CN110257365B

CN110257365B - 餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法及应用

Info

Publication number: CN110257365B
Application number: CN201910434759.3A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 刘奇; 薛亚平; 邹树平; 柯霞; 周海岩; 柳志强
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110257365A

Abstract

本发明公开了一种餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法及应用，该方法包括：分别对克鲁维毕赤酵母和林生地霉进行高密度液体发酵，再将菌液按比例混合；将复合菌液浓缩后，加入至改性后的载体中，进行混合，并在混合过程中加入交联剂，然后进行恒温通气培养；恒温通气培养后，进行低温干燥，得到固定化微生物菌剂。本发明方法不仅显著提高了载体固定的菌体量，还使载体与菌体之间的结合紧密，防止菌体在制备过程和保藏中的活菌大量损失，提高了单位质量菌剂的活菌数，减少了菌剂的使用量；制备获得的解餐厨垃圾能力强、能够消除降解餐厨垃圾过程中产生的异味，而且载体中固定的菌体量大，载体与菌体之间的结合更紧密，活菌生物量大。

Description

餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及环保生物技术领域，尤其涉及一种餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法及应用。

背景技术

相对于游离状态的微生物，固定在载体空间内的微生物不仅可以保持良好的活性和稳定性，还有助于细胞抵御酸碱性、高渗透压以及高温等不利环境的影响。而且，细胞固定化技术能够在一定空间内增加微生物的浓度。细胞固定化技术以其方法简单、可反复使用、稳定性高及易于分离等优点得到研究者的广泛重视。在崇尚环保的今天，细胞固定化技术已经应用于污水处理，这使得水资源得到很好的循环利用；在制药工业中，细胞固定化技术已应用于抗生素的生产，微生物的转化等领域；在发酵行业，细胞固定化技术应用的更普遍。但是，细胞固定化技术还仍处于研发阶段，还不成熟，有很多方面有待于继续探索。

餐厨垃圾降解菌剂的固定化方法为吸附固定化，其原理是载体与菌体之间的静电作用力使菌体与载体相互吸引，最终菌体吸附到载体表面而得到固定。

专利申请号为201611130234.3的专利申请公开了几种耐高油脂的高效分解菌种，在逐级梯度油脂含量的培养条件下进行富集培养，最后将单一菌粉后混合做成复合菌剂，复合菌剂中按质量份计算，菌剂比例为地衣芽孢杆菌为20-30份，黑曲霉为20-30份，枯草芽孢杆菌40-50份，酿酒酵母20-30份，洋葱假单胞菌为20-30份。

专利申请号为200810223029.0的专利申请提供了一种用于餐厨垃圾预处理的复合菌剂及其制备方法和应用，所述复合菌剂中活性组分为嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、发酵单胞菌、土壤杆菌、酿酒酵母和假丝酵母，所述组分按嗜热脂肪芽孢杆菌15～30％、地衣芽孢杆菌10～25％、发酵单胞菌10～25％、土壤杆菌10～25％、酿酒酵母15～30％、假丝酵母10～25％混合。所述复合菌剂按以下方法制备：将4℃保存的上述菌种分别接种到普通肉汤液体培养基，接种量为0.1％(v/v)，在28～37℃下活化培养8-18小时；然后分别转接普通肉汤液体培养基，在28～34℃下培养8-18小时，接种量为0.1～0.5％(v/v)，培养后将各菌液按上述比例混合。

尽管以上专利申请文献都提供了餐厨垃圾降解菌剂的微生物配方，但是菌剂的制备方法都是采用直接干燥菌体而得到，因此不利于菌剂的长时间保存。

专利申请号为201010284628.0的专利申请公开了一种用于处理餐厨垃圾的复合微生物菌剂的制备方法及应用，由用于降解餐厨垃圾的微生物的复合菌体与透气性良好的载体材料混合而成，所述复合菌体占所述载体材料质量百分含量的5～20％。

专利申请号为201410324504.9的专利申请提供了一种降解舰艇船舶餐厨垃圾的微生物菌剂及其制备方法。它解决了现有船舶餐厨垃圾处理能力差的问题。该微生物菌剂由以下质量分数的菌种原料混合而成：枯草芽孢杆菌15-35份、侧孢芽孢杆菌10-20份、解脂假丝酵母30-50份、绿色木霉10-20份、黑曲霉15-35份。其制备方法为：1)、将上述各菌株分别进行单株培养，再进行活化培养及发酵；2)、用载体进行吸附，各菌株获得单一菌粉；3)、取得相应组分的各菌株单一菌粉，充分混合得到微生物菌剂。

尽管上述专利申请都提供了餐厨垃圾降解菌剂的微生物菌株配方，但是上述菌株均没有涉及消除降解餐厨垃圾过程中异味的问题，造成降解产物的臭味非常明显。

此外，尽管上述专利申请都添加了载体，但都采用菌体直接与载体进行混合的制备方法，造成菌体与载体之间接触不紧密，对菌体的保护作用不强，不是严格意义上的固定化菌剂。

因此，有必要筛选降解餐厨垃圾能力强且除臭效果显著的优势菌株，以解决降解产物臭味明显的问题，并改进菌剂的固定化方法，从而提高菌体与载体接触紧密度，提高菌剂整体的品质和保质期。

发明内容

本发明提供了一种餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法及应用，制得的固定化微生物菌剂不仅解餐厨垃圾能力强、能够消除降解餐厨垃圾过程中产生的异味，而且载体中固定的菌体量大，载体与菌体之间的结合更紧密，活菌生物量大；该制备方法不仅能够提高载体固定的菌体量，还能使载体与菌体之间的结合紧密，防止菌体在制备过程和保藏中的活菌大量损失，提高了单位质量菌剂的活菌数，减少了菌剂的使用量。

具体技术方案如下：

一种餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别对克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091和林生地霉(Geotrichumsilvicola)ZJB-092进行高密度液体发酵，获得菌液，再将克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)菌液和林生地霉(Geotrichum silvicola)菌液按比例混合，得到复合菌液；

所述克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019263，保藏时间为2019年4月17日；

所述林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019264，保藏时间为2019年4月17日；

(2)将载体粉碎后过筛，进行酸碱改性处理，得到改性后的载体；

(3)将步骤(1)获得的复合菌液浓缩后，加入至改性后的载体中，进行混合，并在混合过程中加入交联剂，然后进行恒温通气培养；

(4)恒温通气培养后，进行低温干燥，得到固定化微生物菌剂。

本发明的创新之处在于：将克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091和林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092进行混合制得复合菌液，再与酸碱改性后的载体进行混合，并进行恒温通气培养，不仅显著提高了载体固定的菌体量，还使载体与菌体之间的结合紧密，防止菌体在制备过程和保藏中的活菌大量损失，提高了单位质量菌剂的活菌数，减少了菌剂的使用量；制备获得的解餐厨垃圾能力强、能够消除降解餐厨垃圾过程中产生的异味，而且载体中固定的菌体量大，载体与菌体之间的结合更紧密，活菌生物量大。

恒温通气培养的过程中，一方面，菌体因为吸附作用、黏附作用、交联剂的综合作用力下被固定于载体表面；另一方面，附着于载体表面的菌体沿着载体开始生长繁殖形成生物膜；而且由于载体的存在，会刺激菌体生长过程中大量分泌胞外多糖加强菌体的黏附作用。

作为优选，步骤(1)中，所述克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091和林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的质量比为1～10:0.5～5。

进一步地，步骤(1)中，所述克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJ B-091进行发酵培养的培养基配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖5g/L、动植物油15g/L、氯化钠5g/L；发酵培养的条件为：温度30～32℃，发酵罐搅拌培养，转速150～180rpm，时间60～80h；所述林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092进行发酵培养的培养基配方为：蔗糖5g/L、动植物油20g/L、硝酸钠5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸二氢钾1g/L硫酸镁0.5g/L；发酵培养的条件为：温度28～30℃，发酵罐搅拌培养，转速150～220rpm，时间1～5天。

作为优选，步骤(2)中，载体为小麦秸秆，颗粒大小为5～300目。采用小麦秸秆作为载体防止菌剂结块，进而避免菌剂使用过程中因机械粉碎而造成活菌数降低。小麦秸秆的颗粒大小对于固定化菌体量和保藏3个月后的损失率有影响，更优选，颗粒大小为5～150目或5～18目。

进一步地，步骤(2)中，所述酸碱改性处理的方法为：先将粉碎过筛后的载体加入体积浓度为1～20％的盐酸水溶液中，处理5～35min；再取出，加入至体积浓度为1～20％的氢氧化钠水溶液中，处理5～35min。

进一步地，步骤(3)中，所述交联剂为海藻酸钠、聚乙烯醇中的至少一种；以混合体系的质量分数计，交联剂的添加量为1％～5％。

进一步地，步骤(3)中，步骤(3)中，所述恒温通气培养的温度为25～40℃，时间为4～12h。

进一步地，步骤(4)中，低温干燥的温度为30～60℃。

本发明还提供了所述的制备方法制得的固定化微生物菌剂。

本发明还提供了所述固定化微生物菌剂在降解餐厨垃圾中的应用。

本发明还提供了一种利用所述的固定化微生物菌剂处理餐厨垃圾的方法，包括：

将所述的固定化微生物菌剂加入至待处理的餐厨垃圾中，进行发酵处理；

所述固定化微生物菌剂与待处理的餐厨垃圾的质量比为0.1～0.5:50；所述发酵处理的温度为45～65℃，时间为24～30h；在发酵处理过程中，进行搅拌，搅拌频率为每搅拌25min暂停5min；所述餐厨垃圾的中水的质量百分含量为60％～85％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明制备方法将克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091和林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092进行混合制得复合菌液，再与酸碱改性后的载体进行混合，并进行恒温通气培养，不仅显著提高了载体固定的菌体量，还使载体与菌体之间的结合紧密，防止菌体在制备过程和保藏中的活菌大量损失，提高了单位质量菌剂的活菌数，减少了菌剂的使用量；制备获得的解餐厨垃圾能力强、能够消除降解餐厨垃圾过程中产生的异味，而且载体中固定的菌体量大，载体与菌体之间的结合更紧密，活菌生物量大。

(2)本发明中载体经过改性后，提高了孔隙率，增加了表面活性基团，加大了菌体固定化量和固定化的紧密程度；加入交联剂也能促进菌体与载体之间的结合；菌体与载体混合后再培养能够使菌体附着在载体上面生长，进一步加大了固定化菌体量和提高了固定化的紧密程度。

(3)本发明生产流程简单，操作难度低；载体原料来源丰富而且便宜，降低了生产成本，具有巨大应用前景。

附图说明

图1为克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091正面(A)、背面(B)和光学显微镜40×10倍下的菌株形态(C)。

图2为克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091的基于18s rDNA序列同源性构建的系统发育树。

图3为林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092在培养皿中正面(A)、背面(B)和光学显微镜10×10倍下的菌株形态(C)。

图4为林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092的基于18s rDNA序列同源性构建的系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1餐厨垃圾降解优势菌的筛选与鉴定

取浙江工业大学毓秀餐厅附近的土样5g加入到已灭菌的带有小玻璃珠和50mL无菌水的锥形瓶中，30℃，200r/min震荡20min，于超净台中进行菌悬液梯度稀释，浓度梯度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，吸取100μL各浓度的菌悬液接种于PDA平板上，用封口膜将平板封口后倒置，放于28～37℃恒温培养箱中培养24～48h，选择菌落数合适的平板，挑取典型菌落，分离纯化后，分别接种至蛋白质、淀粉、脂肪、纤维素鉴别培养基平板并用已灭菌过的涂布棒涂布均匀，将培养皿用封口膜封口后倒置放于28～37℃恒温培养箱中培养48～37h，观察溶菌圈的直径和菌落直径比。选取菌圈较大的菌株，分别接种至PDA液体培养基，培养24h后，取适量菌液用30％的甘油保藏于-80℃冰箱里；取部分菌液进行形态学、生理生化和分子鉴定。

用FastDNA^TM Spin Kit for Soil试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，扩增引物为真菌通用引物：

ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR程序：在95℃进行预变性5min；95℃40s，55℃30s，72℃2min，30个循环延伸；72℃10min。

由上海尚亚生物技术有限公司进行PCR产物测序，其18s rDNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

将获得的DNA序列，输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对，选择合适的DNA序列建立系统发育树(具体见图2和图4)；再结合形态、生理生化鉴定结果，确定筛选所得的菌株分别为克鲁维毕赤酵母和林生地霉，分别命名为克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091和林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092。

取克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091菌液在PDA固体培养基上划线，28℃培养24h，结果如图1(A)和(B)所示；将培养好的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091制片，用光学显微镜40×10倍下的菌株形态(C)。

取林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092菌液在PDA固体培养基上划线，28℃培养24h，结果如图3(A)和(B)所示；将培养好的林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092制片，用光学显微镜观察结果如图3(C)所示。

克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091和林生地霉(Geotrichumsilvicola)ZJB-092均已在中国典型培养物保藏中心进行保藏；具体信息如下：

(1)克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091：

保藏编码：CCTCC NO：M 2019263；

保藏时间：2019年4月17日；

(2)林生地霉(Geotrichum silvicola)ZJB-092：

保藏编码：CCTCC NO：M 2019264；

保藏时间：2019年4月17日；

中国典型培养物保藏中心CCTCC的地址为：湖北省武汉市洪山区珞珈山街道八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心。

上述方法中涉及的培养基成分如下：

PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1L、pH自然；

PDA液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L、pH自然；

蛋白质鉴别培养基：脱脂奶粉50g、可溶性淀粉10g、酵母提取物5g、KH₂PO₄1g、MgSO₄·7H₂O0.2、琼脂20g、水1L、pH7.0；

淀粉鉴别培养基：蛋白胨10g、可溶性淀粉2g、牛肉膏5g、NaCl5g、琼脂20g、水1L、pH7.0-7.2；

脂肪鉴别培养基：蛋白胨10g、K₂HPO₄1g、MgSO₄·7H₂O0.5、聚乙烯醇1.2、维多利亚蓝B0.04、橄榄油10g、琼脂20g、水1L、pH8.0；

纤维素鉴别培养基：K₂HPO₄ 0.5、MgSO₄·7H₂O0.2、CMC-Na2g、刚果红0.2g、琼脂16g、明胶2g、水1L、pH7.0。

实施例2微生物菌剂的制备

1、未固定化的微生物菌剂的制备

(一)制备复合菌体

(1)斜面培养：

分别将克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091和取林生地霉(Geotrichumsilvicola)ZJB-092接种在PDA固体培养基；

其中，林生地霉在30℃温度下培养48h，克鲁维毕赤酵母在28℃温度下培养72h，进行菌株的活化。

(2)一级种子液培养：

将步骤(1)所得的活化后的克鲁维毕赤酵母和林生地霉分别接种于250mL液体培养基，进行种子培养，得到克鲁维毕赤酵母一级种子液培养和林生地霉一级种子液培养；

其中，林生地霉在30℃温度下培养48h，克鲁维毕赤酵母在28℃温度下培养72h。

(3)发酵罐培养：

将步骤(2)所得的克鲁维毕赤酵母一级种子液培养和林生地霉一级种子液培养分别接种到10L发酵罐的液体培养基中进行发酵培养，得到克鲁维毕赤酵母发酵液和林生地霉发酵液；最终发酵液中菌体湿重为20g/L。

克鲁维毕赤酵母的液体培养基配方：蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、葡萄糖5g/L、动植物油15g/L、氯化钠5g/L。

林生地霉的液体培养基配方：蔗糖5g/L、动植物油20g/L、硝酸钠5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸二氢钾1g/L硫酸镁0.5g/L。

将克鲁维毕赤酵母发酵液和林生地霉发酵液按照体积比为1∶5进行混合。

(二)载体的制备：小麦秸秆粉碎过后过5目筛网。

(三)菌剂的制备：将载体加入克鲁维毕赤酵母和林生地霉的混合发酵液发酵液中混合均匀，载体和混合发酵液的质量比为1∶20。

(四)干燥：将混合后的湿菌剂通过震荡流化床进行干燥，得到粉末状的菌剂。

2、固定化微生物菌剂I的制备

(一)制备复合菌体

按第1部分的培养方式对各菌种单独培养制备得到菌体湿重为20g/L的发酵液，最后将克鲁维毕赤酵母发酵液和林生地霉发酵液按照体积比为1∶5进行混合。

(二)载体的制备：小麦秸秆粉碎过后过10目筛网，将粉碎过筛后的载体加入体积浓度为10％的盐酸水溶液中，处理30min；再取出，加入体积浓度为10％的氢氧化钠水溶液中，处理30min。

(三)菌体的固定化：将载体加入克鲁维毕赤酵母和林生地霉的混合发酵液中混合均匀，载体和混合发酵液的质量比为1∶20，混合后置于发酵罐中，向发酵罐中添加质量分数1％的海藻酸钠后恒温30℃通气培养4h。

(四)干燥：将固定化后的湿菌剂通过震荡流化床进行干燥，得到粉末状的菌剂。

3、固定化微生物菌剂II的制备

(一)制备复合菌体

按第1部分的培养方式对各菌种单独培养得到菌体湿重为20g/L的发酵液，最后将克鲁维毕赤酵母发酵液和林生地霉发酵液按照体积比为1∶1进行混合。

(二)载体的制备：小麦秸秆粉碎过后过5目筛网，将粉碎过筛后的载体加入体积浓度为20％的盐酸水溶液中，处理5min；再取出，加入体积浓度为20％的氢氧化钠水溶液中，处理5min。

(三)菌体的固定化：将载体加入克鲁维毕赤酵母和林生地霉的混合发酵液发酵液中混合均匀，载体和混合发酵液的质量比为1∶20，混合后置于发酵罐中，向发酵罐中添加质量分数1％的聚乙烯醇后恒温30℃通气培养12h。

对比实施例2中未固定化的微生物菌剂、固定化微生物菌剂I和固定化微生物菌剂II中所含有的活菌数和保藏3个月后活菌数的损失率，结果如下表1。

表1三种菌剂的活菌数和3个月保藏后的活菌损失率

实施例3

本实施例为采用实施例2制得的不同固定化微生物菌剂对餐厨垃圾进行降解试验：

(1)取学校食堂餐厅中剩下的饭菜，进行分拣，去除骨头、纸屑、木筷、塑料等固体垃圾；

(2)向垃圾处理机中加入15kg分拣后的餐厨垃圾，取实施例2制得的微生物菌剂(分别为未固定化的微生物菌剂、固定化微生物菌剂I和固定化微生物菌剂II)900g放进垃圾处理机里，继续发酵24h后，然后每隔一天加入10kg上述餐厨垃圾，连续10天，加入的总的餐厨垃圾与微生物菌剂的重量比大约为130∶1；

发酵温度为55℃，时间为28h；在发酵处理过程中，进行搅拌，搅拌频率为每搅拌25min暂停5min；餐厨垃圾中水的质量百分含量具体为80％；

(3)将某市售菌剂A和某市售菌剂B分别置于垃圾降解处理机内按照步骤(2)进行降解试验；平行3组。

(4)测定垃圾降解率

复合微生物菌剂的降解处理结果(垃圾降解率)以重量减量效率来体现：

餐厨垃圾降解率计算采用以下公式进行：降解率＝(A-B)/A×100％。其中，A表示餐厨垃圾、复合菌剂投入后的总重量；B表示餐厨垃圾、复合菌剂处理后的总重量。

以未改良的微生物菌剂为例，10后加入的餐厨垃圾总重量为115kg(A)，10天后再称量垃圾机和菌剂及剩余餐厨垃圾的总重量为16.91kg(B)。根据公式计算出垃圾机运行10天后的垃圾重量平均减量效率为84.3％。

(5)活菌数测定：使用稀释涂布平板法测定实施例2中的三种菌剂和市售菌剂的单位干菌剂的活菌数。

(6)气味检测：先通过嗅觉感受餐厨垃圾降解过程中产生的气体，判断有无臭气；再收集气体利用四合一气体检测仪，检测氨气和硫化氢的含量，ppm与mg/m³的转换公式：ppm＝(22.4×mg/m³)/所测气体分子量

氨气的分子量为17.031，硫化氢的分子量为34.08。

表2气味阈值强度分级表

采用实施例2中制得的三种菌剂和市售菌剂对餐厨垃圾进行降解试验，结果如表3所示。

表3实施例2中的三种菌剂和市售菌剂降解餐厨垃圾的减重率和臭味测定

实施例4载体的筛选

本实施例为筛选不同颗粒大小的载体配合特定培养式固定化方法的实验。载体在菌剂中的作用主要是保护菌体不受外部环境的干扰，比如烘干过程和保藏过程中的失水等。

本实验将小麦秸秆5目、18目、150目、300目等不同大小的载体制备成为菌剂(除载体目数替换外，其余步骤与实施例2中固定化微生物菌剂I的制备方法相同)，首先测定湿菌剂的活菌数，然后将菌剂放置与50℃烘箱中烘干后再测定干菌剂的活菌数，最后将干菌剂常温25℃保藏3个月后测定活菌数。

下表列出了实验结果，5目小麦秸秆的干燥损失比例和保藏损失比例都较小说明5目的小麦秸秆对菌体干燥和保藏作用较好，主要原因为5目秸秆具有较大的平整表面，菌体黏附在载体上面结果培养繁殖后与载体结合的更紧密，因此能够得到载体的保护作用(见表4)。

表4不同目数的载体对菌体的固定化菌体量和保藏3个月后的损失率

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 449

<212> DNA

<213> 克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)

<400> 1

cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttactgtgat ttatatctta tacacatgcg 60

tgagcgcacc aaacacctaa aattgtaata ccaccagtca gtaagtttta acaaaacaaa 120

actttcaaca acggatctct tggttctcgc atcgatgaag agcgcagcga aatgcgatac 180

ctagtgtgaa ttgcagccat cgtgaatcat cgagttcttg aacgcacatt gcgccccatg 240

gtattccatg gggcatgcct gtctgagcgt cgtttccttc ttgcgcaagc agagttgaga 300

acaggctatg cctttttcga aatggaacgt cgtggacgaa gtgaactaaa tttttagcac 360

gctttggccg ccgaactttt aactaagctc gacctcagat caggtaggaa tacccgctga 420

acttaagcat atcaataagc ggaggaaaa 449

<210> 2

<211> 375

<212> DNA

<213> 林生地霉(Geotrichum silvicola)

<400> 2

cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taagaattat aaatatttgt gaaatttaca 60

cagcaaacaa taattttata gtcaaaacaa aaataatcaa aacttttaac aatggatctc 120

ttggttctcg tatcgatgaa gaacgcagcg aaacgcgata tttcttgtga attgcagaag 180

tgaatcatca gtttttgaac gcacattgca ctttggggta tcccccaaag tatacttgtt 240

tgagcgttgt ttctctcttg gaattgcatt gcttttctaa aatttcgaat caaattcgtt 300

tgaaaaacaa cactattcaa cctcagatca agtaggatta cccgctgaac ttaagcatat 360

caataagcgg aggaa 375

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分别对克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）ZJB-091和林生地霉（Geotrichum silvicola）ZJB-092进行高密度液体发酵，获得菌液，再将克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）ZJB-091菌液和林生地霉（Geotrichum silvicola）ZJB-092菌液按比例混合，得到复合菌液；

所述克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）ZJB-091，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019263，保藏时间为2019年4月17日；

所述林生地霉（Geotrichum silvicola）ZJB-092，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019264，保藏时间为2019年4月17日；

（2）将载体粉碎后过筛，进行酸碱改性处理，得到改性后的载体；

（3）将步骤（1）获得的复合菌液浓缩后，加入至改性后的载体中，进行混合，并在混合过程中加入交联剂，然后进行恒温通气培养；

（4）恒温通气培养后，进行低温干燥，得到固定化微生物菌剂。

2.如权利要求1所述的餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）ZJB-091和林生地霉（Geotrichum silvicola）ZJB-092的质量比为1~10 : 0.5~5。

3.如权利要求1所述的餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，载体为小麦秸秆，颗粒大小为5~300 目。

4.如权利要求1所述的餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述酸碱改性处理的方法为：先将粉碎过筛后的载体加入体积浓度为1~20%的盐酸水溶液中，处理5~35 min；再取出，加入至体积浓度为1~20%的氢氧化钠水溶液中，处理5~35 min。

5.如权利要求1所述的餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述交联剂为海藻酸钠、聚乙烯醇中的至少一种；以混合体系的质量分数计，交联剂的添加量为1%~5%。

6.如权利要求1所述的餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述恒温通气培养的温度为25~40℃，时间为4~12 h。

7.如权利要求1所述的餐厨垃圾处理的固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，低温干燥的温度为30～60℃。

8.如权利要求1~7任一项所述的制备方法制得的固定化微生物菌剂。

9.如权利要求8所述的固定化微生物菌剂在降解餐厨垃圾中的应用。

10.一种利用权利要求8所述的固定化微生物菌剂处理餐厨垃圾的方法，其特征在于，包括：

将如权利要求8所述的固定化微生物菌剂加入至待处理的餐厨垃圾中，进行发酵处理；

所述固定化微生物菌剂与待处理的餐厨垃圾的质量比为0.1~0.5:50；所述发酵处理的温度为45~65℃，时间为24~30 h；在发酵处理过程中，进行搅拌，搅拌频率为每搅拌 25min暂停5min；待处理餐厨垃圾中水的质量百分含量为60% ～ 85%。