MXPA96004107A

MXPA96004107A - Composicion pesticida novedosa y cepa de bacillusthuringiensis

Info

Publication number: MXPA96004107A
Application number: MXPA/A/1996/004107A
Authority: MX
Inventors: Liu Chili; C Manker Denise; L Starnes Robert; M Macmullan Anita; A Lufburrow Patricia
Original assignee: Novo Nordisk Entotech Inc
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 1998-09-18

Abstract

La presente invención se refiere a una composición pesticida que comprende:(a) una sustancia que tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden Coleóptero, y actúa con un pesticida relacionado con Bacillus seleccionado a partir del grupo que consiste en cepas de Bacillus, esporas de Bacilus, proteínas de Bacillus y fragmentos de las mismas, contra una plaga, obteniéndose dicha sustancia de un sobrenadante de una fermentación de una cepa de Bacillus, en donde esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa estáen el sobrenadante de dicha fermentación, en la cual dicha sustancia estápresente en dicha composición en una cantidad de, por lo menos, 1g/ unidad de Leptinotarsa texana teniendo dicha sustancia la estructura (I) en donde R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en amino, hidroxi, alquilo de 1 a 10átomos de carbono,éster alquílico de 1 a 1'átomos de carbono,éster arílico, halógeno, alcoxi de 1 a 5átomos de carbono y amimoácido;R2 es amino o alquilo de 1 a 10átomos de carbono;R3 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo de 1 a 10átomos de carbono,éster alquílico de 1 a 10átomos de carbono,éster arílico, halógeno, alcoxi de 1 a 5átomos de carbono, metilamina, dimetilamina, tionilo, metiltionilo, ciano y sales de los mismos, R4 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo de 1 a 10átomos de cabono,éster alquílico de 1 a 10átomos de carbono,éster arílico, halógeno, alcoxi de 1 a 15átomos de carbono y sales de los mismos;R5 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, metoxi, amino, hidroxi, alquilo de 1 a 10átomos de carbono,éster alquílico de 1 a 10átomos de carbono,éster arílico, halógeno y alcoxi de 1 a 5átomos de carbono;R6 selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo de 1 a 10átomos de carbono,éster alquílico de 1 a 10átomos de carbono,éster arílico, halógeno y alcoxi de 1 a 5átomos de carbono;R7 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo de 1 a 10átomos de carbono,éster alquílico de 1 a 10átomos de carbono,éster arílico, halógeno, alcoxi de 1 a 5átomos de carbono y sales de los mismos;R8 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo de 1 a 10átomos de carbono,éster alquílico de 1 a 10átomos de carbono,éster arílico, halógeno, alcoxi de 1 a 5átomos de carbono, metilamina, dimetilamina, tionilo, metiltionilo;ciano y sales de los mismos;R9 es amino o alquilo de 1 a 10átomos de carbono;R10 se selecciona a partir del grupo que consiste en amino, hidroxi, alquilo de 1 a 10átomos de carbono,éster alquílico de 1 a 10átomos de carbono,éster arílico, halógeno, alcoxi de 1 a 5átomos de carbono y aminoácido;y R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en alquilo de 1 a 10átomos de carbono,éster alquílico de 1 a 10átomos de carbono,éster arílico y oxígeno;en donde dicho arilo se selecciona a partir del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo y halobenzoilo;y (b) un pesticida relacionado con Bacillus.

Description

COMPOSICIÓN PESTICIDA NOVEDOSA Y CEPA DE BACILLUS THURINGIENSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN 5 La invención se refiere a una cepa(s) novedosa de Bacillus thuringiensis, en donde esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de una fermentación de dicha cepa. La cepa produce una substancia, la cual tiene una actividad contra una peste(s) de insectos del orden Coleópteros y la cual mejora la actividad pesticida de un pesticida relacionado con Bacillus. La invención además se refiere a composiciones pesticidas que comprenden la substancia y un vehículo pesticida, o lá substancia y un pesticida relacionado con Bacillus, un pesticida químico y/o un virus con propiedades pesticidas, así como métodos para utilizar las composiciones pesticidas para el control de una peste.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cada año, grandes porciones de los granos agrícolas, : o comercialmente importantes en el mundo, incluyendo alimentos, textiles y varias plantas domésticas, se pierden por plagas, dando como resultado en pérdidas de millones de dólares. Se han utilizado varias estrategias para lograr controlar dichas pestes. Una estrategia es el uso de pesticidas de amplio espectro, es 5 decir, pesticidas químicos con una amplia escala de actividad. Sin embargo, existen un número de desventajas por la utilización de dichos pesticidas. Específicamente, debido a su amplio espectro de actividad, estos pesticidas pueden destruir organismos, que no son el objetivo, tales como insectos y parásitos benéficos de pestes destructivas. Además, estos pesticidas químicos frecuentemente son tóxicos para los animales y seres humanos, y frecuentemente las pestes objetivo desarrollan una resistencia, cuando se exponen, en forma repetida, a tales substancias. Otra estrategia ha implicado el uso de biopesticidas, la cual hace uso de patógenos de existencia natural para controlar plagas de los granos por insectos, hongos y maleza. Los biopesticidas comprenden una bacteria que produce una toxina, una substancia tóxica a la peste. Los biopesticídas generalmente son menos dañinos a organismos que no son objetivo, y al ambiente como un todo, que los pesticídas químicos. El biopesticida más ampliamente utilizado es Bacillus thuríngiensis (B.t.). El B.t. es microorganismo ampliamente distribuido, con forma de vara, aeróbico y formador de esporas. Durante su ciclo de esporulación, B.t. produce una proteína(s) conocida como delta-endotoxina(s) cristal, la cual mata larvas de insectos. Por lo tanto, B.t. es muy útil como pesticida agrícola. Algunas cepas v. gr. , Bacillus thuringiensis subsp. Kustaki y Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, se han encontrado que son específicas para Lepidópteros. Se ha encontrado que Bacillus thuringiensis subsp. israelensis es específico para Dípteros (Qoldberg , patente de E. U .A. No. 4, 166, 1 12). Otras cepas v. gr. , Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg y otros, 1988, Patente de E. U.A. No. 4, 766,203), se han encontrado específicas para coleópteros. El aislamiento de otra cepa de Bacillus thuringiensis tóxica a coleópteros fue reportada en 1986 (Hernnstadt y otros, Bio/Technology, vol. 4, 305-308, 1986, patente de E. U.A. 4, 764,372, 1988). Esta cepa, designada "Bacillus thuringiensis subsp. san diego", M-7, ha sido depositada en Northen Regional Research Laboratory (Laboratorio de Investigación Regional del Norte), E. U .A. , bajo el número de acceso NRRL B-15939. Sin embargo, el cesionario de la patente '372, Mycogen, Corp. , ha reconocido públicamente que Bacillus thuringiensis subsp. san diego es Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. Además, la patente '372 ha sido cedida a Novo Nordisk A/S. Además, se ha descrito una cepa de B.t., la cual es tóxica contra lepidópteros y coleópteros (solicitud del PCT No. WO90/13651 ). La toxina descrita en la solicitud del PCT No. WO90/3651 tiene un peso molecular de 81 kd. Durante su ciclo de esporulación, B.t. produce una proteína(s) en forma de cristal conocida como una delta-endotoxina(s) de cristal, que tiene un peso molecular que varía de 27-140 kd, la cual por ingestión, mata las larvas de insectos. La actividad tóxica puede residir en una o más de dichas endotoxinas en una cepa dada de B.t. La mayoría de las delta-endotoxinas, son protoxinas que son proteolíticamente convertidas a polipéptidos tóxicos (truncados) más pequeños, en las entrañas de los insectos que son objetivo (Hofte y Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255). Las delta-endotoxinas son codificadas por genes cry (proteína de cristal). Los genes cry han sido divididos en seis clases y varias subclases con base en similitudes estructurales y carácter específico y pesticida. Las clases principales son Lepidópteros-específicos (cryl); Lepidópteros y Dípteros-específicos (cryll); Coleóptero-específico (crylll); Díptero-específico (crylV), (Hófte y Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255); Coleóptero y Lepidóptero-específicos (denominadas como genes cryV por Taylor y otros, 1992, Molecular Microbiology, 6: 121 1 -1217); y genes de Nemátodos-específicos (denominados como CryV y CryVI, por Feitelson y Otros, 1992, Bio/Technology 10:271 -275). Las delta-endotoxinas han sido producidas mediante métodos recombinantes de ADN. Las delta-endotoxinas producidas por métodos recombinantes de ADN pueden o no pueden estar en la forma de cristal. La delta-endotoxina B.t. es insolubie en agua excepto a un pH alcalino, y por lo regular es un plásmido codificado. Algunas cepas de Bacillus thuringiensis han mostrado que producen un análogo de nucleótido de adenina pesticida, estable al calor, conocido como ß-exotoxina o thuringiensis, el cual sólo es pesticida (Sebesta y otros, en H.D. Burges (e.d.), Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York, p. 249-281 , 1981 ). La ß-exotoxina se ha encontrado en el sobrenadante de algunos cultivos de Bacillus thuringiensis. Tiene un peso molecular de 789 y está compuesta de adenosina, glucosa y ácido alárico (Lüthy y otros en Kurstak (de.) Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, p. 35-72) . Su escala de huéspedes incluye, pero no se limita a, Musca domestica, Mamestra configúrate Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster, y Tetranychus cinnabarinus. La toxicidad de la ß-endotoxina se cree que se debe a la inhibición de polimerasa de ARN dirigido por ADN por la competencia con ATP. Se ha mostrado que la ß-exotoxina es codificada por un plásmido Cry en 5 cepas de Bacillus thuringiensis (B.t.), y que la ß-exotoxina puede ser clasificada como ß-exotoxina tipo I o tipo II (Levinson y otros, 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179) . La ß-exotoxina del tipo I se encontró que es producida por B.t. subsp. thuringiensis serotipo 1 , B.t. subsp. tolworthi serotipo 9, y B.t. subsp. darmstadiensis, serotipo 10. La ß-exotoxina del tipo II se encontró que es producida por B.t. subsp. morrísoni serotipo 8ab, y es activa contra Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la papa de Colorado). Otras substancias solubles en agua que han sido aisladas de B.t. incluyen alfa-exotoxina, la cual es tóxica contra las larvas de Musca domestica (Lüthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8: 1 -7); gama-exotoxinas, las cuales son varias enzimas proteolíticas que incluyen lecitinasas, quitinasas y proteasas, los efectos tóxicos de las cuales son expresados sólo en combinación con beta-exotoxina o delta-exotoxina (Forsberg y otros, 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Enviromental Quality, National Research Council of Canadá, N RC Associate Committee on Scientific Criteria for Enviromental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxina, la cual tiene una estructura similar a la beta-exotoxina, y también es activa contra Leptinotarsa decemlineata (Argauer y otros, 1991 , J. Entorno!. Sci. 26:206-213); y anhidro thuringiensin (Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 40, 1775 , 1975). WO 94/09630 describe una substancia soluble en agua que mejora la actividad de Bacillus thuringiensis var. Kurstaki y Bacillus thuringiensis var. aizawai. Stonard y otros (1994, In Natural and Engineered Pest Management Agents, Paul A. Mann, Robert M. Hollingworth, eds. , ACS, Washington , D. C. , p. 25-36) describen diabroticinas que tienen la estructura: 1 R , R 1 l R2=H , R3=OH Diabrocticina A 2R, R1 , R2, R3=H Diabrocticina B Las diabroticinas fueron aisladas de B. Subtilis y tienen actividad contra diabrotica undecimpunctaca, Leptinotarsa decemlineata, Anthomus grandis Boheman, larva de mosquito, Staphylococcus aureus, y Micrococcus lútea, pero no tienen actividad contra gorgojo de maíz europeo, Escherichia coli, B. subtilis. , y Pseudomonas aeurigonosa. La actividad contra otras plagas no fue descrita en Stonard y otros. También se aisló la diabroticina A de caldos de fermentación de B. cereus. La técnica se ha esforzado en obtener una mortalidad incrementada de formulaciones de B.t. Se han incluidos medios para buscar nuevas cepas con mortalidad incrementada, procesar por medio de ingeniería cepas presentes, y diseñar formulaciones más efectivas combinando esporas y/o cristales de B.t. con ?uevos portadores pesticidas o con pesticidas químicos. Es un objeto de la presente invención mejorar la actividad insecticida de formulaciones conocidas de B.t. También es un objeto de la presente invención mejorar la actividad pesticida de pesticidas así como encontrar usos novedosos para productos pesticidas conocidos. Es ventajoso aislar nuevas cepas de Bacillus thuringiensis para producir nuevas substancias, de manera que existe un espectro más amplio de biopesticidas para cualquier plaga dada de insectos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una cepa novedosa de Bacillus thuringiensis, en la cual esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de una fermentación de dicha cepa. La proteína de cristal y las esporas obtenidas de la fermentación de una cepa de Bacillus thuringiensis de la presente invención, no posee ninguna actividad pesticida. En una modalidad específica, la cepa se selecciona del grupo que consiste de EMCC-0077, que tiene las características de identificación de NRRL B-21090, o mutantes del mismo, que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0077, EMCC-0078 que tiene las características de identificación de NRRL B-21091 , o sus mutantes que tienen substancíalmente las mismas propiedades de EMCC-0078, EMCC-0079 que tiene las características de identificación de NRRL B-21092, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de NRRL B-21092, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0078, EMCC-0079 que tiene las características de identificación de NRRL B-21092, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0079, EMCC-0080 que tiene las características de identificación de NRRL B-21093, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0080, y EMCC-0081 que tiene las características de identificación de NRRL B-21094, o sus mutantes que tienen las mismas propiedades de EMCC-0081 . Una substancia, la cual tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden de Coleópteros y actúa en conjunto como un, por ejemplo, potenciador o sinergizador con un pesticida relacionado con Bacillus contra una peste, es obtenida de un sobrenadante de la fermentación de dicha cepa. En una modalidad preferida, dicha substancia, tiene un LC50 (LC50 es la concentración de una substancia pesticida dada requerida para matar 50% de las plagas) de 126 µg de ingrediente activo/g del material total contra Leptinotarsa texana. El LC5o de la pella de la fermentación de dicha cepa es más de aproximadamente 3,000 µg del ingrediente activo/g del material total como se verificó mediante bioanálisis. En otra modalidad, dicha substancia tiene una actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden de Coleópteros. En una modalidad más específica, dicha substancia tiene una actividad contra una plaga de insectos de las especies Diabrotica undecimpunctata, Leptinotarsa texana, Anthomus grandia, así como sorprendentemente actividad contra una plaga de insectos de las especies Ips calligraphus, Popillia japonicus, Epilachna varivastis, Leptinotarsa decemlineata, y Dentroctonus frontalis del orden de Coleóptero. En una modalidad específica, dicha substancia mejora la actividad insecticida de delta-endotoxina(s) de cristal de Bacillus thuringiensis contra una plaga(s) de insectos. En una modalidad específica, dicha substancia mejora la actividad insecticida de delta-endotoxina de cristal de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis contra una plaga(s) de insectos del orden de Coleóptero. Como se define en la presente, "un pesticida relacionado con Bacillus" es una cepa o espora de Bacillus (v. gr. , Bacillus thuringiensis o Bacillus subtilis) . Un pesticida relacionado con Bacillus también puede ser una substancia derivada de Bacillus, v. gr. , proteína o fragmento del mismo que tiene una actividad contra o que mata plagas; una substancia que provee protección a las plantas, v.gr. , una substancia incomible; o un microorganismo capaz de expresar un gen de Bacillus que codifica una proteína o fragmento de Bacillus del mismo que tiene actividad contra o que mata plagas (v.gr. , delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis), y un vehículo aceptable (ver más adelante Sección de Composiciones). Por ejemplo, la plaga puede ser un insecto, un nemátodo, un acaro, o un caracol. Un microorganismo capaz de expresar un gen de Bacillus que codifica una proteína o fragmento de Bacillus del mismo que tiene actividad contra o que mata plagas estableciendo el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas), y/o el rizósfero (la tierra que rodea las raíces de las plantas), y/o ambientes acuáticos, y es capaz de competir exitosamente en cualquier ambiente (granos y otros hábitats de insectos) con microorganismos de tipo salvaje y proveen el mantenimiento y expresión estables de un gen de Bacillus que codifica una proteína o fragmento de Bacillus del mismo que tiene actividad contra o mata plagas. Ejemplos de dichos microorganismos incluyen, pero no se limitan a, bacterias, v. gr. , del género Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes, y Clostridium; algas, v.gr. , de las familias de Cyanophyceae, Prochiorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, y Chlorophyceae; y hongos, particularmente levaduras, v.gr. , del género Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidi?m. Como se define aquí, "actividad pesticida'' mide la cantidad de actividad contra una peste ya sea eliminando o aturdiendo el crecimiento de la plaga o protege la planta de la infestación por plaga. La invención también se refiere a composiciones pesticidas que comprenden la substancia de un pesticida relacionado con Bacillus así como a métodos para utilizar las composiciones para controlar una plaga. La invención además está dirigida a un método para obtener una substancia "substancialmente pura" de la presente invención , que comprend los pasos de: a) cultivar una cepa de Bacillus thuringiensis en un medio adecuado de crecimiento; b) recuperar el sobrenadante de a); y c) someter el sobrenadante del paso b) a cromatografía de columna para purificar la substancia. Como se define en la presente, una substancia "substancialmente pura" representa una substancia que contiene menos de 5% de contaminantes, por ejemplo, la proteína delta-endotoxina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Estos y otros aspectos, características, y ventajas de la presente invención se entenderán mejor considerando la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y los dibujos anexos, en donde: La Figura 1 muestra un esquema sintético para obtener la estructural I . La Figura 2 muestra las estructuras de los Derivados A y B. La Figura 3 muestra la eficacia del sinergismo de la/Ib y NOVODOR™ sobre Leptinotarsa decemlineata.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Obtención de la Substancia La substancia(s) puede ser obtenida del sobrenadante de una fermentación de Bacillus thuringiensis incluyendo, pero no limitándose a B.t. de las cepas EMCC-0077, que tiene las características de identificación de NRRL B-21090, o mutantes del mismo, que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0077, EMCC-0078 que tiene las características de identificación de NRRL B-21091 , o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0078, EMCC-0079 que tiene las características de identificación de NRRL B-21092, o sus mutantes que tienen substanciafmente las mismas propiedades de EMCC-0079, EMCC-0080 que tiene las características de identificación de NRRL B-21093, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0080, y EMCC-0081 que tiene las características de identificación de NRRL B-21094, o sus mutantes que tienen las mismas propiedades de EMCC-0081 . La substancia tiene actividad contra una plaga(s) de insectos del orden Coleóptero y actúa junto con un pesticida relacionado con Bacillus como un, v.gr. , potenciador o sinergizador. En una modalidad específica, la substancia tiene la estructura (I): en donde, R T es un amino, hidroxi, alquilo éster alquílico (d.io) , éster arílico (v.gr. , benzoílico, nitrobenzoílico, dinitrobenzoílico, halógenobenzoílico) , halógeno, alcoxi de C?-5, o aminoácido, incluyendo , pero no limitándose a, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, fenilalanilo, glicinilo, y feni Iglicinilo ; R es alquilo (C?-?0); R3 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico (C?-?o), éster arílico (v. gr. , benzoílico, nitrobenzoílico , dinitrobenzoílico, halógenobenzoílico) , halógeno, alcoxi de C1.5, metilamina, dimetilamina, tionilo, metiltionilo, ciano, o una sal de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R4 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico (C1.10), éster arílico (v.gr. , benzoílico, nitrobenzoílico, dinitrobenzoílico, haiógenobenzoílico), halógeno, alcoxi de C?.s, o una sal de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R5 es hidrógeno, metoxi, amino, hidroxi, alquilo (C1.10) , éster alquílico (C1.10), éster arílico (v.gr. , benzoílico, nitrobenzoílico, dinitrobenzoílico, halógenobenzoílico), halógeno, o alcoxi de C?-5; Rß es amino, hidroxi, alquilo (C1-10), éster alquílico, halógeno o alcoxi de C?-S; R7 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico (C1-10), éster arílico (v.gr. , benzoílico, nitrobenzoílico, dinitrobenzoílico, halógenobenzoílico), halógeno, alcoxi de C?.s, o una sal de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R8 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (d-10), éster alquílico (C1-10), éster arílico (v.gr. , benzoílico, nitrobenzoílico, dinitrobenzoílico, halógenobenzoílico), halógeno, alcoxi de C1.5, metilamina, dimetilamina, tionilo, metiltionilo, ciano o una mezcla de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R9 es alquilo (C?-?0); y R10 es amino, hidroxi , alquilo (C1.10) , éster alqu ílico (d.10) , éster arílico (v.gr. , benzoílico, nitrobenzoílico, dinitrobenzoílico, halógenobenzoílico), halógeno, alcoxi de d.s, o aminoácido incluyendo alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, fenilalanilo, glicinilo, y fenilglicinilo. Los nitrógenos de pirazina pueden ser opcionalmente substituidos con alquilo (d.10) , éster alquílico (C1.-10) , éster arílico (v.gr. , benzoílico, nitrobenzoílico, dinitrobenzoílico, halógenobenzoílico), u oxígeno. Se debe entender que la invención se extiende a cada una de las formas estereoisoméricas de los compuestos de la estructura I así como los racematos. En modalidades más específicas, la substancia tiene la estructura la, de aquí en adelante denominada como "la" o Ib, de aquí en adelante denominada como "Ib": la :R , R1 , R2 l R3=H lb: R, R1 , R2=H , R3=OH Bacillus thuringiensis puede ser cultivado utilizando medios y técnicas de fermentación conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Rogoff y otros, 1969, J. lnvertebrate Path. 14: 122-129; Dulmage y otros, 1971 , J. Investebrate Path 18:353-358; Dulmage y otros, en Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H .D. Burges, de. , Academic Press, N.Y. , 1980). Al término del ciclo de fermentación, el sobrenadante puede ser recuperado s parando las esporas y cristales de B.t. del caldo de fermentación mediante medios bien conocidos en la técnica, v.gr. , centrifugación y/o ultrafiltración. Dicha substancia está contenida en el sobrenadante, la cual puede ser recuperada mediante medios bien conocidos en la técnica, v.gr. , ultrafiltración, evaporación, y secado por aspersión. Alternativamente, la substancia(s) de la presente invención puede ser obtenida por medio de síntesis química utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Para obtener la estructura I, el anillo simple de pirazina, con los grupos apropiados de substitución y de protección, puede ser formado por medio de un número de reacciones, por ejemplo, condensación espontánea de compuestos alfa-aminocarbonilo. Un intermediario de dihidropirazina se forma, pero es fácilmente oxidado con oxígeno a la pirazina. La dimerización de un compuesto individual de alfa-aminocarbonilo, mediante este método, podría conducir a una sola pirazina, mientras que una reacción con dos diferentes compuestos de alfa-aminocarbonilo podría conducir a tres productos; dicha substancia podría ser aislada mediante separación cromatográfica (véase Figura 1 ) . La última reacción permite la síntesis de pirazinas con diferentes substituyentes de cada lado del anillo. La purificación de la substancia(s) puede realizarse mediante varios procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía (v. gr. , cromatografía de intercambio de iones, de afinidad, y de columna de exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, extracción o cualquier otra técnica conocida en el arte (véase, por ejemplo, Protein Purification, eds. , J-C. Janson y Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989). La actividad de dicha substancia puede ser bioanálisada utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como incorporación de dieta artificial, recubrimiento de dieta artificial , pintura en las hojas, goteo en las hojas, y aspersión foliar. Ejemplos específicos de dichos bioanálisis se presentan en la Sección de Ejemplos, infra.

Composiciones que Comprenden la Substancia Dicha substancia puede ser formulada sola; junto con un pesticida relacionado con Bacillus, el cual, como se definió anteriormente, es una cepa de Bacillus, espora, proteína o fragmento del mismo, que tiene actividad contra o que mata plagas, y opcionalmente un vehículo en una composición(es) pesticida, que es, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo para espolvorear, un granulo dispersable, un polvo húmedo, un concentrado emulsificable, un aerosol o granulo impregnado.

Ej mplos de dichas cepas de Bacillus incluyen, pero no se limitan a, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (vendido como DIPEL™ de Abbott Laboratories, Inc. , JAVELIN™ de Sandoz, BIOBIT™ de Novo Nordisk A/S, FORAY™ de Novo Nordisk A/S, MVP™ de Mycogen, BACTOSPEINE™ de Novo Nordisk A/S, y THURICI DE™ de Sanfoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawai vendido como FLORBAC™ de Novo Nordisk A/S, y XENTARI ™ de Abbott Laboratories, Inc.) ; Bacillus thuringiensis subsp. tenebriónis (vendido como NOVODOR™ de Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ de Sandoz, M-TRAK™ y M-ONE™ de Mycogen); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (vendido ya sea como BACTIMOS™ o SKEETAL™ de Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ de Sandoz, y VECTOBAC™ de Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus sphaericus (vendido como SPHERIMOS ™ de Novo Nordisk A/S); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (vendido como FOIL™ por Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (vendido como CÓNDOR ™ de Ecogen y AGREE™ por Cibag-Geigy) ; y Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (vendido como CUTLASS™ de Ecogen). La proteína relacionada con Bacillus puede ser seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a, Cryl , Cry II , Cryl ll , CrylV, CryV, y CryVI . Dicha substancia también puede ser formulada con otros factores o substancias obtenidas del sobrenadante de un sobrenadante de Bacillus incluyendo, pero no limitándose a, una exotoxina y/o el factor mejorador descrito en la solicitud serie no. 08/095,240, presentada el 20 de julio de 1993, incorporada aquí por referencia. Opcionalmente, la formulación puede también comprender un pesticida relacionado con Bacillus, un pesticida químico, y/o un virus con propiedades pesticidas y un vehículo aceptable. en una modalidad específica, los componentes de dicha composición pueden actuar en una forma sinergística. Como resultado, dicha composición puede tener una mayor eficacia que la que puede ser obtenida con cada componente individual. El sinergismo puede ser también manifestado por una eficacia igual o mayor con dosis frecuentes inferiores/menores que las que se podrían requerir para cada componente individual. Alternativamente, dicha substancia puede actuar como un pesticida relacionada con Bacillus. En Composiciones que comprenden la substancia y un pesticida relacionado con Bacillus, la substancia está presente en la cantidad de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 300 g por LTU . Como se definió anteriormente, "LTU" es una unidad de Leptinotarsa texana como fue determinado mediante bioanálisis. El bioanálisis compara la muestra con un material de referencia de Bacillus, normal, utilizando Leptinotarsa texana u otra plaga, como el organismo de prueba normal. La potencia se determinó dividiendo la referencia normal LC50, después multiplicar por la potencia normal de referencia. En otra modalidad, la composición puede comprender dicha substancia en una forma substancialmente pura o un sobrenadante de Bacillus en forma seca , concentrada o líquida, y un vehículo pesticida adecuado, ejemplos de los cuales se describen infra. Esta composición puede ser aplicada por separado a una planta, v.gr. , plantas transgénicas. Específicamente, la composición puede ser aplicada a una planta que contenga previamente un gen de Bacillus thuringiensis. En otr modalidad, la composición puede ser aplicada a una planta previamente expuesta a una composición de Bacillus thuringiensis. La substancia está presente en la composición a una concentración de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 60% (p/p). Dichas composiciones, descritas anteriormente, pueden ser obtenidas mediante la adición de un agente tensoactivo, como un vehículo inerte, un conservador, un humectante, un estimulante de la alimentación, un atrayente, un agente de encapsulación, un aglutinante, un emulsificante, un colorante, un protector de U .V. , un regulador de pH, un agente dé fluido, u otro componente, para facilitar el manejo y la aplicación del producto, para plagas que son objetivo, particulares. Los agentes tensoactivos adecuados incluyen , pero no se limitan a, compuestos aniónicos, tales como un carboxilato, por ejemplo, un carboxilato de metal de ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosihato; mono- o diésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol graso, o sales de dichos esteres; sulfatos de alcohol graso tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sultafo de sodio; sulfatos de alcohol graso etoxilados; alquilfenol sulfatos etoxilados; lignin sulfonatos; petróleo sulfonatos; alquil-aril sulfonatos tales como alquilbencen sulfonatos o alquilnaftalen sulfonatos, inferior, v.gr. , naftalen sulfonato de butilo; sales o condensados de naftalen-formaldehído sulfonados; sales de condensados de fenol-formaldehído sulfonados; o sulfonatos más complejos tales como los amida sulfonatos, v.gr. , el producto de condensación sulfonado de ácido oléico y N-metil taurina o los dialquil sulfosuccinatos, v. gr. , sulfonato de sodio o succinato de dioctilo. Los agentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, productos de condensación de esteres de ácido graso, alcoholes grasos, amidas de ácido graso o fenoles alquil o alquenil-substituidos, grasos con óxido de etileno, esteres grasos de éteres de alcohol polihídrico, v.gr. , esteres de ácido graso-sorbitan, productos de condensación de dichos esteres con óxido de etileno, v.gr. , esteres de ácido graso de polioxietilen-sorbitol, copolímeros bloqueadóres de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como 2 ,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-dioI, o glicoles acetilénicos, etoxilados. Ejemplos de un agente tensoactivo catiónico incluyen, por ejemplo, una mono-, di-, o poliamina alifática tal como un acetato, naftenato u oleato; una amina que contiene oxígeno, tal como óxido de amina de polioxietilen alquilamina; una amina entrelazada con amida preparada mediante la condensación de un ácido con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternario. Ejemplos de materiales inertes incluyen, pero no se limitan a, minerales inorgánicos tales como caolín, mica, yeso, fertilizante, filosilicatos, carbonatos, sulfatos o fosfatos; materiales orgánicos tales como azúcar, almidones, o ciclodextrinas; o materiales botánicos tales como productos de madera, corcho, mazorca en polvo, vainas de arroz, y cascaras de nuez. Las composiciones de la presente invención pueden estar en una forma adecuada para aplicación directa o como un concentrado o composición primaria, la cual requiere dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente, antes de la aplicación. La concentración pesticida variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, específicamente, si ésta es un concentrado o va a ser utilizada directamente. La composición contiene de 1 a 98% en peso de un vehículo inerte sólido o líquido, y de 0 a 50%, de preferencia de 0.1 a 50% de un agente tensoactivo. Estas composiciones serán administradas al régimen marcado para el producto comercial, de aproximadamente 0.01 1 a 5.604 kg/hectárea cuando está en la forma seca y de aproximadamente 0.01 pintas a 25 pintas por acre cuando está en la forma líquida. En una modalidad adicional, el pesticida relacionado con Bacillus y/o substancia puede ser tratado antes de la formulación para prolongar la actividad pesticida cuando se aplica al ambiente de una plaga que es el objetivo, mientras que el pretratamiento no sea nocivo al pesticida relacionado con Bacillus o substancia. Dicho tratamiento puede ser mediante medios químicos y/o físicos siempre que el tratamiento no afecte nocivamente las propiedades de la composición(es). Ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero no se limitan a, agentes de halogenación ; aldehidos tales como formaldehído y glutaraldehído; anti-infecciosos, tales como cloruro de zefirano: alcoholes, tales como ísopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tales como el fijador de Bouin y el fijador de Helly (véase, por ejemplo, Humason, Animal Tissue Techniques, W.H . Freeman and Co. , 1967). Las composiciones de la invención pueden ser aplicadas directamente a la planta mediante, por ejemplo, aspersión o espolvoreo en el momento en el que empieza a aparecer lá plaga, como una medida protectora. Las plantas que van a ser protegidas, dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cereales (trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo y granos relacionados), remolacha (betabel y pastura), drupas, pomos y fruta blanda (manzanas, peras, ciruelas, duraznos, almendras, cerezas, fresas, frambuesas y las zarzamoras) , plantas leguminosas (alfalfa, frijoles, lentejas, chícharos, soya), plantas de aceite (nabo, mostaza, amapola, olivos, girasoles, cocos, plantas de aceite de ricino, granos de cacao, nueces molidas), plantas de cohombro (pepino, tuétano, melones), plantas fibrosas (algodón, lino, cáñamo, yute), frutas cítricas (naranjas, limones, toronjas, mandarinas), vegetales (espinaca, lechuga, espárrago, coles y otros vegetales, zanahorias, cebollas, jitomate, papas), lauráceas (aguacates, canela, alcanfor), árboles deciduos y coniferas (v.gr. , árboles de tilo, árboles de tejo, árboles de roble, alisos, álamos, abedules, abetos, lárices, pinos) , o plantas tales como maíz, césped, tabaco, nueces, café, caña de azúcar, vinos, lúpulos, plátanos y plantas de hule naturales, así como ornamentales. La substancia puede ser aplicada mediante aplicación foliar, surco, y granulo de siembra, "extendida" o remojando la tierra. Generalmente, es importante obtener un buen control de plagas en las primeras etapas del crecimiento de la planta, ya que este es el momento cuando la planta puede ser severamente dañada. La aspersión o polvo pueden contener convenientemente otro pesticida, si éste se cree necesario. En una modalidad preferida, la composición de la invención es aplicada directamente a la planta. Las composiciones de ia presente invención pueden ser efectivas contra plagas del orden de Coleóptero v.gr. , Leptinotarsa sp. (v.gr. , Leptinotarsa texana, Leptinotarsa decemlineata), Diabrotica undecimpunctata, Dendroctonus frontalis, Anthonomus grandis, Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macodactylus s?bspinosus, Popillia japónica, Rhizotrogus majalis, Alphitobl?s diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor. Las composiciones de la invención pueden ser también efectivas contra plagas de insectos incluyendo, pero no limitándose a, plagas del orden de Lepidópteros, v.gr. , Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ípsilon, Alábame argillacea, Alsophila pometaria, Amyelosis transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., j gyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx morí, Bucculatrix thwberiella, Cadra camella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Dataria integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmiafuneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diarraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma lofiini, Ephestia elutella, Eranrús tilaria, Estigmene aerea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Gallería mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa súbflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia tycopersicella, Larnbdinafiscellariafiscellaria, Lambdinafiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar. Macolla thyrsisalis, Malacosoma sp., Níamestra brassicae, Mamestra configurata. Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pec?nophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota ßouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontiaprotodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Díptera, e.g., Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barben, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres súbalbatus, Calliphora stygia, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentaos, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina moristans morsitans, Glossina moristans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinas, Haematobius irritans, Hypoderma bovis, Hydoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Pnaenicia sericata, Phlebowmus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa; Acari, e.g., Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; Hymenoptera, e.g., Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isoptera, e.g., Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; Siphonaptera, e.g., Ceratophyllus g llinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllusfasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalldesfelis, Echicnophaga gallinácea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tuga penetrans; y Tylenchida, v. gr. , Melodidogyne incógnita, Pratylenchus penetrans. Los siguientes ejemplos se pr sentan a manera de ilustración, y no en forma limitante EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Cultivo de Varios Aislados de B.t. Subcultivos de EMCC-0077, EMC-0078, EMCC-0079, EMCC-0080, y EMCC-0081 , mantenidos sobre cultivos inclinados de Agar de Caldo Nutriente, se utilizaron para inocular matraces de agitación, desviados de 250 mi , conteniendo 50 mi del medio con la siguiente composición.

Licor de maíz remojado 15 g/L Maltrin-100 40 g/L Almidón de papa 30 gL KH2PO4 1 .77 g/L K2HPO4 4.53 g/L El pH del medio se ajustó a 7.0 utilizando 10 N de NaOH . Después de la inoculación, los matraces de agitación se incubaron a 30°C sobre un agitador giratorio a 250 rpm durante 72 horas. Todos los caldos de cultivo se utilizaron para prueba contra Diabrotica undecimpunctata.

EJEMPLO 2: Actividad de Diabrotica undecimpunctata en Todos ios Caldos de Cultivo de varios Aislados de B.t. 2.5 mi de todos los caldos de cultivo obtenidos de la fermentación anterior fueron removidos y transferidos de los matraces de agitación a tubos de ensayo con 50 mi de polipropileno. Se añadió dieta de Diabrotica undecimpunctata a cada tubo a un volumen final de 25 mi. La dieta y el material de prueba se mezclaron después vigorosamente y se dispensaron a charolas de bioanálisis para llevar a cabo el bioanálisis. De tres a seis huevos de Diabrotica undecimpunctata se aplicaron sobre la superficie de la "dieta". Se planchó Mylar sobre las charolas de bioanálisis y las charolas se incubaron a 28°C sin un fotoperíodo. Se llevó a cabo la clasificación durante 7 días. Se determinó la mortalidad en el séptimo día después de la incubación. SS7 = el tamaño de larvas muertas en el séptimo día, cuando se comparó con las larvas de control, vivas, en el mismo día como SS7 de 4. SS7 = 3, SS7 = 2, y SS7 = 1 , representan el tamaño de las larvas como 75% , 50%, y 25%, respectivamente de las larvas de control, vivas de 4. Los resultados se muestran a continuación en el CUADRO 1. Estos resultados indican que en las 5 cepas probadas existió una mortalidad del 100% . Además, las larvas muertas fueron de un 12.5% del tamaño de tas larvas de control, vivas.

CUADRO 1 Actividad de Diabrotica undecimpunctata en Todos los Caldos de Cultivo Cepa % de Mortalidad SS7 EMCC-0077 100 0.5 EMCC-0078 100 0.5 EMCC-0079 100 0.5 E EMMCCCC--00008800 1 10000 0.5 EMCC-0081 100 0.5 EJEMPLO 3: Localización de la Actividad de Diabrotica undecimpunctata Con el fin de probar si la actividad de Diabrotica undecimpunctata está asociada con las delta-endotoxina/esporas o el sobrenadante, 2.5 mi de todos los caldos de cultivo de EMCC-0077, EMCC-0080, EMCC-0081 , nb125 (un Bacillus thuringiensis subsp. que creció bajo condiciones idénticas) se centrifugaron en una centrífuga de Sorvall RC-5B a 15,000 rpm (rotor Sorvall SS34) durante 15 minutos para separar el sobrenadante y la pella. Las delta-endotoxinas de cristal más las esporas se recuperaron en la pella. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado de B.t. activo a Diabrotica undecimpunctata, EMCC-0077, tienen pesos moleculares de 66kD, 29kD, y 12kD, según se determinó mediante SDS-PAGE. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado de B.t. activo a Diabrotica undecimpunctata, EMCC-0078, tienen pesos moleculares de 153kD, 77kD, 67kD, 61 kD, 50kD, 42kD, 34kD, 30kD, 24kD, según se determinó mediante SDS-PAGE. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado de B.t. activo a Diabrotica undecimpunctata, EMCC-0079, tienen pesos moleculares de 135- 145kD, según se determinó mediante SDS-PAGE. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado de B.t. activo a Diabrotica undecimpunctata, EMCC-0080, tienen pesos moleculares de 94kD, y 40kD, según se determinó mediante SDS-PAGE. Las delta-endotoxinas producidas por el aislado de B.t. activo a Diabrotica undecimpunctata, EMCC-0081 , tienen p sos moleculares de 129kD y 32kD, según se determinó mediante SDS-PAGE. Cada sobrenadante (2.5 mi) obtenido de la centrifugación anterior se transfirió a un tubo de bioanálisis con 50 mi de polipropileno. La pella se volvió a suspender después en 2.5 mi de agua destilada, estéril, y se transfirió a un tubo de bioanálisis, por separado, con 50 mi de polipropileno. Se añadió después la dieta de Diabrotica undecimpunctata a los tubos de bioanálisis, los cuales contenían ya sea el sobrenadante o la pella resuspendida a un volumen final de 25 mi. Los pasos restantes del bioanálisis son idénticos a aquellos descritos anteriormente. La clasificación también es la misma como la anterior. Los resultados, que se pueden ver en el CUADRO 2, muestran que la actividad de Diabrotica undecimpunctata de EMCC-0077, EMCC-0080, y EMCC-0081 está presente en todos los sobrenadantes, mientras que ia actividad menor de Diabrotica undecimpunctata del Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis está concentrada en la pella (espora más cristal).

CUADRO 2 Actividad de Diabrotica undecimpunctata en el Sobrenadante y la Pella Cepa Fracción % de Mortalidad Clasificación de Crecimiento EMCC-0077 Sobrenadante 100 0.5 Pella 10 3.0 EMCC-0080 Sobrenadante 100 0.5 Pella 0 4.0 EMCC-0081 Sobrenadante 100 0.5 Pella 0 3.0 NB125 Sobrenadante 0 3.0 Pella 50 1 .5 EJEMPLO 4: Actividad Contra Leotinotarsa texana Después de la filtración a través de una membrana de 0.2µ, el sobrenadante EMCC-0080, obtenido del Ejemplo 1 , se utilizó para analizar la actividad del escarabajo. El sobrenadante filtrado se aplicó al follaje de berenjena a un volumen de 187 l/ha (litros por hectáreas). Las diluciones fueron 0, 1 : 1 , 1 :4, 1 : 8 (sobrenadante:agua desionizada, v/v). Las larvas de Leptinotarsa texana fueron expuestas al follaje tratado siguiendo el protocolo normal. Cada planta se cargó con 20 larvas de Leptinotarsa texana. Los resultados, como se tabulan en el CUADRO 3 a continuación, muestran que el sobrenadante filtrado de EMCC-0080 es activo contra Leptinotarsa texana.

CUADRO 3 Actividad de Leptinotarsa texana en EMCC-0080 Cepa Dilución % de Mortalidad EMCC-0080 0 95 1 : 1 55 1 1 ::44 20 1 :8 0 Control no tratado 0 EJEMPLO 5: Efecto Sineraístico de EMCC-0080 v NOVODOR™ Los resultados mostrados en el CUADRO 3, supra, indican que el sobrenadante de EMCC-0080 no es activo a una dilución de 1 :8 (v/v), sólo. Sin embargo, cuando el follaje de la berenjena es tratado con 1.25% o 2.5% de sobrenadante de EMCC-0080 10X concentrado más 200 µg de NOVODOR ™ (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) por mi, se obtiene un efecto sinergístico como se evidenció por él agudo declive de LC50 y LCßo de NOVODOR™ . Los datos se presentan en el CUADRO 4, a continuación.

CUADRO 4 Efecto Sinergístico de EMCC-0080 y NOVODOR™ Muestra LC^p (ua/q)1 LCa¿(ug/g)2 Declive3 NOVODOR ™ 642 4,286 1.55 NOVOOOR™ + 1 .25% EMCC-0080 250 1 ,292 1 .79 NOVODOR ™ + 2.5% EMCC-0080 98 490 1.83 1 LCso se define como la concentración que aniquila 50% de la población objetivo de insectos. LCso se define como la concentración que aniquila 90% de la población objetivo de insectos. Declive se refiere al declive de un % de mortalidad v. curva de concentración log.

EJEMPLO 6: Purificación de Substancia Activa a Coleópteros Producida por B.t. Cepa EMCC-0080 Se hizo crecer B.t. cepa EMCC-0080 durante 24 horas a 30°C en un medio con la siguiente composición en gramos por litro a un pH de 7.0: Maltodextrina 40g Proteína de soya 40g KH2PO4 1.8g K2HPO4 4.5g MgSO4-7H2O 0.3 g Metales trazas 0.2 mi Se removieron células y otros insolubles de todo el caldo de cultivo de B.t. cepa EMCC-0080 mediante centrifugación seguido por filtración del sobrenadante resultante a través de Celite y una membrana de 0.2 µ. La penetración resultante se concentró después a 10 veces la evaporación. La purificación de la substancia(s) activa a coleóptero de la penetración 10X concentrada se logró utilizando un procedimiento de cuatro pasos. Durante la purificación, se verificó la actividad mediante un bioanálisis de superficie de Diabrotica undecimpunctata, como se describió infra, y se determinó la pureza mediante electroforesis capilar, como se describe en el EJEMPLO 8. Todos los pasos cromatográficos emplean detección a 226 nm. Específicamente, el bioanálisis de superficie se condujo como sigue. Muestras de penetrado 10X concentrado se aplicaron a cavidades individuales de una placa de microtitulación conteniendo 200 µl de dieta de insecto artificial solidificado, y después se secaron con aire. De dos a cuatro neonatos de Diabrotica undecimpunctata (gusano de la raíz del maíz, GRM) se colocaron moderadamente en cada cavidad con un pincel. Las placas de microtitulación se sellaron después con Mylar haciendo agujeros para intercambio de aire y se incubaron a 30°C y una humedad de 80%. Se llevó a cabo la clasificación del porcentaje de mortalidad durante 5 días. En el primer paso, el penetrado 10X concentrado se purificó primero mediante cromatografía de columna (5 x 30) de Pharmacia SP Sephadex® C-25 (intercambio de cationes). Una muestra de 450 mi del penetrado 10X concentrado se diluyó a 18 litros con agua desionizada, se cargó sobre la columna, la cual fue pre-equilibrada con un regulador de pH acetato de amonio 20mM a un pH de 5.0. La columna se eluyó a 18 mi por minuto con 5.0 litros continuos de gradiente de regulador de pH de acetato de amonio de 20 mM a 0.5M a un pH de 5.0. Fracciones de 10 mi fueron recogidas, bioanalizadas y examinadas para pureza. Las fracciones activas se depositaron (aproximadamente 150 mi), se liofilizaron y se volvieron a disolver en agua desionizada a aproximadamente 1/5 del volumen original. En el segundo paso, se cargó una muestra de 25 mi del primer paso, sobre una columna de exclusión de tamaño (5 x Í00 cm) de BioRad P2 (extra fina), la cual fue pre-equilibrada con agua desionizada. La columna se eluyó a una velocidad de flujo de 1 mi por minuto con agua desionizada. Fracciones de 10 mi fueron recogidas, bioanalizadas y examinadas para pureza mediante electroforesis capilar. Las fracciones activas se depositaron (aproximadamente 400 mi). En el tercer paso, los depósitos de 400 mi del segundo paso se diluyeron a 16 litros con agua desionizada. La solución se cargó sobre una columna (5 x 30 cm) de Flujo Rápido Pharmacia S Spharose® (intercambio de cationes fuerte), la cual fue pre-equilibrada con regulador de pH de acetato de amonio de 20mM a un pH de 5.0. La columna se eluyó a una velocidad de flujo de 17 mi por minuto con un gradiente continuo de 5 litros de regulador de pH de acetato de amonio de 20 mM a 0.5M a un pH de 5.0. Fracciones de 20 mi fueron recogidas, bioanalizadas y examinadas para pureza. Las fracciones activas se depositaron (aproximadamente 250 mi) y después se liofilizaron a sequedad para remover el regulador de pH de acetato de amonio, volátil. En el cuarto paso, el depósito liofilizado del tercer paso se disolvió en 400 mi de agua desionizada. La solución se cargó sobre una columna (0.9 X 30 cm) BioRad Chelex®, la cual fue pre-equilibrada con regulador de pH de formiato de amonio 20 mM a un pH de 4.0. La columna se eluyó a una velocidad de flujo de 5 mi por minuto con un gradiente de paso de 2.4 litros de regulador de pH de formiato de amonio de 0.02 ? 0.1 ? 0.2 ? 0.35 ? 0.5 ? 1 .0M a un pH de 4.0. Fracciones de 20 mi fueron recogidas, bioanalizadas y examinadas para pureza. Las fracciones activas se depositaron (aproximadamente 300 mi) y después fueron liofilizadas a sequedad para remover el regulador de pH de formiato de amonio, volátil. La electroforesis capilar muestra que el material activp al coleóptero, purificado, comprende dos compuestos, la, Ib.

EJEMPLO 7: Elucidación de la Estructura de Substancias Activas a Coleópteros Las estructuras de los compuestos la y Ib son elucidadas a partir de los datos espectroscópicos recogidos en sus derivados acetilados. Una mezcla de 1 14 mg de ia y Ib se acetilaron en 5.0 mi de piridina con 5.0 mi de anhídrido acético y un cristal de 4-dimetilaminopiridina como un catalizador, durante 24 horas a temperatura ambiente, y después se purificó mediante HPLC de RP-Cis semi-preparativa. Una muestra de 5 mg en 25 µl se cargó sobre la columna y se eluyó a 4 mi por minuto con 80% de agua-20% de acetonitrilo. La detección es a 254 nm. Se obtuvieron dos derivados acetilados de la purificación, designados como Derivado A y Derivado B. Las estructuras de los Derivados A y B son como se muestran en la Figura 4. Los datos espectroscópicos de RMN, recogidos en el Derivado A, indican la presencia de 14 carbonos y 17 protones. Sin embargo, los datos del espectro de masa sugieren un peso molecular de 652 y una fórmula de C2ßH4oN6O?2 (masa exacta, 653.2801 , MH+, cale. 653.2782). Por lo tanto, se determinó que el compuesto es simétrico, en donde sólo la mitad de las señales se observaron mediante RMN.

Varios sistemas de giro fueron observados mediante RMN . Un anillo de pirazina central substituido en las posiciones 2 y 5 es indicado por las bandas individuales de protón de alto campo a 8.6 ppm (H-3 y H-6), lo cual muestra acoplamientos a gran escala de todos los carbonos en el anillo y al primer carbono de la cadena lateral (C-7). La cadena lateral de tres carbonos es acetilada en la posición tanto 7 como 8 con un metileno en la posición 9. Se encontró que el carbono 9 tiene una correlación a gran escala con el carbonilo de un éster, y se determinó que el éster es parte de una alanina, la cual es acetilada en el grupo amino. La estructura del Derivado B difiere en una posición del Derivado A. En una de las cadenas laterales del Derivado B, el carbono C-7 ya no es acetilado o unido al oxígeno, pero se encontró que es un metileno. La otra cadena lateral es idéntica a aquella en el Derivado A. Esta diferencia de sólo un oxígeno se observa también en los datos de espectro de masa. Los datos de espectro de masa son obtenidos con una masa exacta de 595.2722 (MH + , cale. 595.2727) para el Derivado B, indicando una fórmula de C26H38N6O10. Las densidades ópticas de los Derivados A y B son como sigue: derivado A [a]D27=-6.9°C y el Derivado B [a]D 7= + 32°C . Se realizaron asignaciones completas de los datos de 1H y 13C RMN con base en los experimentos de desacoplamiento, COSY, HMQC y HMBC. Las asignaciones se presentan en el CUADRO 5.

CUADRO 5 Datos de 1H y 13C RMN del Derivado A y el Derivado B en D-4 Metanol Posición 1H (constantes de acop.mult.integ.) 13/ Derivado A Derivado B A B 2 152.9 154.7 3 8.6(s,1H) 8.54(s,1H) 144.2 144.4 152.9 151.1 6 8.6(s,1H) 144.2 145.6 7 5.84(d,1H,J = 7.4Hz) 2.95(dd,1H, 74.0 37.5 J = 13.9,9.2) 3.10(dd,1H, J = 13.9,4.8) 8 4.72(m,1H) 4.48(m,1H) 52.1 50.2 9 4.24(dd,1H, 4.11(dd,1H, 63.5 66.3 J = 11.5,6.7 Hz) J = 11.4,6.7) 4.30(dd,1H, 4.20(m,1H) J = 11.5,6.7 Hz) 10 174.8f 174.7 11 4.20(q,1H,J=7.1Hz) 4.20(m,1H) 50.3 49.8 12 1.2(d,3H,J = 7.1Hz) 1.17(d,3H,J = = 7.3) 17.8 18.1 13 5.84(d,1H,J = 7.4Hz) 5.80(d,1H,J = =7.4) 74.0 73.9 14 4.72(m,1H) 4.70(m,1H) 52.1 52.1 4.24(dd,1H, 4.20(m,1H) 63.5 63.6 J = 11.5,6.7Hz) 4.30(dd,1H,J=11.5,6.7) 4.30(dd,1H,J=11.6,6.8) 16 174.8f 174.7 17 4.20(q,1H,J = 71Hz) 4.20(m,1H) 50.3 50.4 18 1.2(d,3H,J = 7.1Hz) 1.20(d,3H,J = = 7.3H z) 17.8 17.8 19 171.4| 171.4 2.1* 1.97 20.6** 20.6 21 172.9| 172.4 22 2.0* 2.02 20.5** 22.5 23 172.3f 172.5 24 1.95* 2.09 22.5** 22.6 172.3f 172.9 26 1.95* 2.03 22.5** 20.7 27 172.9t 171.4 28 2.0* 1.95 20.5** 20.6 29 171.4f 30 2.1* 20.6** *, **, f -- señales que pueden ser intercambiadas Los datos del espectro de masa para la mezcla de los compuestos la y Ib dan dos iones moleculares de 400 y 384. A partir dé estos datos se determinó que la fórmula molecular del compuesto la es C16H2ßN6?6 y el compuesto Ib es C?6H2ßN6Os. Las estructuras de la y Ib son determinadas comparando los datos de RMN del Derivado A y B con los datos de RMN de la mezcla de la y Ib. Las estructuras de la y Ib son como se muestra a continuación.

Las propiedades de los compuestos la y Ib y sus derivados acetilados se resumen a continuación: Derivado A: Peso molecular: 652 Fórmula empírica: C28H4oNßO?2 UV(MeOH): 275, 310nm MS(FAB): (M + H) m/z 653.2801 , cale.653.2782 Derivado B: Peso molecular. 594 Fórmula empírica: C26H3ßN6O?0 UV(MeOH): 275, 310nm MS(FAB): (M + H) m/z 595.2722, cale.595.2727 la: Peso molecular: 400 Fórmula empírica: C?ßH28Nß?6 UV(H2O): 275, 310nm MS(FAB): (M+H) 401 Ib: Peso molecular: 384 Fórmula empírica: C?6H2ßNßOs UV(H2O): 275, 310nm MS(FAB): (M + H) 385 EJEMPLO 8: Cuantificación de los Compuestos la v Ib en Caldos de Fermentación Se hizo crecer B.t. cepa EMCC-0080, como se describió en el Ejemplo 1 . La concentración de compuestos la y Ib en el caldo de fermentación se determinó mediante electroforesis capilar. Específicamente, un sistema de electroforesis capilar BioRad Biofocus 3000 equipado con un capilar no revestido (50 µm x 50 cm), 0.1 M de fosfato a un pH de 2.5, voltaje a 20 KV, polaridad positiva a negativa, y una detección a 20 nm, se utilizó para la cuantificación . El volumen de la muestra fue de 30 µl con una segunda inyección de 0.351 kg/cm2. El tiempo del análisis fue de 10 minutos con los compuestos activos a coleópteros, la y Ib, eluyéndose a 6.0 y 5.9 minutos, respectivamente. Alternativamente, se utilizó para la cuantificación un sistema de electroforesis capilar Beckman P/ACE 2100, equipado con un capilar no revestido (50 µm x 47 cm), regulador de pH de 0.1 M de fosfato a un pH de 2.5, voltaje a 20 KV, polaridad de positiva a negativa , y detección a 200 nm. El volumen de la muestra fue de 30 µl , con una inyección de presión de 10 segundos. El tiempo del análisis fue de 10 minutos con los compuestos activos a coleópteros, la y Ib, eluyéndose a 7.0 y 6.7 minutos, respectivamente. Se removieron las células y otros insolubles de todo el caldo de cultivo de B.t. cepa EMCC-0080 mediante centrifugación y mediante filtración a través de Celite y una membrana de 0.2. El sobrenadante resultante se analizó mediante electroforesis capilar, como se describió anteriormente. Los resultados indicaron que los compuestos activos a coleópteros, la y Ib, estuvieron presentes cada uno a un nivel de aproximadamente 90 mg por litro de caldo de cultivo.

EJEMPLO 9: Determinación de Potencia de los Compuestos la v Ib La potencia relativa de una mezcla cruda de los compuestos la y Ib (aproximadamente 1 : 1 p/p) se determinó utilizando Leptinotarsa texana como el insecto de prueba y comparando la mortalidad asociada con una preparación interna normal de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. Se realizaron bioanálisis foliares para determinar la potencia de una mezcla cruda de compuestos ia y Ib contra Leptinotarsa texana. Para realizar el bioanálisis foliar, se pesaron los materiales de prueba y los normales en tubos de centrífuga de 50 mi y se suspendieron con agua desionizada conteniendo 0.1 % de T een®20. Se pesaron y se suspendieron 1 ,200 mg de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis para dar una concentración final de 12 ,000 µg/g. Las muestras de prueba (es decir, NOVODOR ™ y NOVODOR™ con compuestos la y Ib) se trataron en una forma similar a menos que un bioanálisis de hallazgo de velocidad haya mostrado que la dosis suministrada es demasiado alta o demasiado baja que da como resultado un número suficiente de puntos de datos válidos. Si este es el caso, la concentración de la solución de abastecimiento primaria es incrementada o reducida cambiando la cantidad del diluyente añadido a la solución de abastecimiento. Cada muestra se homogeneizó después durante 30 segundos utilizando un Homogeneizador Virtis, y se le aplicó sonido durante 20 segundos a 100 Watts utilizando un homogeneizador ultrasónico Braunsonic 1510. Cada una de estas soluciones de abastecimiento se diluyeron después utilizando un Hamilton Microlab 1000 para dar siete diluciones en serie consistiendo de 3,000, 2,000, 1333, 857, 545, 364, y 245 µg/mf en un total de 16 mi. Cada una de estas soluciones de 16 mi se aplicaron a aproximadamente 1858.06 cm2 de hojas de berenjena utilizando un rociador de Devries Linear Track, calibrado para suministrar 187 litros por hectárea. Las hojas de control se rociaron con 16 mi de agua desionizada. Las hojas se secaron con aire y después se colocaron sobre el aro de una taza transparente de plástico de 28.35 gramos, conteniendo 5 larvas de Leptinotarsa texana segunda crisálida. Después, se coloraron tapas de cartón sobre la hoja y la tapa se comprimió en su lugar, cortando un disco de hoja de 4 cm y sellándolo dentro de la taza. Las tazas se invirtieron después y las larvas cayeron sobre la superficie tratada de la hoja. Para cada una de las siete diluciones en serie se prepararon ocho tazas. Las tazas se taparon conjuntamente, se etiquetaron, se colocaron en anaqueles, y se incubaron durante 3 días a 30°C y una humedad relativa de 65%. Estas 56 tazas experimentales y 8 tazas de control constituyen un bioanálisis. Después de tres días, se evaluó la mortalidad de insectos. A cada taza se le dio un soplido agudo y las larvas que no se movieron se contaron como muertas. Se calculó el porcentaje de mortalidad , y los datos se analizaron vía análisis probit paralelo. Se estimaron LC5o, LCg0, el declive de las líneas de regresión, coeficiente de variación, y potencias. Para determinar la potencia, se diluyó una mezcla cruda de los compuestos la y Ib, se bioanalizaron y se compararon a un normal de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, a la cual se le asignó una potencia de 20,000 LTU/gramos (unidades de Leptinotarsa fexana/gramos). Los resultados de la potencia se presentan en el CUADRO 6, infra, e indican que la mezcla cruda de los compuestos la y Ib (1 : 1 p/p) tiene una potencia de 75, 555 LTU por gramo de ingrediente activo con un LC50 de 70 ug por mi (1 .8 mg del ingrediente activo total por mi) .

CUADRO 6 Potencia de una Mezcla de los Compuestos la y Ib Muestra LC?n ug/ml Potencia Estimada Mezcla la/Ib 70 75,555 LTU EJEMPLO 10: Potenciación de Delta-Endotoxina de Cristal de Bacillus thurlnaiensis subsp. tenebrionis con los Compuestos la v Ib Se determinó la capacidad de los compuestos la y Ib para potenciar la actividad insecticida de la delta-endotoxina de cristal a partir de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis contra Leptinotarsa texana, añadiendo una mezcla cruda de los compuestos la y Ib a NOVODOR ™ , y se midieron los LC5o vía análisis probit paralelo. Se realizaron bioanálisis foliares contra Leptinotarsa texana, como se describió en el Ejemplo 9, para determinar el nivel de potenciación ganada añadiendo los compuestos la y I b a NOVODOR™ . Una mezcla cruda de los compuestos la y Ib se añadió a NOVODOR ™ . Las soluciones se diluyeron en serie utilizando el Hamilton Microlab 1000 para dar soluciones de abastecimiento conteniendo NOVODOR ™ a 1000.0, 666.7, 444.4, 285.7, 181.8. 121.2, y 80.0 µg/g. Se prepararon dos diferentes diluciones de una mezcla de la y Ib resultando en siete diluciones en serie conteniendo 72.0. 48.0, 32.0, 20.6, 13.1 , 8.7. y 5.8 µg/g (2.5% v/v con 1000 µg/g de NOVODOR ™); y 36.0, 24.0, 16.0, 10.3, 6.5, 4.4, y 2.9 µg/g (1 .25% v/v con 1000 µg/g de NOVODOR ™) . También se prepararon muestras netas (sin los compuestos la y Ib) y substancias de referencia. Los LC5o de las muestras netas en pares se dividieron entre los valores potenciados de LCso para da la doble reducción en LCso asociado con la mezcla de los compuestos la y Ib. Los resultados se presentan en el CUADRO 7, infra, e indican que la mezcla cruda de los compuestos la y Ib activan la potencia de la actividad insecticida de NOVODOR™ contra Leptinotarsa texana.

CUADRO 7 Potenciación de NOVODOR™ con una Mezcla de Compuestos la y Ib Contra Leptinotarsa texana Muestra LCso ug/ml Factor de Potenciación NOVODOR™ 642 0 NOVODOR™ 1.25% la/Ib 250 2.6 NOVODOR™ 2.50% la/Ib 98 6.5 EJEMPLO 11 : Actividad de una Mezcla de los Compuestos la v Ib Contra Escarabajos Ips calliaraphus y Dendroctonus frontalis Se determinó la toxicidad de una mezcla cruda de los compuestos la y Ib contra los escarabajos Ips calligraphus y Dendroctonus frontalis. 3 mi* de una solución cruda de los compuestos la y Ib (1 .8 mg de ingrediente activo por mi) se añadieron a 5 gramos de floema de pino Lobolly seco, congelado, y 7 mi de agua destilada. Se preparó una dieta de control con 10 mi de agua. La dieta se dividió en tres cajas de petri, y en cada caja se colocaron de 5 a 10 escarabajos jóvenes Ips o Dendroctonus recién adultos. Tres diferentes lotes de dieta tratada y dieta de control se colonizaron con 10 a 20 insectos. Las cajas de petri se incubaron en la obscuridad a 25°C, y el número de insectos muertos se contó 4, 7, y 10-12 días después de colocarlos en la dieta. Los datos presentados son promedios de 2 o 3 estudios de replicación, distintos, para cada especie de insecto. Los resultados para Ips caliigraphus se presentan en el CUADRO 8, infra, e indican que la mezcla cruda de los compuestos la y Ib es insecticida.

CUADRO 8 Evaluación de una Mezcla de Compuestos la y Ib contra Ips calligraphus Tratamiento Tratamiento # Insectos # Muerte % Días Post Promedio Mortalidad Promedio Control 4 20 0 0 Control 7 20 0 0 Control 10 20 1 3 la/Ib 4 20 1 5 la/Ib 7 20 7 35 la/Ib 1 0 20 20 1 00 Los resultados para los bioanálisis de Dendroctonus frontalis se presentan en el CUADRO 9, infra, e indican que la mezcla de los compuestos la y Ib es insecticida.

CUADRO 9 Evaluación de una Mezcla de Compuestos la y Ib contra Dendroctonus frontalis Tratamiento Tratami nto # Insectos # Muerte % Días Post Promedio Mi ortalidad P romedio Control 4 14-20 0 0 Control 7 14-20 1 7 Control 10-12 14-20 3 16 la/ib 4 10-20 1 5 la/Ib 7 10-20 1 5 la/Ib 10 20 14 83 EJEMPLO 12: Actividad Contra Pooillia iaoonictí (Escarabajo Japonés) La mezcla cruda de los compuestos la y Ib se probó para la actividad pesticida contra Popillia japónica tercera crisálida. Se remojaron raíces de ballico Perrenial (1 1 días de edad) en ia mezcla cruda de los compuestos la y Ib (1.8 mgs de la y Ib por mi) y se dejaron secar parcialmente. Un tercio de crisálida de larva Popillia japónica se colocó en estaño con varias raíces tratadas. Después de 24 horas, las raíces y las larvas se cubrieron con tierra de cieno de Wooster. Las raíces de control se remojaron en agua, y los controles no tratados consistieron de larvas colocadas directamente en la tierra en el día 1. Los estaños (charolas) se incubaron en la obscuridad a 25°C, y se verificó el número de larvas muertas después de 7, 10, 21 , 28, y 36 días y se reportó la mortalidad corregida del control {(supervivencia de control-supervivencia de tratamiento)/supervivencia de control) x 100%}. Para cada tratamiento se utilizó un total de 25 larvas. Los resultados, como se muestran en el CUADRO 10, demuestran que la mezcla cruda de los compuestos la y Ib es efectiva contra Popillia japónica de tercera crisálida.

CUADRO 10 Actividad dé los Compuestos la y Ib Contra Popillia japónica 7 días 10 días 21 días 28 días 36 días No Tratado # Muerte 2 2 4 5 5 Control Agua # Muerte 2 3 8 10 1 1 % Control 0 4.3 19 25 30 la y Ib # Muerte 6 8 1 3 14 1 5 % Control 17.4 26.1 42.9 45 50 EJEMPLO 13: Actividad contra Epilachna varivestis (Escarabajo del Frijol Mexicano) La mezcla cruda de los compuestos la y Ib (1 .8 mg por mi) se probó para la actividad pesticida contra larvas Epilachna variversis de tercera crisálida. Una colonia encerrada de Epilachna varivesis adultos se mantuvo en frijoles de media luna enanos de Burpee en una cámara de crecimiento durante un fotoperiódo de 16: 8 a 26.6°C y una humedad relativa de 50%. Se recogieron masas de huevos y se incubaron en una caja de petri conteniendo un trozo de algodón húmedo y hojas de frijoles de media luna. Después de dos días, se recogieron las larvas de Segunda crisálida y se utilizaron para los bioanálisis de remojo de hojas. Para llevar a cabo el bioanálisis, se cosecharon hojas de frijol, y el pecíolo de una sola hoja se colocó a través del septo de hule de un tubo de florista conteniendo 4 mi de agua. Después, las hojas se remojaron en diluciones en serie en la escala de 0-12% v/v del material crudo conteniendo ios compuestos la y Ib. Una vez que las hojas se secaron, se colocaron, en cada hoja, 8-10 larvas de segunda crisálida. Los insectos, las hojas y los tubos de florista se colocaron en una taza de 632.7 gramos, cubierta con una malla fina. Las tazas se mantuvieron en la misma cámara de crecimiento utilizada para cultivar la colonia de escarabajos. Cada dos días, las tazas fueron removidas de la cámara de crecimiento, las larvas se enumeraron, y las hojas se volvieron a colocar con hojas tratadas frescas. Las pruebas se terminaron después de 8 días.

Los resultados, mostrados en el CUADRO 1 1 , demuestran que la muestra cruda de los compuestos la y Ib son activas contra larvas Epilachna variversis.

CUADRO 11 Respuesta de Mortalidad de Dosis de Larvas Epilachna varivesis Días después del LCso 95% de Límites Fiduciales Tratamiento %. Inferior Superior 4 5.6 2.58 10.65 6 2.12 3.03 9.37 8 1 .94 0.75 2.81 EJEMPLO 14: Análisis de Campo Contra Leptinotarsa decemlineata (Escarabajo de la Papa de Colorado) El análisis fue conducido contra Leptinotarsa decemlineata para control en papas (variedad Katahdin) con la mezcla cruda de los compuestos la y Ib aplicada a- 50, 100, 150, y 300 gramos por acre, en combinación con NOVODOR™ aplicado a 0.5 y 1 .0 cuartos por acre, y NOVODOR™ también aplicado sólo a 0.5, 1 .0 y 2.0 cuartos por acre. Los tratamientos se aplicaron dos veces durante 7 días por separado junto con un rociador de relleno de CO2 equipado con tres boquillas cónicas huecas de sistemas de aspersión TXVX-12 por fila y calibradas para suministrar 299.2 litros por hectárea a 3 mph y 3.93 kg/cm2. Cada tratamiento se repitió 4 veces en porciones de dos filas (separación de 86.36 cm) por 7.62 metros en un diseño de bloque aleatorio. Se hicieron cuentas de adultos y larvas de Leptinotarsa decemlineata a partir de lo anterior sin dañar el follaje sobre 15.24 metros de fila/porción. Los resultados, como se muestran en la Figura 3, demuestran que una mezcla cruda de los compuestos la y Ib proveen una actividad sinergística significativa con NOVODOR ™ sobre las papas. A 0.5 cuartos de NOVODOR™ por 0.46 hectáreas, se observó un control de 21 % , mientras que a 50 gramos de la mezcla cruda de los compuestos de la y Ib por 0.46 hectáreas, se obtuvo un control del 13%. Sin embargo, cuando se aplicaron, conjuntamente, a estos regímenes, tanto el NOVODOR™ y la mezcla cruda de los compuestos la y Ib, el porcentaje de control se incrementó a 81 %. Similarmente, a 100 gramos de la mezcla cruda de los compuestos la y Ib por 0.46 hectáreas, se obtuvo un control del 28%, mientras que a 0.5 cuartos de NOVODOR ™ se observó un control del 21 %, pero cuando tanto el NOVODOR ™ como la mezcla cruda de los compuestos la y Ib se aplicaron conjuntamente, a estos regímenes, el porcentaje de control se incrementó a 81 %. Además, cuando la mezcla cruda de los compuestos la y Ib a 50 gramos por 0.46 hectáreas y NOVODOR ™ a 1.0 cuartos por 0.46 hectáreas, se aplicaron conjuntamente, el porcentaje de control se incrementó a 88% .

DEPOSITO DE MICROORGANISMOS Las siguientes cepas de Bacillus thuringiensis han sido depositadas de acuerdo al Tratado de Budapest en el Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional Research Center (NRRL), 1815 University Street, Peoría, Illinois, 61604, E. U.A.

Qepa Número de Acceso Fecha de Depósito EMCC-0077 NRRL B-21090 10 de mayo 1993 EMCC-0078 NRRL B-21091 10 de mayo 1993 EMCC-0079 NRRL B-21092 10 de mayo 1993 EMCC-0080 NRRL B-21093 10 de mayo 1993 EMCC-0081 NRRL B-21094 10 de mayo 1993 Las cepas han sido depositadas bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo será disponible durante la vida de esta solicitud de patente a alguien determinado por el Director de Patentes y Marcas intitulado al mismo bajo 37 C. F. R. §1 .14 y 35 U .S.C. § 122. El depósito representa un cultivo substancialmente puro para cada cepa depositada. El depósito está disponible según se requiera por las leyes de patente extranjera en los países en donde las contrapartes de la solicitud principal, o su progenie, son presentadas. Sin embargo, se debe entender que la capacidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención presente en derogación de los derechos de patente otorgados mediante acción gubernamental . La invención descrita y reclamada aquí no está limitada en alcance por las modalidades específicas aquí descritas, ya que estas modalidades pretenden ser ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualquier modalidad equivalente pretende estar dentro del alcance de esta invención. En realidad, varias modificaciones a la invención, además de aquellas mostradas y descritas aquí, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Dichas modificaciones también pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Varias referencias se citan en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Una cepa de Bacillus thuringiensis, en donde esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de una fermentación de dicha cepa. 2 - La cepa de Bacillus thuringiensis de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la cepa de Bacillus thuringiensis se selecciona del grupo que consiste de la cepa EMCC-0077 que contiene las características de identificación de NRRL B-21090, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0077, la cepa EMCC-0078 que tiene las características de identificación de NRRL B-21091 , o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0078, la cepa EMCC-0079 que tiene las características de identificación de NRRL B-21092, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0079, la cepa EMCC-0080 que tiene las características de identificación de NRRL B-21093, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0080, y la cepa EMCC-0081 que tiene las características de identificación de NRRL B-21094, o sus mutantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0081. 3.- La cepa de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde una substancia que tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden de Coleópteros y dicha substancia actúa junto con pesticida relacionado con Bacillus diferente contra una plaga, se

obtiene del sobrenadante de la fermentación de dicha cepa. 4.- La cepa de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la substancia tiene la estructura (I)

en donde R T es un amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico (C?.?o), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de d-5, o aminoácido, incluyendo, pero no limitándose a, alanilo, valinilo, leucinilo , isoleucinilo, fenilalanilo, glicinilo, y fenilglicinilo; R2 es alquilo (C1.10); R3 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico (d-io) , éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de C?-5, metilamina, dimetilamina , tionilo, metiltionilo, ciano, o una sal de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R4 es hidrógeno, amino, hidroxi , alquilo (d- 10) , éster alquílico (d-10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo

que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de C?.5, o una sal de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; Rs es hidrógeno, metoxi, amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico (C1-10), éster arítico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, o alcoxi de C1-5; R6 es amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico, éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno o alcoxi de d-5; R7 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (C1-10), éster alquílico (d.10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, hatógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de d-5, o una sal de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R8 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (d.10), éster alquílico (C1-10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de C1.5, metilamina, dimetilamina, tionilo, metiltionilo, ciano o una mezcla de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R8 es alquilo (C1.10) ; y

R10 es amino, hidroxi, alquilo (Ci.io) , éster alquílico (C1 - 10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo , dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de d-s, o aminoácido incluyendo alanilo, valinilo , leucinilo, isoleucinilo, fenilalanilo, glicinilo, y fenilglicinilo. 5.- La cepa de acuerdo con la reivindicación 4 , en donde R, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de alanilo, leucinilo, isoleucinilo, fenilalanilo, glicinilo y feni Iglicinilo . 6 - La cepa de acuerdo con la reivindicación 4, en donde R10 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de alanilo, valinilo, isoleucinilo, fenilalanilo, glicinilo y fenilglicinilo. 7 - La cepa de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la substancia tiene la estructura:

la: R , R L R2, R3=H Ib: R, RL R2=H , R3=OH . 8 - Una composición pesticida que comprende: (a) una substancia que tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos

del orden de Coleópteros y actúa junto con un pesticida relacionado con Bacillus, diferente, contra una plaga, dicha substancia se obtiene de un sobrenadante de una fermentación de una cepa de Bacillus en donde esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de dicha fermentación, y (b) un pesticida relacionado con Bacillus en donde la substancia está presente en la cantidad de por lo menos aproximadamente 1 g/LTU . 9.- La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la substancia tiene la estructura (I):

en donde R i es un amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico (Ci.io), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de C1 -5, o aminoácido , incluyendo, pero no limitándose a, alanilo, valinilo, leucinilo , isoleucinilo, fenilalanilo, glicinilo, y fenilgl icin ilo ; R2 es alquilo (C1 -10); R3 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (d-io), éster alquílico (C1-10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo , dinitrobenzoilo,

halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de d.s, metilamina, dimetilamina, tionilo, metiltionilo, ciano, o una sal de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, aCetato, carbonato y nitrato; R4 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (d-io), éster alquílico (C1.10) , éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de d-s, o una sal de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R5 es hidrógeno, metóxi, amino, hidroxi, alquilo (d-10), éster alquílico (d-10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógénobenzoilo, halógeno, o alcoxi de d-5; R6 es amino, hidroxi, alquilo (d.10), éster alquílico, éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno o alcoxi de d-s; R7 es hidrógeno, amino, hidroxi, alquilo (C1.10), éster alquílico (C1-10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de C?-5, o una sal de los mismos incluyendo , pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R8 es hidrógeno, amino, hidroxi , alquilo (C1.10), éster alquílico (C1.10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo

que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de C1 -s, metilamina, dimetilamina, tionilo, metiltionilo, ciano o una mezcla de los mismos incluyendo, pero no limitándose a fosfato, sulfato, acetato, carbonato y nitrato; R es alquilo (d.io); y Río es amino, hidroxi, alquilo (d- 10), éster alquílico (C1.10), éster arílico, en donde dicho arilo se selecciona del grupo que consiste de benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, halógenobenzoilo, halógeno, alcoxi de d.5 l o aminoácido incluyendo alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, fenilalanilo, glicinilo, y fenilglicinilo, y (b) un pesticida relacionado con Bacillus. 10.- La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la substancia tiene la estructura:

Ib: R , R L R2 = H , R3=OH 1 1 .- Un método para controlar una plaga, que comprende exponer la plaga a una cantidad efectiva controladora de plagas del pesticida de la reivindicación 8.

12.- Un método para controlar una plaga de insectos de una especie del orden de Coleóptero, seleccionado del grupo que consiste de Leptinotarsa decemlineata, Ips calligraphus, Dendroctonus frontalis, Epilachna varivestis, y Popillia japónica, que comprende exponer la plaga a una cantidad efectiva controladora de plagas de una composición pesticida que comprende, (a) una substancia que tiene una actividad pesticida contra la plaga de insectos del orden de Coleóptero y actúa junto con un pesticida relacionado con Bacillus, diferente, dicha substancia se obtiene de un sobrenadante de una fermentación de una cepa de Bacillus, en donde esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de dicha fermentación y (b) un vehículo pesticidamente efectivo.

13.- Un método para activar la potencia de la actividad pesticida de un pesticida relacionado con Bacillus que comprende exponer la plaga a una composición pesticida que comprende, (a) una substancia que tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden Coleóptero y actúa junto con un pesticida relacionado con Bacillus, diferente, contra una plaga, dicha substancia se obtiene de un sobrenadante de una fermentación de una cepa de Bacillus, en donde esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de dicha fermentación, y (b) un vehículo pesticidamente efectivo en una cantidad suficiente para activar la potencia de la actividad pesticida de dicho pesticida relacionado con Bacillus.

14.- Un método para obtener una substancia substancialmente pura, la cual tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden Coleóptero y que actúa junto con un pesticida relacionado con Bacillus, diferente, contra una peste, dicha substancia se obtiene de un sobrenadante de la fermentación de una cepa de Bacillus thuringiensis, en donde esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de dicha fermentación, que comprende, (a) cultivar una cepa de Bacillus thuringiensis, en donde esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de la fermentación de dicha cepa en un medio adecuado de crecimiento; (b) recuperar el sobrenadante de (a); y (c) aislar la substancia del sobrenadante del paso (b) para obtener una substancia substancialmente pura .