CN114703078B

CN114703078B - 产吲哚金黄杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114703078B
Application number: CN202011486523.3A
Authority: CN
Inventors: 李世友; 赵福强; 严弋敬
Original assignee: Shenyang Enzhi Research Institute Co ltd
Current assignee: Shenyang Enzhi Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN114703078A

Abstract

本发明提供了产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)菌株和该菌株的培养物，及其用于抗线虫的用途和使用方法。本发明提供的产吲哚金黄杆菌的培养物(包括其发酵液、代谢物、提取物)及培养物中分离获得的化合物，能够抑制各类线虫的发展，尤其是对松材线虫起到显著的抑制作用，可利用其制备为相应的可实际应用的产品，在医药、农药和清洁产品领域中的应用潜能巨大。

Description

产吲哚金黄杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种产吲哚金黄杆菌及其应用。

背景技术

天然产物是指动物、植物、昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分、代谢产物和/或内源性的化学成分的统称。微生物天然产物提供丰富的化学多样性来源，是药用小分子、食品添加剂、抗虫抗菌剂等的重要来源之一。而上述具有重要作用的化学物质通常来源于微生物的次级代谢产物，其可以单独使用或与已知的化合物组合使用从而达到抗虫、抗菌等所需的目的。

线虫，属线虫门，在淡水、海水、陆地上随处可见，是多样性仅次于昆虫的一个动物类群，目前有超过28000个已被记录的物种，尚有大量种尚未命名。目前，已有超过16000种寄生性线虫，是包括许多植物及人类在内的动物的病原体，其中较为严重且广泛的主要包括根结线虫、胞囊线虫及松材线虫等。

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)，是一种常见的松树寄生线虫，通过松墨天牛等媒介昆虫传播，进而引发松材线虫病，造成松树大量死亡，是松林的“头号杀手”。目前有报道将松材线虫进一步分为M型株系(mucronate form of B.xylophilus)和R型株系(round tailed form of B.xylophilus)，R型株系群体内一般尾部端钝圆，无尾尖或少数个体有微小尾尖突；而M型株系最早由Wingfield等报道从美国明尼苏达和威斯康辛州的冷杉中发现，其群体内所有雌虫均有明显的尾尖突，形态特征更接近拟松材线虫(B.mucronatus)。Georges De Guiran等报道，M型松材线虫通常是致病性较弱的，而R型松材线虫通常具有致病性，造成松树大量死亡，带来严重的经济损失和生态损失。

当前针对各类线虫的控制主要为化学控制剂和生物控制剂；化学控制剂主要包括有机磷和氨基甲酸酯类、阿维菌素、异氰酸酯、氟噻虫砜、苦参碱等，虽然化学控制剂存在一定的效果，但是其毒性或环境问题也不容忽视。生物制剂中则包括有植物源控制剂和微生物控制剂。植物源控制剂则是通过植物提取物用于控制线虫，如印楝油(含印楝素)、皂苷等。植物源控制剂通常是寻找具有效果的化合物，包括醛和酮、生物碱、糖苷、芥子油苷和异硫氰酸酯、柠檬苦素类、苦木素类和皂甙、有机酸、酚类、黄酮类和醌类化合物、胡椒酰胺类、萜烯类、聚乙炔等。当前植物源控制剂虽然研究的较多，但真正能够实际应用的极少。

目前有若干微生物被报道可制备具有抗线虫活性的微生物控制剂，如：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、穿刺巴斯德柄菌(Pasteuria penetrans)、巴氏杆菌(P.usgae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilanicus)、明尼苏达被毛孢(H.minnesotensis)、洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)、指状节丛孢菌(Arthrobotrys dactyloides)和厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)等。上述各类微生物，或其本身可通过寄生线虫、虫卵从而杀死线虫，或是微生物的代谢产物中含有能够抵抗线虫的物质，从而达到抗线虫的效果。

基于当前线虫化学控制剂对环境的危害和植物源控制剂实际使用率低的问题，为降低线虫造成的大量经济损失，寻找新的微生物菌株以进行线虫控制仍是当前线虫生物控制剂的重要目标。

松材线虫与伴生微生物存在密切的生态关系，伴生微生物主要包括真菌和细菌。目前已被报道的松材线虫伴生细菌包括：泛菌属(Pantoea sp.)、河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、中间肠杆菌(E.intermedius)、肠杆菌(E.sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、荧光假单胞菌Ⅰ型(P.fluorescens biotypeⅠ)、荧光假单胞菌Ⅱ型、恶臭假单胞菌(P.putida)、不解糖消化链球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)、耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)、松鼠葡萄球菌(S.sciurl)、乡间步丘菌(Buttiauxella agrestis)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡状芽孢杆菌(B.cerus)、巨大芽孢杆菌(B.egaterium)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、居泉沙雷菌(Serratia fonticola)、解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiellaornithinolytica)、嗜麦寡养食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、和猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产吲哚金黄杆菌(Chryseobacteriumindologenes)等。

金黄杆菌属(Chryseobacteriurm)，属于黄杆菌科，厚壁菌门。最早是在1994年由Vandamme对其进行了描述，将该属从黄杆菌属(Flavobacterium)独立出去，之后Kampfer、Wu等人对该属的特征进行了补充描述。金黄杆菌广泛存在于自然界中，包括土壤、污水、植物根部、鱼类、昆虫肠道等，且该属部分菌株为条件致病菌，可引起人类及其他动物的严重感染疾病，如产吲哚金黄杆菌。

产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)为非发酵革兰阴性杆菌，可引起腹腔内感染、心内膜炎、菌血症、脑膜炎等多种疾病，是一种高度耐药的细菌。近年来，产吲哚金黄杆菌引起的医院内感染性疾病不断增加，长期使用广谱抗菌药物和免疫抑制剂的患者尤为常见。产吲哚金黄杆菌是条件致病菌，其多重耐药现象普遍存在，且耐药率较高。目前认为产吲哚金黄杆菌的耐药机制主要为该菌产生的金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamase，MBL)，属于Bush-Medeiros-Jacoby3组，分子结构属于B群，具有锌离子活性中心，其耐药性可传播给其他细菌，能够水解β-内酰胺类抗菌药物如碳青霉烯类、头孢菌素类和青霉素类抗生素，对常用β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦等不敏感。据吴海梦的研究表明，2008-2017年所有产吲哚金黄杆菌阳性标本的体外药敏实验结果显示，在检测的8种抗生素中，复方磺胺甲噁唑敏感率最高＞70％，其他抗生素包括庆大霉素、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、亚胺培南的耐药率均＞80％，喹诺酮类如环丙沙星具有一定的敏感率，不足25％。

鉴于产吲哚金黄杆菌存在广谱耐药的问题，当前针对产吲哚金黄杆菌的用途开发并不完善。目前产吲哚金黄杆菌的用途有以下几个方面：(1)《产新型弹性蛋白酶产吲哚金黄杆菌的分离鉴定及酶学性质研究》公开了一株具有较强水解牛筋粉能力的产吲哚金黄杆菌，该菌经液体发酵后的上清液经沉淀、纯化等处理后得到弹性蛋白酶，该弹性蛋白酶对弹性蛋白优先水解，对弹性蛋白、干酪素、明胶和大豆分离蛋白都有较强的水解作用。(2)产吲哚金黄杆菌YM5是一株具有高效羽毛角蛋白降解能力的革兰氏阴性菌，其菌液及其羽毛发酵液对哺乳动物安全无毒副作用，可应用于工业生产。(3)产吲哚金黄杆菌(保藏编号为CCTCC NO：M 2018651)具有高效降解废水中有机污染物的能力，能够改善有机废水出水水质。(4)韩国专利KR1020110092616A公开了一种含有吲哚黄杆菌ISE14的组合物，以生态友好的方法预防植物炭疽病，并减少使用杀虫剂。(5)《蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的分离筛选和鉴定》中分别发酵测定9株菌的PG酶活性，产吲哚金黄杆菌ZYF120413－7发酵酶活最高，为0.7168U/mL，能用于制备蛋白质谷氨酰胺酶。

发明内容

鉴于当前线虫化学控制剂对环境的危害和植物源控制剂实际使用率低的情况，为了解决寻找新的微生物菌株以进行线虫控制的问题和现有技术中产吲哚金黄杆菌的用途开发并不完善的问题，本发明提供了一种产吲哚金黄杆菌及其应用，所述的产吲哚金黄杆菌菌株从M型松材线虫中分离得到，用于制备抑菌产品和/或抗线虫产品。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)，该菌命名为EC200816，于2020年11月24日在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)登记保藏，保藏编号为GDMCC No:61309。

所述产吲哚金黄杆菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO:1。

进一步地，所述产吲哚金黄杆菌具有金黄杆菌属的鉴定特征：菌落金黄色，圆形凸起，半透明状、表面光滑湿润、边缘完整；革兰氏染色阴性，无运动性，不形成芽孢；需氧，30℃适宜生长；氧化酶和过氧化氢酶阳性。

进一步地，所述产吲哚金黄杆菌是从松材线虫中分离，然后经培养后得到。

进一步地，所述产吲哚金黄杆菌是从松材线虫中分离，然后于25-37℃、pH7.0-8.0在培养基中培养。

一种产吲哚金黄杆菌的应用，所述产吲哚金黄杆菌培养物和/或培养物分离出的化合物在抗线虫中的应用。

所述产吲哚金黄杆菌培养物为产吲哚金黄杆菌的全细胞培养液、发酵液、代谢物和/或提取物；

所述培养物分离出化合物为产吲哚金黄杆菌的全细胞培养液、发酵液、代谢物、提取物中一种或几种物质经分离获得的化合物。

进一步地，所述的产吲哚金黄杆菌全细胞培养液具有抗线虫性能。

进一步地，所述的产吲哚金黄杆菌的发酵液具有抗线虫性能。

进一步地，所述的产吲哚金黄杆菌的提取物具有抗线虫性能。

进一步地，所述的产吲哚金黄杆菌的代谢物具有抗线虫性能。

所述产吲哚金黄杆菌的发酵液在制备抗线虫产品中的应用。

所述产吲哚金黄杆菌的提取物在制备抗线虫产品中的应用。

所述产吲哚金黄杆菌的代谢物在制备抗线虫产品中的应用。

进一步地，所述产品为药物、农药或清洁产品。

一种抗线虫制剂，所述抗线虫制剂的活性成分含以权利要求1所述的产吲哚金黄杆菌培养后的全细胞培养液、发酵液、代谢物、提取物、分离的部分化合物中的一种或几种；

所述分离的部分化合物为产吲哚金黄杆菌的全细胞培养液、发酵液、代谢物、提取物中一种或几种物质经分离获得的化合物。

上述化合物还可为自行合成或市面购买。

所述抗线虫制剂为活性成分和农业上可接受的载体；其中，活性成分占产品质量的0.01-99％。

所述活性成分中还包括杀虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀菌剂、杀真菌剂、除草剂、生长调节剂、消毒剂、驱避剂、引诱剂和/或生物农药。

上述抗线虫产品还包括一种或几种以下组分：润湿剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂、表面活性剂和/或分散介质(如水、醇类、食用油等)。

进一步地，所述产品为药物、农药或清洁产品。

一种抗线虫组合物，所述抗线虫组合物包括上述的EC200816产吲哚金黄杆菌的全细胞培养液、发酵液、代谢产物和/或分离自产吲哚金黄杆菌的全细胞培养液、发酵液、代谢产物的具有抗线虫作用的化合物；还可以包括其他杀虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀菌剂、杀真菌剂、除草剂、生长促进剂、生长调节剂、消毒剂、驱避剂、引诱剂和/或生物农药。

所述杀虫剂和杀线虫剂包括但不限于氨基甲酸酯、二酰胺、大环内酯、新烟碱类、有机磷酸酯、苯基吡唑、除虫菊酯、多杀菌素、拟除虫菊酯、季酮酸和四酸。具体包括但不限于阿维菌素、乙虫威、多杀霉素、联苯菊酯、克百威、氯虫苯甲酰胺、噻虫胺、氰虫苯甲酰胺、氟氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、溴氰菊酯、呋虫胺、甲氨基阿维菌素、乙虫腈、溴虫腈、氟虫双酰胺、噻唑磷、吡虫啉、伊维菌素、-氟氯氰菊酯、灭多威、噻嗪草胺、烯啶虫胺、草戊酰胺、氯氰菊酯、乙基多杀菌素、多杀霉素、螺螨酯、螺虫乙酯、氟虫菊酯、噻虫啉、噻虫嗪、噻嗪和/或噻虫威。

所述杀螨剂包括但不限于阿米特拉、甲硫磷、氯苄、环己素、三氯杀螨醇、二烯草胺、乙螨唑、喹螨嗪、氧化芬布汀、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、炔螨特、哒螨灵和/或吡螨胺。

所述杀真菌剂包括但不限于芳香烃、苯并咪唑、苯并噻二唑、羧酰胺、羧酰胺、吗啉、苯酰胺、膦酸酯、醌外抑制剂(例如嗜球果伞素)、噻唑烷、硫菌灵、噻吩羧酰胺和三唑。具体杀真菌剂包括但不限于苯并咪唑-S-甲基、嘧菌酯、苄霜灵、联苯双酯、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、环唑醇、烯酰吗啉、氟环唑醇、氟菌腈、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酯、氟噻菌胺、氟吡菌酰胺和/或膦酰基。

所述除草剂包括但不限于ACCase抑制剂、乙酰苯胺、AHAS抑制剂、类胡萝卜素生物合成抑制剂、EPSPS抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂、PPO抑制剂、PSII抑制剂和合成生长素；具体除草剂包括但不限于乙草胺、烯草酮、麦草畏、氟米噁嗪、氟磺胺草醚、草甘膦、草铵膦、硝磺草酮、喹禾灵、苯噻草胺、磺草酮和/或2、4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)。

所述生长调节剂包括但不限于抗生长素，例如氯贝酸或2，3，5-三碘苯甲酸；生长素，如4-CPA、2，4-D、2，4-DB、2，4-DEP、二氯丙烷、非诺普、有机肥料、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)，萘乙酰胺、1-萘酚、环氧乙酸、环烷酸钾、环烷酸钠和和具有生长促进功能的微生物，如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根部瘤菌属(Rhizobium Frank)、木霉菌属(Trichoderma)等；细胞分裂素，如2IP、苄基腺嘌呤激动素、玉米素；脱叶剂、如氰胺钙、二甲基吡啶、乙硫磷、硫磷、甲氧磺隆、五氯苯酚、噻苯隆和/或三丁磷；乙烯抑制剂，如鸟甘氨酸和1-甲基环丙烯；乙烯释放剂，如ACC，依他赛，乙烯利和乙二肟；生长抑制剂，如脱落酸、安替米多、布曲林、甲萘威、氯仿、氯丙嗪、丁酮古拉克、氟美他林、酰氟酰胺、膦酰胺、草甘膦、异吡啶酚、茉莉酮酸、马来酰肼、甲哌喹、哌普坦尼、丙氢茉莉酮、丙嗪、2，3，5-三碘苯甲酸；吗啡肽，如氯芴、氯芴醇、二氯芴醇、芴醇；生长延缓剂，如氯甲喹、达米酰肼、氟普利多、甲流地德、多效唑、环唑、四环素、烯效唑、安昔多尔、三己酸乙酯和孕二酮-Ca；生长刺激剂，如芸苔素内酯、氯吡脲、恶霉灵、2-氨基-6-氧嘌呤衍生物、吲哚啉酮衍生物、3，4-二取代马来酰亚胺衍生物和稠合氮杂酮衍生物。还包括其它活性成分，例如苯并氟、丁胺磷、香芹酮、环丁肽、氯芬赛、氯氧乙酸、环苯胺、环己酰亚胺、环氧氯丙烷、乙氯乙酸、乙烯、哒嗪磷、庚炔、全反射、茚虫腈、卡瑞他嗪、砷酸铅、甲磺威、丙己二酮、吡丹农、辛托芬、三联苯酚和曲奈沙帕。

所述驱避剂包括但不限于N，N-二乙基-3-甲基苯甲酰胺(DEET)、乙基己二醇、邻苯二甲酸二甲酯、3，4-二氢-2，2-二甲基-4-氧代-2H-吡喃-6-羧酸丁酯、二氢萘内酯和/或二氢萘内酯衍生物。

所述引诱剂包括信息素和干扰素，具体包括：Z-5-癸烯基乙酸酯、乙酸十二烷基酯、乙酸Z-7-十二烯酯、E-7-十二烯基乙酸酯、乙酸Z-8-十二烯酯、E-8-十二烯基乙酸酯、乙酸Z-9-十二烯酯、E-9-十二烯基乙酸酯、E-10-十二烯基乙酸酯、11-十二烯基乙酸酯、雌二醇、丁香酚、吲哚等。

所述生物农药包括苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌、球孢白僵菌、棉铃虫核型多角体病毒、木霉菌、金龟子绿僵菌、多粘类芽孢杆菌、甜菜夜蛾核型多角体病毒、斜纹夜蛾核型多角体病毒、淡紫拟青霉、荧光假单胞杆菌、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、甘蓝夜蛾核型多角体病毒、蜡质芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、厚孢轮枝菌、哈茨木霉菌、解淀粉芽孢杆菌等微生物和/或其代谢物在内的微生物源生物农药；还包括苦参碱、印楝素、鱼藤酮、蛇床子素、除虫菊酯、藜芦碱、烟碱、香芹酚、丁子香酚、小檗碱、苦皮藤素、大黄素甲醚、异硫氰酸烯丙酯、桉油精、狼毒素、雷公藤甲素、莪术醇、甾烯醇、螺威、大蒜素、补骨脂种子提取物、茶皂素、互生叶白千层提取物、银杏果提取物植物源生物农药等。

所述线虫为抗线虫动物门的所有线虫。

进一步地，所述线虫包括无尾感器纲(Aphasmida)和尾感器纲(Phasmida)的所有线虫。

进一步地，所述无尾感器纲线虫包括色矛目(Chromadorida)、疏毛目(Araeolaimida)、带线虫目(Desmocolecida)、单宫目(Monohysterida)、刺嘴目(Enoplida)、单齿目(Monochida)、矛线目(Dorylaimida)、毛首目(Trichocephalida)、索虫目(Mermithida)所有线虫。

进一步地，所述尾感器纲(Phasmida)包括双胃线虫目(Diplogasterida)、垫刃线虫目(Tylenchida)、旋尾目(Spiruria)、小杆目(Rhabditia)、圆线虫目(Strongylida)、蛔虫目(Ascaridia)中所有线虫。

进一步地，所述垫刃线虫目包括垫刃线虫属(Tylenchus Bastian)、粒线虫属(Anguina Scopoli)、茎线虫属(Ditylenchus Filipjev)、刺线虫属(BelonolaimusSteiner)、矮化线虫属(Tylenchorhynchus Cobb)、短体线虫属(Pratylenchus Filipjev)、潜根线虫属(Hirschmanniella Luc&Goodey)穿孔线虫属(Radopholus Thorne)、假根结线虫属(Nacobbus Thorne&Allen)、根结线虫属(Meloidogyne Goeldi)、真滑刃线虫属(Aphelenchus Bastian)、滑刃线虫属(Aphelenchoides Fuscher)、伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus Fuchs)等。

进一步地，所述矛线线虫目包括长针线虫属(Longidorus Micoletzky)、剑线虫属(Xiphinema Cobb)等。

进一步地，所述线虫优选为伞滑刃属所有线虫。

进一步的，所述伞滑刃属包括伪伞滑刃线虫(B.fraudulentus)、锥尾伞滑刃线虫(B.conicaudatus)、鲍嘉伞滑刃线虫(B.baujardi)、豆伞滑刃线虫(B.doui)、新加坡伞滑刃线虫(B.singaporensis)、大尖尾伞滑刃线虫(B.macromucronatus)、非洲伞滑刃线虫(B.africanus)、松伞滑刃线虫(B.piniperdae)、鞘翅伞滑刃线虫(B.elytrus)、小松伞滑刃线虫(B.pinasteri)、荒漠伞滑刃线虫(B.eremus)、维尔伞滑刃线虫(B.willi)、中华伞滑刃线虫(B.sinensis)、拟松材线虫(B.mucronatus)、松材线虫(B.xylophilus)等。

进一步地，所述线虫更优选为松材线虫。

一种抗线虫的方法，所述方法包括对被线虫侵染的植物、种子和/或土壤等需要抗线虫的场地施用上述抗线虫产品和/或抗线虫组合物，以此防治、灭杀不需要的线虫。

上述制剂和/或产品可以使用现有技术中已知的方法来施加。确切地说，上述制剂和/或产品可以施加到植物、植物部分或植物周围。本发明所述植物是指所有植物和植物群体，包括所需和非所需的野生植物或农作物植物(包括天然产生的农作物植物)。所述农作物植物可以是由常规植物育种、由生物技术和基因改造方法、或由上述方法的组合获得的植物。本发明所述植物部分是指植物在地面上方和/或下方的所有部分和器官，如茎、枝、叶、花、根、果实、种子等。

上述抗线虫制剂和/或抗线虫产品可施用于土壤。某种情况下，在种植前将抗线虫组合物施用到土壤中；某种情况下，在种植后将抗线虫剂和/或抗线虫产品施用到土壤中；某种情况下，使用滴灌系统将抗线虫剂和/或抗线虫产品施用到土壤上；某种情况下，使用喷洒系统将抗线虫剂和/或抗线虫产品施用于土壤；某种情况下，将抗线虫剂和/或抗线虫产品耕作到土壤中或在沟渠中施用。

与现有技术比，本发明的有益效果如下：

本发明通过实验证明，本发明提供的EC200816产吲哚金黄杆菌，其发酵液、提取物、代谢产物及分离自上述发酵液、提取物、代谢产物的化合物，均具有抗线虫作用，能够抑制各类线虫的发展(包括发育异常、死亡率、摄食减少、交配中断和/或丧失繁殖能力)，尤其是对松材线虫起到显著的抑制作用。本发明提供的EC200816产吲哚金黄杆菌，可利用其制备为相应的可实际应用的产品，在医药、农药和清洁产品领域中的应用潜能非常巨大。

附图说明

图1为本发明EC200816的革兰氏染色结果图(*1000)。

图2本发明EC200816的16s rDNA序列进化树分析图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

定义

本发明所用术语“包括”、“包含”、“具有”、或其任何其它变体意欲覆盖非排它性包含物，受任何明确指出的限制。例如，包括元素列表的组合物，混合物，工艺或方法不一定限于那些元素，而是可以包括没有明确列出的或这种组合物，混合物，工艺或方法固有的其它元素。

本发明所述“抗线虫”是指抑制线虫的发展(包括发育异常、死亡率、摄食减少、交配中断和/或丧失繁殖能力)。

本发明所述“耐药”(resistance to drug)也称抗药性，系指微生物对于化疗药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。

本发明所述“衍生自”是指：自指定来源直接分离或获得，或作为替代方案，具有自指定来源分离或获得的物质或有机体的识别特征；在所述指定来源是有机体的情况下，“衍生自”是指其可以自所述有机物本身或自用于培养或生长所述有机体的培养基分离或获得。

本发明所述“全细胞培养液”是指含有细胞和培养基两者的液体培养物。如果细菌在培养板上生长，那么可以在水中或其它液体(全部培养物)中采集细胞。

本发明所述“上清液”是指当生长在培养液中的虫体或细胞，在其本身的培养液或另一液体中，自采集和离心、过滤、沉降或其它手段，经移除虫体或细胞时剩余的液体。

本发明所述“滤液”或“发酵液”是指已经穿过膜的全培养物或全细胞培养液的液体，其中不含活的细胞。

本发明所述“提取物”是指由溶剂(水、清洁剂、缓冲剂、有机溶剂)自细胞移除，且经离心、过滤或其它方法自细胞分隔的液体物质。

本发明所述“代谢物”是指自具有抗线虫、尤其是具有抗松材线虫活性的微有机体获得的微有机体其上清液、滤液、发酵液、提取物中化合物、物质或副产品。

本发明所述“经分离的化合物”，是指基本上不含其它不被需要的化合物或物质、或是其它不被需要的化合物或物质控制在所需的含量范围内；例如，至少为约10％纯净、优选为约20％纯净、更优选约30％纯净、更优选约40％纯净、更优选约50％纯净、更优选约60％纯净、更优选约70％纯净、更优选约80％纯净、更优选约90％纯净、更优选地约95％纯净、最优选约＞97％纯净；所述分析方法包括但不限于萃取法、色谱法和电泳法。

本发明所述“杀虫剂”是衍生自增加植物害虫死亡率或抑制其增长率的生物产品或化学物质的物质，包括但不限于杀线虫剂、除藻剂、除草剂、杀昆虫剂、植物杀真菌剂、植物杀菌剂和/或植物杀病毒剂。

一种产吲哚金黄杆菌，该产吲哚金黄杆菌命名EC200816，于2020年11月24日在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)登记保藏，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61309，该菌株的分类命名为Chryseobacteriumindologenes。

实施例1 EC200816菌的分离鉴定

1.EC200816菌的分离培养

(1)供试松材线虫来源与松材线虫的扩大培养

来源：实验室长期传代培养的M型松材线虫；

培养：称取形态完整的干玉米粒300g常温下用清水浸泡2天后分装进10只容量为250mL的锥形瓶中，分装好后用透气封口膜封口，放入湿热高压灭菌锅120℃灭菌30分钟。灭菌完成后待其自然冷却至室温后在无菌条件下接种适量的灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，25℃、70％RH人工气候箱内避光培养5-7天后；向每个锥形瓶中接种松材线虫3000-5000头，25℃、70％RH人工气候箱内避光继续培养8-15天后可收获大量M型松材线虫。

(2)EC200816菌的分离

EC200816菌从M型松材线虫中分离得到，具体分离方法如下：

①线虫处理：将适量无菌水加入至(1)中接种过M型松材线虫的锥形瓶中，轻轻晃动使松材线虫悬浮于水中，然后倒出水溶液备用；从水溶液中取2000条左右M型松材线虫至1.5mL离心管中，2000rpm/min离心2min，弃上清液；然后加入1mL消毒液(含1mg/mL链霉素和0.02mg/mL放线菌酮)混匀，静置消毒10min，然后2000rpm/min下离心2min，弃上清液；然后加入1mL无菌水清洗，2000rpm/min离心2min，弃上清液；反复清洗三次，于最后一次加入200uL无菌水重悬线虫，得M型松材线虫悬浮液原液。

②接种平板：将M型松材线虫悬浮液原液经无菌水逐级稀释10倍、100倍、1000倍，分别取M型松材线虫悬浮液原液及各级稀释液20uL均匀涂布于NA琼脂平板培养基上，置于25℃，70％RH，黑暗下倒置培养。

③划线分离菌株：挑选平板上具有典型形态特征的单菌落或菌苔，在NA琼脂平板培养基上划线分离，25℃下培养，观察菌落生长情况；将分离的单菌落再次划线分离，25℃下培养，直到出现长势良好，形态特征典型的单菌落。

④纯化菌株：挑取筛选出的单菌落至1mL NB肉汤培养基中，25℃，200rpm/min培养过夜(视生长状况而定，约1个麦氏浊度)；取培养过夜的菌悬液，用生理盐水稀释1000倍，得稀释液；取稀释液20uL涂布于NA琼脂平板培养基上，25℃下培养48小时，观察单菌落生长状况并记录菌落形态特征。

上述培养基组成：

NB营养肉汤培养基：10g/L蛋白胨，3g/L牛肉浸出粉，5g/L氯化钠；北京奥博星生物技术有限公司，批号：20200326；

NA琼脂平板培养基：10g/L蛋白胨，3g/L牛肉浸出粉，5g/L氯化钠，17g/L琼脂。

(3)EC200816菌的培养条件筛选：

最适温度的筛选：将EC200816接种至NB肉汤培养基中，28℃，180rpm/min摇床培养，得全细胞培养液；取摇床培养过夜的EC200816全细胞培养液用无菌水稀释至0.5麦氏浊度，无菌棉拭子蘸取稀释的全细胞培养液，均匀涂布于NA琼脂平板培养基上培养24小时，设定培养温度分别为4、25、30、37、45℃有氧环境，对菌株的生长条件进行测试。测试结果显示：在25-37℃下，细菌生长良好；4℃和45℃均不生长，45℃放置培养48h再放回25℃，细菌也不生长，说明EC200816对温度敏感。

最适pH值的筛选：配制NA琼脂培养基，用1M NaOH调节pH值为7.19，8.33，9.04，10.10，115℃，高压灭菌30min，待冷却至50℃左右倾倒平板，配制成pH值为7.19，8.33，9.04，10.10的培养基平板。取上述稀释的全细胞培养液，无菌棉拭子蘸取全细胞培养液，均匀涂布于各pH值的NA琼脂平板培养基上，30℃下倒置培养48小时；测试结果显示pH值在7.0和8.0时，EC200816生长良好，pH值为9.0时，EC200816生长缓慢，pH值为10.0时，EC200816不生长。

2、EC200816菌的保存

用NB肉汤配置50％甘油溶液，高温灭菌后待用。将EC200816接种至NB肉汤培养基中，28℃，180rpm/min摇床培养过夜，以1:1的体积比与灭菌的50％甘油溶液混匀，置于-20℃保存(长时间储存可转置于-80℃保存)。

复苏菌种时，取出一管保藏管，室温下溶解后，以1％接种量接种至NB肉汤培养基中培养24h活化，或用接种环取一环全细胞培养液在NA琼脂平板培养基上划线培养。

3、EC200816菌的鉴定

(1)形态特征

将上述筛选得到的EC200816菌进行革兰氏染色，结果为阴性，如图1所示。EC200816菌的单菌落为圆形微凸，呈现金黄色、半透明状，边缘整齐，表面光滑湿润。最适温度和pH值实验表明，菌株生长温度在25℃-37℃均可以生长，以30℃为最佳生长温度；在pH7.0–8.0范围的NA琼脂平板培养基上皆可生长。氧化酶实验阳性，KOH实验有拉丝现象显示为G-，过氧化氢酶实验有气泡产生显示为阳性，具体结果如表1所示。

表1 EC200816菌特点

特性	表现
		革兰氏染色	-
细菌形态	圆形微凸
		芽孢	-
培养条件	有氧
		温度生长范围	25-37℃
最适温度	30℃
		pH值生长范围	7.0-8.0
最适pH值	7.2
		KOH实验	-(黄色菌落变为红色)
过氧化氢酶实验	+
		氧化酶实验	+
来源	M型松材线虫

(2)16S rDNA分析

将经纯化后的菌株交给生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rDNA送检测序。

测序序列如下：

TCTTGAGAGCGGCGTACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTGCCTTTATCTGGGGGATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCCCATAATATACTGGATGGCATCATTCGGTATTGAAAACTCCGGTGGATAGAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCTGCGATCTTTAGGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTGAGAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTGTATAGGGATAAACCTACTCTCGTGAGAGTAGCTGAAGGTACTATACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTCAGTGGTGAAATCTCACAGCTTAACTGTGAAACTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTGTTGTTGAAGTAGCTGGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTTACTAAGCAACAACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCTAACTCGTTTTTGGGTTTTCGGATTCAGAGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGGGAAATGACAGGTTTAGAAATAGACTTTTCTTCGGACATTTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTCACTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGGACTCTAGTGAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGCCACACACGTAATACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGT

经鉴定EC200816为金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)。

与金黄杆菌属公认的模式菌株建立基于16S rDNA的系统发育树，在NCBI核酸数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中下载临近菌株的16S rDNA序列，利用生物学聚类软件MEGA7.0进行系统发育树的构建，计算遗传距离，利用N-J法建立近缘种的系统发育树，发育树显示EC200816没有与其他菌株在同一小分支，与之最为接近的是Chryseobacterium indologenes strain D4 JX515610.1与最临近菌株相似性为99.47％，显示EC200816为产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)，详见图2所示。

实施例2 EC200816菌的药物敏感性试验

1.药物处理

链霉素(streptomycin，STR)：使用硫酸链霉素配制成1280μg/mL的母液，使用二倍稀释法逐级稀释成640、320、160ug/mL的药液。

庆大霉素(Gentamicin，GEN)：使用硫酸庆大霉素配制成1280μg/mL的母液，使用二倍稀释法逐级稀释成640、320、160μg/mL的药液。

2.药物敏感性实验

配制MHA(牛肉粉6g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酸水解酪蛋白17.5g/L，琼脂17g/L)琼脂平板培养基，采用纸片扩散法检测药物敏感性实验。

药敏纸片处理：取无菌空白药敏纸片放置于无菌干净的培养皿上，取20uL各待测药液滴加于药敏纸片上，使药敏纸片含药量为25.6、12.8、6.4μg/mL超净台内自然风干，以无菌水作为空白对照。

含菌液平板处理：用无菌棉拭子蘸取对数期的EC200816全细胞培养液，均匀涂布于MHA平板上，在超净台内稍稍干燥。

将风干的药敏纸片轻轻贴于含EC200816全细胞培养液的平板上，纸片贴上后不可再移动，每片药敏纸片的间距>2cm，30℃倒置培养24h。

3.实验结果

观察抑菌圈大小，以此判断EC200816对药物的敏感性；由结果可知，EC200816对链霉素及庆大霉素耐药，实验结果如下：

表2 EC200816菌菌株药敏实验结果

药物	药物浓度(μg/disc)	抑菌圈(mm)	敏感度
				链霉素	25.6	0	耐药
链霉素	12.8	0	耐药
				链霉素	6.4	0	耐药
庆大霉素	25.6	0.9	耐药
				庆大霉素	12.8	0	耐药
庆大霉素	6.4	0	耐药

实施例3 EC200816菌的全细胞培养液和发酵液的抗松材线虫活性实验

1.实验材料

供试虫源：实验室长期传代培养的R型松材线虫；

培养：称取形态完整的干玉米粒300g常温下用清水浸泡2天后分装进10只容量为250mL的锥形瓶中，分装好后用透气封口膜封口，放入湿热高压灭菌锅120℃灭菌30分钟。灭菌完成后待其自然冷却至室温后在无菌条件下接种适量的灰葡萄孢菌Botrytis cinerea，25℃、70％RH人工气候箱内避光培养5-7天后向每个锥形瓶中接种R型松材线虫3000-5000头，25℃、70％RH人工气候箱内避光继续培养8-15天后可收获大量R型松材线虫。

线虫处理：待灰葡萄孢玉米粒锥形瓶培养基中R型松材线虫爬满瓶壁后，将适量无菌水加入至锥形瓶中，轻轻晃动使R型松材线虫悬浮于水中，然后倒出水溶液备用，得R型松材线虫悬浮液。

本实施例中所述新NB肉汤培养基为：0.25％葡萄糖+25％NB肉汤培养基；

NA平板培养基为：NB肉汤培养基+1.7％琼脂粉。

2.实验处理

(1)线虫处理

将无菌水洗出的R型松材线虫悬浮液进行计数并检查死亡率，死亡率低于5％才可用于生物活性检测试验。取线虫悬浮液(含R型松材线虫约4000条)至离心管中，2000rpm/min，离心2min，去除上清液，加入1mL消毒液(含1mg/mL链霉素和0.02mg/mL放线菌酮)，静置消毒10分钟，2000rpm/min，离心2min，弃上清液，加入1mL无菌水重悬，2000rpm/min，离心2min，弃上清液，无菌水清洗三次，最后弃上清液，得线虫液。

(2)全细胞培养液处理

从NA琼脂平板培养基上挑取EC200816单菌落至1mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养5～6h后，从中取100uL接种至10mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养24h，得EC200816全细胞培养液1。

(3)发酵液处理

从NA琼脂平板培养基上挑取EC200816单菌落至1mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养5～6h后，从中取100uL接种至10mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养3d。取培养3d的EC200816全细胞培养液，12000rpm/min，离心5min，取上清液经0.22um微孔滤膜过滤除菌，得EC200816发酵液1。同时以自身发酵培养3d的新NB肉汤培养基经0.22um微孔滤膜过滤除菌得到的新NB肉汤培养基滤液作为空白对照。

(4)生测试验

取无菌水、新NB肉汤培养基、EC200816全细胞培养液1、新NB肉汤培养基滤液和EC200816发酵液1各500uL重悬线虫液，轻轻吹打混匀后转移至24孔细胞板中，于25℃，70％RH，无光条件下培养，得5种线虫混合液。

(5)计数调查

将(4)中得到的5种线虫混合液培养一定时间后，各取10微升(取样前用移液枪轻轻吹打使混合液中的线虫分布均匀)，然后涂片后在光学显微镜下观察并计数线虫死亡数量并做好记录，重复三次。

(6)数据处理

死亡率＝(死虫数/总虫数)*100；

平均死亡率＝三次计数死亡率/3；

校正死亡率＝(样品组平均死亡率-培养基对照组平均死亡率)/(1-培养基对照组平均死亡率)*100。

3.实验结果

EC200816菌全细胞培养液抗线虫活性的实验结果如表3所示。

表3 EC200816菌全细胞培养液抗线虫活性

表3中可以看出：EC200816全细胞培养液1处理R型松材线虫，全细胞培养液1和松材线虫共培养24h时，全细胞培养液1的杀虫率大于90％，48h达到100％的效果。

EC200816菌发酵液的抗线虫活性的实验结果如表4所示。

表4 EC200816菌发酵液抗松材线虫活性

表4中可以看出：EC200816发酵液1处理R型松材线虫，和线虫共培养24h和48h时，发酵液1的杀虫率大于80％，此结果可证明EC200816发酵液1具有抗松材线虫活性，推测该发酵液中含有一种或几种具有抗松材线虫活性的物质。

实施例4培养基改变对于EC200816菌的全细胞培养液和发酵液的抗松材线虫活性实验

1.实验材料

供试虫源：实验室长期传代培养的R型松材线虫；

线虫处理：待灰葡萄孢玉米粒培养基中R型松材线虫爬满瓶壁后，将适量无菌水加入至灰葡萄孢菌-玉米粒培养基中，轻轻晃动使R型松材线虫悬浮于水中，然后倒出水溶液备用，得R型松材线虫悬浮液。

本实施例中所述新NB肉汤培养基为：0.25％葡萄糖+50％NB培养基；

NA琼脂平板为：NB培养基+1.7％琼脂粉。

2.实验处理

(1)线虫处理：同实施例3

(2)全细胞培养液处理

从NA琼脂平板培养基上挑取EC200816单菌落至1mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养5～6h后，从中取100uL接种至10mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养24h，得EC200816全细胞培养液2。

(3)发酵液处理

从NA琼脂平板培养基上挑取EC200816单菌落至1mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养5～6h后，从中取100uL接种至10mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养3d。取培养3d的EC200816全细胞培养液，12000rpm/min，离心5min，取上清液经0.22um微孔滤膜过滤除菌，得EC200816发酵液2。同时以自身发酵培养3d的新NB肉汤培养基经0.22um微孔滤膜过滤除菌，得到的新NB肉汤培养基滤液作为空白对照。

(4)生测试验：

取无菌水、新NB肉汤培养基、EC200816全细胞培养液2、新NB肉汤培养基滤液和EC200816发酵液2各500uL重悬线虫液，轻轻吹打混匀后转移至24孔细胞板中，于25℃，70％RH，无光条件下培养，得5种线虫混合液。

(5)计数调查：同实施例3

(6)数据处理：同实施例3

3.实验结果

改变培养基后，EC200816菌全细胞培养液的抗线虫活性的实验结果如表5所示。

表5培养基改变后EC200816菌的全细胞培养液的抗线虫活性

由上表可知，EC200816全细胞培养液2处理R型松材线虫，全细胞培养液2和线虫共培养5h时，全细胞培养液2的杀虫率就已经达到98％，抗线虫效果显著。

改变培养基后，EC200816菌发酵液的抗线虫活性的实验结果如表6所示。

表6培养基改变后EC200816菌发酵液的抗线虫活性

由上表可知，EC200816发酵液2处理R型松材线虫，发酵液2和线虫共培养5h，发酵液2的杀虫率也达到98％。

与实施例3相比，本实施例增加了NB培养基的含量，结果表明本实施例中EC200816培养3d发酵液的抗R型松材线虫效果优于实施例3中的，推测是由于培养基浓度的改变，使EC200816发酵液中的抗R型松材线虫活性物质含量升高。

实施例5 EC200816菌的抗松材线虫活性实验

1.实验材料

供试虫源：实验室长期传代培养的R型松材线虫；

培养基：新NB肉汤培养基：0.25％葡萄糖+50％NB培养基，NA平板：NB培养基+1.7％琼脂粉。

2.实验处理

(1)线虫处理：同实施例3

(2)菌体处理

从NA琼脂平板培养基上挑取EC200816单菌落至1mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养5～6h后，从中取100uL接种至10mL新NB肉汤培养基中，25℃，180rpm/min摇床培养24h，得EC200816全细胞培养液，取500uL EC200816全细胞培养液，12000rpm/min，离心10min，弃上清液，取500uL无菌水重悬，得EC200816菌体水溶液。

(3)生测试验

取无菌水、EC200816菌体水溶液各500uL重悬线虫液，轻轻吹打混匀后转移至24孔细胞板中，于25℃，70％RH，无光条件下培养。

(4)计数调查：同实施例3

(5)数据处理：同实施例3

3.实验结果

EC200816菌体水溶液的抗线活性见表7。

表7 EC200816菌体水溶液的抗线活性

由上表可知，EC200816菌体水溶液处理R型松材线虫，菌体和线虫共培养24h时，EC200816菌体对线虫杀虫活性较低，由此推断，EC200816杀虫活性成分大部分来自于全细胞培养液或发酵液中产生的活性物质。

实施例6 EC200816发酵液的复配活性试验

1.实验材料

本实施例采用的EC200816发酵液为：从NA平板上挑取EC200816单菌落至1mL新NB肉汤培养基(0.25％葡萄糖+50％NB培养基)中，25℃，180rpm/min摇床培养5～6h，取100uL接种至10mL新NB肉汤培养基(0.25％葡萄糖+50％NB培养基)中，25℃，180rpm/min摇床培养3d。取培养3d的EC200816菌悬液，12000rpm/min，离心5min，取上清液经0.22um微孔滤膜过滤除菌，得到EC200816发酵液。

本实施例提供了几种农药制剂，包括按质量百分比计的如下组分：

(1)呋虫胺2.0％、苯甲酸钠0.4％、丙三醇10.0％、EC200816发酵液余量。

(2)苦参碱0.5％、苯甲酸钠0.4％、丙三醇10.0％、EC200816发酵液余量。

(3)阿维菌素0.18％、苯甲酸钠0.4％、丙三醇10.0％、EC200816发酵液余量。

供试虫源：待接入R型松材线虫的灰葡萄孢玉米粒培养基中R型松材线虫爬满瓶壁后，用无菌水洗出，得线虫悬浮液，用于实验。

2.制备方法

上述农药制剂的制备方法具体包括如下步骤：

(1)将呋虫胺投入到EC200816发酵液中，用磁力搅拌器溶解混匀，再加入苯甲酸钠，丙三醇，继续搅拌混匀，用EC200816发酵液定容，混匀后静置过夜，即得农药制剂1。

(2)将苦参碱投入到EC200816发酵液中，用磁力搅拌器溶解混匀，再加入苯甲酸钠，丙三醇，继续搅拌混匀，用EC200816发酵液定容，混匀后静置过夜，即得农药制剂2。

(3)将1.8％阿维菌素原油10mL投入到50mL EC200816发酵液中，用磁力搅拌器混匀，再加入苯甲酸钠，丙三醇，继续搅拌混匀，用EC200816发酵液定容至100mL，混匀后静置过夜，即得农药制剂3。

3.实验处理

(1)线虫处理：同实施例3

(2)生测试验

空白对照1：EC200816发酵液中加入0.4％苯甲酸钠，10.0％丙三醇混匀；

空白对照2：50％EC200816发酵液中加入0.4％苯甲酸钠，10.0％丙三醇混匀，纯水补足；

取纯水，空白对照1，空白对照2，农药制剂1，农药制剂2，农药制剂3各待测样品500uL，重悬线虫液，吹打混匀后转移至24孔细胞板中，25℃，70％RH，无光条件下培养。

(3)计数调查：同实施例3

(4)数据处理：同实施例3

4.实验结果

各组EC200816发酵液的复配制剂的抗松材线虫活性见表8。

表8 EC200816发酵液的复配抗线活性

由上表可知，空白对照1和2在2h时的杀虫活性为80％左右，而农药制剂1、2、3在2h时的杀虫活性均达到了90％，尤其是农药制剂1，2h时的杀虫活性就达到了99％，由此结果可知EC200816发酵液与呋虫胺、苦参碱和阿维菌素均有协同杀虫的作用。

序列表

<110> 沈阳恩柽研究院有限公司

<120> 产吲哚金黄杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcttgagagc ggcgtacggg tgcggaacac gtgtgcaacc tgcctttatc tgggggatag 60

cctttcgaaa ggaagattaa taccccataa tatactggat ggcatcattc ggtattgaaa 120

actccggtgg atagagatgg gcacgcgcaa gattagatag ttggtgaggt aacggctcac 180

caagtctgcg atctttaggg ggcctgagag ggtgatcccc cacactggta ctgagacacg 240

gaccagactc ctacgggagg cagcagtgag gaatattgga caatgggtga gagcctgatc 300

cagccatccc gcgtgaagga cgacggccct atgggttgta aacttctttt gtatagggat 360

aaacctactc tcgtgagagt agctgaaggt actatacgaa taagcaccgg ctaactccgt 420

gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg 480

gtccgtaggc ggatctgtaa gtcagtggtg aaatctcaca gcttaactgt gaaactgcca 540

ttgatactgc aggtcttgag tgttgttgaa gtagctggaa taagtagtgt agcggtgaaa 600

tgcatagata ttacttagaa caccaattgc gaaggcaggt tactaagcaa caactgacgc 660

tgatggacga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 720

cgatgctaac tcgtttttgg gttttcggat tcagagacta agcgaaagtg ataagttagc 780

cacctgggga gtacgttcgc aagaatgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840

cggtggatta tgtggtttaa ttcgatgata cgcgaggaac cttaccaagg cttaaatggg 900

aaatgacagg tttagaaata gacttttctt cggacatttt tcaaggtgct gcatggttgt 960

cgtcagctcg tgccgtgagg tgttaggtta agtcctgcaa cgagcgcaac ccctgtcact 1020

agttgccatc attaagttgg ggactctagt gagactgcct acgcaagtag agaggaaggt 1080

ggggatgacg tcaaatcatc acggccctta cgccttgggc cacacacgta atacaatggc 1140

cggtacagag ggcagctaca cagcgatgtg atgcaaatct cgaaagccgg tctcagttcg 1200

gattggagtc tgcaactcga ctctatgaag ctggaatcgc tagtaatcgc gcatcagcca 1260

tggcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcaagcca tggaagt 1317

Claims

1.一种产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)菌株，其特征在于：所述产吲哚金黄杆菌命名为EC200816，已于2020年11月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61309。

2.根据权利要求1所述产吲哚金黄杆菌菌株，其特征在于：所述产吲哚金黄杆菌是从松材线虫中分离，然后经培养后得到。

3.一种权利要求1所述的产吲哚金黄杆菌的应用，其特征在于：所述产吲哚金黄杆菌培养物在抗线虫中的应用；

所述产吲哚金黄杆菌培养物为产吲哚金黄杆菌的全细胞培养液或发酵液。

4.一种抗线虫制剂，其特征在于：所述抗线虫制剂的活性成分含以权利要求1所述的产吲哚金黄杆菌培养后的全细胞培养液或发酵液。

5.根据权利要求4所述的抗线虫制剂，其特征在于：所述抗线虫制剂为活性成分和农业上可接受的载体；其中，活性成分占产品质量的 0.01-99% 。

6.根据权利要求4或5所述的抗线虫制剂，其特征在于：所述活性成分中还包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂、生长调节剂、驱避剂或引诱剂。

7.根据权利要求4所述的抗线虫制剂，其特征在于：所述线虫为抗线虫动物门的所有线虫。

8.根据权利要求7所述的抗线虫制剂，其特征在于：所述线虫为伞滑刃线虫属所有线虫。

9.根据权利要求8所述的抗线虫制剂，其特征在于：所述线虫为松材线虫。