KR20010075707A - 식물 페스트를 억제하는 조성물 및 방법 - Google Patents

식물 페스트를 억제하는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살충, 항진균 및 항세균 활성을 나타내는 신규한 항생물질-생산 및 대사물질-생산Bacillus subtilis균주에 관한 것이다. 이 신규한 균주의 상청액은 효과적인 살충, 항진균 및 항세균제를 포함한다. 상청액에서 생산된 용매 추출가능한 저분자량(＜10,000 달톤) 옥수수 뿌리벌레-활성이 있는 대사물질이 본 발명에 또한 포함된다. 본 발명에 역시 포함되는 것은 항생물질/대사물질-생산 신규Bacillus subtilis균주, 신규한Bacillus subtilis균주에 의해 생산된 항생물질/대사물질 또는 이의 조합의 유효량을 식물에 적용하는 단계를 포함하고, 선택적으로 제 2 의 항생물질-생산 세균 균주 및/또는 화학 살충제를 적용하는 단계를 더 포함하는 식물을 진균 및 세균 감염 및 옥수수 뿌리벌레 감염으로부터 보호 또는 처리하는 방법이다. 본 발명은 또한 신규한Bacillus subtilis균주 단독의 전 육즙 배양물 또는 배양물로부터 얻어진 상청액을 단독으로 또는 화학 살충제 및/또는 다른 생물학적 억제제와 조합하여 진균 및 세균 감염을 예방 또는 처리하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 아그라스타틴으로 명명된 신규한 항진균 및 항살균 화합물 및 A-이투린, 플리파스타틴, 표면활성물질 및 아그라스타틴을 포함하는 신규한 조합을 포함한다. 신규한 아그라스타틴 및 A-형태 이투린, 플리파스타틴 표면활성물질 및 아그라스타틴을 포함하는 신규한 조합을 투여하는 단계를 포함하는 식물을 진균 및 세균 감염 및 옥수수 뿌리벌레 감염으로부터 처리 또는 보호하는 방법이 제공된다. 더욱이, 살충 활성을 가진 균주 AQ713 으로부터 분리된 리포펩티드 추출물 및 살충 활성을 가진 균주 AQ713 으로부터 분리된 표면활성물질 리포펩티드가 제공된다.

Description

식물 페스트를 억제하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR CONTROLLING PLANT PESTS}
수년동안, 식물 질병 억제에 유용한 생물학적 활성을 나타내는 다양한 미생물이 밝혀졌다. 진보는 농경 및 원예에 중요한 다양한 식물 질병을 억제하기 위한 생물학적 살충체의 동정 및 개발 분야에서 이루어졌지만, 사용중인 대부분의 살충제는 합성 화합물이다. 야생생물 및 다른 비-표적 종에 독성이 있는 많은 이러한 화학적 살진균제는 EPA 에 의해 발암성 물질로 분류된다. 게다가, 병원균은 화학적 살충제에 대한 내성을 개발시킬 수 있다. (예를 들어, Schwinn et al., p. 244, ADVANCES IN PLANT PATHOLOGY:PHYTOPHTHORA INFESTANSTHE CAUSE OF LATE BLIGHT OF POTATO (Academic Press, San Diego 1991참조.)
매년, 2 억 5 천만-3 억 달러 가치의 화학적 살충제가 옥수수 뿌리벌레 (rootworm) 감염에 사용된다. 많은 이러한 화학적 살충제는 인간, 야생생물 및 다른 비표적 종에 독성이 있다. 또한 어떤 것은 지하수에서 발견되었다. 신규한 화학적 살충제 개발을 위해서는 1억 달러의 비용이 든다.
생물학적 억제는 합성 화학 살진균제에 매력적인 대안을 제공한다. 생물학적살충제(살아있는 유기물 및 이러한 유기물에 의해 생산된 천연적으로 생산된 화합물)는 더욱 안전하고 , 더욱 생물학적 분해가능하고, 개발에 더적은 비용이 들 수 있다.
미생물로부터 개발된 생물학적 살충제는 농경, 공공 위생 및 도시 환경에서 종합된 페스트 경영 프로그램에 매우 바람직하다. 일반적으로 사용된 생물학적 살충제 중의 하나는 그람 양성 세균Bacillus thuringiensis이다. 살충성B. thuringiensis균주는 포자형성동안 곤충 및 선충류의 어떤 목, 종에 특이적으로 독성이 있는 결정 단백질을 생산하는 것으로 알려진다. (예를 들어, U. S. 특허번호 4,999,192 및 U. S. 특허번호 5,208,017 참조).B. thuringiensis에 의해 생산된 단백질성 내독소는 또한 옥수수 뿌리벌레 및 다른 딱정벌레에 대한 살충제로서 작용한다. (예를 들어,U. S. 특허번호 T. J. et al. (1993),J. Economic Entomology, 86: 330-333 참조).B. thuringiensis내독소는 정제된 결정체, 세척된 세포 펠릿, 및 발현된 단백질로서 효과적임을 보였다. Warren et al. (WO 96/10083)은Bacillus cereus및B. thuringiensis의 식물성 단계동안 생산된 비-내독소 단백질을 개시한다. Vip 1 및 Vip2 로 불리우는 식물성 단백질은 옥수수 뿌리벌레에 대하여 잠재적인 활성을 가진다(노던 및 웨스턴). Estruch et al. (1997)Nature Biotechnology 15: 137-141 및 Mullins et al. (1997),Appl. Environ. Microbiol. 63.
β-외독소로 언급된B. thuringiensis열안정성 대사물질이 역시 살충성질을 가지는 것을 보였다. Burgjeron and Biache (1979),Entomophaga 11: 279-284 은 콜로라도 감자 딱정벌레(Colorado potato beetle) (Leptinotarsa decemlineata) 에 대한 활성이 있는 β-외독소를 보고한다. 게다가, 알려진B. thuringiensisβ-외독소는 선충류 뿐만 아니라 파리, 거염벌레, 진드기, 및 옥수수 뿌리벌레를 죽이는 비-특이적인 살충작용을 나타낸다. 시그마-외독소는 β-외독소에 유사한 구조를 가지고, 콜로라도 감자 딱정벌레에 활성이 있다. (Argauer et al.(1991)J. Entomol. Sci.26: 206-213). α-외독소는Musca domestica의 유충에 대한 독성이 있다. (Cluthy (1980)FEMS Microbiol. Lett.8: 1-7). γ-외독소는 다양한 단백질 분해 효소, 키티나제 및 프로테아제이다. γ-외독소의 독성 효과는 β-외독소 또는 δ-내독소와 조합하여서만 발현된다. Forsberg et al. (1976)"Bacillus thuringiensis;환경 성질에 있어서의 영향" 캐나다의 국제 조사 회의. Stonard et al. (1994)ACS Symposium Series 551: 25 는Bacillus cereus균주의 상청액에서 옥수수 뿌리벌레에 대해 활성이 있는 제 2 의 수용성 대사물질을 보고한다.
광범위한 스펙트럼 살충작용을 가진 증명된Bacillus subtilis균주가 없다.
스크리닝 프로그램은 항진균작용을 나타내는 어떠한Bacillusspp. (Bacillus spp.는B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis을 포함한다.)균주를 동종했다.(예를 들어,Stabb et al. (1990) Applied Environ. Microbiol.60: 4404-4412 참조). 이러한 균주는Phytophthora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum또는Sclerotinia minor에 의해 야기된 토양전염성병인 잘록병에 대해 효과적인 두개의 항생제인 쯔비터미신-A 및 또는 카노사민(Milner et al. (1996) Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3066)을 생산하는 것을 보였다. (Stabb et al., supra 참조). 쯔비터미신-A 는 수용성, 산 안정성 선형 아미노폴리올 분자이다.( He et al, (1994) Tetra Lett. 35 (16): 2499-2502 참조)
미국 특허출원번호 5,049,379 내지 Handelsman et al. 은 쯔비터미신 A 가 자주개자리 및 대두에서 잘록병을 생산하는 방법을 개시한다. 종자가 B. cereus ATCC 53522 로 피복될 때, 뿌리 부패 진균의 병원성 활성이 억제된다. 유사하게, 대두 종자 또는 종자를 에워싸는 토양에 어떤B. cereus균주의 포자-기초 조제물의 응용은 밭 위치에서 대두 산출량을 향상시키는 것을 보였다. (See, Osburne et al (1995) Am. Phytopathol. Soc. 79 (6): 551-556). 생물학적살충제를 사용하는 방법은 당업계에서 잘 알려지고 예를 들어, 습윤성 분말, 유동성 건조물, 유효제의 미세캡슐제, 적당한 배양물로부터 항생물질 부분의 액상 또는 고체 조제물을 포함한다. (U. S. Patent No. 5,061,495 to Rossall or U. S. Patent No. 5,049,379 to Handelsman 참조).
Smith et al. (1993) Plant Disease 77 (2): 139-142 는 코토니 큐컴버 리크를 야기하는 토양전염성 진균Pythium aphanidermatum의 활성이 쯔비터미신-생산B. cereus균주 UW85 의 사용으로 억제될 수 있다는 것을 보고한다. Leifert et al.(1995) J. Appl. Bacteriol. 78: 97-108 은 두개의Bacillus균주,B. subtilisCL27 andB. pumilus에 의한 항-Botrytis및 항-Alternaria항생제의 생산을 보고한다.
전 육즙 및 무세포 여과액은 시험관내 시험에서Botryis및Alternaria에 대해 활성이 있었고,Astilbe에 대한 생체내 작은 식물 시험에서 생체내 작은 식물 시험에서Botrytis에 대하여 활성이 있어다. Leifert et al (1997) U. S. 특허번호 5,597,565 는B. subtilis, B. pumilus, 및 구체적으로는 경작 후 질병을 야기하는 진균 억제에 효과적인B. polymyxa을 개시한다. 그들은 또한 무세포 배양 여과액에서 생산된 항생물질의 존재 및 서로 다른 pH 값에서 그들의 활성을 개시하나, 이러한 화합물을 동정하지 않는다.
Rossall (1994) 미국 특허번호 5,344,647 는 광범위한 항진균활성을 가진Bacillus subtilis균주를 개시한다. Sholberg et al. (1995)Can JMicrobiol.41: 247-252,Swinburne et al. (1975)Trans. Brit. Mycol. Soc. 65: 211-217, Singh 및 Deverall (1984)Trans. Br. Mycol. Soc. 83: 487-490, Ferreira et al. (1991)Phytopathology 81: 283-287, 및 Baker et al. (1983)Phytopathology 73: 1148-1152 는 진균 식물 병원균의 생물학적 억제제로서Bacillusspp. 및Bacillus subtilis의 사용을 개시한다. Baker et al. (1983)Phytopathology73: 1148-1152 는 또한 식물 병원균에의 사용을 위한 항진균성Bacillus subtilis를 보고한다. Puseyet al. (1988)Plant Dis.72: 622-626, Pusey and Robins (U. S. 특허번호5,047,239), 및 McKeenet al. (1986)Phytopathology 76: 136-139 은B. subtils를 사용한 경작후 과실 부패의 억제을 개시한다. McKeenet al., supra,는B. subtils의 이러한 살진균활성에 기여하는 저분자량 이투린 고리형 폴리펩티드에 유사한 항생물질을 보여주었다.
Liu et al. (1995) U. S. 특허번호 5,403,583 은Bacillus megaterium, ATCC 55000 및 진균 식물 병원균,Rhizoctonia solani을 억제하는 방법을 개시한다. Islam 및 Nandi (1985)J. Plant Diseases and Protection 92(3): 241-246 은 벼 갈색점무늬병의 원인제인Drechslera oryzae에 길항작용을 가진Bacillus megaterium을 개시한다. 같은 저자, Islam and Nandi (1985)J. Plant Diseases and Protection 92(3) 233-240 은 또한Drechslera oryzae, Alternaria alternata and Fusarium roseum에 대한B. megaterium의 시험관내 길항작용을 개시한다.그들은 배양물 여과액의 세가지 성분을 개시한다. 가장 활성이 있는 항생물질은 235nm 에서 UV 피크 및 260 nm 에서 쇼울더로 물 및 메탄올에서 높은 용해성을 보였고 그것은 폴리옥신-유사 지방포펩티드로 증명되었다.Cook ( (1987)Proceedings Beltwide Cotton Production-Mechanization Research Conference, Cotton Council, Memphis, pp. 43-45) 는 면 뿌리 부패의 원인인Phymatotrichum omnivorum에 의해 죽은 면 식물의 수를 감소시키는Bacillus megaterium의 상청액의 사용을 개시한다.
B. megaterium의 항생물질의 생산은 안사미토신-PDM-O , 바시메트린, 메가신, 펜타펩티드 및 호모펩티드와 같은 하등 포유동물 독성 펩티드 항생물질의 생산을 보고한 Berdy (CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vols. I-XIV, (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL 1980-87) 에 의해 기록되었다.
Bacilli 는 항진균 및 항균성의 제 2 의 대사물질을 생산하는 것으로 알려졌고, 위스콘신 및 코넬 대학 연구진은 신규한 살진균성 화합물,Bacillussp. 에 의해 생산된 쯔비터미신 A 를 동정했다. (He et al. (1994)Tetra. Lett. 35 (16): 2499-2502). 최근에 같은 균주에 의해 생산된 제 2 의 살진균성 대사물질이 공지된 아미노-당, 카노사민으로 동정되었다.(Milner et al. (1996)Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3065).
이전에 기술된Bacillus물질대사의 또다른 군은 이투린 유형의 고리형 리포펩티드이고, 이들 중의 얼마간은 살진균제이다. 이러한 약제는 7 개의 α- 아미노산을 가진 고리형 옥타펩티드 및 지방족 측쇄를 가진 하나의 β-아미노산으로 구성된다. 아미노산 서열의 순서 및 내용이 다른 몇 군의 이투린이 있다. 하기의 표 1 에서 보여진다. 일반적으로, 일군의 관련 분자는 지방족 아미노산 잔기의 길이 및 분지의 차이로 생산된다.Saccharomyces cerevisiae에 대하여 시험될 때, 이튜린-A 및 바실로미신 L (모두 LC50 = 30 μ/mL을 가짐) 에 뒤이어 미코서브틸린이 가장 활성제(LC50 = 10ug/mL) 로 발견되었다. (Beeson et al. (1979) J. Antibiotics 32 (8): 828-833). 이러한 고리형 리포펩티드의 작용 양식은 생체 이온의 해리를 허용하는 막관통 채널을 생성하는 진균막과의 상호작용으로 인한 것임이 보고되었다.(Latoudet al.(1986)Biochem. Biophys. Acta 856: 526-535). 이투린-C 는Penicillium chrysogenum을 포함하는 진균에 대하여 불활성이다. (Peypouxet al. (1978)Tetrahedron Lett.34: 1147-1152).
USDA의 연구 그룹은 아미노산 사슬 길이에서 차이가 있는 많은 유사체를 합성하는 것에 의해 이투린의 구조/활성 관계를 조사했다. 연구자들은 이투린의 활성이 지방산 측쇄의 길이 및 이소 > 노말 > 안티이소의 순서로 말단 분지에 따라 증가했다는 것을 보고했다. (Blandet al. (1995)Proc. Plant Growth Regulation Soc. Am.22nd: 105-107). 그들은 또한 균주Bacillus을 생산하는 많은 이투린으로 한 그들의 연구에 기초하여 "천연 생산으로부터 얻어진 이투린의 양은 상업적으로 이용하기에 부적절하다는 것"을 주장한다.
B.cereus로부터 분리된 또다른 군의 고리형 리포펩티드는 플리파스타틴이다. 이러한 화합물은 일군의 아크릴화된 데카펩티드이고, 이의 구조는 도 1 에서 보여진다. (Nishikiori et al. (1986)J. Antibiotics 39(6): 755761). 이러한 화합물은 원래 돼지 이자 포스포리파제 A2의 억제제로서 분리되었다.(Umezawa et al. (1986)J. Antibiotics 39(6): 737-744), 그러나, 후에Botrytis, Pyricularia및Alternaria를 포함하는 어떤 식물 병원성 진균을 억제하는 것으로 밝혀졌다. (Yamada et al. (1990)Nippon Noyaku Gakkaishi 15(1): 95-96). Yamada 는 또한 같은B.subtilis균주로부터 생산된 이투린 A 및 플리파스타틴 사이에 관찰된 상승작용 효과를 보고했다.
연구를 액체 (Phae and Shoda (1991)J Ferment. Bioeng. 71: 118-121); Ohno et al. (1993)J. Ferment. Bioeng 75: 463-465) 및 고체 상태 발효(Ohno et al. (1992) Biotech. Lett. (9) (9) 817-822 817-822; Ohno Ohno et al. (1995)J. Ferment. Bioeng. 5: 517-519) 모두에서 이투린의 생산을 증가시기 위한 발효 개선상에서 행했다. 그 자체로는 불활성인 밀접하게 관련된 표면활성물질과 동일한B.subtilis균주에 의해 생산된 이투린 사이의 상승작용의 보고가 있다. (Hiraokaet al. (1992)J. Gen. Appl. Microbiol. 38: 635-640). 이투린 A 의 생합성 및 표면활성물질을 공동-조절하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이 공개되었다.(Huanget al.(1993)J. Ferment. Bioeng. 76(6): 445-450). 이투린-생산 균주에 기초한 분야 작업은Rhizoctonia의 억제을 위한 토양처리에 집중되었고 (Asaka and Shoda(1996)Appl. Environ. Microbiol.62: 4081-4085) 이투린의 잎 분야에의 적용은 보고되지 않았다.
B.subtilis에 의해 생산된 또다른 고리형 리포펩티드 화합물은 예외적인 계면활성제 활성을 가지는 표면활성물질이다. (Kaninumaet al.(1969)Agric.Biol. Chem. 33: 973-976) 표면활성물질은 표면활성물질 및 이투린 A 둘다와, 바실로마이신 F 및 L 및 미코서브틸린을 생산한B.subtilis균주에서 발견된 LLDLLDL(SEQ ID NO: 1)서열로 헵타펩티드 부분에 락톤 고리로 연결된 C 14 or C15-히드록시 지방산을 포함한다. (Arimaet al. (1968)Biochem. Biophys. Res. Commun 31: 488-494. Sandrinet al. ( (1990)Biotechnol. Appl. Biochem. 12: 370-375)
종래에 균주Bacillus megaterium으로 여겨졌고 현재 균주Bacillus subtilis로서 동정된, 본 발명자에 의해 발견된 신규한 미생물 AQ713 은 A 이투린, 플리파스타틴 및 표면활성물질을 생산한다. 미생물에 의한 이러한 조합의 리포펩티드의 생산은 종래에 보고되지 않았었다. 게다가, 본 발명자는 AQ713 은 또한 "아그라스타틴"으로 명명된 새로이 개시된 일군의 화합물을 생산한다는 것을 발견했다. 신규한 아그라스타틴을 가진 상기의 세 개의 모든 공지된 화합물의 조합이 또한 신규이다.
발명의 개시
종래에는Bacillus megaterium으로 동정되었던, 광범위한 살진균 및 살균활성을 나타내고 또한 살충활성을 나타내는 신규한 항생물질-생산 및 대사물질-생산 균주Bacillus subtilis가 제공된다. 잎 및 땅속 곤충에 대한 활성을 가진 신규한B. subtilis로부터의 신규한 대사물질이 역시 제공된다. 또한 항생물질-생산Bacillus subtilis의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 식물을 진균, 세균 및 곤충 감염으로부터 처리 또는 보호하는 방법이 제공된다. 항생물질-생산Bacillus subtilis은 완전 육즙 배양물에서 현탄액으로 또는 항생물질-생산 균주Bacillus의 완전 육즙 배양물로부터 얻어진 항생물질-함유 상청액으로서 제공될 수 있다. 또한 완전 육즙 배양물 또는 배양물 상청액인 신규한 대사물질-생산Bacillus subtilis의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 식물 뿌리를 땅속 감염(예를 들어, 옥수수 뿌리벌레)으로부터 처리 또는 보호하는 방법이 제공된다. 신규한 대사물질-생산Bacillus subtilis가 완전 육즙 배양물에서 현탄액으로 또는 대사물질-함유 상청액 또는 미생물의 완전 육즙 배양물로부터 얻어진 정제된 대사물질로서 제공될 수 있다. 또한 신규한 균주 AQ713 에 의해 생산된 신규한 화합물 아그라스타틴 및 이투린 A, 플리파스타틴, 표면활성물질 및 아그라스타틴을 포함하는 화합물의 신규한 조합이 제공된다.
본 발명은 생물학적 살충제 분야이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 신규한 균주,Bacillus subtilis, AQ713 이 광범위한 범위의 진균 및 세균성 식물 질병을 억제할 수 있고, 또한 곤충에 대한 활성을 가질 수 있다는 연구결과에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 신규한Bacillus균주, 이 균주에 의해 생산된 항생물질 및 대사물질 및 단독으로 또는 다른 화학적 및 생물학적 살충제와 조합하여 포함하는 살진균성, 살균성, 및 살충성 조성물에 관한 것이다.
도 1 은 플리파스타틴 항생물질의 구조를 보여준다(SEQ ID NO: 2).
도 2 는 AQ713 의 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
본 발명은 종래에Bacillus megaterium으로 동정된Bacillus subtilis의 신규한 균주 AQ713, 또는 광범위한 항진균, 살충성 및 항세균 활성을 가진 이의 돌연변이체를 제공한다. 신규한 균주는 AQ713 으로 명명되고, 기탁 번호 B-21661 로특허 절차 목적을 위한 미생물의 기탁에 관한 국제 인식에 기초한 부타페스트 조약조항에 기초하여 1997 년 3 월 7 일 NRRL 로 기탁되었다.
후속적으로 American Type Culture Collection (ATCC)에 의해Bacillus subtilis로 동정되었다.
본 발명은 또한 AQ713 의 세균성 현탁액 또는 AQ713 배양물의 대사물질-함유 상청액 또는 균주 AQ713 으로부터 정제된 대사물질로 곤충 감염을 억제하기위한 식물 뿌리 또는 토양을 처리는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 이러한 세균 균주 또는 항생물질-함유 상청액 또는 이러한 세균 균주로부터 얻어진 순수한 항생물질을 사용하여 식물에서 진균, 세균 및 곤충 질병을 방지하고 처리하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 AQ713 의 세균 현탄액 또는 AQ713 배양물의 대사물질-함유 상청액 또는 진균 AQ713 로부터 정제된 대사물질로 곤충 및 곤충 유충을 억제하기 위하여 식물 잎, 뿌리 또는 식물을 에워싸는 토양을 처리하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 곤충에 활성을 가지는 분자량 10,000 Da 이하인 용매-추출가능한 대사물질을 포함한다. 더욱이 본 발명은 신규한 화합물, 신규한 미생물에 의해 생산된 아그라스타틴을 포함한다. 또한 A-형태의 이튜린, 플리파스타틴, 표면활성물질 및 아그라스타틴을 포함하는 신규한 조합이 포함된다.
정의
여기에 사용된 대로 " 생물학적 억제" 는 제 2 의 유기물을 사용하여 병원균 또는 곤충의 억제로서 정의된다. 생물학적 억제의 알려진 기작은 뿌리의 표면에 공간확보를 위한 경쟁적인 진균에 의해 뿌리 부패를 억제하는 장내 세균을 포함한다.
항생물질과 같은 세균 독소는 병원균을 억제하기 위해 사용되었다. 독소는 분리가능하고 식물에 직접적으로 적용될 수 있거나, 세균 종이 그 위치에서 독소를 생산할 수 있도록 투여될 수 있다.
용어, "세균"은 구별되는 핵을 가지지 않는 어느 원핵 유기물을 포함한다.
용어 "진균" 또는 "진균들"은 클로로필이 없는 광범위하게 다양한 핵종 포자함유 유기물을 포함한다. 진균의 예는 효모,고팡이, 노균병균, 녹병, 및 버섯을 포함한다.
"살진균성"은 진균의 사망율을 증가시키거나 진균의 성장 속도를 억제하는 물질 능력을 의미한다.
"돌연변이"는 유기물의 표현형에서 그 자체로 발현하는 돌연변이 유전자를 함유하는 유기물이다.
"항생물질" 은 미생물을 죽이거나 억제할 수 있는 어느 물질을 포함한다. 항생물질은 미생물 또는 합성 과정 또는 세미합성 과정으로 생산될 수 있다. 그러므로, 용어는 진균, 예를 들어 쯔비터미신-A 또는 카노사민을 억제하거나 죽이는 물질을 포함한다.
"항진균" 은 진균를 죽이거나 성장을 억제하는 어느 물질을 포함한다.
용어 " 배양" 은 다양한 종류의 배지내 또는 배지상에서 유기물의 증식을 언급한다. "전 육즙 배양물" 은 세포 및 배지 모두를 포함하는 액체 배양물을 언급한다. "상청액" 은 세포가 원심분리, 여과, 침전, 또는 당업계에서 잘 알려진 다른수단으로 육즙이 제거된 상태로 배양될 때, 육즙에 남아있는 액체를 언급한다.
"유효량" 은 유리한 또는 바람직한 결과를 이끄는데, 충분한 양이다. 유효량은 한번이상의 투여로 투여될 수 있다. 용어, 처리 및 보호에서 , "유효량" 은 진균 또는 세균 질병 상태를 개선하고, 안정화시키고, 역전시키고, 진전을 늦추거나 지연시키기에 충분한 양이다.
본 명세서에 사용된 대로, 용어 "곤충"은 강 "인섹타(Insecta)" 의 모든 유기물을 포함한다. "전-성충" 곤충은 성충 단계 이전의 예를 들어, 알, 유충 및 애벌레를 포함하는 어떤 형태의 유기물을 언급한다. "살충성" 은 곤충의 사망율을 증가시키거나 성장 속도를 억제하는 물질 능력을 언급한다.
용어 "살선충성" 은 선충류의 사망율을 증가시키거나 성장 속도를 억제하는 물질의 능력을 언급한다. "살충성" 은 곤충, 선충류 및 진드기의 사망율을 증가시키거나 성장 속도를 억제하는 물질을 언급한다.
"양성적인 억제" 는 살충활성을 가진 것으로 알려진 화합물을 의미한다.
"양성적인 억제" 는 상업적으로 이용가능한 화학 살충제를 제한없이 포함한다. 용어 "음성적인 억제" 는 살충활성을 가지지 않은 것으로 알려진 화합물을 의미한다. 음성적인 억제의 예는 물 또는 에틸 아세테이트이다.
용어 "용매"는 용액에서 다른 물질을 보유할 수 있는 어떤 액체를 포함한다. "용매 추출가능한" 은 용매에서 용해되는 어떤 화합물 및 그때 용매로부터 분리될 수 있는 화합물을 언급한다. 용매의 예는 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매를 제한없이 포함한다.
용어 "대사물질" 은 물질 또는 살충활성을 가지는 미생물 발효의 부산물인 어떤 화합물을 언급한다. 상기에 정의된대로 항생물질은 미생물에 대해 특이적으로 활성이 있는 대사물질이다. 용어 " 아그라스타틴" 은 하기의 구조(SEQ ID NO: 3)를 가지는 일군의 신규한 화합물을 언급한다.:
상기식에서, R1은 C8-C20 의 분지 또는 직쇄 지방족 측쇄 사슬이고; X 는 Ala 또는 Val 이고; R2는 아세테이트 또는 에스테르 유도체; 및 Glx 는 Gln 또는 Glu 이다. 이러한 화합물은 넓은 범위의 항세균, 항살충 및 항진균활성을 가진다.
우리는, 종래에Bacillus megaterium으로 동종된 , 광범위한 항진균 및 항세균활성을 가지고 또한 곤충 및 그들의 유충을 죽이거나 생장 저지시키는 신규한 대사물질 및 항생물질-생산 균주Bacillus subtilis를 개시한다. 다른 측면에서, 본 발명은 식물을 진균, 곤충 및 세균 감염으로부터 본 발명에서Bacillus subtilisAQ713 의 전 육즙 배양물로부터 얻어진 상청액의 유효량을 적용하는 단계를 포함하여 처리 또는 보호하는 방법을 제공한다. 상청액은 원심분리, 여과, 침전 등을 포함하는 당업계에서 잘 알려진 방법을 통해 얻을 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 식물을 진균, 곤충 및 세균 감염으로부터 신규한 균주Bacillus subtilis의 전 육즙의 유효량을 적용하는 단계를 포함하여 처리 또는 보호하는 방법을 포함한다.
더 나은 측면에서, 본 발명은 식물을 진균, 곤충 및 세균 질병으로부터 신규한 균주Bacillus subtilis로부터 생산된 항생물질의 유효량을 적용하는 단계를 포함하여 처리 또는 보호하는 방법을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식물 및 식물 뿌리를 곤충 및 유충 감염으로부터 본 발명의Bacillus subtillisAQ713 의 전 육즙 배양물로부터 얻어진 상청액의 유효량을 적용하는 단계를 포함하여 처리 또는 보호하는 방법을 제공한다. 상청액은 원심분리, 여과, 침전 등을 포함하는 당업계에서 잘 알려진 대로 얻을 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식물 및 식물 뿌리를 곤충 및 유충 침투로부터 신규한 균주Bacillus subtillis의 전 육즙의 유효량을 적용하는 단계를 포함하여 처리하거나 보호하는 방법을 포함한다.
더 나은 측면에서, 본 발명은 식물 뿌리를 곤충 침투로부터 신규한 균주Bacillus subtillis로부터 생산된 대사물질의 유효량을 적용하는 단계를 포함하여 처리하거나 보호하는 방법을 포함한다.
본 발명에서 조성물의 양호한 분산 및 흡착을 획득하기 위해서, 전 육즙 배양물, 상청액 및/또는 분산 및 흡착을 돕는 성분을 가진 대사물질/항생물질을 조제하는 것이 유리할 수 있다. 적당한 조제물은 당업계에서 숙련된 자에게 공지될 것이다.
본 발명내의 조성물은 습윤성 분말, 과립 등으로 조제될 수 있거나 적당한 배지등에 미세캡슐제로 될 수 있다. 다른 조제물의 예는 용해성 분말, 습윤성 과립, 유동성 건조제, 유동성 수성, 분산가능한 습윤성 과립, 유화가능한 농축물 및수성 현탄액을 제한없이 포함한다. 다른 적당한 조제물이 당업계의 숙련자에게 공지될 것이다.
그러나, 본 발명의 더 나은 측면에서, "아그라스타틴" 으로 명명된 신규한 군의 화합물이 제공된다. 이러한 화합물은 항-살충활성에 추가적으로 항세균 및 항진균 활성을 나타낸다.
본 발명의 훨씬 더 나은 측면에서, A-형태의 이투린, 플리파스타틴, 표면활성물질 및 아그라스타틴을 포함하는 신규한 조합이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, A-형태 이투린, 플리파스타틴, 표면활성물질 및 아그라스타틴을 포함하는 신규한 조합의 화합물의 유효량을 적용하는 단계를 포함하여 식물을 곤충, 진균 및 세균 질병으로부터 치료 또는 보호하는 방법이 제공된다.
본 발명에서 더 제공되는 것은 살충활성을 가진 균주 AQ713 으로부터 분리된 리포펩티드 추출물 및 살충활성을 가진 균주 AQ713 으로부터 분리된 표면활성물질 리포펩티드이다. 따라서, 본 발명은 분리된 리포펙틴 또는 분리된 표면활성물질의 유효량을 잎, 뿌리 또는 식물 또는 뿌리를 에워싸고 있는 토양에 적용하는 단계에 의해 식물 및/또는 과실을 곤충 감염으로부터 처리 또는 보호하는 방법을 또한 제공한다. 이러한 분리된 조성물은 다른 공지된 살충제(pesticide) 또는 살충제(insecticide)와 결합가능하고 AQ713 에 대해 상기에 기술된 대로 조제될 수 있고, 습윤성 분말, 과립, 유동액 또는 미세캡슐제로 적용될 수 있다.
여기에 언급된 모든 특허 및 공개공보는 전체로서 참고문헌으로 수록된다.하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 이러한 실시예는 제한으로서 해석되지는 않는다.
실시예 1
균주 AQ713 의 특징
분리균을 Bochner (1989)Nature339: 157-158 에 개시된대로 바이오로그 미세플레이트 패널의 사용에 기초하여 동정했다.(Biolog, Inc., Hayward, CA)
바이오로그 미세플레이트는 그람 양성 및 그람 음성 세균에 이용가능한 95 개의 서로다른 탄소 기질 플레이트로 선증량되고 건조된 패널 웰로 구성된다. 분리균을 28 ℃ 에서 액체 배지에서 배양했고 24 시간 후에 세척된 세포 현탄액(0.85% saline)을 GP 미세플레이트의 각각의 패널 웰로 접종했다. (Biolog, Inc.). 28 ℃ 에서 24 시간 후에, 탄소 이용 반응을 평가했다. 그때, 기질 이용 프로파일을 바이오로그 그람 양성 데이타 베이스와 비교(release 3.50)했고, 가장 근접한 유사종을 분리했다. 바이오로그 결과는Bacillus megaterium에 지수 0.883 의 유사성을 부여했다.
AQ713 의 더욱 광범위한 특성을 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection, (ATCC)) 10801 University Blvd., Manassas, VA, 201102209 에 의해 분류했다.
제출된 분리균 : 미공지 ; 균주 AQ713
동정된 분리균 : 유용한 생리적이고 생화학적인 데이터를 이용함, 이 균주는 가장 근접하게Bacillus subtilis와 흡사하다
세포 형태학: 운동성 세포들은 중심 또는 말단 근처 영역에서 형성된 한 내생포자 단독으로 발견된다. 세포들은 그램 양성으로 균일하게 염색된다.
콜로니 형태학: 콜로니들은 볼록형의 양각, 거칠고 둔한 표면 및 울퉁불퉁한 가장자리로 불투명하고 울퉁불퉁하다.
주: 유용한 생리적이고 생화학적인 데이터를 이용함, 이 균주는 가장 근접하게Bacillus subtilis와 흡사하다
실시예 2
옥수수 뿌리벌레에 대한 AQ713 의 활성
Bacillus샘플을Bacillus배양물 배지에서 배양했다. 배지 2 는 5% 펩톤, 5% 덱스트로스, 3% 효모 추출물, 3% 말트 추출물, 1.5% 프로플로 면 종자 추출물 (59% 단백질, 4.26% 지방, 6.73% 재, 3.19% 섬유 및 소량의 고시폴; 평형은 물이다.), 10% 간장 분말, 및 0.5% MgSO4x 7H2O 을 포함한다. 배지 3 은 20% 펩톤 및 3.4% KH2PO4및 4.3% K2HP04를 제외하고는 같은 성분을 포함한다. 어느날 선획이 생긴 오래된 배양물을 250 mL 차단된 진탕 훌라스크와 접종시키기 위해 사용되었다. 훌라스크를 200 rpm ,29 ℃ 에서 5일동안 진탕했다. 살충 활성을 분석하기 위해, 35 mL 의 배양물 육즙을 5,200 rpm 에서 20 분동안 원심분리했고 상청액을 하기에 기술된 미세분석법에서 사용했다.
분석법을 96-웰 미세플레이트에서 수행했다. 각각의 웰은 고체 한천 기질,시험 유기물 및 양성 억제, 음성 억제 또는 실시예 1에서 기술된대로 신규의Bacillus균주로부터 얻어진 상청액을 포함했다.
살충활성을 분석하기 위해서, 한천 기질을 Marroneet al.(1985)J. Econ. Entomol.78: 290-293 에 따라서, 미세플레이트의 웰을 준비했다. 살선충활성을 분석하기 위해서, 평평한 한천(1.5%)을 웰 대신 사용했다.
Avid(avermectin)의 1ppm 용액을 양성 억제로 사용했다.
탈이온화된 물을 음성 억제로 사용했다. 시험 샘플의 두 복제물 또는 대조군을 각각의 분석법을 위해 사용했다. 40 μL 의 상청액 샘플 또는 배지 1,2 또는 3 에서 배양된 전 육즙을 각 샘플 웰로 분배했다. 그 때, 플레이트를 한천 용액이 건조될 때까지 대략 2-3 시간동안 건조를 위해 증기 후드에 놓았다.
시험 유기물을 선-성충 옥수수 뿌리벌레(Diabrotica undecimpunctata), 선-성충 저먼 콕크로치 (Blatella germanica), 선-성충 사탕무우 거염벌레 (Spodoptera exigua), 선-성충 파리(Drosophila melanogaster), 또는 선충류Caenorhabditis elegans의 N2 균주이다. 시험 유기물을 0.1 % 한천에서 각각의 웰로 분산된 25 μL 한천당 대략 5 유기물의 농도로 희석했다. 미세플레이트를Mylar와 같은 밀폐 물질로 밀봉하고, 각 웰을 핀 프레스로 통풍시켰다. 플레이트를 27 ℃ 에서 7 일까지 인큐베이션했다.
인큐베이션 후에, 웰을 유충 사망율 또는 유충 발생의 정도에 의해 스코어했다. 모두 죽거나 성장 저해된 유충을 포함하는 샘플 웰을 스코어 1 로 하고, 얼마간은 죽고 나머지는 심각한 성장 저해를 보이는 유충을 포함하는 웰을 스코어 2 로 하고, 살아있으나 성장 저해된 유충을 스코어 3 으로 하고, 죽은 유충이 없는 것을 포함하는 샘플을 스코어 4 로 했다. 스코어를 각 샘플내의 복제물중에서 평균을 냈다. 결과를 표 2 및 3 에 요약했다.
이 결과는 배지 2 에서 최대의 활성을 가진, 전 육즙 배양물일때 양 배지에서 활성이 있는 AQ713 을 보여준다. 상청액은 AQ713 이 배지 2 에서 배양되었을 때만 활성이 있다.
시험 번호 2
AQ713 을 배지 4 로 지정된 훌라스크 또는 10 리터 발효조의 제 3 의 배지에서 사탕무우 거염벌레 및 옥수수 뿌리벌레에 대해 다시 시험했다. 그것은 프로플로 면 종자 추출물이 없는 배지 3 과 같은 성분을 포함했다. 모든 다른 절차는 상기에 기술된 것과 같다. 시험을 두번 또는 세번 반복했다.
AQ713 상청액 및 전 육즙은 배지 4 에서 옥수수 뿌리 벌레 및 거염벌레에 대해 매우 높은 활성이 있었다.
실시예 3
녹색 복숭아 진디에 대한 AQ 713의 활성
AQ713 을 다른 10 리터의 두 발효조에서 두번 그리고 하나의 400 리터 발효조에서 두번 48시간 동안 배양된 AQ713의 배치를 사용하여 배지 4에서 시험하였다. 녹색 복숭아 진디 ,Myzus persicae를 옥수수 뿌리벌레및 거염벌레에 첨가하여 시험하였다. 완전 육즙 배양물(WB) 및 상청액(S) 양자를 400 리터 배치의 하나로 부터 시험하였다. 녹색 복숭아 진디을 시험하기 위하여, AQ 713의 샘플의 40 ㎕를 96-웰 플레이트내 각각의 8웰의 하부의 작은 여과지 디스크상에 피펫팅하였다. 다음에, 플레이트를 1 내지 2 시간동안 증기 후드하에서 건조시켰다. 양배추잎의 진디을 가볍게 두드려 진디를 각 웰로 첨가하였다. 웰의 바닥을 진디로 덮었다. 웰의 컬럼이 채워졌을 때, 플레이트를 적소에 진디을 유지하기 위한 캡 스트립으로 캡핑했다. 시험 플레이트를 20 내지 22℃에서 인큐베이션하였다. 시험을 살아있는 것과 죽은 진디의 수를 계수하기 위해 현미경을 사용하여 48 시간내에 평가하였다. 다음에 웰을 다른 곤충들과 함께 1 부터 4 의 범위에서 스코어하였다. (4는 죽지 않은 곤충이고, 1은 100% 죽은것이다).
AQ713의 작고 큰 발효에 대한 시험은 완전 육즙 및 상청액이 녹색 복숭아 진디를 살충하는 것에 매우 효과적이라는 것을 보여준다.
실시예 4
녹색 복숭아 진디에 대한 AQ 713의 식물 시험
6 인치 키 후추 식물(욜로 원더)을 온실속에서 6개의 팩내에서 키웠다. 후추들을 온실내의 내재하는 녹색 복숭아 군으로부터 자연적으로 감염되도록 허용했다. 후추를 소형 분무기로 유출되도록 분무했다. 시험한 AQ713 샘플은 전 육즙이었고 건조 분무는 배지 4 내의 400 리터 발효조에서 배양된 전 육즙 분말이었다. 3 일후, AQ713-처리된 후추상의 진디 75%가 죽었다. 무처리 또는 물로 처리된 후추에서 죽은 진디는 없었다.
실시예 5
옥수수 뿌리벌레에 대해 활성이 있는 AQ713 대사물질의 화학적 특징
50mL의 AQ713을 배지 2에서 키웠다. 각 배지에 50mL 에틸 아세테이트를 첨가하였고 혼합물을 분별 깔때기내에서 2분간 진탕했다. 수성층을 제거했고, 유기층을 황산 마그네슘을 함유하는 바닥에서 수거했다. 다음에, 유기여과물을 둥근 바닥 플라스크 내로 여과하였고 용매를 로토뱁(rotovap)상에서 제거하였다.
생물학적분석을 위해, 건조 유기 추출물은 2.5mL 아세톤으로 재용해시켰다. 40㎕ 앨리쿼트를 제거하고 70% 아세톤/물로 800㎕로 희석시켰다. 이것은 유기 추출물의 10× 농도이다. 일련의 희석을 7일 후에 신생 유충(상기에서 제조된 것과 같은 미세적정농도 플레이트내 웰당 1)의 기록된 % 사망율로 유충 옥수수 뿌리벌레상의 샘플을 얻기 위해 실행하였다. 결과는 표 5에 기록하였다.
결과는 AQ713이 옥수수 뿌리벌레를 죽이는 용매-추출가능한 대사물질을 생산한다는 것을 보여준다.
활성 대사물질의 분자량의 범위를 결정하기 위하여, AQ713의 50mL 배양물을 배지2에서 배양했다. 1mL 를 미세퓨즈 튜브내에 배치시켰고 15분간 12,000rpm으로 회전시켰다. 상청액을 제거하였다. 상청액의 500 ㎕를 10,000 Da 분자량 센트리콘 필터의 상부에 배치시켰다. 이것들을 제조자의 지침(35분간 12,000rpm)에 따라서 원심분리하였다. 여과물을 수거하였고 투석유물을 원심분리 및 필터의 세척으로 회수하였다. 상청액 샘플, 여과물 및 투석유물을 신생 옥수수 뿌리벌레 유충에 대해 시험하였다(굶긴 곤충을 가진 96 웰-플레이트, 상기에 기술된 Marroneet al., supra; 웰 당 40㎕ 의 샘플 및 각 샘플에 대한 8 웰, 1 유충/웰). 이 시험의 결과는 표 6에서 나타난다.
결과는 상청액 및 여과물이 활성이 있었고, 따라서 대사물질의 분자량이 10,000 Da 이하이라는 것을 나타낸다.
실시예 6
식물 병원균에 대해 활성이 있는 AQ 713 대사물질의 화학적 성질
50mL의 AQ713을 배지 2에서 키웠다. 각 배양물에 50mL 에틸 아세테이트를 첨가하였고 혼합물을 분별 깔때기내에서 2분간 진탕했다. 수성층을 제거하고 유기층을 황산 마그네슘을 함유하는 바닥에서 수거했다. 다음에, 유기 여과물을 둥근 바닥 플라스크 내로 여과하였고 용매를 로토뱁상에서 제거하였다.
생물학적분석을 위해, 건조된 유기 추출물을 2.5 mL 아세톤으로 재용해시켰다. 40㎕ 앨리쿼트를 제거했고 70% 아세톤/물로 800㎕로 희석시켰다. 이것은 유기 추출물의 10× 농도이다.Pythium ultimum및Botrytis cinerea로 96-웰 플레이트 분석(이하에서 기술됨) 식물 병원균 분석법을 유기 추출물의 활성을 결정하기 위하여 실행했다. 완전 육즙은 100% 대조군(스코어 1)으로 하였지만, 10× 유기 추출물은 두 식물 병원균의 대조군(스코어 4)으로 하지 않았다. 이것은 AQ713에 의해 생산된 옥수수 뿌리벌레 활성 대사물질과 달리, 활성 항생물질은 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매에서 추출가능하지 않다는 것을 나타낸다.
활성 항생물질 부분을 추출하고 신규한 화합물, 아그라스타틴 A를 분리하기 위하여, 1차적으로 부탄올 추출물을 에틸 아세테이트와 같은 부피로 2 번 육즙을 추출하고, 층을 분리하여 발효 육즙을 만들었다. 다음에, 수성 부분을 부탄올과 같은 부피로 2 번 추출하였다. 부탄올 추출물을 합하고 용매를 회전식 증류기로 제거하였다. 분말을 결과 추출물 냉동 건조에 의해 얻었다.
분말을 80% 아세토니트릴/물에 용해시켰고, 초음파처리하였다. 용액을 메탄올로 활성화되고 80% 아세토니트릴/물로 평형화된 C-18 고체 페이즈 추출물(SPE) 카트리지에 적용했다. SPE 카트리지를 80% ACN/물로 용리시켰고, 이 용리제를 수거했고, 용매를 제거했다. 용리제를 HPLC로 더욱 정제하였다. C-18 HPLC 컬럼 (1㎝×25㎝)을 0 분 내지 20분, 33% ACN; 20 분 내지 30분, 40% ACN; 30 분 내지 45분, 45% 내지 55% ACN; 및 45 분 내지 63 분, 55% ACN 과 같은 아세토니트릴 + 0.05 % TFA/물 + 0.05 % TFA 용매 구배로 사용하였다 (210 nm 에서 UV 검출)
AQ713의 HPLC 크로마토그래피는 이투린, 이투린-유사 화합물(플리파스타틴 및 아그라스타틴) 및 표면활성물질의 존재를 나타낸다, 도 1 참조. 이투린 A2, A3, A4, A7 및 A6를 NMR 데이터와 LC 질량 분광 데이터의 조합 및 연구보고서 값의 비교에 의해 확인하였다. 표면활성물질을 HPLC 및 LC 질량 분광법에 의해 구입된 표면활성물질 표준과의 비교로 확인하였다.
이투린-유사 화합물을 플리파스타틴의 혼합물 및 아미노산 분석과 LC 질량분광법의 조합에 의한 신규한 아그라스타틴으로 결정하였다. 또한 광범위의 NMR 데이터를 아그라스타틴 A로 명명된 하나의 신규한 화합물(HPLC 피크 20)에 대하여 수거하였다. 아그라스타틴 A는 Thr; 3 Glu; Pro; Ala; Val; 2 Tyr; 및 Orn 아미노산을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 Val의 존재 및 Ile의 부재에 의해 플리파스타틴A와 다르게 구성된다. 아그라스타틴 A의 분자량을 하기의 구조(SEQ ID NO:4)에 상응하는 1448 로 결정하였다
지방산 부분의 직쇄 성질을1H NMR에 의해 확인하였다. 고리형 펩티드내 아미노산의 위치를 TOCSY 및 ROESY 데이터 세트의 상세한 분석에 의해 결정하였다.
질량 분광법 및 아그라스타틴 B (HPLC 피크 26)의 아미노산 분석법은 그것의 구조가 Ala 잔기를 Val 잔기로 치환한 플리파스타틴 B2 와 유사하다는 것을 제시한다. 구조는 하기에서 보여진다(SEQ ID NO:5)
실시예 7
시험관내 배양(96-웰 플레이트)에서 식물 병원균에 대한 AQ713 의 활성
AQ713이 진균,Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Alterrzaria solani에 대해 효과적인지를 결정하기위해 하기의 실험을 수행했다. 96-웰 플레이트 (바닥이 평평한, 웰 당 400 ㎕, Nunc brand)를 한천 배지(포테이토 덱스트로스 한천)로 채웠다. (PDA, Difco).Phytophthora infestans배양물을 액체 YPG-1 배지(0.4 g 효모, 0.1% KH2PO, 0.5% MgSO4X 7 H2O, 1.5 % 글루코스)에서 3 일동안 배양했다. 다른 진균와 비교하기 위해, 포자를 페트리 플레이트 표면으로부터 긁어 모았고, 0.1-0.2 mL 앨리쿼트의 탈이온화된 물 및 포자 현탄액 (대략적으로 농도 2 X 10'포자/mL)의 병원균을 한천에 스프레드했다.
AQ713 을 실시예 2 에 개시된 대로, 배지 2 또는 3 에서 72 시간동안 배양했다. 상청액을 얻기 위해, 전 육즙 배양물을 5,200 rpm 에서 20 분동안 원심분리했다. 진균 식물 병원균을 96-웰 플레이트(8 웰/병원균)상에 피펫하였다. 진균 성장의 존재 또는 부재를 각각의 8 웰에 대해 기록했다. 대략적으로 40 μL 의 AQ713 상청액 또는 20 μL 의 전 육즙을 각각의 웰에 첨가했다. "1" 의 스코어는 진균 성장의 완전한 억제를 의미한다. "4" 의 스코어는 진균 성장의 무억제를 의미한다. 결과를 표 7 에서 나타낸다.
결과는 AQ713 이 시험관에서 광범위한 살진균성 스펙트럼을 가지고 전 육즙 및 상청액 모두에서 높은 활성이 있다는 것을 보여준다. 상청액은 배지 2 는 아니나 배지 3 에서Rhizoctonia solani상에 활성이 있었다.
실시예 8
시험관내 배양물에서 식물 병원균에 대한 AQ713 의 활성(대 분석법)
한천 분산(대)분석법으로 AQ713 의 활성을 결정하기 위해, 식물 병원균 포자를 10 cm 페트리 디쉬의 포테이토 덱스트로스 한천 표면에 스프레드했다. 7.0 mm 웰을 한천으로부터 제거했고, 배지 2 에서 배양된 AQ713 의 100 μL 샘플의 상청액을 웰에 위치시켰다. 상청액을 4200 rpm 으로 40 분간 원심분리하여 준비하였다. 그때 상청액을 4200 rpm 에서 40 분동안 한번 더 다시 회전시켰다. 전형적인 결과는 웰 주위에 무성장대 및/또는 병원균의 감소된 성장대로 구성된다. mm 로 대 크기를 측정했고 기록했다. 결과를 표 8 에서 보여준다.
실시예 9
세균성 식물 병원균에 대한 AQ713의 활성
표준 한천 분산 분석법을 실시예 6 과 같이 준비했다. 각각의 세균성 병원균의 론(lawn)을 페트리 플레이트의 표면에 스프레드했다. 배지 2 에서 배양된 100 μL 의 AQ713 전 육즙을 각각의 웰에 위치시켰다. 대의 크기를 mm 로 측정했다.
AQ713 은 시험관내에서 시험된 모든 세균 식물 병원균 종에 대해 활성이 있었다.
실시예 10
식물 시험에서 식물 병원균에 대한 AQ713 의 활성
AQ713 을 콩 및 제라늄 잎 상에서 회색 곰팡이,Botrytis cinerea ,토마토 묘목에 대한Alternaria solani ,및 상추의 흰가루병 곰팡이,Bremia lactucae에 대해 시험했다.
6-팩에 심어진 2-3 잎 단계의 토마토 묘목,A. solani에 AQ713 전 육즙(배지 2)으로 흘러가도록 분무했다. 분무후에, 묘목을 건조되도록 허용했다. (약 1.5 시간) 다음에, 묘목에 5.0×104포자/mL 로 분무했다.
묘목을 플라스틱 돔으로 덮고, Percival 인큐베이터내에서 28 ℃에서 유지했다. 병원균 포자가 존재 및 비존재하는 무-AQ713 의 물을 음성 대조군 및 양성 병원균 대조군로서 사용하였다. 4 일 후 시험을 판독하였다. 물A.solani대조군에 비하여, 모든 잎 위에 균일한 병소가 있었고 떡잎이 떨어졌고 심하게 감염되었다.( 평가 5 = 전부 감염,무 대조군) AQ713 처리된 식물은 진엽(true leaf)상에 흩어진 약간의 가벼운 병소를 가졌다. 약간의 작은 병소가 있으나 떡잎은 부착되어있었다.
(평가 1). 음성적 대조군은 감염되지 않았다.
제 2의 시험을 물로 채워진 돌 단지에 놓여진 떨어진 토마토 묘목(줄기가 바닥 수준으로 꺾였다)을 사용하여 돔 아래에 준비했고 상기대로 저장했다. 식물을 상기처럼 분무했고A. solani의 증후를 4일후에 기록하였다. 음성 대조군상에서는 증후는 없었다. 양성 대조군에서는, 묘목위에 균일한 병소가 있었다. AQ713처리를 1로 평가하였다(적거나 무-병소). 2 일후, 양성 대조군내의 식물은 죽었으나, AQ713 처리된 묘목은 사실상 깨끗하였고 음성 대조군처럼 보였다(물 분무된 식물).
Botrytis cinerea에 대한 시험을 위해, 콩 식물의 제 1의 진엽을 각 잎상에 13×100 배양물 튜브의 주둥이로 압착하여 상처를 냈다. 각 잎은 2 개의 상처/잎을 가졌다. 잎에 AQ713 완전 육즙(배지 2) 또는 물만 또는 병원균만 분무하였다. 건조할 때,B.cinerea포자(0.8×106포자/ml)로 다시 분무하였다. 잎을 플라스틱 돔으로 덮힌 평면에 배치하였고 페르시발(Percival)인큐베이터내에서 18-20℃에서 저장하였다. 5일 후, 양성 대조군(병원균 단독)은 직경 약 25mm 의 영역에서 부패되었다. 음성적 대조군(물 단독)은 무-부패를 보였다. AQ713은 잎이 상처을 입은 곳에서 8 분의 7 범위에서 무-감염을 보였다. 감염되었던 한 곳은 그 범위 주변의 두 곳의 위치에서 가벼운 감염을 가졌다.
Bremia시험을 위해, 상추 종자를 토탄, 펄라이트를 함유하는 무균처린된 포팅(potting) 혼합 층 및 약 8 cm 높이 및 범위의 작고 투명한 플라스틱 식물 콘도미니움내의 질석에 심었다. 상추가 발아한 후에(1주), 상추 묘목에 AQ713 육즙 또는 상청액 샘플을 분무하였다. 식물을 건조되도록 한 후에 감염된 상추 묘목으로 부터의 흰가루병 곰팡이 포자 현탄액을 묘목에 분무했다. 플라스틱 커버를 식물위에 놓았고 , 페르시발 인큐베이터에서 18-20 ℃ 로 인큐베이션했다. 1 주 후에, 시험을 평가했다. AQ713 은 흰가루병 곰팡이를 상추 묘목상의Bremia로부터 예방하지 못했다.
실시예 11
식물 질병에 대한 AQ713 의 효험 (온실 시험)
포도 노균병
AQ713을 간장-기초 배지에서 48 시간동안 400 리터 발효조에서 배양했다.포도 식물(cultivar Chardonnay)에 0.5× 및 0.25× 농도로 되도록 멸균수로 희석된 400 리터 발효량으로부터 완전 육즙이 유출되도록 소형 분무기로 분무하였다. 잎이 건조되었을 때, 식물에 한번 더 분무했다. 건조 후에, 식물을 포도 노균병을 야기시키는 병원균Plasmopara viticola과 접종시켰다. 3 종의 식물을 각각의 투여량으로 처리했다. 각각의 식물을 0 내지 100% 억제 스케일에 기초한 % 질병 억제를 측정하여 평가했다. 100% 억제는 눈에 띄는 병소를 가지지 않는 식물이다. 화학 살진균제, 메타락실을 비교를 위해 사용했다. 결과는 하기와 같다:
AQ713 0.5 × 전 육즙 97.7 % 억제
AQ713 0.25 × 전 육즙 100 % 억제
메타락실 30 ppm 100 % 억제
메타락실 10 ppm 98.3 % 억제
메타락실 1 ppm 80 % 억제
결과는 AQ713 의 포도 노균병 뿐만 아니라 화학 살진균제의 억제에도 효과적이었음을 증명했다.
실시예 12
호박 흰가루병 곰팡이에 대한 AQ713 의 효험
AQ713을 간장-기초 배지에서 48 시간동안 400 리터 발효조에서 배양했다. 호박 식물(Crookneck and Acorn)을 400 리터 발효량 및 0.5× 농도로 되도록 멸균수로 희석된 샘플로부터 완전 육즙이 유출되도록 소형 분무기로 분무하였다. 건조 후에, 식물을 호박 흰가루병 곰팡이 병원균,Sphaerothecafuliginea으로 접종했다. 두 식물을 각 투여량으로 처리했다. 분무 건조 분말의 전 육즙을 또한 처리했다. 400 리터 발효 육즙을 물을 제거하기 위해 분무 건조했다. 10 % 및 2.5 % 분무 건조 분말 용액을 상기대로 유출되도록 식물에 분말했다. 흰가루병 곰팡이 질병의 발생율을 0 내지 5 의 스코어로 평가했다. 평가 5는 100% 질병을 나타내는 반면에 평가 0 은 무-질병을 나타낸다. 결과는 표 10 에 보여진다.
AQ713 전 육즙 및 분무 건조 분말은 호박 흰가루병 곰팡이의 거의 완전한 억제를 제공했다.
실시예 13
만발성 마름병, 회색 곰팡이, 포도 흰가루병 곰팡이, 곡물 흰가루병 곰팡이, 온실에서의 초 마름병 및 벼 도열병에 대한 AQ713 의 효험
AQ713 을 간장-기초 배지에서 250 mL 진탕 훌라스크에서 72 시간동안 배양했다. 질병, 원인 병원균 및 숙주를 하기의 표 11 에서 목록화한다. 이러한 완전 육즙 배양물을 하기의 표 11 에서 보여진대로 식물에 시험했다.
각각의 육즙을 소형 분무기로 시험 식물에 1 X 농도로 유출되도록 분무했고, 건조시킨후에 한번 더 분무했다. 3 종의 식물을 각각의 질병 및 처리에 대해 시험했다. 건조 후에, 식물을 병원균과 접종했다. 각각의 식물을 0 내지 100% 억제 스케일에 기초하여 % 질병 억제를 측정하여 평가했다. 100% 억제는 눈에 띄는 병소가 없는 식물을 언급한다. 질병 지표의 비교를 위해 사용된 화학 살진균제는 비-처리 대조군상에서의 질병에 대한 감도이다.
AQ713 은 모든 시험된 병원균에 대한 화학 살진균제의 동등한 활성을 보였다.
실시예 14
Brassica 흰색가루병 곰팡이에 대한 AQ713 의 효험
Bacillus균주 AQ713 을 간장-기초 배지에서 48 시간동안 10 리터 발효조에서 배양했다. 1 X 강도에서 완전 육즙 배양을 3 주된 꽃양배추 및 완전 떡잎 단계에서 다년생 초본 식물에 압축된 공기로 분말화된 전문가의 에어브러쉬로 분무했다. 처리마다 15-25 묘목/포트(pot)의 세개의 복제물에 분무했다. Zeneca 로부터의 아조크시스트로빈(azoxystrobin) 살진균제인 QuadrisTM을 또한 (처리당 3회씩) 250 ppm 및 125 ppm 의 속도로 식물에 분무했다. AQ713 및 Quadris 분무가 건조된 후에, 흰색가루병 곰팡이의 포자 현탄액,Peronospora parasitica을 1-5 X 104포자/mL 로Brassica식물에 분무했다. 식물을 감염동안 24 시간, 15-17 ℃ 에서 유지시킨 후에, 묘목을 6 일 동안 20 -24 ℃ 에서 인큐베이션했다. 포트를 하룻밤동안 15-17 ℃ 로 되돌려서 시험이 평가될 때까지 병원균의 포자형성을 허용한다. 각각의 식물을 0 to 100 % 억제 스케일에 기초한 % 질병 억제를 측정하는 것에 의해 평가했다. 100% 억제는 무-포자형성 병소를 가진 식물이다. 복제물 포트 전체의 평균화된 결과가 하기의 표 14 에 보여진다.
AQ713 은 흰색가루병 곰팡이를 기간 중 3 주 동안 효과적으로 억제했다.
실시예 15
AQ713 및 상업적인 살진균제의 상승작용
AQ713 을 간장-기초 배지에서 10 리터 발효조에서 72 시간 배양했다. 세균 배양물을 무균수로 0.5X 및 0.25X 농도로 희석했다. 1X, 0.5X and 0.25X 농도의 배양물을 3 주된 후추 식물에 압축 공기로 분말화된 전문가의 에어브러쉬로 분무했다. 3 종의 식물을 처리마다 분무했다. Zeneca 로부터 아조크시스트로빈 살진균제, QuadrisTM를 농도 500 ppm, 250 ppm and 125 ppm 으로 또한 식물 (처리당 3 개)에 분무했다. 게다가, 1:1 비율로 Quadris 와 AQ713 의 전 육즙 배양물의 조합을 후추 식물(처리당 세개)에 분무했다. Quadris 로 또는 무-Quardris 처리를 하기의 표 15 에 개요한다. AQ713 및 Quadris 스페레이가 건조된 후에, 1 X 106포자/mL 로Botrytis cinerea의 포자 현탄액, 회색 곰팡이를 후추 식물에 분무했다. 식물을 20 내지 22 ℃ 에서 시험이 평가될 때까지 3 일간 보유한다. 회색 곰팡이 질병의 발생율을 포자 0 내지 5 의 스코어로 평가했다. 0 평가가 무-질병을 지시하는 반면에 5 평가는 100% 질병을 지시한다. 결과는 하기의 표 15 에 나타난다.
결과는 Quadris 및 AQ713 의 조합이 Quadris 또는 AQ713 단독으로 처리되는 경우보다 회색 곰팡이 질병을 현저하게 억제한다는 것을 보여준다.
실시예 16
균주 AQ713 의 살충 성분의 결정
곤충에 대한 시험을 위한 리포펩티드 부분의 추출(이투린, 플리파스타틴, 아그라스타틴 및 표면활성물질)을 하기대로 수행했다:
완전 육즙을 와동시키고 pH 를 HCl로 1.5 로 조정한 후, 다시 와동시킨후에 10,500 rpm 으로 15 분동안 원심분리했다. 상청액을 붓고, 폐기했다. 펠릿을 80%아세톤니트릴/물(ACN/H20)로 현탁하고 그 다음에 30 분동안 음파처리했다. 샘플을 15 분동안 다시 원심분리한 후에 펠릿을 와동에 의해 80% ACN/H20 에서 다시 현탁했다. 그것을 다시 15 분동안 원심분리한 후 하룻밤동안 속도 진공에서 건조했다. 샘플을 80% ACN/H20 에서 재용해한다.
리포펩티드의 하나인 표면활성물질을 단독으로 시험했다. 표면활성물질을 Sigma Chemicals (St. Louis, MO) 로부터 구입하였고, HPLC 에 의해 증명된 대로 AQ713 에서의 표면활성물질과 동일하다. 따라서, 시그마 표면활성물질을 곤충에 대한 시험에 사용하였다.
AQ713 균주의 리포펩티드 추출물은 살충성이다. 단독의 표면활성물질은 진디 및 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성을 보이지만, 거염벌레에 대해서는 활성이 없다. 따라서, 균주 AQ713 의 살충활성은 균주 AQ713 의 리포펩티드에 의해 부분적으로 설명될 수 있다.
본 발명이 이의 특이적인 구체예를 참고로 하여 여기에 자세하게 개시되는 반면에, 본 발명의 취지 및 이의 범위를 벗어나지 않고 상기에 개시된 대로 본 발명의 다양한 변화 및 변형이 당업계의 숙련자에게 만들어질 수 있다는 것이 분명할 것이다.

Claims (25)

  1. Bacillus subtilis균주 AQ713 , NRRL 기탁 번호 B-21661 또는 식물 또는 과실에 대해 상기 균주의 모든 확인되는 특징을 가지는 이의 돌연변이체의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 상기 식물 및 과실을 곤충 감염으로부터 보호 또는 처리하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 곤충 감염은 잎 곤충 감염 또는 땅속 곤충 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 곤충에 대한 활성을 나타내고 용매 추출가능하고 10,000 Da 이하의 분자량을 가지는 제 1 항의Bacillus subtilis균주에 의해 생산된 대사물질의 유효량을 식물 또는 과실에 적용하는 단계를 포함하는 상기 식물 및 과실을 곤충 감염으로부터 보호 또는 처리하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 곤충 감염은 잎 곤충 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 곤충 감염은 땅속 곤충 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 곤충에 대한 활성을 나타내는Bacillus subtilis균주 AQ713 의 배양물로부터 얻어진 상청액의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 식물 및 과실을 곤충 감염으로부터 보호 또는 처리하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 곤충 감염은 잎 곤충 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 곤충 감염은 땅속 곤충 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 또는 화학적 살충제의 유효량을 적용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,Bacillus subtilis균주 AQ713 은 완전 육즙 배양물로서 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,Bacillus subtilis균주 AQ713 은 상청액으로서 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 6 항에 있어서,Bacillus subtilis균주 AQ713 은 습윤성 분말, 과립, 유동액 또는 미세캡슐제로서 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물의 뿌리 또는 뿌리 주위의 토양을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 식물의 뿌리 또는 뿌리 주의의 토양을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 살충활성을 가지는 균주 AQ713 로부터 분리된 것을 특징으로 하는 리포펩티드 추출물.
  16. 살충활성을 가지는 균주 AQ713 으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 표면활성물질 리포펩티드.
  17. 다음 화학식을 가지는 화합물의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 및 과실을 곤충 감염으로부터 보호 또는 처리하는 방법.
    상기식에서, R1은 C8-C20 의 분지 또는 직쇄 지방족 측쇄; X 는 Ala 또는 Val이고, R2는 아세테이트 또는 에스테르 유도체 및 Glx 는 Gln 또는 Glu 이다.
  18. 화학식(SEQ ID NO:4)
    또는 (SEQ ID NO:5)
    를 가지는 화합물의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 및 과실을 곤충 감염으로부터 보호 또는 처리하는 방법.
  19. A-형태의 이투린, 플리파스타틴, 및 계면활성제를 포함하는 조성물의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 및 과실을 곤충 감염으로부터 보호 또는 처리하는 방법.
  20. 제 20 항에 있어서, 아그라스타틴의 유효량을 적용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 살충활성을 가진 균주 AQ713 으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 리포펩티드 추출물.
  22. 살충활성을 가진 균주 AQ713 으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 표면활성물질 리포펩티드.
  23. 제 22 항의 추출물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 또는 과실을 곤충 감염으로부터 처리 또는 보호하는 방법.
  24. 제 23 항의 표면활성물질을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 또는 과실을 곤충감염으로부터 처리 또는 보호하는 방법.
  25. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 조성물을 식물의 뿌리 주위의 토양에 적용하거나 또는 뿌리를 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
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