PL184858B1 - Szczep Bacillus thuringiensis i kompozycja pestycydowa - Google Patents

Abstract

1. Szczep Bacillus thuringiensis z grupy obejmujacej: szczep EMCC-0077 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21090, szczep EMCC-0078 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21091, szczep EMCC-0079 o cechach identyfikacyj- nych NRRL B-21092, szczep EMCC-0080 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21093 1 szczep EMCC-0081 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21094. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Bacillus thuringiensis i kompozycja pestycydowa, do zwalczania szkodliwych owadów, zwłaszcza z rzędu chrząszczy.

Każdego roku, znacząca część światowych, przemysłowo ważnych upraw rolniczych, związanych z żywnością, tekstyliami i różnymi roślinami domowymi, jest tracona na skutek atakowania roślin przez owady, powodujące ogromne straty.

Do zwalczania takich szkodników przyjęto różne strategie.

Jedną ze strategii jest stosowanie szerokiego wachlarza środków szkodnikobójczych tj. pestycydów chemicznych o szerokim zakresie działania. Jednakże ze stosowaniem pestycydów chemicznych wiąże się wiele niedogodności. W szczególności, z powodu ich szerokiego spektrum działania, pestycydy te mogą niszczyć organizmy nie-docelowe takie jak owady

184 858 pożyteczne i pasożyty owadów szkodliwych. Ponadto, pestycydy chemiczne często są toksyczne dla zwierząt i ludzi a docelowe szkodniki rozwijają odporność przy częstym kontakcie z takimi substancjami.

Inna strategia związana jest z biopestycydami, w której wykorzystuje się naturalnie występujące patogeny do ochrony upraw roślinnych atakowanych przez owady, grzyby i chwasty. Biopestycydy obejmują bakterie produkujące toksyny, substancje toksyczne dla szkodników. Jako całość biopestycydy na ogól są mniej szkodliwe dla organizmów nie-docelowych i dla otoczenia niż pestycydy chemiczne.

Najszerzej stosowanym biopestycydem jest Bacillus thuringiensis (B.t.). B.t. jest szeroko rozpowszechnionym, mikroorganizmem tlenowcowym, o kształcie pałeczkowym, tworzącym zarodniki. W trakcie jego cyklu zarodnikowania B.t. produkuje białko/a/ znane jako krystaliczne delta-endotoksyny, które zabijają larwy owadów. B.t. jest zatem bardzo użyteczny dla rolnictwa jako pestycyd.

Stwierdzono, że niektóre szczepy, takie jak Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki i Bacillus thuringiensis ssp. aizawai są specyficzne ssp. dla Lepidoptera. Stwierdzono, że Bacillus thuringiensis ssp. israelensis jest specyficzny dla Diptera (Goldberg, opis patentowy US 4.166.112). Inny szczep np. Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis (Krieg i wsp. 1988, opis patentowy US 4.766.203) jest specyficzny dla Coleoptera. Wyodrębnienie innego szczepu Bacillus thuringiensis toksycznego dla Coleoptera opisano w 1986 (Hernnstadt i wsp. Bio/Technology tom 4, 305-308, 1986, opis patentowy US 4.764.372). Szczep ten oznaczony „Bacillus thuringiensis ssp. san diego, M-7, zdeponowany jest w Northern Regional Research Laboratory, St. Zjedn. i dostępny pod numerem NRRL B-15939. Jednakże stwierdzono, że Bacillus thuringiensis ssp. san diego stanowi Bacillus thuringiensis ssp. lenebrionis. Ponadto, ujawniono szczep B.t., który jest toksyczny wobec Lepidoptera i Coleoptera (zgłoszenie PCT nr WO 90/13651). Toksyna ujawniona w tym zgłoszeniu ma ciężar cząsteczkowy 81 kD.

Podczas cyklu zarodnikowania B.t. produkuje białko/a/ w postaci krystalicznej znane jako krystaliczna delta-endotoksyna/y/ o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 27 do 140 kD, która po spożyciu zabija larwy owada. Działanie toksyczne może tkwić w jednej lub kilku takich delta-endotoksynach wdanym szczepie B.t. Większość delta-endotoksyn stanowi protoksyny, które są proteolitycznie przekształcane do mniejszych toksycznych (ciętych prostopadle do powierzchni) polipeptydów w jelicie cienkim docelowego owada (Hofte i Whiteley, 1989, Microbiol.Rev. 53:242-255). Delta-endotoksyny są kodowane przez geny ery (krystaliczne białka). Geny ery dzielą się na sześć klas i kilka podklas w oparciu i podobieństwa strukturalne i specyficzność szkodnikobójczą. Głównymi klasami są Lepidoptera-specyficzne (cryl); Lepidoptera- i Diptera-specyficzne (cryll); Coleoptera-specyficzne (eryIII); Diptera-specyficzne (cryIV) (Hofte i Whiteley, 1989, Microbiol.Rev. 53:242-255); Coleoptera- i Lepidoptera-specyficzne (oznaczone jako geny cry V przez Tailora i wsp. 1992, Molecular Microbiology 6:1211-1217); i geny nicienio-specyficzne (oznaczane jako cryV i cryVI przez Feitelsona i wsp., 1992, Bio/Technology 10:271-275).

Delta-endotoksyny mogą być otrzymywane metodą rekombinantowego DNA i mogą ewentualnie być w postaci krystalicznej.

Delta-endotoksyna B.t. jest nierozpuszczalna w wodzie, za wyjątkiem środowiska o alkalicznym pH, i jest zawsze kodowana plazmidem. Wykazano, że pewne szczepy Bacillus thuringiensis produkują termicznie trwałe adenino-nukleotydowe analogi szkodnikobójcze, znane jako β-egzotoksyna lub turingiezyna, która sama jest szkodnikobójczą (Sebesta i wsp. w H.D.Burges (wyd.) Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York str. 249-281, 1981). β-egzotoksynę znaleziono w supernatancie niektórych hodowli Bacillus thuringiensis. Ma ona ciężar cząsteczkowy 789 i składa się z adenozyny, glukozy i kwasu allarowego (Luthy i wsp. w Kuestak (wyd.) Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, str. 35-72). Szereg gospodarzy dla niej obejmuje np. Musca domestica, Mamestra configurata Walter, Tetranychus urlicae, Drosophila melanogaster i Tetranychus clnnabarinus. Przypuszcza się, że toksyczność β-egzotoksyn wynika z inhibitowania polimerazy RNA skierowanej na DNA w konkurencji z ATP. Wykazano, ze β-egzotoksyny są kodowane przez plazmid cry w pięciu szczepach Bacillus thuringiensis (B.t.) i że

184 858 β-egzotoksyny mogą być klasyfikowane jako β-egzotoksyny typ i lub typ II (Levinson i wsp.,

1990, J.Bacteriol. 172:3172-3179). Stwierdzono, ze β-egzotoksyny typu I produkowane są przez B.t. ssp. thuringiensis serotyp I, B.t. ssp. tolworthi serotyp 9 i B.t. ssp. darmstadiensis serotyp 10. Stwierdzono, że β-egzotoksyna typu II produkowana przez B.t. ssp. morrisoni serotyp 8a jest aktywna przeciw Leptinotarsa decemlineata (stonka ziemniaczana Colorado). Inne rozpuszczalne w wodzie substancje, które zostały wyizolowane z B.t. obejmują alfa-egzotoksyny toksyczne wobec larw Musca domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7); gamma-egzotoksyny, które stanowią różne enzymy proteolityczne obejmujące lecytynazy, chitynazy i proteazy, których działanie toksyczne wyraża się jedynie w kombinacji z beta-egzotoksynami lub delta-endotoksynami (Forsberg i wsp., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Council of Canada, NRC Associate Commitee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommitees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma egzotoksynę, która ma strukturę podobną do beta-egzotoksyn, i jest również aktywna przeciw Leptinotarsa decemlineata (Arguer i wsp.,

1991, J. Entomol. Sci. 26:206-213); i anhydrothuringienzynę (Coll. Czwechoslovak Chem. Comm. 40, 1775, 1975).

W WO 94/09630 ujawniono rozpuszczalną w wodzie substancję, która wzmaga aktywność Bacillus thuringiensis vax.kurstaki i Bacillus thuringiensis var. aizawai.

Stonard i wsp. (1994, In Natural and Engineered Pest Management Agents, Paul A.Mann, Robert M. Hollingworth, wyd. ACS, Waszyngton, D.C., str. 25-36) ujawnili diabrotycyny o wzorze

1. R, Rj, R₂ = H, R3 = OH Diabrotycyna A

2. R, R), R₂, R3 = H Diabrotycyna B

Diabrotycyny zostały wyizolowane z B subtilis i mają działanie przeciw Diabrotica undecimpunciaia, Leptinotarsa decemlineata, Anthomus grandis Boheman, larwom komara, Staphylococcus aureus i Micrococcus lutea, ale nie wykazują działania przeciw europejskim larwom omacnicowatych, Escherichia coli., B. subtilis i Pseudomonas aeruginosa Stonard i wsp. nie ujawnili aktywności przeciw innym szkodnikom. Diabrotycyna A została również wyizolowana z brzeczki fermentacyjnej B.cereus.

W technice próbowano osiągnąć zwiększoną śmiertelność preparatów B.t. Zaangażowano duże środki na poszukiwanie nowych szczepów o zwiększonej śmiertelności, ingerowano inżynieryjnie w obecne szczepy i projektowano bardziej skuteczne preparaty przez połączenie zarodników i/lub kryształów B.t. z nowymi nośnikami pestycydowymi lub z pestycydami chemicznymi.

Celem obecnego wynalazku było poprawienie aktywności owadobójczej znanych preparatów B.t. oraz wzmocnienie aktywności szkodnikobójczej już istniejących pestycydów. W tym zakresie korzystne byłoby wyizolowanie nowych szczepów Bacillus thuringiensis do

184 858 produkowania nowych substancji tak, aby istniało szersze spektrum biopestycydów dla każdego szkodliwego owada. Szczep taki udało się wyizolować.

Wynalazek obejmuje nowy szczep Bacillus thuringienis, z grupy obejmującej: szczep EMCC-0077 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21090, szczep EMCC-0078 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21091, szczep EMCC-0079 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21092, szczep EMCC-0080 o cechach identyfikacyjnych NRRJL B-21093 i szczep EMCC-0081 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21094.

Ponadto wynalazek obejmuje kompozycję pestycydową do zwalczania szkodliwych owadów z rzędu chrząszczy, na bazie pestycydu pochodzącego do Bacillus, która zawiera Bacillus w postaci szczepu lub zarodnika z grupy obejmującej:

szczep EMCC-0077 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21090, szczep EMCC-0078 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21091, szczep EMCC-0079 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21092, szczep EMCC-0080 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21093 i szczep EMCC-0081 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21094. Oraz zawiera substancję o wzorze la/Ib:

w którym

Ia: R, Rj, R2 i R3 oznaczająH,

Ib: R, R}i R2 oznaczają H, a R3 oznacza OH w ilości od 0,001 do 300 g na każdąjednostkę LTU pestycydu związanego z Bacillus oraz ewentualnie dopuszczalny nośnik.

Stosowana jednostka LTU oznacza jednostkę Leptinotarsa texana oznaczoną za pomocą próby biologicznej. Próba biologiczna porównuje próbkę materiału standardowego danego Bacillus stosując Leptinotarsa texana lub inny szkodnik jako organizm wzorcowy w teście. Moc działania określana jest przez podzielenie LC50 danego wzorca a następnie pomnożenie przez moc działania danego materiału.

W szczepie wyselekcjonowanym z grupy obejmującej EMCC-0077 o charakterystyce identyfikacyjnej NRRL B-21090 lub jego mutantów mających zasadniczo takie same własności jak EMCC-0077, EMCC-0078 o charakterystyce identyfikacyjnej NRRL B-21091 lub jego mutantów mających zasadniczo takie same własności jak EMCC-0078, EMCC-0079 o charakterystyce identyfikacyjnej NRRL B-21092 lub jego mutantów mających zasadniczo takie same własności jak EMCC-0079, EMCC-0080 o charakterystyce identyfikacyjnej NRRL B-21093 lub jego mutantów mających zasadniczo takie same własności jak EMCC-0080 oraz EMCC-0081 o charakterystyce identyfikacyjnej NRRL B-21094 lub jego mutantów mających zasadniczo takie same własności jak EMCC-0081, zasadniczo cała aktywność szkodnikobójcza znajduje się w supematancie z fermentacji tego szczepu. Białka krystaliczne i zarodniki

184 858 otrzymane z fermentacji szczepu Bacillus thuringiensis według wynalazku nie posiadają żadnej aktywności szkodnikobójczej.

Substancję, która ma działanie szkodnikobójcze przeciw szkodliwym owadom rzędu Coleoptera i działa zarazem, na przykład, jako pontencjator lub środek synergizujący z różnymi pestycydami pochodzącymi od Bacillus przeciw szkodnikom, otrzymuje się z supematantu z fermentacji wymienionego szczepu. W korzystnym wykonaniu substancja ta ma LC50 (LC50 oznacza stężenie danej substancji szkodnikobójczej potrzebne do zabicia 50% szkodników) 126 mg składnika aktywnego/g całego materiału przeciw Leptinotarsa texana. LC50 płytek z fermentacji tego szczepu jest większe od około 3000 mg składnika aktywnego/g całkowitego materiału według oznaczenia próbą biologiczną.

Wymieniona substancja ma działanie szkodnikobójcze przeciw owadom rzędu Coleoptera. W szczególności, wymieniona substancja ma działanie szkodnikobójcze przeciw szkodliwym owadom gatunków Diabrotica undecimpunciata, Leptinotarsa tcxana, Anthomus grandia, jak również nieoczekiwaną aktywność przeciw szkodliwym owadom gatunków Ips calligraphus, Popillia japonicus, Epilachna varivastis, Leptinotarsa decemlineata i Dendroctonus frontalis z rzędu Coleoptera.

Ponadto, wymieniona substancja wzmaga działanie szkodnikobójcze krystalicznej/ych/ delta-endotoksyn/y/ Bacillus thuringiensis przeciw szkodliwym owadom. W szczególności wzmaga ona działanie szkodnikobójcze krystalicznej delta-endotoksyny Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis przeciw szkodliwym owadom rzędu Coleoptera.

Stosowane tutaj określenie „pestycyd pochodzący od Bacillus''' oznacza szczep łub zarodnik Bacillus (np. Bacillus thuringiensis lub Bacillus subtilis). Pestycyd pochodzący od Bacillus może również oznaczać substancję związaną z Bacillus np. białko lub jego fragment posiadające działanie zabijające szkodniki, które zapewnia ochronę roślin, np. substancję przeciw zerowaniu lub mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment, mające działanie zabijające szkodniki (np. delta-endotoksynę Bacillus thuringiensis) i dopuszczalny nośnik.

Zwalczanymi szkodnikami mogą być, na przykład owady, nicienie, roztocze lub ślimaki. Mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment ma działanie nakierowane przeciw lub zabijające szkodniki inhibitujące fitopłaszczyznę (powierzchnię liści roślin) i/lub rizosferę (przestrzeń gleby otaczającą korzenie) i/lub środowisko wodne, i jest zdolne do skutecznego konkurowania wdanym otoczeniu (uprawa i inne środowiska owada) z mikroorganizmami typu dzikiego i dostarczenia trwałego utrzymania i ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment o działaniu przeciwko lub zabijającym szkodniki. Przykładami takich mikroorganizmów są, ale się do nich nie ograniczają, bakterie np. rodzaju Bacillus. Pseudomonas, Erwinia, Scrraria, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopscudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobiacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes i Clostridium; algi np. z rodzin Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyccac, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyccae, Eustigmatophyceae, Cruptophyceac, Euglenophyceae, Prosinophyceae i Chlorophyceae, i grzyby zwłaszcza drożdże np. rodzaju Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyccs, Sporobolomyce, Rhodokorula i Aureobasidium.

Stosowane fu określenie „aktywność szkodnikobójcza” jest miarą działania przeciw szkodnikowi poprzez zabicie lub zahamowanie rozwoju szkodnika lub ochronę roślin przed zaatakowaniem szkodnikami.

Poniżej bardziej szczegółowo opisano kompozycje szkodnikobójcze zawierające substancję i pestycyd pochodzący od Bacillus jak również sposoby stosowania kompozycji szkodnikobójczych do zwalczania szkodników i sposób otrzymywania „zasadniczo czystej” substancji stosowanej w kompozycji według wynalazku.

Powyższe określenie „zasadniczo czysta” substancja oznacza substancję, która zawiera mniej niż 5% zanieczyszczeń, na przykład, białka delta-endotoksynowego.

Otrzymywanie zasadniczo czystej substancji prowadzi się w następujących etapach:

(a) hoduje się szczep Bacillus thuringiensis na odpowiedniej pożywce;

184 858 (b) odzyskuje się supernatant z etapu (a); i (c) poddaje się supernatant z etapu (b) na kolumnę chromatograficzną w celu oczyszczenia substancji.

Substancję/e/ wchodzącą w skład kompozycji otrzymuje się z supematantu z fermentacji Bacillus thuringiensis włączając, ale bez ograniczenia, szczepy B.t. EMCC-0077 o charakterystyce identyfikacyjnej NRrL B-21090 lub ich mutanty posiadające zasadniczo taką samą charakterystykę jak EMCC-0077, EMCC-0078 o charakterystyce identyfikacyjnej NRRL B-21091 lub ich mutanty posiadające zasadniczo taką samą charakterystykę jak EMCC-0078, EMCC-0079 o charakterystyce identyfikacyjnej NRRL B-21092 lub ich mutanty posiadające zasadniczo taką samą charakterystykę jak EMCC-0079, EMCC-0080 o identyfikacyjnej NRRL B-21093 lub ich mutanty posiadające zasadniczo taką samą charakterystykę jak EMCC-0080 i EMCC-0081 o charakterystyce identyfikacyjnej NRRL B-21094 lub ich mutanty posiadające zasadniczo taką samą charakterystykę jak EMCC-0081.

Bacillus thuringiensis można hodować stosując znane środowiska i techniki fermentacji (patrz, na przykład, Rogoff i wsp., 1969, J. Invertebrate Path. 14:122-129; Dulmage i wsp., 1971, J. Invertebrate Path. 18:353-358; Dulmage i wsp. w Microbial Confcrol of Pests and Plant Diseases, H.D.Burges, wyd. Academic Press, N.Y., 1980). Po zakończeniu cyklu fermentacji supernatant można odzyskać poprzez oddzielenie zarodników i kryształów z brzeczki fermentacyjnej znanymi sposobami np. przez odwirowanie i przez ultrafiltrację. Wymieniona substancja zawarta jest w supernatancie, który można odzyskać znanymi sposobami np. przez ultrafiltrację, odparowanie lub suszenie rozpyłowe.

Alternatywnie, substancję/e/ można otrzymać drogą syntezy chemicznej stosując znane sposoby wytwarzania związków o wzorze I. Na rysunku fig. 1 przedstawiono schemat syntezy prowadzącej do otrzymania związku o wzorze I.

Dla otrzymania substancji przedstawionej wzorem I, zwykły pierścień pirazynowy z odpowiednim podstawieniem i grupami ochronnymi można utworzyć drogą wielu reakcji, na przykład, spontanicznej kondensacji związków alfa-aminokarbonylowych. Tworzy się związek pośredni dihydropirazynowy, który z łatwością utlenia się do pirazyny. Dimeryzacja pojedynczego związku alfa-aminokarbonylowego tą metodą prowadziłaby do pojedynczej pirazyny, podczas, gdy reakcja z dwoma różnymi związkami alfa-aminokarbonylowymi prowadziłaby do trzech produktów; przy czym substancje te wyodrębnia się za pomocą rozdziału chromatograficznego (patrz fig. 1). Ta ostatnia reakcja pozwala na syntezę pirazyn o różnych podstawnikach po każdej stronie pierścienia.

W przedstawionym na fig. 1 związku o wzorze I

R(D

Ri2

R1 oznacza grupę amino, hydroksy, (C1.10) alkil, (CucO-alkilo ester, arylo (np. benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, chlorowcobenzoilo) ester, chlorowiec, grupę (C].₅)-alkoksy lub

184 858 aminokwas włączając, ale bez ograniczenia, alanylowy, walinylowy, leucynylowy, izoleucynylowy, fenyloalanylowy, glicynylowy i fenyloglicynylowy;

R2 oznacza grupę amino lub (Ciiio)alkil;

R3 oznacza wodór, grupę amino, hydroksy, (Ci-io)alkil, (CM0)alkilo ester, arylo (np. benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobenzoilo, chlorowcobenzoilo) ester, chlorowiec, grupę (C1.5)alkoksy, metyloaminę, dimetyloaminę, tionyl, metylotionyl, cyjano, lub sól włączając, ale bez ograniczenia, fosforan, siarczan, octan, węglan i azotan;

R4 oznacza wodór, grupę amino, łayd^^o^.sy/', (Ci-io)alkil, (Ci.io)alkllo ester, arylo (np. benzoilo, nitrobeazoilo, dinitrobenzoilo, chiorowcobeazoilo) ester, chlorowiec, grupę (Ci-5)alkoksy lub sól włączając, ale bez ograniczenia, fosforan, siarczan, octan, węglan i azotan;

R5 oznacza wodór, grupę metoksy, amino, hydroksy, (Ci.io)alkil, (CiioOalkilo ester, arylo (np. benzoilo, nitrobenzoilo, dinitrobeazoilo, chlorowcobenzoilo) ester, chlorowiec lub grupę (Ci.₅)alkoksy;

R_fi oznacza wodór, grupę amino, hydroksy, (Cnojalkil, ester, chlorowiec lub grupę (Ci5)alkoksy;

R7 oznncza wodór, grupę amino. hyiiroksy, (Ci.io)alkll, (Ci.iojalkUo eistirr, arylo (np. benzoilo, nitrobeazoilo, diaitrobeazoilo, chiorowcobeazoilo) ester, chlorowiec, grupę (Ci_5)alkoksy lub sól włączając, ale bez ograniczenia, fosforan, siarczan, octan, węglan i azotan;

Rg oznacza wodór, grupę amino. hydroksy, (Ci-iojakiH, (CiiiojalkUo oseer, arylo (np. benzoilo, aitrobenzoilo, diaitrobenzoilo, chlorowcobeazoilo) ester, chlorowiec, grupę (Ci.5)alkoksy' metyloaminę, dimetyloaminę, tionyl, metyio-tionyl, cyjano, lub sól włączając, ale bez ograniczenia' fosforan, siarczan, octan, węglan i azotan;

R9 oznacza grupę amino lub (Ci-io)alkil; i

Rio oznacza grupę amino, hydroksy, (Ciio)alkil, (Ci.io)alkilo ester, arylo (np. benzoilo' aitrobenzoilO' dinitrobeazoilo, chlorowcobeazoilo) ester, chlorowiec, grupę (Ci5)-alkoksy lub aminokwas taki jak alanylowy, walinylowy, leucynylowy, izoleucynylowy, fenyloalanylowy' glicynylowy i feaylogiicynylowy;

Azoty pirazynowe mogą ewentualnie być podstawione (C1-10) alkilem' (Cl-lo)alkiio estrem, arylo (np. benzoilo, nitrobeazoilo, dinitrobeazoilo, chiorzwcobeazoiio) estrem lub tlenem.

Należy rozumieć, że w zakres wynalazku wchodzi również każda z postaci stereoizomerycznych związków o wzorze I jak również racematy.

W kompozycji według wynalazku substancja o wzorze I ma wzór Ia, nazywany dalej „Ia” lub wzór Ib nazywany dalej „Ib”.

la. R, Ri, R2, R3 = H lb. R, Ri, R2 = H, R3 = OH

184 858

Oczyszczanie substancji można przeprowadzać różnymi znanymi sposobami, łącznie, ale bez ograniczania, z chromatografią (np. chromatografią kolumnową pracującą na zasadzie wymiany jonowej, powinowactwa i wykluczania rozmiaru), procedurami elektroforetycznymi, różnicy rozpuszczalności, ekstrakcji lub dowolnej innej znanej techniki standardowej (patrz na przykład, Protein Purification, wyd. J-C Janson and Lars Dyden, VCH Publishers, New York, 1989).

Substancja ta wykazuje aktywność przeciw szkodliwym owadom rzędu Coleoptera i działa razem z pestycydem pochodzącym od Bacillus jako np. potencjator lub środek synergizujący.

Aktywność wymienionej substancji może być oceniana biologicznie przy zastosowaniu znanych procedur takich jak na przykład sztuczne wprowadzanie do pożywienia, nanoszenie na sztuczne pożywienie, pędzlowanie liści, zanurzanie liści oraz oprysk liści. Poszczególne przykłady podano poniżej w przykładach.

Kompozycje zawierające substancję sporządza się z wymienionej substancji w połączeniu z pestycydem pochodzącym od Bacillus, który jak zdefiniowano powyżej jako Bacillus, oznacza szczep lub zarodnik o działaniu szkodnikobójczym oraz ewentualnie z dopuszczalnym nośnikiem, w postaci kompozycji pestycydowej takiej jak na przykład zawiesina, roztwór, emulsja, pył, granulki dyspergowalne, proszek zawiesinowy, koncentrat emulgowalny, aerozol lub granulki impregnowane.

Przykłady takich szczepów Bacillus obejmują, ale nie są do nich ograniczone, Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki (sprzedawany pod nazwą DIPEL™ z Abbott Laboratories, Inc., JAVELIN™ z firmy Sandoz, BIOBIT™ z firmy Novo Nordisk A/S, FORAY™ z firmy Novo Nordisk A/S, MVP™ z firmy Mycogen, BACTOSPEINE™ z firmy Novo Nordisk A/S i THURICIDE™ z firmy Sandoz). Bacillus thuringiensis ssp. aizawai (sprzedawany pod nazwą FLORBAC™ z firmy Novo Nordisk A/S i XENTARI™ z Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis ssp. tenebnonis (sprzedawany pod nazwą NOVODOR™ z firmy Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ z firmy Sandoz, M-TRAK™ i M-INE™ z firmy Mycogen); Bacillus thuringiensis ssp. israelensis (sprzedawany pod nazwą BACTIMOS™ lub SKEETAL™ z NoVo Nordisk A/S, TEKNAR™ z firmy Sandoz i VECTOBAC™ z Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus sphaericus (sprzedawany pod nazwą SDHEIMOS'™ przez Novo Nordisk A/S); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (sprzedawany pod nazwą FOIL™ przez Ecogen); Bacillas thuringiensis kurstaki/aizawai (sprzedawany pod nazwą CONDOR™ przez ecogen i AGREE™ z Ciba-Geigy); Białko dotyczące Bacillus może być dobrane z grupy obejmującej, ale nie ograniczonej do niej, CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV i CryVI.

Wymienioną substancję można również łączyć w preparatach z innymi czynnikami lub substancjami otrzymanymi z supernatantu Bacillus łącznie z endotoksyną i/lub znanym czynnikiem wzmacniającym działanie. Ewentualnie, preparat może również zawierać dalszy pestycyd pochodzący od Bacillus, pestycyd chemiczny i/lub wirus o własnościach szkodnikobójczych oraz dopuszczalny nośnik.

Składniki tej kompozycji mogą działać w sposób synergiczny. Wynikiem takiej kompozycji może być większa skuteczność od skuteczności pochodzącej od indywidualnych składników. Synergizm może się manifestować równą lub większą skutecznością przy mniejszych i/lub rzadziej podawanych dawkach niż byłyby wymagane przy każdym indywidualnym składniku. Alternatywnie substancja ta może działać w kierunku wzmożenia działania pestycydu pochodzącego od Bacillus

Na załączonych rysunkach fig. 2 przedstawia skuteczność synergizmu Ia/Ib i NOVODORU™ (pestycyd z firmy Novo Nordisk A/S) wobec Leptinotarsa decemlineata.

W kompozycjach zawierających substancję i pestycyd związany z Bacillus, substancja obecna jest w ilości około 0,001 do około 300 g na każdą jednostkę aktywności LTU pestycydu związanego z Bacillus. Stosowane określenie „LTU” oznacza, omówioną powyżej, jednostkę Leptinotarsa texana oznaczoną za pomocą próby biologicznej.

W innym wykonaniu, kompozycja może zawierać substancję w postaci zasadniczo czystej lub supernatant z Bacillas w postaci suchej, stężonej lub ciekłej i odpowiedni szkodnikobójczy nośnik, którego przykłady podano poniżej. Składniki kompozycji mogą być stosowane

184 858 oddzielnie na rośliny, np. rośliny transgeniczne. W szczególności kompozycja może być stosowana na rośliny uprzednio zawierające gen Bacillus thuringiensis. W innym wykonaniu kompozycja może być stosowana na rośliny, na które wcześniej stosowano Bacillus thuringiensis. Substancja zawarta jest w kompozycji w stężeniu od około 0,001% do około 60% (wag/wag).

Do kompozycji ujawnionych powyżej mogą być dodane środki powierzchniowo czynne, nośnik obojętny, środek konserwujący, środek zwilżający, środek zwiększający apetyt, środek wabiący, środek kapsułkujący, spoiwo, emulgator, barwnik, środek ochronny przed promieniani Uv, bufor, środek upłynniający lub inny składnik ułatwiający manipulowanie i stosowanie dla danych szkodników docelowych.

Odpowiednie środki powierzchniowo czynne obejmują, ale nie są do nich ograniczone, związki anionowe takie jak karboksylany, na przykład, karboksylany długołańcuchowych kwasów tłuszczowych z metalami; N-acylosarkozyniany; mono- i di-estry kwasu fosforowego z etoksylanami alkoholi tłuszczowych lub solami takich estrów; siarczany alkoholi tłuszczowych takie jak dodecylosiarczan sodowy, oktadecylosiarczan sodowy lub cetylosiarczan sodowy; siarczany etoksylowanych alkoholi tłuszczowych; siarczany etoksylowanych alkilofenoli; ligninosulfoniany, sulfoniany ropy naftowej, alkiloarylosulfoniany takie jak sulfoniany alkilobenzenu lub sulfoniany niższego alkilonaftalenu np. sulfonian butylonaftalenu lub kondensaty sulfonowanego naftalenu z formaldehydem; sole kondensatów sulfonowanego fenolu z formaldehydem; lub bardziej złożone kondensaty takie jak sulfoniany amidowe np. sulfonowany produkt kondensacji kwasu olejowego i N-metylotauryny lub sulfobursztyniany dialkili np. sulfonian sodowy bursztynianu dioktylu. Środki niejonowe obejmują, ale nie są do nich ograniczone, produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych, alkoholi tłuszczowych, amidów kwasów tłuszczowych lub fenoli podstawionych alkilami lub alkenylami tłuszczowymi z tlenkiem etylenu, estry tłuszczowe eterów z alkoholami wielowodorotlenowymi np. sorbitanowe estry kwasów tłuszczowych, produkty kondensacji takich estrów z tlenkiem etylenu np. estry polioksyetyleno-sorbitolowe kwasów tłuszczowych, kopolimery blokowe tlenku etylenu i tlenku propylenu, glikole acetylenowe takie jak 2,4,7,9-tetraetylo-5-decyno-4,7-diol lub etoksylowane glikolo acetylenowe. Przykłady kationowych środków powierzchniowo czynnych obejmują, na przykład, alifatyczne mono-, di- lub poliaminy takie jak octanowe, nafiidenianowe lub oleinianowe; aminy zawierające tlen takie jak aminotlenek polioksyetylenoalkiloaminy; amido przyłączona amina sporządzona przez kondensację kwasu karboksylowego z di- lub poliaminą; lub czwartorzędową sól amoniową.

Przykłady materiałów obojętnych obejmują, ale nie są do nich ograniczone, minerały nieorganiczne takie jak kaolin, mika, gips, nawozy, filosilikaty, węglany, siarczany lub fosforany; materiały organiczne takie jak cukier, skrobie lub cyklodekstryny; lub materiały botaniczne takie jak produkty pochodzące z drewna, kora, sproszkowane kolby kukurydziane, łuski ryzu, łuski arachidowe i łupiny orzecha włoskiego.

Kompozycje według wynalazku mogą być sporządzone w postaci do bezpośredniego stosowania lub w postaci koncentratu lub pierwotnej kompozycji, która przed użyciem wymaga rozcieńczenia odpowiednią ilością wody lub innego rozcieńczalnika. Stężenie szkodnikobójcze będzie różne w zależności, od charakteru danego preparatu, zwłaszcza czy jest to koncentrat czy ma być stosowany bezpośrednio. Kompozycja zawiera 1 do 98% wagowo stałego lub ciekłego nośnika obojętnego i 0 do 50%, korzystnie 0,1 do 50% środka powierzchniowo czynnego. Kompozycje te będą podawane w dawkach podanych na naklejkach opakowań produktu handlowego, korzystnie około (0,0112 do 5,6 kg/ha w postaci suchej lub około 0,005 do 12,5 litra/ha w postaci ciekłej.

W dalszym wykonaniu, pestycyd związany z Bacillus i/lub substancja mogą być traktowane przed sporządzeniem preparatu dla przedłużenia aktywności szkodnikobójczej przy stosowaniu do środowiska szkodnika docelowego, o ile traktowanie wstępne nie jest szkodzące pestycydowi związanemu z Bacillus, lub substancji. Takie traktowanie można przeprowadzić środkami chemicznymi i/lub fizycznymi. Przykłady reagentów chemicznych obejmują, ale nie są do nich ograniczone, środki, chlorowcujące; aldehydy takie jak formaldehyd i aldehyd glutarowy; środki antyinfekcyjne takie jak chlorek zefiranu, alkohole takie jak izopropanol

184 858 i etanol; oraz histologiczne środki utrwalające takie jak środek utrwalający Bouina i środek utrwalający Hellego (patrz, na przykład, Humason, Animal Tissue Technigues, W.H.Freeman & Co, 1967).

Kompozycje według wynalazku można nanosić bezpośrednio na rośliny, na przykład, przez opryskiwanie lub opylanie w czasie rozpoczęcia pojawiania się szkodników na roślinach lub zapobiegawczo jako środek ochronny przed pojawieniem się szkodników. Rośliny chronione w zakresie wynalazku obejmują, ale nie są do nich ograniczone, zboża (pszenicę, jęczmień, zyto, owies, ryż, sorgo i pokrewne uprawy), buraki (buraki cukrowe), pestkowce, jabłkowate i owoce miękkie (jabłka, gruszki, śliwki, brzoskwinie, migdały, czereśnie, wiśnie, truskawki, maliny i jagody), rośliny warzywne (alfaalfa, fasole, soczewicę, grochy, soje), rośliny oleiste (rzepak, gorczycę, mak, oliwki, słonecznik, kokos, rośliny rącznika, ziarna kakaowe, orzeszki ziemne), rośliny ogórkowate (ogórki, cukinie, melony), rośliny włókniste (bawełnę, len, konopie, jutę) owoce cytrusowe (pomarańcze, cytryny, grapefruity, mandarynki), jarzyny (szpinak, sałatę, szparagi, kapusty i inne kapustowate, marchew, cebulę, pomidory, ziemniaki), laurowate (awokado, cynamon, kamforę), drzewa zrzucające liście i iglaste (np. lipy, cisy, dęby, olchy, topole, brzozy, jodły, modrzewie, sosny) łub rośliny takie jak kukurydza, darnie, tytoń, orzechy, kawa, trzcina cukrowa, herbata, winorośle, chmiel, banany i rośliny kauczukowe, jak również rośliny ozdobne. Substancję można stosować na liście, do bruzd, rozsiewać granulki na wszystkie strony, okładać lub stosować w nawadnianiu gleby. Na ogól istotne jest uzyskanie dobrego zwalczania szkodników we wczesnych stadiach wzrostu rośliny, ponieważ jest to czas, kiedy roślina może być najpoważniej uszkodzona. Jeśli wydaje się to konieczne, dogodnie oprysk lub opylanie można stosować z innym pestycydem. W korzystnym wykonaniu, kompozycję według wynalazku stosuje się bezpośrednio na rośliny.

Kompozycje według wynalazku mogą być skuteczne przeciwko szkodnikom rzędu Coleoptera np. Leptinotarsa sp. (np. Leptinotarsa texana. Leptinotarsa decemlineata). Diabrotica undecimpunclaia, Dendroctonus frontalis, Anthonomus grandis, Acanthoscelides οΒιε(Ίι^. Callosobruchus ehlnensls, Epilachna varivensls, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronorus oregonensis, Sitophilus sp, Cyclocephala borealis, Cyclocephala Immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popilia Japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitoblus diaperinus, Polorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor. Kompozycje według wynalazku mogą być również skuteczne przeciw szkodnikom owadom łącznie, ale bez ograniczenia do nich, ze szkodnikami rzędu Lepidoptera np. Achroia grisella, Acleris gloverana, Aclems variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transltella, Anagasta kuehmeda, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archip sp, Argyrotaenia sp., Atheris mindara, Bombyx morl, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp. Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana Integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma lof tini, Ephestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molestra, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca ollvlae, Homoeosoma electell.um, Hyphantria cunea, Kelferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantrla dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp, Mamestra brassicea, Mamestra configurata, Manduca guingaemaculata, Manduca sexla, Maruca testł/dalis, Melanchra pieta, Operophtera brumata. Orgyia sp Ostrinlc nubllahs, Paleacrita vernat.a, Pcpilio cresphon^tes, Pectlnophora gossypiella, Phyganldic californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Plerlś rapae, Plathypena scabra, Platynotc Jlouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostalla, Pontia protodice, PseudaleIIc unipunctala, Pseudoplasla ineludens, Sabulodes aegrotata, Schlzura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota oeellana, Spodoptera sp, Thaurnstopoea pityocampa, Tineola basselhella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges eurialls, Yponomeuta padella, Dlpiera np

184 858

Aedes sp, Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculalus, Armigeres subalnatus, Calliphora stygia, Calliphora vicina, Ceratitis capitana, Chirinomus lentans, Chrysomya rufifacies, Cochllomyla macellaria, Culex sp , Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia plantura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina moristans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina lachinoides, Haemagogus equlnus, Haematobius irritans, Hypoderma bovls, Hydoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilla cuprlca, Lucilla sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca aulumnalis, Musca domestica, Neobelllerta sp, Nephrotoma saturalls, Ophyra aenescens, Phaenicia sericala, Phlebotomus sp , Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercorarla, Stomaxys calcilrans, Toxorhynchites amblonensis, Triptoroides bambusa; Acari, np, Oligonychus pralyensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae, Hymenoptera np., Irldomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isoptera np, Reticulitermes hesperus, Reticulltermes flasipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immlgrans; Siphonaptera np., Ceratophyllus gallinae Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciarus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echinophaga gallinacea, Pulex irrilans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexahilis, Tunga penelrans i Tylenchida np.; Melodidogyne incognila, Pratylenchuspenetrans.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek, ale nie ograniczają jego zakres.

Przykłady

Przykład 1. Hodowla różnych izolatów B.t.

Podkultury EMCC-0077, EMCC-0078, EMCC-0079, EMCC-0080 i EMCC-0081, utrzymywane na skosie agarowym z pożywką, używano do szczepienia 250 ml kolby wytrząsarki z przegrodami, zawierającej 50 ml następującej kompozycji.

Namok kukurydziany 15 g/1

Maltrin-100 40 g/1

Skrobia ziemniaczana 30 g/1

KH2PO4 1,77 g/1

K2HPO4 4,,553 g/1

Nastawiono pH środowiska na 7,0 za pomocą 10 n NaOH.

Po zaszczepieniu, kolby wytrząsarki inkubowano w temperaturze 30°C na wytrząsarce obrotowej przy 250 obr/min przez 72 godziny. Całą brzeczkę hodowlaną stosowano do testowania Diabrotica undecimpunctata.

Przykład 2. Diabrotica undecimpunctata aktywność w całej brzeczce hodowlanej z różnych izolatów B.t.

Odebrano po 2,5 ml całych brzeczek hodowlanych otrzymanych z fermentacji i przeniesiono z wytrząsarki do 50 ml probówek polipropylenowych do oznaczeń biologicznych. Do każdej probówki dodano pożywienie Diabrotica undecimpunctata do końcowej objętości 25 ml. Następnie pożywienie i badany materiał energicznie wymieszano i rozdzielono na tace do prób biologicznych w celu przeprowadzenia oznaczeń biologicznych. Na powierzchnię „pożywienia” naniesiono trzy do sześciu jajeczek Diabrotica undecimpunctata Na tacach z próbami biologicznymi rozprasowano mylar [produkt f-my DuPont - poli(tereftalan etylenu)] i tace inkubowano w temperaturze 28°C bez fotookresu. Ocenę przeprowadzono w ciągu 7 dni. Śmiertelność oznaczono siódmego dnia po inkubacji. SS7 = 4 wielkość martwej larwy w siódmym dniu przez porównanie z żywą larwą kontrolną tego samego dnia co SS7, SS7 = 3, SS7 = 2, SS7 = 1, oznaczają wielkość larwy jako 75%, 50% i 25% odpowiednio w stosunku do żywej larwy kontrolnej 4.

Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 1. Wyniki te pokazują, że we wszystkich 5 badanych szczepach śmiertelność wyniosła 100%. Ponadto, wielkość martwych larw wynosiła 12,5% żywych larw kontrolnych.

184 858

Tabela 1

Działanie całej brzeczki hodowlanej na Diabrotica undecimpunctata

Szczep	% Śmiertelności	SS7
EMCC-0077	10	0,5
EMCC-0078	100	0,5
EMCC-0079	100	0,5
EMCC-0080	100	0,5
EMCC-0081	100	0,5

Przykład 3. Lokalizacja aktywności wobec Diabrotica undecimpunctata

Dla przebadania czy aktywność wobec Diabrotica undecimpunctata związana jest z delta-endotoksyną/zarodnikami czy z supematantem, 2,5 ml całej brzeczki hodowlanej z EMCC-0077, EMCC-0080, EMCC-0081 i NB 125 (Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis hodowany w identycznych warunkach) wirowano w wirówce Sorvall RC-5B przy 15.000 obr/min (rotor Sorvall SS34) przez 15 minut dla oddzielenia supematantu i płytek. Kryształki deltaendotoksyn plus zarodniki odzyskano z płytek. Delta-endotoksyny produkowane przez Diabrotica undecimpunctata - aktywny B.t. izolat EMCC-0077 mają ciężar cząsteczkowy 66kD, 29kD i 12kD według oznaczenia za pomocą SDS-PAGE. Delta-endotoksyny produkowane przez Diabrotica undecimpunctata - aktywny B.t. izolat EMCC-0078 mają ciężar cząsteczkowy 153kD, 77kD, 67kD, 61kD, 50kD, 42kD, 34kD, 30kD, 24kD według oznaczenia SDSPAGE. Delta-endotoksyny produkowane przez Diabrotica undecimpunctata - aktywny B.t. izolat EMCC-0079 mają ciężar cząsteczkowy 135-145kD według oznaczenia SDS-PAGE. Delta-endotoksyny produkowane przez Diabrotica undecimpunctata - aktywny B.t. izolat EMCC-0080 mają ciężary cząsteczkowe 94kD i 40kD według oznaczenia SDS-PAGE. Deltaendotoksyny produkowane przez Diabrotica undecimpunctata - aktywny B.t. izolat EMCC0081 mają ciężary cząsteczkowe 129kD i 32kD według oznaczenia SDS-PAGE.

Każdy supernatant (2,5 ml) otrzymany z odwirowania przeniesiono do 50 ml probówek polietylenowych do oznaczeń biologicznych. Płytki następnie ponownie zawieszono w 2,5 ml sterylnej wody i przeniesiono do oddzielnej 50 ml probówki polipropylenowej do prób biologicznych. Następnie dodano pożywienie Diabrotica undecimpunctata do probówek do oznaczeń biologicznych, które zawierały bądź supernatant, bądź ponownie zwieszone płytki, do objętości końcowej 25 ml. Pozostałe etapy oznaczeń biologicznych były identyczne z opisanymi powyżej. Ocenę przeprowadzono również tak samo jak opisano powyżej.

Wyniki przedstawione w tabeli 2 pokazują, że aktywność Diabrotica undecimpunctata z EMCC-0077, EMCC-0080 i EMCC-0081 obecna jest we wszystkich supematantach, natomiast mniejsza aktywność Diabrotica undecimpunctata ze znanego Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis jest skoncentrowana w płytkach (zarodniki plus kryształki).

Tabela 2

Aktywność wobec Diabrotica undecimpunctata w supematancie i płytkach

Szczep	Frakcja	% śmiertelności	Ocena zahamowania
EMCC-0077	Supernatant	100	0,5
	Płytki	10	3,0
EMCC-0080	Supernatant	100	0,5
	Płytki	0	4,0
EMCC-0081	Supernatant	100	0,5
	Płytki	0	3,0
NB125	Supernatant	0	3,0
	Płytki	50	1,5

184 858

Przykład 4. Działanie przeciw Leptinotarsa texana

Po przesączeniu przez membranę o,2 m, Supernatant EMCC-oo8o, otrzymany z przykładu i użyto do oznaczenia działania na chrząszcze.

Przesączony supernatant naniesiono na liście oberżyny w objętości i9o litrów/ha. Rozcieńczenia wynosiły o,i:i, i:4, i:8 (supernatant: woda dejoaizzwana, obj/obj).

Larwy Leptinotarsa texana wystawiono na traktowane liście postępując zgodnie ze standardowym protokołem. Na każdą roślinę nałożono 2o larw Leptinotarsa texana

Wyniki przedstawione w poniższej tabeli 3 pokazują, ze przefiltrowany supei-natant EMCC-oo8o jest aktywny wobec Leptinotarsa texana.

Tabela 3

Leptinotarsa texana działanie w EMCC-oo8o

Szczep	Rozcieńczenie	% śmiertelności
EMCC-oo8o	o	95
	i:i	55
	i:4	2o
	i.8	o
Nietraktowana próba kontrolna		o

Przykład 5. Działanie synergiczne EMCC-oo8o i NOVODORu™

Wyniki przedstawione w tabeli 3 powyżej pokazują, ze sam supernatant EMCC-oo8o nie jest aktywny w rozcieńczeniu i:8 (obj/obj). Jednak, gdy liście oberżyny potraktuje się i,25% lub 2,5% io x stężonego supematantu EMCC-oo8o plus 2oo mg nOvODORu™ (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dania) na ml uzyskuje się efekt synergiczny jak wykazały ostre odchylenia LC50 i LC90 NOVODORu™. Dane przedstawiono poniżej w tabeli 4.

Tabela 4

Synergiczne działanie EMCC-oo8Q i NOVODORu™

Próbka	LC5o (mg/g)i	LC9o (mg/g)2	Pochyleni
NOVODOR™	642	4,286	i,55
NOVODOR™ + i,25% EMCC-oo8o	25o	i,292	i,79
NOVODOR™ + 2,5% EMCC-oo8o	98	49o	i'83

*LC5o oznacza stężenie zabijające 5o% populacji docelowego owada ²LC₉o oznacza stężenie, które zabija 9o°o populacji docelowego owada 3 Pochylenie pochylenia krzywej % śmiertelności wobec log stężenia

Przykład 6. Oczyszczanie substancji aktywnej wobec Coleoptera wyprodukowanej przez szczep B.t. EMCC-oo8o

Szczep B.t. EMCC-oo8o hodowano przez 24 godziny w temperaturze 3o°C w pożywce o następującym składzie w g/litr przy pH 7,o:

Maltodekstryna 40 g

Białko sodowe 40 g

KH2PO4 1,8β

K2HPO4 4,4 5

MgSO4-7H2O 0,3 3

Metale śladowe 0,2 ml

Komórki i inne substancje nierozpuszczalne usunięto z całej brzeczki hodowlanej szczepu B.t. EMCC-oo8o przez odwirowanie a następnie przefiltrowano otrzymany supernatant przez Celite i o,2 m membranę. Otrzymany permeat zatężono następnie io krotnie przez odparowanie.

Oczyszczenie substancji aktywnej/ych/ wobec Coleoptera z i o krotnie zatężonego permeatu uzyskano stosując cztero etapową procedurę oczyszczania. W trakcie oczyszczania

184 858 monitorowano aktywność za pomocą powierzchniowej próby biologicznej z Diabrotica undccimpunctata jak opisano powyżej a czystość oznaczono za pomocą kapilarnej elektroforezy jak opisano w przykładzie 8. We wszystkich etapach chromatograficznych stosowano detekcję przy 226 nm.

W szczególności, powierzchniową próbę biologiczną prowadzono jak następuje. Próbki 10 x zatężonego permeatu naniesiono do poszczególnych wgłębień na płytkach do mikromiareczkowania zawierających 200 ml stałego sztucznego pożywienia dla owadów na wgłębienie a następnie osuszono na powietrzu. Dwie do czterech nowowyklutych Diabrotica undecimpunctata (corn rootworm, CRW) delikatnie umieszczono w każdym wgłębieniu za pomocą pędzelka. Płytki do mikromiareczkowania następnie zakryto mylarem z podziurkowanymi otworkami dla wymiany powietrza i inkubowano w temperaturze 30°C przy 80% wilgotności. Ocenę % śmiertelności przeprowadzono po 5 dniach.

W pierwszym etapie, 10 x zatężony permeat najpierw oczyszczono na kolumnie chromatograficznej (5 x 30 cm) Pharmacia SP Sephadex® C-25 (wymiana kationowa). 450 ml próbkę 10 krotnie stężonego permeatu rozcieńczono do 18 litrów wodą dejonizowaną, wprowadzono do kolumny, którą wstępnie zrównoważono za pomocą 20 mM buforu octano amonowego o pH 5,0. Kolumnę eluowano 5,0 litrami, 18 ml na minutę przy ciągłym gradiencie od 20 mM do 0,5 M buforu octano amonowego przy pH 5,0. Zbierano frakcje 10 ml, oznaczano biologicznie i badano na czystość. Frakcje aktywne zebrano (około 150 ml), liofilizowano i ponownie rozpuszczono w wodzie dejonizowanej do około 1/5 pierwotnej objętości.

W drugim etapie, 25 ml próbkę z pierwszego etapu wprowadzono do kolumny (5 x 100 cm) BioRad P2 (ekstra drobna) pracującą na zasadzie wykluczania według wielkości, którą zrównoważono wstępnie wodą dejonizowaną. Kolumnę eluowano wodą dejonizowaną z małą szybkością 1 ml na minutę. Zbierano frakcje 10 ml, oznaczano biologicznie i badano na czystość za pomocą elektroforezy kapilarnej. Frakcje aktywne zebrano (około 400 ml).

W trzecim etapie, 400 ml zebranego produktu z drugiego etapu rozcieńczono do 16 litrów dejonizowaną wodą. Roztwór załadowano na kolumnę Pharmacia S Sepharose® Fast Flow (wymiana mocnego kationu) (5 x 30 cm), którą równoważono wstępnie 20 mM buforem octano amonowym o pH 5,0. Kolumnę eluowano 5,0 litrami octano amonowego buforu o pH 5,0, z szybkością przepływu 17 ml/minutę przy gradiencie od 20 mM do 0,5 M. Frakcje 20 ml zbierano, oceniano biologicznie i badano na czystość. Frakcje aktywne zebrano (około 250 ml), po czym liofilizowano do sucha w celu usunięcia lotnego buforu octano amonowego.

W czwartym etapie, liofilizowany zebrany produkt z etapu trzeciego rozpuszczono w 400 ml wody dejonizowanej. Roztwór załadowano na kolumnie BioRad Chelex® 100 (0,9 x 30 cm), którą zrównoważono wstępnie 20 mM buforem mrówczano amonowym o pH 4,0. Kolumnę eluowano z szybkością 5 ml na minutę 2,4 litrami etapowego gradientu 0,02 — 0,1 — 0,2 — 0,35 — 0,5 — 1,0 M buforu mrówczano amonowego o pH 4,0. Frakcje 20 ml zbierano, oceniano biologicznie i badano na czystość. Frakcje aktywne zebrano (około 300 ml) a następnie liofilizowano do sucha w celu usunięcia lotnego buforu mrówczano amonowego.

Elektroforeza kapilarna wykazała, że oczyszczony materiał aktywny wobec Coleoptera zawiera dwa związki Ia i Ib.

Przykład 7. Wyjaśnienie struktury substancji aktywnych wobec Coleoptera

Strukturę związków Ia i Ib wyjaśniono na podstawie danych spektroskopowych zebranych na ich acylowanych pochodnych (Pochodne A i B).

114 mg mieszaniny Ia i Ib acylowano w 5,0 ml pirydyny 5,0 ml bezwodnikiem octowym i kryształkiem 4-dimetyloamino-pirydyny jako katalizatorem w ciągu 24 godzin w temperaturze pokojowej a następnie oczyszczano za pomocą pół-preparatywnej RP-Cis HPLC. 5 mg próbkę w 25 ml załadowano do kolumny i eluowano 4 ml/minutę 80% wody - 20% acetonitrylu. Detekcja przy 254 nm.

Dane spektroskopowe NMR zebrane na Pochodnej A wskazują obecność 14 węgli i 17 protonów. Jednakowoż, dane widma masowego sugerują, ciężar cząsteczkowy 652 i wzór C28H40N6012 (dokładna masa 653,2801, MH+, obl. 653,2782). Tak więc, związek jest określany jako symetryczny tam, gdzie obserwuje się tylko połowę sygnałów NMR..

184 858

Układy kilku spinów obserwowano przez NMR. Wskazany został centralny pierścień pirazynowy podstawiony w pozycjach 2 i 5 przez singlety wysokoprotonowe (high field protons) przy 8,6 ppm (H-3 i H-6), który pokazuje długi szereg sprzęzeń z wszystkimi węglami w pierścieniu i z pierwszym węglem łańcucha bocznego (C-7) Boczny łańcuch trzech węgli jest acetylowany w obu pozycjach 7 i 8 z metylenem w pozycji 9. Stwierdzono, że węgiel 9 ma długozakresową korelację z karbonylem estru, i że ester oznaczony jest jako część alaniny, która jest acetylowana przy grupie aminowej.

Struktura Pochodnej B różni się w jednej pozycji od Pochodnej A. W jednym z łańcuchów bocznych Pochodnej B, węgiel C-7 nie jest już acetylowany ani przyłączony do tlenu, ale stwierdzono, ze przyłączony jest do metylenu. Drugi łańcuch boczny jest identyczny jak w Pochodnej A. Ta różnica tylko jednego tlenu zauważona jest w danych widma masowego. Otrzymano dane widma masowego 595,2722 (MH+, obl. 595,2727) dla Pochodnej B, wskazujące wzór C26H3RN6O10. Gęstości optyczne Pochodnych A i B są następujące:

Pochodna A [ajcT = -6,9° a Pochodnej B[a]o27= 32°. Pełne przypisanie danych 1h i ¹³C NMR przeprowadzono na podstawie prób rozprzęgania, COSY, HMQC i HMBC. Przypisanie przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Dane 'H i ¹³C NMR dla Pochodnej A i Pochodnej B w D-4 metanolu

Pozycja	H (stałe sprzężenia mult Integ.)	C
	Pochodna A	Pochodna B	A	B
1	2	3	4	5
2			152,9	154,7
3	8,6 (s, 1H)	8,54 (s, 1H)	144,2	144,4
5			152,9	151,1
6	8,6 (s, 1H)		144,2	145,6
7	5,84 (d, 1H, J=7,4Hz)	2,95 (dd, 1H, J=13, 9;92) 3,10 (dd, 1H, J= 13, 9;4,8)	74,0	37,5
8	4,72 (m, 1H)	4,48 (m, 1H)	52,1	50,2
9	4,24 (dd, 1H, J=11, 5,6,7Hz) 4,30 (dd, 1H, J=11, 5,6,7Hz)	4,11 (dd, 1H, J=11, 4;6, 7Hz) 4,20 (m, 1H)	63,5	66,3
10			174,8	174,7
11	4,20 (q, 1H, J=7, 1Hz)	4,20 (m, 1H)	50,3	49,8
12	1,2 (d,3H, J=7, 1Hz)	1,17 (d, 3H, J=7, 3 Hz)	17,8	18,1
13	5,84 (d, 1H, J=7, 4Hz)	5,80 (d, 1H, J=7, 4Hz)	74,0	73,9
14	4,72 (m, 1H)	4,70 (m, 1H)	52,1	52,1
15	4,24 (dd, 1H, J=11,5;6, 7Hz) 4,30 (dd, 1H, J=11, 5,6, 7Hz)	4,20 (m, 1H) 4,30 (dd, 1H, J=11,6,6, 8Hz)	63,5	63,6
16			174,8_	174,7
17	4,20 (q, IH, J=7, 1Hz)	4,20 (m, 1H)	50,3	50,4
18	1,2 (d, 3H, J=7, 1Hz)	1,20 (d, 3H, J=7, 3Hz)	17,8	17,8
19			171,4	171,4

184 858 cd. tabeli

1	2	3	4	5
20	2,1	1,97	20,6**	20,6
21			172,9ń	172,4
22	2,0*	2,02	20,5**	22,5
23			172,3_	172,5
24	1,95*	2,09	22,5* *	22,6
25			172,3_	172,9
26	1,95*	2,03	22,5**	20,7
27			172,9	171,4
28	2,0*	1,95	20,5*	20,6
29			171,4
30	2,1*		20,6**

*, **, _-sygnały mogą być wymieniane

Dane widma masowego dla mieszaniny związków Ia i Ib dają dwa jony cząsteczkowe 400 i 384. Z danych tych oznaczono, że wzorem cząsteczkowym związku Ia jest C16H28N6O6 a związku Ib C16H28N 6O5. Budowa związków Ia i Ib została ustalona przez porównanie danych NMR Pochodnej A i Pochodnej B z danymi NMR mieszaniny Ia i Ib. Budowę Ia i Ib przedstawiono poniżej.

Ia: R, R1, R2, R3 = H Ib: R, R_b R2 - H, R3 = OH

Własności związków Ia i Ib oraz ich acetylowanych pochodnych zestawiono poniżej: Pochodna A:

Ciężar cząsteczkowy: 652

Wzór empiryczny: C28H00N βθ io

UV(MeOH): 275,310 run

MS(FAB): M+H) m/z 653,2801 , obl .

184 858

Pochodna B:

Ia:

Ciężar cząsteczkowy Wzór empiryczny: UV(MeOH): MS(FAB):

594

C28H38N6O10

275,300 im (M+H) m/z 595,2722, obi . 5⁽5^f^l'71

Ib:

Ciężar cząsteczkowy: Wzór empiryczny: UV(H2O):

MS(FAB):

400

Cl6t2233NF6O>6 275, 310 nm (M+H) ^0() 1

Ciężar cząsteczkowy: Wzór empiryczny: UV(H2O):

MS(FAB):

384

C iHK2N^₆C55 275,310^1 Mf+H) 385

Przykład 8: Oznaczenie ilościowe związków Ia i Ib w brzeczce fermentacyjnej

Szczep B.t. EMCC-0080 hodowano tak jak opisano w przykładzie 1. Stężenie związków Ia i Ib w brzeczce fermentacyjnej oznaczono za pomocą elektroforezy.

W szczególności, do oznaczeń ilościowych stosowano BioRad Biofocus 3000 Capillary Electrophoresis System wyposażony w niepowlekaną kapilarę (50 m x 50 cm) 0,1 M fosforan o pH 2,5 przy p0 KV, polamość ujemną e doąatniąoraz detekcje e^icj^' 200 run. Objętość próbki wynosiła 30 ml z iniekcją 5 psi sekunda (34,3 kPa sekunda). Czas analizy 10 minut związków Ia i Ib aktywnych wobec Coleoptera przy elucji 6,0 i 5,9 minut, odpowiednio.

Alternatywnie, do oznaczeń ilościowych stosowano Beckman P/ACE 2100 Capillary Electrophoresis System wyposażony w niepowleka^ią kapilarę (50 m x 47 cm) 0,1 M bufor fosforanowy o pH 2,5, napięcie 20 KV, polamość ujemną i dodatnią, oraz detekcję przy 200 nm. Objętość próbki wynosiła 30 ml z 10 sekundową iniekcją pod ciśnieniem. Czas analizy 10 minut związków Ia i Ib aktywnych wobec Coleoptera przy elucji 7,0 i 6,7 minut, odpowiednio.

Komórki i inne substancje nierozpuszczalne usunięto z całej brzeczki hodow-danej szczepu B.t. EMCC-0080 przez odwirowanie i za pomocą filtracji przez Celite i 0,2 membranę. Otrzymany supernatant analizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej jak opisano powyżej. Wyniki pokazały, ze związki Ia i Ib aktywne wobec Coleoptera obecne są w stężeniu około 90 mg na litr brzeczki hodowda^iej.

Przykład 9. Oznaczenie mocy działania związków Ia i Ib

Względną moc działania surowej mieszaniny związków Ia i Ib (w przybliżeniu 1: 1 wag/wag) przebadano stosując Leptinotarsa texana jako badany owad i porównano śmiertelność związaną ze standardowym preparatem z Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis

Przeprowadzono liściowe próby biologiczne w celu oznaczenia mocy działania surowej mieszaniny związków Ia i Ib wobec Leptinotarsa tcxana. Aby przeprowadzić liściową próbę biologiczną badane materiały i standardy zważono do 50 ml probówek wirówkowych i zawieszono w wodzie dejonizowanej zawierającej 0,1% fw-een®20. Zważono 1200 mg standardu Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis i zawieszono otrzymując końcowe stężenie 12.000 mg/g. Badane próbki (tj. NOVODOR™ i NOVODOR™ ze związkami Ia i Ib) traktowano w podobny sposób dopóty aż próba biologiczna zoałezienla dawkowania nie wykazała, że dostarczona dawka jest zbyt wysoka lub zbyt niska do dostarczenia dostatecznej liczby punktów ważnych danych. W tym przypadku, stężenie pierwotnego roztworu podstawowego zwiększano lub obniżano poprzez zmianę ilości rozcieńczalnika dodawanego do roztworu. Każdą próbkę następnie homogenizowano przez 30 sekund stosując homogeoioator Virtis i poddano działaniu ultradźwięków na 20 sekund o mocy 100 watt stosując homogeoizator ultradźwiękowy Braunsonic 1510. Każdy z tych podstawowych roztworów rozcieńczano następnie stosując Hamilton Microlab 1000 do otrzymania siedmiu serii rozcieńczeń zawierających 3.000, 2.000, 1.333, 857, 545, 364 i 245 mg/ml w 16 ml. Każdy z tych 16 ml roztworów stosowano w przybliżeniu na 53,3 m² liści oberżyny za pomocą spryskiwacza Devries Linear Track kalibrowanego na dostarczenie 190 l/ha. Liście kontrolne spryskano 16 ml wody de

184 858 jonizowanej. Liście wysuszono na powietrzu a następnie umieszczono na obrzezu małego jasnego kubka plastikowego zawierającego 5 larw Leptinotarsa texana w stadium po drugiej wylince. Następnie na liściach położono kartonowe pokrywki i przyciśnięto pokrywki w miejscu, odcinając 4 cm krążek liścia i zamykając go wewnątrz kubka. Kubki następnie odwrócono i larwy opadły na powierzchnię traktowanego liścia. Przygotowano po osiem kubków na każdą z siedmiu serii rozcieńczeń. Kubki powiązano razem, przyklejono naklejki, umieszczono na stojakach i inkubowano przez 3 dni w temperaturze 30°C i wilgotności względnej 65%. Tych 56 kubków eksperymentalnych i 8 kubków kontrolnych stanowiło jedną próbę biologiczną.

Po trzech dniach oceniono śmiertelność owadów. Każdy kubek mocno uderzono i larwy, które się nie ruszały policzono jako martwe. Obliczono % śmiertelność i dane przeanalizowano za pomocą równoległej analizy probitowej. Ustalono LC50, LC90, nachylenie krzywej regresji, współczynnik zmiany i moc działania.

Dla ustalenia mocy działania, rozcieńczono surową mieszaninę związków Ia i Ib, przeprowadzono próby biologiczne i porównano ze standardem Bacillus thuringiensis spp. lenebrionis, której przypisano siłę działania 20.000 LTU/g (jednostek Leptinotarsa texana/gęram).

Wyniki oznaczenia mocy działania przedstawiono poniżej w tabeli 6 i wskazano, że surowa mieszanina związków Ia i Ib (1:1 wag/wag) ma moc działania 75.555 LTU na g składnika aktywnego przy LC50 70 mg/ml (całkowita zawartość 1,8 mg składnika aktywnego na ml).

Tabela 6

Moc działania mieszaniny związków Ia i Ib

Próbka	LC50 mg/ml	Ustalona moc działania
Mieszanina la/Ib	70	75.555 LTU

Przykład 10. Potencjalizacja krystalicznej delta-endotoksyny Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis związkami Ia i I b

Zdolność związków Ia i Ib do potencjalizacji działania owadobójczego krystalicznej delta-endotoksyny Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis wobec Leptinotarsa lexana oznaczono przez dodanie surowej mieszaniny związków Ia i Ib do NOVODORu™ i zmierzenie LC50 za pomocą równoległej analizy probitowej.

Liściową próbę biologiczną przeprowadzono z Leptinotarsa texana jak opisano w przykładzie 9 w celu oznaczenia poziomu zyskanej mocy działania przez dodanie związków Ia i Ib do NOVODORu™. Surową mieszaninę związków Ia i Ib dodano do NOVODORu™. Roztwory seryjnie rozcieńczono za pomocą Hamilton Microlab 1000 do otrzymania roztworu podstawowego zawierającego NOVODOR™ o 1000,0, 666,7, 444,4, 285,7, 181,8, 121,2 oraz 80,0 mg/g. Przygotowano dwa różne rozcieńczenia mieszaniny Ia i Ib otrzymując siedem serii rozcieńczeń zawierających 72,0, 48,0, 32,0, 20,6, 13,1, 8,7 oraz 5,8 mg/g (2,5% wag/wag z 1000 mg/g NOVODORu™); i 36,0, 24,0, 16,0, 10,3, 6,5, 4,4 oraz 2,9 mg/g (1,25% wag/wag z 1000 mg/g NOVODORu™). Przygotowano czyste próbki (bez związków Ia i Ib) a także próbki substancji porównawczych. LC50 par czystych próbek podzielono przez wartości LC50 próbek potencjalizowanych otrzymując krotność redukcji LC50 związanej z mieszaniną związków Ia i Ib.

Wyniki przedstawione w poniższej tabeli 7 wskazują, ze surowa mieszanina związków Ia i Ib zwiększa działanie owadobójcze NOVODORu™ wobec Leptinotarsa lexana.

Tabela 7

Potencjalizacja NOVODORu™ mieszaniną związków Ia i Ib przeciw Leptinotarsa texana

Próbka	LC50 mg/ml	Wskaźnik potencjalizacji
NOVODOR™	642	0
NOVODOR™ + 1,25% Ia/Ib	250	2,6
NOVODOR™ + 2,50% Ia/Ib	98	6,5

184 858

Przykład ii. Działanie mieszaniny związków Ia i Ib przeciw chrząszczom Ips calligraphus i Dendroctonus fronalis

Oznaczono toksyczność surowej mieszaniny związków Ia i Ib przeciw chrząszczom Ips calligraphus i Dendroctonus fronalis Do 3 ml surowego roztworu związków Ia i Ib (i,8 mg składnika aktywnego na ml) dodano 5 g łyka sosnowego Lobolly i 7 ml wody destylowanej. Pożywienie kontrolne sporządzono z io ml wody. Pożywienie rozdzielono na 3 szalki Petriego i na każdej szalce umieszczono chrząszcze io młodych dorosłych Ips lub ostatnio wyklutych Dendroctonus. Na trzech różnych szarżach traktowanego pożywienia i pożywienia kontrolnego umieszczono po io do 2o owadów. Płytki Petriego iakubowaao w ciemności w temperaturze 25°C i liczbę martwych owadów policzono po 4, 7 i io-i2 dniach od umieszczenia ich na pożywieniu. Dane przedstawiają średnie z 2 lub 3 różnych powtórzonych badań dla każdego gatunku owada.

Wyniki dla Ips calligraphus przedstawiono poniżej w tabeli 8 i wskazują one, ze surowa mieszanina związków Ia i Ib jest owadobójcza.

Tabela 8

Ocena mieszaniny związków Ia i Ib wobec Ips calligraphus

Traktowanie	'Dni po traktowaniu	Liczba owadów	Średnia liczba martwych owadów	Średni % śmiertelności
Kontrola	4	20	0	0
Kontrola	7	20	0	0
Kontrola	10	20	1	3
Ia/Ib	4	20	1	5
la/Ib	7	20	7	35
Ia/Ib	10	20	20	100

Wyniki prób biologicznych z Dendroctonus frontalis przedstawiono poniżej w tabeli 9 i wskazują one, że mieszanina związków Ia i Ib jest owadobójcza.

Tabela 9

Ocena mieszaniny związków Ia i Ib przeciw Dentroctonus frontahs

Traktowanie	Dni po traktowaniu	Liczba owadów	Średnia liczba martwych owadów	Średni % śmiertelności
Kontrola	4	i4-2o	0	0
Kontrola	7	i4-2o	1	7
Kontrola	10-12	i4-2o	3	i6
la/Ib	4	10-20	1	5
Ia/Ib	7	10-20	1	5
Ia/Ib	10	20	i4	83

Przykład i2. Działanie przeciw Popillia Japonica (chrząszcz japoński)

Surową mieszaninę związków Ia i Ib przebadano na działanie szkodnikobójcze przeciw

Popillia japonica w stadium po trzeciej wylince. Korzenie rajgrasu angielskiego (i i dniowego) zanurzono w surowej mieszaninie związków Ia i Ib (i,8 mg Ia i Ib na ml) i pozostawiono do częściowego wyschnięcia. Jedną larwę Popillia Japonica w stadium po trzeciej wylince umieszczono w puszce z kilkoma traktowanymi korzeniami. Po 24 godzinach korzenie i larwy przykryto glebą gliniastą Woostera. Korzenie kontrolne zanurzono w wodzie i nietraktowaną próbę kontrolną zawierającą larwę umieszczono dnia i bezpośrednio na glebę gliniasta. Puszki iakubzwaao w ciemności w temperaturze 25°C i liczbę martwych larw sprawdzano po 7, io, 2i, 28 mi 36 dniach i podano śmiertelność skorygowaną przez próbę kontrolną {(przeżycie w próbie kontrolnej - przeżycie po traktzwaniu)/(przeżycie w próbie kontrolnej) x ioo%}. W każdym traktowaniu stosowano 25 larw. Wyniki przedstawione w tabeli io pokazują' ze

184 858 surowa mieszanina związków Ia i Ib jest skuteczna przeciw Popillia japonica po trzeciej wylince.

Tabela 10

Aktywność związków Ia i Ib przeciw Popillia japonica

	7 dni	10 dni	21 dni	28 dni	36 dni
Nietraktowane
liczba martwych	2	2	4	5	5
Kontrola z wodą liczba martwych	2	3	8	10	11
% kontroli	0	4,3	19	25	30
Ia 1 Ib liczba martwych	6	8	13	14	15
% kontroli	17,4	26,1	42,9	45	50

Przykład 13: Działanie przeciw Epilachna varivestis (chrząszcz fasoli meksykańskiej)

Surową mieszaninę związków Ia i Ib (1.8 mg/ml) badano na działanie szkodnikobójcze przeciw larwom Epilachna varivesis po trzeciej wylince. Kolonie dorosłych Epilachna varivesis w klatce utrzymywano na krzakach fasoli lima Burpee'ego w komorze wzrastania przy fotookresie (jasno/ciemno) 16:8 w temperaturze 26,5°C i wilgotności względnej 50%. Zebrano masę jajeczek i pozwolono na wyklucie się ich na szalkach Petriego zawierających wilgotny tampon waty i liście fasoli lima. Po dwóch dniach larwy po drugiej wylince zebrano i użyto w próbie biologicznej na zanurzonych liściach. Dla przeprowadzenia próby biologicznej zebrano liście fasoli i ogonki pojedynczych liści wepchnięto przez gumowy kapturek do kwiaciarskiej rurki zawierającej 4 ml wody. Liście zanurzono następnie w serii rozcieńczeń w zakresie 0-12% wag/wag surowego materiału zawierającego związki Ia i Ib. Jak tylko liście wyschły umieszczono na każdym liściu 8-10 larw po trzeciej wylince. Owady, liście i rurki kwiaciarskie umieszczono w 22-uncjowym kubku papierowym, przykryto gęstą siatką. Kubki trzymano w tej samej komorze wzrostowej stosowanej do wychodowania kolonii chrząszczy. Co dwa dni kubki wyjmowano z komory wzrostowej, larwy spisywano i liście wymieniano na liście świeżo traktowane. Test prowadzono przez 8 dni.

Wyniki przedstawione w tabeli 11 pokazują, że surowa mieszanina związków Ia i Ib jest aktywna przeciw larwom Epilachna varivesis.

Tabela 11

Dawka śmiertelnej odpowiedzi larw Epilachna vartvesis

Dni po traktowaniu	LC50 %	95% limit zaufania niższy wyższy
4	5,6	2,58 10,65
6	2,12	3,03 9,37
8	1,94	0,75 2,81

Przykład 14. Próby polowe przeciw Leptinotarsa decemlineata (stonka ziemniaczana)

Próby zwalczania Leptinotarsa decemlineata prowadzono na ziemniakach (odmiana Katahdin) za pomocą surowej mieszaniny związków Ia i Ib w dawkach 5(0 100,150 i 300 g/akr (125, 250, 375 i 750 g/ha) w połączeniu zNOVODORem™ stosowanym w dawce 1,2 i 2,4 l/ha i z samym NOVODORem™ stosowanym w dawce 1,2 i 2,4 1/ha. Traktowanie prowadzono dwukrotnie w odstępie 7 dni za pomocą CO2 z rozpylacza ręcznego Spray Systems TXVX-12 zaopatrzonego w 3 dysze o stożkowych otworach na rząd i kalibrowanego na dostarczenie 300 l/ha przy 3 m/godz i ciśnieniu 385 kPa. Każde traktowanie powtarzano 4 krotnie na poletkach z dwoma rzędami, w odstępie 0,85 m o długości 8 m w przypadkowym ułożeniu Dorosłe

184 858 i larwy Leptinotarsa decemlineata policzono od góry bez dotykania liści w rzędach na długości 15 m/poletko.

Wyniki przedstawione na fig. 5 pokazują, że surowa mieszanina związków Ia i Ib wykazuje znaczące działanie synergiczne zNOVODORem™ w ziemniakach. W dawce NOVODORu™ 1,2 l/ha zaobserwowano 21% zwalczanie podczas, gdy w dawce 125 g/ha surowej mieszaniny związków la i Ib uzyskano 13% zwalczanie. Jednakowoż, gdy razem zastosowano NOVODOR™ i surową mieszaninę związków Ia i Ib w powyżej podanych dawkach zwalczenie zwiększyło się do 81%. Podobnie, przy 250 g/ha surowej mieszaniny związków la i Ib uzyskano zwalczanie 28% podczas, gdy przy 0,25 l NOVODORu™ zwalczenie wyniosło 21%, ale gdy zastosowano razem NOVODOR™ 'surową mieszaninę związków Ia i Ib w podanych dawkach, zwalczenie wzrosło do 81%. Ponadto, gdy razem zastosowano surową mieszaninę związków Ia i Ib w dawce 125 g/ha i NOVODOR w dawce 1 l/ha zwalczenie zwiększyło się do 88%.

Zdeponowanie mikroorganizmów

Następujące szczepy Bacillas thuringiensis zdeponowano zgodnie z Porozumieniem Budapesztańskim w Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional Research Center (NRRL), 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, St. Zjedn.

Szczep	Numer dostępu	Data zdeponowania
EMCC-0077	NRRL B-21090	10 maj 1993
EMCC-0078	NRRL B-21091	10 maj 1993
EMCC-0079	NRRL B-21092	10 maj 1993
EMCC-0080	NRRL B-21093	10 maj 1993
EMCC-0081	NRRL B-21094	10 maj 1993

Szczepy zdeponowano na takich warunkach, aby zapewniony był do nich dostęp w trakcie rozpatrywania niniejszego zgłoszenia do czasu wyznaczonego przez Komisarza d/s Patentów i Znaków Towarowych z mocy 37 C.F.R.par.1.14 i 35 U.S.C. par 122. Depozyt reprezentuje zasadniczo czystą kulturę każdego zdeponowanego szczepu. Depozyt jest dostępny zgodnie z wymaganiami zagranicznych praw patentowych w krajach, w których będą zgłoszone odpowiedniki niniejszego zgłoszenia lub z nich pochodzące. Należy jednak rozumieć, że dostępność depozytu nie stanowi licencji na stosowanie wynalazku, w przypadku naruszeniu patentu.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Szczep Bacillus thuringiensis z grupy obejmującej:

   szczep EMCC-0077 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21090, szczep EMCC-0078 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21091, szczep EMCC-0079 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21092, szczep EMCC-0080 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21093 i szczep EMCC-0081 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21094.
2. 2. Kompozycja pestycydowa do zwalczania szkodliwych owadów z rzędu chrząszczy, na bazie pestycydu pochodzącego od Bacillus, znamienna tym, że zawiera Bacillus W postaci szczepu lub zarodnika z grupy obejmującej:

   szczep EMCC-0077 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21090, szczep EMCC-0078 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21091, szczep EMCC-0079 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21092, szczep EMCC-0080 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21093 i szczep EMCC-0081 o cechach identyfikacyjnych NRRL B-21094 oraz zawiera substancję o wzorze:

   w którym la. : R, Rj, R2 i R3 oznaczająH lub lb. : R, R1 i R2 oznaczająH, a R3 oznacza OH, w ilości 0,001 do 300 g na każdąjednostkę LTU pestycydu pochodzącego od Bacillus oraz ewentualnie dopuszczalny nośnik.