JP3773265B2 - バシラス農薬活性の増強因子を製造する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、１９９２年１１月５日に出願された出願番号０７／９７１，７８６の一部継続出願である、１９９２年１２月１４日に出願された出願番号０７／９９０，２０２の一部継続出願である、１９９３年７月２０日に出願された出願番号０８／０９５，２４０の一部継続出願である、１９９３年１１月３日に出願された出願番号０８／１４６，８５２の一部継続出願である、１９９４年８月２３日に出願された出願番号０８／２９５，２８３の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、バシラス（Bacillus）関連農薬、化学的農薬および／または農薬の性質を有するウィルスの農薬活性を増強する因子を同定して得る方法に関する。
発明の背景
毎年、農業、林業および公衆衛生に有害な病害虫（pest）は、何百万ドルもの損失を引き起こす。種々の戦略を用いてこのような病害中を防除してきた。
一つの戦略は、広い範囲またはスペクトルの活性を有する化学農薬の使用である。しかしながら、化学農薬を用いると多くの不利益がある。詳しくは、それらの広範な活性スペクトルのゆえに、これらの農薬は、有益な昆虫および、破壊的な病害虫に対する寄生虫のような非標的生体を駆除する可能性があるからである。更に、化学農薬は、しばしば、動物およびヒトに対し毒性である。更には、標的にした病害虫は、このような物質に繰り返し露出された場合、しばしば、耐性を獲得する。
別の戦略は、昆虫、菌類および雑草の害を防除する生物農薬の使用に関連する。生物農薬は、天然に存在する病原体および／またはこれらの病原体により産生された物質である。生物農薬を用いる有利性は、一般的に、化学農薬と比較して全体的に非標的生体および環境に害が少ないということである。
１．Bacillus thuringiensis（バシラス・スリンジェンシス）
最も広く用いられる生物農薬はBacillus thuringiensisである。Bacillus thuringiensisは、自然界、特に土壌および、昆虫の多い環境に広く分布している、運動性の桿状のグラム陽性細菌である。胞子形成中に、Bacillus thuringiensisは、チョウ目、ハエ目、および甲虫目の感受性昆虫の幼虫にとって摂食により殺虫性となる副胞子（parasporal）結晶封入体を産生する。封入体は、形状、数、および組成において変化することができる。これらは、サイズが２７−１４０ｋＤａの範囲にあってもよいデルタ−内毒素類と呼ばれる１つ以上の蛋白質から成る。殺虫性デルタ−内毒素類は、一般的に、幼虫の腸内でプロテアーゼ類により、昆虫の中腸の破壊、および最終的に死を引き起こす、より小さい（先端を切断した）毒性のポリペプチドに変換される（Hofte and Whiteley，1989，Microbiological Reviews 53:242-255）。
林業、農業、および公衆衛生領域において生物農薬として広く用いられるいくつかのBacillus thuringiensis菌株がある。Bacillus thuringiensis subsp. kurstakiおよびBacillus thuringiensis subsp. aizawaiは、チョウ目に特異的なデルタ−内毒素類を産生する。甲虫目に特異的なデルタ−内毒素類は、Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionisにより産生される（Krieg等，1988，米国特許第４，７６６，２０３）。更に、Bacillus thuringiensis subsp. israelensisは、ハエ目に特異的なデルタ−内毒素類を産生する（Goldberg，1979，米国特許第４，１６６，１１２）。
ハエ目の害虫に特異的な他のBacillus thuringiensis菌株も述べられてきた。ハエ目およびチョウ目に毒性である、Bacillus thuringiensis分離菌株が、開示されてきた（Hodgman等，1993，FEMS Microbiology Letters 114:17-22）。この分離菌株から得た精製した結晶デルタ−内毒素のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＣｒｙＩＡ（ｂ）、ＣｒｙＩＢ、およびＣｒｙＩＩＡトキシンに関連する３種の蛋白質種を示した。１４０、１２２、７６、７２、および３８ｋＤａの分子量を有する蛋白質から成る、ハエ目に活性な結晶を産生するBacillus thuringiensis分離菌株も開示されてきた（Payne，1994，米国特許第５，２７５，８１５）。ＥＰＯ ４８０，７６２は、ハエ目害虫に対しそれぞれ活性である５種のB.t.菌株を開示しており、また、それぞれ、独特の結晶デルタ−内毒素のパターンを有する。
チョウ目、甲虫目、およびハエ目以外の害虫（pest）に対して農薬活性を有するいくつかのBacillus thuringiensis菌株が述べられてきた。線虫類に対して毒性であるデルタ−内毒素を産生する５種のBacillus thuringiensis菌株が開示されてきた（Edward、Payne、およびSoares，1988，ヨーロッパ特許出願０ ３０３ ４２６ Ｂ１）。また、寄生性原生動物の宿主となっているヒトおよび動物を治療するために用いることのできるBacillus thuringiensis菌株、ＰＳ８１Ｆも開示されてきた（ThompsonおよびGaertner，1991，ヨーロッパ特許出願０ ４６１ ７９９ Ａ２）。ダニ害虫に対する活性を有するいくつかのBacillus thuringiensis分離菌株も開示されてきた。これらの分離菌株は、３５ｋＤａから１５５ｋＤａの（広い）範囲の分子量を有する蛋白質から成る結晶を産生する（Payne、Cannon、およびBagley，1992，ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９２／１９１０６）。また、ハチ目の害虫に対する活性（Payne、Kennedy、Randall、Meier、およびUick，1992，ヨーロッパ特許出願０ ５１６ ３０６ Ａ２）；カメムシ目の害虫に対する活性（PayneおよびCannon，1993，米国特許第５，２６２，１５９）；吸虫類の害虫に対する活性（Hickle、Sick、Schwab、Narva、およびPayne，1993，米国特許第５，２６２，３９９）；ならびにプチロプテラ（Phthiraptera）目の害虫に対する活性（PayneおよびHickle，1993，米国特許第５，２７３，７４６）を有するBacillus thuringiensis菌株も開示されてきた。更に、ハジラミDamalinia ovis、プチロプテラ目害虫に毒性である、オーストラリアンシープの刈り取った毛から単離したBacillus thuringiensis subsp. Kurstakiの別の菌株、ＷＢ３Ｓ−１６が開示されてきた（Drummond、Miller、およびPinnock，1992，J. Invert. Path. 60:102-103）。
デルタ−内毒素は、通常プラスミド上に位置するｃｒｙ（結晶蛋白質）遺伝子によってコードされている。ｃｒｙ遺伝子は、相対的アミノ酸相同性および殺虫特異性に基づいて６つのクラス及びいくつかのサブクラスに分類されてきた。主要なクラスは、チョウ目に特異的な（ｃｒｙＩ）；チョウ目およびハエ目に特異的な（ｃｒｙＩＩ）；甲虫目に特異的な（ｃｒｙＩＩＩ）；ハエ目に特異的な（ｃｒｙＩＶ）（HofteおよびWhiteley，1989，Microbiological Reviews 53:242-255）；甲虫目およびチョウ目に特異的な（ｃｒｙＶ遺伝子：Tailor等，1992，Molecular Microbiology 6:1211-1217により称される）；ならびに線虫類に特異的な（ｃｒｙＶおよびｃｒｙＶＩ遺伝子：Feitelson等，1992，Bio/technology 10:271-275により称される）ものである。
デルタ−内毒素類は、組み換えＤＮＡ法により生産されてきた。組み換えＤＮＡ法により生産されるデルタ−内毒素類は、結晶形態であってもよいし、なくてもよい。
Bacillus thuringiensisのいくつかの菌株は、単独で農薬活性を示すβ−外毒素Ｉ型即ちスリンジェンシン（thuringiensin）として知られている熱安定性の殺有害生物アデニン−ヌクレオチド類似体を産生することを示してきた（Sebesta等，H.D.Burges（編），Microbial Control of Pests and Plant Diseases，Academic Press，New York，1980，249-281ページ）。β−外毒素Ｉ型は、いくつかのBacillus thuringiensis培養の上澄中で発見された。これは、７０１の分子量を有し、アデノシン、グルコースおよびアラル酸（allaric acid）から成る（Farkas等，1977，Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 42:909-929;Luthy等，Kurstak（編），Microbial and Viral Pesticides，Marcel Dekker，New York，1982，35-72ページ）。その宿主の範囲には、イエバエ（Musca domestica）、Mamestra configurata Walker、ナミハダニ（Tetranychus urticae）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、およびニセナミハダニ（Tetranychus cinnabarinus）が含まれるがこれらに限定される訳ではない。β外毒素Ｉ型の毒性は、ＡＴＰとの競合によるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害によるものと考えられる。β−外毒素Ｉ型は、５種のBacillus thuringiensis菌株のｃｒｙプラスミドによりコードされていることが示されてきた（Levinson等，1990，J. Bacteriol. 172:3172-3179）。β−外毒素Ｉ型は、Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis血清型１、Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi血清型９、およびBacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis血清型１０により産生されることが見い出された。
β−外毒素ＩＩ型として分類される別のβ−外毒素が、述べられてきた（Levinson等，1990，J. Bacteriol. 172:3172-3179）。β−外毒素ＩＩ型は、Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni血清型８ａｂにより産生されることが見い出されており、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）に対して活性である。β−外毒素ＩＩ型の構造は、完全には分かっていないが、さもなければプロトンによって占められるであろう位置にリボース環への結晶があるアデニンの場所にプソイドウリジン部分がある点でβ−外毒素Ｉ型のそれと著しく異なる（Levinson，in Hickle and Finch（編），Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis，ACSシンポジウムシリーズ，Washinguton，D.C.，1990，1414-136ページ）。更に、ヌクレオシド塩基に相当するプロトンＮＭＲスペクトルで唯一のシグナル（７．９５ｐｐｍ）があり、リボース型のアノマー性蛋白質シグナル（５．７８ｐｐｍ）がない。
Bacillus thuringiensisから単離されてきた他の水溶性物質としては、イエバエの幼虫に対して毒性であるアルファ−外毒素（Luthy，1980，FEMS Microbiol. Lett 8:1-7）；その毒性作用がベータ−外毒素またはデルタ−内毒素との組み合わせでのみ発現される、レシチナーゼ、キチナーゼ、およびプロテアーゼを含む種々の酵素であるガンマ−外毒素類（Forsberg等，1976，Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality，カナダ国内評議会、環境の質に対する科学的基準に関するＮＲＣ準委員会、農薬および関連化合物ならびに生物学的現象に関する副委員会）；ベータ−外毒素と類似した構造を持ち、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）に対しやはり活性であるシグマ外毒素（Argauer等，1991，J. Entomol. Sci. 26:206-213）；ならびにアンヒドロスリンジェンシン（Prystas等，1975，Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 40:1755）が挙げられる。
２．ツウィッタマイシン（zwittermicin）
植物病原体疫病菌Phytophthora medicaginis（フィトフトーラ・メディカギニス）の生育を阻害しアルファルファの感染を減少させるBacillus cereus（バシラス・セレウス）由来の物質が単離されている（例えば、米国特許第４，８７７，７３８および４，８７８，９３６参照）。他の活性は開示されていない。以下の構造が、ツウィッタマイシンＡについて解明されてきた（He等，Tet. Lett. 35:2499-2502）：
発明の目的
当業界は、増加した死亡率のB.t.処方物を達成しようと努力してきた。その方法には、増加した死亡率を有する新規な菌株の探索、現在の菌株を操作する試み、ならびにB.t.胞子および結晶と新規な農薬担体、化学農薬、または増強剤（例えば、米国特許第５，２５０，５１５、トリプシン阻害物質参照）とを組み合わせることにより、より効果的な処方物を設計する試みが含まれていた。従って、農薬の農薬活性を増強する（potentiate）ことが、本発明の目的である。
発明の概要
本発明は、
（ａ）適切な条件下でBacillus菌株を培養し；
（ｂ）工程（ａ）の培養物の上澄から因子を回収して成るBacillus関連農薬の農薬活性を増強する因子を得る方法に関する。
特定の態様において、Bacillus菌株は、Bacillus subtilus（バシラス・サブチラス）、Bacillus licheniformis（バシラス・リケニフォルミス）、およびBacillus thuringiensis（バシラス・スリンジェンシス）から成る群から選ばれる。好ましい態様において、この因子は、実質的に純粋な形態である。本明細書で定義するような゛実質的に純粋な゛因子とは、１０％未満の夾雑物、例えば、デルタ−内毒素蛋白質を含有する因子を意味する。このような実質的に純粋な因子は、例えば、カラムクロマトグラフィーにより、この因子を単離することにより得ることができる。
得られる因子は、増強因子である。本明細書で定義するような゛増強因子（potentiator）゛とは、有意な農薬活性がない、例えば、生物検定法（セクション６参照）により測定して約３０００μｇ／ｇを超えるＬＣ50（ＬＣ50は、害虫の５０％を殺すのに必要な物質濃度である）であるが、Bacillus関連農薬の農薬活性を少なくとも約５０％増加させるように作用し、幼虫の発育阻止をしない物質である。セクション２で述べるように、トリプシン阻害物質および外毒素のような当業界で公知の農薬活性を増強することのできる他の物質は、農薬活性を有する。
特定の態様において、この因子は、水溶性である。本明細書の定義では、少なくとも約１ｍｇの物質を１ｍｌの水に溶解することができれば、物質または化合物は、゛水溶性゛である。この因子は、化学農薬および／または農薬的性質を有するウィルスの農薬活性も増強することができる。
本明細書で定義するような、゛Bacillus関連農薬゛とは、Bacillus（例えば、Bacillus thuringiensisまたはBacillus subtilis）菌株、胞子、または物質、例えば、害虫に対する活性もしくは害虫を殺す活性を有する蛋白質もしくはその断片、または害虫に対する活性もしくは害虫を殺す活性を有するBacillus蛋白質（例えば、Bacillus thuringiensisデルタ−内毒素）もしくはその断片をコードするBacillus遺伝子を発現させることのできる微生物および許容される担体（このような担体の例は、下記のセクション５．２．参照）である。害虫（又は有害生物とも言う；pest）は、例えば、昆虫、線虫、ダニ、またはカタツムリ類（snail）であってもよい。害虫に対する活性もしくは害虫を殺す活性を有するBacillus蛋白質もしくはその断片をコードするBacillus遺伝子を発現させることのできる微生物は、葉面（植物の葉の表面）、および／または根圏（植物の根を取り巻く土壌）、および／または水性環境に存在し、特定の環境（作物および他の昆虫生息地）で野生型微生物とうまく競合することができ、害虫に対する活性もしくは害虫を殺す活性を有するBacillus蛋白質もしくはその断片をコードするBacillus遺伝子の安定な維持および発現を提供する。このような微生物の例としては、細菌、例えば、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsiella）、ザントモナス（Xanthomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、ロードシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストック（Leuconostoc）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、およびクロストリジウム（Clostridium）属；藻類、例えば、シアノフィセアエ（Cyanophyceae）、プロクロロフィセアエ（Prochlorophyceae）、ロードフィセアエ（Rhodophyceae）、ジノフィセアエ（Dinophyceae）、クリソフィセアエ（Chrysophyceae）、プリムネシオフィセアエ（Prymnesiophyceae）、ザントフィセアエ（Xanthophyceae）、ラフィドフィセアエ（Raphidophyceae）、バシラリオフィセアエ（Bacillariophyceae）、オースチグマトフィセアエ（Eustigmatophyceae）、クリプトフィセアエ（Cryptophyceae）、オーグレノフィセアエ（Euglenophyceae）、プラシノフィセアエ（Prasinophyceae）、およびクロロフィセアエ（Chlorophyceae）科；ならびに菌類、特に酵母、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、スポロボロマイセス（Sporobolomyces)、ロードトルラ（Rhodotorula）、およびオーレオバシジウム（Aureobasidium）属が挙げられるが、これらに限定される訳ではない。
本明細書で定義される゛農薬活性（pesticidal activity）゛は、害虫の殺傷もしくは害虫の生育の阻止または害虫の害からの植物の保護を通じて、害虫に対する活性の量を測定する。
得られた因子は、因子および農薬担体ならびに因子およびBacillus関連農薬、化学農薬および／または農薬の性質を有するウィルスを含んで成る組成物に処方することができる。これらの組成物は、害虫を防除するために、この因子および農薬的に許容される担体を含んで成る組成物に害虫を露出してBacillus関連農薬に対する害虫の抵抗性を減少させるために、またはBacillus関連農薬の農薬活性を増強するために用いることができる。
また、本発明は、
（ａ）Bacillusの菌株の培養；
（ｂ）（ａ）の培養物の上澄を回収；および
（ｃ）Bacillus関連農薬に対する増強効果を（ｂ）の上澄について測定
して成る、この因子を同定する方法に向けられる。
図の簡単な説明
図１は、Ｉａを精製するのに用いた一般的方法を図式的に示す。
図２は、Ｉａの13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
図３は、ＩａプロトンＮＭＲスペクトルを示す。
図４は、Ｉａのアセチル化誘導体についてのｎＯｅ実験の結果を示す。
発明の詳細な説明
この因子は、Bacillus関連農薬の農薬活性を増強し、約３５０から約１２００または特定の態様においては約３５０から約７００の分子量であってもよい。
この因子は、Bacillus関連農薬の農薬活性を少なくとも約１．５倍から任意に約１０００倍、好ましくは約１００倍から約４００倍増強する。特定の態様において、この因子は、全鎖長形態、または蛋白質分解により処理され先端が切断された形態の、これらに限定される訳ではないが、ＣｒｙＩ（これらに限定される訳ではないがＣｒｙＩＡ、ＣｒｙＩＢ、およびＣｒｙＩＣを含む）、ＣｒｙＩＩ、ＣｒｙＩＩＩ、ＣｒｙＩＶ、ＣｒｙＶ、またはＣｒｙＶＩ蛋白質を含むBacillus thuringiensisデルタ−内毒素の農薬活性を、約１．５倍から約１０００倍増強する。最も特定の態様において、この因子は、B.t.デルタ−内毒素を約１００倍から約４００倍増強する。また、この因子は、化学農薬および／または農薬の性質を有するウィルスの農薬活性も増強する。
また、この因子は、水溶性であり、水中で約１００℃まで少なくとも約５分間安定であり、少なくとも約１０時間直射日光に供した場合安定であり、および／または約２のｐＨで約１０日間安定であることができる。この因子は、１３個の炭素を有することができる。更に、この因子は、δ１．５、３．２２、３．２９、３．３５、３．４３、３．５８、３．７３、３．９８、４．０７、４．１５、４．２５、４．３５に1Ｎ ＮＭＲシフトを有することができる。
最も特定の態様において、この因子又はその塩は、構造式Ｉａを有する。
この塩は、Bacillus関連農薬を増強することができるであろう。
１．因子の獲得
該因子は、振蕩フラスコまたは発酵容器内のBacillus菌株（例えば、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、およびBacillus thuringiensis）から得ることができる。特定の態様において、これらに限定される訳ではないが、Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki、Bacillus thuringiensis subsp. aizawai、Bacillus thuringiensis subsp. galleriae、Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus、Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis、Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis、Bacillus thuringiensis subsp. alesti、Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis、Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis、Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus、Bacillus thuringiensis subsp. finitimus、Bacillus thuringiensis subsp. kenyae、Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni、Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus、Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffiおよびBacillus thuringiensis subsp. israelensisを含むBacillus thuringiensisの培養物の上澄から因子を得ることができる。好ましい態様において、因子は、Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki、Bacillus thuringiensis subsp. aizawai、もしくはBacillus thuringiensis subsp. galleriae、または実質的に同じ増強活性を有するその突然変異体の上澄から得ることができる。特定の態様において、因子は、Bacillus thuringiensis subsp. kurstakiのｃｒｙ-ｓｐｏ-突然変異体から回収される。
Bacillusは、当業界で公知の培地および発酵技術を用いて培養することができる（例えば、Rogoff等，1969，J. Invertebrate Path. 14:122-129；Dulmage等，1971，J. Invertebrate Path. 18:353-358；Dulmage等，in Microbial Control of Pest and Plant Diseases，H.D. Burges，ed.，Academic Press，N.Y.，1980参照）。このサイクルの終了後、当業界で周知の方法、例えば、遠心分離および/または限外濾過により培養（発酵）ブロスからB.t.胞子及び結晶を分離することにより上澄を回収することができる。因子は、当業界で周知の方法、例えば、限外濾過、蒸発、および噴霧乾燥により回収することのできる上澄に含まれている。この手法を、以下のセクションで更に詳細に述べる。
因子の精製は、これらに限定される訳ではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、電気泳動手法、溶解度較差、抽出、または当業界で公知の他の標準技法を含む、当業界で公知の種々の手法により行うことができる。
Bacillus関連農薬、農薬活性を有するウィルス、または種々の害虫に対する化学農薬の農薬活性を増強する因子の活性は、人工昆虫飼料への混入、人工飼料への重層、葉面塗布、葉面浸せき、および葉面散布のような当業界で公知の手法を用いて測定することができる。このような測定の特定の例を、下記のセクション７に示す。
２．因子を含んで成る組成物
得られた因子は、単独で；上記で定義したような、害虫に対する活性もしくは害虫を殺すか害虫から植物を保護する活性を有するBacillus菌株、胞子、蛋白質もしくはその断片または他の物質であるBacillus関連農薬と共に；化学農薬および/または昆虫病原性ウィルス、ならびに許容される担体と共に農薬組成物、例えば、懸濁剤、液剤、エマルション、粉剤、分散顆粒剤、水和剤、乳剤、エアゾール剤または含浸顆粒剤に、処方することができる。このようなBacillus菌株の例としては、Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki（Abbott Laboratories，Inc.からDIPELTM、SandozからJAVELINTM、Novo Nordisk A/SからBIOBITTM、Novo Nordisk A/SからFORAYTM、Novo Nordisk A/SからBIOCOTTM、MycogenからMVPTM、Novo Nordisk A/SからBACTOSPEINETM、およびSandozからTHURICIDETMとして市販）；Bacillus thuringiensis subsp. aizawai（Novo Nordisk A/SからFLORBACTM、およびAbbott Laboratories，Inc.からXENTARITMとして市販）；Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis（Novo Nordisk A/SからNOVODORTM、SandozからTRIDENTTM、MycogenからM-TRAKTMおよびM-ONETMとして市販）；Bacillus thuringiensis subsp. israelensis（Novo Nordisk A/SからBACTIMOSTMまたはSKEETALTMのいずれか、SandozからTEKNARTMおよびAbbott Laboratories，Inc.からVECTOBACTMとして市販）；Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis（EcogenからFOILTMとして市販）；Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai（EcogenからCONDORTMおよびCiba-GeigyからAGREETMとして市販）；ならびにBacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki（EcogenからCUTLASSTMとして市販）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。Bacillus関連蛋白質は、これらに限定される訳ではないが、ＣｒｙＩ、ＣｒｙＩＩ、ＣｒｙＩＩＩ、ＣｒｙＩＶ、ＣｒｙＶ、およびＣｒｙＶＩを含む群から選ぶことができる。化学農薬は、例えば、ジフルベンズロンのような昆虫成長調整物質、チオジカルブおよびメソミルのようなカーバメート剤、クロルピリフォスのような有機燐剤、シペルメスリンおよびエスフェンバララートのようなピレスロイド剤、クリオライトのような無機フッ素、ならびにピロールであってもよい。昆虫病原性ウィルスは、バキュロウィルス（baculovirus）、例えば、Autographa californica核多角体ウィルス（ＮＰＶ）、Syngrapha falciferaＮＰＶ、Cydia pomonella ＧＶ（グラニュローシスウィルス）、Heliothiszea ＮＰＶ、Lymantria dispar ＮＰＶ、Orgyia pseudotsugata ＮＰＶ、Spodoptera exigua ＮＰＶ、Neodiprion lecontei ＮＰＶ、Neodiprion sertifer ＮＰＶ、Harrisina brillians ＮＰＶ、およびEndopiza viteana Clemens ＮＰＶであってもよい。
物質およびBacillus関連農薬を含んで成る組成物中に、物質は、少なくとも約０．１ｇ／ＢＩＵまたはBacillusデルタ−内毒素および胞子１ｇ当たり０．０５ｇの因子、任意に約３００ｇ／ＢＩＵまたはBacillusデルタ−内毒素および胞子１ｇ当たり１５０ｇまでの物質、好ましくは２ｇ／ＢＩＵまたはBacillusデルタ−内毒素および胞子１ｇ当たり１ｇの量で存在することができる。本明細書で定義する゛ＢＩＵ゛は、生物検定法により測定されるビリオン国際単位である。生物検定法は、標準検定昆虫としてTrichoplusia niまたは他の害虫を用いた標準Bacillus比較物質と試料を比較する。力価は、比較標準ＬＣ50で割り、次いで、比較標準力価を掛けることにより決定する。
別の態様において、本組成物は、実質的に純粋な形態の因子、または乾燥、濃縮、または液体形態のBacillus由来の上澄、ならびにその例が下記に開示される農薬的に許容される担体を含んで成ることができる。この組成物は、植物、例えば、トランスジェニック植物に個別に供することができる。詳細には、本組成物は、前もってBacillus thuringiensis遺伝子を含み発現する植物に供することができる。別の態様において、本組成物は、前もってBacillus thuringiensis組成物に露出した植物に供することができる。別の態様において、本組成物は、ハエ目害虫の他の環境、例えば水または土壌に供することができる。この物質は、本組成物中に約０．００１％から約６０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。
この物質および農薬として許容される担体を含んで成る組成物は、害虫の防除に加え、農薬に対する害虫の抵抗性を減少させるのにも用いることができる。あるいは、本組成物は、Bacillus関連農薬を増強するのに用いることができる。一つの態様において、本組成物は、少なくとも約２ｇ物質／ＢＩＵから任意に約３００ｇ物質／ＢＩＵの量で農薬と同時に供することができる。他の態様において、本組成物は、残存農薬の効き目を拡大するアジュバントとして農薬の約２４時間後までに供することができる。
上記で開示したこのような組成物は、表面活性剤、不活性な担体、保存料、湿潤剤、摂食刺激剤、誘引物質、カプセル化剤、結合剤、乳化剤、染料、Ｕ．Ｖ．保護剤、緩衝剤、流動化剤、または製品の扱いやすさおよび特定の標的害虫への施用を容易にする他の成分の添加により得ることができる。
適切な表面活性剤としては、カルボン酸塩、例えば、長鎖脂肪酸の金属カルボキシレート；Ｎ−アクリルサルコシナート；脂肪アルコールエトキシレート類と燐酸のモノもしくはジ−エステル又はこのようなエステルの塩；ドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウムまたはセチル硫酸ナトリウムのような脂肪アルコール硫酸塩；エトキシル化脂肪アルコール硫酸塩；エトキシル化アルキルフェノール硫酸塩；リグニンスルホン酸塩；石油スルホン酸塩；アルキル−ベンゼンスルホン酸塩または低級アルキルナフタレンスルホン酸塩、例えば、ブチル−ナフタレンスルホン酸塩のようなアルキルアリ−ルスルホン酸塩；スルホン化ナフタレン−ホルミアルデヒド縮合物の塩；スルホン化フェノール−ホルミアルデヒド縮合物の塩；または、アミドスルホネート類、例えば、オレイン酸とＮ−メチルタウリンのスルホン化縮合生成物もしくは、ジアルキルスルホコハク酸塩、例えば、スルホン酸ナトリウムもしくはジオクチルスクシナートのようなより複雑なスルホン酸塩のような陰イオン化合物が挙げられる。非イオン性薬物としては、脂肪酸エステル類、脂肪アルコール類、脂肪酸アミド類または脂肪−アルキル−もしくはアルケニル−置換フェノール類とエチレンオキシドとの縮合生成物、多価アルコールエーテル類の脂肪エステル類、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル類、エチレンオキシドとこのようなエステル類の縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマー類、２，４，７，９−テトラエチル−５−デシン−４，７−ジオールのようなアセチレングリコール類、またはエトキシル化アセチレングリコール類が挙げられる。陽イオン表面活性剤の例としては、例えば、アセテート、ナフテナートまたはオレアートのような脂肪族モノ−、ジ−、またはポリアミン；ポリオキシエチレンアルキルアミンのアミンオキシドのような酸素含有アミン；カルボン酸とジ−またはポリアミンとの縮合により調製されるアミド−結合アミン；または四級アンモニウム塩が挙げられる。
不活性な物質の例としては、カオリン、雲母、石膏、肥料、フィロ珪酸塩類、炭酸塩類、硫酸類、もしくは燐酸塩類のような無機物質；蔗糖、デンプン類、もしくはシクロデキストリン類のような有機物質；または木産物、コルク、粉末にしたトウモロコシの穂軸、籾殻、落花生の殻、およびクルミの殻のような植物性物質が挙げられる。
本発明の組成物は、直接の適用に好適な形態で、または適用前に適切な量の水もしくは他の希釈剤での希釈を必要とする濃縮物もしくは一次組成物として存在することができる。農薬の濃度は、特定の処方物の性質、詳しくは、濃縮物か又は直接用いることになっているかどうかに依存して変化する。本組成物は、１から９８％の固形または液体不活性担体、および０から５０％，好ましくは０．１から５０％の表面活性剤を含有する。これらの組成物は、市販品に表示された割合、好ましくは、乾燥形態の場合エーカー当たり約０．０１ポンドから５．０ポンド、液体形態の場合エーカー当たり約０．０１パイントから２５パイントで投与する。
更なる態様において、Bacillus thuringiensis結晶デルタ−内毒素および／または因子は、標的害虫の環境に供する場合、前処理が結晶デルタ−内毒素または物質に有害でない限り、農薬活性を延長するために処方に先だって処理することができる。このような処理は、処理が本組成物の性質に有害に影響しない限り、化学的および／または物理的手段によってもよい。化学的試薬の例としては、ハロゲン化薬剤；ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；ゼフィランクロライド（zephiran chloride）のような抗−感染剤；イソプロパノールおよびエタノールのようなアルコール類；ならびにBouinの固定液およびHellyの固定液のような組織学的固定液（例えば、Humason，Animal Tissue Techniques，W.H. Freeman and Co.，1967）参照）が挙げられるがこれらに限定される訳ではない。
本発明の組成物は、害虫が植物上に出現しはじめる時点で又は保護的手段として害虫の出現前に、例えば、噴霧または散粉により植物に直接供することができる。本発明の範囲内で保護される植物としては、禾穀類（コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、イネ、モロコシおよび関連作物）、ビート類（サトウダイコンおよび飼料ビート）、石果類、梨果類およびソフトフルーツ（リンゴ類、梨類、プラム類、桃類、アーモンド類、サクランボ類、イチゴ類、キイチゴ類、およびブラックベリー類）、マメ科植物（アルファルファ、ソラマメ類、インゲンマメ類、レンズマメ類、エンドウマメ類、ダイズ類）、油料植物類（セイヨウアブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ類、ヒマワリ類、ココナッツ類、ヒマ類、ココアマメ類、ピーナツ類）、キュウリ科植物類（キュウリ、ペポカボチャ類、メロン類）、繊維植物類（ワタ、アマ、アサ、ジュート）、柑橘類の果物（オレンジ類、レモン類、グレープフルーツ、マンダリン類）、野菜類（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ類および他のアブラナ科、ニンジン類、タマネギ類、トマト類、ジャガイモ類）、クスノキ類（アボガド類、シナモン、ショウノウ）、落葉樹および針葉樹（シナノキ類、イチイ類、オーク類、ハンノキ類、ポプラ類、カボノキ類、モミ類、カラマツ類、マツ類）、またはトウモロコシ、芝草、タバコ、ナッツ類、コーヒー、サトウキビ、お茶、ブトウ糖、ホップ類、バナナ類および天然のゴムの木ならびに観賞植物が挙げられるが、これらに限定される訳ではない。本組成物は、葉面、畦間、全面顆粒、゛レイ−バイ（lay-by）゛散布、または土壌灌注施用により供することができる。それが、植物が最も深刻に損傷をうけ得る時期であることから、植物成長の初期段階で害虫の良好な防除を得ることが概ね重要である。噴霧剤または粉剤は、それが必要と考えられるならば、他の農薬を都合よく含有することができる。好ましい態様において、本発明の組成物は、植物に直接供する。
また、本発明の組成物は、池、湖、小川、川、よどんだ水、およびハエ目害虫、特に公衆衛生上重要な害虫による害を受けやすい他の地域に直接供することもできる。本組成物は、噴霧、粉剤散布、スプリンクリング等により供することができる。
本発明の組成物は、チョウ目、例えば、アクロイア・グリセラ（Achroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、アドキソフィエス・オラナ（Adoxophyes orana）、アグロティス・イプシロン（Agrotis ipsilon）、アラバマ・アルギラセアエ（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アミエロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarisia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンセラエア・ペルニ（Antheraea pernyi）、アンティカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、アーチプス sp.（Archips sp.）、アルジロタエニア sp.（Argyrotaenia sp.）、アセティス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボンビックス・モリ（Bombyx mori）、バキュラトリックス・スルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、カドラ・カウテラ（Cadra cautella）、コリストニューラ sp.（Choristoneura sp.）、コキリス・ホスペス（Cochylis hospes）、コリアス・ユーリテム（Colias eurytheme）、コルシラ・セファロニカ（Corcyra cephalonica）、サイディア・ラティフェレアナス（Cydia latiferreanus）、サイディア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテジェリマ（Datana integerrima）、デンドロリマス・シベリカス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フュネラリス（Desmia funeralis）、ジアファニア・ハイアリナタ（Diaphania hyalinata）、ジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、エノモス・サブシグナリア（Ennomos subsignaria）、イーオレウマ・ロフティニ（Eoreuma loftini）、エフェスティア・エルテラ（Ephestia elutella）、エラニス・ティリアリア（Erannis tiliaria）、エスティグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、ユーリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、ユーポエシリア・アンビグエラ（Eupoecilia ambiguella）、ユープロクティス・クリソルホエア（Euproctis chrysorrhoea）、ユーゾア・メロリア（Euxoa messoria）、ガリエリア・メロネラ（Galleria mellonella）、グラフォリタ・モレスタ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカーナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレキサ（Helicoverpa subflexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）、ヘリオチス・ビレッセンス（Heliothis virescens）、ヘミロイカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテラム（Homoeosoma electellum）、ヒファントリア・クネア（Hyphantria cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ランブディナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ランブディナ・フィセラリア・ルグブロザ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ロイコマ・サリシス（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロキソステゲ・スティクティカリス（Loxostege sticticalis）、リマントリア・ジスパー（Lymantria dispar）、マカラ・チルシサリス（Macalla thyrsisalis）、マラコソーマ sp.（Malacosoma sp.）、マメストラ・ブラシカエ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィギュラータ（Mamestra configurata）、マンズカ・キンクエマクラータ（Manduca quinquemaculata）、マンズカ・セキサタ（Manduca sexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、オペロフテラ・ブルマータ（Operophtera brumata）、オルギア sp.（Orgyia sp.）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピリオ・クレスフォンテス（Papilio cresphontes）、ペクチノフォラ・ゴシピエラ（Pectinophora gossypiella）、フリガニジア・カリフォルニア（Phryganidia californica）、フィロノルクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、プラチペラ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・サルタナ（Platynota sultana）、プラチプチリア・カルデュイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、プロディア・インテルパンクテラ（Plodia interpunctella）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）、ポンティア・プロトディス（Pontia protodice）、プソイダレチア・ユニパンクタ（Pseudaletia unipuncta）、プソイドプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シトトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロノタ・オセラナ（Spilonota ocellana）、スポドプテラ sp.（Spodoptera sp.）、タウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、チネオラ・ビセリエラ（Tineola bisselliella）、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）、ウデア・ルビガリス（udea rubigalis）、キシロマイゲス・クルイアリス（Xylomyges cruialis）、イポノミュタ・パデラ（Yponomeuta padella）；ハエ目、例えば、アエデス sp.（Aedes sp.）、アンデス・ビタタス（Andes vittatus）、アナストレファ・ルーデンス（Anastrepha ludens）、アナストレファ・サスペンサ（Anastrepha suspensa）、アノフェレス・バルベリ（Anopheles barberi）、アノフェレス・クアドリマクラタス（Anopheles quadrimaculatus）、アルミゲレス・スバルバタス（Armigeres subalbatus）、カリフォラ・スチジアン（Calliphora stygian）、カリフォラ・ビシナ（Calliphora vicina）、セラチチス・カピタタ（Ceratitis capitata）、キロノムス・テンタンス（Chironomus tentans）、クリソミア・ルフィファシエス（Chrysomya rufifacies）、コクリオミア・マセラリア（Cochliomyia macellaria）、クレックス sp.（Culex sp.）、クリセタ・イノルナタ（Culiseta inornata）、ダカス・オレアエ（Dacus oleae）、デリア・アンティクア（Delia antiqua）、デリア・プラチュア（Delia platura）、デリア・ラジカム（Delia radicum）、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）、ユーペオデス・コロラエ（Eupeodes corollae）、グロシナ・アウステニ（Glossina austeni）、グロシナ・ブレビパルピス（Glossina brevipalpis）、グロシナ・ファウシペス（Glossina fuscipes）、グロシナ・モルシタンス・セントラリス（Glossina morsitans centralis）、グロシナ・モルシタンス・モルシタンス（Glossina morsitans morsitans）、グロシナ・モリスタンス・サブモルシタンス（Glossina moristans submorsitans）、グロシナ・パリジペス（Glossina pallidipes）、グロシナ・パルパリス・ガンビエンシス（Glossina palpalis gambiensis）、グロシナ・パルパリス・パルパリス（Glossina palpalis palpalis）、グロシナ・タキノイデス（Glossina tachinoides）、ハエマゴガス・エクイナス（Haemagogus equinus）、ハエマトビア・イリタンス（Haematobia irritans）、ヒポデルマ・ボビス（Hypoderma bovis）、ヒポデルマ・リネアタム（Hypoderma lineatum）、ロイコピス・ニナエ（Leucopis ninae）、ルシリア・クプリナ（Lucilia cuprina）、ルシリア・セリカタ（Lucilia sericata）、ルツゾミア・ロングルパイピス（Lutzomyia longlpaipis）、ルツゾミア・シャンノニ（Lutzomyia shannoni）、リコリエラ・マリ（Lycoriella mali）、マイエチオラ・デストラクター（Mayetiola destructor）、ムスカ・オータムナリス（Musca autumnalis）、ムスカ・ドメスティカ（Musca domestica）、ネオベリエリア sp.（Neobellieria sp.）、ネフロトマ・サチュラリス（Nephrotoma suturalis）、オフィラ・アエネッセンス（Ophyra aenescens）、ファエニシア・セリカタ（Phaenicia sericata）、フレボトムス sp.（Phlebotomus sp.）、フォルミア・レジナ（Phormia regina）、サベセス・シアネウス（Sabethes cyaneus）、サルコファガ・ブラタ（Sarcophaga bullata）、スカトファガ・ステルコラリア（Scatophaga stercoraria）、ストモキシス・カルシトランス（Stomoxys calcitrans）、トキソリンキテス・アンボイネンシス（Toxorhynchites amboinensis）、トリプテロイデス・バンブサ（Tripteroides bambusa）の昆虫の害虫に対して効果的であることが可能である。しかしながら、本発明の組成物は、甲虫目、例えば、レプチノタルサ sp.（Leptinotarsa sp.）、アカンソスセリデス・オブテクタス（Acanthoscelides obtectus）、カロソブルクス・キネンシス（Callosobruchus chinensis）、エピラクナ・バリベスティス（Epilachna varivestis）、ピルハルタ・ルテオラ（Phrrhalta luteola）、サイラス・ホルミカリウス・エレガンツラス（Cylas formicarius elegantulus）、リストロノタス・オレゴネンシス（Listronotus oregonensis）、シトフィラス sp.（Sitophilus sp.）、シクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）、シクロセファラ・イマキュラタ（Cyclocephala immaculata）、マクロダクチラス・サブスピノサス（Macrodactylus subspinosus）、ポピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）、リゾトロガス・マヤリス（Rhizotrogus majalis）、アルフィトビウス・ジアペリナス（Alphitobius diaperinus）、パロラス・ラゼブルギ（Palorus ratzeburgi）、テネブリオ・モリタ（Tenebrio molitor）、テネブリオ・オブスキュラス（Tenebrio obscurus）、トリボリウム・カスタニウム（Tribolium castaneum）、トリボリウム・コンフサム（Tribolium confusum）、トリボリウム・テストラクター（Tribolius destructor）；ダニ目、例えば、オリゴニカス・プラテンシス（Oligonychus pratensis）、パノニカス・ウルミ（Panonychus ulmi）テトラニカス・ウルチカエ（Tetranychus urticae）；ハチ目、例えば、イリドミルメックス・ヒュミリス（Iridomyrmex humilis）、ソレノプシス・インビクタ（Solenopsis invicta）；シロアリ目、例えば、レチキュリタルメス・ヘスペラス（Reticulitermes hesperus）、レチキュリタルメス・フラビペス（Reticulitermes flavipes）、コプトタルメス・ホルモサヌス（Coptotermes formosanus）、ズーテルモプシス・アンギュスチコリス（Zootermopsis angusticollis）、ネオテルメス・コネクス（Neotermes connexus）、インシシテルメス・マイナ（Incisitermes minor）、インシシテルメス・イミグランス（Incisitermes immigrans）；ノミ目（Siphonaptera）、例えば、セラトフィラス・ガリナエ（Ceratophyllus gallinae）、セラトフィラス・ニガー（Ceratophyllus niger）、ノソプシラス・ファスシアタス（Nosopsyllus fasciatus）、レプトプシラ・セグニス（Leptopsylla segnis）、クテノセファリデス・カニス（Ctenocephalides canis）、クテノセファリデス・フェリス（Ctenocephalides felis）、エキクノファガ・ガリナセアエ（Echicnophaga gallinacea）、プレックス・イリタンス（Pulex irritans）、キセノプシラ・ケオピス（Xenopsylla cheopis）、キセノプシラ・ベキサビリス（Xenopsylla vexabilis）、ツンガ・ペネトランス（Tunga penetrans）；およびハリセンチュウ目（Tylenchida）、例えば、メロジドギネ・インコグニタ（Melodidogyne incognita）、プラチレンカス・ペネトランス（Pratylenchus penetrans）の害虫に対してもやはり効果的であることが可能である。
具体的に説明するために以下の実施例を示すが、本発明はそれにより制限される
ものではない。
実施例：Ｉａの特徴付け
ここで詳細に述べる通りに、Ｉａを回収し精製する。Ｉａの特徴付けを、下記に詳細に述べる。
１Ｉａの回収および精製
B. thuringiensis subsp. kurstaki菌株ＥＭＣＣ００８６（ＮＲＲＬにＢ−２１１４７として寄託）を、デンプン、加水分解したデンプン、またはグルコースのような炭素源および、蛋白質、加水分解した蛋白質、またはコーンスティープリカーのような窒素源から成る培地中で３０℃で７２時間発酵させる。発酵後１３時間でＩａの生産を検出する。約３０時間でピークの活性を見い出す。
B. thuringiensis subsp. kurstaki発酵により得た上澄を遠心分離により回収し、次いで、Rhone Poulenc UFシステムを用い３０ｋＤａ ＭＷ−ＣＯ膜を介した限外濾過により浄化する。３０ｋＤａ濾過は、残存細胞破片、結晶デルタ−内毒素、胞子、および３０ｋＤａ分子量より大きい可溶性蛋白質を除去した。透過物を、蒸発により１０倍に濃縮する。透過物を遠心分離し、次いで、０．２μ濾過して更にブロスから不溶性のものを除去するとＩａを含有する透明なブロスが残る。
均一になるまでのＩａの精製を、図１に模式図により示した多工程精製手順を用いて達成する。上記で概説した回収プロトコールと連結して、５ｋＤａ限外濾過工程を続けた。５ｋＤａ限外濾過から得た透過物をスルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換樹脂に吸着させ、酢酸アンモニウム溶液で溶出する。化合物を、次いで、凍結乾燥により約３０Ｘに濃縮し、塩および他の夾雑物を、ＢｉｏＲａｄ Ｐ２サイズ排除カラムで除去する。Ｐ２カラムから得たプールを、高分解能ＳＰ ＨＰＬＣ陽イオン交換カラムに通し、均質な化合物を得る。夾雑塩を、反復凍結乾燥により除去する。
活性を、Spodoptera exigua微生物学的定量法により監視し、純度を、キャピラリー電気泳動により測定する。ＢＩＯＢＩＴTM ＦＣ（１００μｌ）から精製した５０μｌのＩａおよび５０μｌのＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白質（１５μｇ／ｍｌ）から成る試料を、５００μｌの固形にした人口昆虫食餌を入れたゼリートレーの各ウェルに供する。種々の試料を入れたトレーを風乾させる。２匹から４匹の第二または第三前期齢のSpodoptera exiguaを、乾燥した試料をいれたウェルに加える。ウェルを、つついて穴を開けたマイラーで封をし、３０℃で２−３日間インキュベートする。発育阻止の程度および死亡率パーセントを、次いで、記録する。代表的には、各試料に対し、５個の複製ウェルで実験する。
２．構造解明
活性化合物は、水溶性であることを見いだしたが、有機溶媒中では可溶性ではない。これは、陽性に荷電しており、シリカ薄層クロマトグラフィーにより明らかにされるようにニンヒドリンと反応する。本化合物の13ＣおよびプロトンＮＭＲを、それぞれ図２および３に示す。13Ｃ ＮＭＲ実験は、１３個の炭素（３−［トリメチルシリルプロピオン酸を対象とした）の存在を示した。ＤＥＰＴ実験は、３個の四級炭素（Ｃ）、７個のメチン（ＣＨ）、３個のメチレン（ＣＨ2）があり、メチル基（ＣＨ3）はないことを測定した。１−ＤデカップリングおよびＣＯＳＹのようなプロトンカップリング実験を用い、８個の炭素を含む１つの大きなスピン系を同定する。更に、２個の炭素から成るより小さいスピン系が存在する。炭素プロトン相関実験（ＨＭＢＣ）は、その結合炭素に対する分子内の各プロトン共鳴の帰属を可能にした。
活性化合物（１３ｍｇ）のピリジン中の無水酢酸での処理は、極性がはるかに少ないアセチル化誘導体の形成に帰した。この誘導体をＨＰＬＣにより精製して３ｍｇの純粋なアセチル化誘導体を得る。質量分析は、この誘導体が、７個のアセテートおよび６９０の分子量を有し、その内３９６の分子量が活性化合物のものであり、偶数の窒素が存在することを示した。また、６個のアセテートおよび５個のアセテートを含有する断片を検出する。５個および６個のアセテート娘イオンの高分解能データは、６４５．２５９４（６個のアセテート）および６０７．２５１９（５個のアセテート）であり、これは、Ｉａが以下の分子式Ｃ13Ｈ28Ｎ6Ｏ8であることを示す。
活性化合物（１３ｍｇ）の６ＮのＨＣｌでの処理により、ニンヒドリン陽性である誘導体を得た。これらの結果は、アミド結合の存在を示す。誘導体は、２，３−ジアミノプロピオン酸として薄層クロマトグラフィーにより測定したものと同じＲｆ値を有した。ＮＭＲデータと共にこれらの結果は、２，３−ジアミノプロピオン酸の存在を示唆する。
Ｉａを分析するのに用いた別の技法は、空間を介した相互のプロトンの隣接を検出することのできるｎＯｅ（核オーバーハウザー効果）である。Ｉａのアセチル化誘導体に関してｎＯｅを行う。二次元のｎＯｅ実験（ＮＯＥＳＹ）において、８．０６ｐｐｍでのＮ−Ｈプロトンおよび５．１７プロトン間にＮＯＥｓを観察する（図４）。
Ｉａの以下の構造が解明された
これは、ウレイドアミドとして分類することができる。構成成分は、２個のアミド、１個の尿素、２個のアミノ、および５個のヒドロキシルを含む。これは、７個のキラルセンターを含む。
３．Ｉａの性質
単離したＩａは、Spodoptera exiguaに対するBacillus thuringiensis subsp. kurstakiおよびBacillus thuringiensis subsp. aizawai結晶デルタ−内毒素農薬活性蛋白質の活性を、農薬活性蛋白質の形態と無関係に増強することを見い出す。処方されたB.t.k.、単離された結晶、全鎖長（１３０ｋＤａ分子量）または先端が切断されたＣｒｙＩＡ蛋白質（〜６５ｋＤａ分子量）の農薬活性は全て増強される。ＣｒｙＩＩおよびＣｒｙＩＣ封入体の活性も増強される。個々の先端が切断されたＣｒｙＩＡ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）蛋白質の活性も増強することが見い出される。ＩａとＣｒｙ蛋白質とのインキュベーション時間は、生物学的活性に臨界的であるとは見い出されていない。しかしながら、Ｉａは、単独では不活性である。増強作用の水準は、先端を切断したＣｒｙＩＡ蛋白質、ＣｒｙＩＩおよびＣｒｙＩＣ封入体では１００−２００倍ならびに全鎖長ＣｒｙＩＡ（ｃ）で約３２０倍（それぞれ表Ｉおよび表ＩＩ参照）であることが見い出される。詳しくは、全鎖長蛋白質では、Ｉａを用いた場合、０．７５μｇ／ｍｌのＣｒｙＩＡ（ｃ）により、２４０μｇ／ｍｌのＣｒｙＩＡ（ｃ）単独で得られるのと同じ昆虫死亡率／発育阻止得点を得た。先端が切断されたＣｒｙＩＡ（ｃ）の場合、Ｉａと組み合わせた、ＯＤ280が０．０００６のものは、ＯＤ280が０．０７５である単独で試験した同じ試料のＣｒｙＩＡ（ｃ）と同じ発育阻止得点であった。Ｉａと組み合わせた０．６μｇ／ｍｌの濃度のＣｒｙＩＩ封入体は、１２５倍の増強作用である、７５μｇ／ｍｌのＣｒｙＩＩ蛋白質単独と同じ発育阻止得点および同様の死亡率であった。Ｉａを加えた０．３μｇ／ｍｌの濃度のＣｒｙＩＣ封入体は、７５μｇ／ｍｌのＣｒｙＩＣ蛋白質単独と同様の死亡率および発育阻止得点であり、これは、２５０倍水準の増強作用を反映している。発育阻止をもたらすＣｒｙＩＡ蛋白質の濃度は、Ｉａの添加により死亡をもたらす。
Ｉａは、５分間の煮沸ではセクション７．１．で述べたような生物検定法により安定であることが見いだされるが、オートクレーブ（＞１９０℃）にかけることにより全ての活性を失う。更に、これは、直射日光に少なくとも１０時間供した場合、安定である。Ｉａは、ｐＨ２で３日間安定であるが、ｐＨ１２では不安定である。過ヨウ素酸または濃ＨＣｌに露出した場合、全活性を失うことが見い出される。
４．Bacillus thuringiensisの他の亜種およびBacillusの他の種の評価
いくつかのBacillus種を、Ｉａの産生について評価する。菌株を、デンプン、加水分解したデンプン、またはグルコースのような炭素源および、蛋白質、加水分解した蛋白質、またはコーンスティープリカーのような窒素源から成る培地中で３０℃で７２時間発酵する。上澄を、上記のSpodoptera exigua微生物学的定量法を用い、Ｉａ生産について調査する。B. thuringiensis subsp. aizawai菌株ＥＭＣＣ００８７（ＮＲＲＬ Ｂ−２１１４８としてＮＲＲＬに寄託）およびB. thuringiensis subsp. galleriae（ＮＲＲＬに寄託）は、B. thuringiensis subsp. kurstakiとほぼ同じ濃度でＩａを産生することを見い出す。
また、Ｉａは、キャピラリー電気泳動により測定されるように、B. substilis、B. cereus、B. t. subsp. alesti、B. t. subsp. canadiensis、B. t. subsp. darmstadiensis、B. t. subsp. dendroliumus、B. t. subsp. entomocidus、B. t. subsp. finitimus、B. t. subsp. israelensis、B. t. subsp. kenyae、B. t. subsp. morrisoni、B. t. subsp. subtoxicus、B. t. subsp. tenebrionis、B. t. subsp. thuringiensis、および、B. t. subsp. toumanoffi、B. cereus、B. subtilis、ならびにB. thuringiensis subsp. kurstaki ｃｒｙ−ｓｐｏ−突然変異体中で産生される。
詳しくは、Ｉａの水準を定量化するのに、５０μｍｘ５７ｃｍ未被覆のキャピライーを具備したベックマンＰ／ＡＣＥキャピラリー電気泳動システム、０．２Ｍの燐酸緩衝液ｐＨ６．８、１５ＫＶの電圧、および２００ｎｍでの検出を用いる。試料容量は、２５分の操作時間で２０ｎｌである。
標準として精製Ｉａを１．２５ｍｇ／ｍｌ、０．６２５ｍｇ／ｍｌ、０．３１２５ｍｇ／ｍｌ、０．１５６ｍｇ／ｍｌ、および０．０７８ｍｇ／ｍｌの水準で用いて標準曲線を得る。直線の検量線を得る。その結果できたｙ＝ｍｘ＋ｂ等式を用いて各試料のＩａ濃度を得る。
各実験前に、キャピラリーにランニングバッファー（０．２Ｍ燐酸塩、ｐＨ６．８）を３分間流す。それぞれ２５分の実験後、キャピラリーに、１ＮのＮａＯＨを１分間、ＨＰＬＣ濾過水を１分間、０．５Ｍ燐酸を３分間、およびＨＰＬＣ濾過水を１分間流す。各ピーク下の面積を積分し、ピーク面積を決定し、標準曲線から最終濃度を算定する。
５．B.t.産生物の評価
種々の商業的に入手可能なB.t.産生物に存在するＩａの量を、上記セクション６．４．で述べたキャピラリー電気泳動により測定する。BACTOSPEINETM、JAVELINTM、NOVODORTM、SPHERIMOSTM、BACTIMOSTM、FORAYTM、FLORBACTMおよびBIOBITTMは、Novo Nordisk A/Sから得られる。XENTARITMおよびDIPELTMは、Abbott Laboratoriesから得られる。AGREETMはCiba-Geigyから得られ；MVPTMはMycogenから得られ、CUTLASSTMはEcogenから得られる。
結果を下記表ＩＩＩに示すが、これは、Ｉａが０．００１ｇ Ｉａ／ＢＩＵ未満から０．０７１ｇ Ｉａ／ＢＩＵの範囲の種々の量で存在することを示している。
６．食餌混入生物検定法
第三齢Spodoptera exigua幼虫、第二齢Helicoverpa zea幼虫、第三齢Spodoptera frugiperda幼虫、第二齢Heliothis virescens幼虫、第３齢Trichoplusia ni幼虫、第三齢Pseudoplusia includens幼虫、第三齢Plutella xylostella幼虫、第三齢Spodoptera littoralis、および第三齢Mamestra brassicae幼虫を用い人工食餌混入生物検定法によりB.t.k.活性を測定する。
B.t.産生物にＩａを加えることによる増強作用の水準を測定し影響される昆虫の範囲を確立するために、食餌混入生物検定法を行う。Spodoptera exiguaに対して高濃度のＩａ（７．４−２３．７ｇ Ｉａ／ＢＩＵ）を用いた実験において、精製Ｉａ（７０％の有効成分、３０％アセテート対イオン）を用いてBIOBITTM FC（ＦＣは、フロアブル剤を表す）を増強する。表ＩＶに示す残りのデータは、BIOBITTM HPWP（高力価水和剤）のＩａ（０．６５８％有効成分）による増強作用を示す。FLORBACTM HPWPおよびＩａを用いてS. littoralisおよびM. brassicaeを調査する。
種々のB.t.産生物の重量を測定し、Ｉａを、０．１から２３７ｇ Ｉａ／ＢＩＵになるように加える。容量を０．１％ＴｗｅｅｎTMで調整する。試料を１分間音波処理し、次いで、最終容量に希釈する。ニートの試料（Ｉａ非含有）および比較物質を、同様に調製する。比較物質としては、ミリグラム当たり１６，０００国際単位（ＩＵ）の力価が与えられているB.t.k.HD-1-S-1980（NRRLから入手）および５３，０００ Spodoptera単位／ｍｇ（ＳＵ）の力価が与えられているJAVELINTM WGが挙げられる。
水、寒天、蔗糖、カゼイン、コムギ胚芽、メチルパラベン、ソルビン酸、亜麻仁油、セルロース、塩、およびビタミン類から成る標準人工食餌を、２０Ｌの加熱した釜の中で調製する。これは、７種の異なる濃度の各試験物質で１０から１２の試料を調査するのに十分な食餌を提供する。B.t.溶液を１６ｍｌ量になるように連続して希釈する。各アリコートを１８４ｇの溶解した食餌に加える。混合物を、次いで、均質にし、次いで、４０個の個々のセルを有するプラスティックトレー中に注ぐ。それぞれのバッチの食餌について３つの対照のトレーを調製する。一旦食餌が冷め固まったならば、既知齢（２−３齢）の昆虫１匹を各セルに加え、トレーを透明なマイラーの穴を開けたシートで覆う。トレーを棚の上に置き、２８℃で６５％相対湿度で４日間インキュベートする。
４日後、昆虫死亡率を評価する。各トレーを、テーブルの上に強く打ちつけ、動かなかった幼虫を死んだものとして数える。死亡率パーセントを算定し、データを、平衡プロビット分析を介して分析する。ＬＣ50ｓ、ＬＣ90ｓ、回帰線の傾き、変動係数、および力価を推定する。試料は、少なくとも３回または３つの力価が各試料の算定した平均の２０％以内になるまで実験する。各濃度のＩａと関係する活性の増加を算定するために、B.t.／Ｉａ試料のＬＣ50ｓを、試料中のB.t.の量を反映するように補正する。対のニートの試料のＬＣ50を、補正したＬＣ50値で割り、Ｉａと関係がある、ＬＣ50の減少倍数を得る。
以下の手法を用いてLobesia bothranaについて測定する。Lobesia bothranaにより攻撃されたブドウのつるを、噴霧していない畑で集め、幼虫を除去する。Ｉａの一連の希釈物（２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、および１０００μｇ／ｍｌ）を水で作成する。１匹の幼虫をペトリ皿の中央におく。幼虫が飲むのが観察されたならば、新たにカットしたブドウ液果を入れたペトリ皿に移す。幼虫を２２℃で３−４日間貯蔵する。
表ＩＶに示すように、ＬＣ50ｓの著しい減少が全種で観察される。
Spodoptera exiguaに対する種々の製品のＩａによる増強作用を、上記の食餌混入生物検定法を用いて測定する。加えたＩａの量／製品のＢＩＵを、下記表Ｖに示す。Ｉａ／Ｂ．ｔ．製品混合物は、寒天をベースとしたコムギ胚芽カゼイン食餌中に混入されている。昆虫を食餌上に４日間置き、２８℃に維持する。死亡率を記録し、プロビット分析を用いて分析する。ＬＣ50、ＬＣ90および力価を、Ｉａ非含有の見合った製品から算定する。表Ｖに示す結果は、Ｉａが、種々の源から得られた種々のB.t.k.およびB.t.a.製品を増強することを示している。これらの製品に含まれるB.t.菌株は、上記セクション５．２．で説明している。
7.葉面生物検定法
BIOBITTM FCおよびＩａを用いブロッコリ植物体に対し第二齢Spodoptera exigua幼虫で葉面生物検定法を行う。BIOBITTM FCに対するＩａの比率は、同じ２ｇ Ｉａ／ＢＩＵのBIOBITTM FCである。エーカー当たり２０ガロンの担体容量でトラックスプレーヤーを介してブロッコリ植物体に処置を施す。スプレーデポジットが乾燥した後、植物体から葉を切り取り、第二齢のSpodoptera exigua幼虫をたからせる。結果を下記の表ＶＩに示す。８．７ＢＩＵ／ヘクタールBIOBITTM FC＋Ｉａの比率で１００％の死亡率が観察されたが、一方、BIOBITTM FC単独では５８．８ＢＩＵ／ヘクタールで９２％および１７．６ＢＩＵ／ヘクタールで８％の幼虫を殺した。処理した植物体を直射日光下に８時間置いた後も、葉を切り取り上記幼虫をたからせる。日光下で８時間後、BIOBITTM FC単独では５８．８ＢＩＵ／ヘクタールで２７％の死亡率を得、一方、BIOBITTM FC＋Ｉａでは８．７ＢＩＵ／ヘクタールで１００％の死亡率を得た。
第四齢初期の幼虫で行った葉面検定は、BIOBITTM FC単独では５２ＢＩＵ／ヘクタールで７５％の死亡率、BIOBITTM FC（ＦＣは、フロアブル剤である）＋Ｉａでは１３ＢＩＵ／ヘクタールで１００％の死亡率であった。
８．圃場試験
ガーボンゾ・ビーンズ（garbonzo beans）に対する圃場試験（Spodoptera exigua）は、BIOBITTM FC単独で７０ＢＩＵ／ヘクタールでは５１％の防除を得、一方、２ｇ Ｉａ／ＢＩＵBIOBITTM FCで４０ＢＩＵ／ヘクタールでは８９％の防除（非処理と比較して）を提供することを示した。４５ＢＩＵ／ヘクタールのJAVELINTM WGにより５１％の防除を得た。
スィートコーンに対する圃場試験（Spodoptera frugiperda）は、３９．５ＢＩＵ／ヘクタールおよび２ｇ Ｉａ/ＢＩＵBIOBITTM FCが８４％の防除を提供することを示した。
９．抵抗性比率
感受性および抵抗性のコナガ（Plutella xylostella）のコロニーを生物検定する。抵抗性蛾は、JAVELINTM WGに徹底露出後、B.t.抵抗性を獲得した、フロリダの圃場で集めた試料である。BIOBITTM HPWPとＩａとを葉面浸漬生物検定法を用いて分析する。JAVELINTMおよびXENTARITMに対する抵抗性を、Ｉａ無しで測定する。直径６ｃｍのキャベツ葉の円形の切片を、８種の異なる濃度のB.t.産生物またはB.t.／Ｉａ処方物の１つに１０秒間浸す。濃度は、１から１０００ｐｐｍの範囲である。円形の葉を、２時間風乾させ、第二齢（０．２から０．４ｍｇ）の幼虫を入れたプラスティックのペトリ皿に置く。２５匹の昆虫／葉量／日を２回繰り返して５０匹の昆虫／投与量にする。２７℃で７２時間後、死亡率を記録する。葉量死亡率回帰をプロビット分析により分析する。感受性蛾のＬＣ50およびＬＣ90値を割ることにより抵抗性比率を算定する。結果を表ＶＩＩに示すが、これは、２ｇのＩａ／ＢＩＵおよび４ｇのＩａ/ＢＩＵによりBIOBITTM HPWPが増強されることを示す。詳しくは、４ｇのＩａ／ＢＩＵで、ＬＣ50抵抗性比率が２倍減少およびＬＣ90抵抗性比率が１０倍減少する。
ここで開示した特定の態様は、本発明のいくつかの相を具体的に説明することを意図したものであることから、ここで述べ特許請求した本発明は、これらの態様により範囲を制限されるものではない。いずれの同等の態様も本発明の範囲内にあるものとする。事実、本明細書で示し説明したものに加えて本発明の種々の変形例が、前述の説明から当業者等に明白にある。このような変形例も、付記する特許請求の範囲内に入るものとする。
種々の参考文献を本明細書で引用しており、これらの開示物は、参照によりそっくりそのまま明細書に含めるものとする。
微生物の寄託
Bacillus thuringiensisの以下の菌株を、ブダペスト条約により、アグリカルチュラル リサーチ サービス パテント カルチャー コレクション（ＮＲＲＬ）、ノーザーン リージョナル リサーチ センター（Northern Regional Research Center），1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，USAに寄託した。
菌株は、37 C.F.R. §1.14および35 U.S.C. §122の下にそれへの資格があると特許庁長官により定められた者に本特許出願中に培養物の入手が可能であることを保証する条件で寄託した。寄託物は、各寄託菌株の実質的に純粋な培養物を意味する。寄託物は、対象とする出願の対応するそれ、又はその所産を出願する国の外国特許法により必要に応じて入手可能である。しかしながら、寄託物の入手可能性が、政府の通知により付与された特許権の特例で本発明を実施する実施権を構成するものではないことは当然のことである。
発明の分野
本発明は、バシラス（Bacillus）関連農薬、化学的農薬および／または農薬の性質を有するウィルスの農薬活性を増強する因子を同定して得る方法に関する。
発明の背景
毎年、農業、林業および公衆衛生に有害な病害虫（pest）は、何百万ドルもの損失を引き起こす。種々の戦略を用いてこのような病害中を防除してきた。
一つの戦略は、広い範囲またはスペクトルの活性を有する化学農薬の使用である。しかしながら、化学農薬を用いると多くの不利益がある。詳しくは、それらの広範な活性スペクトルのゆえに、これらの農薬は、有益な昆虫および、破壊的な病害虫に対する寄生虫のような非標的生体を駆除する可能性があるからである。更に、化学農薬は、しばしば、動物およびヒトに対し毒性である。更には、標的にした病害虫は、このような物質に繰り返し露出された場合、しばしば、耐性を獲得する。
別の戦略は、昆虫、菌類および雑草の害を防除する生物農薬の使用に関連する。生物農薬は、天然に存在する病原体および／またはこれらの病原体により産生された物質である。生物農薬を用いる有利性は、一般的に、化学農薬と比較して全体的に非標的生体および環境に害が少ないということである。
１．Bacillus thuringiensis（バシラス・スリンジェンシス）
最も広く用いられる生物農薬はBacillus thuringiensisである。Bacillus thuringiensisは、自然界、特に土壌および、昆虫の多い環境に広く分布している、運動性の桿状のグラム陽性細菌である。胞子形成中に、Bacillus thuringiensisは、チョウ目、ハエ目、および甲虫目の感受性昆虫の幼虫にとって摂食により殺虫性となる副胞子（parasporal）結晶封入体を産生する。封入体は、形状、数、および組成において変化することができる。これらは、サイズが２７−１４０ｋＤａの範囲にあってもよいデルタ−内毒素類と呼ばれる１つ以上の蛋白質から成る。殺虫性デルタ−内毒素類は、一般的に、幼虫の腸内でプロテアーゼ類により、昆虫の中腸の破壊、および最終的に死を引き起こす、より小さい（先端を切断した）毒性のポリペプチドに変換される（Hofte and Whiteley，1989，Microbiological Reviews 53:242-255）。
林業、農業、および公衆衛生領域において生物農薬として広く用いられるいくつかのBacillus thuringiensis菌株がある。Bacillus thuringiensis subsp. kurstakiおよびBacillus thuringiensis subsp. aizawaiは、チョウ目に特異的なデルタ−内毒素類を産生する。甲虫目に特異的なデルタ−内毒素類は、Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionisにより産生される（Krieg等，1988，米国特許第４，７６６，２０３）。更に、Bacillus thuringiensis subsp. israelensisは、ハエ目に特異的なデルタ−内毒素類を産生する（Goldberg，1979，米国特許第４，１６６，１１２）。
ハエ目の害虫に特異的な他のBacillus thuringiensis菌株も述べられてきた。ハエ目およびチョウ目に毒性である、Bacillus thuringiensis分離菌株が、開示されてきた（Hodgman等，1993，FEMS Microbiology Letters 114:17-22）。この分離菌株から得た精製した結晶デルタ−内毒素のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＣｒｙＩＡ（ｂ）、ＣｒｙＩＢ、およびＣｒｙＩＩＡトキシンに関連する３種の蛋白質種を示した。１４０、１２２、７６、７２、および３８ｋＤａの分子量を有する蛋白質から成る、ハエ目に活性な結晶を産生するBacillus thuringiensis分離菌株も開示されてきた（Payne，1994，米国特許第５，２７５，８１５）。ＥＰＯ ４８０，７６２は、ハエ目害虫に対しそれぞれ活性である５種のB.t.菌株を開示しており、また、それぞれ、独特の結晶デルタ−内毒素のパターンを有する。
チョウ目、甲虫目、およびハエ目以外の害虫（pest）に対して農薬活性を有するいくつかのBacillus thuringiensis菌株が述べられてきた。線虫類に対して毒性であるデルタ−内毒素を産生する５種のBacillus thuringiensis菌株が開示されてきた（Edward、Payne、およびSoares，1988，ヨーロッパ特許出願０ ３０３ ４２６ Ｂ１）。また、寄生性原生動物の宿主となっているヒトおよび動物を治療するために用いることのできるBacillus thuringiensis菌株、ＰＳ８１Ｆも開示されてきた（ThompsonおよびGaertner，1991，ヨーロッパ特許出願０ ４６１ ７９９ Ａ２）。ダニ害虫に対する活性を有するいくつかのBacillus thuringiensis分離菌株も開示されてきた。これらの分離菌株は、３５ｋＤａから１５５ｋＤａの（広い）範囲の分子量を有する蛋白質から成る結晶を産生する（Payne、Cannon、およびBagley，1992，ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９２／１９１０６）。また、ハチ目の害虫に対する活性（Payne、Kennedy、Randall、Meier、およびUick，1992，ヨーロッパ特許出願０ ５１６ ３０６ Ａ２）；カメムシ目の害虫に対する活性（PayneおよびCannon，1993，米国特許第５，２６２，１５９）；吸虫類の害虫に対する活性（Hickle、Sick、Schwab、Narva、およびPayne，1993，米国特許第５，２６２，３９９）；ならびにプチロプテラ（Phthiraptera）目の害虫に対する活性（PayneおよびHickle，1993，米国特許第５，２７３，７４６）を有するBacillus thuringiensis菌株も開示されてきた。更に、ハジラミDamalinia ovis、プチロプテラ目害虫に毒性である、オーストラリアンシープの刈り取った毛から単離したBacillus thuringiensis subsp. Kurstakiの別の菌株、ＷＢ３Ｓ−１６が開示されてきた（Drummond、Miller、およびPinnock，1992，J. Invert. Path. 60:102-103）。
デルタ−内毒素は、通常プラスミド上に位置するｃｒｙ（結晶蛋白質）遺伝子によってコードされている。ｃｒｙ遺伝子は、相対的アミノ酸相同性および殺虫特異性に基づいて６つのクラス及びいくつかのサブクラスに分類されてきた。主要なクラスは、チョウ目に特異的な（ｃｒｙＩ）；チョウ目およびハエ目に特異的な（ｃｒｙＩＩ）；甲虫目に特異的な（ｃｒｙＩＩＩ）；ハエ目に特異的な（ｃｒｙＩＶ）（HofteおよびWhiteley，1989，Microbiological Reviews 53:242-255）；甲虫目およびチョウ目に特異的な（ｃｒｙＶ遺伝子：Tailor等，1992，Molecular Microbiology 6:1211-1217により称される）；ならびに線虫類に特異的な（ｃｒｙＶおよびｃｒｙＶＩ遺伝子：Feitelson等，1992，Bio/technology 10:271-275により称される）ものである。
デルタ−内毒素類は、組み換えＤＮＡ法により生産されてきた。組み換えＤＮＡ法により生産されるデルタ−内毒素類は、結晶形態であってもよいし、なくてもよい。
Bacillus thuringiensisのいくつかの菌株は、単独で農薬活性を示すβ−外毒素Ｉ型即ちスリンジェンシン（thuringiensin）として知られている熱安定性の殺有害生物アデニン−ヌクレオチド類似体を産生することを示してきた（Sebesta等，H.D.Burges（編），Microbial Control of Pests and Plant Diseases，Academic Press，New York，1980，249-281ページ）。β−外毒素Ｉ型は、いくつかのBacillus thuringiensis培養の上澄中で発見された。これは、７０１の分子量を有し、アデノシン、グルコースおよびアラル酸（allaric acid）から成る（Farkas等，1977，Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 42:909-929;Luthy等，Kurstak（編），Microbial and Viral Pesticides，Marcel Dekker，New York，1982，35-72ページ）。その宿主の範囲には、イエバエ（Musca domestica）、Mamestra configurata Walker、ナミハダニ（Tetranychus urticae）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、およびニセナミハダニ（Tetranychus cinnabarinus）が含まれるがこれらに限定される訳ではない。β外毒素Ｉ型の毒性は、ＡＴＰとの競合によるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害によるものと考えられる。β−外毒素Ｉ型は、５種のBacillus thuringiensis菌株のｃｒｙプラスミドによりコードされていることが示されてきた（Levinson等，1990，J. Bacteriol. 172:3172-3179）。β−外毒素Ｉ型は、Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis血清型１、Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi血清型９、およびBacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis血清型１０により産生されることが見い出された。
β−外毒素ＩＩ型として分類される別のβ−外毒素が、述べられてきた（Levinson等，1990，J. Bacteriol. 172:3172-3179）。β−外毒素ＩＩ型は、Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni血清型８ａｂにより産生されることが見い出されており、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）に対して活性である。β−外毒素ＩＩ型の構造は、完全には分かっていないが、さもなければプロトンによって占められるであろう位置にリボース環への結晶があるアデニンの場所にプソイドウリジン部分がある点でβ−外毒素Ｉ型のそれと著しく異なる（Levinson，in Hickle and Finch（編），Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis，ACSシンポジウムシリーズ，Washinguton，D.C.，1990，1414-136ページ）。更に、ヌクレオシド塩基に相当するプロトンＮＭＲスペクトルで唯一のシグナル（７．９５ｐｐｍ）があり、リボース型のアノマー性蛋白質シグナル（５．７８ｐｐｍ）がない。
Bacillus thuringiensisから単離されてきた他の水溶性物質としては、イエバエの幼虫に対して毒性であるアルファ−外毒素（Luthy，1980，FEMS Microbiol. Lett 8:1-7）；その毒性作用がベータ−外毒素またはデルタ−内毒素との組み合わせでのみ発現される、レシチナーゼ、キチナーゼ、およびプロテアーゼを含む種々の酵素であるガンマ−外毒素類（Forsberg等，1976，Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality，カナダ国内評議会、環境の質に対する科学的基準に関するＮＲＣ準委員会、農薬および関連化合物ならびに生物学的現象に関する副委員会）；ベータ−外毒素と類似した構造を持ち、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）に対しやはり活性であるシグマ外毒素（Argauer等，1991，J. Entomol. Sci. 26:206-213）；ならびにアンヒドロスリンジェンシン（Prystas等，1975，Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 40:1755）が挙げられる。
２．ツウィッタマイシン（zwittermicin）
植物病原体疫病菌Phytophthora medicaginis（フィトフトーラ・メディカギニス）の生育を阻害しアルファルファの感染を減少させるBacillus cereus（バシラス・セレウス）由来の物質が単離されている（例えば、米国特許第４，８７７，７３８および４，８７８，９３６参照）。他の活性は開示されていない。以下の構造が、ツウィッタマイシンＡについて解明されてきた（He等，Tet. Lett. 35:2499-2502）：
当業界は、増加した死亡率のB.t.処方物を達成しようと努力してきた。その方法には、増加した死亡率を有する新規な菌株の探索、現在の菌株を操作する試み、ならびにB.t.胞子および結晶と新規な農薬担体、化学農薬、または増強剤（例えば、米国特許第５，２５０，５１５、トリプシン阻害物質参照）とを組み合わせることにより、より効果的な処方物を設計する試みが含まれていた。従って、農薬の農薬活性を増強する（potentiate）ことが、本発明の目的である。
発明の概要
本発明は、
（ａ）適切な条件下でBacillus菌株を培養し；
（ｂ）工程（ａ）の培養物の上澄から因子を回収して成るBacillus関連農薬の農薬活性を増強する因子を得る方法に関する。
特定の態様において、Bacillus菌株は、Bacillus subtilus（バシラス・サブチラス）、Bacillus licheniformis（バシラス・リケニフォルミス）、およびBacillus thuringiensis（バシラス・スリンジェンシス）から成る群から選ばれる。好ましい態様において、この因子は、実質的に純粋な形態である。本明細書で定義するような゛実質的に純粋な゛因子とは、１０％未満の夾雑物、例えば、デルタ−内毒素蛋白質を含有する因子を意味する。このような実質的に純粋な因子は、例えば、カラムクロマトグラフィーにより、この因子を単離することにより得ることができる。
得られる因子は、増強因子である。本明細書で定義するような゛増強因子（potentiator）゛とは、有意な農薬活性がない、例えば、生物検定法（セクション６参照）により測定して約３０００μｇ／ｇを超えるＬＣ50（ＬＣ50は、害虫の５０％を殺すのに必要な物質濃度である）であるが、Bacillus関連農薬の農薬活性を少なくとも約５０％増加させるように作用し、幼虫の発育阻止をしない物質である。セクション２で述べるように、トリプシン阻害物質および外毒素のような当業界で公知の農薬活性を増強することのできる他の物質は、農薬活性を有する。
特定の態様において、この因子は、水溶性である。本明細書の定義では、少なくとも約１ｍｇの物質を１ｍｌの水に溶解することができれば、物質または化合物は、゛水溶性゛である。この因子は、化学農薬および／または農薬的性質を有するウィルスの農薬活性も増強することができる。
本明細書で定義するような、゛Bacillus関連農薬゛とは、Bacillus（例えば、Bacillus thuringiensisまたはBacillus subtilis）菌株、胞子、または物質、例えば、害虫に対する活性もしくは害虫を殺す活性を有する蛋白質もしくはその断片、または害虫に対する活性もしくは害虫を殺す活性を有するBacillus蛋白質（例えば、Bacillus thuringiensisデルタ−内毒素）もしくはその断片をコードするBacillus遺伝子を発現させることのできる微生物および許容される担体（このような担体の例は、下記のセクション５．２．参照）である。害虫（又は有害生物とも言う；pest）は、例えば、昆虫、線虫、ダニ、またはカタツムリ類（snail）であってもよい。害虫に対する活性もしくは害虫を殺す活性を有するBacillus蛋白質もしくはその断片をコードするBacillus遺伝子を発現させることのできる微生物は、葉面（植物の葉の表面）、および／または根圏（植物の根を取り巻く土壌）、および／または水性環境に存在し、特定の環境（作物および他の昆虫生息地）で野生型微生物とうまく競合することができ、害虫に対する活性もしくは害虫を殺す活性を有するBacillus蛋白質もしくはその断片をコードするBacillus遺伝子の安定な維持および発現を提供する。このような微生物の例としては、細菌、例えば、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsiella）、ザントモナス（Xanthomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、ロードシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストック（Leuconostoc）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、およびクロストリジウム（Clostridium）属；藻類、例えば、シアノフィセアエ（Cyanophyceae）、プロクロロフィセアエ（Prochlorophyceae）、ロードフィセアエ（Rhodophyceae）、ジノフィセアエ（Dinophyceae）、クリソフィセアエ（Chrysophyceae）、プリムネシオフィセアエ（Prymnesiophyceae）、ザントフィセアエ（Xanthophyceae）、ラフィドフィセアエ（Raphidophyceae）、バシラリオフィセアエ（Bacillariophyceae）、オースチグマトフィセアエ（Eustigmatophyceae）、クリプトフィセアエ（Cryptophyceae）、オーグレノフィセアエ（Euglenophyceae）、プラシノフィセアエ（Prasinophyceae）、およびクロロフィセアエ（Chlorophyceae）科；ならびに菌類、特に酵母、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、スポロボロマイセス（Sporobolomyces)、ロードトルラ（Rhodotorula）、およびオーレオバシジウム（Aureobasidium）属が挙げられるが、これらに限定される訳ではない。
本明細書で定義される゛農薬活性（pesticidal activity）゛は、害虫の殺傷もしくは害虫の生育の阻止または害虫の害からの植物の保護を通じて、害虫に対する活性の量を測定する。
得られた因子は、因子および農薬担体ならびに因子およびBacillus関連農薬、化学農薬および／または農薬の性質を有するウィルスを含んで成る組成物に処方することができる。これらの組成物は、害虫を防除するために、この因子および農薬的に許容される担体を含んで成る組成物に害虫を露出してBacillus関連農薬に対する害虫の抵抗性を減少させるために、またはBacillus関連農薬の農薬活性を増強するために用いることができる。
また、本発明は、
（ａ）Bacillusの菌株の培養；
（ｂ）（ａ）の培養物の上澄を回収；および
（ｃ）Bacillus関連農薬に対する増強効果を（ｂ）の上澄について測定
して成る、この因子を同定する方法に向けられる。
図の簡単な説明
図１は、Ｉａを精製するのに用いた一般的方法を図式的に示す。
図２は、Ｉａの13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
図３は、ＩａプロトンＮＭＲスペクトルを示す。
図４は、Ｉａのアセチル化誘導体についてのｎＯｅ実験の結果を示す。
発明の詳細な説明
この因子は、Bacillus関連農薬の農薬活性を増強し、約３５０から約１２００または特定の態様においては約３５０から約７００の分子量であってもよい。
この因子は、Bacillus関連農薬の農薬活性を少なくとも約１．５倍から任意に約１０００倍、好ましくは約１００倍から約４００倍増強する。特定の態様において、この因子は、全鎖長形態、または蛋白質分解により処理され先端が切断された形態の、これらに限定される訳ではないが、ＣｒｙＩ（これらに限定される訳ではないがＣｒｙＩＡ、ＣｒｙＩＢ、およびＣｒｙＩＣを含む）、ＣｒｙＩＩ、ＣｒｙＩＩＩ、ＣｒｙＩＶ、ＣｒｙＶ、またはＣｒｙＶＩ蛋白質を含むBacillus thuringiensisデルタ−内毒素の農薬活性を、約１．５倍から約１０００倍増強する。最も特定の態様において、この因子は、B.t.デルタ−内毒素を約１００倍から約４００倍増強する。また、この因子は、化学農薬および／または農薬の性質を有するウィルスの農薬活性も増強する。
また、この因子は、水溶性であり、水中で約１００℃まで少なくとも約５分間安定であり、少なくとも約１０時間直射日光に供した場合安定であり、および／または約２のｐＨで約１０日間安定であることができる。この因子は、１３個の炭素を有することができる。更に、この因子は、δ１．５、３．２２、３．２９、３．３５、３．４３、３．５８、３．７３、３．９８、４．０７、４．１５、４．２５、４．３５に1Ｎ ＮＭＲシフトを有することができる。
最も特定の態様において、この因子又はその塩は、構造式Ｉａを有する。
１．因子の獲得
該因子は、振蕩フラスコまたは発酵容器内のBacillus菌株（例えば、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、およびBacillus thuringiensis）から得ることができる。特定の態様において、これらに限定される訳ではないが、Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki、Bacillus thuringiensis subsp. aizawai、Bacillus thuringiensis subsp. galleriae、Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus、Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis、Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis、Bacillus thuringiensis subsp. alesti、Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis、Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis、Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus、Bacillus thuringiensis subsp. finitimus、Bacillus thuringiensis subsp. kenyae、Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni、Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus、Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffiおよびBacillus thuringiensis subsp. israelensisを含むBacillus thuringiensisの培養物の上澄から因子を得ることができる。好ましい態様において、因子は、Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki、Bacillus thuringiensis subsp. aizawai、もしくはBacillus thuringiensis subsp. galleriae、または実質的に同じ増強活性を有するその突然変異体の上澄から得ることができる。特定の態様において、因子は、Bacillus thuringiensis subsp. kurstakiのｃｒｙ-ｓｐｏ-突然変異体から回収される。
Bacillusは、当業界で公知の培地および発酵技術を用いて培養することができる（例えば、Rogoff等，1969，J. Invertebrate Path. 14:122-129；Dulmage等，1971，J. Invertebrate Path. 18:353-358；Dulmage等，in Microbial Control of Pest and Plant Diseases，H.D. Burges，ed.，Academic Press，N.Y.，1980参照）。このサイクルの終了後、当業界で周知の方法、例えば、遠心分離および/または限外濾過により培養（発酵）ブロスからB.t.胞子及び結晶を分離することにより上澄を回収することができる。因子は、当業界で周知の方法、例えば、限外濾過、蒸発、および噴霧乾燥により回収することのできる上澄に含まれている。この手法を、以下のセクションで更に詳細に述べる。
因子の精製は、これらに限定される訳ではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、電気泳動手法、溶解度較差、抽出、または当業界で公知の他の標準技法を含む、当業界で公知の種々の手法により行うことができる。
Bacillus関連農薬、農薬活性を有するウィルス、または種々の害虫に対する化学農薬の農薬活性を増強する因子の活性は、人工昆虫飼料への混入、人工飼料への重層、葉面塗布、葉面浸せき、および葉面散布のような当業界で公知の手法を用いて測定することができる。このような測定の特定の例を、下記のセクション７に示す。
２．因子を含んで成る組成物
得られた因子は、単独で；上記で定義したような、害虫に対する活性もしくは害虫を殺すか害虫から植物を保護する活性を有するBacillus菌株、胞子、蛋白質もしくはその断片または他の物質であるBacillus関連農薬と共に；化学農薬および/または昆虫病原性ウィルス、ならびに許容される担体と共に農薬組成物、例えば、懸濁剤、液剤、エマルション、粉剤、分散顆粒剤、水和剤、乳剤、エアゾール剤または含浸顆粒剤に、処方することができる。このようなBacillus菌株の例としては、Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki（Abbott Laboratories，Inc.からDIPELTM、SandozからJAVELINTM、Novo Nordisk A/SからBIOBITTM、Novo Nordisk A/SからFORAYTM、Novo Nordisk A/SからBIOCOTTM、MycogenからMVPTM、Novo Nordisk A/SからBACTOSPEINETM、およびSandozからTHURICIDETMとして市販）；Bacillus thuringiensis subsp. aizawai（Novo Nordisk A/SからFLORBACTM、およびAbbott Laboratories，Inc.からXENTARITMとして市販）；Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis（Novo Nordisk A/SからNOVODORTM、SandozからTRIDENTTM、MycogenからM-TRAKTMおよびM-ONETMとして市販）；Bacillus thuringiensis subsp. israelensis（Novo Nordisk A/SからBACTIMOSTMまたはSKEETALTMのいずれか、SandozからTEKNARTMおよびAbbott Laboratories，Inc.からVECTOBACTMとして市販）；Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis（EcogenからFOILTMとして市販）；Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai（EcogenからCONDORTMおよびCiba-GeigyからAGREETMとして市販）；ならびにBacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki（EcogenからCUTLASSTMとして市販）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。Bacillus関連蛋白質は、これらに限定される訳ではないが、ＣｒｙＩ、ＣｒｙＩＩ、ＣｒｙＩＩＩ、ＣｒｙＩＶ、ＣｒｙＶ、およびＣｒｙＶＩを含む群から選ぶことができる。化学農薬は、例えば、ジフルベンズロンのような昆虫成長調整物質、チオジカルブおよびメソミルのようなカーバメート剤、クロルピリフォスのような有機燐剤、シペルメスリンおよびエスフェンバララートのようなピレスロイド剤、クリオライトのような無機フッ素、ならびにピロールであってもよい。昆虫病原性ウィルスは、バキュロウィルス（baculovirus）、例えば、Autographa californica核多角体ウィルス（ＮＰＶ）、Syngrapha falciferaＮＰＶ、Cydia pomonella ＧＶ（グラニュローシスウィルス）、Heliothiszea ＮＰＶ、Lymantria dispar ＮＰＶ、Orgyia pseudotsugata ＮＰＶ、Spodoptera exigua ＮＰＶ、Neodiprion lecontei ＮＰＶ、Neodiprion sertifer ＮＰＶ、Harrisina brillians ＮＰＶ、およびEndopiza viteana Clemens ＮＰＶであってもよい。
物質およびBacillus関連農薬を含んで成る組成物中に、物質は、少なくとも約０．１ｇ／ＢＩＵまたはBacillusデルタ−内毒素および胞子１ｇ当たり０．０５ｇの因子、任意に約３００ｇ／ＢＩＵまたはBacillusデルタ−内毒素および胞子１ｇ当たり１５０ｇまでの物質、好ましくは２ｇ／ＢＩＵまたはBacillusデルタ−内毒素および胞子１ｇ当たり１ｇの量で存在することができる。本明細書で定義する゛ＢＩＵ゛は、生物検定法により測定されるビリオン国際単位である。生物検定法は、標準検定昆虫としてTrichoplusia niまたは他の害虫を用いた標準Bacillus比較物質と試料を比較する。力価は、比較標準ＬＣ50で割り、次いで、比較標準力価を掛けることにより決定する。
別の態様において、本組成物は、実質的に純粋な形態の因子、または乾燥、濃縮、または液体形態のBacillus由来の上澄、ならびにその例が下記に開示される農薬的に許容される担体を含んで成ることができる。この組成物は、植物、例えば、トランスジェニック植物に個別に供することができる。詳細には、本組成物は、前もってBacillus thuringiensis遺伝子を含み発現する植物に供することができる。別の態様において、本組成物は、前もってBacillus thuringiensis組成物に露出した植物に供することができる。別の態様において、本組成物は、ハエ目害虫の他の環境、例えば水または土壌に供することができる。この物質は、本組成物中に約０．００１％から約６０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。
この物質および農薬として許容される担体を含んで成る組成物は、害虫の防除に加え、農薬に対する害虫の抵抗性を減少させるのにも用いることができる。あるいは、本組成物は、Bacillus関連農薬を増強するのに用いることができる。一つの態様において、本組成物は、少なくとも約２ｇ物質／ＢＩＵから任意に約３００ｇ物質／ＢＩＵの量で農薬と同時に供することができる。他の態様において、本組成物は、残存農薬の効き目を拡大するアジュバントとして農薬の約２４時間後までに供することができる。
上記で開示したこのような組成物は、表面活性剤、不活性な担体、保存料、湿潤剤、摂食刺激剤、誘引物質、カプセル化剤、結合剤、乳化剤、染料、Ｕ．Ｖ．保護剤、緩衝剤、流動化剤、または製品の扱いやすさおよび特定の標的害虫への施用を容易にする他の成分の添加により得ることができる。
適切な表面活性剤としては、カルボン酸塩、例えば、長鎖脂肪酸の金属カルボキシレート；Ｎ−アクリルサルコシナート；脂肪アルコールエトキシレート類と燐酸のモノもしくはジ−エステル又はこのようなエステルの塩；ドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウムまたはセチル硫酸ナトリウムのような脂肪アルコール硫酸塩；エトキシル化脂肪アルコール硫酸塩；エトキシル化アルキルフェノール硫酸塩；リグニンスルホン酸塩；石油スルホン酸塩；アルキル−ベンゼンスルホン酸塩または低級アルキルナフタレンスルホン酸塩、例えば、ブチル−ナフタレンスルホン酸塩のようなアルキルアリ−ルスルホン酸塩；スルホン化ナフタレン−ホルミアルデヒド縮合物の塩；スルホン化フェノール−ホルミアルデヒド縮合物の塩；または、アミドスルホネート類、例えば、オレイン酸とＮ−メチルタウリンのスルホン化縮合生成物もしくは、ジアルキルスルホコハク酸塩、例えば、スルホン酸ナトリウムもしくはジオクチルスクシナートのようなより複雑なスルホン酸塩のような陰イオン化合物が挙げられる。非イオン性薬物としては、脂肪酸エステル類、脂肪アルコール類、脂肪酸アミド類または脂肪−アルキル−もしくはアルケニル−置換フェノール類とエチレンオキシドとの縮合生成物、多価アルコールエーテル類の脂肪エステル類、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル類、エチレンオキシドとこのようなエステル類の縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマー類、２，４，７，９−テトラエチル−５−デシン−４，７−ジオールのようなアセチレングリコール類、またはエトキシル化アセチレングリコール類が挙げられる。陽イオン表面活性剤の例としては、例えば、アセテート、ナフテナートまたはオレアートのような脂肪族モノ−、ジ−、またはポリアミン；ポリオキシエチレンアルキルアミンのアミンオキシドのような酸素含有アミン；カルボン酸とジ−またはポリアミンとの縮合により調製されるアミド−結合アミン；または四級アンモニウム塩が挙げられる。
不活性な物質の例としては、カオリン、雲母、石膏、肥料、フィロ珪酸塩類、炭酸塩類、硫酸類、もしくは燐酸塩類のような無機物質；蔗糖、デンプン類、もしくはシクロデキストリン類のような有機物質；または木産物、コルク、粉末にしたトウモロコシの穂軸、籾殻、落花生の殻、およびクルミの殻のような植物性物質が挙げられる。
本発明の組成物は、直接の適用に好適な形態で、または適用前に適切な量の水もしくは他の希釈剤での希釈を必要とする濃縮物もしくは一次組成物として存在することができる。農薬の濃度は、特定の処方物の性質、詳しくは、濃縮物か又は直接用いることになっているかどうかに依存して変化する。本組成物は、１から９８％の固形または液体不活性担体、および０から５０％，好ましくは０．１から５０％の表面活性剤を含有する。これらの組成物は、市販品に表示された割合、好ましくは、乾燥形態の場合エーカー当たり約０．０１ポンドから５．０ポンド、液体形態の場合エーカー当たり約０．０１パイントから２５パイントで投与する。
更なる態様において、Bacillus thuringiensis結晶デルタ−内毒素および／または因子は、標的害虫の環境に供する場合、前処理が結晶デルタ−内毒素または物質に有害でない限り、農薬活性を延長するために処方に先だって処理することができる。このような処理は、処理が本組成物の性質に有害に影響しない限り、化学的および／または物理的手段によってもよい。化学的試薬の例としては、ハロゲン化薬剤；ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類；ゼフィランクロライド（zephiran chloride）のような抗−感染剤；イソプロパノールおよびエタノールのようなアルコール類；ならびにBouinの固定液およびHellyの固定液のような組織学的固定液（例えば、Humason，Animal Tissue Techniques，W.H. Freeman and Co.，1967）参照）が挙げられるがこれらに限定される訳ではない。
本発明の組成物は、害虫が植物上に出現しはじめる時点で又は保護的手段として害虫の出現前に、例えば、噴霧または散粉により植物に直接供することができる。本発明の範囲内で保護される植物としては、禾穀類（コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、イネ、モロコシおよび関連作物）、ビート類（サトウダイコンおよび飼料ビート）、石果類、梨果類およびソフトフルーツ（リンゴ類、梨類、プラム類、桃類、アーモンド類、サクランボ類、イチゴ類、キイチゴ類、およびブラックベリー類）、マメ科植物（アルファルファ、ソラマメ類、インゲンマメ類、レンズマメ類、エンドウマメ類、ダイズ類）、油料植物類（セイヨウアブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ類、ヒマワリ類、ココナッツ類、ヒマ類、ココアマメ類、ピーナツ類）、キュウリ科植物類（キュウリ、ペポカボチャ類、メロン類）、繊維植物類（ワタ、アマ、アサ、ジュート）、柑橘類の果物（オレンジ類、レモン類、グレープフルーツ、マンダリン類）、野菜類（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ類および他のアブラナ科、ニンジン類、タマネギ類、トマト類、ジャガイモ類）、クスノキ類（アボガド類、シナモン、ショウノウ）、落葉樹および針葉樹（シナノキ類、イチイ類、オーク類、ハンノキ類、ポプラ類、カボノキ類、モミ類、カラマツ類、マツ類）、またはトウモロコシ、芝草、タバコ、ナッツ類、コーヒー、サトウキビ、お茶、ブトウ糖、ホップ類、バナナ類および天然のゴムの木ならびに観賞植物が挙げられるが、これらに限定される訳ではない。本組成物は、葉面、畦間、全面顆粒、゛レイ−バイ（lay-by）゛散布、または土壌灌注施用により供することができる。それが、植物が最も深刻に損傷をうけ得る時期であることから、植物成長の初期段階で害虫の良好な防除を得ることが概ね重要である。噴霧剤または粉剤は、それが必要と考えられるならば、他の農薬を都合よく含有することができる。好ましい態様において、本発明の組成物は、植物に直接供する。
また、本発明の組成物は、池、湖、小川、川、よどんだ水、およびハエ目害虫、特に公衆衛生上重要な害虫による害を受けやすい他の地域に直接供することもできる。本組成物は、噴霧、粉剤散布、スプリンクリング等により供することができる。
本発明の組成物は、チョウ目、例えば、アクロイア・グリセラ（Achroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、アドキソフィエス・オラナ（Adoxophyes orana）、アグロティス・イプシロン（Agrotis ipsilon）、アラバマ・アルギラセアエ（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アミエロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarisia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンセラエア・ペルニ（Antheraea pernyi）、アンティカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、アーチプス sp.（Archips sp.）、アルジロタエニア sp.（Argyrotaenia sp.）、アセティス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボンビックス・モリ（Bombyx mori）、バキュラトリックス・スルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、カドラ・カウテラ（Cadra cautella）、コリストニューラ sp.（Choristoneura sp.）、コキリス・ホスペス（Cochylis hospes）、コリアス・ユーリテム（Colias eurytheme）、コルシラ・セファロニカ（Corcyra cephalonica）、サイディア・ラティフェレアナス（Cydia latiferreanus）、サイディア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテジェリマ（Datana integerrima）、デンドロリマス・シベリカス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フュネラリス（Desmia funeralis）、ジアファニア・ハイアリナタ（Diaphania hyalinata）、ジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、エノモス・サブシグナリア（Ennomos subsignaria）、イーオレウマ・ロフティニ（Eoreuma loftini）、エフェスティア・エルテラ（Ephestia elutella）、エラニス・ティリアリア（Erannis tiliaria）、エスティグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、ユーリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、ユーポエシリア・アンビグエラ（Eupoecilia ambiguella）、ユープロクティス・クリソルホエア（Euproctis chrysorrhoea）、ユーゾア・メロリア（Euxoa messoria）、ガリエリア・メロネラ（Galleria mellonella）、グラフォリタ・モレスタ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカーナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレキサ（Helicoverpa subflexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）、ヘリオチス・ビレッセンス（Heliothis virescens）、ヘミロイカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテラム（Homoeosoma electellum）、ヒファントリア・クネア（Hyphantria cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ランブディナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ランブディナ・フィセラリア・ルグブロザ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ロイコマ・サリシス（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロキソステゲ・スティクティカリス（Loxostege sticticalis）、リマントリア・ジスパー（Lymantria dispar）、マカラ・チルシサリス（Macalla thyrsisalis）、マラコソーマ sp.（Malacosoma sp.）、マメストラ・ブラシカエ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィギュラータ（Mamestra configurata）、マンズカ・キンクエマクラータ（Manduca quinquemaculata）、マンズカ・セキサタ（Manduca sexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、オペロフテラ・ブルマータ（Operophtera brumata）、オルギア sp.（Orgyia sp.）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピリオ・クレスフォンテス（Papilio cresphontes）、ペクチノフォラ・ゴシピエラ（Pectinophora gossypiella）、フリガニジア・カリフォルニア（Phryganidia californica）、フィロノルクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、プラチペラ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・サルタナ（Platynota sultana）、プラチプチリア・カルデュイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、プロディア・インテルパンクテラ（Plodia interpunctella）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）、ポンティア・プロトディス（Pontia protodice）、プソイダレチア・ユニパンクタ（Pseudaletia unipuncta）、プソイドプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シトトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロノタ・オセラナ（Spilonota ocellana）、スポドプテラ sp.（Spodoptera sp.）、タウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、チネオラ・ビセリエラ（Tineola bisselliella）、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）、ウデア・ルビガリス（udea rubigalis）、キシロマイゲス・クルイアリス（Xylomyges cruialis）、イポノミュタ・パデラ（Yponomeuta padella）；ハエ目、例えば、アエデス sp.（Aedes sp.）、アンデス・ビタタス（Andes vittatus）、アナストレファ・ルーデンス（Anastrepha ludens）、アナストレファ・サスペンサ（Anastrepha suspensa）、アノフェレス・バルベリ（Anopheles barberi）、アノフェレス・クアドリマクラタス（Anopheles quadrimaculatus）、アルミゲレス・スバルバタス（Armigeres subalbatus）、カリフォラ・スチジアン（Calliphora stygian）、カリフォラ・ビシナ（Calliphora vicina）、セラチチス・カピタタ（Ceratitis capitata）、キロノムス・テンタンス（Chironomus tentans）、クリソミア・ルフィファシエス（Chrysomya rufifacies）、コクリオミア・マセラリア（Cochliomyia macellaria）、クレックス sp.（Culex sp.）、クリセタ・イノルナタ（Culiseta inornata）、ダカス・オレアエ（Dacus oleae）、デリア・アンティクア（Delia antiqua）、デリア・プラチュア（Delia platura）、デリア・ラジカム（Delia radicum）、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）、ユーペオデス・コロラエ（Eupeodes corollae）、グロシナ・アウステニ（Glossina austeni）、グロシナ・ブレビパルピス（Glossina brevipalpis）、グロシナ・ファウシペス（Glossina fuscipes）、グロシナ・モルシタンス・セントラリス（Glossina morsitans centralis）、グロシナ・モルシタンス・モルシタンス（Glossina morsitans morsitans）、グロシナ・モリスタンス・サブモルシタンス（Glossina moristans submorsitans）、グロシナ・パリジペス（Glossina pallidipes）、グロシナ・パルパリス・ガンビエンシス（Glossina palpalis gambiensis）、グロシナ・パルパリス・パルパリス（Glossina palpalis palpalis）、グロシナ・タキノイデス（Glossina tachinoides）、ハエマゴガス・エクイナス（Haemagogus equinus）、ハエマトビア・イリタンス（Haematobia irritans）、ヒポデルマ・ボビス（Hypoderma bovis）、ヒポデルマ・リネアタム（Hypoderma lineatum）、ロイコピス・ニナエ（Leucopis ninae）、ルシリア・クプリナ（Lucilia cuprina）、ルシリア・セリカタ（Lucilia sericata）、ルツゾミア・ロングルパイピス（Lutzomyia longlpaipis）、ルツゾミア・シャンノニ（Lutzomyia shannoni）、リコリエラ・マリ（Lycoriella mali）、マイエチオラ・デストラクター（Mayetiola destructor）、ムスカ・オータムナリス（Musca autumnalis）、ムスカ・ドメスティカ（Musca domestica）、ネオベリエリア sp.（Neobellieria sp.）、ネフロトマ・サチュラリス（Nephrotoma suturalis）、オフィラ・アエネッセンス（Ophyra aenescens）、ファエニシア・セリカタ（Phaenicia sericata）、フレボトムス sp.（Phlebotomus sp.）、フォルミア・レジナ（Phormia regina）、サベセス・シアネウス（Sabethes cyaneus）、サルコファガ・ブラタ（Sarcophaga bullata）、スカトファガ・ステルコラリア（Scatophaga stercoraria）、ストモキシス・カルシトランス（Stomoxys calcitrans）、トキソリンキテス・アンボイネンシス（Toxorhynchites amboinensis）、トリプテロイデス・バンブサ（Tripteroides bambusa）の昆虫の害虫に対して効果的であることが可能である。しかしながら、本発明の組成物は、甲虫目、例えば、レプチノタルサ sp.（Leptinotarsa sp.）、アカンソスセリデス・オブテクタス（Acanthoscelides obtectus）、カロソブルクス・キネンシス（Callosobruchus chinensis）、エピラクナ・バリベスティス（Epilachna varivestis）、ピルハルタ・ルテオラ（Phrrhalta luteola）、サイラス・ホルミカリウス・エレガンツラス（Cylas formicarius elegantulus）、リストロノタス・オレゴネンシス（Listronotus oregonensis）、シトフィラス sp.（Sitophilus sp.）、シクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）、シクロセファラ・イマキュラタ（Cyclocephala immaculata）、マクロダクチラス・サブスピノサス（Macrodactylus subspinosus）、ポピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）、リゾトロガス・マヤリス（Rhizotrogus majalis）、アルフィトビウス・ジアペリナス（Alphitobius diaperinus）、パロラス・ラゼブルギ（Palorus ratzeburgi）、テネブリオ・モリタ（Tenebrio molitor）、テネブリオ・オブスキュラス（Tenebrio obscurus）、トリボリウム・カスタニウム（Tribolium castaneum）、トリボリウム・コンフサム（Tribolium confusum）、トリボリウム・テストラクター（Tribolius destructor）；ダニ目、例えば、オリゴニカス・プラテンシス（Oligonychus pratensis）、パノニカス・ウルミ（Panonychus ulmi）テトラニカス・ウルチカエ（Tetranychus urticae）；ハチ目、例えば、イリドミルメックス・ヒュミリス（Iridomyrmex humilis）、ソレノプシス・インビクタ（Solenopsis invicta）；シロアリ目、例えば、レチキュリタルメス・ヘスペラス（Reticulitermes hesperus）、レチキュリタルメス・フラビペス（Reticulitermes flavipes）、コプトタルメス・ホルモサヌス（Coptotermes formosanus）、ズーテルモプシス・アンギュスチコリス（Zootermopsis angusticollis）、ネオテルメス・コネクス（Neotermes connexus）、インシシテルメス・マイナ（Incisitermes minor）、インシシテルメス・イミグランス（Incisitermes immigrans）；ノミ目（Siphonaptera）、例えば、セラトフィラス・ガリナエ（Ceratophyllus gallinae）、セラトフィラス・ニガー（Ceratophyllus niger）、ノソプシラス・ファスシアタス（Nosopsyllus fasciatus）、レプトプシラ・セグニス（Leptopsylla segnis）、クテノセファリデス・カニス（Ctenocephalides canis）、クテノセファリデス・フェリス（Ctenocephalides felis）、エキクノファガ・ガリナセアエ（Echicnophaga gallinacea）、プレックス・イリタンス（Pulex irritans）、キセノプシラ・ケオピス（Xenopsylla cheopis）、キセノプシラ・ベキサビリス（Xenopsylla vexabilis）、ツンガ・ペネトランス（Tunga penetrans）；およびハリセンチュウ目（Tylenchida）、例えば、メロジドギネ・インコグニタ（Melodidogyne incognita）、プラチレンカス・ペネトランス（Pratylenchus penetrans）の害虫に対してもやはり効果的であることが可能である。
具体的に説明するために以下の実施例を示すが、本発明はそれにより制限される
ものではない。
実施例：Ｉａの特徴付け
ここで詳細に述べる通りに、Ｉａを回収し精製する。Ｉａの特徴付けを、下記に詳細に述べる。
１Ｉａの回収および精製
B. thuringiensis subsp. kurstaki菌株ＥＭＣＣ００８６（ＮＲＲＬにＢ−２１１４７として寄託）を、デンプン、加水分解したデンプン、またはグルコースのような炭素源および、蛋白質、加水分解した蛋白質、またはコーンスティープリカーのような窒素源から成る培地中で３０℃で７２時間発酵させる。発酵後１３時間でＩａの生産を検出する。約３０時間でピークの活性を見い出す。
B. thuringiensis subsp. kurstaki発酵により得た上澄を遠心分離により回収し、次いで、Rhone Poulenc UFシステムを用い３０ｋＤａ ＭＷ−ＣＯ膜を介した限外濾過により浄化する。３０ｋＤａ濾過は、残存細胞破片、結晶デルタ−内毒素、胞子、および３０ｋＤａ分子量より大きい可溶性蛋白質を除去した。透過物を、蒸発により１０倍に濃縮する。透過物を遠心分離し、次いで、０．２μ濾過して更にブロスから不溶性のものを除去するとＩａを含有する透明なブロスが残る。
均一になるまでのＩａの精製を、図１に模式図により示した多工程精製手順を用いて達成する。上記で概説した回収プロトコールと連結して、５ｋＤａ限外濾過工程を続けた。５ｋＤａ限外濾過から得た透過物をスルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換樹脂に吸着させ、酢酸アンモニウム溶液で溶出する。化合物を、次いで、凍結乾燥により約３０Ｘに濃縮し、塩および他の夾雑物を、ＢｉｏＲａｄ Ｐ２サイズ排除カラムで除去する。Ｐ２カラムから得たプールを、高分解能ＳＰ ＨＰＬＣ陽イオン交換カラムに通し、均質な化合物を得る。夾雑塩を、反復凍結乾燥により除去する。
活性を、Spodoptera exigua微生物学的定量法により監視し、純度を、キャピラリー電気泳動により測定する。ＢＩＯＢＩＴTM ＦＣ（１００μｌ）から精製した５０μｌのＩａおよび５０μｌのＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白質（１５μｇ／ｍｌ）から成る試料を、５００μｌの固形にした人口昆虫食餌を入れたゼリートレーの各ウェルに供する。種々の試料を入れたトレーを風乾させる。２匹から４匹の第二または第三前期齢のSpodoptera exiguaを、乾燥した試料をいれたウェルに加える。ウェルを、つついて穴を開けたマイラーで封をし、３０℃で２−３日間インキュベートする。発育阻止の程度および死亡率パーセントを、次いで、記録する。代表的には、各試料に対し、５個の複製ウェルで実験する。
２．構造解明
活性化合物は、水溶性であることを見いだしたが、有機溶媒中では可溶性ではない。これは、陽性に荷電しており、シリカ薄層クロマトグラフィーにより明らかにされるようにニンヒドリンと反応する。本化合物の13ＣおよびプロトンＮＭＲを、それぞれ図２および３に示す。13Ｃ ＮＭＲ実験は、１３個の炭素（３−［トリメチルシリルプロピオン酸を対象とした）の存在を示した。ＤＥＰＴ実験は、３個の四級炭素（Ｃ）、７個のメチン（ＣＨ）、３個のメチレン（ＣＨ2）があり、メチル基（ＣＨ3）はないことを測定した。１−ＤデカップリングおよびＣＯＳＹのようなプロトンカップリング実験を用い、８個の炭素を含む１つの大きなスピン系を同定する。更に、２個の炭素から成るより小さいスピン系が存在する。炭素プロトン相関実験（ＨＭＢＣ）は、その結合炭素に対する分子内の各プロトン共鳴の帰属を可能にした。
活性化合物（１３ｍｇ）のピリジン中の無水酢酸での処理は、極性がはるかに少ないアセチル化誘導体の形成に帰した。この誘導体をＨＰＬＣにより精製して３ｍｇの純粋なアセチル化誘導体を得る。質量分析は、この誘導体が、７個のアセテートおよび６９０の分子量を有し、その内３９６の分子量が活性化合物のものであり、偶数の窒素が存在することを示した。また、６個のアセテートおよび５個のアセテートを含有する断片を検出する。５個および６個のアセテート娘イオンの高分解能データは、６４５．２５９４（６個のアセテート）および６０７．２５１９（５個のアセテート）であり、これは、Ｉａが以下の分子式Ｃ13Ｈ28Ｎ6Ｏ8であることを示す。
活性化合物（１３ｍｇ）の６ＮのＨＣｌでの処理により、ニンヒドリン陽性である誘導体を得た。これらの結果は、アミド結合の存在を示す。誘導体は、２，３−ジアミノプロピオン酸として薄層クロマトグラフィーにより測定したものと同じＲｆ値を有した。ＮＭＲデータと共にこれらの結果は、２，３−ジアミノプロピオン酸の存在を示唆する。
Ｉａを分析するのに用いた別の技法は、空間を介した相互のプロトンの隣接を検出することのできるｎＯｅ（核オーバーハウザー効果）である。Ｉａのアセチル化誘導体に関してｎＯｅを行う。二次元のｎＯｅ実験（ＮＯＥＳＹ）において、８．０６ｐｐｍでのＮ−Ｈプロトンおよび５．１７プロトン間にＮＯＥｓを観察する（図４）。
Ｉａの以下の構造が解明された
３．Ｉａの性質
単離したＩａは、Spodoptera exiguaに対するBacillus thuringiensis subsp. kurstakiおよびBacillus thuringiensis subsp. aizawai結晶デルタ−内毒素農薬活性蛋白質の活性を、農薬活性蛋白質の形態と無関係に増強することを見い出す。処方されたB.t.k.、単離された結晶、全鎖長（１３０ｋＤａ分子量）または先端が切断されたＣｒｙＩＡ蛋白質（〜６５ｋＤａ分子量）の農薬活性は全て増強される。ＣｒｙＩＩおよびＣｒｙＩＣ封入体の活性も増強される。個々の先端が切断されたＣｒｙＩＡ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）蛋白質の活性も増強することが見い出される。ＩａとＣｒｙ蛋白質とのインキュベーション時間は、生物学的活性に臨界的であるとは見い出されていない。しかしながら、Ｉａは、単独では不活性である。増強作用の水準は、先端を切断したＣｒｙＩＡ蛋白質、ＣｒｙＩＩおよびＣｒｙＩＣ封入体では１００−２００倍ならびに全鎖長ＣｒｙＩＡ（ｃ）で約３２０倍（それぞれ表Ｉおよび表ＩＩ参照）であることが見い出される。詳しくは、全鎖長蛋白質では、Ｉａを用いた場合、０．７５μｇ／ｍｌのＣｒｙＩＡ（ｃ）により、２４０μｇ／ｍｌのＣｒｙＩＡ（ｃ）単独で得られるのと同じ昆虫死亡率／発育阻止得点を得た。先端が切断されたＣｒｙＩＡ（ｃ）の場合、Ｉａと組み合わせた、ＯＤ280が０．０００６のものは、ＯＤ280が０．０７５である単独で試験した同じ試料のＣｒｙＩＡ（ｃ）と同じ発育阻止得点であった。Ｉａと組み合わせた０．６μｇ／ｍｌの濃度のＣｒｙＩＩ封入体は、１２５倍の増強作用である、７５μｇ／ｍｌのＣｒｙＩＩ蛋白質単独と同じ発育阻止得点および同様の死亡率であった。Ｉａを加えた０．３μｇ／ｍｌの濃度のＣｒｙＩＣ封入体は、７５μｇ／ｍｌのＣｒｙＩＣ蛋白質単独と同様の死亡率および発育阻止得点であり、これは、２５０倍水準の増強作用を反映している。発育阻止をもたらすＣｒｙＩＡ蛋白質の濃度は、Ｉａの添加により死亡をもたらす。
Ｉａは、５分間の煮沸ではセクション７．１．で述べたような生物検定法により安定であることが見いだされるが、オートクレーブ（＞１９０℃）にかけることにより全ての活性を失う。更に、これは、直射日光に少なくとも１０時間供した場合、安定である。Ｉａは、ｐＨ２で３日間安定であるが、ｐＨ１２では不安定である。過ヨウ素酸または濃ＨＣｌに露出した場合、全活性を失うことが見い出される。
いくつかのBacillus種を、Ｉａの産生について評価する。菌株を、デンプン、加水分解したデンプン、またはグルコースのような炭素源および、蛋白質、加水分解した蛋白質、またはコーンスティープリカーのような窒素源から成る培地中で３０℃で７２時間発酵する。上澄を、上記のSpodoptera exigua微生物学的定量法を用い、Ｉａ生産について調査する。B. thuringiensis subsp. aizawai菌株ＥＭＣＣ００８７（ＮＲＲＬ Ｂ−２１１４８としてＮＲＲＬに寄託）およびB. thuringiensis subsp. galleriae（ＮＲＲＬに寄託）は、B. thuringiensis subsp. kurstakiとほぼ同じ濃度でＩａを産生することを見い出す。
また、Ｉａは、キャピラリー電気泳動により測定されるように、B. substilis、B. cereus、B. t. subsp. alesti、B. t. subsp. canadiensis、B. t. subsp. darmstadiensis、B. t. subsp. dendroliumus、B. t. subsp. entomocidus、B. t. subsp. finitimus、B. t. subsp. israelensis、B. t. subsp. kenyae、B. t. subsp. morrisoni、B. t. subsp. subtoxicus、B. t. subsp. tenebrionis、B. t. subsp. thuringiensis、および、B. t. subsp. toumanoffi、B. cereus、B. subtilis、ならびにB. thuringiensis subsp. kurstaki ｃｒｙ−ｓｐｏ−突然変異体中で産生される。
詳しくは、Ｉａの水準を定量化するのに、５０μｍｘ５７ｃｍ未被覆のキャピライーを具備したベックマンＰ／ＡＣＥキャピラリー電気泳動システム、０．２Ｍの燐酸緩衝液ｐＨ６．８、１５ＫＶの電圧、および２００ｎｍでの検出を用いる。試料容量は、２５分の操作時間で２０ｎｌである。
標準として精製Ｉａを１．２５ｍｇ／ｍｌ、０．６２５ｍｇ／ｍｌ、０．３１２５ｍｇ／ｍｌ、０．１５６ｍｇ／ｍｌ、および０．０７８ｍｇ／ｍｌの水準で用いて標準曲線を得る。直線の検量線を得る。その結果できたｙ＝ｍｘ＋ｂ等式を用いて各試料のＩａ濃度を得る。
各実験前に、キャピラリーにランニングバッファー（０．２Ｍ燐酸塩、ｐＨ６．８）を３分間流す。それぞれ２５分の実験後、キャピラリーに、１ＮのＮａＯＨを１分間、ＨＰＬＣ濾過水を１分間、０．５Ｍ燐酸を３分間、およびＨＰＬＣ濾過水を１分間流す。各ピーク下の面積を積分し、ピーク面積を決定し、標準曲線から最終濃度を算定する。
５．B.t.産生物の評価
種々の商業的に入手可能なB.t.産生物に存在するＩａの量を、上記セクション６．４．で述べたキャピラリー電気泳動により測定する。BACTOSPEINETM、JAVELINTM、NOVODORTM、SPHERIMOSTM、BACTIMOSTM、FORAYTM、FLORBACTMおよびBIOBITTMは、Novo Nordisk A/Sから得られる。XENTARITMおよびDIPELTMは、Abbott Laboratoriesから得られる。AGREETMはCiba-Geigyから得られ；MVPTMはMycogenから得られ、CUTLASSTMはEcogenから得られる。
結果を下記表ＩＩＩに示すが、これは、Ｉａが０．００１ｇ Ｉａ／ＢＩＵ未満から０．０７１ｇ Ｉａ／ＢＩＵの範囲の種々の量で存在することを示している。
第三齢Spodoptera exigua幼虫、第二齢Helicoverpa zea幼虫、第三齢Spodoptera frugiperda幼虫、第二齢Heliothis virescens幼虫、第３齢Trichoplusia ni幼虫、第三齢Pseudoplusia includens幼虫、第三齢Plutella xylostella幼虫、第三齢Spodoptera littoralis、および第三齢Mamestra brassicae幼虫を用い人工食餌混入生物検定法によりB.t.k.活性を測定する。
B.t.産生物にＩａを加えることによる増強作用の水準を測定し影響される昆虫の範囲を確立するために、食餌混入生物検定法を行う。Spodoptera exiguaに対して高濃度のＩａ（７．４−２３．７ｇ Ｉａ／ＢＩＵ）を用いた実験において、精製Ｉａ（７０％の有効成分、３０％アセテート対イオン）を用いてBIOBITTM FC（ＦＣは、フロアブル剤を表す）を増強する。表ＩＶに示す残りのデータは、BIOBITTM HPWP（高力価水和剤）のＩａ（０．６５８％有効成分）による増強作用を示す。FLORBACTM HPWPおよびＩａを用いてS. littoralisおよびM. brassicaeを調査する。
種々のB.t.産生物の重量を測定し、Ｉａを、０．１から２３７ｇ Ｉａ／ＢＩＵになるように加える。容量を０．１％ＴｗｅｅｎTMで調整する。試料を１分間音波処理し、次いで、最終容量に希釈する。ニートの試料（Ｉａ非含有）および比較物質を、同様に調製する。比較物質としては、ミリグラム当たり１６，０００国際単位（ＩＵ）の力価が与えられているB.t.k.HD-1-S-1980（NRRLから入手）および５３，０００ Spodoptera単位／ｍｇ（ＳＵ）の力価が与えられているJAVELINTM WGが挙げられる。
水、寒天、蔗糖、カゼイン、コムギ胚芽、メチルパラベン、ソルビン酸、亜麻仁油、セルロース、塩、およびビタミン類から成る標準人工食餌を、２０Ｌの加熱した釜の中で調製する。これは、７種の異なる濃度の各試験物質で１０から１２の試料を調査するのに十分な食餌を提供する。B.t.溶液を１６ｍｌ量になるように連続して希釈する。各アリコートを１８４ｇの溶解した食餌に加える。混合物を、次いで、均質にし、次いで、４０個の個々のセルを有するプラスティックトレー中に注ぐ。それぞれのバッチの食餌について３つの対照のトレーを調製する。一旦食餌が冷め固まったならば、既知齢（２−３齢）の昆虫１匹を各セルに加え、トレーを透明なマイラーの穴を開けたシートで覆う。トレーを棚の上に置き、２８℃で６５％相対湿度で４日間インキュベートする。
４日後、昆虫死亡率を評価する。各トレーを、テーブルの上に強く打ちつけ、動かなかった幼虫を死んだものとして数える。死亡率パーセントを算定し、データを、平衡プロビット分析を介して分析する。ＬＣ50ｓ、ＬＣ90ｓ、回帰線の傾き、変動係数、および力価を推定する。試料は、少なくとも３回または３つの力価が各試料の算定した平均の２０％以内になるまで実験する。各濃度のＩａと関係する活性の増加を算定するために、B.t.／Ｉａ試料のＬＣ50ｓを、試料中のB.t.の量を反映するように補正する。対のニートの試料のＬＣ50を、補正したＬＣ50値で割り、Ｉａと関係がある、ＬＣ50の減少倍数を得る。
以下の手法を用いてLobesia bothranaについて測定する。Lobesia bothranaにより攻撃されたブドウのつるを、噴霧していない畑で集め、幼虫を除去する。Ｉａの一連の希釈物（２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、および１０００μｇ／ｍｌ）を水で作成する。１匹の幼虫をペトリ皿の中央におく。幼虫が飲むのが観察されたならば、新たにカットしたブドウ液果を入れたペトリ皿に移す。幼虫を２２℃で３−４日間貯蔵する。
表ＩＶに示すように、ＬＣ50ｓの著しい減少が全種で観察される。
BIOBITTM FCおよびＩａを用いブロッコリ植物体に対し第二齢Spodoptera exigua幼虫で葉面生物検定法を行う。BIOBITTM FCに対するＩａの比率は、同じ２ｇ Ｉａ／ＢＩＵのBIOBITTM FCである。エーカー当たり２０ガロンの担体容量でトラックスプレーヤーを介してブロッコリ植物体に処置を施す。スプレーデポジットが乾燥した後、植物体から葉を切り取り、第二齢のSpodoptera exigua幼虫をたからせる。結果を下記の表ＶＩに示す。８．７ＢＩＵ／ヘクタールBIOBITTM FC＋Ｉａの比率で１００％の死亡率が観察されたが、一方、BIOBITTM FC単独では５８．８ＢＩＵ／ヘクタールで９２％および１７．６ＢＩＵ／ヘクタールで８％の幼虫を殺した。処理した植物体を直射日光下に８時間置いた後も、葉を切り取り上記幼虫をたからせる。日光下で８時間後、BIOBITTM FC単独では５８．８ＢＩＵ／ヘクタールで２７％の死亡率を得、一方、BIOBITTM FC＋Ｉａでは８．７ＢＩＵ／ヘクタールで１００％の死亡率を得た。
第四齢初期の幼虫で行った葉面検定は、BIOBITTM FC単独では５２ＢＩＵ／ヘクタールで７５％の死亡率、BIOBITTM FC（ＦＣは、フロアブル剤である）＋Ｉａでは１３ＢＩＵ／ヘクタールで１００％の死亡率であった。
ガーボンゾ・ビーンズ（garbonzo beans）に対する圃場試験（Spodoptera exigua）は、BIOBITTM FC単独で７０ＢＩＵ／ヘクタールでは５１％の防除を得、一方、２ｇ Ｉａ／ＢＩＵBIOBITTM FCで４０ＢＩＵ／ヘクタールでは８９％の防除（非処理と比較して）を提供することを示した。４５ＢＩＵ／ヘクタールのJAVELINTM WGにより５１％の防除を得た。
スィートコーンに対する圃場試験（Spodoptera frugiperda）は、３９．５ＢＩＵ／ヘクタールおよび２ｇ Ｉａ/ＢＩＵBIOBITTM FCが８４％の防除を提供することを示した。
９．抵抗性比率
感受性および抵抗性のコナガ（Plutella xylostella）のコロニーを生物検定する。抵抗性蛾は、JAVELINTM WGに徹底露出後、B.t.抵抗性を獲得した、フロリダの圃場で集めた試料である。BIOBITTM HPWPとＩａとを葉面浸漬生物検定法を用いて分析する。JAVELINTMおよびXENTARITMに対する抵抗性を、Ｉａ無しで測定する。直径６ｃｍのキャベツ葉の円形の切片を、８種の異なる濃度のB.t.産生物またはB.t.／Ｉａ処方物の１つに１０秒間浸す。濃度は、１から１０００ｐｐｍの範囲である。円形の葉を、２時間風乾させ、第二齢（０．２から０．４ｍｇ）の幼虫を入れたプラスティックのペトリ皿に置く。２５匹の昆虫／葉量／日を２回繰り返して５０匹の昆虫／投与量にする。２７℃で７２時間後、死亡率を記録する。葉量死亡率回帰をプロビット分析により分析する。感受性蛾のＬＣ50およびＬＣ90値を割ることにより抵抗性比率を算定する。結果を表ＶＩＩに示すが、これは、２ｇのＩａ／ＢＩＵおよび４ｇのＩａ/ＢＩＵによりBIOBITTM HPWPが増強されることを示す。詳しくは、４ｇのＩａ／ＢＩＵで、ＬＣ50抵抗性比率が２倍減少およびＬＣ90抵抗性比率が１０倍減少する。
種々の参考文献を本明細書で引用しており、これらの開示物は、参照によりそっくりそのまま明細書に含めるものとする。
微生物の寄託
Bacillus thuringiensisの以下の菌株を、ブダペスト条約により、アグリカルチュラル リサーチ サービス パテント カルチャー コレクション（ＮＲＲＬ）、ノーザーン リージョナル リサーチ センター（Northern Regional Research Center），1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，USAに寄託した。
Claims (6)
- バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株により生産された農薬の農薬活性を増強する方法であって、
前記農薬を、病害昆虫の抑制のために、前記農薬の農薬活性を増強する因子と組み合わせて使用することを含み、
前記因子は以下の構造
を有する化合物またはその塩である、前記方法。 - 前記バシラス菌株により生産された農薬が、バシラス・スリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ−内毒素または農薬的に活性なその断片を含んで成る、請求項１に記載の方法。
- 前記バシラス・スリンジェンシスデルタ−内毒素または農薬的に活性なその断片が、ＣｒｙＩ、ＣｒｙＩＩ、ＣｒｙＩＩＩ、ＣｒｙＩＶ、ＣｒｙＶ、およびＣｒｙＶＩから成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
- 前記バシラス・スリンジェンシスデルタ−内毒素または農薬的に活性なその断片が、ＣｒｙＩＡデルタ−内毒素または農薬的に活性なその断片である、請求項３に記載の方法。
- 前記バシラス・スリンジェンシスデルタ−内毒素または農薬的に活性なその断片が、ＣｒｙＩＣデルタ−内毒素または農薬的に活性なその断片である、請求項３に記載の方法。
- 前記バシラス菌株により生産された農薬が、バシラス・スリンジェンシス胞子を含んで成る、請求項１に記載の方法。
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