JPH039110B2

JPH039110B2 -

Info

Publication number: JPH039110B2
Application number: JP7836580A
Authority: JP
Inventors: Fusao Tomita; Hirofumi Nakano; Tomoyasu Sato; Kimikatsu Shirahata; Mayumi Koda; Makoto Morimoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1980-06-12
Filing date: 1980-06-12
Publication date: 1991-02-07
Also published as: JPS574975A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一般式（）（式中、Ｒは水素原子またはＮ，Ｎ−ジメチル
セリル基を表わす。）で表わされるフエナジン誘
導体およびその塩ならびにそれらの製造法に関す
る。一般式（）で表わされるフエナジン誘導体の
塩としては、ナトリウム，カリウムなどのアルカ
リ金属塩があげられる。一般式（）において、
Ｒが水素原子であるとき、該化合物は１−（２−
ハイドロキシ−５−オキソ−サイクロペント−１
−エニル）カルバモイル−６−（ヒドロキシメチ
ル）−９−メトキシフエナジン（以下DC−59−Ｈ
と称する。）であり、ＲがＮ，Ｎ−ジメチルセリ
ル基であるとき、該化合物は１−（２−ハイドロ
キシ−５−オキソ−サイクロペント−１−エニ
ル）カルバモイル−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルセリ
ルオキシメチル）−９−メトキシフエナジン（以
下、DC−59−Ａと称する。）である。本発明の化合物は、各種の菌に抗菌作用を有
し、さらに抗腫瘍作用も有すると推定される有用
な化合物である。本発明者らは、大阪府堺市の土
壌より分離された菌株（DO−59株と称する。）
を培地に培養すると、培養物中にDC−59−Ｈま
たはDC−59−Ａが生産されることを見い出し本
発明を完成した。次に本発明に用いられるDO−59株の菌学的性
質について記述する。 (A) 形態的性質 DC−59株は、一般の分離用培地で気菌糸を着
生し、その形態は、スパイラル型である。胞子は
10個以上連鎖し、表面は突起状（ワーテイ）であ
る。胞子の形状は楕円形（0.4〜0.7×0.8〜1.2μ）
である。分枝法は単純分枝で車軸分枝は認められ
ない。胞子のう及び胞子に鞭毛はない。また菌核
の形成も認められなかつた。 DO−59株を各種培地上で生育させたときの生
育状態、コロニーの表面および裏面の色、および
可溶性色素について第１表に示す。色は表示はColor Harmony Manual
（Container Corporation of America）による
色の分類に従つたものである。

【表】 (B) 生理学的性質 DO−59株の生理学的性質について第２表に示
す。温度、ミルク及び繊維素に対する作用以外の
ものについては27℃で２週間後の観察結果を示
し、温度は５日後、ミルクおよび繊維素に対する
作用については１ケ月後の結果を示す。第２表 DO−59株の生理学的性質 (1) 炭素源の資化性炭素源資化性Ｄ−アラビノース＋Ｄ−キシロース＋Ｄ−グルコース＋Ｄ−フラクトース＋シユクロース＋イノシトール＋Ｌ−ラムノース＋ラフイノースＤ−マンニツト＋コントロール（炭素源無添加 − (2) ゼラチンの液化 ± (3) ミルクに対する作用液化ありペンプトン化なし (4) 繊維素の分解わずかにある (5) 澱粉の加水分解ある (6) 至適生育PH 6.8〜7.5 (7) 至適生育温度 28〜38℃ (8) チロシナーゼの生成わずかにある (9) メラノイド色素の生成なし以上の性状からDO−59株はストレプトマイセ
ス属に属する放線菌に分類される。この菌に属す
る種に関するE.K¨uster（Intern.J.System.
Bacteriol.，22巻 No.３ 139頁，1972）による
分類によれば、DO−59株に類似の菌としてスト
レプトマイセス・エンダスがあげられる。しかし
ストレプトマイセス・エンダスは可溶性色素は生
産せずまたシユクース，イノシトール，フライノ
ースでは生育がほとんど認められないと記載され
ている（E.B.Shirling and D.Goulieb，Intern，
J.System.Bacteriol.，18（４），279〜392頁，
1968）。一方DO−59株は上記のように可溶性色素を生
産しまた糖の利用能も異るところから、ストレプ
トマイセン・エンダスとは区別できる。しかしな
がら、胞子の形状からDO−59株をストレプトマ
イセス・エンダスに属する菌株と考えるのが妥当
である。そこでDO−59株をDO−59株が生産す
る黄色色素に因んでストレプトマイセス・エンダ
ス・サブスペシーズ・オーレウスDO−59株
（Streptomyces endus subsp.Aureus DO−59）
と命名した。この菌は茨城県筑波群谷田部町東１−１−３に
所在する工業技術院微生物工業技研究所およびア
メリカ合衆国イリノイ州ペオリアに所在するU.S.
Department of Agricultureにそれぞれ寄託さ
れ、微土研菌寄第5519号およびNRRL12174の受
託番号が与えられている。以下に本発明を詳細に説明する。本発明により提供されるDC−59−ＡおよびDC
−59−Ｈの理化学的性質を以下に示す。 (1) DC−59−Ａの理化学的性質元素分析値：Ｃ：60.45％Ｈ：5.40％
Ｎ：11.05％分子量：494 FDマススペクトルによる主なピーク： 495（Ｍ＋１），379，363，134 分子式：C₂₅H₂₆N₄O₇ 融点：190℃ 紫外部吸収スペクトル（95％エタノール
中）：第１図赤外部吸収スペクトル（KBr錠剤法）：第２
図 PMRスペクトル（CDCl₃中，TMS基準）
2.39（6H，ｓ），2.67（4H，ｓ），3.3〜3.9（3H，
ｍ），4.28（3H，ｓ），5.82（2H，ｓ），7.09（1H，
ｄ），7.88（1H，ｄ）7.96（1H，ｄ，ｄ），8.40
（1H，ｄ，ｄ），8.93（1H，ｄ，ｄ），12.80
（1H，ｓ），約14（1H，broad） CMRスペクトル（CDCl₃中，TMS基準）
17.05（ｓ），164.1（ｓ），155.6（ｓ），142.6（ｓ）
，
138.8（ｓ），136.1（ｄ），135.0（ｄ），132.2（ｄ）
，
130.2（ｄ），126.9（ｓ），125.0（ｓ），115.0（ｓ）
，
106.8（ｄ），68.1（ｄ），62.3（；），59.2（ｔ），
56.2（ｑ），41.6（ｑ），☆ 29.2（ｔ） ☆ CD₃ODを加えたときのみ検出される。溶解性：クロロホルム，DMSO，DMF，ジ
オキサンに易溶，エタノール，メタノール，酢
酸エチル，水に可溶，エチルエーテル，ｎ−ヘ
キサンには難溶。薄層クロマトグラフイー：シリカゲル薄層
（Kieselgel60，Art5721，E.Merck社製西独）
でクロロホルム：メタノール（９：1v／ｖ）
の展開系でRfは0.52であり酢酸エチル：メタノ
ール（８：2v／ｖ）の展開系でRfは0.12であ
る。平面構造式：以上のデータおよび希アルカリ
処理により後の(2)に述べるDC−59−Ｈを生ず
ることから次の一般式を有する化合物であるこ
とが確認された。 DC−59−Ａは文献未記載の新規化合物である。 (2) DC−59−Ｈの理化学的性質元素分析値：Ｃ：63.58％Ｈ：4.45％
Ｎ：10.89％分子量：379 EIマススペクトルによる主なピーク：379
（Ｍ），267，240 高分解能マススペクトル：379，1181 分子式：C₂₀H₁₇N₃O₅ 融点：明確な融点を示さず282〜290℃で分解紫外部吸収スペクトル（95％エタノール
中）：第３図赤外部吸収スペクトル（KBr錠剤法）：第４
図 PMRスペクトル（CDCl₃中，d₆−
DMSO1drop，TMS基準） 2.67（4H，ｍ），4.30（3H，ｓ），5.30（2H，
ｍ），7.13（1H，ｄ），7.85（1H，ｄ），8.00（1H，
ｄ，ｄ），8.49（1H，ｄ，ｄ），8.98（1H，ｄ，
ｄ），12.96（1H，broad，ｓ），13.76（1H，ｓ）溶解性：クロロホルム，DMF，DMSOに可
溶，メタノール，エタノール，水に難溶（塩基
性では可溶），ｎ−ヘキサンに不溶。薄層クロマトグラフイー：シリカゲル薄層
（Kieselgel60，Art5721，Ｅ，Merck社製西
独）でクロロホルム：メタノール（９：1v／
ｖ）の展開系ではRfは0.78であり、酢酸エチ
ル：メタノール（８：2v／ｖ）の展開系でRf
は0.45である。平面積造式：以上のデータから次の一般式を
有する化合物であることが確認された。又、DC−59−Ｈも文献末記載の新規化合物で
ある。次に、DC−59−ＡおよびDC−59−Ｈの各種細
菌に対する抗菌活性（寒天希釈法PH7.0）を第３
表に示す。

【表】次に本発明化合物の抗腫瘍活性を示す。実験に
はDC−59−ＡとDC−59−Ｈの混合比が６：４の
化合物（以下、DC−59−混合物と称す。）を用い
た。実験方法サルコーマ180腹水型腫瘍に対する治療効果体
重約20ｇのddy雄マウス１群６匹にサルコーマ
180腹水型腫瘍細胞５×10⁶個を腋窩部皮下に移植
した。移植後24時間目に各種濃度のDC−59−混
合物の燐酸緩衝液生理食塩水（PBS）溶液0.2ml
を１回腹腔内に投与した。PBSの組成はNaCl0.8
ｇ／dl、KCl0.02ｇ／dl，Na₂HPO₄1.15ｇ／dl，
KH₂PO₄0.02ｇ／dl，PH7.2のものである。比較例
として腫瘍細胞移植後24時間目にマイトマイシン
Ｃを含むPBS0.2mlを腹腔内に投与した群を設け
た。移植10日後のＴ／Ｃ（Ｔ：試験例の平均腫瘍
体積、Ｃ：PBS0.2mlを腹腔内投与したものの平
均腫瘍体積）を測定し、第４表に示す結果を得
た。

【表】以上の結果DC−59−混合物は抗腫瘍活性を有
しており、DC−59−混合物中のDC−59−Ａと
DC−59−Ｈとの量比、DC−59−ＡおよびDC−
59−Ｈの構造相関ならびにその抗菌活性などから
両化合物が共に抗腫瘍活性を有しているものと推
定される。従つて両化合物は、それぞれ抗菌剤のみなら
ず、抗腫瘍剤としての利用が期待される。次に、DC−59−ＨまたはDC−59−Ａの製造法
について説明する。 DC−59−ＨまたはDC−59−Ａは、ストレプト
マイセス属に属し、DC−59−ＨまたはDC−59−
Ａを生産する能力を有すする微生物を培地に培養
し、DC−59−ＨまたはDC−59−Ａを培養物中に
蓄積せしめ、該培養物からDC−59−ＨまたはDC
−59−Ａを採取することによつて得ることができ
る。本発明において使用する微生物はストレプトマ
イセス属に属し、DC−59−ＨまたはDC−59−Ａ
を生産する能力を有する微生物であればいずれの
微生物も用いることができる。好適な菌株として
は前記DC−59株があげられる。DO−59株の菌学
的性質は前記の通りであるが、この菌株はストレ
プトマイセス属に属する既知菌種の場合にみられ
るように、その性状が例えば紫外線、Ｘ線、薬品
等の人工的変異手段で変異することもあるが、こ
のような変異株であつてもDC−59−ＨまたはDC
−59−Ａの生産能を有するものはすべて本発明に
適用できる。本発明の培養においては通常の放射菌の培養法
が一般に用いられる。培養のための栄養源として
は下記に示すごとくいろいろのものが用いられ
る。炭素源としてはブドウ糖、殿粉、デキストリ
ン、マンノース、フラクトース、シユークロー
ス、ラクトース、キシロース、アラビノース、マ
ンニトース、糖蜜などが単独または組み合わせて
用いられる。さらに、菌の資化能によつては炭化
水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。
無機および有機の窒素源としては塩化アンモン、
硫酸アンモン、硝酸アンモン、硝酸ソーダ、尿素
などがまた天然窒素源としてはペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・
リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組
み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて
食塩、塩化カリ、硫酸マグネシウム、炭酸カルシ
ウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウ
ム、硫酸第一鉄、塩化カリシウム、硫酸マンガ
ン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。
さらに使用菌の生育やDC−59−ＡおよびDC−59
−Ｈの生産を促進する微量成分例えばビタミン
B₁、ビオチンなどを適当に添加することができ
る。培養法としては、液体培養法、とくに深部撹拌
培養法がもつとも適している。培養温度は25〜40
℃、特に28〜38℃が最適で、培地のPHはアンモニ
ア水や炭酸アンモン溶液などを添加して、PH４〜
10、好ましくは６〜８で培養を行なうことが望ま
しい。液体培養で通常１日ないし７日培養を行な
うと、DC−59−ＡおよびDC−59−Ｈが培養物中
に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を
停止し、菌体を別し、培養液と菌体にわける。培養液からのDC−59−ＡまたはDC−59−Ｈ
の単離精製には、微生物代謝生産物を、その培養
液から単離するために用いられる通常の分離・精
製法が利用される。例えば、培養生産物を培養液
と菌体とに分離し、培養液はPH５〜６に調整し、
非イオン性多孔性樹脂（たとえば、商品名「ダイ
ヤイオンHP−20」三菱化成社製など）を通過さ
せ、活性成分を吸着させた後、メタノール、アセ
トン、酢酸エチルなどを用いて吸着物質を脱着さ
せる。この脱着液を濃縮乾固し、セライト粉末に
吸着させた粉末を得る。この粉末を予め酢酸エチ
ルで懸濁後、カラムに充填したシリカゲルを用い
てクロマトグラフイーを行う。まず酢酸エチルを
通塔することによつて不純物を除去し、次いで酢
酸エチル：アセトン（１：1v／ｖ）で溶出する
とDC−59−Ｈの画分が溶出される。続いて酢酸
エチル：メタノール（９：1v／ｖ）で溶出する
とDC−59−Ａの画分が得られる。得られたDC−
59−ＨまたはDC−59−Ａをそれぞれ濃縮し、ク
ロロホルムに溶解し、酢酸エチルとメタノールを
加えて放置すると純品の結晶が得られる。次に実施例をあげる。実施例中、DC−59−ＡおよびDC−59−号の動
向はバチルス，ズブチリスNo.10707を用いるバイ
オアツセイまたは薄層クロマトグラフイーにより
DC−59−ＡおよびDC−59−Ｈの紫外部吸収を目
安にして追跡した。実施例１種菌としては、ストレプトマイセス・エンダ
ス・サプスペシーズ・オーレウスDO−59（微工
研菌寄第5519）を用いた。該菌株の１白金耳を50
ml容量の太型試験管中の種培地（デキストリン20
ｇ／，グルコース10ｇ／，ペプトン10ｇ／
，酵母エキス１ｇ／，KH₂PO₄0.5ｇ／，
MgSO₄・7H₂00.5ｇ／，CaCO₃1ｇ／，PH
7.2）10mlに植菌し、30℃で24時間振盪培養した。
かくして得られた種培養液10mlを２容量の三角
フラスコ中の種培地（培地組成：記と同じ）300
mlに植菌し、30℃で24時間振とう（220r.p.m）培
養した。かくして得られた種培養液を30容量の
ジヤーフアーメンター中の下記組成の発酵培地18
に10％（割合）で移し、30℃で通気撹拌方式
（回転数350r.p.m.通気量18／min）により培養
を行つた。発酵培地組成：フラクトース40ｇ／，酵母エキ
ス１ｇ／，グルタミン酸モノナトリウム2.2
ｇ／，ヒスチジン塩酸塩0.8ｇ／，K₂HPO₄1
ｇ／，MgSO₄・7H₂O5mg／，ZnSO₄・
7H₂O10mg／，CaCl₂・2H₂O10mg／，
FeSO₄・7H₂O10mg／，Cocl₂・6H₂O0.006mg／
，CaCO₃1ｇ／，PH7.2 培養中培地のPHは制御しないで、72時間培養し
た。培養液より菌体および沈殿物を別し、液
15を得た。液のPHを塩酸で５に調整した後、
該液を0.8の非イオン性多孔性樹脂（商品名
「ダイヤイオンHP−20」三菱化成社製）に通塔
して活性物質を吸着させた。水３で水洗後、メ
タノール：水（４：６）ｖ／ｖ）10で洗い不純
物を除去した。次いで、酢酸エチルで溶出した。酢酸エチル溶出区分３を約100mlまで濃縮後、
0.01M燐酸緩衝液（PH6.0）200mlとクロロホルム
300mlを加えて抽出を行つた。抽出したクロロホ
ルム層を無水硫酸ソーダで脱水後、濃縮し、少量
のクロマトグラフイー用シリカゲル（関東化学社
製）にまぶして粉末状とした。この粉末サンプル
を、予め酢酸エチルで懸濁後カラムに充填したシ
リカゲル（100ml）のカラムに乗せた後、酢酸エ
チルを通塔することによつて不純物を除去し、次
いで酢酸エチル：アセトン（１：1v／ｖ）で溶
出するとDC−59−Ｈの画分が溶出された。この
画分を濃縮後、該濃縮物を少量のクロロホルムに
溶解し、これに酢酸エチルとメタノールを加えて
４℃に放置し、針状結晶としてDC−59−H41mg
を得た。実施例２種菌、種培地および発酵培地として実施例１で
用いたのと同じものを用いた実施例１と同様に培
養した。培養液より菌体および沈殿物を別し、液15
を得た。液のPHを塩酸で５に調整した後、該
液0.8の非イオン性多孔性樹脂（商品名「ダイ
ヤイオンHP−20」三菱化成社製）に通塔して活
性物質を吸着させた。水３で水洗後、メタノー
ル：水（４：6v／ｖ）10で洗い不純物を除去
した。次いで、酢酸エチルで溶出した。酢酸エチル溶出区分３を約100mlまで濃縮後、
0.01M燐酸緩衝液（PH6.0）200mlとクロロホルム
300mlを加えて抽出を行つた。抽出したクロロホ
ルム層を無水硫酸ソーダで脱水後、濃縮し、少量
のクロマトグラフイー用シリカゲル（関東化学社
製）にまぶして粉末状とした。この粉末サンプル
を、予め酢酸エチルで懸濁後カラムに充填したシ
リカゲル（100ml）のカラムに乗せた後、酢酸エ
チルを通塔することによつて不純物を除去し、次
いで酢酸エチル：アセトン（１：1v／ｖ）で溶
出すると活性画分が溶出された。さらに、酢酸エ
チル：メタノール（９：1v／ｖ）で溶出すると
DC−59−Ａの画分が溶出された。この溶出され
たDC−59−Ａ画分を濃縮後、該濃縮物を少量の
クロロホルムに溶解し、これに酢酸エチルとメタ
ノールを加えて４℃に放置し、針状結晶として
DC−59−A28mgを得た。実施例３実施例１において発酵培地組成を次のものに代
えて行う以外は実施例１と同様に行い、DC−59
−H55mgを得た。発酵培地組成：グルコース10ｇ／，可溶性デン
プン40ｇ／，乾燥酵母５ｇ／，ペプトン１
ｇ／，ロイシン５ｇ／，KH₂PO₄1ｇ／，
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ／，ZnSO₄・7H₂O10mg／
，CaCl₂・2HO10mg／，FeSO₄10mg／，
CoCl₂・6H₂O0.006mg／，CaCO₃1ｇ／，PH
6.8（殺菌前）にNaOHで調整した。実施例４実施例２において発酵培地組成を次のものに代
えて行う以外は実施例２と同様に行い、DC−59
−A21mgを得た。発酵培地組成：グルコース10ｇ／，可溶性デン
プン40ｇ／，乾燥酵母５ｇ／，ペプトン１
ｇ／，ロイシン５ｇ／，KH₂PO₄1ｇ／，
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ／，ZnSO₄・7H₂O10mg／
，CaCl₂・2H₂O10mg／，FeSO₄・7H₂O10
mg／，CoCl₂・6H₂O0.006mg／，CaCO₃1ｇ／
，PH6.8（殺菌前）にNaOHで調整した。

【図面の簡単な説明】

第１図はDC−59−Ａの紫外部吸収スペクトル
を示す。第２図はDC−59−Ａの赤外部吸収スペ
クトルを示す。第３図はDC−59−Ｈの紫外部吸
収スペクトルを示す。第４図はDC−59−Ｈの赤
外部吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（）〔式中、Ｒは水素原子（該化合物をDC−59−Ｈ
と称す。）またはＮ，Ｎ−ジメチルセリル基（該
化合物をDC−59−Ａと称す。）を表す。〕で表さ
れるフエナジン誘導体およびその塩。