DE69327726T2

DE69327726T2 - Verstärker für Bazilluspestizide

Info

Publication number: DE69327726T2
Application number: DE69327726T
Authority: DE
Inventors: David Lidster; Caryl Macintosh; Carol Manker; Lee Starnes
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Valent BioSciences LLC
Priority date: 1992-11-05
Filing date: 1993-11-04
Publication date: 2000-08-17
Anticipated expiration: 2013-11-05
Also published as: FI952133A; JPH08501798A; GR3033278T3; DE69327726D1; PT670677E; WO1994009630A1; RU95112806A; MX9306922A; ES2144507T3; EP0670677A1; KR950703854A; RU2156574C2; CA2148683C; FI952133A0; IL107494A0; JP2859963B2; DK0670677T3; EP0670677B1; ZA938163B; AU683859B2

Description

1. BEREICH DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf einen Faktor welcher die pestizidale Aktivität eines von Bacillus abgeleiteten Pestizides, eines chemischen Pestizides und/oder eines Virus mit pestizidalen Eigenschaften potenziert, sowohl als auch Verfahren zum Erzielen dieses Faktors. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf pestizidale Zusammensetzungen, welche den Faktor und einen pestizidalen Träger beinhalten, oder den Faktor und ein von Bacillus abgeleitetes Pestizid, ein chemisches Pestizid und/oder einen Virus mit pestizidalen Eigenschaften sowohl als auch Verfahren zum Einsatz solcher Zusammensetzungen umfassen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen mutierten oder variierten Bacillusstamm bei welchem ein solcher Faktor in größeren Mengen erzielt wird oder welcher größere Poteintierungsaktivität besitzt verglichen zu dem Urstamm und Verfahren zur Herstellung solcher mutierten oder variierten Stämme.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Jedes Jahr werden erhebliche Anteile der in der Welt kommerziell wichtigen agrikulturellen Anbauprodukte einschließlich Nahrungsmittel, Textilien und zahlreichen Hauspflanzen aufgrund von Schädlingsbefall verloren, was zu Verlusten in höhe von Millionen von Dollarn führt. Zahlreiche Strategien wurden verwendet beim Versuch solche Schädlinge zu bekämpfen.
Eine Strategie ist der Einsatz von Breitspektrumpestiziden, chemischen Pestiziden mit einem breiten Aktivitätsbereich. Jedoch gibt es eine Anzahl von Nachteilen bei dem Einsatz solcher chemischer Pestizide. Aufgrund ihres breiten Aktivitätsspektrums können diese Pestizide auch nicht anvisierte Organismen zerstören, sowie begünstigende Insekten und Parasiten der zerstörerischen Schädlinge. Zusätzlich sind diese chemischen Pestizide oft toxisch für Tiere und Menschen und anvisierte Schädlinge entwickeln häufig Resistenzen, wenn sie wiederholt solche Substanzen ausgesetzt sind.
Eine weitere Strategie beinhaltet die Verwendung von Biopestiziden, welche aus natürlich auftretenden Pathogene Nutzen ziehen um den Befall von Anbauprodukten durch Insekten, Pilzen und Kräutern zu bekämpfen. Biopestizide beinhalten ein Bakterium welches ein Toxin erzeugt; diese Substanz ist toxisch für den Schädling. Biopestizide sind im allgemeinen für diejenigen Organismen, die nicht anvisiert sind und für die Umwelt als ein Ganzes im Vergleich zu chemischen Pestiziden weniger schädlich. Das am weitesten genutzte Biopestizid ist das Bacillus Thuringiensis (B. t.). B. t. ist ein weitverbreiteter stäbchenförmiger, aerober und sporenbildender Mikroorganismus. Während seines Sporenbildungszykluses produziert B. t. ein Protein(e) in einer Kristallform bekannt als ein delta- Endotoxin(e) Kristall, welches Insektenlarven tötet. B. t. ist daher sehr nützlich als ein agrikulturelles Pestizid.
Einige Stämme, z. B. Bacillus Thuringiensis subsp. Kurstaki, und Bacillus Thuringiensis subsp. Aizawai sind nachweislich spezifisch für Lepidoptera. Bacillus Thuringiensis subsp. Israelensis ist nachweislich spezifisch für Diptera (Goldberg, U. S. Patent No. 4,166, 112). Andere Stämme, beispielsweise Bacillus Thuringiensis subsp. Tenebrionis (Krieg et al., 1988, U. S. Patent No. 4,766,203) sind nachweislich spezifisch für Coleoptera. Die Isolierung von einem anderen Coleoptera toxischen Bacillus Thuringiensisstamm wurde 1986 berichtet (Hernnstadt et al. Bio/Technology Vol. 4, 305-308, 1986, U. S. Patent 4,764,372, 1988). Dieser Stamm, als "Bacillus Thuringiensis subsp. San Diego"bezeichnet, M-7, wurde beim Northern Regional Research Laboratory, USA unter der Accessionnummer NRRL B-15939 hinterlegt. Jedoch hat der Inhaber des '372 Patentes, Mycogen, Corp. öffentlich eingestanden daß das Bacillus Thuringiensis subsp. San Diego identisch ist mit Bacillüs Thuringiensis subsp. Tenebrionis. Weiterhin wurde das '372 Patent an Novo Nordisk A/S übertragen. Zusätzlich wurde ein B. t. Stamm offengelegt welcher toxisch ist gegen Lepidoptera und Coleoptera (PCT Applicationsnr. WO 90/13651). Das Toxin welches in der PCT Applicationsnr. WO 90/13651 beschrieben ist hat ein molekulares Gewicht von 81 kd.
Während seine s Sporenbildungszykluses produziert B. t. ein Protein(e) in Kristallform, bekannt als ein delta-Endotoxin(e) Kristall welches ein molekulares Gewicht besitzt von 27-140kd, welcher nach Nahrungsaufnahme die Insektenlarven tötet. Die toxische Aktivität kann in einem oder mehreren solcher Kristallproteine bei einem gegebenen B. t. Stamm liegen. Die meisten delta-Endotoxine sind Protoxine welche proteolytisch in kleinere toxische (verkürzte) Polypeptide in mittleren Gedärm des Zielinsekts umgewandelt werden (Höfte und Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255). Die delta-Endotoxine werden durch cry (Kristallpotein) Gene kodiert. Die cry Gene wurden in sechs Klassen und verschiedene Unterklassen basierend, auf strukturellen Ähnlichkeiten und der pestizidalen Spezifität aufgeteilt. Die Hauptklassen sind Lepidoptera-spezifisch (cryI); Lepidoptera- und Diptera-spezifisch (cryII); Coleopteraspezifisch (cryIII); Diptera-spezifisch (crylV) (Höfte und Whiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255); Coleoptera- und Lepidoptera-spezifisch (bezeichnet als cryV durch Tailor et al., 1992, Mol. Microbiol. 6: 1211-1217); und Nematode-spezifisch (bezeichnet als cryV und cryVI durch Feitelson et al., 1992, Bio/Technology 10: 271-275).
Delta-Endotoxine wurden durch DNS-Rekombinationsmethoden produziert. Die Delta-Endotoxine, die durch DNS-Rekombinationsmethoden hergestellt werden, können aber müssen nicht in kristalliner Form sein.
B. t. Delta-Endotoxin in wasserunlöslich außer bei alkalischen pH, und ist fast immer durch Plasmide kodiert. Einige Stämme von Bacillus Thuringiensis haben nachweislich ein wärmestabiles pestizidales Adenin-Nukleotidanalogon produziert, bekannt als β -Exotoxin oder Thuringiensin, welches pestizidal alleine ist (Sebesta et al., in H. D. Burges (Herausgeber), Mikrobielle Bekämpfung von Schädlingen und Pflanzenerkrankungen, Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York Seiten 249-281, 1981). β-Exotoxin wurde im Überstand einiger Bacillus Thuringiensis Kulturen gefunden. Es hat ein Molekulargewicht von 789 und besteht aus Adenosin, Glukose und allarischer Säure (Lüthy et al., in Kurstak (Herausgeber), Mikrobielle und virale Pestizide, Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, Seiten 35-72). Sein Wirtsbereich umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster, und· Tetranychus cinnabarinus. Die Toxizität von β-Exotoxin ist gemäß der Lehrmeinung bedingt in der Inhibition der DNS-gesteuerten RNS-Polymerase durch die Kompetition mit ATP. Es wurde gezeigt das β-Exotoxin durch ein cry Plasmid in fünf Bacillus Thuringiensis (B. t.) Stämmen kodiert wird und das β-Exotoxin als Typ I oder Typ II β-Exotoxin klassifiziert werden kann(Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Es wurde nachgewiesen, daß β-Exotoxin Typ I produziert durch B. t. subsp. Thuringiensis Serotyp 1, B. t. subsp. tolworthi Serotyp 9, und B. t. subsp. darmstadiensis Serotyp 10 produziert wird. Es wurde nachgewiesen, daß β-Exotoxin Typ II durch B. t. subsp. morrisoni Serotyp Bab produziert wird uhd daß es gegen Leptinotarsa texana wirksam ist. Andere wasserlösliche Faktoren welche aus B. t. isoliert wurden umfassen alpha-Exotoxin (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8 : 1- 7); gamma-Exotoxine, welche zahlreiche proteolytische Enzyme sind einschließlich Lezithinasen, Chitinasen und Proteasen (Forsberg et al., 1976, "Bacillus Thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality", National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcomittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-Exotoxin (Argauer et al., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206-213); und Anhydrothuringiensin (Coll. Czechoslovak Chem. Co mm. 40, 1775, 1975).
Im Fachgebiet wurde danach gestrebt eine erhöhte Mortalität von B. t. Zusammensetzungen zu erreichen. Mittel dazu erreichen das Suchen nach neuen Stämmen mit erhöhter Mortalität, der Versuch vorhandene Stämme zu bearbeiten und der Versuch effektivere Zusammensetzungen durch das Kombinieren von B. t. Sporen und/oder Kristallen mit neuen pestizidalen Trägern, chemischen Pestiziden oder Verstärkern (siehe beispielsweise U. S. Patentnr. 5,250,515, einem Trypsinhemmstoff)zu entwickeln. Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung die pestizidale Aktivität von Pestiziden zu verstärken.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuartigen Faktor welcher anders als bisherige Faktoren, die im Fachgebiet bekannt sind, die pestizidale Aktivität eine s von Bacillus abgeleiteten Pestizide verstärkt. Spezifisch ist der Faktor der vorliegenden Erfindung ein Verstärker. Wie hierin definiert, ist ein "Verstärker" eine Substanz, welche keine signifikante pestizidale Aktivität hat, die zum Beispiel eine LC&sub5;&sub0; (LC&sub5;&sub0; ist die Konzentration der Substanz die erforderlich ist um 50% der Schädlinge zu töten) besitzt von mehr als etwa 3000 ug/g, wie untersucht durch einen Bioassay (siehe Abschnitt 6) aber wirkt um die pestizidale Aktivität eines von Bacillus abgeleiteten Pestizides um mindestens 50% zu erhöhen und bewirkt kein Verkümmern der Larven. Wie in Abschnitt 2 bemerkt, haben andere Substanzen die in der Lage sind die pestizidale Aktivität zu erhöhen und die im Fachgebiet bekannt sind, wie delta- Endotoxine, Trypsinhemmstoffe und Exotoxine, auch eine pestizidale Aktivität.
In einer spezifischen Ausführung ist der Faktor wasserlöslich. Wie hierin definiert, ist eine Substanz oder Verbindung "wasserlöslich" wenn mindestens /ml einer Substanz in /ml Wasser aufgelöst werden kann. Der Faktor kann ebenfalls die pestizidale Aktivität eines chemischen Pestizides und/oder eines Viruses mit pestizidalen Eigenschaften verstärken.
Wie hierin definiert ist ein "von Bacillus abgeleitetes Pestizid" ein Bacillus (z. B. Bacillus Thuringiensis oder Bacillus Subtilis) Stamm, Spore, oder Substanz, z. B. Protein oder Fragment, welches eine Aktivität gegen Schädlinge besitzt oder welches sie tötet; eine Substanz die Pflanzenschutz bietet, z. B. Antifütterungssubstanz oder ein Mikroorganismus der in der Lage ist ein Bacillusgen zu äußern, welches ein Bacillusprotein oder ein Fragment davon kodiert, welches eine Aktivität gegen Schädlinge besitzt oder diese tötet (z. B. Bacillus Thuringiensis Delta-Endotoxin) und ein verträglicher Träger (siehe Abschnitt 5.2, unterhalb, für Beispiele solcher Träger). Der Schädling kann beispielsweise ein Insekt, eine Nematode, eine Milbe oder eine Schnecke sein. Ein Mikroorganismus, der in der Lage ist ein Bacillusgen auszudrücken, welches ein Bacillusprotein oder ein Fragment davon kodiert welches eine Aktivität gegen Schädlinge aufweist oder diese tötet befindet sich auf das Phylloplan (die Oberfläche der Pflanzenblätter), und/oder die Rhizosphere (den Boden der die Pflanzenwurzel umgibt) und/oder wässerige Umgebungen und ist fähig in dieser bestimmten Umgebung (Anbauprodukte und andere Insekten-habitats) mit den Wild-Typmikroorganismen in Kompetition zu kommen und den stabilen Erhalt und die Äußerung eines Bacillusgens, welches ein Bacillusprotein oder ein Fragment davon kodiert das eine Aktivität gegen Schädlinge besitzt oder diese tötet, zu sichern. Beispiele solcher Mikroorganismen umfassen, sind aber nicht nur auf Bakterien beschränkt, zum Beispiel die Arten Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes und Clostridium; Algen, zum Beispiel die Familien Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae, und Chlorophyceae; und Pilze, insbesondere Hefe, zm Beispiel die, Arten Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium.
Wie hierin definiert bemißt "pestizidale Aktivität" die Menge an Aktivität gegen einen Schädling durch Töten oder Wachstumsbehinderung des Schädlings oder den Schutz der Pflanze gegen Schädlingsbefall.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen mutierten oder variierten Bacillusstamm, bei welchem ein solcher Faktor in großen Mengen erzielt wird verglichen zu dem Hauptstamm, sowohl als auch auf Verfahren zum erzielen einer solchen Mutante oder Variante.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf pestizidale Zusammensetzungen welche den Faktor und einen pestizidalen Träger enthalten, sowohl als auch den Faktor und ein von Bacillus abgeleitetes Pestizid, chemisches Pestizid und/oder einen Virus mit pestizidalen Eigenschaften.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren zur Verwendung der pestizidalen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Schädlingskontrolle welches das Aussetzen zu einer schädlingsbekämpfenden Menge der Zusammensetzung beinhaltet. Eine andere Ausführung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abnahme des Widerstands eines Schädlings gegen ein von Bacillus abgeleitetes Pestizid, was das Aussetzen des Schädlings gegen eine Zusammensetzung umfaßt, welche den Faktor und einen pestizidalen Träger beinhaltet. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Verstärkung der pestizidalen Aktivität eines von Bacillus abgeleiteten Pestizides, was das Verabreichen an einen Schädling, der einem Bacillus abgeleiteten Pestizid ausgesetzt ist, einer Zusammensetzung, welche den Faktor und den Träger beinhaltet in Mengen die wirksam sind um die pestizidale Aktivität eines von Bacillus abgeleiteten Pestizides zu verstärken, umfaßt.
Die Erfindung ist weiterhin auf ein Verfahren zum Erzielen eines "im wesentlichen reinen" Faktors der vorliegenden Erfindung gerichtet, das die folgenden Schritte umfasst:
(a) Gärung eines Bacillusstammes;
(b) Aufsammeln des Überstandes aus (a); und
(c) das Isolieren des Faktors aus dem Überstand.
Wie hierin definiert ist ein "im wesentlichen reine" Faktor ein Faktor welcher weniger als 10% Verunreinigungen enthält, zum Beispiel, Delta-Endotoxinprotein.
Die Erfindung zielt weiterhin auf ein Verfahren ab zur Identifizierung des Faktors der vorliegenden Erfindung, folgendes umfassend:
(a) Gärung eines Bacillusstammes;
(b) Aufsammeln des Überstandes auf der Gärung aus (a); und
(c) Untersuchung des Überstands von (b) zur Verstärkung eines von Bacillus abgeleiteten Pestizids.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt schematisch das allgemeine Verfahren zur Reinigung von Ia.
Fig. 2 zeigt das ¹³C NMR Spektrum von Ia.
Fig. 3 zeigt das Protonen NMR Spektrum von Ia.
Fig. 4 zeigt die abgeleitete Struktur von Ia. Protonen (¹H) und 13C Verschiebungen werden in ppm gezeigt, in D&sub2;O aufgezeichnet.
Fig. 5 zeigt ein synthetisches Schema zum Erziehlen der Struktur Ia.

5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Faktor der die pestizidale Aktivität eines von einem Bacillus abgeleiteten Pestizids verstärkt. Der Faktor kann ein molekulares Gewicht von etwa 350 bis etwa 1200 oder in einer spezifischen Ausführung von ungefähr 350 bis etwa 700 haben.
Der Faktor der vorliegenden Erfindung verstärkt die pestizidale Aktivität eines von Bacillus abgeleiteten Pestizides um mindestens etwa das 1,5 fache bis optional etwa 1000-fache vorzugsweise von etwa das 100-fache bis etwa 400-fache. In einer spezifischen Ausführung, verstärkt der Faktor der vorliegenden Erfindung die pestizidale Aktivität eines Bacillus Thuringiensis Delta-Endotoxins, umfassend aber nicht beschränkt auf ein CryI- (umfassend aber nicht beschränkt auf CryIA, CryIB und CryIC), CryII-, CryII-, CryIV-, CryV- oder CryVI-Protein in der vollen Länge oder in einer proteolytisch bearbeiteten, verkürzte Form von etwa 1,5-fach bis etwa 1000-fach. In der am meisten bestimmten Ausführung verstärkt der Faktor der vorliegenden Erfindung ein B. t. Delta-Endotoxine von etwa das 100-fache bis etwa das 400-fache. Der Faktor kann ebenfalls die pestizidale Aktivität eines chemischen Pestizides und/oder eines Viruses mit pestizidalen Eigenschaften verstärken.
Der Faktor kann ebenfalls wasserlöslich, stabil in Wasser bis etwa 100ºC für mindesten etwa 5 Minuten, stabil wenn direkt dem Sonnenlicht ausgesetzt für mindestens ca. 10 Stunden und/oder stabil bei einem pH vob etwa 2 über etwa 10 Tage. sein
In einer spezifischen Ausführung hat der Faktor 13 bis 24 Kohlenstoffatome.
In einer spezifischeren Ausführung hat der Faktor 13 bis 19 Kohlenstoffatome. In der am meisten spezifizierten Ausführung hat der Faktor 13 Kohlenstoffatome.
In einer spezifischen Ausführung hat der Faktor die Strukturformel (I)
wobei
R¹ eine Amino-, Hydroxy-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl-, Benzamid-, 3,5- Dinitrobenzamid-, p-Nitrobenzamid-, Halobenzamid-, Alkylbenzamid-, Thiophenamid-, Furanamid-, Pyrrolamid-, Imidazolamid-, Pyrazolamid-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylamino-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Dialkylamino-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl- oder Benzylester-, Halogen- oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkoxygruppe ist;
R² ist (CH&sub2;)n wobei n eine ganze Zahl von 0-10 ist;
R³ und R&sup4; sind unabhängig (NH)P wobei p 0 oder 1 ist;
R5 ist
oder (CHOH)qCH&sub2;OH wobei X¹, X², X³, X&sup4;, X&sup5;, X&sup6; und X&sup7; unabhängig NH&sub2;, OH, Acetyl, Halogen oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alköxy sind und q ist eine ganze Zahl von 1-10; R&sup6; ist ein Hydroxyl-, Amino-, ein C&sub1;-10-Alkoxy- oder Benzoxy-, Benzylester-, 3,5-Dinitrobenzylester-, p-Nitrobenzylester-, Halobenzylester-, Alkylbenzylester-, Thiophenester-, Furanester-, Pyrrolester-, Imidazolestergruppe; oder ein pestizidal verträgliches Salz davon, umfassend aber nicht beschränkt auf Phosphat, Sulfat, Acetat, Carbonat und Nitrat.
In einer am meisten spezifizierten Ausführungsform hat der besagte Faktor die Struktur

5.1 ERZIELEN DES FAKTORS

Der Faktor der vorliegenden Erfindung kann erzielbar sein aus einer Bacillusgärung (z. B. Bacillus Subtilis, Bacillus Cereus und Bacillus Thuringiensis). In einer spezifischen Ausführung ist der Faktor der vorliegenden Erfindung aus dem Überstand einer Bacillus Thuringiensis Gärung erzielbar umfassend Bacillus Thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus Thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus Thuringiensis subsp. Galleriae, Bacillus Thuringiensis subsp. Entomocidus, Bacillus Thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus Thuringiensis subsp. Thuringiensis, Bacillus Thuringiensis subsp. Alesti, Bacillus Thuringiensis subsp. Canadiensis, Bacillus Thuringiensis subsp. Darmstadiensis, Bacillus Thuringiensis subsp. Dendrolimus, Bacillus Thuringiensis subsp. Finitimus, Bacillus Thuringiensis subsp. Kenyae, Bacillus Thuringiensis subsp. Morrisoni, Bacillus Thuringiensis subsp. Subtoxicus, Bacillus Thuringiensis subsp. Toumanofft und Bacillus Thuringiensis subsp. Israelensis. In einer bevorzugten Ausführung ist der Faktor aus einem Überstand von Bacillus Thuringiensis subsp. Kurstaki, Bacillus Thuringiensis subsp. Aizawai, oder Bacillus Thuringiensis subsp. Galleriae oder Mutanten davon, welche im wesentlichen die gleiche verstärkende Aktivität besitzen, erzielbar. In einer spezifischen Ausführung wird der Faktor aus einer cry- spo- Mutante von Bacillus Thuringiensis subsp. Kurstaki aufgesammelt.
In einer Ausführung ist der Faktor aus einer Mutante von Bacillus, insbesondere bei einem Bacillus Thuringiensis bei welchem der Faktor in größeren Mengen produziert wird oder ein mutierter Bacillus Thuringiensis bei welchem die verstärkende Aktivität des, von der Mutante erhaltbaren Faktors, größer ist, verglichen mit dem Urstamm erzielbar. Ein "Hauptstamm" wie hierin definiert ist der ursprüngliche Bacillusstamm vor der Mutagenese. Um solche Mutanten zu erhalten kann der Urstamm beispielsweise mit einem Mutagen durch chemische Mittel sowie N- Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonat, gamma-Bestrahlung, Röntgenstrahlung oder UV-Bestrahlung behandelt werden. Spezifisch wird in einem Verfahren zur Mutierung von Bacillusstämmen und zur Auswahl solcher Mutanten der Urstamm:
i) mit einem Mutagen behandelt;
ii) die so behandelten Mutanten auf einem Medium gezüchtet, welches geeignet ist zur Auswahl eines mutierten Stammes;
iii) Auswahl eines mutierten Stammes.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung dieses Verfahrens werden die ausgewählten Kolonien in einem normalen Produktionsmedium gezüchtet und eine abschließende Auswahl für Stämme, die in der Lage sind vermehrt Faktor zu produzieren, wird durchgeführt.
Bacillus kann unter Verwendung von Medien und Fermentationstechniken, die im Fachgebiet bekannt sind, kultiviert werden (siehe beispielsweise Rogoff et al., 1969, J. Invertebrate Path. 14: 122-129; Dulmage et al., 1971, J. Invertebrate Path. 18: 353-358; Dulmage et al., in Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H. D. Burges, Ed., Academic Press, N. Y., 1980). Nach Abschluß des Gärungszykluses kann der Überstand aufgesammelt werden, in dem die B. t. Sporen und Kristallen aus der Fermentationsbrühe durch Mittel die im Fachgebiet gut bekannt sind, wie zum Beispiel Zentrifugierung und/oder Ultrafiltration, getrennt werden. Der Faktor der vorliegenden Erfindung ist im Überstand, welcher durch Mittel die im Fachgebiet gut bekannt sind, z. B. Ultrafiltration, Verdampfung und Sprühtrocknung aufgesammelt werden kann, enthalten. Dieses Verfahren wird in den folgenden Abschnitten genauer beschrieben.
Alternativ kann der Faktor der vorliegenden Erfindung durch chemische Synthesen, unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren, erzielt werden. Wie oben in einer spezifischen Ausführung beschrieben, hat der Faktor die Strukturformel (Ia)
Ein synthetisches Schema ist in Abb. 5 gezeigt. 2,3- Diaminopropionsäure (DAP) wird durch Boc (t-Butylcarbamat) geschützt. Das voll N-geschützte DAP kann in das Imidizoyl durch Behandlung mit diimidazoischem Carbonat, um die Verbindung A (siehe Abb. 5) zu ergeben, umgewandelt werden. Verbindung B (siehe Abb. 5) kann aus 3-Amino-3-desoxy-aldonsäure durch selektive Substitution am terminalen primären Alkohol unter Verwendung einer Benzolsulfonyl-liefernde Gruppe hergestellt werden. Die Kondensation von A und B wird unter Julia Bedingungen (NaH, THF) erreicht gefolgt durch Entschwefelung mit Raney Nickel. Die Ketogruppe in Verbindung C (siehe Abb. 5) kann stereoselektiv durch Chelatbildungssteuerung unter Verwendung von Natriumborhydridtriacetat reduziert werden. Entschütztes C kann mit Isocyanat D, abgeleitet aus DAP, behandelt werden um das entsprechende Ureidoderivat zu ergeben, welches durch Hydrogenolyse entschützt wird und die Verbindung (Ia) zu ergeben.
In einer Ausführung können die Aminogruppen von (Ia), welche synthetisch oder aus einem Bacillusüberstand erzielt wurden, acetyliert werden entweder mit Säurechlorid oder Säureanhydrid in Anwesenheit von wässerigem Natriumhydroxid um Triacetamide-, Tribenzamide und Trioctamide von (Ia) zu erzielen. Alternativ können die Amino und Hydroxygruppen peracyliert werden in dem zunächst Methylester gebildet werden unter Verwendung von überschüssigem Diazomethan, gefolgt durch peracylierung an den Amino- und Hydroxylgruppen durch Behandlung mit einem Acylanhydrid (z. B. Acetanhydrid, Benzoesäureanhydrid, n- Octansäureanhydrid) in Pyridin. In einer anderen Ausführung, ausgehend von einem acylierten Derivat, kann ein gemischter Amidester hergestellt werden durch selektive Methylierung des Carboxyls gefolgt durch Behandlung mit einem Acylanhydrid in Pyridin. In einer weiteren Ausführung kann die Carbonsäure um Alkyl- oder Arylester oder Amide zu bilden abgeleitet werden. In einer weiteren Ausführung können selektive Oxidationen der Hydroxysubstituenten zu Ketonen- und kettenverkürzten Carbonsäureanaloga vorhanden sein.
In einer weiteren Ausführung können die Aminogruppen von (Ia) als t-Butylcarbamate durch Behandlung mit Boc-Anhydrid im Anwesenheit von wässerigen Natriumcarbonat geschützt werden, gefolgt von der selektiven Schützung der Hydroxylgruppen durch Benzylbromid in Natriumhydrid um (X) zu ergeben, wie unten gezeigt
Dieses voll geschützte Derivat kann mit wässerigem Natriumhydroxid an der Ureidoverknüpfung hydrolisiert werden. Dies kann durch selektive Acylierung mit beispielsweise Aminosäuren, Hydroxycarbonsäuren oder Dicarbonsäuren umfassend aber nicht beschränkt auf Asparaginsäure, Glutaminsäure, 2- Aminoadipinsäure, Malinsäure, Adipinsäure in Anwesenheit von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gefolgt sein. N-Boc und O- Benzylgruppen können mit milder Säurespaltung und Hydrogenolyse über Palladium auf Holzkohle entfernt werden um die untere Struktur (II) zu erhalten
In einer weiteren Ausführungsform kann die voll geschütze Verbindung (X) mit zahlreichen Isocyanaten abgeleitet aus Aminosäuren umfassend aber nicht beschränkt auf Glycin Alanin, Valin, Phenylalanin, Phenylglycin, Methionin, Normethionin, um 9-Ureidoderivate zu erhalten, behandelt werden. Schützende Gruppen können, wie oben beschrieben, um die Struktur (III) zu erhalten, entfernt werden
wobei R eine natürlich auftretende Aminosäure ist.
In einer weiteren Ausführung wird 2,3-Diaminopropionsäure an der 2-Stellung mit Boc und wässerigem Natriumcarbonat geschützt, um N-2-Boc-2,3-Diaminopropionsäure zu ergeben. Dieses Derivat kann mit Peracetylaldonsäuren acyliert werden umfassend aber nicht beschränkt auf penta-O-Acetyl-D-gluconsäure, penta-O- Acetyl-D-mannonsäure, penta-O-Acetyl-D-galactonsäure, hepta-O- Acetyl-D-erythro-L-mannoactoanonsäure in Anwesenheit von DCC, gefolgt durch Solvolyse der Acetylgruppen und Boc-Gruppen mit von Methylammonium (Chem. Pharm. Bull. 1985, 33: 509-514). Polyhydroxyamidanaloga welche die Struktur (IV) haben, können durch leichte Säurebehandlung erzielt werden
wobei n 1-10 ist. Die gleiche Sequenz kann unter Verwendung von peracetylierter Zucckerdicarbonsäuren, beispielsweise D-Glucaro- 6,3-lacton, angewendet werden um Polyhydroxy mit primären terminalen Carbonsäureamide zu ergeben.
In einer weiteren Ausführung wird ein geschütztes Derivat der 2,3-Diaminopropionsäure mit einem Isocyanat, welches von einem Aminozuckerderivat mit einem Phosgenequivalent abgeleitet ist gekoppelt. In einer Ausführung kann der Aminozucker eine 1- oder 2-Aminohexose (z. B. 1-Amino-1-desoxysorbitol, Glucosamin, Mannosamin) sein, und besitzt die Struktur (V)
wobei n 1-10 ist.
Die Reinigung des Faktors der vorliegenden Erfindung kann durch verschiedene Verfahren die im Fachgebiet bekannt sind, umfassend aber nicht beschränkt auf Chromatographie (z. B. Ionenaustausch, Affinität und Ausschlußchromatographie), elektrophoretische Verfahren, differentielle Löslichkeit, Extraktion und andere Standardtechniken die im Fachgebiet bekannt sind durchgeführt werden.
Die verstärkende Aktivität des Faktors der vorliegenden Erfindung der pestizidalen Aktivität eines von Bacillus abgeleiteteten Pestizids, eines Virus der pestizidale Aktivität besitzt, oder eines chemischen Pestizids gegen zahlreiche Schädlinge, kann unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren, so wie ein Einschluß in eine künstliche Insektenernährung, künstliche Ernährungsüberlagerung, bestreichen von Blättern, betropfen von Blättern und das besprühen von Blättern untersucht werden. Spezifische Beispiele solcher Assays sind angegeben in Abschnitt 6, siehe unten.

5.2. ZUSAMMENSETZUNGEN DIE DEN FAKTOR BEINHALTEN

Der Faktor der vorliegenden Erfindung, der oben beschrieben worden ist, kann mit einem von Bacillus abgeleiteten Pestizid und einem verträglichen Träger in eine pestizidale Zusammensetzung(en) welche beispielsweise eine Suspension, eine Lösung, eine Emuslion, ein Staubpuder, ein zerstreubares Körnchen, ein anfeuchtbares Puder, ein emulgierbares Konzentrat, ein Aerosol oder impregnierte Körnchen ist, zusammengesetzt werden. Beispiele solcher von Bacillus abgeleiteten Pestizide umfassen vorzugsweise, sind aber nicht beschränkt auf, Pestizide die durch Bacillus Thuringiensis subsp. Kurstaki (B. t. k.) (vermarktet als DIPELTM von Abbott Laboratories, Inc., JAVELINTM von Sandoz, BIOBITTM von Novo Nordisk A/S. FORAYTM von Novo Nordisk A/S. MVPTM von Mycogen, BACTOSPEINETM von Novo Nordisk A/S. und THURICIDETM von Sandoz) und Bacillus Thuringiensis subsp. Aizawai (B. t. a.) (vermarktet als FLORBACTM von Novo Nordisk A/S, und XENTARITM von Abbott Laboratories, Inc.) hergestellt werden. Weitere Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Bacillus Thuringiensis subsp. Israelensis (B. t. i.) (vermarktet als BACTIMOSTM von Novo Nordisk A/S und VECTOBACTM von Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus Sphaericus (B. sphr.) (vermarktet als SPHERIMOSTM von Novo Nordisk A/S); Bacillus Thuringiensis Kurstaki/Tenebrionis (vermarktet als FOILTM von Ecogen); Bacillus Thuringiensis Aizawai/Kurstaki (B. t. k./B. t. k.) (vermarktet als CONDORTM von Ecogen und AGREETM von Ciba-Geigy); und Bacillus Thuringiensis Kurstaki/Kurstaki. (B. t. k/B. t. k.) (vermarktet als CUTLASSTM von Ecogen). Der Virus der eine Aktivität gegen Schädlinge besitzt kann ein Baculovirus, z. B. Autographa californica nucleare Hyperhidrose Virus (NPV), Syngrapha falcifera NPV, Cydia pomonella GV (granulosis virus), Heliothis zea NPV, Lymantria dispar NPV, Orgyia pseudotsugata NPV, Spodoptera Exigua NPV, Neodiprion lecontei NPV, Neodiprion sertifer NPV, Harrisina brillians NPV, und Endopiza viteana Clemens NPV, sein.
In Zusammensetzungen welche den Faktor und ein von Bacillus abgeleitetes Pestizid umfassen, kann der Faktor in der Menge von mindestens 0,002 g/BIU vorhanden sein. In einer Ausführung kann der Faktor die Struktur Ia haben und/oder kann in einer Menge von mindestens 0,1 g/BIU oder 0,05 g Faktor pro g Bacillus Delta- Endotoxin und Spore, optionell bis etwa 300 g/BIU oder 150 g Faktor pro g Bacillus Delta-Endotoxin und Spore, vorzugsweise 3 g pro BIU oder 1 g Faktor pro g Bacillus Delta-Endotoxin und Spore vorhanden sein. Wie hierin definiert ist "BIU" milliarden internationale Einheiten, wie durch einen Bioassay nachgewiesen. Der Bioassay vergleicht die Probe mit einem Standard Bacillus Referenzmaterial unter Verwendung von Trichoplusia ni oder anderen Schädlingen als Standardtest Insekt. Die Stärke wird festgestellt in dem der Referenzstandard LC&sub5;&sub0; geteilt und dann mit der Referenzstandardstärke multipliziert wird.
In einer anderen Ausführung kann die Zusammensetzung den Faktor der vorliegenden Erfindung im wesentlichen reiner Form oder einen Überstand von Bacillus in trockener, konzentrierter oder flüssiger Form und einen geeigneten pestizidalen Träger, wovon Beispiele unten beschrieben werden umfassen. Diese Zusammensetzung kann getrennt auf einer Pflanze z. B. transgenische Pflanzen, angewendet werden. Spezifisch kann die Zusammensetzung auf eine Pflanze, die bereits zuvor ein Bacillus, z. B. B. t. Gen enthält, angewendet werden. In einer anderen Ausführung kann die Zusammensetzung auf einer Pflanze angewendet werden die zuvor einer Bacillus-, z. B. B. t.- Zusammensetzung ausgesetzt wurde, die in der Menge von mindestens etwa 0,01% bis etwa 60% vorhanden ist.
Die Zusammensetzung, die den Faktor und einen pestizidalverträglichen Träger umfaßt, kann außer zur Bekämpfung von Schädlingen, auch dazu verwendet werden den Widerstand eines Schädlings gegen ein Pestizid zu vermindern. Alternativ kann die Zusammensetzung um ein von Bacillus abgeleitetes Pestizid zu verstärken verwendet werden. Die Zusammensetzung kann in einer Ausführung zum gleichen Zeitpunkt wie das Pestizid in einer Menge von mindestens etwa 2 g Faktor/BIU bis zu optional etwa 300 g Faktor/BIU angewendet werden. In einer weiteren Ausführung kann die Zusammensetzung, bis zu 24 Stunden nach dem Pestizid als ein Hilfsmittel eingesetzt werden, um die Wirksamkeit des restlichen Pestizids zu erweitern.
Diese oben beschriebenen Zusammensetzungen können durch den Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels, eines inerten Trägers, eines Konservierungsstoffes, eines Benetzungs-mittels, einer Fütterungsstimmulanzie, eines Lockstoffes, eines einbettendes Mittels, eines Binders, eines Emulgators, eines Farbstoffes, eines U. V. Schutzstoffes, eines Puffers, eines Flußmittels, oder anderer Bestandteile erzielt werden, um den Umgang mit dem Produkt und seine Anwendung gegen bestimmte Zielschädlinge zu erleichtern.
Geeignete oberflächenaktiven Mittel umfassen sind aber nicht beschränkt auf anionische Verbindungen wie Carboxylat, beispielsweise ein Metalcarboxylat einer langkettigen Fettsäure; ein N-Acylsarcosinat; mono oder di-Ester der Phosphorsäure mit Fettalkoholethoxylaten oder Salze solcher Ester; fettige Alkoholsulfate wie Natriumdodecylsulfat, Natriumoctadecylsulfat oder Natriumcetylsulfat; ethoxylierte fettige Alkoholsulfate; ethoxylierte Alkylphenolsulfate; Ligninsulfonate; Erdölsulfonate; Alkylarylsulfonate wie Alkyl-Benzolsulfonate oder niedrige Alkylnaphthalensulfonate, z. B. Butylnaphthalensulfonate; Salze von sulfonierten Naphthalen- Formaldehydkondensaten; Salze von sulfonierten Phenol- Formaldehydkondensaten; oder komplexere Sulfonate wie die Amidsulfonate, z. B. das sulfonierte Kondensationsprodukt aus ÖlSäure und N-Methyltaurin oder die Dialkylsulphosuccinate, z. B. das Natriumsulfonat oder das Dioctylsuccinat. Nicht-ionische Mittel umfassen Kondensationsprodukte aus Fettsäureester, Fettalkoholen, Fettsäureamiden oder Fettalkyl- oder Fettalkenylsubstituierten Phenolen mit Ethylenoxid, Fettester von polyhydrierten Alkoholestern, z. B. Sorbitanfettsäureestern, Kondensationsprodukte solcher Ester mit Ethylenoxid, z. B. Polyoxyethylen, Sorbitanfettsäureester, Ethylenoxid- und Propylenoxidblockcopolymeren, acetylenglykole sowie 2,4,7,9- Tetraethyl-5-decyn-4,7-diol, oder ethoxylierte acetylenglykole. Beispiele eines kationischen oberflächenaktiven Mittels umfassen beispielsweise ein aliphatisches mono-, di- oder Polyamin wie ein Acetat, Naphthenat oder Oleat; ein Sauerstoff enthaltendes Amin wie ein Aminoxid von Polyoxyethylenalkylamin; ein amidgebundenes, durch die Kondensation einer carbonsäure mit einem di- oder Polyamin hergestelltes Amin, oder ein quaternäres Ammoniumsalz.
Beispiele inerter Materialien umfassen sind aber nicht beschränkt auf anorganische Mineralien, wie Kaolin, Phyllosilicate, Carbonate, Sulfate, Phosphate oder botanische Materialien wie Kork, gepuderte Maiskolben, Erdnußhüllen, Reishüllen und Walnußschalen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer geeigneten Form zur direkten Anwendung oder als ein Konzentrat oder eine primäre Zusammensetzung, welche eine Verdünnung mit einer geeigneten Menge Wasser oder eines anderen Verdünnungsmittel vor ihrer Anwendung erfordern, sein. Die pestizidale Konzentration variiert in Abhängigkeit der Natur der besonderen Zusammensetzung, insbesondere, ob es sich um ein Konzentrat handelt oder direkt verwendet wird. Die Zusammensetzung enthält 1 bis 98% eines festen oder flüssigen inerten Trägers, und 0 bis 50%, vorzugsweise 0,1 bis 50% eines oberflächenaktiven Stoffes. Diese Zusammensetzungen werden mit der ausgewiesenen Rate für das kommerzielle Produkt verabreicht, vorzugsweise etwa 0,009-4,6 kg/Hektar wenn in trockener Form und etwa 0,012-11,68 Liter/Hektar wenn in flüssiger Form.
In einer weiteren Ausführung kann der Bacillus, z. B. B. t. Delta-Endotoxin Kristall und der verstärkende Faktor vor der Mischung um die pestizidale Aktivität zu verlängern, wenn sie in die Umgebung eines Zielschädlings eingebracht wird, solange diese Vorbehandlung nicht für das Delta-Endotoxin Kristall oder für den Faktor schädlich ist, behandelt werden. Eine solche Behandlung kann mit chemischen und/oder physikalischen Mitteln durchgeführt werden, solange die Behandlung nicht schädlich ist für die Eigenschaften der Zusammensetzung(en). Beispiele von chemischen Reagentien umfassen sind aber nicht beschränkt auf halogenierende Mittel; Aldehyde wie Formaldehyd und Glutaraldehyd; anti-Infektiva, wie Zephiranchlorid; Alkohole wie Isopropanol und Ethanol; und histologische Fixierungsmittel wie Bouin's Fixierungsmittel und Helly's Fixierungsmittel (siehe beispielsweise Humason, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman und Co., 1967).
Die Zusammensetzungen der Erfindung können direkt auf der Pflanze angewendet werden beispielsweise durch Sprühen oder Einstauben zu dem Zeitpunkt wenn der Schädling damit begonnen hat auf der Pflanze zu erscheinen oder vor dem Auftreten von Schädlingen als eine Sicherheitsmaßnahme. Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung zu schützende Pflanzen, umfassen sind aber nicht beschränkt auf Getreide (Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Hirse und verwandte Anbauprodukte); Rüben (Zuckerrübe und Futterrübe), Steinfrüchte, Kernfrüchte und weiche Früchte (Äpfel, Birnen, Pflaumen, Pfirsiche, Mandeln, Kirschen, Erdbeeren, Himbeeren, und Brombeeren), Hülsenfrüchte (Alfalfa, Bohnen, Linsen, Erbsen, Sojabohnen), Ölpflanzen (Raps, Senf, Mohn, Oliven, Sonnenblumen, Kokosnüsse, Rizinußölpflanzen, Kakaobohnen, Erdnüsse), Gurkenfrüchte (Gurke, Kürbisse, Melonen), Faserpflanzen (Baumwolle, Flachs, Hanf, Jute), Zitrusfrüchte (Orangen, Zitronen, Grapefruit, Mandarinen), Gemüse (Spinat, Kopfsalat; Spargel, Kohlköpfe und andere Brassicae, Karotten, Zwiebeln, Tomaten, Kartoffeln, Paprika), Lauraceae (Avocados, Zimt, Camphor), Laub- und Nadelbäume (z. B. Lindenbäume, Eiben, Eichen, Erlen, Pappeln, Birkenbäume, Fichten, Lerchen, Pinien), oder Pflanzen sowie Mais, Torfpflanzen, Tabak, Nüsse, Kaffee, Zuckerrohr, Tee, Reben, Hopfen, Bananen und natürliche Gummipflanzen, sowohl als auch Zierpflanzen. In beiden Fällen ist die bevorzugte Anwendungsart das schichtenweise Sprayen. Es ist im allgemeinen wichtig eine gute Bekämpfung der Schädlinge in frühen Phasen des Pflanzenwachstums zu erreichen da dies der Zeitpunkt ist an dem die Pflanzen am meisten geschädigt werden können. Das Spray oder der Staub können günstigerweise ein anderes Pestizid enthalten, falls dies für notwendig erachtet wird. In einer bevorzugten Ausführung wird die Zusammensetzung der Erfindung direkt auf die Pflanze angewendet.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können gegen Schädlinge umfassend aber nicht beschränkt auf Schädlinge der Art Lepidoptera wirksam sein, z. B. Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Collas eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiose/ta, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Thaumstopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Diptera, e. g. Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygia, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus centans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delle antigua, Delia platura, Delle radicum, Orosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina moristans morsitans, Glossina moristans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Naemagogus equinus, Haematobius irritans, Hypoderma bovis, Hydoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutomyia shannoni Lycoriela mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa; Coleoptera, e. g. Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillla japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitoblus diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor Acari, e. g. Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; Hymenoptera, e. g. Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isoptera, e. g. Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, lncisitermes minor, Incisitermes immigrans; Siphonaptera, e. g. Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalldes canis, Ctenocephalldes felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex. irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; Tylenchida, e. g. Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung dargestellt.

6. BEISPIEL: CHARAKTERISIERUNG VON Ia

Wie hierin ausführlich berichtet, ist Ia aufgesammelt und gereinigt. Die Charakterisierung von Ia wird unten genauer beschrieben.

6.1. AUFSAMMELN UND REINIGUNG VON Ia

Der B. Thuringiensis subsp. Kurstakisstamm EMCC0086 (hinterlegt bei der NRRL als B-21147) wird 72 Stunden lang bei 30ºC in einem Medium bestehend aus einer Kohlenstoffquelle wie Stärke, hydrolisierte Stärke, oder Glukose und einer Stickstoffquelle wie Protein, hydrolisiertes Protein oder Kornsteeplikör gegärt. Die Herstellung von Ia wird nach 13 Stunden innerhalb der Gärung nachgewiesen. Die Spitzenaktivität wird nach etwa 30 Stunden festgestellt.
Der Überstand einer B. Thuringiensis subsp. Kurstakigärung wird durch Zentrifugieren aufgesammelt und dann durch Ultrafiltration mit einer 30kDa MW-CO Membrane, unter Verwendung einer Rhone Poulenc UF Vorrichtung geklärt. Die 30kDa Filtration entfernte jeglichen übriggebliebenen Zelldebri, kristallines Delta-Endotoxin, Sporen und lösliches Protein welches eine größere molekulare Masse als 30kDa besaß. Das Permeat wird durch Verdampfung 10-fach konzentriert. Das Permeat wird zentrifugiert und dann 0,2u gefiltert um weitere unlösliche Stoffe aus der Brühe zu entfernen, wobei eine klare Brühe übrig bleibt, die Ia enthält.
Die Reinigung von Ia zur Homogenität wird erreicht unter Verwendung eines Mehrschrittreinigungsverfahrens, das schematisch in Abb. 1 dargestellt ist. Mit dem Aufsammelprotokoll das oben umrissen ist, schritt die Reinigung mit einem 5kDa Ultrafiltrationsschritt fort. Das Permeat der 5kDa Ultrafiltration wird auf ein Sulfopropyl (SP) Kationenaustauscherharz adsorbiert und mit einer Ammoniumacetatlösung eluiert. Die Verbindung wird dann durch Lyophilisation ca. 30-fach konzentriert, und das Salz und andere Verunreinigungen werden mit einer BioRad P2 Größenausschlußsäule entfernt. Der Pool aus der P2 Säule wird über eine hochauflösende SP HPLC Kationenaustauschersäule getrieben, was zu einer homogenen Verbindung führte. Das verunreinigende Salz wird durch wiederholte Lyophilisation entfernt.
Die Aktivität wird durch einen Spodoptera Exigua Mikrobioassay kontrolliert und die Reinheit wird durch kapillare Elektrophorese festgestellt. Aus BIOBITTM FC (100 ul) gereinigte Proben die aus 50 ul Ia und 50 ul CrylA(c) Protein (15 ug/ml) gereinigt bestanden, wurden in separate Kammern einer Gelatinetablette, welche 500 ul gefestigter künstlicher Insektennahrung enthielt, aufgetragen. Die Tabeletten die die verschiedenen Proben enthalten sind luftgetrocknet. Zwei bis vier. 2te oder frühe 3 tagige Spodoptera Exigua werden den Kammern hinzugefügt, welche die getrockneten Proben enthalten. Die Kammern werden mit Mylar versiegelt, es werden Löcher gestochen und sie werden 2-3 Tage bei 30ºC gezüchtet. Das Ausmaß der Verkümmerung und der Prozentsatz der Mortalität werden dann aufgezeichnet. Üblicherweise werden 5 identische Kammern durchgeführt führ jede Probe.

6.2. AUFKLÄRUNG DER STRUKTUR

Die aktive Verbindung ist nachweislich wasserlöslich aber nicht im organischen Lösungsmittel löslich. Sie ist positiv geladen und reagiert mit Ninhydrin wie durch Silicadünnschichtchromatographie bewiesen. ¹³C und Protonen NMR der Verbindung sind in den Abb. 2 bzw. 3 gezeigt. ¹³C NMR Experimente zeigten das Vorhandensein von 13 Kohlenstoffatomen. Ein DEPT- Experiment wies nach das es drei quartäre Kohlenstoffe (C), sieben Methine (CH), drei Methylene (CH&sub2;) und keine Methylgruppen (CH&sub3;) gibt. Unter Verwendung von Protonenkopplungsexperimenten sowie 1-D Entkopplung und COSY, wurde ein großes Drehsystem welches acht Kohlenstoffatome enthält, identifiziert. Zusätzlich gibt es ein kleineres Drehsystem welches aus zwei Kohlenstoffen besteht. Ein zweidimensionales Kohlenstoffprotonenkorrelationsexperiment (HETCOR) erlaubte die Zuordnung jeder Protonenresonanz in dem Molekül zu seinem angehefteten Kohlenstoff (siehe Abb. 4).
Die Behandlung der aktiven Verbindung (13 mg) mit acetanhydrid in Pyridin führte zur Bildung eines acetylierten Derivates welches wesentlich weniger polar ist. Dieses Derivat wird durch HPLC gereinigt um 3 mg eines reinen acetylierten Derivates zu ergeben. Die Massenspektroskopieanalyse zeigte, daß das Derivat 7 Acetat und ein molekular Gewicht von 690 hat, was ein molekulares Gewicht von 396 ergibt und anzeigt das eine gerade Zahl von Stickstoffen vorhanden ist. Ebenfalls wurden Fragmente von 6 Acetaten und 5 Acetaten nachgewiesen. Die Hochauflösungsdaten für 5 und 6 Acetattochterionen sind 645.2594 (6 Acetate) und 607.2519 (5 Acetate) welche die folgende molekulare Formel für Ia anzeigen: C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub8;N&sub6;O&sub8;.
Die Behandlung der aktiven Verbindung (13 mg) mit 6 N HCl ergab ein Derivat welches Ninhydrin positiv ist. Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Amidbindungen. Das Derivat hat den gleichen Rf Wert wie durch Dünnschichtchromatographie für die 2,3-Diaminopropionsäure nachgewiesen worden ist. Diese Ergebnisse zusammen mit dem NMR-Daten zeigen das Vorhandensein von 2,3 diaminopropionsäure an.
Die folgende Strukturformel wurde aufgedeckt für Ia:
Es kann als ein Ureidoamid klassifiziert werden. Die Bestandteile beinhalten 2 Carboxyle (1 amidiert), einen Harnstoff, drei Amine und vier Hydroxyle. Es enthält sieben chirale Zentren.

6.3. EIGENSCHAFTEN VON Ia

Es wurde nachgewiesen daß das isolierte Ia die Aktivität von Bacillus Thuringiensis subsp. Kurstaki und Bacillus Thuringiensis subsp. Aizawai Kristall Delta-Endotoxine pestizidalen Proteinen gegenüber Spodoptera Exigua unabhängig von der Form der pestizidalen Proteine verstärkt. Die pestizidalen Aktivitäten von gebildeten B. t. k., isolierten Kristallen, voller Länge (130 kDa molekulare Masse) oder gekürzter CryIA Proteinen (~65 kDa molekulare Masse) werden alle verstärkt. Die Aktivitäten von Cryll und CryIC Einschlüsse werden ebenfalls verstärkt. Es wurde ebenfalls herausgefunden das die Aktivität der individuell gekürzten CryIA(a), (b) und (c) Proteine verstärkt wird. Nachweislich ist die Inkubationszeit von Ia, mit dem Cry Protein nicht kritisch für die Bioaktivität. Jedoch ist Ia allein inaktiv. Das Ausmaß der Verstärkung ist nachweislich 100-200-fach für die gekürzten CryIA Proteine, CryII und CryIC Einschlüsse und etwa 320-fach mit CryIA(c) mit voller Länge (siehe jeweils Tabellen I und II). Insbesondere erzeugten 0,75 ug/ml CryIA(c) mit dem Protein voller Länge den gleichen Insektenmortalitäts/Verkümmerungsergebnis wenn. Ia hinzugefügt wurde, wie 240 ug/ml CryIA(c) alleine. In dem Fall des gekürzten CryIA(c), gab ein OD&sub2;&sub8;&sub0; von 0,0006 das gleiche Verkümmerungsergebnis in Verbindung mit Ia wie die gleiche Probe von CryIA(c) alleine getestet mit einem OD&sub2;&sub8;&sub0; von 0,075. CryII Einschlüsse, in einer Konzentration von 0,6 ug/ml ergaben das gleichen Verkümmerungsergebnis und ähnliche Mortalität in Verbindung mit Ia, wie das CryII Protein alleine bei 75 ug/ml, was eine 125-fache Verstärkung ist. CryIC Einschlüsse bei 0,3 ug/ml mit den Zusatz von Ia ergaben ähnliche Mortalitäten und Verkümmerungsergebnis wie 75 ug/ml des CryIC Proteins alleine, was ein 250-faches Niveau der Verstärkung darstellt. Die Konzentration des CryIA Proteins das Verkümmerung erzeugte, lieferte Mortalität bei Zusatz von Ia.
Ia ist nachweislich stabil beim Kochen für 5 Minuten, verliert jedoch die gesamte Aktivität beim Vorgang des autoklavierens (> 190ºC). Weiterhin ist es stabil wenn es direktem Sonnenlicht für mindestens 10 Stunden ausgesetzt wird. Ia ist bei einem ph von 2 über 3 Tage stabil, jedoch instabil bei pH 12. Nachweislich verliert er seine gesamte Aktivität wenn es Periodsäure oder konzentrierter HCl ausgesezt wird. TABELLE I VERSTÄRKUNGSWIRKUNGEN VON Ia MIT GEREINIGTEM GEKÜRZTEM Bt PROTEIN
* Mortalität = Anzahl der toten Insekten dividiert durch die Anzahl der gesamten Insekten nach 2 Tagen.
Der Verkümmerungsergebnis wird definiert durch die durchschnittliche Größe der lebendingen Insektenlarven am Ende des Bioassays: 4.0 = unbehandelte Kontrolle, 3.0 = 75% Größe der unbehandelten Kontrolle, 2,0 = 50% Größe der unbehandelten Kontrolle, 1,0 = 25% der unbehandelten Kontrolle, 0,0 = kein Wachstum oder unveränderte Größe seit Beginn des Experimentes. TABELLE II VERSTÄRKUNGSWIRKUNGEN VON Ia MIT Bt PROTEIN
* Mortalität = Anzahl der toten Insekten dividiert durch die Anzahl der gesamten Insekten nach 2 Tagen.
Der Verkümmerungsergebnis wird definiert durch die durchschnittliche Größe der lebendingen Insektenlarven am Ende des Bioassays: 4.0 = unbehandelte Kontrolle, 3.0 = 75% Größe der unbehandelten Kontrolle, 2,0 = 50% Größe der unbehandelten Kontrolle, 1,0 = 25% der unbehandelten Kontrolle, 0,0 = kein Wachstum oder unveränderte Größe seit. Beginn des Experimentes.

6.4. BEURTEILUNG ANDERER UNTERARTEN VON Bacillus Thuringiensis UND ANDERER Bacillusarten

Einige Bacillusspezies werden beurteilt hinsichtlich ihrer Produktion von Ia. Die Stämme werden 72 Stunden lang bei 30ºC in einem Medium gegärt, welches aus einer Kohlenstoffquelle sowie Stärke, hydrolisierte Stärke oder Glukose und einer Stickstoffquelle sowie Protein, hydrolisiertes Protein oder Kornstepplikör besteht. Die Überstände werden hinsichtlich ihrer Ia Produktion unter Verwendung des Spodoptera Exigua mikro- Bioassays der oben beschrieben wurde untersucht. Der B. Thuringiensis subsp. Aizawaistamm EMCC0087 (hinterlegt bei der NRRL als NRRL B-21148) und B. Thuringiensis subsp. Galleriae (hinterlegt bei der NRRL) haben nachweislich eine Produktion von Ia in etwa derselben Konzentration wie B. Thuringiensis subsp. Kurstaki.
Ia wird ebenfalls von B. Subtilis, B. Cereus, B. t. subsp. Alesti, B. t. subsp. Canadiensis, B. t. subsp. Darmstadiensis, B. t. subsp. Dendrolimus, B. t. subsp. Entomocidus, B. t. subsp. Finitimus, B. t. subsp. Israelensis, B. t. subsp. Kenyae, B. t. subsp. Morrisoni, B. t. subsp. Subtoxicus, B. t. subsp. Tenebrionis, B. t. subsp. Thuringiensis, and B. t. subsp. Toumanofft, B. Cereus, B. Subtilis, and B. Thuringiensis subsp. Kurstaki cry- spo- Mutante produziert, wie durch kapillare Elektrophorese, nachgewiesen.
Spezifisch wird ein Beckman P/ACE Kapillarelektrophorese System, ausgestattet mit einer 50 um · 57 cm unbeschichteten Kapillare, 0,2M Phosphat pH 6,8 Puffer, Spannung bei 15KV und Nachweis 200 nm, zur Bestimmung des Niveaus von Ia verwendet. Die Probenvolumina sind 20n1 mit einer Laufzeit von 25 Minuten.
Eine Standardkurve wird unter Verwendung von gereinigten Ia als der Standard bei Niveaus von 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml und 0,078 mg/ml erzeugt. Es wird eine lineare Eichkurve erzeugt. Die entstehende y = mx + b Gleichung wird verwendet um die Konzentraton von Ia in jeder Probe zu erzeugen.
Vor jedem Durchlauf wird die kapillare drei Minuten lang mit Laufpuffer (0,2M Phosphat, pH 6,8) gespült. Nach jedem 25 Minuten Durchlauf wird die kapillare 1 Minute lang mit 1 N NaOH, 1 Minute mit gefiltertes HPLC Wasser, 3 Minuten mit 0,5M phosphorische Säure, und 1 Minute lang mit gefiltertem HPLC Wasser gespült. Der Bereich unter jedem Ausschlag wird intigriert und der Spitzenbereich wird festgestellt und eine endgültige Konzentration aus der Standardkurve berechnet.

6.5. BEURTEILUNG VON B. t. PRODUKTEN

Die in verschiedenen kommerziell verfügbaren B. t. Produkten, Menge an Ia wird dürch kapillare Elektrophorese, wie in Abschnitt 6. 4 oben beschrieben bestimmt. BACTOSPEINETM, JAVELINTM, NOVODORTM, SPHERIMOSTM, BACTIMOSTM, FORAYTM, FLORBACTM und BIOBITM werden erhalten von Novo Nordisk A/S. XENTARITM und DIPELTM werden erhalten von Abbott Laboratories. AGREETM wird erhalten von Ciba- Geigy; MVPTM wird erhalten von Mycogen und CUTLASSTM wird erhalten von Ecogen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III unten dargestellt und zeigen daß Ia in verschiedenen Mengen im Bereich von weniger als 0,001 g Ia/BIU bis 0,71 g Ia/BIU enthalten ist. TABELLE III Ia IN Bacillus Thuringiensis PRODUKTEN

6.6. ERNÄHRUNGSEINSCHLUß BIOASSAY

Die B. t. k. Aktivität wird nachgewiesen durch einen künstlichen Ernährungseinschluß Bioassayuntersuchung, unter Verwendung von dreitägigen Spodoptera Exigualarven, zweitägigen Helicoverpa Zealarven, dreitägigen Spodoptera Frugiperdalarven, zweitägigen Heliothis Virescenslarven, dreitägigen Trichoplusia Nilarven, dreitägigen Pseudoplusia Includenslarven, dreitägigen Plutella Xylosteillalarven, dreitägigen Spodoptera Littoralis, und dreitägigen Mamestra Brassicaelarven.
Um das Niveau der Verstärkung, welches durch den Zusatz von Ia zu B. t. Produkten erzielt wird, und um den Bereich der betroffenen Insekten festzustellen, werden Ernährungseinschlußbioassays durchgeführt. In den Experimenten mit höheren Konzentrationen von Ia gegen Spodoptera Exigua (7.4- 23.7 g Ia/BIU), wird gereinigtes Ia (70% aktiver Inhaltsstoff, 30% Acetat gegen Ionen) verwendet um BIOBITTM FC (FC bedeutet fließfähiges Konzentrat) zu verstärken. Die übrigen Daten die in Tabelle IV dargestellt sind, zeigen die Verstärkung von BIOBITTM HPWP (hochpotenzanfeuchtbares Puder) mit Ia (0,658% aktiver Inhaltsstoff). S. Littoralis und M. Brassicae werden unter Verwendung von FLORBACTM HPWP und Ia untersucht.
Die verschiedenen B. t. Produkte werden abgewogen und Ia wird hinzugegeben um 0,1 bis 237 g Ia/BIU zu ergeben. Das Volumen wird mit 0,1% TweenTM angepaßt. Die Proben werden 1 Minute beschallt und dann auf ein endgültiges Volumen verdünnt. Leere Proben (ohne Ia) und Bezugssubstanzen werden ebenfalls vorbereitet. Die Bezugssubstanzen umfassen B. t. k. HD-1-S-1980 (erhalten von der NRRL) welches eine Verstärkung von 16,000 internationalen Einheiten (IU) pro Milligramm zugeordnet sind und JAVELINTM WG welches eine Verstärkung von 53,000 Spodoptera Einheiten/mg (SU) zugeordnet wurde.
Eine künstliche Standardernährung bestehend aus Wasser, Agar, Zucker, Casein, Weizenkeimen, Methylparaben, Sorbinsäure, Leinsamenöl, Zellulose, Salzen und Vitamine wird in einem geheizten 20L Kessel hergestellt. Diese liefert genug Nahrung um 10 bis 12 Proben mit sieben unterschiedlichen Konzentrationen jeder Testsubstanz zu untersuchen. Die B. t. Lösungen werden seriell verdünnt um 16 ml Teile zu ergeben. Jedes Teil wird zu 184 g geschmolzener Nahrung hinzugefügt. Die Mischung wird anschließend homogenisiert und dann in ein Plastiktablett, welches 40 einzelne Zellen enthält gegossen. Drei Kontrolltabletts werden für jede Nahrungsladung hergestellt.
Sobald die Nahrung ausgekühlt ist und fest geworden ist, wird ein Insekt eines bekannten Alters (2-3 tägig) jeder Zelle hinzugefügt und die Tabletts werden mit einem perforiertem klarem Mylar Blatt abgedeckt. Die Tabeletts werden auf Ständer gestellt und vier Tage bei 28ºC und 65% relativer Feuchtigkeit gezüchtet.
Nach vier Tagen wird die Mortalität der Insekten bemessen. Jedem Tablett wird ein harter Schlag gegen eine Tischoberläche versetzt und Larven, die sich nicht bewegen, werden als tot gezählt. Die prozentuale Mortalität wird berechnet und die Daten werden durch eine parallele Probitanalyse analysiert. LC&sub5;&sub0;s, LC&sub9;&sub0;s, die Schräge der Regressionslinien, der Variationskoeffizient, und die Verstärkung werden geschätzt. Die Proben werden mindestens drei mal oder solange bis drei Verstärkungen innerhalb 20% eines berechneten Mittelwertes für jede Probe liegen, durchgeführt. Um die Erhöhung der Aktivität in Verbindung mit jeder Konzentration von Ia, zu berechnen wird der LC50 der B. t./Ia Probe korrigiert um die Menge von B. t. in der Probe zu spiegeln. Die LC&sub5;&sub0; s der gepaarten reinen Proben werden geteilt durch die korrigierten LC&sub5;&sub0; Werte um die x-fache Reduktion in LC&sub5;&sub0;, die mit Ia in Verbindung ist zu ergeben.
Das folgende Verfahren wird verwendet um ein Assay für Lobesia Bothrana durchzuführen. Weintrauben, die von Lobesia Bothrana befallen sind werden in einem nicht besprühten Feld gesammelt und die Larven werden entfernt. Eine Verdünnungsserie von Ia (250 ug/ml, 500 ug/ml und 1000 ug/ml) wird in Wasser erstellt. Eine Larve wird in die Mitte der Petrischale gesetzt. Wenn beobachtet wird das die Larve trinkt wird sie in eine Petrischale mit frisch geschnittenen Weintrauben versetzt. Die Larven werden 22ºC 3-4 Tage aufbewahrt.
Wie in Tabelle IV gezeigt werden signifikante Reduktionen in LC&sub5;&sub0;s beobachtet für alle Spezies. TABELLE IV Ernährungseinschuß Bioassas TABELLE IV Ernährungseinschuß Bioassas
Die Verstärkung zahlreicher Produkte gegen Spodoptera Exigua durch Ia, wird nachgewiesen unter Verwendung der Ernährungseinfluß Bioassays, die oben beschrieben sind nachgewiesen. Die Mengen von Ia, die hinzugefügt wurden pro BIU Produkt sind unten in Tabelle V dargestellt. Die Ia/B. t. Produktmischung wird in eine agar-bestehende Weizenkeimcaseinnahrung eingesetzt. Die Insekten werden vier Tage lang auf. diese Ernährung gesetzt und bei 28ºC gehalten. Die Mortalität wird aufgezeichnet und analysiert unter Verwendung einer Probe mit Analyse. LC50, LC90 und Verstärkung werden aus einem entsprechenden Produkt berechnet, wobei Ia fehlt. Die Ergebnisse die in Tabelle V gezeigt sind zeigen an daß Ia zahlreiche B. t. k. und B. t. a. Produkte die von verschiedenen Quellen erhalten wurden verstärkt. Die B. t. Stämme die in diesen Produkten enthalten sind, sind in Abschnitt 5.2 beschrieben. siehe oben.
TABELLE V Verstärkung von B. t. Produkten gegen Spodoptera Exigua

6.7. BLATT BIOASSAYS

Blatt Bioassays werden mit zweitägigen Spodoptera· Exigua Larven auf Broccolipflanzen unter Verwendung von BIOBITTM FC und Ia durchgeführt. Das Verhältnis von Ia zu BIOBITIM FC ist die gleiche 2 g Ia/BIU BIOBITTM FC. Die Behandlungen werden auf Broccolipflanzen aufgetragen mittels eines Bahnssprayers in einem Trägervolumen von 20 Gallonen pro Hektar Land. Die Blätter werden von den Pflanzen abgeschnitten nach dem die Sprayablagerung getrocknet ist, und mit zweitägigen Spodoptera Exigua Larven verseucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI unten dargestellt. 100% Mortalität wird bei einem Verhältnis von 8,7 BIU/Hektar BIOBITTM FC + Ia beobachtet, wogegen BIOBITTM FC alleine 92% der Larven bei 58,8 BIU/Kektar und 8% bei 17,6 BIU/Hektar tötete. Behandelte Pflanzen werden ebenfalls direkt von dem Sonnenlicht 8 Stunden lang ausgesetzt, nach denen die Blätter abgeschnitten und verseucht werden. Nach acht Stunden im Sonnenlicht ergibt BIOBITTM FC alleine bei 58,8 BIU/Hektar eine Mortalität von 27%, wogegen BIOBITTM FC + Ia 100% Mortalität bei 8,7 BIU/Hektar ergab.
Ein Blattassay der mit frühen viertägigen Larven durchgeführt wurde zeigte BIOBITTM FC alleine mit 75% Mortalität bei 52 BIU/Hektar, und BIOBITTM FC (FC bedeutet fließfähiges Konzentrat) mit + Ia ergab 100%ige Mortalität bei 13 BIU/Hektar. TABELLE VI Blatt Bioassays

6.8. FELDVERSUCHE

Feldversuche auf Garbonzobohnen (Spodoptera Exigua) zeigten daß BIOBITTM FC alleine bei 70 BIU/Hektar eine 51%ige Schädlingsbekämpfung ergab wobei 2 g Ia/BIU BIOBITTM FC bei 40 BIU/Hektar eine 89%ige Schädlingsbekämpfung lieferte (verglichen zur unbehandelten Fläche). JAVELINTM WG bei 45 BIU/Hektar ergab eine 51%ige Schädlingsbekämpfung.
Feldversuche auf Gemüsemais (Spodoptera Frugiperda) zeigten daß bei 39,5 BIU/Hektar, 2 g Ia/BIU BIOBITTM FC 84% Schädlingsbekämpfung lieferten.

6.9. WIEDERSTANDSVERHÄLTNISSE

Kolonien von empfindlichen und resistenten Plutella Xylostella werden einem Bioassay unterzogen. Die resistenten Motten sind im Feld aufgesammelte Proben aus Florida welche einen B. t. Widerstand nach intensiver Aussetzung gegen JAVELINTM WG entwickelt haben. BIOBITTM HPWP mit Ia wird analysiert unter Verwendung eines Blattropfenbioassays. Die Resistenz gegen JAVELINTM und XENTARITM wird einem Assay ohne Ia unterzogen. Hohe Blattscheiben mit sechs Zentimeter Durchmesser werden 10 Sekunden in eine von acht unterschiedlichen Konzentrationen von B. t. Produkten oder B. t./Ia Zusammensetzungen eingetaucht. Die Konzentrationen reichen von 1 bis 1000 ppm. Die Blattscheiben werden an der Luft zwei Stunden lang getrocknet und im Plastikpetrischalen mit zweitägigen (0,2 bis 0,4 mg) Larven gesetzt. Fünfundzwanzig Insekten/Dosis/Tage werden zwei mal wiederholt um 50 Insekten/Dosis zu ergeben. Nach 72 Stunden bei 27ºC wird die Mortalität aufgezeichnet. Die Dosen Mortalitätsregression wird mit der Probeanalyse analysiert. Die Widerstandsverhältnisse werden berechnet in dem die LC&sub5;&sub0; und LC&sub9;&sub0; Werte der empfindlichen Motten geteilt werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII gezeigt und zeigen daß das BIOBITTM HPWP verstärkt wird mit 2 g Ia/BIU und 4 g Ia/BIU. Spezifisch besteht mit 4 g Ia/BIU eine 2-fache Abnahme des LC&sub5;&sub0; Widerstandsverhältnisses und eine 10-fache Abnahme des LC&sub9;&sub0; Widerstandsverhältnis. TABELLE VII Plutella Xylostella (B. t. k. Resistent) Widerstandsverhältnisse
TABELLE VII Plutella Xylostella (B. t. k. Resistent) Widerstandsverhältnisse

7. HINTERLEGUNG DER MIKROORGANISMEN

Die folgenden Stämme von Bacillus Thuringiensis wurden gemäß dem Budapest Vertrag in der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA hinterlegt.
Die Stämme wurden unter Bedingungen hinterlegt, die sichern daß der Zugang zu der Kultur möglich sein wird, während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung zu jemanden, der festgelegt wird durch das Ausschußmitglied, Notar der Patente und Warenzeichen, der dazu berechtig ist, gemäß 37 C. F. R. §1.14 und 35 U. S. C. §122. Die Hinterlegung stellt eine im wesentliche reine Kultur jedes hinterlegten Stammes dar. Die Hinterlegung ist verfügbar wie nach dem ausländischen Patentrecht in Ländern in denen Gegenstücke der vorliegenden Anmeldung oder seine Ableger eingereicht werden erforderlich. Jedoch soll klar gemacht werden daß die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz zur Durchführung der zugrunde liegenden Erfindung darstellt, in Abbruch mit Patentrechten die durch Handlungen der Regierung gesichert sind.

Claims

1. Faktor, der aus dem Fermentationsüberstand eines Bacillus Stammes erhältich ist und der die pestizide Aktivität eines von Bacillus Thuringiensis abgeleiteten Pestizides erhöht, wobei der Faktor 13 Kohlenstoffe enthält, wasserlöslich ist, bei 100ºC mindestens 5 Minuten lang stabil ist, gegenüber ultraviolettem Licht mindestens 10 Stunden lang stabil ist, und der bei einem pH-Wert von 2 während 3 Tagen stabil ist.

2. Faktor nach Anspruch 1, wobei der Faktor ¹H NMR Verschiebungen bei 1.5, 3.22, 3.29, 3.35, 3.43, 3.58, 3.73, 3.98, 4.07, 4.15, 4.25, 4.35 aufweist.

3. Faktor nach Anspruch 1, wobei der Faktor ein Molekulargewicht von 350 bis 700 besitzt.

4. Faktor nach Anspruch 1, wobei das von Bacillus Thuringiensis abgeleitete Pestizid einen Bacillus Thuringiensis-Stamm und einen verträglichen Träger umfaßt.

5. Faktor nach Anspruch 1, wobei das von Bacillus Thuringiensis abgeleitete Pestizid eine Spore eines Bacillus Thuringiensis- Stammes und einen für ein Pestizid verträglichen Träger umfaßt.

6. Faktor nach Anspruch 1, wobei das von Bacillus Thuringiensis abgeleitete Pestizid ein Protein eines Bacillus Thuringiensis- Stammes oder ein Fragment davon umfaßt, das eine Aktivität gegen einen Schädling besitzt, und einen für ein Pestizid verträglichen Träger umfaßt.

7. Faktor nach Anspruch 6, wobei das Protein des Bacillus Thuringiensis-Stammes das Bacillus Thuringiensis delta-Endotoxin ist.

8. Ein Faktor, der die Struktur (I):

aufweist, worin R¹ eine Amino-, Hydroxy-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl-, Benzamid-, 3,5-Dinitrobenzamid-, p-Nitrobenzamid-, Halobenzamid-, Alkylbenzamid-, Thiophenamid-, Furanamid-, Pyrrolamid-, Imidazolamid-, Pyrazolamid-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylamino-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Dialkylamino-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl- oder Benzylester-, Halogen- oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkoxygruppe ist;

R² (CH&sub2;)n ist, wobei n eine ganze Zahl von 0-10 ist;

R³ und R&sup4; unabhängig (NH)p sind, wobei p gleich 0 oder 1 ist;

R&sup5; gleich

oder (CHOH)qCH&sub2;OH ist,

wobei X¹, X², X³, X&sup4;, X&sup5;, X&sup6;, und X&sup7; unabhängig gleich NH&sub2;, OH, Actyl, Halogen oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkoxy sind, und wobei q eine ganze Zahl von 1-10 ist;

R&sup6; eine Hydroxyl-, Amino-, eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0; Alkoxy- oder Benzoxy-, Benzylester-, 3,5-Dinitrobenzylester-, p-Nitrobenzylester-, Halobenzylester-, Alkylbenzylester-, Thiophenester-, Furanester-, Pyrrolester-, Imidazolestergruppe ist; oder ein für ein Pestizid verträgliches Salz davon.

9. Faktor nach Anspruch 8, wobei der Faktor die Struktur (Ia) besitzt:

10. Faktor, der die pestizide Aktivität eines von Bacillus abgeleiteten Pestizids erhöht, wobei der Faktor oder das Derivat davon durch folgende Schritte erhältlich ist: (a) Fermentation eines Bacillus-Stammes; (b) Gewinnen des Fermentationsüberstandes von (a); und (c) das Isolieren des Faktors oder der Derivate davon aus dem Überstand von (b).

11. Faktor nach Anspruch 10, wobei der Faktor aus einem Fermenationsüberstand von Bacillus Subtilis erhalten wird.

12. Faktor nach Anspruch 10, wobei der Faktor aus einem Fermentationsüberstand von Bacillus Cereus erhalten wird.

13. Faktor nach Anspruch 10, wobei der Faktor aus einem Fermentationsüberstand von Bacillus Thuringiensis erhalten wird.

14. Faktor nach Anspruch 13, wobei der Faktor aus einem Fermentationsüberstand einer Subspezies von einem Bacillus Thuringiensis erhalten wird, der aus der Gruppe gewählt ist, die aus Bacillus Thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus Thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae oder Mutanten davon besteht, die im wesentlichen die gleiche pestizide Aktivität besitzen.

15. Faktor nach Anspruch 13, wobei der Faktor aus einem Fermentationsüberstand von Bacillus Thuringiensis subsp. kurstaki oder Mutante davon, die eine pestizide Aktivität besitzt, erhalten wird.

16. Faktor nach Anspruch 13, wobei der Faktor aus einem Fermentationsüberstand einer cry-spo Mutante von Bacillus Thuringiensis subsp. Kurstaki erhalten wird.

17. Pestizide Zusammensetzung, die (a) den Faktor von Anspruch 1 und (b) ein von Bacillus Thuringiensis abgeleitetes Pestizid umfaßt, in dem der Faktor in der Zusammensetzung in der Menge von mindestens 0,1 g pro BIU enthalten ist.

18. Pestizide Zusammensetzung, die (a) den Faktor von Anspruch 1 und (b) ein von Bacillus Thuringiensis abgeleitetes Pestizid umfaßt, wobei der Faktor in der Zusammensetzung in der Menge von mindestens 0,05 g pro Gramm Bacillus Thuringiensis delta- Endotoxin und Spore vorhanden ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Zusammensetzung weiterhin einen Virus enthält, der eine Aktivität gegen einen Schädling aufweist, und wobei der Faktor weiterhin die pestizide Aktivität eines Virus, der eine Aktivität gegenüber einem Schädling besitzt, verstärkt.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18 wobei der Bacillus Thuringiensis aus der Gruppe gewählt ist, die aus Bacillus Thuringiensis subsp. kurstaki und Bacillus Thuringiensis subsp. Aizawai besteht.

21. Pestizide Zusammensetzung, die (a) den Faktor aus Anspruch 1 und (b) einen Virus, der eine Aktivität gegenüber einem Schädling besitzt, umfaßt.

22. Pestizide Zusammensetzung, die (a) den Faktor aus Anspruch 1 und (b) einen pestiziden Träger umfaßt, wobei der Faktor in der Zusammensetzung in der Menge von mindestens 0,01 Gewichtsprozent vorhanden ist.

23. Verfahren zur Schädlingsbekämpfung, das das Aussetzen des Schädlings mit einer schädlingsbekämpfenden Menge der pestiziden Zusammensetzung nach Anspruch 17, 18, 21 oder 22 umfaßt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Schädling auf einer transgenen Pflanze auftritt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die transgene Pflanze ein Bacillus Thuringiensis Gen enthält.

26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Pflanze zuvor mit einem von Bacillus Thuringiensis abgeleiteten Pestizid ausgesetzt wurde.

27. Verfahren zur Potenzierung der pestiziden Aktivität eines von Bacillus Thuringiensis abgeleiteten Pestizids, das den Schritt umfaßt, einem Schädling, der einem von Bacillus Thuringiensis abgeleiteten Pestizid ausgesetzt war, die Zusammensetzung nach Anspruch 22 in einer Menge zu verabreichen, die wirksam ist, um die pestizide Aktivität des von Bacillus Thuringiensis abgeleiteten Pestizids zu verstärken.

28. Verfahren zum Erhalt des Faktors nach Anspruch 1, das folgende Schritte umfaßt:

(a) die Fermentation eines Bacillusstammes;

(b) das Gewinnen des Fermentationsüberstandes von (a); und

(c) das Isolieren des Faktors aus dem Überstand von (b), um einen im wesentlichen reinen Faktor zu erhalten.

29. Verfahren zur Identifizierung des Faktors nach Anspruch 1, das folgende Schritte umfaßt:

(a) die Fermentation eines Bacillus-Stammes;

(b) die Gewinnung des Fermentationsüberstandes von (a); und

(c) die Untersuchung des Überstandes von (b) im Hinblick auf die Verstärkung eines von Bacillus abgeleiteten Pestizids.

30. Eine Mutante oder Variante eines Bacillus-Stammes, die den Faktor nach Anspruch 1 produziert.

31. Verfahren zur Gewinnung der Mutante oder Variante nach Anspruch 30, das folgende Schritte umfaßt:

(a) das Behandeln des parenteralen Stammes mit einem Mutagen,

(b) das Anzüchten des mutierten parenteralen Stammes auf einem Medium, das für die Auswahl eines Mutantenstammes geeignet ist; und

(c) die Selektion des Mutantenstammes.