CN110317733B - 林生地霉菌株及其在降解餐厨垃圾中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种林生地霉菌株及其在降解餐厨垃圾中的应用，该菌株命名为林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB‑092，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编码为CCTCC NO：M 2019264，保藏时间为2019年4月17日。本发明提供的林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB‑092是一种高效的餐厨垃圾降解菌，不仅能够高效降解餐厨垃圾，还能够消除异味，实现餐厨垃圾的无臭处理。
Description
技术领域
本发明涉及环保生物技术领域，尤其涉及一种林生地霉菌株及其在降解餐厨垃圾中的应用。
背景技术
餐厨垃圾，亦称泔水、剩食等，是食物在加工处理(包括烹煮)后所剩的部分(如菜叶、果皮、果渣等)，或在食用后所剩并被丢弃的食物的统称。伴着经济水平和社会资料的转变，人们对饮食越来越讲究，由此也造成了大量的浪费。据研究报道，全球有一半的食物被浪费掉。
餐厨垃圾主要成分包括米和面粉类食物残余、蔬菜、动植物油、肉骨等，从化学组成上，有淀粉、蛋白质、纤维素、脂类和无机盐等，这些组分由于其具有含水率高，营养丰富的特点，极易腐烂发臭，传播细菌和病毒，不仅影响市容市貌，还污染环境和危害人们的健康。然餐厨垃圾所蕴含的丰富营养又是极其宝贵的可再生资源，如果能有效合理地处理餐厨垃圾，必定能带来较高的价值。此外，由于餐厨垃圾本身的不均质性，致使其运输和处理也非常不便且成本较高。
随着环保、可持续发展理念的不断深入，生物法处理餐厨垃圾因其独有的优点逐步成为研究和关注的热点。如授权公告号为CN105665417B的发明专利公开了一种餐厨垃圾高效降解复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂由复合菌体和载体组成，所述复合菌体由东方伊萨酵母菌、枯草芽孢杆菌、异常威克汉姆酵母菌、黒木霉及放线菌混合组成，所述载体由豆粕、麸皮、稻壳粉、刨花组成，所述复合菌体占复合微生物菌剂的重量百分含量为6～12％；如授权公告号为CN103937713B的发明专利公开了一种食物源有机垃圾的微生物降解液体菌剂，其制备方法为选用如下3种菌：多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)F8、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F10、假单胞菌(Pseudomonassp.)No.7；公开号为CN104531550A的发明申请公开了一种高温降解餐厨垃圾微生物菌剂及其制备、使用方法。所述微生物菌种，由以下质量份数的菌种原料复合而成：努比卤地无氧芽孢杆菌15-30份、嗜热液化芽孢杆菌10-25份、热脱氮地芽孢杆菌20-40份、嗜热脂肪地芽孢杆菌25-50份等，这些菌剂都有较好的餐厨垃圾降解效果，但是他们都没有很好地协调好减重与异味的平衡问题，致使一直没法大规模推广应用。
因此，有必要筛选具有较好降解餐厨垃圾能力和除臭效果显著的优势菌株，以解决上述问题。
发明内容
本发明提供了一种林生地霉菌株及其在降解餐厨垃圾中的应用，该菌株不仅能够高效降解餐厨垃圾，还能够消除异味，实现餐厨垃圾的无臭处理。
具体技术方案如下：
林生地霉菌株，命名为林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019264，保藏时间为2019年4月17日。
上述林生地霉菌株于2019年4月17日保藏在中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。
所述林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的18s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
所述林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的生物学特征为：在28℃～37℃下24h～48h菌落开始生长，初为乳白色细毛绒状，2～3周后周边或中间渐变无色；韧、易碎，真菌丝，裂殖，节孢子单个或连接成链，长筒形，方形，圆形或椭圆形；能产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶。
本发明提供了所述的林生地霉菌株在降解餐厨垃圾中的应用。
本发明还提供了一种包含所述的林生地霉菌株的微生物菌剂。
具体的，微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述的林生地霉菌株接种至PDA斜面培养基上恒温培养，进行菌株的活化培养；
(2)将活化后的菌株接种至PDA液体培养基中，进行种子培养，得到种子液；
(3)将所述种子液接种至含发酵培养基的发酵罐内，进行发酵培养，得到微生物菌剂。
步骤(1)中，PDA斜面培养基的组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1L；活化培养的条件为：25～30℃恒温培养24～48h。
步骤(2)中，PDA液体培养基的组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L；种子培养的条件为：在25～40℃、150～200r/min的条件下摇床振荡培养24～48h。
步骤(3)中，发酵培养基的组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L；发酵培养的条件为：在25℃～40℃、200～450r/min的条件下发酵培养36～80h。
本发明提供了所述的微生物菌剂在降解餐厨垃圾中的应用。
本发明还提供了一种处理餐厨垃圾的方法，包括以下步骤：
(1)去除餐厨垃圾中大块且坚硬的固体垃圾；
(2)将权利要求5所述制备方法制得的微生物菌剂加入至餐厨垃圾中，进行餐厨垃圾的降解。
本发明提供的林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092是一种高效的餐厨垃圾降解菌，该菌在生长过程中能乳化餐厨垃圾中的油脂，改善餐厨垃圾降解过程中微生物活动的微环境，不仅能够高效降解餐厨垃圾，还能够消除异味，实现餐厨垃圾的无臭处理。
附图说明
图1为本发明林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092在培养皿中正面(A)、背面(B)和光学显微镜10×10倍下的菌株形态(C)。
图2为本发明林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的基于18s rDNA序列同源性构建的系统发育树。
图3为餐厨垃圾144h降解过程的pH变化；
其中，A为未接种林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的餐厨垃圾pH变化曲线；B为接种林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的餐厨垃圾pH变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1餐厨垃圾降解优势菌的筛选与鉴定
取浙江工业大学毓秀餐厅附近的土样5g加入到已灭菌的带有小玻璃珠和50mL无菌水的锥形瓶中，30℃，200r/min震荡20min，于超净台中进行菌悬液梯度稀释，浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，吸取100μL各浓度的菌悬液接种于PDA平板上，用封口膜将平板封口后倒置，放于28～37℃恒温培养箱中培养24～48h，选择菌落数合适的平板，挑取典型菌落，分离纯化后，分别接种至蛋白质、淀粉、脂肪、纤维素鉴别培养基平板并用已灭菌过的涂布棒涂布均匀，将培养皿用封口膜封口后倒置放于28～37℃恒温培养箱中培养48～37h，观察溶菌圈的直径和菌落直径比。选取菌圈较大的菌株，分别接种至PDA液体培养基，培养24h后，取适量菌液用30％的甘油保藏于-80℃冰箱里；取部分菌液进行形态学、生理生化和分子鉴定。
用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，扩增引物为真菌通用引物：
ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
PCR程序：在95℃进行预变性5min；95℃40s，55℃30s，72℃2min，30个循环延伸；72℃10min。
由上海尚亚生物技术有限公司进行PCR产物测序，其18s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
将获得的DNA序列，输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对，选择合适的DNA序列建立系统发育树(具体见图2)；再结合形态、生理生化鉴定结果，确定筛选所得的菌株为林生地霉(Geotrichum silvicola)，命名为林生地霉(Geotrichumsilvicola)ZJB-092。
林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092已在中国典型培养物保藏中心进行保藏；具体信息如下：
保藏编码：CCTCC NO：M 2019264；
保藏时间：2019年4月17日；
中国典型培养物保藏中心CCTCC的地址为：湖北省武汉市洪山区珞珈山街道八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心。
取林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092菌液在PDA固体培养基上划线，28℃培养24h，结果如图1(A)和(B)所示；将培养好的林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092制片，用光学显微镜观察结果如图1(C)所示。
上述方法中涉及的培养基成分如下：
PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1L、pH自然；
PDA液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L、pH自然；
蛋白质鉴别培养基：脱脂奶粉50g、可溶性淀粉10g、酵母提取物5g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O0.2、琼脂20g、水1L、pH7.0；
淀粉鉴别培养基：蛋白胨10g、可溶性淀粉2g、牛肉膏5g、NaCl5g、琼脂20g、水1L、pH7.0-7.2；
脂肪鉴别培养基：蛋白胨10g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O0.5、聚乙烯醇1.2、维多利亚蓝B0.04、橄榄油10g、琼脂20g、水1L、pH8.0；
纤维素鉴别培养基：K2HPO4 0.5、MgSO4·7H2O0.2、CMC-Na2g、刚果红0.2g、琼脂16g、明胶2g、水1L、pH7.0。
实施例2林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的酶活测定
将分离得到的林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092接种到PDA液体培养基中，于30℃摇床振荡培养48h，发酵液4℃，8000r/min离心10min，取上清液测定淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶酶活。
淀粉酶活性测定用DNS法，酶活定义：1mL酶液每分钟生成1ug麦芽糖所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。蛋白酶活性测定用福林酚法，酶活定义：1mL酶液每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。脂肪酶活性测定用国标GB/T 23535-2009，酶活定义：1mL酶液在一定温度和pH下(本实施例采用40℃、pH7.0),1min水解底物(本实施例以橄榄油为底物)产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以“U/mL”表示；纤维素酶活性测定用3，5一二硝基水杨酸法，1mL酶液每分钟水解纤维素生成1μg葡萄糖所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。
实施例3餐厨垃圾摇瓶降解试验
将林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092接种于PDA斜面；分别在25～30℃恒温培养24～48h，进行菌株活化；所用活化的PDA斜面组分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1L、pH自然，115℃灭菌30min。
将活化后的和林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092接种于马铃薯葡萄糖液体培养基；于25～30℃、150～200r/min摇床振荡培养48～72h，得林生地霉(Geotrichumsilvicola)ZJB-092菌液。所用培养基均为马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L、pH自然，115℃灭菌30min。
将林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092菌液按10％的重量比接种到装有餐厨垃圾的摇瓶中，37℃下150～200r/min培养，每12h取样测pH。结果如图3所示，未接种林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的餐厨垃圾在整个自然降解过程中，pH下降很快(如图3A所示)；而经过接种林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092菌剂后餐厨垃圾的pH下降较慢，且pH会在微生物大量增殖后，逐步上升，较长时间维持在一个偏中性的环境中，加速餐厨垃圾降解过程(如图3B所示)。
实施例4菌剂的制备
①斜面培养
将林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092接种于PDA斜面；在25～30℃恒温培养24～48h，进行菌株活化；所用活化的PDA斜面组分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1L、pH自然，115℃灭菌30min。
②种子液
将步骤①所得活化后的林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092接种于马铃薯葡萄糖液体培养基；分别于25～30℃、150～200r/min摇床振荡培养24～48h，得林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092种子液。所用培养基均为马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L、pH自然，115℃灭菌30min。
③扩大培养：
在发酵罐内放置50～67％体积比的培养基，将步骤②所得的林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092种子液接种到装有体积比为50～67％培养基的发酵罐内，于25℃～30℃、200～450r/min发酵培养36～80h；获得林生地霉(Geotrichumsilvicola)ZJB-092菌液，即微生物菌剂，活菌数≥1.0×108CFU/mL。
步骤③所用液体培养基：以1L计，200g马铃薯加1L水煮20min，过滤，取滤液，加入20g葡萄糖，加水补至1L，115℃灭菌30min。
实施例5菌剂的应用
以浙江工业大学毓秀餐厅收集的餐厨垃圾进行试验，
(1)去除餐厨垃圾中的骨头、塑料吸管等大块、坚硬的部分；
(2)将上述实施例4制得的餐厨垃圾降解菌剂(重150g)，置于垃圾降解处理机内，加入1kg餐厨垃圾运行24h后，每天补料约1kg，继续运行10天；平行3组。
(3)将某市售菌剂A和某市售菌剂B分别置于垃圾降解处理机内，加入1kg餐厨垃圾运行24h后，每天补料约1kg，继续运行10天；平行3组。
(4)测定垃圾降解率和气味检测
微生物菌剂的降解处理结果(垃圾降解率)以重量减量效率来体现：
减重率(％)＝(A-B)÷A×100％
A:投入的餐厨垃圾与微生物菌剂的总重(Kg)；B：处理后残余物总重(Kg)。
降解结果：餐厨垃圾经林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092菌液接种作用一定的时间后，呈灰褐色糊状，随着降解时间的不断延长，餐厨垃圾被不断地分解利用，最终呈棕褐色颗粒或粉状。
气味检测：先通过嗅觉感受餐厨垃圾降解过程中产生的气体，判断有无臭气；再收集气体利用四合一气体检测仪，检测氨气和硫化氢的含量，ppm与mg/m3的转换公式：
ppm＝(22.4×mg/m3)/所测气体分子量
氨气的分子量为17.031，硫化氢的分子量为34.08。
气味阈值强度分级
| 等级 | 强度 | 说明 |
| 0 | - | 无臭味 |
| 1 | + | 气味较弱，无法辨别气体强度和种类 |
| 2 | ++ | 能判断哪种气味 |
| 3 | +++ | 明显闻到气味 |
| 4 | ++++ | 较强气味 |
| 5 | +++++ | 强烈气味，但能接受 |
| 6 | ++++++ | 强烈气味，但不能接受 |
试验结果：
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 林生地霉菌株及其在降解餐厨垃圾中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 林生地霉(Geotrichum silvicola)
<400> 1
cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taagaattat aaatatttgt gaaatttaca 60
cagcaaacaa taattttata gtcaaaacaa aaataatcaa aacttttaac aatggatctc 120
ttggttctcg tatcgatgaa gaacgcagcg aaacgcgata tttcttgtga attgcagaag 180
tgaatcatca gtttttgaac gcacattgca ctttggggta tcccccaaag tatacttgtt 240
tgagcgttgt ttctctcttg gaattgcatt gcttttctaa aatttcgaat caaattcgtt 300
tgaaaaacaa cactattcaa cctcagatca agtaggatta cccgctgaac ttaagcatat 360
caataagcgg aggaa 375
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20
Claims (7)
1.一种林生地霉菌株，其特征在于，命名为林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019264，保藏时间为2019年4月17日。
2.如权利要求1所述的林生地霉菌株在降解餐厨垃圾中的应用。
3.一种包含权利要求1所述的林生地霉菌株的微生物菌剂。
4.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的林生地霉菌株接种至PDA斜面培养基上恒温培养，进行菌株的活化培养；
(2)将活化后的菌株接种至PDA液体培养基中，进行种子培养，得到种子液；
(3)将所述种子液接种至含发酵培养基的发酵罐内，进行发酵培养，得到微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：在25℃～40℃、200～450r/min的条件下，发酵培养36～80h。
6.如权利要求3所述的微生物菌剂在降解餐厨垃圾中的应用。
7.一种处理餐厨垃圾的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)去除餐厨垃圾中大块且坚硬的固体垃圾；
(2)将权利要求4所述制备方法制得的微生物菌剂加入至餐厨垃圾中，进行餐厨垃圾的降解。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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