MXPA97000326A - Compuesto novedoso activo y dipteros y cepa debacillus thuringiensis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una substancia novedosa con actividad contra plagas de insectos del orden Díptera. La invención además se refiere a la substancia que actúa junto con un pesticida relacionado con Bacillus, un pesticida químico y/o un virus con propiedades pesticidas. La invención además se refiere a una cepa(s) novedosa de Bacillus thuringiensis, la cual produce dicha substancia. La invención además se refiere a composiciones pesticidas que comprenden la substancia y un vehículo pesticida, o la substancia y un pesticida relacionado con Bacillus, un pesticida químico y/o un virus con propiedades pesticidas, asícomo a métodos para utilizar las composiciones pesticidas para controlar una plaga.

Description

COMPUESTO NOVEDOSO ACTIVO A DÍPTEROS Y CEPA DE BACILLUS THURINGIENSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un compuesto novedoso con actividad contra una peste(s) de insectos del orden Díptera. La invención además se refiere a dicho compuesto, el cual activa o sinergiza la actividad pesticida de un pesticida relacionado con Bacillus, un pesticida químico y/o un virus entomopatogénico. La invención además se refiere a una cepa(s) novedosa de Bacillus thuringiensis, la cual produce dicho compuesto. La invención además se refiere a formulaciones pesticidas que comprenden el compuesto y a un vehículo pesticida, o al compuesto y a un pesticida relacionado con Bacillus, un pesticida químico y/o un virus entomopatogénico. La invención además se refiere a métodos para utilizar las formulaciones pesticidas para controlar una plaga.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cada año, las plagas dañan a la agricultura, al bosque, y a la salud pública, ocasionando pérdidas de millones de dólares. Se han utilizado varias estrategias para controlar dichas plagas. Una estrategia es el uso de pesticidas químicos con una a mplia escala o espectro de actividad. Sin embargo , existe un número de desventajas al utilizar pesticidas químicos. Específicamente, debido a su amplio espectro de actividad, estos pesticidas pueden destruir organismos no objetivos, tales como insectos y parásitos benéficos de plagas destructivas. Además, los pesticidas químicos son frecuentemente tóxicos para los animales y el ser humano. Además, las plagas objetivo frecuentemente desarrollan resistencia cuando se exponen repetidamente a dichas substancias. Otra estrategia implica el uso de biopesticidas para controlar insectos, hongos e infestaciones de maleza. Los biopesticidas son patógenos de existencia natural y/o substancias producidas por estos patógenos. La ventaja de utilizar biopesticidas es que generalmente son menos dañinos a ios organismos no objetivo y al ambiente, como un todo, comparado con los pesticidas químicos. El biopesticida más ampliamente utilizado es Bacillus thuringiensis. El Bacillus thuringiensis es una bacteria móvil, con forma de barra, gram-positiva , que está ampliamente distribuida en la naturaleza, especialmente en el suelo y en ambientes enriquecidos de insectos. Durante la esporulación , el Bacillus thuringiensis produce una inclusión(es) de cristal paraesporal, la cual es insecticida al ser ingerido por las larvas del insecto susceptible de los órdenes de Lepidotera, Díptera y Coleóptera. Las inclusiones pueden variar en forma, número y composición . Están compuestas d e una o más proteínas denominadas delta-endotoxinas , las cuales pueden varia en tamaño , de 27-140 kDa . Las delta-endotoxinas insecticidas son generalmente convertidas por las proteasas en los intestinos larvarios, a polipéptidos tóxicos más pequeños (truncados), ocasionando una destrucción del intestino medio, y finalmente, la muerte del insecto (Hófte and Whiteley, 1989, Microbial Reviews 53:242-255). Existen varias cepas de Bacillus thuringiensis que son ampliamente utilizadas como biopesticidas en las áreas forestal, agrícola, y de salud pública. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki y Bacillus thuringiensis subsp. aizawai produce delta-endotoxinas específicas para Lepidoptera. Una delta-endotoxina específica para Coleóptera, es producida por Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg y otros, 1988, patente de E. U.A. No. 4,766,203). Además, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis produce delta-endotoxinas específicas para Díptera (Golgberg, 1979, patente de E. U .A. No. 4, 166, 1 12). También se ha descrito otras cepas de Bacillus thuringiensis específicas para plagas de dípteros. Se ha descrito un aislado de Bacillus thuringiensis, el cual es tóxico a Díptera y Lepidopter (Hodgman y otros, 1993, FEMS Microbiology Letters 1 14: 17-22). La electroforesis de gel de docecil poliacrilamida de sodio, de la delta-endotoxina de cristal purificada de este aislado, reveló tres especies de proteína, las cuales está relacionadas con las toxinas CrylA(b) , CrylB, y Cryl lA. También se ha descrito un aislado de Bacillus thuringiensis, el cual produce un cristal activo contra dípteros, compuesto de proteínas con pesos moleculares de 140, 122 , 76. 72 , y 38 kDa (Payne, 1994, patente de E. U.A. No . 5,275,815). EPO 480, 762 describe cinco cepas de B. t. , las cuales son cada una activa contra plagas de dípteros; cada también tiene un único patrón de delta-endotoxina de cristal. Se han descrito varias cepas de Bacillus thuringiensis, las cuales tienen actividad pesticida contra plagas diferentes de Lepidoptera, Coleóptera y Díptera. Se ha descrito que las cinco cepas de Bacillus thuringiensis producen delta-endotoxinas que son tóxicas contra nemátodos (Edwards, Payne, and Soares, 1988, Sol. de Pat. Eur. No. 0 303 426 B1 ) . También se ha descrito una cepa de Bacillus thuringiensis, PS81 F, la cual puede ser utilizada para tratar seres humanos y animales que tienen como huéspedes protozoarios parasíticos (Thompson and Gaertner, 1991 , Sol. Pat. Eur. No. 0 461 799 A2) . Se ha descrito también que varios aislados de Bacillus thuringiensis tienen actividad contra plagas de acáridos. Estos aislados producen cristales compuestos de proteínas con pesos moleculares en la escala (amplia) de 35 kDa a 155 kDa (Payne, Cannon and Bagley, 1992, Solicitud del PCT No. WO 92/19106). También se han descrito cepas de Bacillus thuringiensis con actividad contra plagas del orden de Himenoptera (Payne, Kennedy, Randall, Meier, and Uick, 1992, Sol. Pat. Eur. No. 0 516 306 A2); con actividad contra plagas del orden de Hemiptera (Payne and Cannon , 1993, patente de E. U .A. No. 5,262 , 159) ; con actividad contra plagas de gusanos (H ickle , Sick, Schwab , Narva, and Payne, 1993 , patente de E. U .A. No. U .S.5, 262, 399) ; y con actividad contra plagas del orden de Phthiraptera (Payne and H ickle, 1993, patente de E. U .A .

No . 5,273,746) . Además, se ha descrito que otra cepa de Bacillus thuringiensis subsp. kustaki, WB3S-16, aislada de las esquilas de la lana del borrego Australiano, es tóxica a la mordida del piojo, Damalinia ovis, una plaga del orden de Phthiraptera (Drummond , Miller and Pinnock. 1992, J. Invert. Path. 60: 102-103). Las delta-endotoxinas son codificadas por genes cry (proteína de cristal), los cuales son generalmente ubicados en los plásmidos. Los genes cry han sido divididos en seis clases y varias subclases, con base en la homología relativa del aminoácido y el carácter específico del pesticida. Las clases principales son Lepidotera-específica (cryl); Lepidotera-y Diptera-específicas {cryll); Coleoptera-específica (crylll); Diptera-específica (crylV) (Hófte and Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53:242-255); Coleoptera-y Lepidoptera-específicas (denominadas como genes cryV por Tailor y otros, 1992, Molecular Microbiology 6: 121 1 - 1217); y Nematoda-específica (denominada como cryV y cryVI por Feitelson y otros, Bio/Technoligy 10:271 -275) . Las delta-endotoxinas han sido producidas mediante métodos recombinantes de ADN. Las delta-endotoxinas producidas mediante métodos recombinantes de ADN pueden o no pueden estar en la forma de cristal. Algunas cepas de Bacillus thuringiensis han mostrado prod ucir un análogo de adenina-nucleótido pesticida, estable al calo r, conocido como ß-exotoxina tipo I o thuringiensin , el cual solamente es pesticida (Sebesta y otros, en H . D . Burges (ed .) , Microbial Control of Pßsts and Plant Diseases, Academic Press, New York, 1980, pp. 249-281 ). La ß-exotoxina tipo I se ha encontrado en el sobrenadante de algunos cultivos de Bacillus thuringiensis. Tiene un peso molecular de 701 y está compuesta de adenosina, glucosa, y ácido alárico (Farkas y otros, 1977, Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 42:909-929; Lüthy y otros, en Kurstak (ed .), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, pp. 35-72). Su escala de huésped incluye, pero no se limita a, Musca domestica, Mamestra configúrate Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster, y Tetranychus cinnabarinus. Se cree que la toxicidad de la ß-extoxina tipo I se debe a la inhibición de la polimerasa de ARN dirigida por ADN por la competencia con ATP. Se ha mostrado que la ß-exotoxina tipo I es codificada por un plásmido cry en cinco cepas de Bacillus thuringiensis (Levinson y otros, 1990, J. Bacteriol. 172 : 3172-3179) . Se encontró que la ß-exotoxina tipo I es producida por Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis serotipo 1 , Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi serotipo 9, y Bacillus thuringiensis subsp . darmstadiensis serotipo 10. Se ha descrito otra ß-exotoxina clasificada como ß-exotoxina tipo II (Levinson y otros, 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179) . Se ha encontrado que la ß-exotoxina tipo I I es producida por Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotipo 8ab y es activa contra Leptinotarsa decemlineata. La estructura de la ß-exotoxina tipo I I n o es completamente conocida , pero es significativamente diferente d e aquella de la ß-exotoxina tipo I , en que una porción de pseudouridina está en lugar de adenina, en cuya unión al anillo de ribosa está en una posición que podría de otra forma ser ocupada por un protón (Levinson , en Hickle and Finch (eds.) , Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington , D.C. , 1990, pp. 1 14-136). Además, sólo existe una señal en el espectro de RNM del protón que corresponde a la base de nucleósido (a 7.95 ppm), y no tiene una señal de proteína anomérica de tipo de ribosa (5.78 ppm). Otras substancias solubles en agua de Bacillus thuringiensis que han sido aisladas incluyen alfa-exotoxina, la cual es tóxica contra la larva de Musca domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8: 1 -7); gama-exotoxinas, las cuales con varias enzimas que incluyen lecitinasas, quitinasas, y proteasas, los efectos tóxicos de las cuales se expresan solamente en combinación con la beta-exotoxina o la delta-endotoxina (Forsberg y otros, 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canadá, N RC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcomittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxina, la cual tiene una estructura similar a la beta-exotoxina , y también es activa contra Leptinotarsa decemlineata (Argauer y otros, 1991 , J. Entomol. Sci. 26:206-213) ; y anhidrothuringiensin (Prystas y otros , 1975, Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 40: 1 175) . WO 94/09630 describe un factor que acciona la actividad pesticida de B. t. Este factor es obtenido a partir del sobrenadante de un cultivo de B.t. La técnica se ha esforzado en mejorar la efectividad y de ampliar la escala de huésped de Bacillus thuringiensis. Los medios han incluido aislar las cepas de Bacillus thuringiensis con actividad pesticida mejorada o nueva, procesando mediante ingeniería las cepas de Bacillus thuringiensis, y diseñando formulaciones más efectivas, combinando delta-endotoxinas de cristal de Bacillus thuringiensis y esporas con nuevos vehículoes pesticidas o con pesticidas químicos. Es un objeto de la presente invención, proveer una substancia novedosa que tenga actividad contra plagas del orden Díptera. Es también un objeto de la presente invención, mejorar la actividad pesticida de formulaciones conocidas de Bacillus thuringiensis. Es un objeto más de la presente invención , incrementar la actividad pesticida de los pesticidas . Es ventajoso aislar nuevas cepas de Bacillus thuringiensis para producir nuevas substancias, con el fin de que exista un espectro más amplio de biopesticidas para utilizarse contra cualquier plaga de insectos dada.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una substan cia novedosa , caracterizada porque tiene las siguientes propiedades: (a) actividad pesticida contra una plaga de insectos del orden Díptera; y (b) actúa en conjunto, v.gr. , como un potenciador o sinergizador, con un pesticida relacionado de Bacillus diferente, un pesticida químico, y/o un virus entomopatogénico contra una plaga(s). La substancia de la invención también puede ser un nucleósido de uracilo, que tiene tres porciones de azúcar y dos fosfatos con desplazamientos químicos de 1 H-RNM a aproximadamente 7.62 (1 H ,d), 5.83 (1 H ,d) , y 5.78 (1 H ,d). La substancia puede tener un peso molecular menor que aproximadamente 1000. La substancia se puede obtener de una fermentación de Bacillus. Alternativamente, la substancia se puede obtener de una fermentación de una cepa de Bacillus, v.gr. , Bacillus thuringiensis, en donde esencialmente toda la actividad pesticida de la cepa está en el sobrenadante de la fermentación. Específicamente, la substancia de la presente invención, tiene un LC50 ele 7 µg de ingrediente activo/g de dieta contra la larva de Musca domestica, como se analizó mediante bioensayo (LC50 es la concentración de una substancia pesticida dada, requerida para aniquilar 50% de las plagas). El LCso de la pella de la fermentación , de dicha cepa, tiene más de aproximadamente 3000 µg de ingrediente activo/g de dieta contra la larva de Musca domestica, como se analizó mediante bioensayo La substancia de la presente invención , puede tener actividad pesticida contra una plaga de insectos del género Drosphila y el género Musca del orden Díptera. En una modalidad muy específica, la substancia de la presente invención tiene actividad pesticida contra una plaga de insectos de la especie Drosphila melanogaster y la especie Musca domestica del orden Díptera. En otra modalidad, la substancia de la presente invención acciona la actividad pesticida de un pesticida relacionado con Bacillus. En una modalidad específica, la substancia de la presente invención acciona la actividad insecticida de delta-endotoxina(s) de cristal de Bacillus thuringiensis contra una plaga(s) de insectos. En otra modalidad, la substancia de la presente invención acciona o sinergiza la actividad insecticida de la delta-endotoxina de cristal Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki contra una plaga de insectos del orden Lepidoptera. Como se define en la presente, "un pesticida relacionado con Bacillus'' es una cepa, espora, o substancia de Bacillus (v.gr. , Bacillus thuringiensis o Bacillus subtilis), v.gr. , proteína o fragmento de la misma, con actividad contra o el cual aniquila plagas o provee protección a la planta contra una plaga; o un microorganismo capaz de expresar un gen de Bacillus que codifica a una proteína de Bacillus o fragmento del mismo, con actividad contra o el cual aniquila plagas o prevee protección a la plante contra una plaga (v.gr. , delta-endotoxina de Bacillus thuringiensisK), y un vehículo aceptable. La plaga puede ser, por ejemplo , un insecto, un nemátodo, un acaro, o un caracol . U n microorganismo , capaz de expresar un gene de Bacillus que codifica a una proteína de Bacillus o un fragmento del mismo, con actividad contra o el cual aniquila plagas o provee protección a la planta contra una plaga, se establece en el filoplano (la superficie de las hojas de la planta), y/o rizósfero (el suelo que rodea las raíces de las plantas) , y/o ambientes acuáticos, y es capaz de competir exitosamente en el ambiente particular (grano y otros hábitats de insectos) con los microorganismos de tipo silvestre y proveer un mantenimiento estable y expresión de un gen de Bacillus que codifica una proteína de Bacillus o fragmento del mismo, con actividad contra o el cual aniquila plagas. Ejemplos de dichos microorganismos incluyen, pero no se limitan a, bacterias, v.gr. , de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylphilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azobacter, Leuconostoc, Alcaligenes, y Clostridium; algas, v.gr. , familias Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae, y Chlorophyceae; y hongos, particularmente levaduras, v. gr. , de los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. Como se definió en la presente "actividad pesticida" mide la cantidad de actividad contra una plaga a través de la aniquilación o del impedimento del crecimiento de la plaga , o proteger a la planta de la infestación por plaga .

La invención además se refiere a una cepa novedosa de Bacillus y, específicamente, a una cepa(s) de Bacillus thuringiensis, la cual produce dicha substancia. La delta-endotoxina de cristal y las esporas obtenidas de la fermentación de una cepa de Bacillus thuringiensis de la presente invención, no poseen esencialmente ninguna actividad pesticida. En una modalidad específica, la cepa se selecciona del grupo que consiste de EMCC-0110, que tiene las características de identificación de NRRL B-21269, o sus mutantes o variantes, que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0110, EMCC-0111, que tiene las características de identificación de NRRL B-21270, o sus mutantes o variantes, que tienen substancialmente las mismas características de EMCC-0111, EMCC-0112, que tiene las características de identificación de NRRL B-21271, o sus mutantes o variantes, que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0112, y EMCC-0113, que tiene las características de identificación de NRRL B-21272, o sus mutantes o variantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0113. Los mutantes y las variantes de EMCC-0110. EMCC-0111, EMCC-0112, y EMCC-0113 retienen la habilidad para producir la substancia de la presente invención. La invención además se refiere a un mutante o variante de la cepa de Bacillus, en donde dicha substancia es obtenida en una cantidad mayor, comparada con la cepa paternal, así como a métodos para obtener dicho mutante o variante. La invención además se refiere a composiciones pesticidas que comprenden la substancia y a un vehículo pesticida, así como a una substancia y a un pesticida relacionado con Bacillus, pesticida qu ímico, y/o un virus entomopatogénico, así como a métodos para utilizar las composiciones pesticidas para el control de una plaga. La invención además está dirigida a un método para obtener una substancia "substancialmente pura" de la presente invención, que comprende los pasos de: (a) cultivar una cepa de Bacillus sobre un medio adecuado de crecimiento; (b) recuperar el sobrenadante de (a) ; y (c) aislar la substancia del sobrenadante de (b) , para obtener la substancia substancialmente pura. Como se define en la presente, substancia "substancialmente pura" significa una substancia que contiene menos de 55% de contaminantes, por ejemplo, la proteína delta-endotoxina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Estos y otros puntos , aspectos, y ventajas de la presente invención se entenderán mejor considerando la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y dibujos anexos , en los cuales : La Figura 1 es un espectro de 1 H-RNM de la substancia de la presente invención . La Figura 2 es un espectro de 1 H-RNM de una ß-exotoxina .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Obtención de la Substancia La substancia de la presente invención es producida mediante microorganismos pertenecientes al género Bacillus, v.gr., Bacillus thuringiensis, y se puede obtener cultivando el Bacillus y recuperando la substancia del sobrenadante, En una modalidad específica, la substancia de la presente invención se puede obtener a partir del sobrenadante de una fermentación de una cepa de Bacillus thuringiensis del grupo que consiste de EMCC-0110, que tiene las características de identificación de NRRL B-21269, o sus mutantes o variantes, que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0110, EMCC-0111, que tiene las características de identificación de NRRL B-21270, o sus mutantes o variantes, que tienen substancialmente las mismas características de EMCC-0111, EMCC-0112, que tiene las características de identificación de NRRL B-21271, o sus mutantes o variantes, que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0112, y EMCC-0113, que tiene las características de identificación de NRRL B-21272, o sus mutantes o variantes que tienen substancialmente las mismas propiedades de EMCC-0113. Los mutantes y las variantes de EMCC-0110, EMCC-0111, EMCC-0112, y EMCC-0113 retienen la habilidad para producir la substancia de la presente invención. En una modalidad, la substancia de la presente invención se puede obtener a partir de un mutante o variante de Bacillus, particularmente, Bacillus thuringiensis, en donde la substancia es producida en una cantidad mayor, o un mutante o variante de Bacillus thuringiensis, en donde la actividad insecticida de la substancia obtenida del mutante o variante es mayor, comparada con la cepa paternal. Una "cepa paternal", como se define en la presente, es la cepa original de Bacillus antes de la mutagénesis. Para obtener dichos mutantes o variantes, la cepa paternal puede ser, por ejemplo, tratada con un mutagen mediante medios químicos tales como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina o sulfonato de etilmetano, o mediante irradiación con rayos gama, rayos X, o UV. Específicamente, en un método para la mutación de cepas de Bacillus y para la selección de dichos mutantes o variantes, se utiliza el siguiente procedimiento: i) la cepa paternal es tratada con un mutagen; ii) los mutantes o variantes así probables de la cepa paternal se hacen crecer en un medio adecuado para seleccionar una cepa mutante; y iii) la cepa de mutante o variante se selecciona para la producción incrementada de la substancia. De acuerdo con una modalidad preferida de este método, Jas colonias seleccionadas se hacen crecer en un medio de producción , y se lleva a cabo una selección final para las cepas de mutantes o variantes, capaces de la producción incrementada de la substancia . La producción incrementada puede ser determi nada mediante métodos conocidos en la técnica, v.gr., cromatografía de alto rendimiento, electroforesis capilar, o cromatografía de capa delgada. El Bacillus puede ser cultivado utilizando medios y técnicas de fermentación, conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Rogoff y otros, 1969, J. Invertebrate Path. 14:122-129; Dulmage y otros, 1971, J. Invertebrate Path. 18:353-358; Dulmage y otros, en Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges (ed.), Academic Press, New York, 1980). Al término del ciclo de fermentación, el sobrenadante puede ser recuperado, separando las esporas y cristales de Bacillus thuringiensis del caldo de fermentación mediante medios bien conocidos en la técnica, v.gr., centrifugación y/o ultrafiltración. La substancia de la presente invención está contenida en el sobrenadante, el cual puede ser recuperado mediante medios bien conocidos en la técnica, v.gr., ultrafiltración, evaporación y secado por aspersión. La purificación de la substancia de la presente invención, puede realizarse mediante varios procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (v.gr., cromatografía de columna de intercambio de iones, de afinidad, y de exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, extracción, o cualquier otra técnica normal, bien conocida (véase, por ejemplo, CRC Handbook of Natural Pesticides: Methods, Volumen II, Isolation and Identification, N. Bhushan Mandava, de. CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida, 1985). La actividad de la substancia de la presente invención, puede ser bioanalizada utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como incorporación de dieta artificial, recubrimiento de dieta artificial, pintura de hojas, goteo de hojas, aspersión foliar, y acuática. Los ejemplos específicos de dichos bioanálisis se presentan en la sección de Ejemplos, supra.

Composiciones que Comprenden la Substancia La substancia de la presente invención puede ser formulada sola; con un pesticida relacionado con Bacillus, el cual como se definió, supra, es una cepa, espora, proteína o fragmento de Bacillus, u otra substancia del mismo, con actividad contra o el cual aniquila plagas de protege a las plantas contra una plaga; con un pesticida químico y/o un virus entomopatogénico y un vehículo aceptable en una composición(es) pesticida, es decir, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo espolvoreable, un granulo dispersable, un polvo humedecible, un concentrado emulsificable, un aerosol o un granulo impregnado. Ejemplos de dichas cepas de Bacillus incluyen, pero no se limitan a, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (vendida como DIPEL™ de Abbott Laboratories, Inc. , JAVELIN ™ de Sandoz, BIOBIT™ de Novo Nordisk A/S , FORAY™ de Novo Nordisk A/S, BIOCOT™ de Novo Nordisk A/S , MVP ™ de Mycogen, BACTOSPEN E ™ de Novo Nordisk A/S, y TH U RICI DE™ de Sandoz) ; Bacillus thuringiensis subsp . aizawai (vendida como FLORBAC ™ de Novo N ordisk A/S, y XENTA R I ™ de Abbott Laboratories, Inc. ) ; Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (vendida como NOVODOR ™ de Novo Nordisk A/S, TR I DENT™ de Sandoz, M-TRAK™ y M-ON E ™ de Mycogen, y DIPTERRA™ de Abbott Laboratories Inc.); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (vendida tanto como BACTIMOS™ o como SKEETAL™ de Novo Nordisk A/S, TEKNAR ™ de Sandoz, y VECTOBAC™ de Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (vendida como FOIL™ de Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (vendida como CÓN DOR ™ de Ecogen y AGREE™ de Ciba-Geigy); y Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (vendida como CUTLASS ™ de Ecogen). La proteína relacionada con Bacillus puede ser seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a, Cryl , Cryl l , Cryll l , CrylV, CryV, y CryVI . El pesticida químico puede ser, por ejemplo, . un regulador del crecimiento del insecto tal como diflubenzuron, un carbamato tal como tiodicarbo y metomilo, un organofosfato tal como clorpirifos, un piretroide tal como cipermetrin y esfenvalerato, flúor inorgánico tal como criolita, y un pirrol. El virus entomopatogénico puede ser un baculovirus, v.gr. , virus polihedrosis nuclear, Autographa californica (N PV) , Syngrapha falcifera N PV, Cydia pomonella GV (virus de granulosis) , Heliothis zea N PV, Lymantria dispar N PV, Orgyia pseudotsugata NPV, Spodoptera exigua N PV, Neodiprion lecontei N PV, Neodiprion sertifer N PV, Harrisina brillians N PV, y Endopiza viteana Clemens N PV. La substancia de la presente invención también puede ser formulada con otros factores o substancias obtenidas del sobrenadante de un Bacillus incluyendo, pero no limitándose a, una exotoxina y/o el factor mejorador descrito en WO94/09630 (Solicitud de patente de E.U.A. Serie No. 08/146,852, presentada el 3 de noviembre de 1993), y/o la substancia descrita en la solicitud serie no. 08/212,462, presentada el 14 de marzo de 1994, incorporadas aquí por referencia. Opcionalmente, la formulación también puede comprender un pesticida relacionado con Bacillus, un pesticida químico y/o un virus con propiedades pesticidas y un vehículo aceptable. En una modalidad específica, los componentes de dicha composición pueden actuar en una forma sinergística. Dicha composición puede tener mayor eficacia que la que puede ser obtenida con cada uno de los componentes individuales. El sinergismo puede ser manifestado por una eficacia igual o superior con dosis de frecuencia inferior y/o menor que la que se puede requerir para cada componente individual. Alternativamente, la substancia de la presente invención puede actuar para activar un pesticida relacionado con Bacillus, en donde la substancia de la presente invención puede no tener ninguna actividad pesticida por sí misma. En composiciones que comprenden la substancia y un pesticida relacionado con Bacillus, la substancia puede estar presente en la cantidad de por lo menos aproximadamente 0.1 g/BIU o 0.05 g de factor por g de delta-endotoxina y espora de Bacillus, opcionalmente aproximadamente 300 g/BIU o 150 g de substancia por g de delta-endotoxina y espora de Bacillus, preferiblemente 2 g/BIU de substancia por g de delta-endotoxina y espora de Bacillus. Como se define en la presente, "BI U" son unidades internacionales de billón , según se determina mediante bioanálisis. El bioanálisis compara la muestra con un material de referencia normal de Bacillus utilizando Trichoplusia ni u otra plaga, como el insecto de prueba normal. La potencia es determinada dividiendo LCso, normal de referencia , después multiplicando por la potencia normal de referencia. En otra modalidad, la composición puede comprender la substancia de la presente invención en una forma substancialmente pura, o un sobrenadante de Bacillus en forma seca, concentrada o líquida, y un vehículo pesticida adecuado, ejemplos del cual se describen, infra. Esta composición puede ser aplicada en forma separada a una planta, v.gr. , plantas transgénicas. Específicamente, la composición puede ser aplicada a un planta previamente, conteniendo y expresando un gen de Bacillus thuringiensis. En otra modalidad, la composición puede ser aplicada a una planta previamente expuesta a una composición de Bacillus thuringiensis. En otra modalidad , la composición puede ser aplicada a otros ambientes de una plaga(s) de dípteros, v.gr. , agua o suelo. La substancia está presente en la composición a una concentración de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 60% (p/p) . La composición que comprende la substancia y un veh ículo pesticidamente aceptable, además de controlar una plaga, puede también ser utilizada para reducir la resistencia de una plaga a un pesticida. Alternativamente, la composición puede ser utilizada para activar un pesticida relacionado con Bacillus. La composición, en una modalidad, puede ser aplicada al mismo tiempo que el pesticida, en una cantidad de por lo menos aproximadamente 2 g de substancia/BI U hasta opcionalmente alrededor de 300 g de substancia/Bl U . En otra modalidad , la composición puede ser aplicada hasta aproximadamente 24 horas después del pesticida, como un auxiliar para alargar la eficacia del pesticida residual. Dichas composiciones descritas anteriormente, pueden ser obtenidas mediante la adición de un agente tensoactivo, un veh ículo inerte, un conservador, un humectante, un estimulante del apetito, un atrayente, un agente de encapsulación, un aglutinante, un emulsificante, un colorante, un protector contra U.V. , un regulador de pH , un agente de flujo, u otro componente para facilitar el manejo y la aplicación del producto para plagas objetivo, particulares. Los agentes tensoactivos adecuados incluyen compuestos aniónicos tales como carboxilato, por ejemplo, un carboxilato de metal de un ácido graso de cadena larga ; un N-acilsarcocinato ; mono- y di-ésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol graso o sales de dichos esteres; sulfatos de alcohol graso tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sulfato de sodio; sulfatos de alcohol graso etoxilado; alquilfenol sulfatos etoxilados ; lignin sulfonatos; sulfonatos de petróleo; alq uil-ari l sulfonatos, tales como alquil-bencen sulfonatos o alquilo inferio r-naftalen sulfonatos, v.gr. , butil-naftalen sulfonato; sales o condensados de naftaleno-formaldehído sulfonados; sales de condensados de fenol-formaldehído sulfonados; o sulfonatos más complejos tales como amida sulfonatos, v.gr. , el producto de condensación sulfonado de ácido oléico y N-metil taurina o los dialquil sulfosuccinatos , v.gr. , sulfonato o dioctil succinato de sodio . Los agentes noiónicos incluyen productos de condensación de esteres de ácido graso, alcoholes grasos, amidas de ácido graso o fenoles grasos substituidos con alquilo o alquenilo con óxido de etileno , esteres grasos de éteres de alcohol polih ídrico, v. gr. , esteres de ácido graso de sorbitán , productos de condensación de dichos esteres con óxido de etileno, v.gr. , esteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán , copol ímeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como 2 ,4, 7 , 9-tetraetil, 5 , decin-4 , 7-diol , o glicoles acetilénicos, etoxilados. Ejemplos de agentes tensoactivos catiónicos incluyen , por ejemplo, una mono-, di-, o poliamina alifática tal como acetato, naftenato u oleato ; u na amina que contiene oxígeno tal como un óxido de amina de polioxietilen alquilamina; una amina enlazada con amida preparada por la condensación de un ácido carboxílico con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternario . Ejemplos de materiales inertes incluyen minerales inorgánicos tales como kaolín, m ica, yeso, fertilizante, filosilicatos, carbonatos, sulfatos , o fosfatos; materiales orgánicos tales como azúcar, almidones, o ciclodextrinas; o materiales botánicos tales como productos de madera, corcho , mazorcas en polvo , vaina de arroz, y cascaras de nuez.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en una forma adecuada para aplicación directa o como un concentrado, o composición primaria, la cual requiere de dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente, antes de la aplicación. La concentración pesticida variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, específicamente, si es un concentrado o se va a utilizar directamente. La composición contiene de 1 a 98% de un vehículo inerte sólido o líquido, y de 0 a 50% , preferiblemente de 0.1 a 50% de un agente tensoactivo. Estas composiciones serán administradas a la velocidad etiquetada para el producto comercial, preferiblemente de alrededor de 0.01 1208 kg a 5.604 kg por hectárea cuando está en forma seca, y de aproximadamente 0.00473166 litros a 1 1 .82915 litros por hectárea, cuando está en forma líquida. En una modalidad adicional , la delta-endotoxina de cristal de Bacillus thuringiensis y/o la substancia de la presente invención , puede ser tratada antes de la formulación para prolongar la actividad pesticida, cuando se aplica al ambiente de una plaga objetivo , siempre que el pretratamiento no sea dañino a la delta-endotoxina de cristal o la substancia. Dicho tratamiento puede ser mediante medios químicos y/o físicos, siempre que el tratamiento no afecte en forma peligrosa las propiedades de la composición(es) . Ejemplos d e reactivos químicos incluyen , pero no se limitan a, agentes d e halogenación; aldehidos tales como formaldehído y g lutaraldehíd o ; agentes contra la infección, tales como cloruro de zefiran ; alcoholes , tales como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos , tales com o fijador de Bouin y fijador de Helly (véase, por ejemplo, Humason , Animal Tissue Techniques, W. H . Freeman and Co. , 1967). Las composiciones de la invención pueden ser aplicadas directamente a la planta, por ejemplo, mediante aspersión o espolvoreo en el momento en el que la plaga empieza a aparecer sobre la planta o antes de la aparición de las plagas, como una medida de protección . Las plantas que van a ser protegidas, dentro del alcance de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, cereales (trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo y granos relacionados) , remolachas (remolacha de azúcar y remolacha de forraje), drupas, pomos y fruta blanda (manzanas, peras, ciruelas, duraznos, almendras, cerezas, frambuesas, fresas, y zarzamoras) , plantas leguminosas (alfalfa, frijoles, lentejas, chícharos, soya) , plantas oleosas (nabo, amapola, oliva, girasoles, cocos, plantas de aceite de ricino, grano de cacao, cacahuates) , plantas de cohombro (pepino, tuétano, melones) , plantas de fibra (algodón , lino, cáñamo , yute), frutas cítricas (naranjas, limones, toronjas, mandarinas) , vegetales (espinaca, lechuga , espárrago, coles y otras, zanahorias, cebollas, jitomates, papas) , lauráceas (aguacates, canela, alcanfor) , árboles deciduos y coniferas (árboles de tila, árboles de tejo, robles , alisos, álamos, abedul, abetos, alerce, pinos) , o plantas tales como maíz, plantas de turba , tabaco, nueces , café, caña de azúcar, té , vid, lúpulos, plátanos y plantas de hule natural, así como ornamentales. La composición puede ser aplicada mediante aplicación foliar, de surco, granulo sembrado al voleo , "tendida" o suelo remojado. Es generalmente importante obtener un buen control de plagas en las primeras etapas del crecimiento de las plantas, ya que en este momento es cuando la planta puede ser severamente afectada. La aspersión o el espolvoreo puede contener convenientemente otro pesticida, si se cree que este es necesario. En una modalidad preferida, la composición de la invención se aplica directamente a la planta. Las composiciones de la presente invención también pueden ser aplicadas directamente a estanques, lagos, corrientes, ríos, agua tranquila, y otras áreas sometidas a la infestación por plagas de dípteros, especialmente, plagas que conciernen a la salud pública. La composición puede ser aplicada mediante aspersión , espolvoreo, sacudida, o similares. Las composiciones de la presente invención pueden ser efectivas contra plagas de insectos del orden Díptera, v.gr. , Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomya macellaria, Culex so., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucila cuprina, Lucina sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp. , Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa. Sin embargo, las composiciones de la invención también pueden ser efectivas contra plagas de insectos del orden de Lepidoptera, v.gr. , Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ípsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelosis transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp. , Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp. , Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydua latiferranus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene aerea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhea, Euxoa messoria, Gallería mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphant a cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thysisalis, Malocosoma sp. , Mamestra brassicae, Mamestra configúrate, Manduca quinquemaculata, Maduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypíella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancadella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pntia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp. , Thaurnstopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Coleptera , v.gr. , Leptinotarsa sp. , Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp. , Cyclocephata borealis, Cyclophala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japónica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzaburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tríbolium confusum, Tribolius destructor; Acari , v. gr. , Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetraychus urticae; Hymenoptera, v. gr. , Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isoptera, v.gr. , Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; Siphonapter, v.gr. , Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinecea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrnas; y Tylenchida, v. gr. , Melodidogyne incógnita, Pratylenchus penetrans. En una modalidad específica, las composiciones de la invención son activas contra plagas de insectos del género Drosophila (v. gr. , Drosophila melanogaster) o del género Musca (v.gr. , Musca domestica) del orden Díptera. Los siguientes ejemplos se presentan a manera de ilustración , y no de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : CULTIVO DE AISLADOS DE BACILLUS THURINGIENSIS Subcultivos de aislados de Bacillus thuringiensis, EMCC-01 10 , EMCC-01 1 1 , EMCC-01 12, y EMCC-01 1 3, mantenidos sobre cultivos inclinados de agar de Caldo Nutriente , se utilizaron para inocular matraces de 250 ml, de agitación desviados, conteniendo 50 ml del medio con la siguiente composición: Licor de Maíz remojado 1 5 g/L Maltrin-100 40 g/L Almidón de papa 30 g/L KH2PO4 1 .77 g/L K2HPO 4.53 g/L El pH del medio se ajustó a 7.0 con 10 N de Na OH . Después de ia inoculación, los matraces de agitación se incubaron a 30°C sobre un agitador giratorio a 250 rpm durante 72 horas, hasta que se observó, la esporulación y lisis de la célula, microscópicamente dejando los cristales y las esporas. Los cristales y las esporas se cosecharon a partir del caldo de cultivo entero mediante centrifugación a 15,000 rpm (rotor Sorvall GSA). El sobrenadante resultante se recuperó también y se filtró a través de una membrana de 0.2µ antes de utilizarse. El caldo de cultivo entero , obtenido en la fermentación anterior, así como el sobrenadante y los cristales más las esporas, se utilizaron para caracterizar la substancia responsable de la actividad insecticida .

EJEMPLO 2: CARACTERÍSTICAS DE LOS AISLADOS DE BA CILLUS THURINGIENSIS Los aislados, EMCC-01 10, EMCC-011 1 , EMCC-01 12, y EMCC-01 13, de Bacillus thuringiensis activo a los d ípteros, tienen las siguientes características : Aislado de EMCC-01 10: Morfología de colonia: Colonia grande, superficie opaca, Bacillus thuringiensis típico. Morfología de célula vegetativa: Bacillus thuringiensis típico. Inclusiones: Inclusiones bipiramidales brillantes de fase.

Aislado de EMCC-01 11 : Morfología de colonia: Colonia grande, superficie opaca, Bacillus thuringiensis típico. Morfología de célula vegetativa: Bacillus thuringiensis típico, Inclusiones: Inclusiones biparamidales de tamaño medio brillantes de fase.

Aislado de EMCC-01 12: Morfología de colonia: Colonia grande, superficie opaca, Bacillus thuringiensis típico. Morfología de célula típica: Bacillus thuringiensis típico. Inclusiones: Inclusiones bipiramidales brillantes de fase, pero los bordes no son tan agudos como aquellos de las inclusiones bipiramidales dei aislado EMCC-01 1 1 .

Aislado EMCC-01 13: Morfología de colonia: Colonia grande, su perficie opaca, Bacillus thuringiensis típico. Morfolog ía de célula vegetativa: Bacillus thuringiensis típico. I nclusiones: I nclusiones esféricas y con forma de lágrima, brillosas de fase. EJEMPLO 3: ANÁLISIS DE SDS-PAGE DE INCLUSIONES DE CRISTAL DE AISLADOS DE BACILLUS THURINGIENSIS Las proteínas que comprenden las inclusiones de cristal producido por los aislados de Bacillus thuringiensis, EMCC-0110, EMCC-0111, EMCC-0112, y EMCC-0113 son determinadas mediante electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) de dodecil sulfato de sodio (SDS). Antes del análisis de SDS-PAGE de las proteínas de cristal, los cristales se separaron de las esporas mediante extracción bifásica con dextran sulfato de sodio y glicol polietilénico. Los subcultivos de los aislados de Bacillus thuringiensis, EMCC-0110, EMCC-0111. EMCC-0112, y EMCC-0113, mantenidos sobre cultivos inclinados de agar de Caldo de Nutriente, se utilizaron para inocular matraces de agitación de 250 ml, desviados, conteniendo 50 ml del medio con la siguiente composición: D-glucosa 2.0 g/L Citrato de sodio 2.0 g/L CaCI2 0.1 g/L MnCI2«4H2O 0.016 g/L MnCI2«6H2O 0.43 g/L ZnCI2 0.007 g/L FeCI3 0.003 g/L Casaminoácidos 5.0 g/L KH2PO4 0.86 g/L K2H PO4 0.55 g/L Después de la inoculación , los matraces de agitación se incubaron a 30°C, sobre un agitador giratorio, a 250 rpm durante 72 horas hasta que la esporulación y la lisis de célula se observaron microscópicamente, liberando los cristales y las esporas . Una muestra de 1 .5 ml de cada caldo de cultivo entero se transfirió a un tubo de centrífuga Eppendorf, y se centrifugó para cosechar los cristales y las esporas . La pella de cristales/esporas se lavó con 1 .0 ml de 1 .0M de cloruro de sodio, seguido por 1 .0 ml de agua desionizada . Los cristales y las esferas, como pella, se resuspendieron en una solución de dextran de sodio (fase inferior) . La solución de dextran de sodio comprendió 1 1 5 µl de agua desionizada, 120 µl de 20% de glicol polietilénico 8000 (Du Pont) , 1 70 µl de 20% de dextran sulfato de sodio, y 50 µl de 0.3M de cloruro de sodio . Después , se añadieron 500 µl de una solución de glicol polietilénico (fase su perior) a la mezcla de cristales/esporas , suspendida en la solución de fase inferior. La solución de glicol polietilénico comprendió 30 mg de dextran sulfato de sodio , 7.0 g de glicol polietilénico 8000 , y 1 .75 g de cloruro de sodio en 100 ml de agua desionizada. Las fases superior e inferior, se mezclaron vigorosamente y se dejaron reposar durante 20 minutos a temperatu ra ambiente hasta que las dos fases se separaron . La fase superior, la cual contiene grandes cantidades de esporas , se removió con una pipeta . La fase inferior co ntie ne cristales y esporas residuales . Se añadió una fase superi o r adicional, como antes, y se repitió el procedimiento hasta que la fase superior no contuvo esencialmente nada de esporas microscópicamente detectables. La fase inferior final después se diluyó con 1.0 ml de agua desionizada y se centrifugó a la pella de cristales. La pella de cristales se lavó con 1.0 ml de 1.0M de cloruro de sodio, seguido por 1.0 ml de agua desionizada. Las pellas de cristales se resuspendieron finalmente en 500 µl de agua desionizada. Una muestra de 50 µl de la suspensión de cristales anterior, se transfirió a un tubo de centrífuga Eppendorf, y se centrifugó para formar una pella de cristales. El sobrenadante se removió y se desechó. Los cristales, como pella, se solubilizaron mediante la adición de 10 µl de agua desionizada, seguido por 10 µl de un regulador de pH de solubilización y calentando la solución de cristales durante 10 minutos a 100°C. La solución de solubilización comprendió 10mM de Tris-10mM de EDTA-0.15 M de ditiotretol-2.5% p/v SDS a un pH de 8.0. Las proteínas de cristal solubilizadas se analizaron mediante SDS-PAGE. Después de SDS-PAGE, las proteínas se visualizaron con un colorante azul de Coomassie. Las inclusiones producidas por el aislado de Bacillus thuringiensis activo a dípteros, EMCC-0110, tienen una proteína con un peso molecular de 120 kilodaltons. Las inclusiones producidas por el aislado de Bacillus thuringiensis activo a dípteros, EMCC-0111, tienen proteínas con pesos moleculares de 92 y 40 kilodaltons. Las inclusiones producidas por el aislado de Bacillus thuringiensis activo a dípteros, EMCC-01 12 , tienen proteínas con pesos moleculares de 92 y 40 kilodaltons. Las inclusiones producidas por el aislado de Bacillus thuringiensis activo a dípteros, EMCC-01 13, tienen proteínas con pesos moleculares de 56 y 48 kilodaltons.

EJEMPLO 4: ACTIVIDAD CONTRA DÍPTEROS EN CALDOS DE CULTIVO ENTEROS DE VARIOS AISLADOS DE BACILLUS THURINGIENSIS Los caldos de cultivo enteros de los aislados de Bacillus thuringiensis, EMCC-01 10, EMCC-01 1 1 , EMCC-01 12, y EMCC-01 13, como se describió en el Ejemplo 1 , se probaron contra Drosophila melanogaster adulto para la actividad insecticida utilizando un bioanálisis de incorporación de dieta. Específicamente, la dieta de insecto artificial tibia se mezcló con el caldo de cultivo entero , diluido, a una concentración final de 20% , y después 2.0 ml de la mezcla se colocaron en tubos de 13 x 100 mm y se dejaron secar. También se realizó un control sin la prueba de muestra, así como AVI D™ (Merck) como un control positivo. Después , de 8-10 de Drosophila melanogaster adulto, de una semana de edad, se colocaron en cada tubo. Los tubos se taparon con algodón y se incubaron a 28-30°C. Después de 7- 10 días, los tubos se clasificaron para mortalidad e impedimento de crecimiento. La clasificación del impedimento de crecimiento es el tamaño de los adultos el mismo día, cuando se comparan con adultos vivos, de control. Los valores del impedimento de crecimiento de 3, 2, 1 y 0 representan el tamaño de los adultos como un 75%, 50%, 25% de los adultos vivos, de control, con una clasificación de 4. U n valor de 0 representa un 100% de mortalidad. Los resultados de los bioanálisis de Drosophila melanogaster adulto, para los caldos de cultivo enteros, se muestran el Cuadro 1 , infra. Los resultados indican que todos los caldos de cultivo enteros tienen actividad insecticida contra Drosophila melanogaster adulto.

CUADRO 1 : Actividad de Drosoohila melanoaaster Adulto en Caldos de Cultivo Enteros Cepa Valor del impedimento de Crecimiento Control 4.0 EMCC-01 10 0.5 EMCC-01 1 1 0.5 EMCC-01 12 0.5 EMCC-01 13 0.5 EJEMPLO 5: LOCALIZACION DE LA ACTIVIDAD DE DÍPTEROS EN CALDOS DE CULTIVO ENTEROS DE AISLADO DE ACILLUS THURINGIENSIS La localización de la actividad de dípteros, es decir, la delta-endotoxina de cristal y las esporas o el sobrenadante, se determinó mediante bioanálisis. Una muestra de 10 ml de cada uno de los caldos de cultivos enteros de los aislados de Bacillus thuringiensis, EMCC-01 10, EMCC-01 1 1 , EMCC-01 12, y EMCC-01 13, como se describió en el Ejemplo 1 , se centrifugó a 15, 000 rpm (rotor Sorvall SS34) durante 15 minutos para separar el sobrenadante de la delta-endotoxina de cristal, en pella, y las esporas. El sobrenadante se recuperó. Las mezclas de cristal/espora se lavaron con agua destilada y se recuperaron mediante centrifugación, como antes. Se siguió el mismo procedimiento de bioanálisis para Drosophila melanogaster adulto, como se describió en el EJEMPLO 4. Las mezclas de delta-endotoxina de cristal/espora de los aislados de Bacillus thuringiensis, EMCC-01 10, EMCC-01 1 1 , EMCC-01 12 y EMCC-01 13, no mostraron ninguna actividad contra Drosophila melanogaster adulto. Los resultados de estos bioanálisis, para los sobrenadantes, se muestran en el Cuadro 2 , infra . Todos los sobrenadantes contuvieron actividad insecticida contra Drosophila melanogaster adulto.

CUADRO 2: Actividad de Drosoohila melanoaaster Adulto en Sobrenadantes Cepa Valor del impedimento de Crecimiento Control 4.0 EMCC-01 10 0.5 EMCC-01 1 1 0.5 EMCC-01 12 0.5 EMCC-01 13 0.5 EJEMPLO 6: PURIFICACIÓN DE LA SUBSTANCIA ACTIVA CONTRA DÍPTEROS Se fermentó la cepa de Bacillus thuringiensis, EMCC-01 10, y el sobrenadante se recuperó, como se describió en el EJEMPLO 1. La purificación de la substancia activa contra dípteros, del sobrenadante, se obtuvo utilizando un procedimiento de purificación de tres pasos. Durante la purificación, la actividad se verificó mediante un bioanálisis de Drosophila melanogaster adulto, y se determinó la pureza mediante electroforesis capilar, como se describió en el EJ EMPLO 8. Todos los pasos cromatográficos se verificaron a 278 nm . Específicamente , el bioanálisis contra Drosophila melanogaster adulto se condujo como sigue. Se colocaron 2 ml de dieta de insecto artificial caliente en tubos de 13 x 100 mm y se dejaron secar. Se colocaron 100 µl de la muestra de prueba sobre la parte superior de la dieta. En un horno de microondas se calentaron 1.3X de dieta artificial de insecto, concentrada, hasta hacerse líquido, y 200 µl se colocaron sobre la parte superior de la muestra. El tubo se mezcló rápidamente, dejando que la mezcla se combinara con 1.3X de dieta artificial de insecto, concentrada, caliente. Después de que la mezcla de dieta/muestra, sobre la parte superior, se secó, entonces se colocaron 10-20 Drosophila melanogaster adultos en cada tubo. Los tubos se taparon con algodón y se incubaron a 28-30°C. Después de 5 días, los tubos se clasificaron para el porcentaje de mortalidad. En el paso 1, se removieron células, desperdicio celular, y otros insolubles, del caldo de cultivo entero de la cepa de Bacillus thuringiensis, EMCC-0110, como se describió en el EJEMPLO 1, seguido por filtración del sobrenadante resultante a través de un filtro de 0.2 µ. Un litro del sobrenadante filtrado a través de 0.2 µ, se cargó a 10 ml por minuto sobre una columna de octadilo C18 ligado, Baker, (2.5 x 3.5 cm), la cual fue precondicionada con 100% de acetonitrilo y después pre-equilibrada con 5% de acetonitrilo en agua desionizada. Después de la carga, la columna se lavó a 10 ml por minuto, con 250 ml de agua desionizada. El paso se recogió (aproximadamente 1250 ml) y se bioanalizó para actividad. En el paso 2, el paso de la etapa 1 se diluyó a 2000 ml con /fragua desionizada. Se añadieron 1.21 g de base Trizman® (Sigma Chemical Co.) a una concentración final de 5 mM. La solución se ajustó después a un pH de 8.0. Una muestra de 1000 ml de la solución se cargó a 8.0 ml por minuto sobre una columna de flujo rápido Pharmacia Q-Sepharose (2.5 cm x 30 c ) , la cual se pre- equilibró con 20 mM de Tris pH 8.0. La columna se lavó después a 8.0 ml por minuto con 20 mM de Tris-HCl pH de 8.0 para 1 -2 volúmenes de columna, y después se eluyó con 1 .5 litros de gradiente continuo a partir de 20 mM de Tris-HCl pH de 8.0 a 20 mM de Tris-HCI-0.5 M de cloruro de sodio pH de 8.0. Se recogieron fracciones de 16.0 ml, se bioanalizaron, y se examinaron para pureza. Las fracciones activas se encharcaron (aproximadamente 200 ml) , se liof ilizaron a sequedad, y se redisolvieron en agua desionizada a 1 /20 a 1/50 del volumen original. 15 En el paso 3, una muestra de 5.0 ml del charco 20X concentrado, del paso 2, se cargó a 1 .4 ml por minuto sobre una columna Pharmacia Sephadex G-25 (1 .6 cm x 80 cm) , la cual se pre- equilibró con agua desionizada. La columna se eluyó a 1 .4 ml por minuto con agua desionizada. Se recogieron las fracciones de 3.0 ml, se bioanalizaron , y se examinaron para pureza. Las fracciones activas se encharcaron (aproximadamente 30 ml) y se secaron mediante liofilización . La electroforesis capilar mostró que la substancia de la presente invención es purificada a una pureza de aproximadamente 98% , mediante el procedimiento de purificación de tres pasos .

La substancia purificada es soluble en agua, es estable a un pH de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 12 en agua durante 10 días, es estable en agua a aproximadamente 72°C durante por lo menos aproximadamente 60 minutos, tiene un peso molecular menor que 1000, y tiene UV máxima a 230 y 262 nm (pH 7.0). La ß-exotoxina tipo I tiene UV máxima a 227 y 259 nm (pH 7.0), mientras que la ß-exotoxina tipo I I tiene UV máxima a 230 y 262 nm (pH 7.0).

EJEMPLO 7: DATOS ESTRUCTURALES DE LA SUBSTANCIA ACTIVA CONTRA DÍPTEROS Los datos estructurales sobre la substancia de la presente invención, se obtuvieron de la información espectroscópica recopilada sobre el compuesto purificado del EJEMPLO 6. Los datos de la masa espectral sobre el compuesto, muestran un peso molecular de 758 con un ion de fragmento de 679. La ß-exotoxina tipo I tiene un peso molecular de 701 . Los datos de la masa espectral sobre la ß-exotoxina tipo I I revelan que el ion de fragmento más grande tiene una masa de 481. Los datos de RM N recopilados sobre el compuesto indicaron que es un nucleósido de uracilo con tres porciones de azúcar y dos fosfatos con desplazamientos químicos de 1 H-RMN a 7.62 (1 H ,d) , .83 (1 H , d) , y 5.78 (1 H , d) , (véase Figura 1 , Cuadros 3 y 4) . El compuesto difiere significativamente de la ß-exotoxina tipo I (véase Figura 2) y de la ß-exotoxina tipo II. La ß-exotoxina tipo I es un nucleósido de adenina, mientras que la ß-exotoxina tipo II es un nucleósido de pseudoureido, solamente son un protón sobre la base de nucleósido (Levinson, en Hickie and Finch (eds.), Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington , D.C., 1990, pp. 114-136).

CUADRO 3: Datos Estructurales sobre la Substancia Activa Contra Dípteros Desplazamientos Químicos de Protón (ppm) Substancia ß-exotoxina tipo ß-exotoxina tipo II Base de 7.62 (1H,d) 8.34 (1H,s) 7.95 (1H,d) Nucleósido 5.78 (1H,d) 8.14 (1H,s) Protón de 5.83 (1H,d) 5.90 (1H,d) Ribosa 4' s = banda individual d = banda doble *r CUADRO 4: Datos de 1H v 13c de la Substancia Activa Contra Dípteros Posición 1H RMN (ppm) 13C RMN (ppm) 1 166.5 2 5.78 (d,J=8.2 Hz) 102.9 3 7.63 (d,J=8.2 Hz) 142.1 4 10 5 152.3 6 1 ' 5.83 (d,J = 5.4) 88.8 2'-5' 3.7-4.4 (picos múltiples) 70-78 1 " 4.8 (d,J=3.76) 96.8 15 2"-6" 3.2-3.7 (picos múltiples) 50-65 6 otro hidroxilo conteniendo carbonos entre 3.3-3.6, correspondiendo a señales de carbono entre 60-70 ppm.

EJEMPLO 8: CUANTITACION DE LA SUBSTANCIA CON ACTIVIDAD CONTRA DÍPTEROS Se fermentó la cepa Bacillus thuringiensis, EMCC-01 10, como se describió en el EJ EMPLO 1 . La cuantitación de la cantidad de l a substancia de la presente invención en el caldo de fermentación se determinó mediante electroforesis capilar. Específicamente, un Sistema de Electroforesis Capilar Biorad Biofocus 3000, equipado con un capilar no revestido de 50 µm x 36 cm, 0.1 M de Tris-Borato-0.0002 M de EDTA, pH 8.3, voltaje a 20 KV, polaridad positiva a negativa, y detección de UV a 260 nm. El tiempo del análisis fue de 10 minutos para la substancia de la presente invención, eluyendo a 5.2 minutos. El sobrenadante, de la fermentación descrita en el EJEMPLO 1 , se recuperó mediante centrifugación, se filtró a través de un filtro de 2 µ, y se analizó mediante electroforesis capilar, como se describió anteriormente. Los resultados indicaron que la substancia de la presente invención está presente a un nivel de aproximadamente 0.2 g por litro de caldo.

EJEMPLO 9: ACTIVIDAD CONTRA LA LARVA DE MUSCA DOMESTICA Se hizo crecer en el medio, como se describió en el EJ EMPLO 1 , la cepa de Bacillus thuringiensis, EMCC-01 10. El sobrenadante , conteniendo la substancia de la presente invención, se recuperó del caldo de cultivo entero, como se describió en el EJ EMPLO 1 . Se prepararon muestras para el bioanálisis , como sigue: (1 ) sobrenadante no diluido, (2) 5 ml de agua más 10 ml de ( 1 ) , (3) 5 ml de agua más 10 ml de (2), (4) 5 ml de agua más 10 ml de (3), (5) 5 ml de agua más 10 ml de (4) , (6) 5 ml de agua más 10 ml de (5) , y (7) 5 ml de agua más 10 ml de (6) . Se criaron larvas de Musca domestica (mosca doméstica) a partir de huevos en un medio normal de larvas de mosca CSMA (Purina Mills #5060) durante 3 días a 30°C. Se cargaron 19 g del medio de CSMA, recientemente preparado, a tazas de espécimen de 1 13.4 g. Se añadió 1 ml de cada muestra de prueba al medio, y se agitó concienzudamente con una espátula de metal. Las tazas se taparon y se dejaron asentar durante 2 horas. A cada taza se transfirieron 25 larvas de Musca domestica. Cada taza se cubrió con una gas de nylon de 32 mallas y se mantuvo en su lugar con una banda de hule. Para cada dilución se ensamblaron tres réplicas y una de control (agua estéril). Cada análisis se incubó durante 14 días a 28°C. Después de 14 días, se contó el número de Musca domestica adultas, en cada taza. Se determinó el porcentaje de mortalidad de control, como el número de Musca domestica adultas dividido entre el número de larvas colocadas en la taza (%CM) . Los resultados se presentan en el Cuadro 4, infra, e indican que el sobrenadante es insecticida contra la larva de la Musca domestica.

CUADRO 4: Actividad Contra la Larva de Musca domestica Conc. de Muestra (ug/g) # Adultos %CM 50,000 7/75 86.9 33,333 26/75 50.0 22 ,222 31 /75 40.4 14,815 31 /75 40.4 9, 877 37/75 28.8 6, 584 56/75 0 4,390 51 /75 1 .9 Control 52/75 _ EJEMPLO 10: POTENCIACIÓN DE LA ACTIVIDAD INSECTICIDA DE BACILLUS THURINGIENSIS subsp. KURSTAKI Como se describió en el EJEMPLO 1 , se hizo crecer en el medio la cepa de Bacillus thuringiensis, EMCC-001 10. La substancia activa contra dípteros, purificada, de la presente invención, se obtuvo como se describió en el EJ EM PLO 6. La potenciación de la actividad pesticida de una delta-endotoxina de cristal, BIOBIT™ FC, mediante la substancia activa a dípteros, se determinó mediante el bioanálisis de incorporación de dieta artificial , utilizando larvas Spodoptera exigua de segunda crisálida. La dieta artificial , normal , comprendió agua, agar, azúcar, caseína, germen de trigo, metil paraben , ácido sórbico, aceite de linaza, celulosa, sales, y vitaminas , y se preparó en un recipiente de 20 litros. Se dispensaron alicuotas de 1 .0 ml con una pipeta a una charola de plástico con 240 cavidades individuales y se dejó solidificar. Se hizo una solución de abastecimiento de 1 mg/ml (20 ml) BIOBIT™ FC (Novo Nordisk A/S) a una potencia de 8 Bl U/mg , en una solución diluida de agar compuesta de 1 .7 g de agar (Difco) por litro de agua desionizada. Después, la solución de abastecimiento de 1 mg/ml se diluyó con la solución de agar para hacer diluciones de 0.25, y 0. 12 , y 0.06 mg/ml (40 ml cada una) . También se preparó un control de una solución de agar sin BIO BIT ™ FC . Se dispensó una alícuota de 3.0 ml de cada una de las cuatro dosis , con una pipeta de Hamilton a las cavidades individuales, a un régimen de 10 cavidades por dosis. Se preparó una solución de 0.4 mg/ml de la substancia de la presente invención , disolviendo 4 mg de la substancia de la presente invención en 1 0 mi de agua desionizada . Se dispensó una alícuota de 50 µl de la substancia de la presente invención , hacia cada cavidad con u na pipeta, se ag itó para mezclar con la solución de BIOBIT ™ FC , y después se dejó secar durante la noche . A cada cavidad se le añadió una larva de Spodoptera exigua de segunda crisálida, y después las charolas se cubrieron con una lámina perforada de mylar transparente. Las charolas se incubaron durante 4 días a 28°C y a una humedad relativa de 65% . Después de cuatro días, se registró el número de larvas vivas por 10 cavidades.

Los resultados, como se muestran en el Cuadro 5, infra, demuestran que la substancia activa contra dípteros de la presente invención acciona la actividad insecticida de la delta-endotoxina de cristal, BIOBIT™ FC.

CUADRO 5: Potenciación de BIOBIT™ FC Dosis de BIOBIT™FC (mo/ml) Control Número de Larvas Vivas en la Subst. 0 1 0 1 0 0.06 1 0 4 0. 12 10 3 0.25 10 4 DEPOSITO DE MICROORGANISMOS Las siguientes cepas de Bacillus thuringiensis han sido depositadas de acuerdo al Tratado de Budapest en la Recolección de Cultivo de Patentes del Servicio de Investigación Agrícola /- (Agricultural Research Service Patent Culture Collection), Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 University Street, Peoría, Illinois 61604, USA.

Cepa Número de Acceso Fecha de Depósito EMCC-01 10 N RRL B-21269 27 Mayo, 1994 EMCC-01 1 1 NRRL B-21270 27 Mayo, 1994 EMCC-0112 NRRL B-21271 27 Mayo, 1994 EMCC-01 13 N RRL B-21272 27 Mayo, 1994 10 Las cepas fueron depositadas bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la suspensión de esta solicitud de patente, determinada por el Director de Patentes y Marcas, intitulado a lo mismo, bajo 37 C. F. R. § 1 .14 y 35 U .S.C. §122. El depósito representa un cultivo substancialmente puro de cada cepa depositada. El depósito está disponible como se requiera por las leyes de patentes extranjeras, en donde las contrapartes de la solicitud principal, o su progenie sean presentadas. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar el tema de la invención en derogación de derechos de patente otorgados por acción gubernamental. La invención descrita y reclamada aquí, no está limitada en el alcance por las modalidades específicas descritas aquí, ya que estas modalidades pretenden ilustrar los varios aspectos de la invención .

Cualesquiera modalidades equivalentes pretenden estar dentro del _ *• alcance de esta invención. En realidad, varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Dichas modificaciones también se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Las varias descripciones citadas en la presente, se incorporan aquí por referencia en su totalidad .

(TCP Regla 13 bis) A. La indicación hecha a continuación se refiere al microorganismo referido en la descripción en la página 23 , línea 30_ IDENTIFICACIÓN DE Se identifican otros depósitos en la hoja adicional [X] fk. jbre de la institución del depósito Agricuttural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) Dirección de la institución del despósito (incluyendo código postal y país) Northern Regional Research Center 1815 University Street Peoría, IL 61604, EUA. Fecha de depósito Número de Acceso 27 de Mayo de 1994 NRRL B-21269 C. INDICACIONES ADICIONALES (dejar en blanco si no es aplicable) Esta información continua en una hoja adicional [ ] Con respecto a aquellas designaciones, en donde se busca una patente Europea y/o Australiana durante la vigencia de la solicitud de patente, una muestra del microorganismo depositado sólo se J, ' «orovee a un experto independiente nominado por la persona que solicita la muestra (Regla 28(4) EPC/Reglamento 3.25 de la Regla Estatutaria de Australia de 1991 No. 71). D. ESTADOS DESIGNADOS A LOS CUALES SE HACEN LAS INDICACIONES (si las indicaciones no son para todos los Estados designados) E. TERMINACIÓN POR SEPARADO DE LAS INDICACIONES (dejar en blan8 si no es aplicable) La indicación listada a continuación será sometida al Despacho Internacional (especificar la naturaleza genral de las indicaciones, v.gr., "Número de Acceso del Depósito") Para uso exclusivo de la Oficina de Recepción Para uso exclusivo del Despacho Internacional [ X ] Esta hoja ha sido recibida con la solicitud [ ] Esta hoja ha sido recibida en el Despacho internacional Internacional el: Funcionario autorizado Funcionario autorizado FIRMADO (703)305-3682 Sig.rie Hostad International División RO US Forma TCP/R0/134 (Julio 1992) (TCP Regla 13 bis) Para uso exclusivo de la Oficina de Recepción Para uso exclusivo del Despacho Internacional [ X ] Esta hoja ha sido recibida con la solicitud [ ] Esta hoja ha sido recibida en el Despacho internacional Internacional el: Funcionario autorizado Funcionario autorizado FIRMADO (703)30&36ß2 Sigfried Hostad International División RO/US Forma TCP RO/134 (Julio 1992) INDICACIONES RELACIONADAS CON UN MICROORGANISMO DEPOSITADO (TCP Regla 13 bis) Para uso exclusivo de la Oficina de Recepción Para uso exclusivo del Despacho Internacional [ X ] Esta hoja ha sido recibida con la solicitud [ ] Esta hoja ha sido recibida en el Despacho internacional Internacional el: Funcionario autorizado Funcionario autorizado FIRMADO (703)30S 36ß2 Sigfried Hostad International División RO US Forma TCP/RO/134 (Julio 19T2) INDICACIONES RELACIONADAS CON UN MICROORGANISMO DEPOSITADO (TCP Regla 13 bis) Para uso exclusivo de la Oficina de Recepción Para uso exclusivo del Despacho Internacional [ X ] Esta hoja ha sido recibida con la solicitud [ ] Esta hoja ha sido recibida en el Despacho internacional Internacional el: Funcionario autorizado Funcionario autorizado FIRMADO (703)3a&3682 Stgfried Hostad International División RO/US Forma TCP RO/134 (Julio 1992)

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1 .- Una substancia caracterizada porque tiene las siguientes propiedades: (a) una actividad pesticida contra plagas de insectos del orden Díptera; (b) actúa junto con un pesticida relacionado con Bacillus; y (c) es un nucleósido de uracilo con tres porciones de azúcar y dos fosfatos y desplazamiento químicos de 1 H-RMN a aproximadamente 7.62 (1 H,d), 5.83 (1 H ,d), y 5.78 (1 H ,d).

2.- La substancia de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde dicha substancia tiene un peso molecular menor que 1000.

3.- La substancia de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde dicha substancia se obtiene de un sobrenadante de una fermentación de Bacillus, en la cual esencialmente toda la actividad pesticida de dicha cepa está en el sobrenadante de dicha fermentación.

4.- La substancia de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha substancia se obtiene de un sobrenadante de una fermentación de Bacillus thuringiensisK.

5.- La substancia de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha substancia se obtiene de un cultivo biológicamente puro de una cepa de Bacillus thuringiensis, seleccionada del grupo que consiste de EMCC-01 10, EMCC-01 1 1 , EMCC-01 12 , y EMCC-01 13, y sus mutantes y variantes, los cuales son capaces de producir la substancia.

6. - U n cultivo biológicamente p u ro de una ce pa de Bacillus, la cual produce la substancia de acuerdo con la reivindicación 1.

7.- El cultivo biológicamente puro de una cepa de Bacillus thuringiensis de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la cepa se selecciona del grupo que consiste de EMCC-01 10, EMCC-01 1 1 , EMCC-01 12, y EMCC-01 13, y sus mutantes y variantes, los cuales son capaces de producir la substancia.

8.- Un mutante o variante de una cepa de Bacillus, que produce la substancia de acuerdo con la reivindicación 1 , en una cantidad mayor que la cantidad producida por la cepa paternal correspondiente.

9.- Un método para obtener un mutante o variación de una cepa de Bacillus de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende (a) tratar la cepa de Bacillus con un mutagen; (b) cultivar la cepa de Bacillus tratada del paso (a) en un medio adecuado para la selección del mutante o variante; y (c) seleccionar el mutante o variante del paso (b) para la producción incrementada de la substancia.

10.- Una composición pesticida , que comprende la substancia de acuerdo con la reivindicación 1 , y un vehículo pesticidamente adecuado en la cantidad de por lo menos 2 g/Bl U . 1 1 .- Una composición pesticida que comprende (a) la substancia de la reivindicación 1 , y (b) un pesticida relacionado con Bacillus, en donde la substancia está presente en dicha composición en la cantidad de por lo menos aproximadamente 0.05 g/g de delta-endotoxina de Bacillus y esporas. 12.- Un método para controlar una plaga, que comprende exponer dicha plaga a una cantidad efectiva, controladora de plagas, del pesticida de la composición de la reivindicación 10. 13.- Un método para controlar una plaga, que comprende exponer la plaga a una cantidad efectiva controladora de plagas, de la composición pesticida de la reivindicación 1 1 . 14.- Un método para potenciar la actividad pesticida de un pesticida relacionado con Bacillus, que comprende exponer la plaga a una cantidad de la composición pesticida de la reivindicación 10, en una cantidad suficiente para accionar la actividad pesticida de dicho pesticida relacionado con Bacillus. 15.- Un método para potenciar la actividad pesticida de un pesticida relacionado con Bacillus, que comprende exponer la plaga a una cantidad de la composición pesticida de la reivindicación 1 1 , en una cantidad suficiente para accionar la actividad pesticida de dicho pesticida relacionado con Bacillus. 16.- Un método para producir una substancia substancialmente pura de la reivindicación 1 , que comprende (a) cultivar una cepa de Bacillus sobre un medio de crecimiento adecuado para producir un sobrenadante; (b) recuperar el sobrenadante de (a); y (c) aislar la substancia del sobrenadante de (b) .