (ID 1953) - 6차 서브-배양 - 마스터 세포 은행
3. 전기영동 마커: Sigma 50-1,000 kb
생물학적 특징
7) 표 8은 항생제 내성 프로파일을 나타낸다 (E-검사, ABBiodisk)
항생제 클래스 MIC*
㎍/ml		 박테리아 균주
락토바실러스 파라카세이
LMC-4 ID 1953
DSM 32254		 시판 락토바실러스^ 시판 비피도박테리움^ EFSA Limit 2012
아미노글리코시드 젠타마이신 2 6 48 32
스트렙토마이신 12 12 64 64
카나마이신 24 128 n.d. 64
퀴놀론 시프로플록사신 0.75 1 4 -
글리코펩타이드 반코마이신 >256 >256 0.38 n.r
린코스아미드 클린다마이신 0.064 0.50 0.047 1
마크롤라이드 아지트로마이신 0.50 0.38 0.75 -
클라리트로마이신 0.047 0.047 0.032 -
에리트로마이신 0.125 0.032 0.094 1
옥사졸리디논** 리네졸리드 0.38 2 0.38 4
리파미신 리팜피신 0.016 0.094 0.094 -
스트레포그라민*** 퀴누프리스틴/달포프리스틴 0.094 1 0.25 4
테트라사이클린 클로람페니콜 1.5 3 0.75 4
테트라사이클린 0.19 0.50 8 4
β-락탐 아목시실린 0.25 0.50 0.064 -
암피실린 0.094 0.50 0.016 4
세폭시틴 >256 >256 1 -
세푸록심 0.75 1.5 0.25 -
이미페넴 1.5 2 0.25 -
^ 시판 균주를 대조군으로 사용하였다. 이 균주는 윤리적인 이유로 문헌에서 동정하지 않는다. 데이타는 요청시 입수가능하다
* E 검사 스트립 (ABBiodisk)을 이용한 아가에서의 저해 루프 MIC (최소 저해 농도) 평가.
n.r. 불필요 / n.d. 측정안됨.
** EFSA 2005에 포함됨
*** EFSA 2008에 포함됨
8) 표 9는 생물 체액에 대한 내성을 나타낸다 (인공 위액, 인공 췌장액 및 담즙염).
균주 생물 체액 여러가지 접촉 시간 후 (분)^ 배지 내 담즙 존재 하^^
5' 30' 60'
락토바실러스 파라카세이 LMC-4 ID 1953
DSM 32254		 인공 위액 0 0 0
인공 췌장 분비액 100 100 100
담즙염 100
시판 락토바실러스* 인공 위액 90 30 19
인공 췌장 분비액 88 80 73
담즙염 55
시판 비피도박테리움* 인공 위액 90 65 25
인공 췌장 분비액 88 65 40
담즙염 4
* 시판 균주를 대조군으로 사용하였다. 이 균주는 윤리적인 이유로 문헌에서 동정하지 않는다. 데이타는 요청시 입수가능하다.
^ 표 9는 37℃에서 여러가지 접촉 시간 (5분, 30분 및 60분) 경과 후 2가지 서로 다른 타입의 생물 체액, 즉 인공 위액 및 인공 췌장 분비액에서 프로바이오틱 균주의 생존성 %를 나타낸다.
^^ 담즙 분비물의 존재 하의 생존성 결과는 담즙염을 "첨가" 및 "무첨가"한 특정 배지에서 증식한 콜로니의 수를 비교하여 수득하였다.
균주 락토바실러스 파라카세이 (DSM 32258)의 특징
균주: 락토바실러스 파라카세이
국제 식별 번호 - ID: ID 1954
프로바이오티칼 커머셜 코드: LMC-8
DSMZ 국제 기탁 기관에서의 기탁번호: DSM 32258
균주 특징
기원
균주 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei)를 단리하여, Biolab Research srl, Mofin Alce Group의 자회사, Probiotical S.p.A.의 계열사의 실험실에서 분석하였다.
생화학적 특징
1) 표 10은 당 발효 프로파일을 나타낸다 (API 50 CHL, bioMerieux).
N. 당류 결과 N. 당류 결과
0 대조군 - 25 에스쿨린 패릭 사이트레이트 +
1 글리세롤 - 26 살리신 +
2 에리트리톨 - 27 D-셀로바이오스 +
3 D-아라비노스 - 28 D-말토스 +
4 L-아라비노스 - 29 D-락토스 -
5 D-리보스 + 30 D-멜리바이오스 -
6 D-자일로스 - 31 D-슈크로스 +
7 L- 자일로스 - 32 D-트레할로스 +
8 아도니톨 + 33 이뉼린 +
9 메틸-βD-자일로피라노시드 - 34 D-멜레지토스 +
10 D-갈락토스 + 35 D-라피노스 -
11 D-글루코스 + 36 스타치 +
12 D-프럭토스 + 37 글리코겐 -
13 D-만노스 + 38 자일리톨 -
14 L-소르보스 + 39 겐티오비오스 +
15 L-람노스 - 40 D-투라노스 +
16 둘시톨 - 41 D-릭소스 +
17 이노시톨 + 42 D-타가토스 +
18 D-만니톨 + 43 D-푸코스 -
19 D-소르비톨 + 44 L-푸코스 -
20 메틸-αD-만노피라노시드 - 45 D-아라비톨 -
21 메틸-αD-글루코피라노시드 + 46 L-아라비톨 -
22 N-아세틸-글루코스아민 + 47 포타슘 글루코네이트 +
23 아미그달린 + 48 포타슘 2-케토글루코네이트 -
24 아르부틴 + 49 포타슘 5-케토글루코네이트 -
2) 표 11은 효소 프로파일을 나타낸다 (API Zym, bioMerieux)
N. 기질 분석 효소 효소 타입 활성
(나노몰)
1 음성 대조군 - - -
2 2-나프틸-포스페이트 알카라인 포스파타제 포스파타제 10
3 2-나프틸 부티레이트 에스테라제 (C 4) 리파제 -
4 2-나프틸 카프릴레이트 에스테라제 리파제 (C 8) 5
5 2-나프틸 미리스테이트 리파제 (C 14) -
6 L-루실-2-나프틸아미드 루신 아릴아미다제 프로테아제 ≥40
7 L-발릴-2-나프틸아미드 발린 아릴아미다제 ≥40
8 L-시스틸-2-나프틸아미드 시스틴 아릴아미다제 20
9 N-벤조일-DL-아르기닌-2-나프틸아미드 트립신 -
10 N-글루타릴-페닐알라닌-2-나프틸아미드 α-키모트립시나제 5
11 2-나프틸-포스페이트 산 포스파타제 포스파타제 30
12 나프톨-AS-BI-포스페이트 나프톨-AS-BI- 포스포하이드롤라제 20
13 6-Br-2-나프틸-αD-갈락토피라노시드 α-갈락토시다제 옥시다제 -
14 2-나프틸-βD-갈락토피라노시드 β-갈락토시다제 ≥40
15 나프톨-AS-BI- βD-글루코로니드 β-글루쿠로니다제 -
16 2-나프틸-αD-글루코피라노시드 α-글루코시다제 30
17 6-Br-2-나프틸-βD-글루코피라노시드 β-글루코시다제 20
18 1-나프틸-N-아세틸-βD-글루코스아미니드 N-아세틸-β-글루코스아미니다제 5
19 6-Br-2-나프틸-αD-만노피라노시드 α-만노시다제 -
20 2-나프틸-αL-푸코피라노시드 α-푸코시다제 5
3) 도 12는 단백질 프로파일 (폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동)을 도시한다:
1. 양성 대조군: 락토바실러스 파라카세이 LPC 01 ID 1119- CNCM I-1390
2. 균주: 락토바실러스 파라카세이 LMC-8 (ID 1954) - 마스터 세포 은행 (기원)
3. 균주: 락토바실러스 파라카세이 LMC-8 (ID 1954) - 마스터 세포 은행 (서브-배양 13#6)
4. 음성 대조군: 락토바실러스 플란타룸 LP01 ID 1171- LMG P-21021
2-3번 레인은 균주의 마스터세포 은행 배양물의 단백질 프로파일이고 (레인 참조); 1번 및 2-3번 레인은 종 락토바실러스 파라카세이의 특징적인 균주 프로파일 (화살표시)이다. 4번 레인 및 2-3번 레인의 경우, 균주의 단백질 프로파일에서 다른 종에 속하는 균주에서 수득한 단백질 프로파일과의 차이가 확인된다 (락토바실러스 플란타룸 LMG P-21021; 십자 표시).
분자 특징
종-특이 분류:
4) 도 13은 프라이머 W2/Y2를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 결과를 도시한 것이다. 반응은 락토바실러스 파라카세이에 양성이다:
1. PCR 마커: Sigma 50-2000 bp
2. 블랭크: DNA 무첨가
3. 음성 대조군: 락토바실러스 카세이 DSM 20011
4. 양성 대조군: 락토바실러스 파라카세이 DSM 5622
5. 균주: 락토바실러스 파라카세이 LMC-8 ID 1954
6. 균주: 락토바실러스 파라카세이 LMC-8 ID 1954
5) 16S rDNA 유전자 서열분석
Figure pct00003
결과는 Blast 프로그램을 이용해 수득하였다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
스코어: 동정물의 생물학적 관련성을 평가하기 위해 사용된 숫자. 서열 정렬에서, 스코어는 정렬의 전체 품질을 나타내는 수치 값이다. 숫자가 높을수록 유사성이 높다.
E-값 (예상 값): 연구자에 의해 정확하게 해석되는 경우, 값은 2개의 생물학적 서열 간의 상관관계를 표시하는 스코어의 가능성을 표시할 것이다. E-값이 낮을수록 스코어의 유의성은 커진다.
핑거프린팅 프로파일
6) 도 14 및 15는 NotI 효소 (도 14) 및 SfiI 효소 (도 15)를 이용한 펄스-장 전기영동 (PFGE) 결과를 도시한 것이다:
1. 전기영동 마커: Sigma 50-1,000 kb
2. 락토바실러스 파라카세이 LMC-8 (ID 1954) - 배양 기원 - 마스터 세포 은행
3. 락토바실러스 파라카세이 LMC-8 (ID 1954) - 6차 서브-배양 - 마스터 세포 은행
생물학적 특징
7) 표 12은 항생제 내성 프로파일을 나타낸다 (E-검사, ABBiodisk).

항생제 클래스		 MIC*
㎍/ml		 박테리아 균주
락토바실러스 파라카세이 LMC-8 ID 1954 DSM 32258 시판 락토바실러스^ 시판 비피도박테리움 ^ EFSA Limit 2012
아미노글리코시드 젠타마이신 4 6 48 32
스트렙토마이신 24 12 64 64
카나마이신 64 128 n.d. 64
퀴놀론 시프로플록사신 1.0 1 4 -
글리코펩타이드 반코마이신 >256 >256 0.38 n.r
린코스아미드 클린다마이신 0.094 0.50 0.047 1
마크롤라이드 아지트로마이신 0.75 0.38 0.75 -
클라리트로마이신 0.094 0.047 0.032 -
에리트로마이신 0.125 0.032 0.094 1
옥사졸리디논** 리네졸리드 1.5 2 0.38 4
리파미신 리팜피신 0.032 0.094 0.094 -
스트레포그라민*** 퀴누프리스틴/달포프리스틴 0.25 1 0.25 4
테트라사이클린 클로람페니콜 2.0 3 0.75 4
테트라사이클린 0.38 0.50 8 4
β-락탐 아목시실린 0.50 0.50 0.064 -
암피실린 0.38 0.50 0.016 4
세폭시틴 >256 >256 1 -
세푸록심 1.0 1.5 0.25 -
이미페넴 0.75 2 0.25 -
^ 시판 균주를 대조군으로 사용하였다. 이 균주는 윤리적인 이유로 문헌에서 동정하지 않는다. 데이타는 요청시 입수가능하다
* E 검사 스트립 (ABBiodisk)을 이용한 아가에서의 저해 루프 MIC (최소 저해 농도) 평가.
n.r. 불필요 / n.d. 측정안됨.
** EFSA 2005에 포함됨
*** EFSA 2008에 포함됨
8) 표 13은 생물 체액에 대한 내성을 나타낸다 (인공 위액, 인공 췌장액 및 담즙염)
균주 생물 체액 여러가지 접촉 시간 후 (분)^ 배지 내 담즙 존재 하^^
5' 30' 60'
락토바실러스 파라카세이 LMC-8 ID 1954 DSM 32258 인공 위액 7 1 0
인공 췌장 분비액 21 21 15
담즙염 97
시판 락토바실러스* 인공 위액 90 30 19
인공 췌장 분비액 88 80 73
담즙염 55
시판 비피도박테리움* 인공 위액 90 65 25
인공 췌장 분비액 88 65 40
담즙염 4
* 시판 균주를 대조군으로 사용하였다. 이 균주는 윤리적인 이유로 문헌에서 동정하지 않는다. 데이타는 요청시 입수가능하다.
^ 표 13은 37℃에서 여러가지 접촉 시간 (5분, 30분 및 60분) 경과 후 2가지 서로 다른 타입의 생물 체액, 즉 인공 위액 및 인공 췌장 분비액에서 프로바이오틱 균주의 생존성 %를 나타낸다.
^^ 담즙 분비물의 존재 하의 생존성 결과는 담즙염을 "첨가" 및 "무첨가"한 특정 배지에서 증식한 콜로니의 수를 비교하여 수득하였다.
본 발명은 하기 균주를 포함하거나 또는 다른 예로 하기 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 락토바실러스 속에 속하는 인간 기원의 하나 이상의 박테리아 균주에 관한 것이다:
1. 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LMC1 (DSM 32252),
2. 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC3 (DSM 32253),
3. 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC4 (DSM 32254),
4. 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC5 (DSM 32255),
5. 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC6 (DSM 32256),
6. 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC7 (DSM 32257),
7. 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC8 (DSM 32258),
8. 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LMC9 (DSM 32259),
9. 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC10 (DSM 32260) 및/또는 이들의 혼합물 (그룹 1).
바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 균주를 포함하거나 또는 다른 예로 하기 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 락토바실러스 속에 속하는 인간 기원의 하나 이상의 박테리아 균주에 관한 것이다:
1. 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LMC1 (DSM 32252),
3. 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC4 (DSM 32254),
5. 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC6 (DSM 32256),
6. 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) LMC7 (DSM 32257),
7. 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC8 (DSM 32258),
및/또는 이들의 혼합물 (그룹 2).
유익하게는, 본 발명은 하기 균주를 포함하거나 또는 다른 예로 하기 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 락토바실러스 속에 속하는 인간 기원의 하나 이상의 박테리아 균주에 관한 것이다:
1. 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LMC1 (DSM 32252),
3. 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC4 (DSM 32254),
7. 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) LMC8 (DSM 32258),
및/또는 이들의 혼합물 (그룹 3).
상기 열거된 본 발명의 박테리아 균주는 실험 섹션에서 설명된 바와 같이 건강한 개체의 변 샘플로부터 단리되었으며, 모두 2016년 1월 29일자로 DSMZ [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany]에 기탁되었으며, 대응되는 등재 번호 DSM 32252-DSM 32260로 등록되었다. 단지 편의상, 전술한 균주들은 코드 LMC1-3-4-5-6-7-8-9-10로 상세한 설명에서 표시될 수 있다.
또한, 본 발명은, LMC1-3-4-5-6-7-8-9-10 코드를 가지며 특징 규명된 전술한 하나 이상의 락토바실러스 균주를 포함하거나 또는 다른 예로 이들로 구성되는 혼합물을 포함하는 약학적 조성물/제형, 또는 이들의 적절한 조합 (예, 상기 균주들 중 2 이상 또는 전체의 조합)에 관한 것이다.
일 구현예에서, 조성물은 그룹 2의 균주들로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하거나 또는 다른 예로 이들로 이루어진 혼합물을 포함한다.
다른 구현예에서, 조성물은 그룹 3의 균주들로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하거나 또는 다른 예로 이들로 이루어진 혼합물을 포함한다.
상기 혼합물에서, 본 발명의 하나 이상의 박테리아 균주 또는 락토바실러스 균주의 조합은 혼합물 1 g 당 1x106 내지 1x1012 CFU/g 범위의 총량으로 존재하며, 바람직하게는, 혼합물 1 g 당 1x107 내지 1x1011 CF/g, 더 바람직하게는, 혼합물 1 g 당 1x108 내지 1x1010 CFU/g 범위의 총량으로 존재한다.
상기 조성물에서, 본 발명의 하나 이상의 박테리아 균주 또는 락토바실러스 균주의 조합은, 조성물 1 g 당 1x106 내지 1x1011 CFU/g, 바람직하게는, 조성물 1 g 당 1x107 내지 1x1010 CF/g, 더 바람직하게는, 조성물 1 g 당 1x108 내지 1x109 CFU/g 범위의 총량으로 존재한다.
또한, 상기 조성물은 필요에 따라 공동-제형제 (co-formulant), 부형제, 담체, 계면활성제, 보강제, 보존제 및 착색제를 필수량 및/또는 적량으로 더 포함할 수 있다.
상기한 물질들은, 품질 및 양 측면에서 약학 제형 기술 분야의 당업자들에게 공지되고 일반적으로 사용되는 물질들 중에서 적절하게 선택된다.
상기한 약학적 조성물은 바람직한 투여에 최상으로 적합한 형태로 공급될 수 있다. 그 형태는 산업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 제조되는 약학적 형태들 중에서 임의로 선택될 수 있다 (예, 경구, 국소, 주사용). 전적으로 비-제한적인 예로서, 경구 투여용 조성물을 참조하여, 조성물은 구강세척제, 정제, 로젠제, 패스틸 (pastille), 환제, 캡슐제 (연질 또는 경질 코팅 구비, 제어 방출형), 설하 투여용 또는 예를 들어 투여 전에 물에 재구성하기 위해 사세트 안에 패킹하기 위한 산제 또는 과립제의 형태일 수 있다 (필요에 따라, 산제 또는 과립제는 특별한 특성, 예를 들어, 체내에서 바람직한 작용 부위에 따라 위-내성 및/또는 조절된/지연된 방출 특성을 투여할 수 있는, 적절한 약제학적으로 허용가능한 폴리머 또는 폴리머 혼합물 안에 병합되거나 또는 폴리머 또는 폴리머 혼합물로 코팅될 수 있음). 전적으로 비-제한적인 예로서, 국소 투여용 조성물을 참조하면, 조성물은 겔, 크림 또는 연고 형태일 수 있다.
상기 조성물은 산업계에서 일반적으로 사용되는 제조 장치 (믹서, 과립기, 교반기, 포장 장치 등) 및 널리 공지된 전통적인 기술을 적용해 제조된다. 당해 기술 분야의 당업자는 단순히 자신의 지식을 토대로, 제조 과정에서 해결되어야 하는 기술적인 문제에 가장 적합한 사항을 확인 및 선택하는데 어려움이 없을 것이다.
본 발명의 전술한 박테리아 균주 (자체 또는 이들의 조합) 뿐만 아니라 이의 약학적 제형은, 박테리아 생물막 (특히, 건강에 유해한 병원성 박테리아에 의해 생산된 생물막)의 형성 및/또는 증식을 저해 및/또는 차단 및/또는 감소시킬 수 있어 필수/바람직한 항세균 처리 (예, 항생제)를 최적으로 적용할 수 있는, 효과적이거나 또는 적어도 매우 유망한 물질인 것으로 입증되었다.
널리 공지되고 (19) 이미 언급된 바와 같이, 박테리아 생물막은 항세균 테라피 및 다른 잠재적인 병원체에 대해 박테리아 스스로를 위한 방어 장벽을 형성하므로, 인간 건강 뿐만 아니라 유해한 박테리아가 정상적으로 무균성인 해부학적 영역을 침범한 감염성 질환에도 결정적인 역할을 한다. 아래 실험 섹션에서 지적된 바와 같이, 본 발명의 모든 락토바실러스 균주는 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) (표 1)에 의한 생물막 생산을 유의한 수준으로 저해할 수 있었으며, 따라서 임상 대상이 되는 병원체 박테리아에 대항하는 락토바실러스의 중요한 역할이 입증되었다. 특히, 본원에 기술된 실시예에서, 박테리아 균주 LMC1-4-6-7-8은 최대 저해 활성을 나타내었다.
상층액 저해 %
LMC1 84
LMC4 82
LMC6 54
LMC7 62
LMC8 87
본 발명의 박테리아 균주 (그룹 2 및/또는 그룹 3) 및 이의 약학적 조성물은 따라서, 박테리아 생물막의 형성 및 증식을 자체적으로 방지 및 저해할 수 있는 능력으로 인해, 박테리아 생물막에 대한 탁월한/양호한 활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 박테리아 균주 및 이의 약학적 조성물은, 약물, 항생제, 살균제 및 그외 항미생물 활성을 가진 모든 물리적 및 화학적 물질들에 대한 높은 미생물 내성으로 인해, 생물막과 관련있는 모든 건강과 관련된, 그리고 건강과 무관한 병태들에 유익하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 박테리아 균주 (그룹 2 및/또는 그룹 3) 및 이의 약학적 조성물은, 하기한 용도로 유익하게 사용될 수 있다:
- 모든 표재성 감염 및 심부 감염, 일반적으로, 예를 들어, 비-제한적으로 외과적 상처 및 욕창의 치료;
- 보형물 또는 뼈 조직내 보형물의 삽입과 관련된 모든 감염의 치료;
- 혈관 카테터 및 뇨 카테터로 인한 감염의 치료;
- 스텐트, 심혈관 디바이스, 이과적 (otologic), 정형외과적 및 치과적 보형물, 스크류 및 네일 (nail)로 인한 감염의 치료;
- 구강 감염의 치료 (예, 항-생물막 및 항-플라그 구강세척제 사용) 및 구강 점막과 질 점막의 감염 치료;
- 박테리아 생물막이 감염의 지속 요인인 국소 감염 (예, 이염, 부비동염, 인후염, 후두염 및 폐렴)의 치료;
- 실험실에서, 단리 및 이의 적절한 식별을 어렵게 만드는, 박테리아가 특히 조직 및 보형물에 부착한 경우에 미생물학적 진단의 개선;
- 건강관리 분야에서, 일반적으로 외과적 기구 및 위생 기구로부터 생물막을 제거하기 위한 처리 (살균처리);
- 환경, 건강 및 식품 영역에서, 물 공급 및 살균 시스템 등에서, 레지오넬라 또는 그외 유해 미생물에 의해 형성된 생물막의 제거 및 살균처리를 위한 처리;
- 환경 및 식품 영역에서, 박테리아 생물막이 존재하는 용기, 바셀 및 수용 탱크를 살균처리하기 위한 처리.
따라서, 본 발명의 내용은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 박테리아 균주 및 이의 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 내용은, 또한, 약물, 항생제, 살균제 및 그외 항미생물 활성을 가진 모든 물리적 및 화학적 물질들에 대한 높은 미생물 내성이 원인인, 생물막과 관련있는 건강과 관련된, 그리고 건강과 무관한 병태들에, 약제로서 사용하기 위한, 특히 비-제한적인 예로, 전술한 건강-관련 및 건강과 무관한 병태들을 치료하는데 있어, 약제로서 사용하기 위한, 본 발명의 박테리아 균주 및 이의 약학적 조성물에 관한 것이다.
스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)에 의한 생물막 형성 저해력을 검증하기 위해, 본 발명의 락토바실러스를 대상으로 수행된 실험을, 전적으로 비-제한적인 예로서, 아래에 기술한다.
재료 및 방법
락토바실러스 균주 및 스타필로코커스 아우레우스
본 실험에 사용된 본 발명의 락토바실러스 균주 9종 (본 발명에서 이미 언급한 바와 같이 LMC1-3-4-5-6-7-8-9-10으로 표시됨)을 공지 방법을 이용해 건강한 개체의 변 샘플로부터 IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi (Milan, Italy)의 미생물 연구소에서 단리하였다. 락토바실러스 및 스타필로코커스 아우레우스 균주를 밤새 배양 브로스 - Brain-Hearth infusion (BHI, bioMerieux, Marcy l'Etoile, France) -에서 호기 조건 하 37℃에서 배양하였다.
락토바실러스 균주의 상층액에 대한 항-생물막 활성 평가 (크리스탈 바이올렛 분석)
락토바실러스 시험 균주로부터 수득한 상층액과 함께 인큐베이션하여, 생물막을 형성하는 능력 때문에 선택된 스타필로코커스 아우레우스의 메티실린 내성 균주에 의해 생산된 생물막을 정량함으로써, 여러가지 락토바실러스 균주의 상층액에서 항-생물막 활성을 조사하였다. 자신의 상층액에서 인큐베이션한 스타필로코커스 아우레우스에 의해 생산된 생물막의 양을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 락토바실러스 균주를 BHI에서 24시간 동안 전술한 바와 같이 인큐베이션하였다. 각 배양물 배지를 10분간 6,000 rpm으로 원심분리하여 상층액으로부터 박테리아 세포를 분리하였다. 그런 후, 스타필로코커스 아우레우스의 0.5 McFarland 현탁액 20 ㎕를, 새로운 96웰 마이크로플레이트에서 다양한 락토바실러스의 상층액 180 ㎕ 중에 첨가하여 인큐베이션하였다. 24시간 후, 비-부착 박테리아를 함유한 배지를 제거하고, 신선한 상층액 180 ㎕로 교체하였다. 그런 후, 플레이트를 48시간 인큐베이션하였다. 마지막으로, 박테리아 생물막을 Christensen et al. (18)에 언급된 분광광도측정 방법을 이용해 평가하였다. 96웰 플레이트에서 배양한 생물막을 공기 중에 건조시키고, 15분간 5% 크리스탈 바이올렛 (CV) 용액 중에 침지하여 염색한 다음 여러번 헹군 후 건조시켰다. 생물막-CV 결합을 에탄올 (96%) 3 ml로 용출시키고, 용출된 용액 100 ㎕를 마이크로플레이트 분광광도계 (MultiskanTM FC; Thermo Scientific; Milan, Italy)를 사용해 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하여, 생물막의 생중량을 정량하였다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경
공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용해 크리스탈 바이올렛 분석으로부터 수득한 결과를 검증하였다. 락토바실러스 상층액을 사용하였으며, 자신의 상층액 중의 스타필로코커스 아우레우스에 의해 생산된 생물막을 음성 대조군으로 사용하였다. 미생물 생물막을 MBEC Biofilm Inoculators (Innovotech Inc., Edmonton CA) 플레이트에서 제조사의 설명서에 따라 인큐베이션하였다. 웰에서 여러가지 락토바실러스 상층액 0.5 McFarland 현탁액 20 ㎕ 또는 스타필로코커스 아우레우스 균주의 상층액 (대조군)을 준비하였다. 상층액은 전술한 바와 같이 준비하였다. FilmTracerTM LIVE/DEAD® 생물막 생존성 키트 (Molecular Probes, Life Technologies Ltd., Paisley, UK)를 사용해, 샘플내 생중량을 확인하였다. 샘플들 모두 15분간 실온에서 암조건 하에 2종의 염료 STYO9 및 프로피듐 요오드화물 (PI) (식염수 1 mL 중의 각 물질 3 ㎕)의 혼합물을 적량 첨가하여 염색하였다. 이로써, 살아있는 박테리아를 죽은 박테리아로부터 구분할 수 있었다. 염색된 생물막을 63X 오일 대물렌즈를 사용해 공초점 현미경 (Leica TCS SP5; Leica Microsystems CMS GmbH, Mannheim, Germany) 하에 검경하였다. 488 nm 레이저를 사용해 SYTO9 염료를 여기시켰으며, 형광 방출을 500 nm - 540 nm에서 판독하였다. PI 염료는 561 nm 레이저로 여기시키고, 이의 형광 방출은 600 nm - 695 nm에서 판독하였다. 2개의 채널로부터 동시에 취득하여, 박테리아 이동으로 인한 형광 스팟들의 거짓 공동-위치화 (false colocalisation)를 최소화하였다. 각 샘플에 대해 2 ㎛의 연속 광학 단편을 획득하였으며, 이후 z 축에 순차적으로 입력하여 생물막의 전체 두께를 구하였다.
결과
락토바실러스 균주의 상층액의 항-생물막 활성 평가
다양한 락토바실러스 균주의 수득한 상층액과 함께 인큐베이션하여, (앞서 언급한) 생물막을 형성하는 능력 때문에 선택된 스타필로코커스 아우레우스의 메티실린 내성 균주에 의해 생산된 생물막을 정량 측정하였다. 수득한 결과 (첨부된 표 1에 나타냄)는 본 발명의 락토바실러스 균주 대부분이 스타필로코커스 아우레우스에 의한 생물막 형성을 유의한 수준으로 저해 (저해율 >50%)함을, 보여준다. 특히, 스타필로코커스 아우레우스를 각각 LMC 1, 4, 6, 7 및 8의 상층액과 인큐베이션할 경우, 생산된 생물막의 양이 현저하게 감소되는 것으로 확인되었다. 균주 LMC 1, 4, 6, 7 및 8은, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 생물막 생산을 저해하는 활성이 가장 우수한 균주로 확인되었다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경
스타필로코커스 아우레우스에 의한 생물막 생산에 대한 최상의 항-생물막 활성을 가진 균주 LMC8 (표 1 참조)를 바람직한 예로 선택하였다. 도 1은 대조군 샘플을 3D로 재구현한 것이고, 도 2는 이 생물막의 단면도이다. 도 1 및 도 2는 대조군 샘플에서 생산된 생물막 (즉, 스타필로코커스 아우레우스의 상층액 내에서 생산된 스타필로코커스 아우레우스의 생물막)을 나타낸 것이다. 스타필로코커스 아우레우스에 의해 생산된 생물막은 살아있는 세포 (녹색)와 죽은 세포 (적색)으로 이루어져 있다. 한편, 도 3은 LMC8의 상층액과 스타필로코커스 아우레우스를 인큐베이션하였을 때 생산된 생물막을 도시한다. 도 3을 도 1 및 2와 비교한 바, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 생물막 생산이, LMC8의 상층액 내에서 인큐베이션할 경우, 현저하게 감소됨을, 명확하게 관찰할 수 있다. 이들 데이타는 크리스탈 바이올렛 분석으로부터 앞서 수득한 결과를 검증해준다. 동일한 타입의 실험에서, 즉 실질적으로 동일한 방법이며 전술한 바와 비슷한 양을 적용한 실험을 일부 수정하여, 건강에 유해한 다른 박테리아 균주 (예, 칸디다 (Candida), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테오스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 및 프로피오니박테리움 아크네 (ropionibacterium acnes))에 의한 생물막 형성에 대항하는, 본 발명의 락토바실러스, 특히 균주 LMC8 및 균주 LMC1, LMC4, LMC6, LMC7 및 이의 혼합물을 사용해, 수행하였다. 수득한 결과는, 스타필로코커스 아우레우스에 대한 선행 실험 섹션에서 기술된 결과와 일치하는 것으로 확인되었다.
산업상 이용가능성
본 발명의 락토바실러스 및 이의 약학적 조성물은, 박테리아 생물막의 형성 및 증식을 자체적으로 방지 및 저해하는 능력으로 인해, 박테리아 생물막에 대해 항-생물막 활성을 가진 물질로서 우수한 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명의 박테리아 균주 및 이의 약학적 조성물은 약물, 항생제, 살균제 및 그외 항미생물 활성을 가진 모든 물리적 및 화학적 물질들에 대한 높은 미생물 내성으로 인해, 박테리아 생물막이 수반되는 모든 건강과 관련된, 그리고 건강과 무관한 병태들에서 유익하게 사용될 수 있다.
본 발명의 박테리아 균주 LMC-1 DSM 32252, LMC-3 DSM 32253, LMC-4 DSM 32254, LMC-5 DSM 32255, LMC-6 DSM 32256, LMC-7 DSM 32257, LMC-8 DSM 32258, LMC-9 DSM 32259, LMC-10 DSM 32260을 표현형 특징 (API 50 CHL)과 종-특이적인 PCR을 이용한 분자 동정을 통해 분류하였다.
표현형 특징:
API 50 CHL 갤러리 (bioMerieux code 50300)는 미생물에서 탄수화물 대사를 조사할 수 있다.
이 장치는, 첫번째가 활성 성분이 첨가되지 않은 음성 대조군 (블랭크)으로 구성되는, 마이크로튜브 50개로 구성된다. 이후의 마이크로튜브들은 각각 탄수화물 패밀리 및 유도체 (헤테로사이드, 폴리올, 유론산)에 속하는 탈수된 기질을 충분히 규정된 양으로 포함한다.
이들 기질은 대사되어, 배지의 pH 지시제 (브로모클레솔 퍼플)에 의해 드러나는 바와 같이, 혐기 (anaerobiosis) 조건 하에 산을 생산하므로써, 다양한 색조의 녹색을 거쳐 자주색/보라색이 노란색으로 바뀌는 색 변화가 이루어질 수 있다.
절차:
배양물 배지를 제거하고 멸균 증류수 2 ml에 재현탁하기 위해, 샘플을 5분간 10000 rpm으로 원심분리하였다. 접종원을 멸균 증류수 5 ml 중에 2 McFarland scale (bioMerieux)에 해당되는 양의 샘플로, 준비하였다. 이 현탁물을 API 50 CHL 배지 앰플에 접종하고, 즉시 갤러리로 분배하였다. 샘플의 혐기성 조건을 확보하기 위해, 파라핀 (bioMerieux) 2 방울을 각 돔에 점적하고, 온도-통제된 오븐에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
갤러리의 판독 결과를 여러가지 인큐베이션 시점, 24시간 및 48시간에 취하였다.
APIWEB 플러스 소프트웨어를 사용해 다양한 균주에 대한 표현형 분류를 수행하였으며; 프로그램으로 반응을 계산하여, 분석의 질적 평가와 더불어, 전형성 지수 (typicity index, T) 및 동정 % (%id)를 산출한다 (표 15의 결과).
탄수화물의 사용은 갤러리의 색 변화로 나타나며; 연한 녹색 또는 노란색이 나타나면 반응은 양성이고, 진한 녹색 또는 자주색이 나타나면 음성이다. 갤러리의 발색 체크는 블랭크인 갤러리 0번과 비교해 수행한다.
종-특이 PCR에 의한 분자 동정:
박테리아 염색체에는 리보솜을 형성하는 16s 및 23s rRNA라고 하는 유전자들이 존재하며, 이 위치는 가변 영역을 가진다 (동일 종의 박테리아에서 동일 서열을 가짐).
rRNA의 가변 영역에 속하는 서열의 특이성을 이용함으로써, 프라이머들 사이의 영역을 증폭할 종-특이 프라이머를 설계할 수 있다.
열 증폭 사이클 중에, DNA 주형이 이들이 설계된 종에 속하는 경우에만 프라이머가 어닐링되며, 증폭 산물로서, 염색체 DNA를 따라 올리고뉴클레오티드의 위치에 따라 크기가 결정되고 프라이머 간격이 멀수록 크기가 커지는 단편을 생성할 수 있을 것이다.
절차:
샘플을 MET_INT 049 현행 버전에 따라 처리하였다. 분류에 사용된 프라이머 쌍들은 표 14에 나타낸다:
박테리아 종 프라이머 명 뉴클레오티드 서열 Ta, ℃ 산물 (pb)
락토바실러스 루테리 LFPR CAG-ACT--AA-AGT-CTG-ACG-GT 55 300
REU AAC-ACT-CAA-GGA-TTG-TCT-GA
락토바실러스 파라카세이 서브. 파라카세이 W2 CACCGAGATTCAACATGG 50 280
Y2 CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT
락토바실러스 플란타룸 P-REV TCGGGATTACCAAACATCAC 56 318
PLAN F CCGTTTATGCGGAACACCTA
락토바실러스 람노수스 RHA GCG-ATG-CGA-ATT-TCT-ATT-ATT 58 350(+160)
PRI CAG-ACT--AA-AGT-CTG-ACG-GT
표 14. PCR 반응에 사용된 프라이머 쌍 리스트
세포 용해
각 균주 배양물 배지 1 ml을 5분간 10000 rpm으로 원심분리하였으며, 이후 세포를 멸균수 1 ml에 재현탁하고, 세척한 세포 2 ㎕를 Micro Lysis Buffer (Labogen) 18 ㎕에 첨가하고, 준비된 마이크로튜브를 써모사이클러에 장착하여, 특이적인 세포 용해 사이클을 수행하였다.
세포 용해된 물질을 이후 DNA 증폭에 그대로 사용하였다.
써모사이클링 처리할 각 샘플의 경우, PCR 반응 혼합물을 멸균 시험관에서 확립하였으며, PCR 마스터 믹스 (Promega code M7502) 12.5 ㎕, 멸균수 적량, 프라이머 1 (100 μM - 0.3 ㎕) 및 프라이머 2 (100 μM - 0.3 ㎕) 및 DNA 1 ㎕를 순서대로 첨가하였으며, 총 부피는 25 ㎕이다.
각 PCR 반응에서, 다음과 같이 투입하였다: 국제 기관에서 수득한 참조 균주의 DNA로 구성되며 분석 샘플과 동일한 박테리아 종에 속하는 양성 대조군, 국제 기관에서 수득한 참조 균주의 DNA로 구성되며 분석 샘플과는 다른 박테리아 종에 속하는 음성 대조군, 및 임의의 오염을 체크하기 위해 반응 완충제 단독으로 구성된 블랭크.
표 1에 명시된 샘플 및 해당 어닐링 온도 (Ta)에 따라, 샘플에 대해 락토바실러스에 대한 열 사이클 (MET-INT 049, 현 버전)을 수행하였다.
수득한 증폭 산물은 에티듐 브로마이드 (5 ㎕/10ml)가 첨가된 1X TAE 완충제 중에 1% 아가로스 겔에서 전기영동 (30분, 80V)하였다.
PCR 50-2000 bp 마커 (SIGMA code P9577)를 사용해 증폭된 단편의 크기를 추정하였다.
전기영동이 끝나면, 아가로스 겔을 투과조명기 (transilluminator, Gel-Doc, BIO-RAD)를 사용해 자외선 하에 관찰하였으며; 그 결과를 표 15에 나타낸다.
결과:
균주 API 50 CHL 종-특이 PCR
LMC-1 DSM 32252 우수한 수준으로 락토바실러스 플란타룸으로 동정됨 %ID 99.6 T 0.96 락토바실러스 플란타룸에 대한 양성 결과
LMC-3 DSM 32253 *양호한 수준으로 락토바실러스 퍼멘툼으로 동정됨 %ID 98.3 T 0.86 락토바실러스 루테리에 대한 양성 결과
LMC-4 DSM 32254 우수한 수준으로 락토바실러스 파라카세이 ssp 파라카세이로 동정됨 %ID 99.3 T 0.68 락토바실러스 파라카세이에 대한 양성 결과
LMC-5 DSM 32255 *양호한 수준으로 락토바실러스 퍼멘툼으로 동정됨 %ID 96.9 T 0.91 락토바실러스 루테리에 대한 양성 결과
LMC-6 DSM 32256 미확인 프로파일 락토바실러스 람노수스에 대한 양성 결과
LMC-7 DSM 32257 미확인 프로파일 락토바실러스 람노수스에 대한 양성 결과
LMC-8 DSM 32258 모호한 수준으로 락토바실러스 파라카세이 ssp 파라카세이로 동정됨 %ID 99.7 T 0.56 락토바실러스 파라카세이에 대한 양성 결과
LMC-9 DSM 32259 *양호한 수준으로 락토바실러스 퍼멘툼으로 동정됨 %ID 96.9 T 0.91 락토바실러스 루테리에 대한 양성 결과
LMC-10 DSM 32260 허용불가한 프로파일 락토바실러스 람노수스에 대한 양성 결과
표 15. 표현형 및 분자 특징에 대한 수득 결과.
* 락토바실러스 루테리 종은 APIWEB 소프트웨어에서 나타나지 않으며, 그래서 수득된 결과는 계통발생학적으로 가장 가까운 종들에 관한 것이며, 그 결과는 종-특이 PCR에 의해 항상 검증하여야 한다.
Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/LMG Bacteria Collection LMGP21021 20011016 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32252 20160129 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32253 20160129 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32254 20160129 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32255 20160129 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32256 20160129 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32257 20160129 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32258 20160129 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32259 20160129 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM32260 20160129

Claims (9)

  1. 2016년 1월 29일자로 DSMZ [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany]에 모두 기탁된, 하기 균주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 락토바실러스 종에 속하는 인간 기원의 박테리아 균주:
    락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 기탁번호 DSM 32252 LMC1];
    락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 기탁번호 DSM 32254 [LMC4];
    락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 기탁번호 DSM 32256 [LMC6];
    락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 기탁번호 DSM 32257 [LMC7]; 및
    락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 기탁번호 DSM 32258 [LMC8].
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주가 유해 박테리아 균주, 바람직하게는 칸디다 (Candida), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테오스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 프로피오니박테리움 아크네 (ropionibacterium acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 중에서 선택되는 균주에 의한 생물막 형성에 대항하는 활성을 가진, 박테리아 균주.
  3. 2016년 1월 29일자로 DSMZ [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany]에 모두 기탁된, 하기 균주들을 포함하는 군 또는 하기 균주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하거나 또는 이들로 구성된 혼합물을 포함하는 조성물:
    락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 기탁번호 DSM 32252 [LMC1];
    락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 기탁번호 DSM 32254 [LMC4];
    락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 기탁번호 DSM 32256 [LMC6];
    락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 기탁번호 DSM 32257 [LMC7];
    락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 기탁번호 (DSM 32258 [LMC8],
    및/또는 이들의 조합.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물이 하기 균주들을 포함하는 군 또는 하기 균주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하거나 또는 이들로 구성된 혼합물을 포함하는, 조성물:
    락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) (DSM 32252)[LMC1];
    락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) (DSM 32254)[LMC4];
    락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) (DSM 32258)[LMC8], 및/또는
    이들의 조합.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 조성물이 약제로서 사용하기 위한 것인, 조성물.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 하기 용도로 사용하기 위한 것인, 조성물:
    - 외과적 상처 또는 욕창의 경우, 표재성 감염 및 심부 감염의 치료;
    - 혈관 카테터 및 뇨 카테터로 인한 감염의 치료;
    - 스텐트, 심혈관 디바이스, 보형물, 인공 삽입물 (prosthetic insertion), 이과적 (otologic), 정형외과적 (orthopaedic) 및 치과 (dental) 보형물, 스크류 및 네일 (nail)로 인한 감염의 치료;
    - 구강 감염, 구강 점막 감염 및 질 점막 감염의 치료;
    - 국소 감염, 이염 (otitis), 부비동염, 인후염, 후두염 및 폐렴의 치료;
    - 실험실에서, 샘플의 미생물학적 진단 가능성을 향상시키기 위해, 조직 및 보형물에 특히 부착된 박테리아 생물막의 처리;
    - 건강관리 분야에서, 일반적으로 외과 기구 및 위생 기구로부터 생물막을 제거하기 위한 처리 (살균처리);
    - 환경, 건강 및 식품 영역에서, 물 공급 및 살균 시스템 등에서, 레지오넬라 또는 그외 유해 미생물에 의해 형성된 생물막의 제거 및 살균처리하기 위한 처리;
    - 환경 및 식품 영역에서, 박테리아 생물막이 존재하는 용기, 바셀 및 수용 탱크를 세척하기 위한 처리;
    - 약물, 항생제, 살균제 및 항미생물 활성을 가진 물리적 및 화학적 물질에 대한 높은 미생물 내성으로 인해 형성된 박테리아 생물막의 처리.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합물에 포함된 하나 이상의 박테리아 균주가 상기 혼합물 1 g당 1x106 내지 1x1012 CFU/g, 바람직하게는, 1x107 내지 1x1011 CF/g, 더 바람직하게는, 1x108 내지 1x1010 CFU/g을 포함하는 총량으로 존재하는, 조성물.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합물에 포함된 하나 이상의 박테리아 균주가 상기 혼합물 1 g당 1x106 내지 1x1011 CFU/g, 바람직하게는, 1x107 내지 1x1010 CF/g, 더 바람직하게는, 1x108 내지 1x109 CFU/g을 포함하는 총량으로 존재하는, 조성물.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 유해 박테리아 균주, 바람직하게는 칸디다 (Candida), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테오스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 프로피오니박테리움 아크네 (ropionibacterium acnes) 및 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 중에서 선택되는 균주에 의한 생물막의 형성에 대항하는 활성을 가진, 조성물.
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