JP2002539820A

JP2002539820A - 植物の病気を制御するためのＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ菌株

Info

Publication number: JP2002539820A
Application number: JP2000608723A
Authority: JP
Inventors: ローリジョーレーマン，; ランディジェイマッコイ，; ベリンダジェーンメッセンジャー，; デニスキャロルマンカー，; ジミーエンジオオルジャラ，; ドルテリントハルド，; パメラゲイルマローン，; デスモンドリトヒメネズ，
Original assignee: アグラクエストインコーポレイテッド
Priority date: 1999-03-30
Filing date: 2000-03-21
Publication date: 2002-11-26
Anticipated expiration: 2020-03-21
Also published as: TR200201743T2; SK13062001A3; CZ20013239A3; TR200201744T2; CN1351652A; IL145291A0; CR6455A; NO20014653D0; NO20014653L; KR100736253B1; CA2367775C; TR200201746T2; BG105982A; CA2367775A1; IL145291A; PL351956A1; TR200102809T2; JP2010200765A; IS6070A; BR122013028999B1

Abstract

(57)【要約】本発明により、ある特定の植物病原体に対してのみ抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性を示さない、新規な抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．、ならびに、この菌株の同定する特徴全てを有する菌株の生物学的に純粋な培養物が提供される。また、これらの菌株、これらの菌株によって産生される上清またはこれらの菌株から単離される代謝物の有効量を施用することによって、植物、果実、および根の真菌感染を処置または真菌感染から保護する方法が提供される。本発明はさらに、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の菌株をＢ−２１６６１（ＡＱ７１３）と共に用いることの相乗的な殺真菌効果を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）この出願は、１９９９年３月３０日に提出された米国特許出願番号第０９／２
８１，３６０号の一部係属出願、および１９９９年１２月１４日に提出された米
国特許出願番号第０９／４６１，７００号の一部継続出願であり、これらの内容
は本明細書中において本開示の参考文献に組み込まれる。

【０００２】（本発明の分野）本発明は、バイオ農薬の分野である。より具体的には、本発明は、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓの新規菌株、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号は、
インビボで広い範囲の真菌による植物の病気を阻害し得るという発見に関連する
。本発明はまた、この新規Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株、および抗生物質およびこの菌
株の精製および未精製画分を単独で、または他の化学的および生物学的農薬と組
み合せて含む殺真菌性の組成物に関連する。本発明はさらに、ＮＲＲＬ登録番号
第Ｂ−３００８７号とＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１号、（ＣＣＲＣ９１０１
０６）を共に用いた相乗的な殺真菌効果に関連する。

【０００３】（背景）一般的に、様々な微生物が植物の疾患を制御するのに有用な生物学的活性を示
すことが知られている。作物学および園芸学的に重要な様々な植物の病気を制御
することが、生物学的農薬を同定および開発する分野において進歩したが、使用
されているほとんどの農薬は未だ合成化合物である。これら化学的殺真菌剤の多
くは、ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｇｅｎｃｙ（Ｅ
ＰＡ）によって発癌性物質として分類され、そして野生生物および他の非標的種
に対して毒性である。それに加えて、病原体は化学的農薬に対して抵抗性を発達
させ得る。例えば、Ｓｃｈｗｉｎｎら、ＡｄｖａｎｃｅｓＩｎＰｌａｎｔ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｔｈｅ
ＣａｕｓｅｏｆＬａｔｅＢｌｉｇｈｔｏｆＰｏｔａｔｏ、２４４頁
、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９
１）を参照のこと。

【０００４】生物学的な制御は、合成化学的殺真菌剤の魅力的な代替を提供する。バイオ農
薬（生存生物体およびこれら生物体によって産生される天然に産生された化合物
）はより安全で、より生物分解性で、そして開発するのがより安価であり得る。

【０００５】通常使用されるバイオ農薬の１つは、グラム陽性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈ
ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓである。農薬性Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株は
、胞子形成の間に結晶性タンパク質を産生することが知られており、それは特定
の状態および特定の種の昆虫および線虫に特に毒性である（例えば米国特許第４
，９９９，１９２号、および米国特許第５，２０８，０１７号を参照のこと）。
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓによって産生されるタンパク質様のエンドトキ
シンはまた、キュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシおよび他の甲虫に対する
殺虫剤として作用する（例えば、米国特許第５，１８７，０９号およびＪｏｈｎ
ｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９３）、Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．、８６：３
３０−３３３）。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシンは、精製結晶
、洗浄細胞ペレット、および発現したタンパク質として有効であることが示され
た。Ｗａｒｒｅｎら、第ＷＯ９６／１００８３号は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒ
ｅｕｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの生長期の間に産生される非エン
ドトキシンタンパク質を開示している。Ｖｉｐ１およびＶｉｐ２と呼ばれるこれ
らの生長期タンパク質は、キュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシ（北部およ
び西部）に対して強力な活性を有する。例えば、Ｅｓｔｒｕｃｈら（１９９７）
、Ｎａｔｕｒｅ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：１３７−１４１を参照の
こと。

【０００６】ベータ外毒素と呼ばれる１つのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの熱安定性代
謝物も、農薬の性質を有することが示された。ＢｕｒｇｊｅｒｏｎおよびＢｉａ
ｃｈｅ（１９７９）、Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ１１：２７９−２８４は、コロ
ラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）に対して
活性であるベータ外毒素を報告している。それに加えて、公知のＢ．ｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓのベータ外毒素は、線虫だけでなく、ハエ、ガの幼虫、ダニ、
およびキュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシを殺す、非特異的な農薬活性を
示す。シグマ外毒素は、ベータ外毒素と類似の構造を有し、そしてコロラドハム
シに対して活性である。Ａｒｇａｕｅｒら（１９９１）、Ｊ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．
Ｓｃｉ．２６：２０６−２１３を参照のこと。アルファ外毒素は、Ｍｕｓｃａ
ｄｏｍｅｓｔｉｃａの幼生に毒性である（Ｃｌｕｔｈｙ（１９８０）、ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．８：１−７）。ガンマ外毒素は、種々のタン
パク質溶解酵素、キチナーゼ、およびプロテアーゼである。ガンマ外毒素の毒性
効果は、ベータ外毒素またはデルタエンドトキシンと組み合せてのみ発現される
。Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｃ．、「Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
：ＩｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＱｕａｌｉｔｙ
」ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌｏｆＣａｎａｄ
ａ、公開番号第ＮＲＣＣ１５３８５号、９１〜１０９頁（１９７６）を参照のこ
と。Ｓｔｏｎａｒｄら（１９９４）、ＡＣＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅ
ｓ５５１：２５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ菌株の上清における、キ
ュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシに対して活性な、水溶性の２次代謝物を
報告している。

【０００７】ツヴィッターマイシン（ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ）Ａは、多くの真菌および
細菌性の植物病原体に対して広いスペクトルの活性を有する、水溶性の酸に安定
な直鎖状アミノポリオール分子である（Ｈｅら（１９９４）、Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎＬｅｔｔ．３５（１６）：２４９９−２５０２を参照のこと）。ツヴィ
ッターマイシンＡはまた、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの活性を増強するこ
とが知られている。Ｍａｎｋｅｒら（ＷＯ９６／３９０３７号）が、最初にツヴ
ィッターマイシンＡのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ−増強能力および性質を
決定した。続いて、Ｓｃｈｎｅｐｆらもまた、ツヴィッターマイシンＡがＢ．ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを増強することを報告した（米国特許第５，７０２，
７０３号）。

【０００８】バチルスは、抗真菌および抗細菌性の２次代謝物を産生することが知られてい
る。Ｋｏｒｚｙｂｓｋｉら、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ科（バチルス科）から単離され
た抗生物質」、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ｏｒｉｇｉｎ，Ｎａｔｕｒｅａｎｄ
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．第ＩＩＩ巻（１９７８）
、およびＢｅｒｄｙ、ＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、第Ｉ−ＸＩＶ巻、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏ
ｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ（１９８０−８７）を参照のこと。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ
によって産生される化合物は、ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎＰ、ｐｕｍｉｌｉｎ、
およびｔｅｔａｉｎを含む。

【０００９】Ｋａｗａｇｕｃｈｉらは、米国特許第４，２５０，１７０号において、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓから、広い範囲のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対する活性を有
する、新規水溶性抗生物質を単離した。Ｓｔａｂｂら（１９９０）Ａｐｐｌｉｅ
ｄＥｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：４４０４−４４１２は、抗真
菌活性を示す特定のＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．
は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂ．ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む）菌株を同定した。これらの菌株は、ツヴィッ
ターマイシンＡおよび／またはカノサミン（ｋａｎｏｓａｍｉｎｅ）を産生する
ことが示された。Ｍｉｌｎｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．
６２：３０６１−３０６６（１９９６）を参照のこと。これらは、Ｐｈｙｔｏｐ
ａｔｈｏｒａｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ｐ．ａｐ
ｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍまたはＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｍｉｎｏｒによって
起こる、土壌伝播性の病気である立枯れ病に対して有効である抗生物質である（
Ｓｔａｂｂら、前出を参照のこと）。ツヴィッターマイシンＡは、水溶性の、酸
に安定な直鎖状アミノポリオール分子である。Ｈｅら（１９９４）Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３５（１６）：２４９９−２５０２を参照のこと。そ
れは多くの真菌および細菌性植物病原体に対して広いスペクトルの活性を有する
。カノサミン（Ｍｉｌｎｅｒら、１９９６）もまた、広い範囲の真菌性植物病原
体および少数の細菌種を阻害する。

【００１０】Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎらは、米国特許第５，０４９，３７９号において、ツヴ
ィッターマイシンＡ−産生Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが、アルファルファおよびダイズの
立枯れ病を制御する方法を記載している。種がＢ．ｃｅｒｅｕｓＡＴＣＣ５３
５２２でコートされた場合、根腐れ真菌の病原性活性が阻害された。同様に、特
定のＢ．ｃｅｒｅｕｓ菌株の胞子に基づく処方を、ダイズの種または種の周りの
土壌に適用すると、畑でのダイズの収量が改善されることが示された。Ｏｓｂｕ
ｒｎｅら（１９９５）Ａｍ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．７９（６）：５
５１−５５６を参照のこと。バイオ農薬の適用方法は、当該分野で周知であり、
そして例えば微生物の可溶性の粉末、乾燥流動可能性（ｆｌｏｗａｂｌｅｓ）、
マイクロカプセル封入、および液体処方、適当な培養物からの培養液全体または
抗生物質画分を含む。例えば、Ｒｏｓｓａｌｌの米国特許第５，０６１，４９５
号、およびＨａｎｄｅｌｓｍａｎの米国特許第５，０４９，３７９号を参照のこ
と。

【００１１】Ｔｓｕｎｏら（１９８６）Ｊ．ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓＸＸＸＩＸ（７）：
１００１−１００３は、インビトロにおいて広い範囲の細菌に対する活性を有す
る、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ由来の新規アミノ糖抗生物質を報告している。

【００１２】Ｋｈｍｅｌ，Ｉ．Ａ．ら（１９９５）は、ＳＵ１８１７８７５において、真菌
性の植物病原体および細菌を制御するのに使用される、Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕ
ｍｉｌｕｓの新規菌株ＶＫＭＣＲ−３３３Ｄを開示している。

【００１３】Ｌｅｉｆｅｒｔら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７８：９７−１０８
（１９９５）は、２つのＢａｃｉｌｌｕｓ菌株、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＣＬ２
７およびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓＣＬ４５による、抗Ｂｏｔｒｙｔｉｓおよび抗Ａ
ｌｔｅｒｎａｒｉａ抗生物質の産生を報告している。培養液全体および細胞がな
い濾液が、インビトロにおける試験でＢｏｔｒｙｔｉｓおよびＡｌｔｅｒｎａｒ
ｉａに対して活性であり、そしてＡｓｔｉｌｂｅに対するインビボ小植物試験に
おいてＢｏｔｒｙｔｉｓに対して活性である。Ｌｅｉｆｅｒｔら（１９９７）米
国特許第５，５９７，５６５号は、収穫後の病気を引き起こす真菌、Ａｌｔｅｒ
ｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａおよびＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅ
ａを阻害するのに特に有効な、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、お
よびＢ．ｐｏｌｙｍｙｘａを開示している。彼らはまた、細胞がない培養濾液に
おいて産生された抗生物質の存在、および異なるｐＨ値でのその活性を開示して
いるが、彼らはこれらの化合物を同定していない。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の
化合物は、低いｐＨで活性を失うが、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ抽出物由来の活性は、
５．６より低いｐＨ値でのみ起こる。Ｌｅｉｆｅｒｔら（１９９８）米国特許第
５，７８０，０８０号は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａお
よびＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａを阻害するために、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、およびＢ．ｐｏｌｙｍｙｘａ菌株で治療し得るキャベ
ツを開示している。

【００１４】Ｌｏｅｆｆｌｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ１１５
：２０４−２１３は、抗真菌および抗細菌活性を有する種々の抗生物質を産生す
るＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ、およびＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ菌株を開示している。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓは
ｂａｃｉｌｙｓｉｎおよびｉｔｕｒｉｎＡを産生した。ｂａｃｉｌｙｓｉｎは
、分子量２７０の非常に小さい化合物であり、酵母のみを阻害する。ｉｔｕｒｉ
ｎは、極性溶媒に可溶性であり、広い抗真菌および抗細菌活性を有する。

【００１５】米国特許第５，３４４，６４７号において、Ｒｏｓｓａｌｌは、広い抗真菌活
性を有するＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株を開示している。さらに、
Ｒｏｓｓａｌｌの米国特許第５，０６１，４９５号は、６３，５００ダルトン、
５より低いｐＨで沈殿し、そしてグラム陽性細菌および真菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ
およびＥｒｙｓｉｐｈｅ）に対して活性を有する、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の
新規抗生物質を提供する。Ｓｈｏｌｂｅｒｇら（１９９５）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．４１：２４７−２５２、Ｓｗｉｎｂｕｒｎｅら（１９７５）Ｔｒ
ａｎｓ．Ｂｒｉｔ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．６５：２１１−２１７、Ｓｉｎｇｈお
よびＤｅｖｅｒａｌｌ（１９８４）Ｔｒａｎｓ．Ｂｒ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．８
３：４８７−４９０、Ｆｅｒｒｅｉｒａら（１９９１）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ
ｏｇｙ８１：２８３−２８７、およびＢａｋｅｒら（１９８３）Ｐｈｙｔｏｐ
ａｔｈｏｌｏｇｙ７３：１１４８−１１５２。全てＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ
．およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの、真菌植物病原体の生物学的制
御薬剤としての使用を開示している。Ｐｕｓｅｙら（１９８８）ＰｌａｎｔＤ
ｉｓ．７２：６２２−６２６、Ｐｕｓｅｙら、米国特許第５，０４７，２３９号
、およびＭｃＫｅｅｎら（１９８６）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ７６：１
３６−１３９は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを用いた収穫後の果実腐敗の制御を開示
している。Ｍｃｋｅｅｎら、前出は、低分子量ｉｔｕｒｉｎ環状ポリペプチドと
類似の抗生物質が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのこの殺真菌活性に寄与していること
を示した。

【００１６】Ｌｉｕらは、米国特許第５，４０３，５８３号において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．（ＡＴＣＣ５５０００）および真菌植物病原体、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉ
ａｓｏｌａｎｉを制御する方法を開示している。ＩｓｌａｍおよびＮａｎｄｉ
（１９８５）Ｊ．ＰｌａｎｔＤｉｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔ．９２（３）：２４１−
２４６は、コメの褐色斑点（ｒｉｃｅｂｒｏｗｎｓｐｏｔ）の原因であるＤ
ｒｅｃｈｓｌｅｒａｏｒｙｚａｅに拮抗するＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．を開示
している。同じ著者ら、ＩｓｌａｍおよびＮａｎｄｉ（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎ
ｔＤｉｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔ．９２（３）：２３３−２４０はまた、Ｄｒｅｃｈ
ｓｌｅｒａｏｒｙｚａｅ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａおよび
Ｆｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍに対するＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．のインビト
ロにおける拮抗を開示している。彼らは、培養濾液中の３つの成分について議論
している。最も活性な抗生物質は、水およびメタノールに高度に可溶性であり、
２５５ｎｍにＵＶピーク、および２６０ｎｍに肩を有し、ポリオキシン様のリポ
ペプチドであることが証明された。Ｃｏｏｋら（１９８７）Ｂｅｌｔｗｉｄｅ
ＣｏｔｔｏｎＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅｓ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、４３−４５頁は、ワタの根腐れの原因であるＰｈｙ
ｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍｏｍｎｉｖｏｒｕｍによって死滅するワタの数を抑制
するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．の懸濁液の使用を開示している。

【００１７】Ｂ’ＣｈｉｒおよびＮａｍｏｕｃｈｉ（１９８８）ＲｅｖｕｅＮｅｍａｔｏ
ｌｏｇｉｑｕｅ１１（２）：２６３−２６６は、線虫捕獲真菌を刺激してその
線虫を捕獲する能力を増加させるＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓについて報
告している。Ｂ’ＣｈｉｒおよびＢｅｌｋａｄｈｉ（１９８６）Ｍｅｄ．Ｆａｃ
．Ｌａｎｄｂｏｕｗｗ．Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖ．Ｇｅｎｔ５１／３ｂ：１２９５
−１３１０は、真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）およびカンキツ属で感染を引き起こす
線虫の細胞相互作用を論じている。その真菌はＢ．ｐｕｍｉｌｕｓと結合してお
り（それらは共に存在する）、そして線虫もそこに存在する場合、真菌はより重
症である。Ｂ．ｐｕｍｍｉｌｕｓは、線虫の食料を供給しているようである。Ｇ
ｏｋｔｅおよびＳｗａｒｕｐ（１９８８）ＩｎｄｉａｎＪ．Ｎｅｍａｔｏｌ．
１８（２）：３１３−３１８は、抗線虫薬であるＢ．ｐｕｍｉｌｕｓについて報
告しているが、彼らは抗真菌活性を報告していない。Ｓｌａｂｏｓｐｉｔｓｋａ
ｙａら（１９９２）ＭｉｋｒｏｂｉｏｌＺｈ（Ｋｉｅｖ）５４（６）：１６−
２２は、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓを含む多くの異なるＢａｃｉｌｌｕｓを、キチナー
ゼを産生する能力に関して比較しているが、彼らは植物病原体に対する活性は報
告していない。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓは、最も低いキチナーゼレベルを産生する。
ＭｃＩｎｒｏｙら（１９９５）ＰｌａｎｔａｎｄＳｏｉｌ１７３（２）：
３３７−３４２は、植物の幹および根中の内生植物である、多くのＢａｃｉｌｌ
ｕｓおよびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓを含む多くの型の細菌を調査した。しかし、彼ら
は、これらの内生植物菌株が抗真菌性であるという証拠は示していない。Ｃｈｅ
ｒｎｉｎら（１９９５）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓは、植物の疾患
を引き起こす細菌（例えばＸａｎｔｈｏｍａｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、
Ｅｒｗｉｎｉａ）および真菌に対する広いスペクトルの活性を有するＢａｃｉｌ
ｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓを発見した。Ｆｅｙら（１９９１）ＡｋａｄＬａｎｄ
ｗｉｒｔｓＫａｒｔは、種イモをＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉから
ある程度守るＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ菌株について報告している。

【００１８】（本発明の開示）特定の特異的な植物病原体に対してのみ抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性
を示さない、新規抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．が提供される。有効な
量の抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．を適用する工程を含む、真菌の感染
から植物、果実および根を処置または保護する方法も提供される。抗生物質産生
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．は、培養液全体の懸濁液として、または抗生物質産生
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．の培養液全体から得た、部分的に精製された抗生物質
を含む上清として提供され得る。特異的な抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性
を示さない新規水溶性抗生物質も提供される。

【００１９】本発明はまた、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する新規化
合物も提供する。その化合物は、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓの培養液全体または上清か
ら単離され、そしてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合せた場合、その殺
虫活性を増強する。本発明はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓの細菌懸濁液またはＢａｃ
ｉｌｌｕｓの培養液の代謝物を含む上清または精製した代謝物を用いて、植物の
上、または中への昆虫の侵入を制御するための植物を治療する方法を含む。

【００２０】本発明はさらに、殺真菌剤として使用するために菌株Ｂ−３００８７と菌株Ｂ
−２１６６１（ＡＱ７１３）の組み合せを提供する。ここでその菌株を共に使用
することは、いずれかを単独で使用する場合よりも高い有効性を提供する。

【００２１】（本発明の実施方法）本発明は、サビ菌、ウドンコ病菌、およびべと病菌のような、特定の植物病原
体に対してのみ抗真菌活性を有する、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．の新規菌株およ
びその変異体または改変体の、全ての識別する特徴を有する菌株の生物学的に純
粋な培養物を提供する。このＢ．ｐｕｍｉｌｕｓの新規菌株は、１９９９年１月
１４日に、ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５ＮｏｒｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙＳｔｒｅｅｔ、ＰｅｏｒｉａＩｌｌ、６１６０４、ＵＳＡに供託され、そ
して特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定のも
とに、受け入れ番号第ＮＲＲＬＢ−３００８７号を与えられた。ＮＲＲＬＢ
−２１６６１号と呼ばれる菌株が、同じ組織に１９９７年３月７日に供託された
。それはその後ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ（ＡＴＣＣ）によってＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓとして同定さ
れた。

【００２２】本発明はまた、そのような細菌菌株、またはそのような細菌菌株から得た抗生
物質を含む上清または純粋な抗生物質を用いて、植物の根を含む植物における真
菌性の病気を予防および治療する方法も含む。本発明はまた、１０，０００ダル
トンより小さい分子量を有し、わずかに熱不安定性、陽性に荷電、そしてＵＶ吸
収によるＨＰＬＣピークが２８０ｎｍで最大、そして２３０ｎｍに肩がある、水
溶性抗真菌性抗生物質も含む。その抗生物質はツヴィッターマイシンＡではない
。

【００２３】本発明のさらなる局面は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合せた場合
にＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ
の培養液全体または上清を含む。本発明はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓの細菌懸濁液
、またはＢａｃｉｌｌｕｓの培養物の代謝物を含む上清、または精製した代謝物
を用いて、植物の上または中への昆虫の侵入を制御するために、植物を治療する
方法を含む。

【００２４】本発明のさらなる局面は、殺真菌剤としてＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ（ＮＲＲＬＢ
−３００８７）とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＲＲＬＢ−２１６６１）の菌株を
組み合せて使用することの、予想外の相乗効果である。本発明はその組成物およ
びそれらを殺真菌剤として用いる方法を含む。

【００２５】（定義）本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」およ
び「ｔｈｅ」は、他に文脈が明らかに指図しなければ、複数の表示を含む。例え
ば、「ａｃｅｌｌ」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。

【００２６】本明細書中で使用される場合、「含む」という用語は、その組成物および方法
は、列挙した成分を含むが、他を除外しないことを意味するように意図される。
「本質的に〜からなる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合
、その組み合せに本質的に重要な他の成分を除外することを意味する。従って、
本質的に本明細書中で定義されたような要素からなる組成物は、単離および精製
方法からの痕跡混入物および、リン酸緩衝化生理食塩水、保存剤等のような薬剤
学的に許容できる担体を除外しない。「〜からなる」は、他の成分および本発明
の組成物を投与する重要な方法工程の痕跡要素以上のものを除外することを意味
する。これら変化（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）用語のそれぞれによって定義された
実施形態は、本発明の範囲内である。

【００２７】「単離された」という用語は、「生物学的に純粋な」と交換可能に使用され、
そしてその菌株または代謝物が通常天然に結合している成分、細胞および他から
分離されたことを意味する。

【００２８】本明細書中で使用される場合、「生物学的制御」は、２番目の生物体を用いる
ことによる、病原体または昆虫の制御として定義される。生物学的制御の公知の
メカニズムは、根の表面の空間に関して真菌をアウトコンピーティング（ｏｕｔ
−ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）することによって根腐れを制御する腸の細菌を含む。抗
生物質のような細菌の毒素が、病原体を制御するために使用されてきた。その毒
素を、単離および植物に直接適用し得、またはインサイチュで毒素を産生するよ
うに細菌種を投与し得る。

【００２９】「真菌（ｆｕｎｇｕｓ）」または「真菌（ｆｕｎｇｉ）」という用語は、クロ
ロフィルを欠く、広範に種々の有核の胞子を有する生物体を含む。真菌の例は、
酵母、カビ、ウドンコ病、錆菌類、およびキノコを含む。

【００３０】「細菌」という用語は、明確な核を有さないあらゆる原核生物を含む。

【００３１】「殺真菌性」は、真菌の死亡率を増加させる、または増殖速度を阻害する物質
の能力を意味する。

【００３２】「抗生物質」は、微生物を殺すまたは阻害することができるあらゆる物質を含
む。抗生物質は、微生物によって、または合成過程によって、もしくは半合成過
程によって産生され得る。従って、その用語は、真菌を阻害するまたは殺す物質
、例えばツヴィッターマイシンＡまたはカノサミンを含む。

【００３３】「抗真菌剤」は、真菌を殺すまたは増殖を阻害できるあらゆる物質を含む。

【００３４】「培養」という用語は、様々な種類の培地上または中での生物体の増殖を指す
。

【００３５】「ブロス培養物全体」とは、細胞および培地を両方含む液体培地をいう。

【００３６】「上清」とは、培養液中で増殖した細胞を遠心、ろ過、沈降、または当該分野
で周知の他の方法によって除去した場合に残る液体培養液をいう。

【００３７】本明細書中で使用される場合、「昆虫」という用語は、「昆虫綱」の全ての生
物体を含む。「前成虫」昆虫とは、例えば卵、幼生、および若虫を含む、成虫期
より前のあらゆる形態の生物体を指す。「殺虫性」とは、昆虫の死亡率を増加さ
せる、または増殖速度を阻害する物質の能力をいう。「抗線虫性」とは、線虫の
死亡率を増加させるか、または増殖速度を阻害する物質の能力をいう。「農薬の
」は、昆虫、線虫、およびダニの死亡率を増加させるまたは増殖速度を阻害する
物質の能力をいう。

【００３８】「ポジティブコントロール」は、農薬活性を有することが知られている化合物
を意味する。「ポジティブコントロール」は、市販で入手可能な化学的農薬を含
むがこれに限らない。「ネガティブコントロール」という用語は、農薬活性を有
さないことが公知の化合物を意味する。ネガティブコントロールの例は、水また
は酢酸エチルである。

【００３９】「溶媒」という用語は、溶液中に別の物質を保持するあらゆる液体を含む。「
溶媒抽出可能」とは、溶媒に溶解し、そして次いで溶媒から単離し得るあらゆる
化合物をいう。溶媒の例は、酢酸エチルのような有機溶媒を含むがこれに限らな
い。

【００４０】「代謝物」という用語は、農薬活性を有する微生物の発酵のあらゆる化合物、
物質または副産物を指す。上記で定義した抗生物質は、微生物に対して特に活性
な代謝物である。

【００４１】「組成物」は、活性薬剤および、不活性（例えば検出可能な薬剤または標識）
、またはアジュバントのように活性な、別の化合物または組成物との組み合せを
意味することを意図する。

【００４２】「画分」は、上清の分子を大きさ、極性、または電荷によって分離するために
使用される分画アッセイからのアリコートを意味することを意図する。

【００４３】「部分的に精製した画分」は、バイオアッセイで発芽を阻害、またはｌｅｐｉ
ｏｌｏｐｌａｕｓに対するＢ＋活性を増強し得る、分画アッセイで回収されたア
リコートの１つである。

【００４４】「有効な量」は、有益なまたは望ましい結果を得るのに十分な量である。有効
な量を、１つ以上の用途において適用し得る。治療および防御に関して、「有効
な量」は、昆虫の外寄生の進行を改善、安定化、逆行、遅延（ｓｌｏｗ）、また
は遅延（ｄｅｌａｙ）させるのに十分な量である。

【００４５】本発明者らは、特定の植物病原体にのみ抗真菌活性を有し、そして抗細菌活性
を有さない、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託されたＢａｃｉｌｌｕ
ｓｓｐ．の新規抗生物質産生菌株、およびその変異体の、全ての同定する性質
を有する菌株の生物学的に純粋な培養を記載する。１つの局面において、その菌
株はＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓｐｕ
ｍｉｌｕｓ、およびその菌株の変異体である。

【００４６】他の局面では、その菌株は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託され
た菌株の全ての同定する性質（下記で提供されるような）を有する、ＮＲＲＬ登
録番号第Ｂ−３００８７号の変異体または改変体である。変異体または改変体は
、本開示中で相互交換可能に使用され、そしてさらに、高いストリンジェンシー
の条件下でＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号のゲノムとハイブリダイズする
ゲノムを有するものとして同定され得る。「ハイブリダイゼーション」とは、１
つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合に
よって安定化される複合体を形成する反応をいう。水素結合は、ワトソン−クリ
ック塩基対形成、フーグスティーン結合、またはあらゆる他の配列特異的な様式
によって起こり得る。その複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖の
複合体を形成する３本以上の鎖、１本の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの
あらゆる組み合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリ
ンジェンシー」の条件下で行い得る。一般的に、低いストリンジェンシーのハイ
ブリダイゼーション反応は、１０×ＳＳＣ中約４０℃で、または同等のイオン強
度／温度の溶液で行われる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーシ
ョンは、代表的には６×ＳＳＣ中約５０℃で、そして高いストリンジェンシーの
ハイブリダイゼーション反応は、一般的に１×ＳＳＣ中約６０℃で行われる。

【００４７】ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の変異体または改変体はまた、ＮＲＲＬ
登録番号第Ｂ−３００８７号のゲノムと、８５％より多い、より好ましくは９０
％より多い、またはより好ましくは９５％より多い配列が同一であるゲノム配列
を有する菌株として定義され得る。ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド
領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列に対して特
定の割合（例えば８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を
有することは、整列した場合、２つの配列を比較してその塩基（またはアミノ酸
）の割合が同一であることを意味する。この整列および相同性の割合または配列
同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばＣＵＲＲＥＮＴ
ＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）補遺３０、第７．７．１８節、表７．７．１で記
載されているものを用いて決定し得る。好ましくは、整列のためにデフォルトパ
ラメーターを使用する。好ましい整列プログラムは、デフォルトパラメーターを
使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパ
ラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード＝標
準；フィルター＝無し；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予期＝１０；マトリック
ス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類＝ＨＩＧＨＳＣＯＲＥ；データ
ベース＝非重複性、Ｇｅｎｂａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａ
ｎｋＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。こ
れらのプログラムの詳細を、以下のインターネットアドレスにおいて見出し得る
：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ
／ＢＬＡＳＴ。

【００４８】本発明はさらに、上記で述べた培養から得た上清を提供する。その上清を、遠
心；ろ過；沈降等を含む、当該分野で周知の方法によって得ることができる。

【００４９】別の局面において、本発明は、水溶性抗真菌性抗生物質である単離された代謝
物を含む。その代謝物は、本発明の菌株から単離され、そして上記で記載される
。それは、特定の植物病原体に対して活性を有するが細菌には活性を有さず、１
０，０００ダルトンより小さい、ＵＶ吸収のピークが２８０ｎｍ、および肩が２
３０ｎｍ、酸および塩基に安定、８０℃より上でわずかに熱不安定性、そして陽
性に荷電した化学的性質を有する。本発明はさらに、この代謝物を産生する過程
、本発明の菌株を培養する工程、および下記で記載する方法を用いて活性代謝物
を単離する工程を包含する方法を提供する。

【００５０】本発明のさらなる局面は、殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３０
０８７号の、部分的に精製された活性画分である。活性画分は、ツヴィッターマ
イシンＡと同一ではない。

【００５１】本発明によってさらに、あらゆる上記の菌株（その変異体または改変体を含む
）、上清、画分および代謝物を、単独または、お互いにおよび担体と組み合せて
含む組成物が提供される。これらの組成物は、さらに少なくとも１つの化学的ま
たは生物学的農薬を加えることによって補充され得る。これらの組成物は、水和
剤、顆粒処方、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物（ｅｍｕｌｓｉｆｉａｂｌｅｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）またはマイクロカプセル化を含むがこれらに限定されな
い、種々の処方の形態を取り得る。

【００５２】本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着を達成するために、培養液全体
、上清、画分および／または代謝物／抗生物質を、分散および接着を助ける成分
とともに処方することが有利であり得る。よって、適当な処方が当業者に公知で
ある（水和剤、顆粒等、または適当な媒体等中にマイクロカプセル化され得る処
方、液体（例えば水性の流動可能物（ｆｌｏｗａｂｌｅｓ）および水性懸濁液）
ならびに乳化可能な濃縮物）。他の適当な処方が、当業者に公知である。

【００５３】上記で述べたあらゆる菌株、代謝物、画分、上清およびこれら活性成分を含む
組成物を、植物、根または果実を真菌感染から処置または保護する方法を提供す
るために使用し得る。その方法は、有効な量の菌株、代謝物、画分、上清または
これら活性成分を含む組成物を、単独で、またはお互いにおよび／または他の生
物学的または化学的農薬と組み合せて、感染した根、植物、または果実に適用す
ることを含む。有効な量のこれら組成物をまた、そのような外寄生を予防するた
めに、植物、根、または果実に適用し得る。

【００５４】さらなる局面において、本発明は、新規菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＲＲ
Ｌ登録番号第Ｂ−３００８７号の同定する性質を全て有する菌株またはその改変
体によって産生された、有効な量の抗生物質を適用することを含む、真菌性の病
気から植物、根、または果実を処置または保護する方法を含む。１つの実施形態
において、その菌株はＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００
８７号である。

【００５５】本発明はさらに、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性
を増強する、水溶性化合物を提供する。ここでその化合物は、１０，０００ダル
トン未満の分子量を有し、そしてその化合物はツヴィッターマイシンＡではない
。その化合物は、ベータ外毒素または他のＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓ産生外毒素ではない。

【００５６】その化合物を、陰イオン交換樹脂、アセトニトリル沈殿、およびサイズ排除ク
ロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって単離する。本発明はまた、その新規化合物
を含むＢａｃｉｌｌｕｓの上清の、部分的に精製された画分を提供する。その新
規化合物および活性画分を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｍ
ｙｃｏｉｄｅｓ、およびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓを含むがこれに限らないＢａｃｉｌ
ｌｕｓｓｐｐ．の群から選択されるＢａｃｉｌｌｕｓから単離し得る。

【００５７】当該分野の化学者（ｃｈｅｍｉｓｔｓｋｉｌｌｅｄｉｎｔｈｅａｒｔ
）が、化合物が完全に精製されたかどうか決定することを可能にする、その¹Ｈ
ＮＭＲ（またはプロトンＮＭＲ）スペクトルによって、部分的に精製された活性
画分を同定し得る。化合物が純粋な場合、１つのプロトンを示すピークが１の任
意の値に統合する。次いで、２つのプロトン、例えばメチレン基を示すピークは
、２の値に統合する。３つのプロトン、例えばメチル基を示すピークは、３に統
合する。これは図３、純粋なツヴィッターマイシンＡスタンダードの場合である
。しかし、活性な部分的に精製されたＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓエンハンサーの¹ＨＮＭＲスペクトルは、１より小さく統合するピーク
の群を有し、そして従ってスペクトル中のより大きなピーク由来の、別の化合物
に属する。

【００５８】単離において、その化合物は殺虫活性を示さない。Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとの組み合せが、植物および植物の根に適用した場合にＢ
ａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫効果を増強する。Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、微生物菌株、市販製品、遺伝子工学
で作られた植物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｐｌａｎｔ）、殺虫的に活性な代謝物
、殺虫的に活性な上清またはデルタエンドトキシンの形態であり得る。

【００５９】Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、パラ胞子（ｐａｒａｓｐ
ｏｒａｌ）結晶性タンパク質を含むことによって特徴付けられる、グラム陽性、
胞子形成細菌である。そのタンパク質は、害虫に対して高度に毒性であり得、そ
してその毒性活性において特異的であり得る。上記の特許請求の範囲で使用され
る場合、「Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ」という用語は、微
生物菌株、そのような菌株またはその菌株から単離された活性代謝物または画分
を含む単離物を含む市販製品、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
の殺虫性タンパク質または遺伝子産物またはデルタエンドトキシンをコードする
遺伝子を発現する、遺伝的に改変された、または遺伝子操作された植物を含む。
毒素遺伝子が単離および配列決定され、そして組換えＤＮＡに基づくＢａｃｉｌ
ｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ産物が産生および使用が認可された。遺伝
子工学技術および、これらのＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエ
ンドトキシンを農業環境に伝達する新しいアプローチが、開発中であり、そして
商業生産されている。これらは、害虫抵抗性のためにエンドトキシン遺伝子を用
いて遺伝子操作された植物の使用、および安定化したインタクトな微生物細胞の
、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシン伝達媒体とし
ての使用を含む（Ｇａｅｒｔｎｅｒら（１９８８）ＴＩＢＴＥＣＨ６：Ｓ４−
Ｓ７）。標的害虫を、天然に毒素を発現する野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒ
ｉｎｇｉｅｎｓｉｓに曝露することによって、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ
ｇｉｅｎｓｉｓを、標的害虫に対して使用可能にし得る。あるいは、望ましい毒
素をコードする遺伝子を、適当な組換え宿主中で形質転換および発現させ得る。
殺虫活性を保持するＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素のフラ
グメントも使用し得る。

【００６０】以下の米国特許は、農薬性のＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
単離物またはＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を発現する組
換え微生物を開示している：米国特許第５，００６，３３５号；同第５，１０６
，６２０号；同第５，０４５，４６９号；同第５，１３５，８６７号；同第４，
９９０，３３２号；同第５，１６４，１８０号；同第５，１２６，１３３号；同
第５，０９３，１１９号；同第５，２０８，０１７号；同第５，１８６，９３４
号；同第５，１８５，１４８号；同第５，２１１，９４６号；同第４，９４８，
７３４号；同第４，８４９，２１７号；同第４，９９６，１５５号；同第４，９
９９，１９２号；同第４，９６６，７６５号；同第５，０７３，６３２号；同第
５，１９６，３４２号；同第５，０６３，０５５号；同第５，０８０，８９７号
；同第５，０２４，８３７号；同第５，１４７，６４０号；同第５，１７３，４
０９号；および同第５，１８６，９３４号。

【００６１】Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｋｕｒｓｔａ
ｋｉの胞子および結晶の調製物が、鱗翅目害虫に対する市販の農薬として、長年
使用されてきた。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｖ
ａｒ．ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ−１は、多くの鱗翅目昆虫の幼生に対して毒性で
ある、デルタエンドトキシンと呼ばれる結晶を産生する。Ｂａｃｉｌｌｕｓｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのさらなる種、すなわちｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓおよ
びｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓが、昆虫を制御するために市販で使用されてきた。

【００６２】ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおけるＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ
ｇｉｅｎｓｉｓ結晶タンパク質遺伝子のクローニングおよび発現は、Ｓｃｈｎｅ
ｐｆ，Ｈ．ら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７
８：２８９３−２８９７において記載された。米国特許第４，４４８，８８５号
、および米国特許第４，４６７，０３６号はいずれも、Ｅ．ｃｏｌｉにおける結
晶タンパク質の発現を開示している。増加した毒性を示し、そして標的害虫に対
する拡大した宿主範囲を示す、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ結晶タンパク質遺伝子が構築された。米国特許第５，１２８，１３
０号、および同第５，０５５，２９４号を参照のこと。米国特許第４，７９７，
２７６号および第４，８５３，３３１号は、様々な環境において鞘翅目害虫を制
御するために使用し得る、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株Ｓ
ａｎＤｉｅｇｏ（Ｂ．ｔ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓとしても知られる、Ｍ−７
としても知られる）を開示している。米国特許第４，９１８，００６号は、双翅
類に対する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを開示
している。米国特許第４，８４９，２１７号は、アルファルファゾウリムシに対
する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物を開示
している。米国特許第５，１５１，３６３号および米国特許第４，９４８，７３
４号は、線虫に対する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓの特定の単離物を開示している。

【００６３】Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ培養物はまた、Ｂｒｏｗｎｓ
ｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘ．のＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）から入手可能である。依頼は、ＵＳ
ＤＡ、ＡＲＳ、ＣｏｔｔｏｎＩｎｓｅｃｔｓＲｅｓｅａｒｃｈＵｎｉｔ、
Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１０３３、Ｂｒｏｗｎｓｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘ．７８５２０ＵＳ
Ａ、またはＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕ．
Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、１８１５Ｎｏｒ
ｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌ．ＵＳＡに
対してなされるべきである。

【００６４】従って、その化合物および活性画分は、線虫、ハエ、ガの幼虫、ダニ、コロラ
ドハムシ、トウモロコシの根を食べる昆虫の幼虫を含むがこれに限らない昆虫に
対するＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する。

【００６５】当業者に周知であるように、その活性成分を、組成物の形態で適用し得る。よ
って、本発明はまた、新規化合物および溶媒または農業的に適当なキャリアのよ
うなキャリアを含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、組成物はさ
らに、上記で記載したような有効な量のＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓを含む。またさらなる実施形態において、組成物は、当該分野で伝統的
に使用されているような、少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む。
本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着を達成するために、培養液全体、
上清および／または代謝物を、分散および接着を助ける成分と共に処方すること
が有利であり得る。植物または植物の根への適用を容易にするために、その処方
は、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物およびマイクロカプセル化処方から
なる群から選択される処方へ処理され得る。

【００６６】新規化合物、活性画分、またはそれらを含む組成物を、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強するために使用し得る。従って、本
発明はまた、有効な増強量の新規化合物、活性画分またはそれらを含む組成物を
、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合わせることによって
、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する方法を
提供する。さらなる局面において、有効な量の少なくとも１つのバイオ農薬また
は化学的農薬をその処方に加える。

【００６７】本発明はさらに、殺真菌剤として使用するために、培養液全体として植物、根
、または果実に適用する、新規化合物ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号をＮ
ＲＲＬ登録番号第Ｂ−２１６６１号と組み合わせて使用することを含み、その殺
真菌剤は化合物の組み合せの予期しない相乗効果の結果として、より強力な効果
を有する。より好ましくは、その組み合せは、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅ
ａまたはＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して１：２（Ｂ−
２１６６１：Ｂ−３００８７）の比で適用される。さらにより好ましくは、その
組み合せはＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ
ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して１：４の比で適用される。またさらなる実施形態
において、組成物は当該分野で伝統的に使用されるような、少なくとも１つの化
学的または生物学的農薬を含む。本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着
を達成するために、培養液全体、上清および／または代謝物を、分散および接着
を助ける成分と共に処方することが有利であり得る。植物または植物の根への適
用を容易にするために、その処方は、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物お
よびマイクロカプセル化処方からなる群から選択される処方へ処理され得る。

【００６８】本開示を通して、種々の出版物、特許および公開された特許明細書が、識別す
る引用によって言及される。これらの出版物、特許および公開された特許明細書
の開示は、これによって本発明が属する技術分野の状態をより充分に説明するた
めに本開示に参考として援用される。

【００６９】（実施例）以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することは意図さ
れない。

【００７０】（実施例１）（菌株ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の特徴づけ）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を、メチルエステルへと誘導体化した全細胞
の細胞性脂肪−ＦＡＭＳに基づいて同定し（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｔ．（１９８２
）「Ｓｉｎｇｌｅｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒ
ｏｕｔｉｎｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｗｈｏｌｅｃ
ｅｌｌｗａｌｌｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｓ，ｉｎ
ｃｌｕｄｉｎｇｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．１６：５８４〜５８６）、そしてＭＩＤＩシステム（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、Ｄ
Ｅ）を使用するガスクロマトグラフィーにより分析した。細菌培養物を増殖する
ために使用される手順およびプロトコル、ならびに装置仕様は、ＭＩＤＩにより
記載されている（細胞性脂肪酸のガスクロマトグラフィーによる細菌の同定。Ｔ
ｅｃｈｎｉｃａｌＮｏｔｅ＃１０１．ＭＩＤＩ，Ｉｎｃ．、１１５Ｂａｒｋ
ｓｄａｌｅＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）
。単離物をＴＳＡ（ＢＢＬ）プレート上で２８℃にて２４時間増殖させ、そして
細胞を収集する。１ｍｌのメタノール性ＮａＯＨ（５０％（容量／容量）メタノ
ール中１５％（重量／容量）ＮａＯＨ）を添加し、そして細胞を１００℃にて３
０分間けん化した。脂肪酸のエステル化を、４６％（容量／容量）メタノール中
３．２５ＮＨＣｌ２ｍｌを８０℃にて１０分間用いて実施した。ＦＡＭＥを
、１：１（容量／容量）メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル−ヘキサン１．２５
ｍｌ中に抽出し、そしてその有機抽出物を、３ｍｌの１．２％（重量／容量）Ｎ
ａＯＨで洗浄し、その後、ガスクロマトグラフィーにより分析した。このガスク
ロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０Ａ）は、水素炎イオ
ン化検出器およびキャピラリーカラム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１９
０９１Ｂ−１０２、架橋型５％フェニルメチルシリコン；２５ｍ×０．２２ｍｍ
内径；フィルム厚０．３３１ｌｍ；相比１５０）を備え、水素をキャリアガス
として用いた。Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ３３９２積分器が自動的にＦ
ＡＭＥピークを積分した。そして細菌単離物を、ＭＩＤＩＭｉｃｒｏｂｉａｌ
ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅ（ＳｈｅｒｌｏｃｋＴＳ
ＢＡＬｉｂｒａｒｙｖｅｒｓｉｏｎ３．８０）を使用して命名した。Ｘａ
ｎｔｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌａＡＴＣＣ１３６３７のＦＡＭＥ
プロフィールを、ＭＩＤＩ決定のための参照チェックとして使用した。

【００７１】別個の３連のＭＩＤＩプロフィールの結果は、類似性指標スコア０．８７５に
て、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７をＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓとし
て同定した。

【００７２】（実施例２）（インビトロ培養における植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８
７の活性（ゾーンアッセイ））ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７が広範囲の植物病原性真菌に対して有効であ
るか否かを決定するために、以下の実験を、以下のこれらの植物病原体を使用し
て実施した：Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒ
ａｓｓｉｃｉｃｏｌａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｃｕｔａｔｕｍ、Ｃ
ｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｃａｒｏｐｈｙｌｕｍ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕ
ｃｔｉｃｏｌａ、Ｖｅｎｔｕｒｉａｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏ
ｎｉａｓｏｌａｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、
Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａｄｅｆｏｒｍａｎ
ｓおよびＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ。

【００７３】寒天拡散（ゾーン）アッセイにおいてＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性
を決定するために、植物病原体胞子（胞子は、ペトリ皿の表面から掻き落とし、
そして約１×１０⁵胞子／ｍｌ（病原体に依存する）に希釈した）を、１０ｃｍ
ペトリ皿中のジャガイモデキストロース寒天の表面上にスプレッディングした。
ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉおよびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌ
ｅｒｏｔｉｏｒｕｍについては、胞子の代わりに菌糸断片をプレート上にスプレ
ッディングした。約７．０ｍｍの環状ウェルを寒天から除去し、そして２５０ｍ
ｌ振盪フラスコ中でダイズ、酵母抽出物培地にて７２時間増殖させたＮＲＲＬ登
録番号Ｂ−３００８７の上清１２５ｌサンプルを、ウェル中に配置した。

【００７４】上清を、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することによって調製した
。代表的な結果は、ウェルの周囲の、増殖していない病原体のゾーンおよび／ま
たは増殖が減少した病原体のゾーンからなり得るか、あるいは全くゾーンが存在
しない状態からなり得る。ゾーンのサイズをミリメートルにて測定し、そしてゾ
ーンが存在するか否かを記録した。結果を、下記の表１に示す。

【００７５】

【表１】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７上清は、ゾーン試験においてほとんどの真菌
性植物病原体に対して活性を示さなかった。

【００７６】（実施例３）（細菌性植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性）標準的寒天拡散アッセイを、実施例２のように設定した。各細菌病原体のロー
ンを、ジャガイモデキストロース寒天の表面上にスプレッディングした。ＮＲＲ
Ｌ登録番号Ｂ−３００８７上清の１２５ｌのサンプルを、上記のように各ウェ
ルに配置した。ゾーンの存在またはゾーンのサイズを、ミリメートルにて測定し
た。

【００７７】

【表２】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、インビトロにて試験した細菌性植物病原
体のいかなる種に対しても活性ではなかった。

【００７８】 (実施例４）（植物試験における植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活
性）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性を、マメサビ菌Ｕｒｏｍｙｃｅｓｐ
ｈａｓｅｏｌｉに対してサヤマメにおいて、そして灰色カビ菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ
ｃｉｎｅｒｅａに対してコショウ植物において、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏ
ｌａｎｉに対してトマト植物において、そしてレタスのべと病菌Ｂｒｅｍｉａ
ｌａｃｔｕｃａｅに対して；べと病菌Ｂｒａｓｓｉｃａに対して、Ｐｅｒｏｎｏ
ｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、トマトの疫病Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈ
ｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓに対して、そしてブドウウドン粉病菌Ｕｎｃｉｎｕ
ｌａｎｅｃａｔｏｒに対して、試験した。

【００７９】（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉ）病原体Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉを、ＰＤＡを含む標準的ペトリ皿
（１０ｃｍ）上で増殖させた。真菌コロニーをプレートから切断し、そして胞子
形成培地（１ｌの滅菌水あたり、２０ｇスクロース、３０ｇ炭酸カルシウム、お
よび２０ｇ寒天）上に配置した。滅菌水を菌糸ブロックを部分的に覆うようにプ
レートに添加し、そしてプレートを２２〜２６℃にて２日間、１４時間の光周期
でインキュベートする。菌糸ブロックをビーカーの滅菌水中に掻き落とすことに
よって収集する。胞子懸濁物を、２×１０⁴胞子／ｍｌに調整する。

【００８０】２インチポットに植えそして平箱に配置した３〜４葉齢のトマト種子（ＵＣ８
２−Ｂ）に、２５０ｍｌ振盪フラスコにおいて７２時間ダイズ粉末、酵母抽出物
培地にて増殖させたＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７のブロス全体を、画家用エ
アブラシ（ａｒｔｉｓｔｓａｉｒｂｒｕｓｈ）を用いて噴霧して溢れ出させ
た（ｒｕｎｏｆｆ）。噴霧後、種子を最低２時間乾燥させた。接種された種子を
２２℃のＰｅｒｃｉｖａｌ露チャンバ（ｄｅｗｃｈａｍｂｅｒ）にて、限定は
しないが最初の４０時間配置した。各平箱中の植物をプラスチックドームで覆い
、そして１４時間の光周期で、Ｐｅｒｃｉｖａｌインキュベーターにて２０〜２
２℃で４８時間維持した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を含まず病原体の胞
子を含む水、ならびにＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を含まず病原体の胞子を
含まない水を、ネガティブコントロールおよびポジティブ病原体コントロールと
して使用した。また、化学殺真菌剤（例えば、Ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ、Ａｂ
ｏｕｎｄ（登録商標））を、１００〜２５０ｐｐｍの率にて比較のために使用し
た。植物を、０〜５のスケールにスコア付けした。ここで、５は、１００％感染
であり、そして０は症状が存在しない。水Ａ．ｓｏｌａｎｉコントロールにおい
て、すべての葉にわたって均一な病変が存在し、そして子葉が剥離し、そして重
篤に感染した（評点５＝完全感染、制御なし）。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８
７で処理した植物は、水コントロールと異ならないように見えた。ＮＲＲＬ登録
番号Ｂ−３００８７による病原体の制御は存在しなかった（これもまた、評点５
）。ネガティブコントロールは感染しなかった。化学処理した植物は、０と１と
の間のスコアを有した。

【００８１】（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）病原体Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａを、ＰＤＡを含む標準的ペトリ皿（
１０ｃｍ）上で増殖させ、そして胞子を、麦芽（０．５ｇ／Ｌ）および酵母抽出
物（０．５ｇ／Ｌ）を補充したジャガイモデキストロースブロス（ＰＤＢ）を使
用して収集し、そして１×１０⁶胞子／ｍｌに調整した。使用した植物は、３〜
５本葉期まで２インチポットにて生長させたコショウ（ＹｏｌｏＷｏｎｄｅｒ
）であった。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７および病原体の適用は、上記と同
じであった。ポットが入った平箱を、限定しないが２０℃一定にてインキュベー
トした。この平箱をプラスチックドームで覆い、そして胞子形成するまで２．５
日間（６０〜６５時間）放置した。

【００８２】化学殺真菌剤（例えば、Ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、Ｒｏｖｒａｌ（登録商標））を
、２０〜１００ｐｐｍの率で比較のために使用した。植物を、０〜５のスケール
にてスコア付けした。ここで、５は、１００％感染であり、そして０は症状が存
在しない。水Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａコントロールにおいて、すべての葉にわたって
均一な病変が存在した（評点５＝完全感染、制御なし）。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−
３００８７で処理した植物は、水コントロールと異ならないように見えた。ＮＲ
ＲＬ登録番号Ｂ−３００８７による病原体の制御は存在しなかった（これもまた
、評点５）。ネガティブコントロールは感染しなかった。化学処理した植物は、
０と１との間のスコアを有した。

【００８３】（Ｂｒｅｍｉａｌａｃｔｕｃａｅ）Ｂｒｅｍｉａ試験について、レタス種子を、約８センチメートルの高さおよび
正方形である小さく透明なプラスチックの植物箱において、ピート、パーライト
およびバーミキュライトを含む滅菌培養土混合物の層に植えた。植付けの１週間
後、レタス種子に、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロスまたは上清サンプル
を噴霧した。この植物を乾燥させ、次いで感染したレタス種子から収集したべと
病菌胞子懸濁物（２×１０⁴胞子／ｍｌ）を種子に噴霧した。Ａｌｉｅｔｔｅ（
ｆｏｓｅｔｙｌ−ａｌ）およびＲｉｄｏｍｉ（ｍｅｔａｌａｘｙｌ）からなる化
学物質スタンダードもまた、適用した。しかし、これらの試験において使用した
Ｂｒｅｍｉａｌａｃｔｕｃａｅの単離物は、商業的に使用されるこれらの２つ
の化学物質スタンダードに非感受性であることが以前に示された。プラスチック
の箱をきつくフィットするフタで覆い、そして制限しないが１６時間Ｐｅｒｃｉ
ｖａｌインキュベーターにて１５〜１６℃にてインキュベートした。次いで、プ
ラスチックの箱を６日間、光の下で室温（２０〜２６℃）に配置した。種子の覆
いを取り、水を噴霧し、再び覆い、そして胞子形成が生じるように１５〜１６℃
にて一晩インキュベーターに戻した。レタスべと病菌の化学物質耐性菌に対する
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の効果を、下記表３に示す。

【００８４】

【表３】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、レタスべと病菌に対する優れた活性を有
し、種子において病原体の胞子形成がほとんどないかまたは全くなかったが、コ
ントロール（水チェック）植物は、べと病菌により完全に胞子形成された。化学
物質スタンダードは、病原体を効果的には制御しなかった。

【００８５】（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を、２５０ｍｌ振盪フ
ラスコにて、上記のように増殖させた。１×強度のブロス培養物全体を、完全子
葉期の１週齢のカリフラワー植物または芽キャベツ植物に、圧縮空気を動力源と
する画家用エアーブラシを用いて噴霧した。１処理あたり３連の１５〜２５種子
／ポットに噴霧した。１〜５×１０⁴胞子／ｍｌのべと病菌Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏ
ｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａの胞子懸濁物を、まずＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００
８７を適用した後に、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物に噴霧した。Ａｌｉｅｔｔｅ（ｆｏ
ｓｅｔｙｌ−ａｌ）およびＲｉｄｏｍｉ（ｍｅｔａｌａｘｙｌ）からなる化学物
質スタンダードもまた、適用した。しかし、これらの試験において使用したＰｅ
ｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａの単離物は、商業的に使用されるこ
れら２つの化学物質スタンダードに非感受性であることが以前に示された。

【００８６】感染のために植物を１５〜１７℃で１６時間保持し、次いで種子を２０〜２４
℃で６日間インキュベートした。病原体の胞子形成が生じるように、ポットを１
５〜１７℃に一晩戻した。各植物を、０〜５のスケールに基づいて疾患制御パー
セントを評価することによって、評価した。評点０は、胞子形成病変を伴わない
植物である。レプリカポットすべてにわたって平均した結果を、以下表４に示す
。

【００８７】

【表４】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、未処理チェックおよび化学物質スタンダ
ードと比較した場合に、より有効にＢｒａｓｓｉｃａべと病菌を制御した。

【００８８】（Ｕｎｃｉｎｕｌａｎｅｃａｔｏｒ）ブドウ種子（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）を、６〜９本葉期まで２インチポットに
て生長させた。ウドン粉病菌の培養物を、１４時間光周期のもとで２２〜２６℃
にてブドウ種子上に維持した。ほとんど最も若い２〜４つの葉を除去する。ＮＲ
ＲＬ登録番号Ｂ−３００８７、化学殺真菌剤（Ｒａｌｌｙ（登録商標）、２５ｐ
ｐｍのミクロブタニル（ｍｉｃｒｏｂｕｔａｎｉｌ））および水チェックを、試
験した他の病原体についての上記の通りに、適用して溢れ出させる。４〜５つの
レプリカを、各処理に使用する。ウドン粉病菌を接種するために、維持種子（ｍ
ａｉｎｔｅｎａｎｃｅｓｅｅｄｉｎｇ）上にカビを有する葉をかみそりで除去
し、そして各植物に個別に接種する。維持種子の表面を絵の具刷毛でおだやかに
ブラッシングして、胞子が試験植物の上側表面上に堆積するようにする。この手
順は、すべての植物が等価な接種物を得るのを確実にするように、ライト付３×
拡大レンズを使用して実施する。ポットが入った平箱を、２０〜２４℃にて１６
〜２４時間暗所に配置する。平箱を、試験を判断するまでさらに９〜１１日間、
１４時間の光周期で２２〜２６℃に維持する。上記のように、植物に、０〜５の
スコアを与える。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を使用する結果を、以下の表
５に示す。

【００８９】

【表５】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、未処理チェックと比較して有効に、そし
て化学物質スタンダードＲａｌｌｙとほとんど同様に、Ｕｎｃｉｎｕｌａウドン
粉病菌を制御した。

【００９０】（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）トマト疫病Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの試験を、２インチ四方のプラスチックポ
ットにて生長させた４〜６本葉期のトマト種子（ＵＣ８２−Ｂ）を使用して実施
した。以前に記載されたように増殖させたＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の適
用を、トマト種子に行った。Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの接種物を、ライムギ種子
寒天上に増殖した胞子形成コロニーを掻き落とし、そして０．７×１０⁴〜１．
０×１０⁴胞子嚢／ｍｌの間に接種濃度を調整することによって、生成した。Ａ
．ｓｏｌａｎｉ試験について上記した通りに正確に、接種した種子を平箱中に配
置し、そしてインキュベートした。種子を、０〜５スケールにて評価した。Ｑｕ
ａｄｒｉｓ（登録商標）（アゾキシストロビン（ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ））
を、６２．５〜１２５ｐｐｍの率にて、比較のために使用した。ＮＲＲＬ登録番
号Ｂ−３００８７を使用する結果を、以下の表６に示す。

【００９１】

【表６】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、接種の４日後に、化学物質スタンダード
Ｑｕａｄｒｉｓとほぼ同様に、疫病を制御した。

【００９２】（Ｕｒｏｍｙｃｅｓｐｈａｓｅｏｌｉ）マメサビ菌Ｕ．ｐｈａｓｅｏｌｉの試験を、第一葉が３／４拡大するまで、サ
ヤマメ種子（供給者の変種）を使用して実行した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００
８７の適用を、他の宿主／病原体の組み合わせについて以前に記載した通りに実
行した。サビ病病原体の接種物を、−２０℃のバイアル中に乾燥サビ菌胞子とし
て貯蔵した。接種物を、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む水に乾燥サビ菌胞
子を添加することにより調製し、そして少なくとも１時間磁気攪拌器上で激しく
攪拌した。接種物を、２×１０⁵〜４×１０⁵胞子／ｍｌに調整する。第一葉に接
種し、そして種子を平箱中に配置し、そしてＰｅｒｃｉｖａｌ露チャンバにて２
０℃にて一晩インキュベートする。次いで種子を、室温（２０〜２６℃）でさら
に８〜１０日間インキュベートする。種子を、存在する胞子形成サビ菌いぼの発
生率および重篤度に基づいて、０〜５のスケールにて評価する。

【００９３】化学殺真菌剤Ｂｒｅａｋ（登録商標）（プロピコナゾール）を、４０ｐｐｍの
率で比較のために使用した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体を使用
する結果を、以下表７に示す。

【００９４】

【表７】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、マメサビ菌を、化学物質スタンダードＢ
ｒｅａｋ（登録商標）とほぼ同様に制御した。

【００９５】（実施例５）（ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７により生成される抗真菌代謝産物）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７のブロス全体を、酢酸エチル画分、ブタノー
ル画分、および水性画分に分割した。各画分を、胞子発芽アッセイにおいてキン
ギョソウサビ菌に対して試験した。キンギョソウサビ菌胞子を、４０ｌのサン
プルおよび２０ｌの病原体胞子を含む、凹部付き（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）顕
微鏡スライドにて各サンプルの存在下で発芽させた。約１６時間後、胞子を顕微
鏡下で観察して、胞子が発芽したかを観察する。水コントロール（１００％発芽
および増殖＝スコア５）と比較しての発芽なし（スコア０）は、試験するサンプ
ルの活性を示す。異なるＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７画分を用いたサビ菌発
芽アッセイの結果を、以下表８に示す（上記のような０〜５の評点に基づくスコ
ア）。

【００９６】

【表８】代謝産物は、明らかに水可溶性画分中にあり、そしてブタノールまたは酢酸エ
チル中に容易には抽出可能ではない。

【００９７】この代謝産物の他の特徴を決定した。この分子は、１０，０００分子量カット
オフフィルターを通ることが示された。このことは、この代謝産物が１０，００
０ダルトン未満であることを示す。この活性は、プロテアーゼでの処理後に失わ
れず、酸で処理した場合でも塩基で処理した場合でも失われなかった。この活性
は、８０℃まで１時間加熱した際にわずかに失われた（キンギョソウサビ菌に対
するスコアは、０から１．５に増加した）。この活性は、カチオン樹脂にて吸収
されたが、アニオン樹脂には吸収されなかった（この代謝産物は、正に荷電して
いる）。

【００９８】（実施例６）（ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の殺真菌画分の部分精製）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７由来のブロス培養物全体（８５０ｍｌ）を、
４２００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして上清を収集した。活性炭（３０ｇ
）をこの上清に添加し、そしてこれを十分に振盪した後、１１，５００ｒｐｍで
２０分間遠心分離した。上清をロータリーエバポレーターにて乾燥し、次いで１
５ｍｌの水に再溶解した。次いで、サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー
（ＳＥＣ）によってさらに精製して、分子量によって成分を分離した。

【００９９】Ｐ−２樹脂（１３０ｇ、ＢｉｏＲａｄ）を、ミリＱ脱イオン水で膨張させて、
カラム２．５ｃｍ×８０ｃｍに充填した。１５ｍｌの濃縮物をこのＰ−２カラム
上にローディングし、このカラムを重力によって水を用いて溶出し、そして１０
ｍｌ画分を収集した。Ｐ−２カラムについてのパラメーター：範囲＝２、ｎｍ＝
２２６ｎｍ、１６ｍｖ。

【０１００】溶出した画分を、実施例５に記載したキンギョソウサビ菌発芽アッセイを使用
してアッセイした。画分１８〜２４が、発芽を完全に阻害することを見出した。
これらの画分を混合し、そしてロータリーエバポレーターにて乾燥し、次いで、
８ｍｌの水に再溶解し、そして０．２ｍｌフィルターに通して濾過した。これを
、第２のＰ−２カラムにローディングし、そして上記のように流したが、ただし
、７ｍｌ画分を収集した。

【０１０１】画分２９〜３８が、バイオアッセイにおいて発芽を阻害することを見出した。
これらの画分を乾燥し、次いで水に再溶解した。小アリコート（５ｍｇ）を、ア
ミノカラム（４．６ｍｍ×１５ｃｍ、５ｍ、１００Å）を使用するＨＰＬＣによ
りさらに分離した。このカラムを、０．０１ＭＫＨ₂ＰＯ₄中で平衡化し、そし
て４％〜４４％アセトニトリル／０．０１ＭＫＨ₂ＰＯ₄勾配を、２００ｎｍの
ＵＶにより検出して、１ｍｌ／分で３０分間流した。

【０１０２】３つのピークを収集し、そしてピーク１を、サイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｔｏ
ｓｏＨａａｓ、Ｇ１０００ＰＷ、７．５ｍｍ×３０ｃｍ、１０ｍ）上にて脱
塩し、２００ｎｍのＵＶにより検出して、１ｍｌ／分の水で溶出した。１つのピ
ークを、サイズ排除カラムから収集し、そして発芽アッセイにおいて活性である
ことを見出した。この半純粋の（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｅ）活性物質の¹Ｈ−ＮＭＲ
スペクトルを、図１に示すようにＤ₂Ｏにおいて４００ＭＨｚにて記録した。

【０１０３】（実施例７）（殺真菌成分の化学的特徴は、ツウィッターマイシン（ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃ
ｉｎ）Ａと異なる）本発明の殺真菌活性画分は、キャピラリー電気泳動において、ツウィッターマ
イシンＡと異なることが示された。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体
を、ダイズ粉末、デキストロース、酵母抽出物、ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｋ₂ＨＰＯ₄、Ｎａ
ＣｌおよびＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏを含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓ培養培地において増殖
させた。画線培養物を使用して、２５０ｍｌ振盪フラスコに接種した。フラスコ
を、２１０ｒｐｍにて３０℃で４日間振盪した。

【０１０４】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体に、精製ツウィッターマイシンＡ
を加え、そしてキャピラリー電気泳動（Ｅ）において泳動した。３０μｌのＮＲ
ＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体に、１０μｌのツヴィッターマイシンＡ
を加えた。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−
３００８７ブロス全体＋ツウィッターマイシンＡ、およびツヴィッターマイシン
Ａ単独のうちの１つのサンプル各々を、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）
を使用してＣＥ上で泳動した。各サンプルについて生じた電気泳動図を図３に示
す。

【０１０５】次いで、部分精製画分を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して、ツヴィ
ッターマイシンＡと比較した。図４は、Ｂ−３００８７の部分精製殺真菌成分の
電気泳動図、２５μｌのツヴィッターマイシンＡを加えたＢ−３００８７の部分
精製殺真菌成分の電気泳動図、およびツヴィッターマイシンＡ単独の電気泳動図
を示す。

【０１０６】図２に示されるツヴィッターマイシンＡの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび図１
に示されるＢ−３００８７の部分精製殺真菌代謝産物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル
を、４００ＭＨｚにてＤ₂Ｏにおいて記録した。図１および図２に示されるよう
なこれらのスペクトルは、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７からの殺真菌代謝産
物は、ツウィッターマイシンＡと異なることを示す。

【０１０７】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７からの殺真菌代謝産物はまた、¹Ｈ−ＮＭＲ
により−体外毒素と区別され得る。−体外毒素の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒ
ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．Ａ．ＨｉｃｋｌｅおよびＷ．Ｌ．Ｆｉｔｃｈ編、ＡＣ
ＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ４３２、１３１頁（１９９０）に示さ
れるように、５ｐｐｍを超える７つの共鳴を有する。対照的に、図１は、ＮＲＲ
Ｌ登録番号Ｂ−３００８７サンプルについて、５ｐｐｍを超える陽子共鳴は出現
しないことを示す。

【０１０８】（実施例８）（エンハンサーの精製）エンハンサーを、以下のようにＢ−３００８７ブロス全体から半精製した。こ
れは、アニオン交換樹脂、アセトニトリル沈殿およびサイズ排除クロマトグラフ
ィーでの４３５ｍＬブロス全体の処理によって、半精製した。このブロス全体を
遠心分離して細胞を除去し、そして１４．５ｇアニオン樹脂（ＡＧ１−Ｘ８、１
００〜２００メッシュ、アセテート形態）を上清に添加し、そして混合物を１分
間振盪した。これを５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、そして上清をデカ
ントし、そして次の工程にて使用した。アセトニトリルを上清に添加して、５０
％溶液を得、そしてこれを１分間振盪し、そして５０００ｒｐｍで２０分間遠心
分離した。下部の暗褐色層が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
エンハンサーを含んだ。

【０１０９】上記からのこの褐色の層を、さらにサイズ排除クロマトグラフィーによって二
工程で精製した。最初に、１３０ｇのＰ−２樹脂（ＢｉｏＲａｄ）をカラム２．
５ｃｍ×８０ｃｍを充填するためにミリＱ脱イオン水で膨潤させた。褐色の層を
、約４×、回転エバポレーターを使用して濃縮し、１５ｍｌの濃縮物をＰ２カラ
ムに置いた。このカラムを、重力下でＭＱ水を用いて溶出し、そして１０分の画
分を１２時間集めた（２８０ｎｍでのＵＶ検出、吸収範囲２．０、１０ｍＶ）。
画分２６〜２８のさらなる精製を、回転エバポレーターを使用して画分を３×ま
で濃縮し、そしてこれらをもとのＰ２カラムに適用することによって行った。カ
ラムをＭＱ水を用いて溶出した。１０分の画分を最初の８０分間集め、次いで、
２分の画分を次の２時間集めた。Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓエンハンサー活性は、画分１６〜２０で溶出した（２２０ｎｍでのＵＶ検出、
吸収範囲２．０、１０ｍＶ）。

【０１１０】（実施例９）エンハンサーの化学的特徴は、ツヴィッターマイシンＡとは異なる。

【０１１１】本発明のエンハンサーは、キャピラリー電気泳動においてツヴィッターマイシ
ンＡとは異なることが示された。Ｂ−３００８７のブロス全体は、ダイズ粉、ブ
ドウ糖、酵母抽出物、ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ＮａＣｌおよびＭｇＳＯ₄×７
Ｈ₂Ｏを含むＢａｃｉｌｌｕｓ培養培地で増殖された。画線培養を使用して２５
０ｍｌ振盪フラスコに播種した。フラスコを２１０ｒｐｍ、３０℃、４日間振盪
した。ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＢ−３００８７ブロス
全体を、精製したツヴィッターマイシンＡを加え、キャピラリー電気泳動（ＣＥ
）を行った。３０μＬのＢ−３００８７ブロス全体を、１０μＬツヴィッターマ
イシンＡを加えた。Ｂ−３００８７ブロス全体（図３Ａ）、Ｂ−３００８７ブロ
ス全体およびツヴィッターマイシンＡ（図３Ｂ）ならびにツヴィッターマイシン
Ａのみ（図３Ｃ）を、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液を使用してＣＥで電
気泳動を行った。ＣＥの通電クロマトグラムが図４に示される。

【０１１２】ツヴィッターマイシンＡおよびＢ−３００８７半精製エンハンサーの¹Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトルを、Ｄ₂Ｏ中、４００ＭＨｚで記録した。スペクトルは、エンハ
ンサーがツヴィッターマイシンＡとは異なることを示す。

【０１１３】（実施例１０）Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを用いる殺虫性増強の決定Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ増強を、シロイチモンジヨトウ（ｂｅｅｔ
ａｒｍｙｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ）相乗アッセイに
おける試験によって、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の
ブロス全体を使用して示した。アッセイを９６ウェルマイクロプレートで行った
。各ウェルは固体寒天基質を含んだ。２０μＬのＢ−３００８７ブロス全体を、
バイオアッセイにおいて、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｊａｖｅｌｉｎ（
０．２５〜１．５０μｇ／ウェル）の市販の調製物を用いて試験した。Ｊａｖｅ
ｌｉｎ濃縮物のみの一連の希釈物を、同様に行った。

【０１１４】殺虫活性をアッセイするために、寒天基質を、Ｍａｒｒｏｎｅら、（１９８５
）、Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．７８：２９０−２９３に従ってマイクロプ
レートのウェルに対して調製した。脱イオン水を、ネガティブコントロールとし
て使用した。試験サンプルまたはコントロールの２つの複製を各アッセイのため
に使用した。次いで、プレートを換気フード内におき、約２〜３時間乾燥させた
。

【０１１５】１〜３匹のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａの第１齢（ｆｉｒｓｔｉｎ
ｓｔａｒ）幼虫を各ウェルに加えた。マイクロプレートをＭｙｌａｒ（登録商標
）のような気密な物質を用いて密封し、そして各ウェルをピン圧力によって通気
した。プレートを２７℃で７日間までインキュベートした。

【０１１６】インキュベーション後、ウェルを、新生児死亡率または幼虫の発達の程度に注
意することによってスコア付した。死亡した幼虫の数を記録した。発育阻止され
た幼虫を１〜４の評点でスコア付した。発育阻止スコアは、以下である：４＝コ
ントロールサイズ；３＝コントロールサイズの７５％；２＝コントロールサイズ
の５０％；１＝コントロールサイズの２５％。結果を以下の表９に要約する。

【０１１７】

【表９】第２の試験を、上記手順を使用して行った。結果を以下の表１０に要約する。

【０１１８】

【表１０】半精製画分の殺虫増強性質を決定するために、サンプルを上記にように、０．
１μｇ／ウェルＪａｖｅｌｉｎを使用して試験し、そして４０μｌ／ウェルの画
分を試験した。結果を以下の表１１に示す。

【０１１９】

【表１１】（実施例１１）Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ（Ｂ−３００８７）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ−２
１６６１）を殺真菌剤として一緒に使用した。

【０１２０】Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、ＮＲＲＬＢ−３００８７の菌株を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ、ＮＲＲＬＢ−２１６６１を用いて試験し、一緒に使用した場合、それぞ
れの菌株が単独で使用された場合よりも殺真菌効果が大きいか否かを決定した。
各菌株を、１０リットルまたは５，０００リットルの発酵槽において、ダイズ粉
ベースの培地中で約５０時間増殖させた。各菌株を、コショウ上のＢｏｔｒｙｔ
ｉｓｃｉｎｅｒｅａ灰色カビ菌、およびＢｒａｓｓｉｃａ上のＰｅｒｏｎｏｓ
ｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａべと病菌に対するブロス培養物全体として試験
した。ブロス全体を、１×、１／２×および１／８×で試験した。次いで、２つ
の菌株を、１／２×、１／４×、および１／８×にて互いに種々の組み合わせで
試験した。水チェック（コントロール）および化学殺真菌剤（２０ｐｐｍのＢＲ
ＥＡＫ（登録商標））もまた比較のために試験した。植物を０〜５のスケールに
基づいてスコア付した（ここで、５＝１００％疾患、制御なし；および０＝１０
０％制御、疾患なし）。この結果は以下の表１２に示される。

【０１２１】

【表１２】Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ試験結果は、菌株が単独で使用される場合
と比較した、その菌株が組み合わせて使用される場合の統計的な差を示す。例え
ば、Ｂ−２１６６１１／４×およびＢ−３００８７１／２×についてのスコ
ア０．７は、単独で使用されたＢ−２１６６１１／４×についてのスコア１．
２とは統計的に異なる。また、Ｂ−２１６６１１／８×およびＢ−３００８７
１／２×のスコアは、Ｂ−２１６６１１／８×のみについてのスコア１．７
またはＢ−３００８７１／２×のみについてのスコア２．３とは統計的に異な
る。一緒のスコアは、単独で使用される各菌株についての予期される平均よりも
低い。これは、殺菌剤としての効力の増加について一緒に菌株を使用することの
相乗効果を示す。

【０１２２】Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ試験結果は、Ｂ−２１６６１１／８×およびＢ−３００８７１／２×の組み合わせについてのスコアが、
添加効果から予期されるよりもはるかに良いことを示す。スコア２．０５は、菌
株の組合せからの添加効果のみが存在する場合、予期される。しかし、実際のス
コアは、０．３であり、これは、組み合わせて菌株を使用することによる明確な
相乗効果が存在することを示す。他のスコアもまた、予期される結果よりも良い
ことを示し、例えば、Ｂ−２１６６１１／４×およびＢ−３００８７１／４
×が、スコア０．５を有し、これは、個々の菌菌株の添加効果のみから予想され
る（２．３５の推定されるスコア）よりもずっと良い。この同じ相乗作用はまた
、Ｂ−２１６６１１／２×およびＢ−３００８７１／２×（スコア０．３）
、Ｂ−２１６６１１／２×およびＢ−３００８７１／４×（スコア０．３）
、ならびにＢ−２１６６１１／２×およびＢ−３００８７１／８×（スコア
０．５）の組み合わせにおいて示される。これらの試験は、菌株を組み合わせて
使用する場合、相乗効果が存在し、そして予期されない効果が存在することを示
す。

【０１２３】本発明が上記実施形態とともに記載されているが、先の記載および実施例は、
例示を意図し、本発明の範囲を限定しないことが理解される。本発明の範囲内の
他の局面、利点および改変は、本発明が関係する当業者に明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託された、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｐ．の部分的に精製した殺真菌性画分の、Ｄ₂Ｏ中４００ＭＨｚで記録し
たＮＭＲスペクトルである。

【図２】図２は、Ｄ₂Ｏ中４００ＭＨｚで記録した、ツヴィッターマイシンＡの¹ＨＮ
ＭＲスペクトルを示す。

【図３】図３Ａ〜３Ｃは、実施例９で記載されたようにＢａｃｉｌｌｕｓから単離され
た上清のキャピラリー電気泳動図である。電気泳動の条件は：コートされていな
い５６ｃｍのキャピラリーを４０Ｃ、３０ｋＶ、陽性の極性、ｐＨ５．８のリン
酸ナトリウム緩衝液で１００μＡ、２００ｎｍでのＵＶ検出で使用した。図３Ａ
は、ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＢ−３００８７の培養液全体のキャピ
ラリー電気泳動図である。図３Ｂは、ツヴィッターマイシンＡスタンダードを加
えたＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＢ−３００８７の培養液全体のキャピ
ラリー電気泳動図である。ツヴィッターマイシンＡのピークは３．２５分の実行
時間付近に現れ、培養液全体のいずれのピークとも共に溶出しない。図３Ｃは、
約３．２８分の実行時間におけるツヴィッターマイシンＡスタンダードを示す。

【図４】図４は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号単独の部分的に精製した画分（
図４Ａ）、ツヴィッターマイシンＡを含むＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号
の部分的に精製した画分（図４Ｂ）、およびツヴィッターマイシンＡ単独（図４
Ｃ）のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析からの、３つの電気泳動図を比較する
。

【図５】図５は、Ｄ₂Ｏ中４００ＭＨｚで記録した、Ｂ−３００８７から単離したＢ＋
エンハンサーとしての活性を有する、部分的に精製した活性画分の¹ＨＮＭＲ
スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者メッセンジャー，ベリンダジェーンアメリカ合衆国カリフォルニア 95616，デイビス， 10ティーエイチストリート 519 (72)発明者マンカー，デニスキャロルアメリカ合衆国カリフォルニア 95616，デイビス，パラドレーン 3037 (72)発明者オルジャラ，ジミーエンジオアメリカ合衆国カリフォルニア 95616，デイビス，リラードドライブ 2905 (72)発明者リントハルド，ドルテアメリカ合衆国カリフォルニア 95616，デイビス，カウェルブールバード 405，アパートメント 307 (72)発明者マローン，パメラゲイルアメリカ合衆国カリフォルニア 95616，デイビス，ビクトリアプレイス 3333 (72)発明者ヒメネズ，デスモンドリトアメリカ合衆国カリフォルニア 95695，ウッドランド，ペンデガストストリート９Ｆターム(参考） 4B064 AH19 BH04 CA02 CE03 CE07 CE10 CE11 DA02 DA12 4B065 AA15X AC14 AC15 BC01 BD14 BD15 CA43 CA44 CA47 4H011 AA01 AC01 BA01 BB21 BC18 DA02 DA06 DA15 DA16 DD03 DF04 4H055 AA01 AA02 AA03 AB03 AB20 AC62 AD32 CA11 DA75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ番号Ｂ−３００８７と命名さ
れたＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定
す特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】ＮＲＲＬ番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ菌株の生物学的に純粋な培養物。
【請求項３】請求項１に記載の生物学的に純粋な培養物と担体とを含む組
成物。
【請求項４】組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、および乳化可能な濃
縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、請求項１に
記載の組成物。
【請求項５】殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命
名されたＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての
同定する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物から分離される、単離され
た代謝物。
【請求項６】殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命
名されたＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての
同定する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物から分離される上清。
【請求項７】請求項６に記載の上清から分離される、部分的に精製された
画分。
【請求項８】請求項５に記載の代謝物と担体とを含む、組成物。
【請求項９】請求項６に記載の上清と担体とを含む、組成物。
【請求項１０】請求項７に記載の部分的に精製された画分と担体とを含む
、組成物。
【請求項１１】組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物
、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、請求項８に記載
の組成物。
【請求項１２】組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物
、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、請求項９に記載
の組成物。
【請求項１３】組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物
、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、請求項１０に記
載の組成物。
【請求項１４】請求項１に記載の代謝物の有効量を施用する工程を包含す
る、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項１５】請求項６に記載の上清の有効量を施用する工程を包含する
、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項１６】請求項７に記載の部分的に精製された画分の有効量を施用
する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するた
めの方法。
【請求項１７】請求項８に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含す
る、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項１８】請求項９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含す
る、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項１９】請求項１０に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項２０】請求項１１に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項２１】請求項１２に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項２２】請求項１３に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項２３】前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅ
ｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎ
ｆｅｓｔａｎｓ；ＵｎｃｉｎｕｌａｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ
ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引
き起こされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅ
ｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎ
ｆｅｓｔａｎｓ；ＵｎｃｉｎｕｌａｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ
ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引
き起こされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅ
ｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎ
ｆｅｓｔａｎｓ；ＵｎｃｉｎｕｌａｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ
ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引
き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅ
ｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎ
ｆｅｓｔａｎｓ；ＵｎｃｉｎｕｌａｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ
ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引
き起こされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅ
ｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎ
ｆｅｓｔａｎｓ；ＵｎｃｉｎｕｌａｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ
ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引
き起こされる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２８】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、請求
項１に記載の組成物。
【請求項２９】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、請求
項７に記載の組成物
【請求項３０】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、請求
項８に記載の組成物
【請求項３１】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施
用する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施
用する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施
用する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の生物学的に純粋な培養
を増殖させる工程、および上清から抗真菌性代謝物を単離する工程を包含する、
抗真菌上清の生成のためのプロセス。
【請求項３５】請求項３４に記載の上清の部分的精製のためのプロセスで
あって、該プロセスが該上清を分画する工程、および該画分に対してバイオアッ
セイを行って抗真菌画分を同定する工程を包含する、プロセス。
【請求項３６】請求項３４に記載のプロセスによって生成された上清。
【請求項３７】前記画分が、植物病原性真菌に対する活性を示し、水性画
分中に見いだされ、わずかに熱に対して不安定であり、酸／塩基およびプロテア
ーゼに対して安定であり、正に荷電し、そして１０，０００ダルトン未満の分子
量を有する、請求項７に記載の部分的に精製された画分。
【請求項３８】前記代謝物が、植物病原性真菌に対する活性を示し、水性
画分中に見いだされ、わずかに熱に対して不安定であり、酸／塩基およびプロテ
アーゼに対して安定であり、正に荷電し、そして１０，０００ダルトン未満の分
子量を有する、請求項５に記載の単離された代謝物。
【請求項３９】水溶性化合物であって、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ
ｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強し、そして該化合物の分子量が１０，０００ダ
ルトン未満であり、かつ該化合物がツヴィッターマイシンＡではない、化合物。
【請求項４０】さらにＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを
含む、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】請求項３９に記載の化合物と担体とを含む、組成物。
【請求項４２】請求項４０に記載の組成物と担体とを含む、組成物。
【請求項４３】Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが、微生
物菌株、市販製品、遺伝子工学で作られた植物またはデルタエンドトキシンの形
態である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む
、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およ
びマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、請求項４
４に記載の組成物。
【請求項４６】Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活
性を増強し、かつツヴィッターマイシンＡまたはβ−外毒素ではないＢａｃｉｌ
ｌｕｓの、ブロス培養物全体の部分的に精製された画分。
【請求項４７】ＢａｃｉｌｌｕｓがＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓで
ある、請求項４６に記載の部分的に精製された画分。
【請求項４８】Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓが、ＮＲＲＬ登録番号
ＮＲＲＬＢ−３００８７の下に寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ
である、請求項４７に記載の部分的に精製された画分。
【請求項４９】請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の画分と担体とを
含む、組成物。
【請求項５０】さらにＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを
含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の画分。
【請求項５１】Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが、微生
物菌株、市販製品、遺伝子工学で作られた植物またはデルタエンドトキシンの形
態である、請求項５０に記載の画分。
【請求項５２】請求項４９に記載の組成物およびＢａｃｉｌｌｕｓｔｈ
ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとを含む、組成物。
【請求項５３】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む
、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の画分。
【請求項５４】組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およ
びマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、請求項４
９に記載の組成物。
【請求項５５】組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およ
びマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、請求項５
２に記載の組成物。
【請求項５６】組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およ
びマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、請求項５
３に記載の組成物。
【請求項５７】Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活
性を増強するための方法であって、請求項３９に記載の化合物の有効量を植物ま
たは根に、そしてＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの有効量を該
植物または根に施用する工程を包含する、方法。
【請求項５８】Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活
性を増強する方法であって、請求項４６に記載の化合物の有効量を植物または根
に、そしてＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの有効量を該植物ま
たは根に施用する工程を包含する、方法。
【請求項５９】植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための
方法であって、請求項４０に記載の化合物の有効量を植物または根に施用する工
程を包含する、方法。
【請求項６０】植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための
方法であって、請求項４４に記載の組成物の有効量を植物または根に施用する工
程を包含する、方法。
【請求項６１】植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための
方法であって、請求項５０に記載の画分の有効量を植物または根に施用する工程
を包含する、方法。
【請求項６２】植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための
方法であって、請求項５２に記載の組成物の有効量を植物または根に施用する工
程を包含する、方法。
【請求項６３】植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための
方法であって、請求項５３に記載の画分の有効量を植物または根に施用する工程
を包含する、方法。
【請求項６４】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む
、請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む
、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項６６】ａ）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃ
ｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を
有する菌株のブロス培養物全体；およびｂ）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株のブロ
ス培養物全体、を含む組成物であって、該菌株は相乗的な殺真菌活性を有する、組成物。
【請求項６７】前記殺真菌活性が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａお
よびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａに対する、請求項６６に記
載の組成物。
【請求項６８】前記菌株が、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−
３００８７について１：２の比率で組み合わされる、請求項６６に記載の組成物
。
【請求項６９】前記菌株が、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−
３００８７について１：４の比率で組み合わされる、請求項６６に記載の組成物
。
【請求項７０】前記菌株が、ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａまたはＰ
ｅｒｅｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−
２１６６１およびＢ−３００８７について１：２の比率で組み合わされる、請求
項６６に記載の組成物。
【請求項７１】前記菌株が、ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａまたはＰ
ｅｒｅｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−
２１６６１およびＢ−３００８７について１：４の比率で組み合わされる、請求
項６６に記載の組成物。
【請求項７２】請求項６６に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項７３】請求項６７に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項７４】請求項６８に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項７５】請求項６９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項７６】請求項７０に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項７７】請求項７１に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【請求項７８】請求項６６に記載の培養物から分離される、上清。
【請求項７９】請求項７８に記載の上清と担体とを含む、組成物。
【請求項８０】組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物
、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、請求項７９に記
載の組成物。
【請求項８１】少なくとも１つの生物学的または化学的殺虫剤をさらに含
む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項８２】少なくとも１つの生物学的または化学的殺虫剤をさらに含
む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８３】組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物
、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、請求項８１に記
載の組成物。
【請求項８４】組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物
、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、請求項８２に記
載の組成物。
【請求項８５】請求項６９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含
する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。