JPS63258587A - 発酵法によるピルビン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は発酵法によるピルビン酸の製造方法に関するも
のである。

ピルビン酸は生体代謝の重要な中間体であり、各種医・
農薬などの有効な合成原料であるのみならず酸素法によ
るＬ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン
などのアミノ酸合成の主要原料である。よって安価に製
造し得れば、種々の合成原料として有用である。

〈従来の技術〉 従来、発酵法によるピルビン酸の製造法としては、サツ
カロミセス属およびキャンディダ属などの酵母菌とその
変異株や担子菌類または特殊なバクテリアによる方法が
知られている（特公昭５７−７９６号公報など）。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、かかる従来方法はエタノール、α−ゲト
グルタル酸などの副生物が多かったり、または、収率・
収量が十分でなかったりしたため工業的に有利な方法と
はいえなかった。

く問題点を解決するための手段および作用〉したがって
本発明者らは、上記問題点を解決することができ、さら
に生産性の高いピルビン酸の製造方法について鋭意研究
した結果、トルロプシス属に属し、ピルビン酸生産能を
有する微生物に、アルギニンを要求する性質を付与する
ことにより、ピルビン酸の蓄積濃度、生成収率が著しく
向上することを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明の上記目的は、トルロプシス属に属し
、ピルビン酸生産能を有する微生物のうち・アルギニン
要求株を培養することにより、培地中にピルビン酸を生
成蓄積させ、これを採取することにより達成されるので
ある・すなわち、本発明はトルロプシス（Ｔｏｒｕ　１
ａｐｓｉｓ）属に属し、生育のためにアルギニンを要求
し、かつピルビン酸生産能を有する変異株を培養して培
養液中にピルビン酸を生成蓄積せしめ、培養液中よりピ
ルビン酸を採取することを特徴とする発酵法によるピル
ビン酸の製造方法である。

次に、本発明の詳細な説明する。

本発明に用いられる変異株は、ピルビン酸生産能を有し
、生育のためにアルギニンを要求するトルロプシス属に
属する微生物であればいかなるものであってもよい。

本発明に用いられる変異株の代表的なものとしては、た
とえばトルロプシス・グラブラータｘ−１５（ＦＥＲＭ
　　Ｐ　−２３／６）　　にニコチン酸、チアミン、ピ
リドキシ、ビオチン、アルギニン要求性）が挙げられる
。この変異株はトルロプシス・グラブラータＩＦＯ００
０５にニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、ビオチン
要求性）を親株として通常の変異処理方法によって誘導
されたものである。

このような変異株は、生育のためにアルギニンを要求し
ない野生株または親株に紫外線照射、あるいはＮ−メチ
ル−Ｎ−二トローＮ−ニトロソグアニジン処理し、エチ
ルメタンスルホネート（以下、ＥＭＳと略す）処理など
の通常の変異処理を施することによって容易に得ること
ができる。

ここにいうアルギニン要求性とは、広義の意味であり、
不完全欠失型（いわゆるＬｅａｋｙ型）も含むものであ
る。さらにアルギニンの生合成前駆物質で要求性が満足
される場合も含むものである。

本発明で用いられる培地は発酵に通常使用される炭素源
、窒素源、無機塩類、ビタミン類などをほどよく含有す
るものであればよいが、炭素源としては、グルコースな
どの糖質、有機酸、エタノール、メタノールなどの使用
酵母菌が利用し得るものが使用される。窒素源としては
硫安、硝安、塩安、尿素、ペプトン、肉エキス、味液、
その池の有機および無機窒素化合物が使用されるが、望
ましくはアミノ酸をバランスよく含む有機窒素化合物が
よい、無機塩類としてはリン酸カリウム、ｖＸ酸マグネ
シウム、鉄、マンガン、その他の無機塩類が用いられ、
さらに必要に応じてチアミン、ナイアシン、ピリドキシ
ン、ビオチンなどの要求ビタミン、またはこれらを含有
する酵母エキス、コーンスチープリカー、その他の天然
物を添加した培地を使用すればよい。

培養中はピルビン酸の生成蓄積にともない、ｐＨの低下
が起こるので炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性カリな
どのアルカリでＰＨ３〜７に調節することがピルビン酸
生産には有効である。培養中の温度は２２°Ｃ〜３２°
Ｃが適当である。培養終了後、系内に蓄積したピルビン
酸は常法により、単離採取することができる。

例えば、酸性エーテル抽出、フェニルヒドラゾン化して
沈澱単離する方法なども採用することができる。

〈実施例〉 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。

実施例１ （Ｌ−アルギニン要求性変異株の取得）トルロプシス・
グラブラータＩＦＯ０００５（ニコチン酸、チアミン、
ピリドキシン、ビオチン要求）の菌体を常法により８Ｍ
Ｓ処理（Ｉ　Ｗ／Ｖ％、３０℃で３時間）したのち、栄
養寒天培地（ＧＰ寒天培地、大五栄養化学株式会社製）
に接種し、３０℃で２日間培養し、ａｃｔ。

Ｙｅａｓｔ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｂａ５ｅ（ＤＩＦＣＯ■製
、以下、ＹＣＢ培地と略す）に、硫安５　ｇ　／　１を
加えた寒天培地（八）とＹＣＢ培地に硫安５　ｇ　／　
１、Ｌ−アルギニン１００■／ｊ２を加えた寒天培地（
Ｂ）に各々レプリカした０次に３０°Ｃで３日間培養し
、実施例２の方法によって寒天培地（Ｂ）で生育し、寒
天培地（八）で生育しないコロニーを釣菌分離し、Ｌ−
アルギニン要求性変異株トルロプシス・グラブラータＸ
Ｘ−１５（ＦＥＲＰ−２３／ろ）を取得しな。

実施例２ （アルギニン要求性の検定） 下記第２表に示す各菌株を、ＧＰ寒天斜面培地で２４時
間培養しその菌体をご＜１ｆａ量かきとり、Ｌ−アルギ
ニン無添加、およびし−アルギニン０．０１％添加した
硫安５　ｔ　／　Ｊ！を含むＹＣＢ寒天平板培地にうず
く塗布し、３０℃のて４日間培養しその生育の有無を観
察した。Ｌ−アルギニン無添加寒天平板培養で生育でき
ず、Ｌ−アルギニン添加寒天平板培地で生育するものを
し一アルギニン要求性変異株とした。

結果は第２表に示すとおりであり、本発明方法で使用す
るし一アルギニン要求性株トルロプシス・グラブラータ
Ｘ−１５は、それぞれ親株のトルロプシス・グラブラー
タＩＦＯ０００５との比較より明らかに、Ｌ−アルギニ
ン要求性を獲得している。

第　　　２　　　表 （注）＋：生育あり　　−：生育なし 実施例３ （ピルビン酸の生産） グルコース１０％、硫安０．３％、ポリペプトン０．５
％、ニコチン酸２＋ｗ／１２、ピリドキシン・塩酸塩４
００μｇ／ｉ、チアミン・塩酸塩２０、ｔｉｔ　／　１
　、ビオチン５μｇ　／　１を含む発酵培地を１１のマ
イヤーフラスコに４０ｍ１づつ分注し、滅菌後、別滅菌
した炭酸カルシウム４％を添加し、親株トルロプシス・
グラブラータＩＦＯ０００５およびアルギニン要求性変
異株トルロプシス・グラブラータＸ−１５を各々接種し
、３０℃で６０時間培養した。ただし、変異株は発酵培
地にし一アルギニン０．０３％を添加して培養した。培
養液中に生成したピルビン酸を高速液体クロマトグラフ
ィーにて定量した。

結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表 なお、収率は消費グルコースに対するピルビン酸の重量
で表わした。

本発明例のトルログシス・グラブラータＸ−グラブラー
タＸ−１５を用いた方法は、蓄積濃度、ピルビン酸生成
収率ともいずれも親株より顕著に向上している。

次に、Ｘ−１５の培養液２００　ｍｌを除菌後、上澄液
に塩酸を加えｐＨ２，０とし、エチルエーテルで抽出し
、次いで苛性ソーダでｐＨを５゜５に中和した後４０℃
で減圧濃縮し、５ｍｌ程度とした。この濃縮液にエタノ
ールを滴下させピルビン酸ソーダ５．９１ｇ　（純度９
７％）を得た。

〈発明の効果〉 本発明方法によれば、ピルビン酸の蓄積量、収率が向上
し、より安価なピルビン酸の生産が可能になった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属に属し、生育
   のためにアルギニンを要求し、かつピルビン酸生産能を
   有する変異株を培養して、培養液中にピルビン酸を生成
   蓄積せしめ、培養液中よりピルビン酸を採取することを
   特徴とする発酵法によるピルビン酸の製造方法。