JP5881234B2 - 変異型βグルコシダーゼ、バイオマス分解用酵素組成物および糖液の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規なβグルコシダーゼ、および、当該βグルコシダーゼを含むバイオマス分解用酵素組成物、およびこれを使用してセルロース由来バイオマスを加水分解することによる糖液の製造方法に関する。

セルロースの糖化には様々な手法があるが、エネルギー使用量が少なく、かつ糖収率の高い酵素糖化法が開発の主流となっている。セルロース分解酵素であるセルラーゼを大別すると、セルロースの結晶領域に作用するセロビオハイドラーゼ、セルロース分子鎖内部から作用して分子量を低減させるエンドグルカナーゼに分けられる。これらセルラーゼは、生成物の一つであるセロビオースによって阻害を受けることが知られている。またβグルコシダーゼは、水溶性オリゴ糖あるいはセロビオースに作用し、そのβ−グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素である。特にβグルコシダーゼは、発酵原料として有用なグルコースを十分に得るためには必須の酵素である。また、セロビオハイドラーゼあるいはエンドグルカナーゼは、セルロース分解で生成したセロビオースの蓄積により反応阻害が引き起こされることが知られている。すなわち、βグルコシダーゼは、セルロース分解により生成するセロビオースの蓄積を大幅に低減することができるため、セルロース分解効率を大幅に向上させるといった効果を有する。

セルロースは、草本系植物、木本系植物中に多く含まれ、これら植物を総称してセルロース含有バイオマスと呼ぶ。セルロース含有バイオマスは、セルロースに加え、キシラン、アラビナンといったヘミセルロース、およびリグニンを含んでいる。特に、セルロース含有バイオマス中に含まれるリグニンは、芳香族系の高分子化合物であるため、糸状菌由来セルラーゼを使用した酵素糖化において、阻害的に作用することが知られている。リグニンによる糸状菌由来セルラーゼの阻害機構に関して、すべて解明されていないが、リグニンにセルラーゼが吸着し、分解効率が低下することが、要因の一つであると言われている（非特許文献１）。

耐熱性酵素は、安定性が高く、高温条件においても長期間活性を保持することから、産業用酵素としての適用が検討されている。こうした耐熱性酵素は、好熱性菌、あるいは超好熱性菌の保有する酵素の中より多くその存在が確認されている。

耐熱性のβグルコシダーゼに関しても、数種の好熱性菌あるいは超好熱性菌より同定されており、具体的にはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、サーモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、スルフォロバス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ）、スルフォロバス・ソルファタリスク（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）などの微生物より耐熱性のβグルコシダーゼが同定されている。特にクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）由来のβグルコシダーゼは単量体（非特許文献２）、スルフォロバス・ソルファタリスク（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）およびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のβグルコシダーゼは４量体を形成する（非特許文献３、非特許文献４）ことが開示されているが、これら構造とその機能との関係は明らかになっていない。

国際公開第２００５／０９３０７２号公報

Ｈｅｔｔｉ Ｐ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０７，６５−７２（２００４） Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｐ．ら，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｎｄ Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ：Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．，ｖｏｌ．１，１２１−１３８（１９９８） Ｏｈｂａ Ｈ．ら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１５８１−１５８３（１９９５） Ｂａｕｅｒ ＭＷ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，３９，２３７４９−２３７５５（１９９６）

本発明の課題は、セルロース含有バイオマスの加水分解における酵素活性を高く保持したβグルコシダーゼを提供することにある。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する従来のβグルコシダーゼ（以下、本明細書において「親βグルコシダーゼ」という。）の特定箇所にアミノ酸変異を導入し、その機能が改良された性質を有する変異体として新規なβグルコシダーゼの取得に成功した。詳細には、本発明者らは、親βグルコシダーゼの三次元構造に着目し、タンパク質結晶構造解析により、その４量体の形成に関わるアミノ酸を特定し、当該アミノ酸に対して選択的に変異を加えることにより、４量体形成が不安定化された新規βグルコシダーゼの取得に成功した。そして本新規βグルコシダーゼは、特に、セルロース含有バイオマスの加水分解において優れた特性を有することを見出した。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］ 各単量体の間で水素結合またはイオン結合を形成するアミノ酸の位置に、βグルコシダーゼの４量体形成を不安定化させる変異を有し、かつ野生型と同等またはそれ以上のセロビオース分解活性を有することを特徴とする、変異型βグルコシダーゼ。
［２］ 配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、該９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の、３９番目のグルタミン酸、１６９番目のアスパラギン酸、１７０番目のアルギニン、２２０番目のアルギニン、２２７番目のチロシンおよび３３０番目のグルタミン酸からなる群から選ばれる少なくとも３以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異を含む、［１］の変異型βグルコシダーゼ。

［３］ 配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、該９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の、３９番目のグルタミン酸、１６９番目のアスパラギン酸、１７０番目のアルギニン、２２０番目のアルギニン、２２７番目のチロシンおよび３３０番目のグルタミン酸からなる群から選ばれる少なくとも３以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の、中性側鎖を有するアミノ酸への置換を含む、［１］または［２］の変異型βグルコシダーゼ。
［４］ 配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、該９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の、１７０番目のアルギニン、２２０番目のアルギニンおよび２２７番目のチロシンに相当するアミノ酸の、中性側鎖を有するアミノ酸への置換を含む、［１］〜［３］のいずれかの変異型βグルコシダーゼ。

［５］ 中性側鎖を有するアミノ酸が、アラニン、フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択される、［３］または［４］の変異型βグルコシダーゼ。
［６］ 配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、該９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の１７０番目のアルギニンに相当するアミノ酸のアラニンへの置換、配列番号１のアミノ酸配列の２２０番目のアルギニンに相当するアミノ酸のアラニンへの置換および配列番号１のアミノ酸配列の２２７番目のチロシンに相当するアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含む、［１］〜［５］のいずれかの変異型βグルコシダーゼ。
［７］ 配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む、［１］〜［６］のいずれかの変異型βグルコシダーゼ。

［８］ 配列番号１のアミノ酸配列の４４０番目のロイシン、４４８番目のアルギニン、４４９番目のグルタミン酸、４５９番目のグルタミン酸からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異をさらに含む、［１］〜［７］のいずれかの変異型βグルコシダーゼ。
［９］ 配列番号１のアミノ酸配列の４４８番目のアルギニンに相当するアミノ酸の中性側鎖もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸への置換、配列番号１のアミノ酸配列の４４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の中性側鎖もしくは塩基性側鎖を有するアミノ酸への置換および配列番号１のアミノ酸配列の４５９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の中性側鎖もしくは塩基性側鎖を有するアミノ酸への置換からなる群から選ばれる１以上の置換を含む、［８］の変異型βグルコシダーゼ。

［１０］ 配列番号３５〜３８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、［８］又は［９］の変異型βグルコシダーゼ。
［１１］ ［１］〜［１０］のいずれかの変異型βグルコシダーゼをコードするＤＮＡ。
［１２］ 配列番号２０、配列番号３１〜３４のいずれかで示される塩基配列を含む、［１１］のＤＮＡ。
［１３］ ［１１］または［１２］のＤＮＡを含む、発現ベクター。
［１４］ ［１３］の発現ベクターを用いた形質転換により作製された、形質転換細胞。
［１５］ ［１］〜［１０］のいずれかの変異型βグルコシダーゼまたは［１４］の形質転換細胞の処理物を含むバイオマス分解用酵素組成物。
［１６］ セルロース含有バイオマスを［１５］のバイオマス分解用酵素組成物を使用して加水分解することを含む、セルロース由来バイオマスより糖液を製造する方法。

本発明により、セルロース含有バイオマス存在下でのグルコシダーゼ酵素活性が改良された新規変異型βグルコシダーゼを提供することができる。本発明のβグルコシダーゼは、セルロース含有バイオマスの加水分解による糖液の製造に好適に使用することができる。

親βグルコシダーゼの結晶構造解析の結果得られた、親βグルコシダーゼのリボンモデルである。 親βグルコシダーゼのサブユニットＡ−Ｂ間の相互作用部位を拡大したリボンモデルである。 親βグルコシダーゼおよび各種変異を導入したβグルコシダーゼの、ブルー・ネイティブＰＡＧＥによる電気泳動の結果である。 変異型βグルコシダーゼの結晶構造解析の結果得られた、変異型βグルコシダーゼのリボンモデルである。 親βグルコシダーゼ、および変異型βグルコシダーゼのゲルろ過による分子量測定の結果である。

以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（１）βグルコシダーゼ
本発明において「βグルコシダーゼ」とは、糖のβ−グルコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素を意味する。βグルコシダーゼはセロビオースの分解活性が高いことを特徴とする。セロビオース分解活性の測定は、例えば５０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したセロビオースの基質溶液に酵素液を添加し、３０〜８５℃で３０分間反応後、必要によりｐＨを変化させるなどして反応を停止させた後、グルコース定量キットを用いて、反応液中のグルコース濃度を定量することによって行うことができる。βグルコシダーゼとして、ＥＣ番号：ＥＣ ３．２．１．２１として、これに帰属される酵素群が例示されているが、上述したセロビオース分解活性を保有していれば、本発明における「βグルコシダーゼ」に含まれる。

（２）親βグルコシダーゼ
本明細書において、親βグルコシダーゼとは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するβグルコシダーゼであり、セロビオース分解活性を示すものである。本明細書において、「親βグルコシダーゼ」を「野生型」と記載する場合がある。この場合、「親βグルコシダーゼ」および「野生型」なる記載は互換的に使用される。

親βグルコシダーゼは、パイロコッカス・フリオサスに由来する酵素である。パイロコッカス・フリオサスは、８０−１１０℃を生育至適温度とする古細菌に分類される微生物で、パイロコッカス・フリオサスは、デンプン、セルロース、マルトース、プルラン、など種々の炭素源を資化することができる微生物である。

親βグルコシダーゼは、Ｋｅｎｇｅｎら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３，３０５−３１２，１９９３年）によって初めて単離精製された酵素である。本文献によると、親βグルコシダーゼは、水溶液中での分子量は約２３０ｋＤａのホモ４量体で存在することが明示されている。また、ＳＤＳなどの界面活性剤によって、この４量体を破壊することができ、各単量体は約５８ｋＤａであることが明示されている。さらに、親βグルコシダーゼの至適ｐＨは５．０、等電点は４．４、反応最適温度は１０２−１０５℃と記載されている。配列番号１で示される親βグルコシダーゼのアミノ酸配列は、Ｖｏｏｒｈｏｒｓｔら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，２４，７１０５−７１１１，１９９５年）で同定されたアミノ酸配列に基づくものである。このアミノ酸配列に基づくその分子量は、約５４ｋＤａ（５４．５８ｋＤａ）と記載されている。

（３）本発明の変異型βグルコシダーゼ
本発明の変異型βグルコシダーゼは、水溶液中でβグルコシダーゼ単量体の間で水素結合またはイオン結合を形成するアミノ酸の位置に、βグルコシダーゼの４量体形成を不安定化させる変異を有することを特徴とする。

本発明の変異型βグルコシダーゼは、水溶液中で、親βグルコシダーゼが本来形成する４量体と比べて、不安定化された４量体で存在することを特徴とする。親βグルコシダーゼは、一次構造としては約５４ｋＤａであるが、水溶液中で安定な４量体を形成し、分子量２００ｋＤａ以上の分子として溶解していることが知られている（Ｂａｕｅｒ ＭＷ．ら，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ ａ β−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，３９，２３７４９−２３７５５（１９９６））。

本発明の変異型βグルコシダーゼが、水溶液中で不安定な４量体を形成していることは、水溶液中での分子量が２００ｋＤａ未満であることから確認することができる。具体的には、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによる手法でその分子量を確認すると１６０ｋＤａ未満の分子量で検出される。水溶液中４量体が不安定化されていることは、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ以外の手法（例えば、ゲル濾過分析、超遠心分析など）を用いて、親βグルコシダーゼと本発明の変異型βグルコシダーゼの水溶液中での挙動を比較することによって、具体的には、水溶液中親βグルコシダーゼの分子量と比較して、本発明のβグルコシダーゼの分子量が小さいことによって、確認することが可能である。

下記実施例にて詳述するように、本発明者らは結晶構造解析により、親βグルコシダーゼのアミノ酸配列、すなわち配列番号１で示されるアミノ酸配列において、３９番目のグルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ３９」と記載）、１６９番目のアスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ１６９」と記載）、１７０番目のアルギニン（以下、「Ａｒｇ１７０」と記載）、２２０番目のアルギニン（以下、「Ａｒｇ２２０」と記載）、２２７番目のチロシン（以下、「Ｔｒｙ２２７」と記載）および３３０番目のグルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ３３０」と記載）が、親βグルコシダーゼの水溶液中における４量体形成に関与していることを明らかにした。すなわち、これらのアミノ酸は、他の親グルコシダーゼの単量体と水溶液中で水素結合またはイオン結合を形成しており、４量体の形成に強く関与しているアミノ酸であることがわかった。本発明における、βグルコシダーゼへのアミノ酸変異の導入の目的は、この４量体の形成に関与するアミノ酸の水素結合またはイオン結合を破壊することにあり、その結果、水溶液中におけるβグルコシダーゼの４量体構造を不安定化させることにある。

本発明における、βグルコシダーゼのアミノ酸変異は、βグルコシダーゼの水溶液中における４量体形成に関与しているアミノ酸の置換および／または欠失を含む。

好ましくは、本発明の変異型βグルコシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、当該配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の、Ｇｌｕ３９、Ａｓｐ１６９、Ａｒｇ１７０、Ａｒｇ２２０、Ｔｙｒ２２７およびＧｌｕ３３０のアミノ酸から選択される少なくとも３以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の、中性側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。

「配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」は、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列で表されるβグルコシダーゼの活性を保持する。

ここで「相当するアミノ酸」とは、前記配列同一性を有するアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列の立体構造を比較した場合に、前記配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列におけるＧｌｕ３９、Ａｓｐ１６９、Ａｒｇ１７０、Ａｒｇ２２０、Ｔｙｒ２２７およびＧｌｕ３３０と同様の位置に存在し、βグルコシダーゼの水溶液中における４量体形成に関与しているアミノ酸を意味する。「相当するアミノ酸」のアミノ酸種は、配列番号１のアミノ酸配列におけるＧｌｕ３９、Ａｓｐ１６９、Ａｒｇ１７０、Ａｒｇ２２０、Ｔｙｒ２２７およびＧｌｕ３３０とそれぞれ同一である。

さらに好ましくは、本発明の変異型βグルコシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、当該配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の、Ａｒｇ１７０、Ａｒｇ２２０およびＴｙｒ２２７のアミノ酸に相当するアミノ酸の、中性側鎖を有するアミノ酸への置換を含む。

「中性側鎖を有するアミノ酸」としては、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンが挙げられる。好ましくは、「中性側鎖を有するアミノ酸」はアラニン、フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択される。

下記実施例にて詳述するように、本発明者らは結晶構造解析により、配列番号１で示されるアミノ酸配列におけるＡｒｇ１７０が、親βグルコシダーゼにおいて、水溶液中４量体を形成する他の全ての親グルコシダーゼ単量体におけるＡｒｇ１７０と水素結合またはイオン結合を形成することを明らかとした。すなわち、Ａｒｇ１７０に変異を導入することによって、４量体形成に関する水素結合またはイオン結合を効果的に破壊することが可能である。また、下記実施例にて詳述するように、本発明者らは結晶構造解析により、親βグルコシダーゼにおいて、水溶液中、Ａｒｇ２２０が、４量体を形成する他の単量体における４４番目のグリシン（Ｇｌｙ４４）と水素結合を形成していること；また、Ｔｙｒ２２７が、４量体を形成する他の単量体における１６５番目のリシン（Ｌｙｓ１６５）と水素結合を形成していること、を明らかにした。すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ａｒｇ１７０に加え、Ａｒｇ２２０およびＴｙｒ２２７に変異を導入することによって、４量体形成に関する水素結合またはイオン結合を効果的に破壊することでき、水溶液中でのβグルコシダーゼの４量体構造を不安定化させることが可能である。

したがって好ましくは、本発明の変異型βグルコシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、当該配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の、Ａｒｇ１７０に相当するアミノ酸をアラニンへ、Ａｒｇ２２０に相当するアミノ酸をアラニンへおよびＴｙｒ２２７に相当するアミノ酸をフェニルアラニンへの置換を含む。

特に好ましくは、本発明の変異型βグルコシダーゼは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の変異型βグルコシダーゼは、セロビオース分解活性を保持し得る限り、配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、当該配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の、Ｇｌｕ３９、Ａｓｐ１６９、Ａｒｇ１７０、Ａｒｇ２２０、Ｔｙｒ２２７およびＧｌｕ３３０に相当するアミノ酸以外の箇所に一または複数のアミノ酸変異を有していても良い。ここで「複数」とは、２〜１０個、好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個を意味し、「アミノ酸変異」には、アミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加が含まれる。

本発明の変異型βグルコシダーゼは、親βグルコシダーゼと比べて、セルロース含有バイオマス存在下でのβグルコシダーゼ活性が向上している、といった改良された優れた性質を示す。この改良された優れた性質は、親βグルコシダーゼが、水溶液中安定な４量体を形成するのに対して、本発明の変異型βグルコシダーゼでは上記変異導入により、４量体構造が不安定化していることが要因として推定される。

本明細書において、本発明の変異型βグルコシダーゼを、「変異体」と記載する場合がある。この場合、「変異型βグルコシダーゼ」および「変異体」なる記載は互換的に使用される。

前述した本発明の変異型βグルコシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、当該配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の、Ｇｌｕ３９、Ａｓｐ１６９、Ａｒｇ１７０、Ａｒｇ２２０、Ｔｙｒ２２７およびＧｌｕ３３０のアミノ酸から選択される少なくとも３以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の、中性側鎖を有するアミノ酸への置換を含み、これらの変異の効果によって４量体化を不安定化させることが可能であるが、これら変異体にさらに変異導入を行ったものでもよい。変異導入の目的としては、さらに活性向上を目的として変異、熱安定性向上を目的とした変異、さらに多量体構造を不安定化することを目的とした変異などを例示することができる。

下記実施例にて詳述するように、本発明者らは前述した変異型βグルコシダーゼに関し、さらに結晶構造解析を実施した結果、本発明の変異型βグルコシダーゼは２量体構造を形成していることを明らかにした。この変異型βグルコシダーゼの２量体構造形成に関与するアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸配列の４４０番目のロイシン、４４８番目のアルギニン、４４９番目のグルタミン酸、４５９番目のアルギニンに相当する４つのアミノ酸である。すなわち、これら４つのアミノ酸は、２量体を形成する他方の変異型グルコシダーゼのアミノ酸と水素結合もしくはイオン結合を形成しており、変異型グルコシダーゼの２量体の形成に強く関与する。本発明では、前述した４量体を不安定化する変異に加え、さらに変異型グルコシダーゼが形成する２量体を不安定化する変異をさらに加えてもよい。

すなわち、本発明の変異型βグルコシダーゼは、前述した４量体を不安定化する変異に加え、配列番号１のアミノ酸配列の４４０番目のロイシン、４４８番目のアルギニン、４４９番目のグルタミン酸、４５９番目のグルタミン酸からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異をさらに含む。

ここで「相当するアミノ酸」とは、前記配列同一性を有するアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列の立体構造を比較した場合に、前記配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の４４０番目のロイシン、４４８番目のアルギニン、４４９番目のグルタミン酸、４５９番目のグルタミン酸と同様の位置に存在し、変異型βグルコシダーゼの２量体形成に関与しているアミノ酸を意味する。

特に好ましくは、前述の変異型βグルコシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の４４８番目のアルギニンに相当するアミノ酸の中性側鎖もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸への置換、または、４４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の中性側鎖もしくは塩基性側鎖を有するアミノ酸への置換、４５９番目のアルギニンに相当するアミノ酸の中性側鎖もしくは塩基性側鎖を有するアミノ酸への置換、からなる群から選ばれる１以上のアミノ酸位置における置換を含む。

「中性側鎖を有するアミノ酸」としては、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンが挙げられる。好ましくは、「中性側鎖を有するアミノ酸」はアラニン、フェニルアラニンおよびグリシンからなる群から選択される。

「酸性側鎖を有するアミノ酸」としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、の群から選択される。

「塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、アルギニン、リジン、ヒスチジン、の群から選択される。

最も好ましくは、前述の変異型βグルコシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の４４８番目のアルギニンに相当するアミノ酸のグルタミン酸もしくはグリシン、配列番号１のアミノ酸配列の４４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸のアルギニン、配列番号１のアミノ酸配列の４５９番目のアルギニンに相当するアミノ酸のグリシンへの変異から選ばれる１以上の変異を含む。

特に好ましくは、本発明の変異型βグルコシダーゼは、配列番号３１〜３４で示されるアミノ酸配列を含む。

また、こうしたアミノ酸置換による変異に加えて、配列番号１のアミノ酸配列の４４０番目以降のアミノ酸全部に相当する領域を、あるいは、配列番号１のアミノ酸配列の４４８番目以降のアミノ酸全部に相当する領域を、あるいは配列番号１のアミノ酸配列の４４９番目以降のアミノ酸全部に相当する領域を、あるいは配列番号１のアミノ酸配列の４５９番目以降のアミノ酸全部に相当する領域を、欠失（削除）したものでもよい。これは４４０番目以降のアミノ酸に相当する配列に関しては、セロビオース分解活性そのものには特段の影響がないためによる。こうした欠失（削除）を行いたい場合は、削除したいアミノ酸の位置に対応する遺伝子においてストップコドンを挿入することで可能になる。

（４）本発明の変異型βグルコシダーゼの製造方法
本発明の変異型βグルコシダーゼを製造する方法としては、例えばβグルコシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、これを発現ベクターに連結し、発現ベクターを宿主に導入し、異種タンパク質として生産し、単離および精製することで得ることができる。

まず上述のＤＮＡの調製方法としては、遺伝子合成により目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを全合成する方法、配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して、部位突然変異法により上記所定の位置に変異を導入する方法が例示される。配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子は、このβグルコシダーゼを保有する微生物、特にパイロコッカス・フリオサスより公知の方法に準じてＤＮＡを単離し、ＰＣＲ等の手法によってＤＮＡ増幅させることで取得することができる。

上記のようにして調製した変異型βグルコシダーゼをコードするＤＮＡを、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより、当該ＤＮＡを含む発現ベクターを製造することができる。発現ベクターとしては、細菌プラスミド、酵母プラスミド、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、レトロウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０の誘導体など、植物細胞用のベクターとしてのアグロバクテリウムなどが挙げられるが、宿主細胞において複製および生存可能ある限り他のいかなるベクターも用いることができる。例えば、宿主が大腸菌である場合、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどを例示することができる。また、宿主が酵母である場合、ｐＰｉｎｋ−ＨＣ、ｐＰｉｎｋ−ＬＣ、ｐＰｉｎｋα−ＨＣ、ｐＰＣＩＺ、ｐＰＣＩＺα、ｐＰＣＩ６、ｐＰＣＩ６α、ｐＦＬＤ１、ｐＦＬＤ１α、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ９などが挙げられる。

プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合、ｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等が、酵母である場合、ＡＯＸ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＡＤＥ２プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＧＡＬ−Ｌ１プロモーターなどが挙げられる。

本発明において用いる宿主細胞としては、大腸菌、バクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などが好ましい。酵母細胞としては、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などが挙げられる。真菌細胞としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などが挙げられる。昆虫細胞としてはＳｆ９など、植物細胞としては双子葉植物など、動物細胞としては、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３などが挙げられる。

形質転換または、トランスフェクションは、リン酸カルシウム法、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。本発明のβグルコシダーゼは、上記のように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞においてプロモーターの制御下にて発現させ、産生物を回収して得ることができる。発現に際しては、宿主細胞を適切な細胞密度まで増殖または成長させた後、温度シフトまたはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）添加などの化学的誘発手段によってプロモーターを誘発させ、細胞をさらに一定期間培養する。

変異型βグルコシダーゼが細胞外に排出される場合には、培地から直接に、また細胞外に存在する場合には、超音波破砕や機械的破砕などの物理的手段もしくは細胞溶解剤などの化学的手段によって、細胞を破壊した後にβグルコシダーゼを精製する。βグルコシダーゼは、組換え細胞の培地から、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動などの技術を組み合わせて、部分的にまたは完全に精製することができる。

（５）変異型βグルコシダーゼを含むバイオマス分解用酵素組成物
本発明の変異型βグルコシダーゼは、セルロース含有バイオマスの加水分解において、親βグルコシダーゼに対して、高い熱安定性、リグニン耐性を有する。具体的には、親βグルコシダーゼに比べて１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍またはそれ以上の高いセロビオース分解活性を得ることができる。

本発明の変異型βグルコシダーゼは、精製されたものであっても、粗精製されたものであっても良い。

また、本発明の変異型βグルコシダーゼは、固相に固定化されていても良い。固相としては例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物などが挙げられる（特にこれらに限定されない）。本発明の変異型βグルコシダーゼを固相に固定することによって、連続反復使用が可能となる点において有利である。

さらに、上記変異型βグルコシダーゼをコードするＤＮＡを用いて形質転換した細胞の処理物も、粗精製された変異型βグルコシダーゼとして利用することができる。当該「形質転換した細胞の処理物」には、固相に固定化した形質転換細胞、ならびに形質転換細胞の死菌、破砕物、およびそれらを固相に固定化したものなどが含まれる。

本発明の変異型βグルコシダーゼは、セルラーゼと混合することで、バイオマス分解用酵素組成物としてセルロース含有バイオマスの加水分解に使用することができる。ここでいうセルラーゼとは、セルロースを分解する活性を有する酵素であれば特に限定されず、一種類以上の混合物であってもよい。このような酵素としては、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼなどが挙げられる。

上述セルラーゼは、好ましくは糸状菌由来セルラーゼである。糸状菌由来セルラーゼは、少なくともエンドグルカナーゼおよびセロビオハイドラーゼの双方を含んでなる混合物である。さらに効率的なセルロースの糖化を行うためには、エンドグルカナーゼに関して２種以上、および／または、セロビオハイドラーゼに関して２種以上含んでなる糸状菌由来セルラーゼであることが好ましい。前記糸状菌セルラーゼを生産する微生物として、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。これら微生物は、培養液中にセルラーゼを産生するために、その培養液を未精製の糸状菌セルラーゼとしてそのまま使用してもよいし、また培養液を精製し、製剤化したものを糸状菌セルラーゼ混合物として使用してもよい。前記培養液より、糸状菌セルラーゼ混合物を精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものを、セルラーゼ製剤として使用してもよい。

本発明で使用する糸状菌由来セルラーゼは、トリコデルマ属由来セルラーゼであることが好ましい。トリコデルマ属は、少なくとも２種以上のエンドグルカナーゼ、および、少なくとも２種以上のセロビオハイドラーゼを含んでなるセルラーゼを培養液中に産生し、こうした培養液より調製されたセルラーゼ混合物は本発明に好ましく使用することができる。こうしたトリコデルマ属のうち、より好ましくは、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ混合物である。トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ混合物としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ Ｒｕｔ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ＱＭ９１２３）に由来するセルラーゼ混合物が挙げられる。また、前記トリコデルマ属に由来し、変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株であってもよい。

本発明のバイオマス分解用酵素組成物は、広くセルロース含有バイオマスの加水分解に使用することができる。セルロース含有バイオマスとは、少なくともセルロースを含むものであれば限定されない。具体的には、バガス、コーンストーバー、コーンコブ、スイッチグラス、稲藁、麦藁、樹木、木材、廃建材、新聞紙、古紙、パルプなどである。これらセルロース含有バイオマスは、高分子芳香族化合物リグニンやヘミセルロースなどの不純物が含まれているが、前処理として、酸、アルカリ、加圧熱水などを用いて、リグニンやヘミセルロースを部分的に分解したセルロース含有バイオマスを、セルロースとして利用してもよい。

本発明におけるセルロース含有バイオマスの酵素処理条件は、処理温度４０℃〜６０℃、処理ｐＨ３〜７、セルロース含有バイオマス固形分濃度０．１〜３０％が好ましい。当該範囲に設定することにより、本発明のバイオマス分解用酵素組成物の分解効率を最大限発揮することができる。従来の好熱性菌由来グルコシダーゼは、反応最適温度が１００℃付近の酵素もあるが、本発明で使用する好熱性菌由来グルコシダーゼは、４０℃〜６０℃においても十分高い比活性を示し、セルラーゼ共存下で、セルロース含有バイオマスの分解を効率的に行うことが可能である。この酵素処理は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。こうした酵素処理によって得られた加水分解物は、グルコース、キシロースなどの単糖成分を含むため、エタノール、乳酸などの原料糖として使用することが可能である。

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

（参考例１）親βグルコシダーゼの大腸菌による組み換え発現調製
親βグルコシダーゼの遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子を全合成し、ｐＥＴ−１１ｄのＮｃｏIおよびＢａｍＨＩにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結し、ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ）に形質転換した。スクリーニングは、アンピシリンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて行った。形質転換されたＪＭ１０９株より、作製したベクターｐＥＴ−ＰｆｕＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析を行った。ｐＥＴ−ＰｆｕＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＰｆｕＢＧＬ株を作製した。ＢＬ２１−ＰｆｕＢＧＬ株を、アンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、アンピシリン含有ＬＢ培地１Ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．８となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液を、８５℃で１５分保温し、該グルコシダーゼ以外の大腸菌に由来するタンパク質を凝集沈殿した。遠心分離により沈殿物を除去し、上清を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に透析した。得られたタンパク質溶液を、親βグルコシダーゼとして使用した。調製した親βグルコシダーゼのアミノ酸配列を配列番号１に記載する。

（実施例１）親βグルコシダーゼの４量体形成部位の特定
親βグルコシダーゼ（パイロコッカス・フリオサス）のＸ線結晶構造は既に報告されているが（Ｔｈｉｊｉｓ Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１７（２０００））分解能が３．３ Åと低く、またＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）への登録もされていない。そこで、ＰｆｕＢＧＬの三次元構造を決定するため、Ｘ線結晶構造解析を試みた。新たな結晶化条件を探索し、リン酸を沈殿剤として結晶化に成功した。大型放射光実験施設ＳＰｒｉｎｇ−８でＸ線回折実験を行い、分解能２．５ÅでＰｆｕＢＧＬの構造を決定した。構造決定は分子置換法を用い、モデル分子には配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するサーモスファエラ・アグリガンズ（Ｔｈｅｍｏｓｐｈａｅｒａ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）由来β−グリコシダーゼ（ＴｈＡｇｇＢＧＹ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＱＶＢ）を用いた。得られた３次元構造データを構造解析用のソフトウェアＣＣＰ４＿Ｃｏｎｔａｃｔを用いてサブユニット間の相互作用を分析した。分析の結果得られたリボンモデルを図１に示す。サブユニットＡ−Ｂ間、Ａ−Ｃ間で相互作用しており、ホモ４量体を形成していることが確認された（図１）。分析結果より得られたサブユニットＡ−Ｂ間の相互作用に関し、表１にまとめた。

サブユニット間の相互作用のうち、アミノ酸主鎖の窒素原子（Ｎ）および酸素原子（Ｏ）のみで相互作用しているもの（イタリック表記のアミノ酸）は、どのアミノ酸でも同様な構造を持っているため改変はできない。そのため、サブユニット間の相互作用の改変には側鎖部分が相互作用に関与するＧｌｕ３９、Ａｓｐ１６９、Ａｒｇ１７０、Ａｒｇ２２０、Ｔｙｒ２２７、Ｇｌｕ３３０への変異導入が有効と考えられた。また、そのうちＡｒｇ１７０−Ａｓｐ１６９間の結合はイオン結合のため、他の水素結合での相互作用に比べ結合が強く、特に変異導入で大きな効果あることが推定された。また、Ａ−Ｂ間の相互作用部位を拡大したリボンモデルを図２に示すが、特に、Ａｒｇ１７０、Ａｒｇ２２０、Ｔｙｒ２２７の残基がインターフェイスエリアが大きく、また結合距離も近いため、変異の導入部位として有力と考えられた。

（実施例２）変異体の調製
本発明のβグルコシダーゼ（変異体）は、表２に示すプライマーを使用し、以下の手法で作製した。

配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子に対して、配列番号３および４の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドを使用して部位突然変異法を用いてＲ１７０Ａ変異体（配列番号１６）を作製した。また同様に、配列番号５および６の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドを使用してＲ２２０Ａ変異体（配列番号１７）、配列番号７および８を使用してＹ２２７Ｆ変異体（配列番号１８）を作製した。また、Ｒ１７０Ａ変異体に対し、配列番号７および８の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドを使用して、Ｒ１７０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体（配列番号１９）を作製した。Ｒ１７０Ａ変異体に対し、配列番号５および６の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドを使用して、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体（配列番号２１）を作製した。Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体に対し、配列番号７および８の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドを使用してＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体（配列番号２０）を作製した。

得られた各遺伝子は、参考例１記載の手順で大腸菌にて発現を実施した。Ｒ１７０Ａ変異体、Ｒ２２０Ａ変異体、Ｙ２２７Ｆ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体のアミノ酸配列を配列番号９〜１４に示す（スタートコドンであるメチオニンは含まない）。前述変異体は、大腸菌にてすべて異種タンパク質として発現可能であることが確認できた。

（実施例３）変異体のセロビオース分解活性１
実施例２で得られた変異体（本発明のβグルコシダーゼ）と、参考例１で調整した親βグルコシダーゼのセロビオース分解活性を以下実験にて比較した。基質に１０ｍＭ セロビオース／５０ｍＭ 酢酸緩衝液を用い、それぞれ実施例２、参考例１で調製した酵素を終濃度０．２３ｍｇ／ｍＬで添加し、５０℃で酵素反応を３０分行った。親βグルコシダーゼにおける５０℃の温度条件下で生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を１００％として、各変異体におけるセロビオース分解活性を相対値で表３に示す。

５０℃においては、親βグルコシダーゼおよび各変異体で活性に差がないことを確認した。

（実施例５）変異体のセロビオース分解活性２
セルロース含有バイオマス存在下での親グルコシダーゼおよび変異体（本発明のβグルコシダーゼ）のセロビオース分解活性を測定した。セルロース含有バイオマスとしては、稲藁を５％希硫酸で１５０℃１０分処理したものを使用した。セルロース含有バイオマス５ｗｔ％を懸濁した溶液に、１０ｍＭ セロビオース／５０ｍＭ 酢酸緩衝液を添加し反応液とした。この反応液に実施例２、参考例１で調製した酵素を終濃度０．２３ｍｇ／ｍＬで添加し、５０℃で酵素反応を３０分行った。親βグルコシダーゼにおける５０℃の温度条件下で生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を１００％として、各変異体におけるセロビオース分解活性を相対値で表４に示す。

親グルコシダーゼおよびＲ１７０Ａ変異体、Ｒ２２０Ａ変異体、Ｙ２２７Ｆ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体では、セルロース含有バイオマス存在下でのセロビオース分解活性にほとんど差がないことが確認できた。一方でＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体では、親グルコシダーゼあるいはその他の変異体に対して活性が大きく向上することが確認された。

（実施例６）ブルー・ネイティブＰＡＧＥによる変異体の分子量測定
親βグルコシダーゼ、及び本発明のβグルコシダーゼであるＲ１７０Ａ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体、およびＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体が安定な４量体を形成するか否か、ブルー・ネイティブＰＡＧＥにより検討を行った。

ブルー・ネイティブＰＡＧＥは３−１２％Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥビストリスゲル（インビトロジェン）を使用した。親βグルコシダーゼ、Ｒ１７０Ａ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体、およびＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体各１μｇを、サンプルバッファー（５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ６−アミノヘキサン酸、０．５％クマシーＧ２５０、０．５％ＤＤＭ）に溶解し泳動サンプルとした。分子量マーカーは、ＮａｔｉｖｅＭａｒｋプロテインスタンダード（インビトロジェン）を使用した。電気泳動は陽極側に、５０ｍＭトリシン、７．５ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）、クマシーＧ２５０、陰極側に、２５ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）を添加し、１５０Ｖ定電圧で１００分電気泳動を行った。バンドの固定化後、Ｇ−２５０の脱色を行った。得られたゲルの写真を図３に示した。

親βグルコシダーゼ、Ｒ１７０Ａ変異体およびＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体に関しては、分子量マーカー１４６ｋＤａから２４２ｋＤａの間のほぼ同じ位置にそれぞれのバンドが検出された。親βグルコシダーゼは、４量体形成時の分子量は２１６ｋＤａであることから、これらは安定な４量体を形成することが確認できた。一方で、本発明のＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体は、分子量マーカー６６ｋＤａから１４６ｋＤａに検出された。すなわち、本発明のＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体は、本来親βグルコシダーゼが形成する４量体形成が不安定化しており、３量体あるいは２量体で水溶液中に存在することが確認された。

（実施例７）βグルコシダーゼを含むバイオマス分解用酵素組成物を用いたセルロース含有バイオマスの加水分解
トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ（セルクラスト、シグマ）、及びグルコシダーゼとして、それぞれ比較例１で調製した親グルコシダーゼ、実施例２で調製した本発明のＲ１７０Ａ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体、とからなるバイオマス分解用酵素組成物を用いた。酵素添加量は、セルラーゼ０．５ｍｇ／ｍＬ、各種グルコシダーゼ０．００５ｍｇ／ｍＬ（セルラーゼの１／１００量）となるよう混合した。

セルロース含有バイオマスとしては、稲藁を５％希硫酸で１５０℃１０分処理したものを使用した。加水分解は、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に５ｗｔ％のセルロース含有バイオマスを懸濁したものを基質とした。反応は５０℃において２８時間まで行い、生成したグルコース濃度の測定を行った。

グルコシダーゼなしに対して、グルコシダーゼを添加することで、グルコース生成量が増大することが確認できた。本発明のＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体では、親βグルコシダーゼ、Ｒ１７０Ａ変異体、Ａ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体に比べて、反応２８時間後におけるグルコース生成量は増えることが確認できた。セルロース含有バイオマスが存在しない時のセロビオース分解活性は、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体、親βグルコシダーゼ、Ｒ１７０Ａ変異体、Ａ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ変異体、の間で差はなかった（実施例３）。したがって、本発明の変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体は、セルロース含有バイオマス存在下での活性が親βグルコシダーゼに対して向上していることが確認できた。

（実施例８）Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体の結晶構造解析
Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体の三次元構造を決定するため、Ｘ線結晶構造解析を試みた。新たな結晶化条件を探索し、リン酸を沈殿剤として結晶化に成功した。大型放射光実験施設ＳＰｒｉｎｇ−８でＸ線回折実験を行い、分解能２．５オングストロームでＰｆｕＢＧＬの構造を決定した。構造決定は分子置換法を用い、モデル分子には配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するサーモスファエラ・アグリガンズ（Ｔｈｅｍｏｓｐｈａｅｒａ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）由来β−グリコシダーゼ（ＴｈＡｇｇＢＧＹ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＱＶＢ）を用いた。得られた３次元構造データを構造解析用のソフトウェアＣＣＰ４＿Ｃｏｎｔａｃｔを用いてサブユニット間の相互作用を分析した。分析の結果得られたリボンモデルを図４に示す。サブユニットＡ−Ｃ間で相互作用しており、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体は、ホモ２量体を形成していることが確認された（図４）。分析結果より得られたサブユニットＡ−Ｃ間の相互作用に関し、表６にまとめた。

すなわち、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体は、Ａｒｇ４４８、Ｌｅｕ４４０、Ｇｌｕ４４９、Ｇｌｕ４５９のアミノ酸残基にて水素結合し、２量体を形成していることが判明した。

（実施例９）変異体の調製２
本発明の変異型βグルコシダーゼ（Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体）は、実施例８に示すとおり２量体を形成することが判明した。そこで、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体に対しさらに、Ａｒｇ４４８、Ｇｌｕ４４９、Ｇｌｕ４５９のいずれか１以上の変異をさらに導入することで、２量体を単量体に改変できるか検討を行った。変異体遺伝子の取得に関しては、表７に示すプライマーを使用し、以下の手法で作製した。

Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体の遺伝子（配列番号２０）に対して、配列番号２３および２４の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２５および２６の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２７および２８の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２９および３０の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド、をそれぞれ使用し、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｅ変異体（配列番号３１）、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｇ変異体（配列番号３２）、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４４９Ｒ変異体（配列番号３３）、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４５９Ｇ変異体（配列番号３４）遺伝子を作製した。

得られた各遺伝子は、参考例１記載の手順で大腸菌にて発現を実施した。Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｅ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｇ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４４９Ｒ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４５９Ｇ変異体のアミノ酸配列を配列番号３５〜３８に示す（スタートコドンであるメチオニンは含まない）。前述の変異体は、大腸菌にてすべて異種タンパク質として発現可能であることが確認できた。

（実施例１０）ゲルろ過による分子量の決定
親グルコシダーゼおよび変異体の分子量を決定するために、ゲルろ過による分子量の決定を行った。カラムはＨｉＬｏｏｄ２６／６０Ｓｕｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用し、緩衝液は、５０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ８）、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを使用した。実施例２、参考例１、実施例９で調製した酵素をカラムに添加し、緩衝液２ｍＬ／ｍｉｎで分離した。酵素の検出は、吸光度２８０ｎｍを測定した。分子量は、オブアルブミン（４４ｋＤａ）、コンアルブミン（７５ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）を分子量マーカーとして使用し、ぞれぞれの酵素成分の溶出時間を元に検量線を作製した。ゲルろ過の結果、測定された分子量（実測分子量、ｋＤａ）およびアミノ酸一次構造より推定される分子量（推定分子量、ｋＤａ）をそれぞれ表８にまとめた。

親グルコシダーゼに関しては、ほぼ４量体の実測分子量（２３７ｋＤａ）、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体は、ほぼ２量体の実測分子量（１２９ｋＤａ）を示すことが判明した。一方、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体に対してさらに変異導入した変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｅ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４４９Ｒ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／ Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｇ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４５９Ｇ変異体、に関しては、実測分子量が５０ｋＤａ〜９０ｋＤａの範囲にあり、さらに変異を導入する効果として、完全に単量体化したものと推定された。

（実施例１１）変異体のセロビオース分解活性３
セルロース含有バイオマス存在下での親グルコシダーゼおよび変異体（本発明のβグルコシダーゼ）のセロビオース分解活性を測定した。セルロース含有バイオマスとしては、稲藁を５％希硫酸で１５０℃１０分処理したものを使用した。セルロース含有バイオマス５ｗｔ％を懸濁した溶液に、１０ｍＭ セロビオース／５０ｍＭ 酢酸緩衝液を添加し反応液とした。この反応液に実施例９で調製した酵素Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｅ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４４９Ｒ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｇ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４５９Ｇ変異体、を終濃度０．２３ｍｇ／ｍＬで添加し、５０℃で酵素反応を３０分行った。親βグルコシダーゼにおける５０℃の温度条件下で生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を１００％として、各変異体におけるセロビオース分解活性を相対値で表９に示す。

Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｅ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４４９Ｒ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／ Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｇ変異体、Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｅ４５９Ｇ変異体では、親グルコシダーゼに対して活性が大きく向上することが判明した。また実施例５のＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ変異体（２量体）に対して、実施例９の変異型グルコシダーゼ（単量体）の方が高いことが判明した。

本発明におけるβグルコシダーゼは、セルロース含有バイオマス存在下で高いセロビオース分解活性を示すため、バイオマスの加水分解および糖液の製造に使用できる。

Claims (10)

1. 各単量体の間で水素結合またはイオン結合を形成するアミノ酸の位置に、βグルコシダーゼの４量体形成を不安定化させる変異を有し、かつ野生型と同等またはそれ以上のセロビオース分解活性を有し、かつ
   配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、該９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の１７０番目のアルギニンに相当するアミノ酸のアラニンへの置換、配列番号１のアミノ酸配列の２２０番目のアルギニンに相当するアミノ酸のアラニンへの置換および配列番号１のアミノ酸配列の２２７番目のチロシンに相当するアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含むことを特徴とする、変異型βグルコシダーゼ。
2. 配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異型βグルコシダーゼ。
3. 配列番号１のアミノ酸配列の４４８番目のアルギニンに相当するアミノ酸のグルタミン酸もしくはグリシンへの置換、配列番号１のアミノ酸配列の４４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸のアルギニンへの置換、又は配列番号１のアミノ酸配列の４５９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換をさらに含む、請求項１又は２に記載の変異型βグルコシダーゼ。
4. 配列番号３５〜３８のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の変異型βグルコシダーゼ。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型βグルコシダーゼをコードするＤＮＡ。
6. 配列番号２０、配列番号３１〜３４のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項５に記載のＤＮＡ。
7. 請求項５または６に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
8. 請求項７に記載の発現ベクターを用いた形質転換により作製された、形質転換細胞。
9. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型βグルコシダーゼまたは請求項８に記載の形質転換細胞の処理物を含むバイオマス分解用酵素組成物。
10. セルロース含有バイオマスを請求項９に記載のバイオマス分解用酵素組成物を使用して加水分解することを含む、セルロース由来バイオマスより糖液を製造する方法。

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