JPH08501798A - バシラス菌殺虫活性の増強剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子並びに前記因子の単離および同定方法に関する。本発明は更に、該因子を含んで成る殺虫剤組成物、並びに害虫を防除するため、殺虫剤に対する害虫の抵抗性を減少させるため、およびバシラス菌系殺虫剤を増強するための前記殺虫剤組成物の利用法に関する。本発明の因子はバシラス菌製剤から得ることができる。最も特別の態様では、前記因子は構造（Ｉａ）を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 バシラス菌殺虫活性の増強剤 １．発明の分野 本発明は、バシラス菌系殺虫剤、化学殺虫剤および／または殺虫性のあるウイ ルスの殺虫活性を増強する因子、並びに該因子を得る方法に関する。更に、本発 明は、前記因子と殺虫剤担体、または前記因子とバシラス菌系殺虫剤、化学殺虫 剤および／または殺虫性のあるウイルスとを含んで成る殺虫剤組成物、並びにそ のような組成物の使用方法に関する。本発明は更に、そのような因子が親株より も多量に得られるかまたは大きな増強活性を有する変異バシラス菌株およびその ような変異株の生産方法にも関する。 ２．発明の背景 食物、織物および様々な家庭植物を含む世の中の商業上重要な作物のかなりの 部分が毎年害虫感染の損害を受け、数百万ドルの損失をもたらしている。そのよ うな害虫を防除しようとして様々な方策が用いられている。 １つの方策は広域スペクトル殺虫剤、即ち広域活性を有する化学殺虫剤の使用 である。しかしながら、そのような化学殺虫剤を使うには多数の欠点がある。広 域スペクトル活性のため、それらの殺虫剤は標的でない生物、例えば有益な昆虫 や破壊的害虫寄生体も殺傷してしまうことがある。その上、それらの化学殺虫剤 は動物や人間に対してしばしば毒性であり、そのような物質に繰り返し暴露する と標的害虫はしばしば抵抗性になる。 別の方策は、作物の昆虫、カビおよび雑草侵襲を防除するために 天然に存在する病原体を利用する生物殺虫剤の使用を含んでいる。生物殺虫剤は 、毒素、即ち害虫に対して毒性のある物質を生産する細菌を含んで成る。生物殺 虫剤は一般的に、化学殺虫剤よりも非標的生物や環境に対して全体として無害で ある。最も広く使用されている生物殺虫剤はバシラス・スリンジエンシス（Baci llus thuringiensis ）（B.t.）である。B.t.は広域に分布し、桿状形態で、好気 性で胞子形成性の微生物である。その胞子形成周期の間に、B.t.は昆虫幼虫を殺 す結晶δ−内毒素として知られる結晶形タンパク質を生産する。従って、B.t.は 農薬として非常に有用である。 幾つかの株、例えばバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus t huringiensis subsp．kurstaki）およびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザ ワイ（Bacillus thuringiensis subsp．aizawai）は鱗翅目に特異的であること がわかった。バシラス・スリンジエンシス亜種イスラエレンシンス（Bacillus t huringiensis subsp．israelensis）は双翅目に特異的であることがわかった（Go ldberg、米国特許第 4,166,112号）。別の株、例えばバシラス・スリンジエンシ ス亜種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp．tenebrionis）（Krieg ら、1988年、米国特許第 4,766,203号）は鞘翅目に特異的であることがわかった 。別の鞘翅目毒性バシラス・スリンジエンシス株の単離が1986年に報告されてい る（Hernnstadtら、Bio/Technology 第４巻、305-308、1986年；米国特許第 4, 764,372号、1988年）。「バシラス・スリンジエンシス亜種サンディエゴ（Bacil lus thuringiensis subsp．san diego）」と命名されたこの株は、受託番号NRRL B-15939のもとに米国のthe Northern Regional Research Laboratory に寄託さ れた。しかしながら、第4,764,372 号特許の譲受人は、バシラス・スリンジエン シス亜種サンディエゴがバシラス・スリンジエンシス亜種テネブリオニスである ことを公に認めた。更に、第 4,764,372号特許はノボ−ノルディスクＡ／Ｓに譲 渡された。また、鱗翅目と鞘翅目に対して毒性であるB.t.株も開示された（PCT 出願第WO 90/13651 号）。PCT 出願第WO90/13651 号に開示された毒素は81 kd の分子量を有する。 胞子形成周期の間、B.t.は、摂取すると昆虫幼虫を致死させる27〜140 kdの範 囲の分子量を有する結晶δ−内毒素として知られる結晶形タンパク質を生産する 。毒性活性は、特定のB.t.株中のそのような結晶タンパク質の１つまたは複数に 存するかもしれない。大部分のδ−内毒素は、標的昆虫の中腸の中でタンパク質 分解により小さな（先端が切り取られた）毒性のポリペプチドに変換されるプロ トキシンである（Hofte およびWhiteley，1989，Microbiol．Rev．53:242-255） 。δ−内毒素はcry（結晶タンパク質）遺伝子によりコードされる。cry 遺伝子 は、構造上の類似性と殺虫特異性に基づいて６つのクラスと幾つかのサブクラス に分割される。主なクラスは鱗翅目特異的（cryＩ）；鱗翅目および双翅目特異 的（cryII）；鞘翅目特異的（cryIII）；双翅目特異的（cryIV）（Hofte および Whiteley，1989，Microbiol．Rev．53:242-255）；鞘翅目および鱗翅目特異的（ Tailorら，1992，Mol．Microbiol．6:1211-1217 によりcryVと命名）；線虫特異 的（Feitelsonら，1992，Bio/Technology10:271-275 によりcryVおよびcryVI と 命名）である。 δ−内毒素は組換えＤＮＡ法により生産されている。組換えＤＮＡ法により生 産されるδ−内毒素は結晶形であってもなくてもよい。 B.t.δ−内毒素はアルカリ性ｐＨを除いて水不溶性であり、ほとんど常にプラ スミドコードされる。バシラス・スリンジエンシスの幾つかの株は、単独で殺虫 性であるβ−外毒素またはスリンジエンシンとして知られる耐熱性殺虫性アデニ ンヌクレオチド類似体を生産することが示されている（Sebesta ら，H.D．Burge s 編，Micro- bial Control of Pests and Plant Diseases，Academic Press，New York，p.24 9-281， 1981）。β−外毒素は幾つかのバシラス・スリンジエンシス培養物の上 清に発見されている。それは789 の分子量を有し、そしてアデノシン、グルコー スおよびアラリン酸から構成される（Luthy ら，Kurstak 編，Microbial and Vi ral Pesti-cides，Marcel Dekker，New York，1982，pp.35-72）。それの宿主域 としては、イエバエ（Musca domestica）、マメストラ・コンフィグラータ・ウ オーカー（Mamestra configurata Walker）、テトラニクス・ウルチカエ（Tetr anychus urticae ）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）お よびテトラニクス・シンナバリヌス（Tetranychus cinnabarinus）が挙げられる が、それらに限定されない。β−外毒素の毒性は、ＡＴＰとの競争によるＤＮＡ 指令型ＲＮＡポリメラーゼの阻害によるものであると思われる。β−外毒素は５ つのバシラス・スリンジエンシス（B.t.）株でCry プラスミドによりコードされ ること、そしてβ−外毒素はＩ型とII型のβ−外毒素として分類され得ることが 示された（Levinsonら，1990，J．Bacteriol．172:3172-3179）。β−外毒素Ｉ 型はB.t.亜種スリンジエンシス（thuringiensis）血清型１、B.t.亜種トルウォ ーチ（tolworthi）血清型９、およびB.t.亜種ダルムスタジエンシス（darmstadi ensis ）血清型10により生産されることがわかった。β−外毒素II型はB.t.亜種 モリソニ（morrisoni）血清型８abにより生産され、レプチノタルサ・テキサナ （Leptinotarsa texana）に対して活性であることがわかった。B.t.から単離さ れている他の水溶性因子としてはα−外毒素（Luthv，1980，FEMS Microbiol．L ett．8:1-7)；レシチナーゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを含む種々のタン パク質分解酵素であるγ−外毒素（Forsbergら，1976，Bacillus thuringiensis ：Its Effects on Environmental Quality， National Research Council of Canada，NRC Associate Committee on Scientif ic Criteria for Environmental Quality，Subcomittees on Pesticides and Re lated Compounds and Biolo- gical Phenomena）；σ−外毒素（Argauerら，199 1，J．Entomol．Sci．26：206-213）；およびアンヒドロスリンジエンシン（Col l．Czechoslovak Chem．Comm．40，1775，1975）が挙げられる。 当業者はB.t.製剤の死亡率増加を達成しようと努力している。その手段として は、増加された死亡率を有する新規株を捜すこと、親株を操作しようと試みるこ と、そしてB.t.胞子および／または結晶を新規殺虫剤担体、化学殺虫剤または増 強剤と組み合わせることにより、より効果的な製剤をデザインしようと試みるこ とが挙げられる（例えば、米国特許第 5,250,515号「トリプシン阻害剤」を参照 のこと）。従って、本発明の目的は殺虫剤の殺虫活性を増強することである。 ３．発明の要約 本発明は、当業界で既知の因子と全く異なるバシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を 増強する新規因子に関する。特に、本発明の因子は増強剤である。本明細書中に 定義されるように、「増強剤」は全く有意な殺虫剤活性を持たず、例えばバイオ アッセイによりアッセイすると約3000μg/g を越えるＬＣ₅₀（ＬＣ₅₀は害虫の50 ％を殺すのに必要な物質の濃度である）を有する（第６章を参照のこと）が、バ シラス菌系殺虫剤の殺虫活性を少なくとも約50％増加させる作用をし、且つ幼虫 の発育阻止を引き起こさない物質である。第２章に記載したように、当業界で既 知である殺虫活性を増強することのできる別の物質、例えばδ−内毒素、トリプ シン阻害剤および外毒素は殺虫活性を有する。 特定の態様では、該因子は水溶性である。少なくとも約１mgの物質を１ml水に 溶かすことができる場合、物質または化合物は「水溶性」であると本明細書中に 定義される。該因子は化学殺虫剤および／または殺虫性を有するウイルスの殺虫 活性を増強することもできる。 本明細書中で使用する時、「バシラス菌系殺虫剤」は、バシラス菌（例えばバ シラス・スリンジエンシスまたはバシラス・サチリス）の株、胞子または物質、 例えば害虫に対して活性を有するか害虫を致死させるタンパク質もしくはその断 片；植物保護を提供する物質、例えば摂食阻害物質；または害虫に対して活性を 有するか害虫を致死させるバシラス菌タンパク質もしくはその断片（例えばバシ ラス・スリンジエンシスδ−内毒素）をコードするバシラス菌遺伝子を発現する ことのできる微生物および許容される担体（そのような担体の例については下記 の第5.2.章を参照のこと）である。害虫は例えば、昆虫、線虫、ダニまたはカタ ツムリであることができる。害虫に対して活性を有するか害虫を致死させるバシ ラス菌タンパク質もしくはその断片をコードするバシラス菌遺伝子を発現するこ とのできる微生物は、葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（植物の根の 周りの土壌）および／または水性環境に生息し、そして特定環境中（作物および 他の昆虫生息環境）で野生型微生物とうまく競争することができ、害虫に対して 活性を有するか害虫を致死させるバシラス菌タンパク質もしくはその断片をコー ドするバシラス菌遺伝子の安定な維持および発現に備えることができる。そのよ うな微生物の例は、細菌、例えばバシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseu domonas ）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsiella ）、ザントモナス（Xanthomonas）、ストレプトマイセス（Streptomy ces ）、リゾビウム（Rhizobium）、 ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilium ）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、 ラクトバシラス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アゾ トバクター（Azotobacter）、リューコノストク（Leuconostoc）、アルカリゲネ ス（Alcaligenes）、およびクロストリジウム（Clostridium）属；藻類、例えば シアノフィセエ（Cyanophyceae）、プロクロロフィセエ（Prochlorophyceae）、 ロドフィセエ（Rhodophyceae）、ディノフィセエ（Dinophyceae）、クリソフィ セエ（Chrysophyceae）、プリムネシオフィセエ（Prymnesiophyceae）、ザント フィセエ（Xanthophyceae）、ラフィドフィセエ（Raphidophyceae）、バシラリ オフィセエ（Bacillariophyceae）、ユースチグマトフィセエ（Eustigmatophyce ae ）、クリプトフィセエ（Cryptophyceae）、ユーグレノフィセエ（Euglenophyc eae ）、プラシノフィセエ（Praxsinophyceae）およびクロロフィセエ（Chloroph yceae ）科；および真菌、特に酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）、 クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、 スポロボロマイセス（Sporobolomyces）、ロドトルラ（Rhodotorula）およびオ ーレオバシディウム（Aureobasidium）属である。 本明細書中で使用する「殺虫活性」は、害虫の致死もしくは発育阻止または害 虫感染からの植物の保護を通した害虫に対する活性の量を意味する。 本発明は更に、親株に比べて多量でそのような因子が得られる変異バシラス菌 株並びにそのような変異株を得る方法に関する。 本発明は更に、該因子と殺虫剤担体、または該因子とバシラス菌系殺虫剤、化 学殺虫剤および／または殺虫性のあるウイルスとを含んで含んで成る殺虫剤組成 物に関する。 本発明は更に本発明の殺虫剤組成物の利用方法にも関する。一態様では、本発 明は害虫を該組成物の害虫防除量に暴露することを含んで成る害虫の防除方法に 関する。別の態様では、本発明は、該因子と殺虫剤担体を含んで成る組成物に害 虫を暴露することを含んで成る、バシラス菌系殺虫剤に対する害虫の抵抗性を減 少させる方法に関する。本発明は更に、該因子と担体を含んで成る組成物を、バ シラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強するのに有効な量で、バシラス菌系殺虫剤に 暴露された害虫に投与することを含んで成る、バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を 増強する方法に関する。 本発明は更に、「実質的に純粋な」本発明の因子を得る方法であって、次の段 階： (a)バシラス株を醗酵させ； (b)(a)の上清を回収し；そして (c)前記上清から前記因子を単離する を含んで成る方法に向けられる。 本明細書中で使用する時、「実質的に純粋な」因子とは、10％未満の混入物（ 例えばδ−内毒素タンパク質）を含有する因子を意味する。 本発明は更に、本発明の因子を同定する方法であって、 (a)バシラス株を醗酵させ； (b)(a)の醗酵物の上清を回収し；そして (c)バシラス菌系殺虫剤の増強について(b)の上清をアッセイする ことを含んで成る方法に向けられる。 ４．図面の簡単な説明 図１は、Ｉａを精製するのに使われる一般手順を概略的に示す。 図２は、Ｉａの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。 図３は、ＩａのプロトンＮＭＲスペクトルを示す。 図４は、Ｉａの推定構造を示す。 プロトン（¹Ｈ）および¹³ＣシフトはD₂O中で記録されたppm として示される。 図５は、構造Ｉａを得るための合成スキームを示す。 ５．発明の詳細な説明 本発明は、バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子に関する。該因子は 約350 〜約1200の分子量を有し、または特定態様では約350 〜約700 の分子量を 有する。 本発明の因子は、バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を少なくとも約1.5 倍から場 合により約1000倍、好ましくは約100 倍から約400 倍増強する。特定態様では、 本発明の因子は、全長形態またはタンパク質分解によりプロセシングされ先端が 切り取られた形態のバシラス・スリンジエンシスδ−内毒素、例えばCryＩ（Cry IA，CryIBおよびCryIC が挙げられるがそれに限定されない），CryII，CryIII， CryIV，CryV またはCryVI タンパク質を包含するδ−内毒素の殺虫活性を約1.5 倍〜約1000倍増強する。最も特定の態様では、本発明の因子はB.t.δ−内毒素を 約100 倍〜約400 倍増強する。該因子は化学殺虫剤および／または殺虫性のある ウイルスの殺虫活性も増強することができる。 該因子は水溶性であり、約100 ℃までの水中で少なくとも約５分間安定であり 、直射日光に当てた時に少なくとも約10時間安定であり、そして／または約２の ｐＨで約10日間安定であることもできる。 特定態様では、該因子は約13〜約24個の炭素を有する。より特定の態様では、 該因子は約13〜約19個の炭素を有する。最も特定の態様では、該因子は約13個の 炭素を有する。 特定態様では、該因子は構造（Ｉ） 〔上式中、 Ｒ¹はアミノ、ヒドロキシ、Ｃ_1-10アルキル、ベンズアミド、３，５−ジニトロ ベンズアミド、ｐ−ニトロベンズアミド、ハロベンズアミド、アルキルベンズア ミド、チオフェンアミド、フランアミド、ピロールアミド、イミダゾールアミド 、ピラゾールアミド、Ｃ_1-10アルキルアミノ、Ｃ_1-10ジアルキルアミノ、Ｃ_1-10 アルキルもしくはベンジルエステル、ハロゲン、またはＣ_1-10アルコキシであり ； Ｒ²は（CH²）_nであり、ここでｎは０〜10の整数であり； Ｒ³とＲ⁴は独立的に（NH）_pであり、ここでｐは０または１であり； であり、ここでＸ¹，Ｘ²，Ｘ³，Ｘ⁴，Ｘ⁵，Ｘ⁶およびＸ⁷は独立的にNH₂、OH、ア セチル、ハロゲンまたはＣ_1-10アルコキシでありそしてｑは１〜10の整数であり ： Ｒ⁶はヒドロキシル、アミノ、Ｃ_1-10アルコキシ、ベンゾキシ、ベンジルエステ ル、３，５−ジニトロベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、ハロベ ンジルエステル、アルキルベンジルエステル、チオフェンエステル、フランエス テル、ピロールエステルまたはイミダゾールエステルである〕を有する化合物； または殺虫剤上許容されるその塩（例えばリン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩お よび硝酸塩が挙げられるがそれに限定されない）であ る。 最も特定の態様では、前記因子は構造（Ｉａ）を有する。 5.1. 因子の獲得 本発明の因子はバシラス菌醗酵物（例えばバシラス・サチリス、バシラス・セ レウスおよびバシラス・スリンジエンシス）から得ることができる。特定態様で は、本発明の因子はバシラス・スリンジエンシス醗酵物〔バシラス・スリンジエ ンシス亜種クルスタキ（kurstaki）、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワ イ（aizawai）、バシラス・スリンジエンシス亜種ガレリエ（galleriae）、バシ ラス・スリンジエンシス亜種エントモシダス（entomocidus）、バシラス・スリ ンジエンシス亜種テネブリオニス（tenebrionis）、バシラス・スリンジエンシ ス亜種スリンジエンシス（thuringiensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種 アレスチ（alesti）、バシラス・スリンジエンシス亜種カナジエンシス（canadi ensis）、バシラス・スリンジエンシス亜種ダルムスタジエンシス（darmstadien sis）、バシラス・スリンジエンシス亜種デンドロリムス（dendrolimus）、バシ ラス・スリンジエンシス亜種フィニチムス（finitimus）、バシラス・スリンジ エンシス亜種ケニエ（kenyae）、バシラス・スリンジエンシス亜種モリソニ（mo rrisoni）、バシラス・スリンジエンシス亜種サブトキシカス（Subtoxicus）、 バシラス・スリンジエンシス亜種トウマノフィ（toumanoffi）およびバシラス・ スリンジエンシス亜種イスラエレンシス（israelensis）が挙げられるがそ れに限定されない〕の上清から得られる。好ましい態様では、該因子はバシラス ・スリンジエンシス亜種クルスタキ、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワ イもしくはバシラス・スリンジエンシス亜種ガレリエ、または実質的に同じ増強 活性を有するそれらの変異株から得られる。特定態様では、該因子はバシラス・ スリンジエンシス亜種クルスタキのcry^- spo^- 変異株から回収される。 一態様では、本発明の因子は、変異バシラス・スリンジエンシス、特に該因子 が多量に生産されるバシラス・スリンジエンシスまたは変異株から得られる因子 の増強活性が親株に比較して大きい変異バシラス・スリンジエンシスから得られ る。本明細書中で使用する「親株」とは、突然変異誘発前の元のバシラス菌株で ある。そのような変異株を得るために、親株は、例えば化学的手段、例えばＮ− メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンもしくはメタンスルホン酸メチ ル、γ線照射、Ｘ線またはＵＶ照射により変異原で処理することができる。特に 、バシラス菌株を変異せしめそしてそのような変異株を選択する１つの方法では 、 ｉ）親株を変異原で処理し； ii）こうして処理された変異株を変異株の選択に適する培地中で増殖させ； iii）変異株を選択する。 この方法の好ましい態様によれば、選択されたコロニーを普通の増殖培地中で 増殖させ、そして増加された因子生産が可能である株についての最終選択を実施 する。 バシラス菌は当業界で既知の培地および醗酵技術を使って培養することができ る（例えば、Rogoffら，1969，J．Invertebrate Path．14:122-129；Dulmageら ，1971，J．Invertebrate Path．18:353-358；Dulmageら，Microbial Control o f Pests and Plant Diseases，H.D．Burges 編，Academic Press，N.Y.，1980を参照のこと）。醗酵 サイクルの完結後、当業界で公知の手段、例えば遠心分離および／または限外濾 過によって醗酵ブロスからB.t.胞子と結晶を分離することにより上清を回収する ことができる。本発明の因子は、当業界で公知の手段、例えば限外濾過、蒸発お よび噴霧乾燥により回収することができる上清中に含まれる。この手順はこの後 の項目において更に詳しく記載される。 あるいは、本発明の因子は、当業界で公知の手順を使って化学合成により得る ことができる。上述したように特定態様では、該因子は構造（Ｉａ）を有する。 合成スキームは図５に示される。２，３−ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）をBo c（ｔ−ブチルカルバメート）を使って保護する。完全にＮ保護されたＤＡＰを ジイミダゾイックカーボネートでの処理によりイミダゾイルに変換して化合物Ａ を与える（図５参照）。化合物Ｂ（図５参照）は、ベンゼンスルホニル脱離基を 使うことによる末端の第一アルコールの選択的置換により３−アミノ−３−デオ キシアルドン酸から調製することができる。ジュリア条件（NaH，THF）下でＡと Ｂの縮合が達成され、次いでラネイニッケルでの脱硫が行われる。化合物Ｃ（図 ５参照）中のケト基は、トリス水素化アセトキシホウ素ナトリウムを使ったキレ ート化制御により立体選択的に還元することができる。脱保護されたＣをＤＡＰ から誘導されたイソシアネートＤで処理して対応するウレイド誘導体にするこ とができ、これを水添分解により脱保護すると化合物（Ｉａ）を与えるだろう。 一態様では、合成的にまたはバシラス菌上清から得られる（Ｉａ）のアミノ基 を、水性水酸化ナトリウムの存在下で酸クロリドまたは酸無水物のいずれかを使 ってアシル化し、（Ｉａ）のトリアセトアミド、トリベンズアミドおよびトリオ クタアミドを得ることができる。あるいは、まず過剰のジアゾメタンを使ってメ チルエステルを形成させ、次いでピリジン中のアシル無水物（例えば無水酢酸、 安息香酸無水物、ｎ−オクタン酸無水物）での処理によりアミノ基とヒドロキシ ル基をペルアシル化することにより、アミノ基とヒドロキシル基をペルアシル化 することができる。別の態様では、アシル化誘導体を使って出発し、カルボキシ ルの選択的メチル化に続くピリジン中のアシル無水物での処理により、混合アミ ドエステルを調製することができる。更に別の態様では、カルボン酸を誘導体化 してアルキルまたはアリールエステルまたはアミドを形成させてもよい。更に別 の態様では、ヒドロキシ置換基を選択的に酸化してケトンおよび鎖が短縮された カルボン酸類似体にしてもよい。 別の態様では、無水炭酸ナトリウムの存在下でのBoc 無水物での処理の後、水 素化ナトリウム中の臭化ベンジルを使ったヒドロキシル基の選択的保護により、 （Ｉａ）のアミノ基をｔ−ブチルカルバメートとして保護し、下記に示される（ Ｘ）を与えることができる。 この完全に保護された誘導体を、水性水酸化ナトリウムを使ってウ レイド結合のところで加水分解する。この後、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボ ジイミド（ＤＣＣ）の存在下で例えばアミノ酸、ヒドロキシカルボン酸またはジ カルボン酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、リ ンゴ酸、アジピン酸が挙げられるがそれに限定されない）を使って選択的アシル 化する。Ｎ−Boc 基とＯ−ベンジル基を穏和な酸開裂と木炭上のパラジウム上で の水添分解により除去すると、下記構造（II）を得ることができる。 更に別の態様では、完全に保護された化合物（Ｘ）を、アミノ酸（例えばグリ シン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、フェニルグリシン、メチオニン、 ノルメチオニンが挙げられるがそれに限定されない）から誘導された種々のイソ シアネートで処理して９−ウレイド誘導体を得る。次いで上述したように保護基 を除去すると下記構造（III）を得ることができる。 ここでＲは天然アミノ酸である。 更に別の態様では、水性炭酸ナトリウムの存在下でBoc を使って２，３−ジア ミノプロピオン酸を２位のところで保護し、Ｎ−２−Boc −２，３−ジアミノプ ロピオン酸を得る。この誘導体をＤＣＣ の存在下でペルアセチルアルドン酸（ペンタ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコン酸、 ペンタ−Ｏ−アセチル−Ｄ−マンノ酸、ペンタ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトン 酸、ヘプタ−Ｏ−アセチル−Ｄ−エリスロ−Ｌ−マンノオクタン酸が挙げられる がそれに限定されない）を使ってアシル化し、次いでメタノール性アンモニアの 存在下でアセチル基とBoc 基のソルボリシス（Chem．Pharm．Bull．1985，33:50 9-514）を行う。穏和な酸処理により、構造（IV）を有するポリヒドロキシアミ ド類似体を得ることができる。 ここでｎは1〜10である。ペルアセチル化されたアルダン酸、例えばＤ−グルカ ロ−６，３−ラクトンを使って同じ手順を適用し、第一位末端カルボキサミド基 を有するポリヒドロキシを得ることができる。 更に別の態様では、２，３−ジアミノプロピオン酸の保護誘導体を、ホスゲン 等価物を使ってアミノ糖誘導体から誘導したイソシアネートとカップリングさせ る。一態様では、アミノ糖は１−または２−アミノヘキソース（例えば１−アミ ノ−１−デオキシソルビトール、グルコサミン、マンノサミン）であり、構造（ Ｖ）を有する。 ここでｎは1〜10である。 本発明の因子の精製は、当業界で公知の様々な方法、例えばクロマトグラフィ ー（例えばイオン交換、アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィー） 、電気泳動法、溶解度差、抽出または当業界で既知の他の任意の標準技術により 実施することできる。 本発明の因子の増強活性は、当業界で公知の方法、例えば人工昆虫飼料混和、 人工飼料上塗り、葉面塗布、葉浸漬および葉面散布を使ってアッセイすることが できる。そのようなアッセイの特定例は下記の第６章に与えられる。 5.2. 因子を含有する組成物 上述した本発明の因子は、バシラス菌系殺虫剤および許容される担体と一緒に 殺虫剤組成物に製剤することができる。この殺虫剤組成物は、例えば、懸濁液、 溶液、乳液、散布剤、分散性顆粒、湿潤性粉末、乳化性濃縮物、エアゾールまた は含浸顆粒である。そのようなバシラス菌系殺虫剤の例としては、好ましくはバ シラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（B.t.k.）（Abbott Laboratories, I nc.からDIPEL^TM、Novo Nordisk A/SからBIOBIT^TM、Novo NordiskA/S からFORAY^{T M} 、Mycogen からMVP^TM、Novo Nordisk A/SからBACTOSPEINE^TM、SandozからTHURI CIDE^TMとして販売されている）およびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワ イ（B.t.a.）（Novo Nordisk A/S からFLORBAC^TM、Abbott Laboratories,Inc.か らXENTARI^TMとして販売されている）により製造された殺虫剤が挙げられるがそ れに限定されない。更なる例としては、バシラス・スリンジエンシス亜種イスラ エレンシス（B.t.i.）（Novo Nordisk A/SからBACTIMOS^TM、Abbott Laboratorie s, Inc．からVECTOBAC^TMとして販売されている）；バシラス・スフェリカス（B .sphr.）（NovoNordisk A/SからSPHERIMOS^TMとして販売されている）；バシラス ・スリンジエ ンシス・クルスタキ／テネブリオニス（EcogenからFOIL^TMとして販売されている ）；バシラス・スリンジエンシス・アイザワイ／クルスタキ（B.t.a.／B.t.k.） （EcogenからCONDOR^TM、Ciba-GeigyからAGREE^TMとして販売されている）；バシ ラス・スリンジエンシス・クスルタキ／クルスタキ（B.t.k.／B.t.k.）（Ecogen からCUTLASS^TMとして販売されている）が挙げられるがそれに限定されない。害 虫に対して活性を有するウイルスとしてはバキュロウイルス、例えばオートグラ ファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＮＰＶ ）、シングラファ・ファルシフェラ（Syngrapha falcifera）ＮＰＶ、サイディ ア・ポモネラ（Cydia pomonella）ＧＶ（顆粒症ウイルス）、ヘリオシス・ゼア （Heliothis zea）ＮＰＶ、リマントリア・ジスパー（Lymantria dispar）ＮＰ Ｖ、オルギア・シュードツガタ（Orgyia pseudotsugata）ＮＰＶ、シロイチモジ ヨトウ（Spodoptera exigua）ＮＰＶ、ネオジプリオン・レコンテイ（Neodiprio n lecontei ）ＮＰＶ、ネオジプリオン・セルチファ（Neodiprion sertifer）Ｎ ＰＶ、ハリシナ・ブリリアンス（Harrisina brillians）ＮＰＶおよびエンドピ ザ・ビテナ（Endopiza viteana）クレメンスＮＰＶが挙げられる。 本発明の因子とバシラス系殺虫剤とを含んで成る組成物中、該因子は少なくと も約 0.002ｇ／BIU の量で存在することができる。一態様では、該因子は構造Ｉ ａを有し、そして／またはバシラス菌δ−内毒素および胞子１ｇあたり因子0.05 ｇもしくは少なくとも約0.1ｇ／BIU の量、場合によりバシラス菌δ−内毒素お よび胞子１ｇあたり因子150ｇもしくは約 300ｇ／BIU までの量、好ましくはバ シラス菌δ−内毒素および胞子１ｇあたり因子１ｇもしくは２ｇ／BIU の量で存 在することができる。本明細書中で使用する時、“BIU”はバイオアッセイによ り測定した時の10億国際単位である。バイオ アッセイは、標準試験昆虫としてトリコプルシア・ニイ（Trichoplusia ni）ま たは他の害虫を使って試料を標準バシラス菌参照材料と比較する。参照標準ＬＣ₅₀ で割り次いで参照標準効力を掛けることにより効力を決定する。 別の態様では、該組成物は、実質的に純粋な形の本発明の因子または乾燥形、 濃縮形もしくは液体形のバシラス菌上清、および適当な殺虫剤担体（その例は下 記に開示される）を含んで成る。この組成物は別々に植物、例えばトランスジェ ニック植物に適用することができる。特別には、該組成物は、バシラス菌遺伝子 、例えばB.t.遺伝子を予め含有する植物に適用することができる。別の態様では 、該組成物はバシラス菌組成物、例えば少なくとも約0.01％から約60％までの量 で存在するB.t.組成物に以前に暴露された植物に適用することができる。 本発明の因子と殺虫剤上許容できる担体とを含んで成る組成物は、害虫を防除 することの他に、殺虫剤に対する害虫の抵抗性を減少させるためにも使うことが できる。あるいは、該組成物はバシラス菌系殺虫剤を増強させるためにも使うこ とができる。一態様では、該組成物は、少なくとも約２ｇの因子／BIU から場合 により約300 ｇの因子／BIU までの量で殺虫剤と同時に散布することができる。 別の態様では、残留殺虫剤の効力を拡大させるための補助剤として、殺虫剤の約 24時間後までに該組成物を散布することができる。 上記に開示されたそのような組成物は、界面活性剤、不活性担体、防腐剤、保 湿剤、摂食刺激剤、誘引剤、封入剤、結合剤、乳化剤、染料、ＵＶ保護剤、緩衝 剤、流動剤、または特定の標的害虫について生成物の取扱や散布を容易にする他 の成分の添加により得ることができる。適当な界面活性剤としては、アニオン性 化合物、例えばカルボキシレート、例えば長鎖脂肪酸の金属カルボキシレート； Ｎ −アシルサルコシネート；リン酸と脂肪アルコールエトキシレートとのモノもし くはジエステルまたはそのようなエステルの塩；脂肪アルコールスルフェート、 例えばトデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウムまたはセチル硫酸 ナトリウム；エトキシル化脂肪アルコールスルフェート；エトキシル化アルキル フェノールスルフェート；リグニンスルホネート；石油スルホネート；アルキル アリールスルホネート、例えばアルキルベンゼンスルホネートまたは低級アルキ ルナフタレンスルホネート、例えばブチルナフタレンスルホネート；スルホン化 ナフタレン−ホルムアルデヒド縮合物の塩；スルホン化フェノール−ホルムアル デヒド縮合物の塩；またはより複雑なスルホネート、例えばアミドスルホネート 、例えばオレイン酸とＮ−メチルタウリンのスルホン化縮合生成物またはジアル キルスルホスクシネート、例えばジオクチルスクシネートのスルホン酸ナトリウ ム塩が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、脂肪酸エステル、脂肪アル コール、脂肪酸アミドまたは脂肪アルキル−もしくはアルケニル置換フェノール とエチレンオキシドとの縮合生成物、多価アルコールエーテルの脂肪酸エステル 、例えばソルビタン脂肪酸エステル、そのようなエステルとエチレンオキシドと の縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、エチレン オキシドとプロピレンオキシドのブロックコポリマー、アセチレン性グリコール （例えば２，４，７，９−テトラエチル−５−デシン−４，７−ジオール）、ま たはエトキシル化アセチレン性グリコールが挙げられる。カチオン性界面活性剤 の例としては、例えば、酢酸塩、ナフテン酸塩またはオレイン酸塩としての脂肪 族モノ、ジもしくはポリアミン；酸素含有アミン、例えばポリオキシエチレンア ルキルアミンのアミンオキシド；カルボン酸とジアミンまたはポリアミンとの縮 合により調製されるアミド結合含有アミン； または第四級アンモニウム塩が挙げられる。 不活性材料の例としては、無機材料、例えばカオリン、フィロケイ酸塩、炭酸 塩、硫酸塩、リン酸塩または植物材料、例えばコルク、粉末トウモロコシ穂軸、 落花生殻、米殻およびクルミ殻が挙げられるがそれらに限定されない。 本発明の組成物は、直接散布に適当な形態でまたは散布前に適当量の水もしく は他の希釈剤での希釈を必要とする濃縮物もしくは一次組成物として存在するこ とができる。殺虫剤濃度は特定製剤の性質に依存して、特に、それが濃縮物であ るのかまたは直接使用するべきものであるかに依存して異なるであろう。組成物 は１〜98％の固形または液状不活性担体と、０〜50％、好ましくは0.1 〜50％の 界面活性剤を含有する。それらの組成物は市販品の表示量で、好ましくは乾燥形 態の時は１エーカーあたり約0.01 lb 〜5.0 lbで、そして液体形態の時は１エー カーあたり約0.01 pts〜10 ptsで散布されるだろう。 更なる態様では、前処理が結晶δ−内毒素または因子にとって有害でないこと を前提として、バシラス菌、例えばB.t.の結晶δ−内毒素および増強因子を製剤 前に処理し、標的害虫の環境に適用した時の殺虫活性を延長させることができる 。そのような処理は、前記処理が組成物の性質に悪影響を及ぼさないことを前提 として、化学的および／または物理的手段によるものであることができる。化学 試薬の例としては、ハロゲン化剤；アルデヒド、例えばホルムアルデヒドおよび グルタルアルデヒド；感染防止剤、例えば塩化ゼフィラン；アルコール、例えば イソプロパノールおよびエタノール；および組織学用固定液、例えばブワン固定 液およびヘリー固定液（例えば、Humason，Animal Tissue Techniques，W.H. Fr eeman and Co.，1967を参照のこと）が挙げられるがそれに限定されない。 本発明の組成物は、例えば、害虫が植物上に現れ始めた時点でまたは保護手段 として害虫の出現より前に、噴霧または散粉により植物に直接散布することがで きる。本発明の範囲内で保護することのできる植物としては、穀類（小麦、大麦 、ライ麦、エンバク、米、モロコシ類および関連作物）、ビート（テンサイおよ び飼料ビート）、石果、仁果および小果樹（リンゴ、ナシ、プラム、モモ、アー モンド、サクランボ、イチゴ、キイチゴおよびクロイチゴ）、マメ科植物（アル ファルファ、インゲンマメ、レンズマメ、エンドウ、大豆）、油料作物（菜種、 カラシ、ポピー、オリーブ、ヒマワリ、ヤシ、ヒマシ油植物、ココア豆、落花生 ）、キュウリ植物（キュウリ、ペポカボチャ、メロン）、繊維植物（綿、亜麻、 麻、ツナソ）、柑橘果実（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン） 、野菜（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツおよび他のアブラナ科 、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ、パプリカ）、クスノキ科（アボカ ド、シナモン、ショウノウ）、落葉樹および針葉樹（例えば菩提樹、イチイ、オ ーク、ハンノキ、ポプラ、カンバ、モミ、カラマツ、パイン）、またはトウモロ コシ、芝、タバコ、堅果、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウ、ホップ、バナナ および天然ゴムなどの植物、並びに観賞植物が挙げられるがそれに限定されない 。どちらの場合でも、好ましい散布方法は葉面散布によるものである。植物成長 の初期段階において好適な害虫防除を得ることが一般的に重要である。何故なら 、この時期は植物が最もひどく被害を受ける可能性のある時期だからである。必 要と思われる場合には、散布液または粉剤は便宜上別の殺虫剤を含むことができ る。好ましい態様では、本発明の組成物は植物に直接散布される。 本発明の組成物は、鱗翅目、例えばアクロイア・グリセラ（Achroia grisella ）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、 アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、アドキソフィエス・オラナ（Adoxo phyes orana ）、アグロチス・イプシロン（Agrotisipsilon）、アラバマ・アル ギラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pome taria ）、アミエロイス・トランシテラ（Amyeloistransitella）、アナガスタ・ クエニーラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarsia linea tella ）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンテラエア・ペルニ ー（Antheraea pernyi）、アンチカルシア・ゲンマタリス（Anticarsia gemmata lis ）、アルキプス（Archips）の種、アルギオタエニア（Argyrotaenia）の種、 アテチス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボンビックス・モリ（Bombyx mori） 、ブクラトリクス・ツルベリアラ（Bucculatrix thurberiella）、カドラ・カウ テラ（Cadra cautella）、コリストネウラ（Choristoneura）の種、コチルス・ ホスペス（Cochylls hospes）、コリアス・ユーリテメ（Colias eurytheme）、 コルシラ・セファロニア（Corcyra cephalonica）、シディア・ラチフェラアヌ ス（Cydia latiferreanus）、シディア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ ・インテゲリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリクス（Dendro limus sibericus ）、デスミア・フネラリス（Desmia funeralis）、ジアファニ ア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、デアパニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis ）、ディアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ジ アトレア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、エンノモス・スブシグナリ ア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフチニ（Eoreuma loftini）、エフ ェスチア・エルテラ（Ephestia elutella）、エラニス・チラリア（Erannis til aria ）、エスチグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、ユーリア・サルブリコ ラ（Eulia salubricola）、ユーポコエリア・ アンビグエラ（Eupocoellia ambiguella）、ユーポエシリア・アンビクエラ（Eu poecilia ambiguella ）、ユープロクチス・クリソルホエア（Euproctis chrysor rhoea ）、ユーキソア・メッソリア（Euxoa messoria）、ガレリア・メロネラ（G alleria mellonella ）、グラフォリタ・メレスタ（Grapholita molesta）、ハリ シナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・スブフェレキサ（H elicoverpa subflexa ）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）、ヘリオチス ・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘミリユーカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae ）、ホメオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）、ヒパント リア・クネア（Hyphantria cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella ）、ランブジナ・フィスエラリア・フィスエラニア（Lambdina fiscellaria fiscellaria ）、ランブジナ・フィスエラリア・ルグブロサ（Lambd ina fiscellaria lugubrosa ）、リューコマ・サリシス（Leucoma salicis）、ロ ベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロキソステガ・スチクチカリス（Loxos tege sticticalis ）、リマントリア・ジスパ（Lymantria dispar）、マカラ・チ ルシサリス（Macalla thyrsisalis）、マラコソマ（Malacosoma）の種、マメス トラ・ブラッシカ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィグラタ（Mame stra configurata ）、マンドカ・クアンクエマクラタ（Manduca quinquemaculat a ）、マンズカ・セクスタ（Manducasexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca te stulalis ）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、オペロフテラ・ブルマ タ（Operophtera brumata）、オルギア（Orgyia）の種、オストリニア・ヌビラ リス（Ostrinia nubilalis）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata） 、パピリオ・クレスホンテス（Papilio cresphontes）、ペクチノホラ・ゴシピ エラ（Pectinophora gossypiella）、 フリガニダ・カリホルニカ（Phryganidia californica）、フィロノリクテル・ ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris na pi ）、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra ）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノ タ・スツルタナ（Platynota stultana）、プラチプチリア・カルズイダクチラ（Platyptilia carduidactyla ）、プロディア・インテルプンクテラ（Plodia inte rpunctella ）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）、ポンチア・ プロトディス（Pontia protodice）、シューダレチア・ウニプンクタ（Pseudale tia unipuncta ）、シュードプラシア・インクルデンス（Pseudoplasia includen s ）、サブロデス・エグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Sc hizura concinna ）、シトツロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピ ロニタ・オセラナ（Spilonota ocellana）、スポドプテラ（Spodoptera）の種、 サウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、チネオラ・ ビセリエラ（Tineolabisselliella）、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni） 、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアレス（Xylomy ges curialis ）、イポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）；双翅目、例え ばヤブカ種、アンデス・ビタツス（Andes vittatus）、アンストレパ・ルデンス （Anastrepha ludens）、アナストレパ・ススペンサ（Anastrepha suspensa）、 アノフェレス・バルベリ（Anopheles barberi）、アノフェレス・クアトリマク ラツス（Anopheles quadrimaculatus）、アルミゲルス・スバルバツス（Armiger es subalbatus ）、セリホラ・スチギア（Calliphora stygia）、セリホラ・ビシ ナ（Calliphora vicina）、セラチチス・カピタタ（Ceratitis capitata）、キ ロノムス・テンタヌス（Chir onomus tentans ）、クリソミア・ルフィファシエス（Chrysomya rufifacies）、 コクリオミア・マセラリア（Cochliomyia macellaria）、イエカ種、クリセタ・ イノルナタ（Culiseta inornata）、ダクス・オレア（Dacus oleae）、デリア・ アンチグア（Delia antigua）、デリア・プラツラ（Delia platura）、デリア・ ラディクム（Delia radicum）、ドロソフィア・メラノガステル（Drosophia mel anogaster ）、ユーペオデス・コロラー（Eupeodes corollae）、グロシナ・アン ステニ（Glossina austeni）、グロシナ・ブレビパルピス（Glossina brevipalp is ）、グロシナ・フスシペス（Glossina fuscipes）、グロシナ・モルシタンス ・セントラリス（Glossina morsitans centralis）、グロシナ・モリスタンス・ モリスタンス（Glossina moristans morsitans）、グロシナ・モリスタンス・サ ブモリスタンス（Glossina moristans submorsitans）、グロシナ・パリディペ ス（Glossina pallidipes）、グロシナ・パルパリス・ガンビエンシス（Glossin a palpalis gambiensis ）、グロシナ・パルパリス・パルパリス（Glossina palp alis palpalis ）、グロシナ・タチノイデス（Glossina tachinoides）、ヘマゴ グス・エクイヌス（Haemagogus equinus）、ヘマトビウス・イリタニス（Haemat obius irritans ）、ヒポデルマ・ボビス（Hypoderma bovis）、ヒドレルマ・リ ネアツム（Hydoderma lineatum）、リューコピス・ニナエ（Leucopis ninae）、 ルシリア・クプリナ（Lucilia cuprina）、ルシリア・セリカタ（Lucilia seric ata ）、ルツオミイア・ロングルパイピス（Lutzomyia longlpaipis）、ルツオミ イア・シャンノリ（Lutzomyia shannoni）、リコリエラ・マリ（Lycoriella mal i ）、マイエチオラ・デスクルクトール（Mayetiola destructor）、ムスカ・ア ウツムナリス（Musca autumnalis）、ムスカ・ドメスティカ（Musca domestica ）、ネオベリエリア（Neobellieria）の種、ネ フロトマ・スツラリス（Nephrotoma suturalis）、オフィラ・アエネセンス（Op hyra aenescens ）、ファエニシア・セリカタ（Phaenicia ericata）、フレボト ムス（Phlebotomus）の種、フォルミア・レギナ（Phormia regina）、サベテス ・シアネウス（Sabethes cyaneus）、サルファガ・ブラタ（Sarcophaga bullata ）、スタファガ・ステルコラリア（Scatophaga stercoraria）、ストマキシス・ カルシトランス（Stomaxys calcitrans）、トキソリンチテス・アンボイネンシ ス（Toxorhynchites amboinensis）、トリプテロイデス・バレグサ（Tripteroid es bambusa ）；鞘翅目、例えばレプチノタルサ（Leptinotarsa）の種、アカント セリデス・オブテクツス（Acanthoscelides obtectus）、カロソブルクス・チネ ンシス（Callosobruchus chinensis）、エピラクナ・バリベスチス（Epilachna varivestis ）、ピルハルダ・ルテオラ（Pyrrhalta luteola）、シラス・フォル ミカリウス・エレガンツルス（Cylas formicarius elegantulus）、リストロノ ツス・オレゴネンシス（Listronotus oregonensis）、シトフィルス（Sitophilu s ）の種、シクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）、シクロセフ ァラ・インマクラタ（Cyclocephala immaculata）、マクロダクチルス・スブス ピノスス（Macrodactylus subspinosus）、ポピラ・ジャポニカ（Popilllajapon ica ）、リゾトログス・マジャリス（Rhizotrogus majalis）、アルフィトブルス ・ジアペリヌス（Alphitoblus diaperinus）、パロルス・ラツエブルギ（Paloru s ratzeburgi ）、テネフリオ・モリトル（Tenebrio molitor）、テンテブリオ・ オブスクルス（Tenebrio obscurus）、トリボリウム・カスタネウム（Tribolium castaneum ）、トリボリウム・コンフスム（Tribolium confusum）、トリボリウ ス・デスクノレクトル（Tribolius destructor）；ダニ目、例えばオリゴニクス ・プラテンシス（Oligonychus pratensis）、 パノニクス・ウルミ（Panonychusulmi）、テトラニクス・ウルチカエ（Tetranyc hus urticae ）；膜翅目、例えばイリドミルメクス・フミリス（Iridomyrmex hum ilis ）、ソレノプシス・インビクタ（Solenopsis invicta）；等翅目、例えばレ チクリテルメス・ヘスペルス（Reticulitermes hesperus）、レチクリテルメス ・フラビペス（Reticulitermes flavipes）、コプトテルメス・フォルモサヌス （Coptotermes formosanus）、ズーテルモプシス・アングスチコリス（Zootermo psis angusticollis ）、ネオテルメス・コンネクスス（Neotermes connexus）、 インシシテルメス・ミノール（Incisitermesminor）、インシテルメス・インミ クランス（Incisitermes immigrans）；陰翅目、例えばセラトフィルス・ガリナ エ（Ceratophyllus gallinae）、セラトフィルス・ニガー（Ceratophyllusniger ）、ノソフィルス・ファシアツス（Nosopsyllus fasciatus）、レプトフィラ・ セグニア（Leptopsylla segnis）、クテノセファルデス・カニス（Ctenocephall des canis ）、クテノセファルデス・フェリス（Ctenocephalldes felis）、エチ クノファガ・ガリナセア（Echicnophaga gallinacea）、プレックス・イリタン ス（Pulex irritans）、キセノプシラ・ケオピス（Xenopsyllacheopis）、キセ ノプシラ・ベキサビリス（Xenopsylla vexabilis）、ツンガ・ペネトランス（Tu nga penetrans ）；チレンチダ（Tylenchida）目、例えばメロディドギン・イン コグニタ（Melodidogyne incognita）、プラチレンクス・ペネトランス（Pratyl enchus penetrans ）といった害虫に対して効果的であろう。 次の実施例は例示のつもりで与えられ、限定のつもりではない。 ６．実施例：Ｉａの特性決定 ここに詳述する通りにＩａを回収しそして精製する。Ｉａの特性 決定を下記に詳述する。 6.1. Ｉａの回収と精製 Ｂ．スリンジエンシス亜種クルスタキ株EMCC0086（B-21147 としてNRRLに寄託 された）を、炭素源（例えばデンプン、水解デンプンまたはグルコース）と窒素 源（例えばタンパク質、水解タンパク質またはコーンスティープリカー）を含む 培地中で30℃にて72時間醗酵させる。Ｉａの生成は13時間目に醗酵物中に検出さ れる。ピーク活性はおよそ30時間目に認められる。 Ｂ．スリンジエンシス亜種クルスタキ醗酵物からの上清を遠心分離により回収 し、次いでRhone Poulenc UFシステムを使った30 kDaのMW-CO 膜を通す限外濾過 により清澄化する。この30 kDa濾過は、いずれの残余細胞破片、結晶δ−内毒素 、胞子、および30 kDa分子量よりも大きい可溶性タンパク質を除去する。透過液 を蒸発により10倍濃縮する。透過液を遠心分離し、次いで0.2 μ濾過してブロス から更に不溶物を除去し、Ｉａを含有する透明なブロスを得る。 均質性になるまでのＩａの精製は、図１に概略的に示される多段階精製法を使 って達成される。上記に概説した回収プロトコールと共に、５ kDa 限外濾過段 階を使って精製を行う。５ kDa 限外濾過からの透過液をスルホプロピル（ＳＰ ）カチオン交換樹脂に吸着させ、そして酢酸アンモニウム溶液を使って溶出させ る。次いで凍結乾燥により化合物を約30倍濃縮し、BioRad P2 サイズ排除カラム を使って塩や他の混入物を除去する。P2カラムからプールした液をSP HPLCカチ オン交換カラムにかけ、均質混合物を得る。混入している塩は繰り返し凍結乾燥 により除去する。 シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）マイクロバイオアッセイにより活 性をモニタリングし、そして毛管電気泳動により純度を決定する。Ｉａ 50μｌ とBOBIT^TM FC から精製したCryIA(ｃ)タ ンパク質（15μg/ml）50μｌとから成る試料（100μｌ）を、固形人工昆虫飼料 500μｌの入ったゼリートレーの個々のウエルに入れる。 様々な試料を含むトレーを風乾する。乾燥試料を含むウエルに２〜４匹の第二齢 または第三齢初期のシロイチモジヨトウ（Spodopteraexigua）を加える。穴をあ けたマイラーフィルムでウエルをシールし、30℃で２〜３日間インキュベートす る。次いで発育阻止の程度と死亡率を記録する。典型的には、各試料について５ つの複製ウエルを使用する。 6.2. 構造解明 活性化合物は水溶性であるが有機溶剤には溶けないことがわかる。それは正電 荷を帯び、シリカ薄層クロマトグラフィーにより証明される通りニンヒドリンと 反応する。該化合物の¹³ＣおよびプロトンＮＭＲはそれぞれ図２および３に示さ れる。¹³Ｃ−ＮＭＲ実験は13個の炭素の存在を示した。DEPT実験は、３個の第四 級炭素（Ｃ）、７個のメチン（ＣＨ）、３個のメチレン（ＣＨ₂）および０個の メチル基（ＣＨ₃）があることを決定づけた。1-D デカップリングおよびCOSYの ようなプロトンカップリング実験において、８個の炭素を含む１つの大きなスピ ン系が同定される。加えて、２個の炭素から成る１つの小さなスピン系が存在す る。二次元炭素−プロトン相関実験（HETCOR）は、該分子中の各プロトン共鳴を それの結合炭素に割り当てることを可能にした（図４参照）。 活性化合物（13mg）をピリジン中の無水酢酸で処理すると、ずっと極性の小さ いアセチル化誘導体の形成をもたらした。この誘導体をHPLCにより精製すると３ mgの純粋なアセチル化誘導体を与えた。質量分析は該誘導体が７アセテートと69 0 の分子量を有することを明らかにし、同数の窒素が存在することを示す396 の 分子量を与えた。また、６アセテートと５アセテートの断片が検出される。５お よび６アセテート派生イオンの高共鳴データは645.2594（６アセテート）と607. 2519（５アセテート）であり、これはＩａが次の分子式Ｃ₁₃Ｈ₂₈Ｎ₆Ｏ₈を有する ことを暗示する。 活性化合物（13mg）の６N HCl処理は、ニンヒドリン陽性の誘導体を与えた。 それらの結果はアミド結合の存在を示す。該誘導体は薄層クロマトグラフィーに より決定すると２，３−ジアミノプロピオン酸と同じＲ_f値を有した。それらの 結果はＮＭＲデータと共に２，３−ジアミノプロピオン酸の存在を支持する。 Ｉａについて次の構造が解明された： それはウレイドアミドとして分類することができる。構成成分はカルボキシル２ 個（アミド化されたもの１個）、尿素１個、アミノ３個およびヒドロキシル４個 を含む。それは７個の不斉中心を含む。 6.3. Ｉａの特性 単離されたＩａは、殺虫性タンパク質の形態にかかわらず、シロイチモジヨト ウに対ずるバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキとバシラス・スリンジエ ンシス亜種アイザワイの結晶δ−内毒素殺虫性タンパク質の活性を増強すること がわかった。製剤化されたB.t.k.、単離された結晶、全長（130 kDa 分子量）ま たは先端が切り取られたCryIA タンパク質（〜65 kDa分子量）の殺虫活性が全て 増強される。CryII およびCryIC 封入体の活性も増強される。個々の先端が切り 取られたCryIA(a)、(b)および(c)タンパク質の活性を増強することもわかった。 ＩａとCry タンパク質とのインキュベーシ ョン時間は生物活性にとって重要でないことがわかった。しかしながら、Ｉａは 単独では不活性である。増強のレベルは先端が切り取られたCryIA タンパク質、 CryII およびCryIC 封入体については100 〜200 倍、そして全長CryIA(c)につい て約320 倍であることがわかった（それぞれ表ＩおよびIIを参照のこと）。特に 、全長タンパク質の場合、0.75μg/mlのCryIA(c)はＩａが含まれると、単独の24 0 μg/mlのCryIA(c)と同じ昆虫死亡率／発育阻止点数をもたらした。先端が切り 取られたCryIA(c)の場合、0.0006のＯＤ₂₈₀はＩａと組み合わせると、0.075 の ＯＤ₂₈₀と一緒に試験したCryIA(c)の同試料と同じ発育阻止点数を与えた。0.6 μg/mlの濃度でのCryII封入体はＩａと組み合わせると、75μg/mlの単独のCryII タンパク質と同じ発育阻止点数および同様な死亡率を与え、125 倍の増強を与 えた。Ｉａを添加した0.3 μg/mlのCryIC 封入体は、75μg/mlの単独のCryIC タ ンパク質と同様な死亡率および発育阻止点数を与え、これは250 倍レベルの増強 を反映する。発育阻止を引き起こすCryIAタンパク質の濃度は、Ｉａの添加と同 時に死亡率を与えた。 Ｉａは５分間煮沸しても安定であるが、オートクレーブ（＞190℃）すると全 ての活性を失うことがわかった。更に、少なくとも10時間直接日光に当てた時も 安定である。ＩａはpH 2では３日間安定であるがpH 12では不安定である。過ヨ ウ素酸または濃HCl にさらすと全活性を失うことがわかった。 6.4. バシラス・スリンジエンシスの他の亜種およびバシラス菌の他の種の評価 幾つかのバシラス種をＩａの生産について評価する。炭素源（例えばデンプン 、水解デンプンまたはグルコース）と窒素源（例えばタンパク質、水解タンパク 質またはコーンスティープリカー）を含む培地中で30℃にて72時間菌株を醗酵さ せる。上述したシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）マイクロバイオアッ セイを使って上清をＩａ生産について試験する。Ｂ．スリンジエンシス亜種アイ ザワイ株EMCC0087（NRRL B-21148としてNRRLに寄託された）とＢ．スリンジエン シス亜種ガレリエ（NRRLに寄託された）はＢ．スリンジエンシス亜種クルスタキ とほぼ同濃度でＩａを生産することがわかった。 毛管電気泳動により調べると、Ｂ．サチリス（subtilis）、Ｂ．セレウス（ce reus ）、B.t.亜種アレスチ（alesti）、B.t.亜種カナジエンシス（canadiensis ）、B.t.亜種ダルムスタジエンシス（darmstadiensis）、B.t.亜種デンドロリム ス（dendrolimus）、B.t.亜種エントモシダス（entomocidus）、B.t.亜種フィニ チムス（finitimus）、B.t.亜種イスラエレンシス（israelensis）、B.t.亜種ケ ニエ（kenyae）、B.t.亜種モリソニ（morrisoni）、B.t.亜種サブトキシカス（s ubtoxicus ）、B.t.亜種テネブリオニス（tenebrionis）、B.t.亜種スリンジエン シス（thuringiensis）およびB.t.亜種トウマノフィ（toumanoffi）、並びにＢ ．セレウス、Ｂ．サチリスおよびＢ．スリンジエンシス亜種クルスタキのcry^- s po^- 変異体においてもＩａが生産される。 特に、50μm ×57cmの未被覆の毛管が取り付けられたBeckman P/ACE 毛管電気 泳動装置、0.2 Ｍリン酸pH 6.8緩衝液、15kVの電圧および200 nmでの検出を使っ てＩａのレベルを定量する。試料容積は 20 nlであり、25分間の泳動時間である。 標準物質として 1.25 mg／ml、0.625 mg／ml、0.3125mg／ml、0.156 mg／mlお よび0.078 mg／mlの濃度の精製Ｉａを使って標準曲線を作成する。直線の検量線 が得られる。得られた式ｙ＝ｍｘ＋ｂを使って各試料中のＩａの濃度を算出する 。 各々の泳動前に、泳動緩衝液（0.2 Ｍリン酸塩、pH 6.8）を使って毛管を３分 間フラッシュする。各々の25分間泳動の後、1N NaOHで１分間、HPLC用濾過精製 水で１分間、0.5 Ｍリン酸で３分間、およびHPLC用濾過精製水で１分間、毛管を フラッシュする。各ピークの下の面積を積分してピーク面積を測定し、そして検 量線から最終濃度を算出する。 6.5. B.t.製品の評価 上記第6.4.章に記載の毛管電気泳動により、様々な市販のB.t.製品中に存在す るＩａの量を測定する。BACTOSPEINE^TM，JAVELIN^TM，NOVODOR^TM，SPHERIMOS^TM， BACTIMOS^TM，FORAY^TM，FLORBAC^TMおよびBIOBIT^TMはNovo Nordisk A/Sから得られ る。XENTARI^TMとDIPEL^TMはAbott Laboratoriesから得られる。AGREE^TMはCiba-Ge igyから得られ、MVP^TMはMycogenから得られ、そしてCUTLASS^TMはEcogenから得ら れる。 結果を下記表IIIに示す。その結果は、Ｉａが0.001 ｇ Ｉａ／BIUから0.71 ｇ Ｉａ／BIU までに及ぶ異なる量で存在することを示す。 6.6. 飼料混和バイオアッセイ 第三齢のSpodoptera exigua幼虫、第二齢のHelicoverpa zea 幼虫、第三齢のSpodoptera frugiperda 幼虫、第二齢のHeliothis virescens 幼虫、第三齢のTr ichoplusia ni 幼虫、第三齢のPseudoplusia includens幼虫、第三齢のPlutella xylostella 幼虫、第三齢 のSpodoptera littoralis幼虫および第三齢のMamestra brassicae幼虫を使った 人工飼料混和バイオアッセイにより、B.t.k.活性を測定する。 B.t.製品にＩａを加えることによる増強のレベルを決定しそして影響を与える 昆虫の範囲を確立するために、飼料混和バイオアッセイを実施する。シロイチモ ジヨトウ（Spodoptera exigua）に対する高濃度のＩａ（7.4〜23.7 ｇ Ｉａ／B IU）を使った実験では、BIOBIT^TM FC（FCは流動性濃縮物を表す）を増強するの に精製Ｉａ（70％活性成分、30％酢酸対イオン）を使用する。表IV中に与えた残 りのデータは、Ｉａ（0.658％活性成分）を使ったBOBIT^TM HPWP（高活性湿潤性 粉末）の増強を示す。ハスモンヨトウ（S. littoralis）とヨトウガ（M．brassi cae ）はFLORBAC^TM HPWP とＩａを使って試験する。 様々なB.t.製品の重量を量り、0.1 〜237 ｇ Ｉａ／BIU となるようにＩａを 添加する。0.1% Tween^TMで容量を調整する。試料を１分間超音波処理し、次いで 希釈して最終容量にする。生試料（Ｉａを含まない）と参照物質も同様に調製す る。参照物質は、１mgあたり16,000国際単位（IU）の効力と指定されているB.t. k. HD-1-S-1980（NRRLから入手）と、53,000スポドプテラ単位／mg（SU）の効力 と指定されているJAVELIN^TM WG とを含んで成る。 水、寒天、砂糖、カゼイン、小麦胚芽、メチルパラベン、ソルビン酸、あまに 油、セルロース、塩およびビタミンから成る標準人工飼料を20ｌのヤカンの中で 調製する。これにより、各試験物質につき７種類の異なる濃度を有する10〜12の 試料を試験するのに充分な飼料が得られる。B.t.溶液を系列希釈して16mlアリコ ートを与える。 各アリコートを184 gの溶融飼料に加える。次いでこの混合物をホモジナイズし 、40の個別セルを有するプラスチック製トレーに注入 する。飼料の各バッチごとに３枚の対照トレーを用意する。飼料が冷めて固まっ たら、既知年齢（第二〜三齢）の昆虫一匹を各セルに入れ、穴をあけた透明なマ イラーシートでトレーを覆う。該トレーをラックの上に置き、28℃および65％相 対湿度で４日間インキュベートする。 ４日後、昆虫の死亡率を評価する。各トレーを卓上面に対して強打し、動かな かった幼虫を死亡したものとしてカウントする。死亡率を計算し、データを平行 プロビット解析により分析する。ＬＣ₅₀、ＬＣ₉₀、回帰線の傾き、変動係数およ び効力を評価する。試料を最低３回または各試料について３つの濃度が計算平均 値の20％以内に入るまで試験する。各Ｉａ濃度に関連する活性の増加を計算する ために、試料中のB.t.の量を反映するようにB.t.／Ｉａ試料のＬＣ₅₀を補正する 。対となる生試料のＬＣ₅₀を補正後のＬＣ₅₀値で割り、Ｉａに関連するＬＣ₅₀の 縮小（分の１）を与える。 次の手順を使ってロベシア・ボスラナ（Lobesia bothrana）についてアッセイ する。未散布のブドウ畑からLobesia bothranaに冒されたブドウを回収し、幼虫 を取る。Ｉａの系列希釈液（250 μg/ml、500 μg/mlおよび1000μg/ml）を水中 に作製する。ペトリ皿の中央に一匹の幼虫を置く。幼虫が水を飲むのを観察した ら、切ったばかりのブドウ液果の入ったペトリ皿に幼虫を移す。幼虫を22℃で３ 〜４日保存する。 表IVに示されるように、全ての種についてＬＣ₅₀の有意な減少が観察される。 Ｉａによるシロイチモジヨトウに対する様々な製品の増強を、上述の飼料混和 バイオアッセイを使って決定する。添加したＩａ／BIU製品の量を下記表Ｖに示 す。Ｉａ／B.t.製品混合物を、寒天ベースの小麦胚芽カゼイン飼料に混和させる 。その飼料の上に昆虫を４日間置き、28℃で維持する。死亡率を記録し、プロビ ット解析を使って解析する。Ｉａを含まない対応製品からＬＣ₅₀、ＬＣ₉₀および 効力を算出する。表Ｖに示した結果は、Ｉａが様々な入手源から得られた様々な B.t.k.およびB.t.a.製品を増強することを示す。それらの製品中に含まれるB.t. 株は上記の第5.2.章に記載されている。 6.7. 葉上バイオアッセイ 葉上バイオアッセイは、BIOBIT^TM FC とＩａを使ってブロッコリー植物上の第 二齢シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）幼虫に対して実施する。Ｉａ対B OBIT^TM FCの比は同一の２ｇ Ｉａ／BIUBIOBIT^TM FC である。１エーカーあたり2 0ガロンの搬送容積を有するトラックスプレーを使ってブロッコリー植物に処理 を施す。散布液付着物が乾燥した後で植物から葉を切り取り、第二齢のシロイチ モジヨトウ幼虫に感染させる。その結果を下記第VI表に示す。8.7BIU／ヘクター ルのBOBIT^TM FC＋Ｉａの量で100％死亡率が観察され、一方で単独のBOBIT^TM FC は58.8 BIU／ヘクタールの量で幼虫の92％を殺し、17.6 BIU／ヘクタールの量で ８％を殺した。処理植物を８時間直射日光の中に置き、その後で葉を切り取り幼 虫に感染させた。日光の下で８時間後、単独のBOBIT^TM FCは58.8 BIU／ヘクター ルで27％の死亡率を与えたが、一方BOBIT^TM FC＋Ｉａは8.7 BIU／ヘクタールで1 00 ％の死亡率を与えた。 第四齢初期の幼虫を使って行った葉上アッセイでは、単独のBIOBIT^TM FCが52 BIU／ヘクタールで75％の死亡率を与え、一方でBIOBIT^TM FC （FCは流動性濃縮 液である）＋Ｉａは13 BIU／ヘクタールで100 ％の死亡率を与えた。 6.6.2. 圃場試験 ヒヨコマメに対する圃場試験（シロイチモジヨトウ、Spodopteraexigua）は、 単独のBIOBIT^TM FC は70 BIU／ヘクタールの量で51％防除を与えるが、２ｇ Ｉ ａ／BIU BIOBIT^TM FC は40 BIU／ヘクタールの量で89％防除を与えることを証明 した（防除無しのものに比較して）。 スイートコーンに対する圃場試験（Spodoptera frugiperda）は39.5 BIU／ヘ クタールにおいて２ｇ Ｉａ／BIU BIOBIT^TM FC が84％防除を与えることを証明 した。 6.9. 抵抗性率 感受性および抵抗性コナガ（Plutella xylostella）のコロニーをバイオアッ セイする。抵抗性の蛾は、JAVELIN^TM WGへの激しい暴露の後でB.t.抵抗性を発現 したフロリダからの圃場採集試料である。葉浸漬バイオアッセイを使ってBIOBIT^TM HPWP＋Ｉａを分析した。JAVELIN^TM WG およびXENTARI^TMに対する抵抗性をＩ ａ無しでアッセイする。直径６cmのキャベツの葉の円形切片を、８つの異なる濃 度のうちの１つのB.t.製品またはB.t.／Ｉａ製剤中に10秒間浸漬する。濃度は1 〜1000 ppmの範囲に及ぶ。葉の円形切片を２時間風乾し、第二齢幼虫（0.2〜0.4 mg）の入ったプラスチック製ペトリ皿の中に置く。25匹昆虫／用量／日を２回繰 り返して50匹昆虫／用量にする。27℃で72時間後、死亡率を記録する。プロビッ ト解析を使って用量−死亡率回帰を解析する。感受性の蛾のＬＣ₅₀とＬＣ₉₀値を 割ることにより抵抗性の比率を算出する。結果を表VIIに示す。結果は、BIOBIT^{T M} HPWPが２ｇ Ｉａ／BIUおよび４ｇ Ｉａ／BIUを増強することを指摘する。特に ４ｇ Ｉａ／BIUでは、ＬＣ₅₀抵抗性率に２倍の減少とＬＣ₉₀抵抗性率に10倍の減 少が認められる。 本明細書中に記載され主張される発明は、明細書中に開示される特定態様によ り範囲を限定されるべきではない。何故なら、それらの態様は本発明の幾つかの 観点の例示のつもりだからである。あらゆる同等の態様を本発明の範囲内に含め るつもりである。実際、本明細書中に例示し記載したものに加えて、上記説明か ら本発明の様々な変形が当業者には明白であろう。そのような変形も添付の請求 の範囲の中に含まれる。 様々な参考文献が明細書中に引用されているが、その開示はそっくりそのまま 参考として組み込まれる。 ７．微生物の寄託 次のバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株は、ブダペス ト条約に従って、合衆国 61604、イリノイ州ペオリア、ユニバーシティストリ ート1815の Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Nort hern Regional Research Center（NRRL）に寄託されている。 株 受託番号 寄託日 EMCC0086 NRRL B-21147 1993年10月6日 EMCC0087 NRRL B-21148 1993年10月6日 上記株は、特許および商標庁長官により37 C.F.R. §1.14および35 U.S.C. § 122 の下で権利を与えられることが決定された人に本特許出願の係属中は培養物 が入手可能であることを保証するという条件下で寄託されている。該寄託物は、 本出願の写しまたはその子出願が出願される国の外国特許法により要求される時 には入手可能である。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の決定により 認められた特許権に反して本発明を実施する許諾であると解してはならない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１１月２８日 【補正内容】 請求の範囲 １．バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）系殺虫剤の殺虫 活性を増強する因子であって、13個の炭素を含み、水溶性であり、約100 ℃で少 なくとも約30分間安定であり、紫外光に当てた時に少なくとも約10時間安定であ り、且つ約２のｐＨで約３日間安定である因子。 ２．前記因子が 1.5，3.22，3.29，3.35，3.43，3.58，3.73，3.98，4.07，4. 15，4.25，4.35に¹Ｈ−ＮＭＲシフトを有する、請求項１に記載の因子。 ３．前記因子が約350 〜約700 の分子量を有する、請求項１に記載の因子。 ４．前記因子がバシラス・スリンジエンシス系殺虫剤の殺虫活性を少なくとも 約1.5 倍増強する、請求項１に記載の因子。 ５．前記バシラス・スリンジエンシス系殺虫剤がバシラス・スリンジエンシス 株と許容される担体とを含んで成る、請求項１に記載の因子。 ６．前記バシラス・スリンジエンシス系殺虫剤がバシラス・スリンジエンシス 株の胞子と殺虫剤上許容される担体とを含んで成る、請求項１に記載の因子。 ７．前記バシラス・スリンジエンシス系殺虫剤が害虫に対して活性を有するバ シラス・スリンジエンシス株からのタンパク質またはその断片と殺虫剤上許容さ れる担体とを含んで成る、請求項１に記載の因子。 ８．前記バシラス・スリンジエンシス株からのタンパク質がバシラス・スリン ジエンシスδ−内毒素である、請求項７に記載の因子。 ９．前記因子がバシラス・スリンジエンシスδ−内毒素の殺虫活 性を約100 〜約400 倍増強する、請求項８に記載の因子。 10．下記構造（Ｉ） 〔上式中、 Ｒ¹はアミノ、ヒドロキシ、Ｃ_1-10アルキル、ベンズアミド、３，５−ジニトロ ベンズアミド、ｐ−ニトロベンズアミド、ハロベンズアミド、アルキルベンズア ミド、チオフェンアミド、フランアミド、ピロールアミド、イミダゾールアミド 、ピラゾールアミド、Ｃ_1-10アルキルアミノ、Ｃ_1-10ジアルキルアミノ、Ｃ_1-10 アルキルもしくはベンジルエステル、ハロゲン、またはＣ_1-10アルコキシであり ； Ｒ²は（ＣＨ₂）_nであり、ここでｎは0〜10の整数であり； Ｒ³とＲ⁴は独立的に（ＮＨ）_Pであり、ここでｐは０または１であり； であり、ここでＸ¹，Ｘ²，Ｘ³，Ｘ⁴，Ｘ⁵，Ｘ⁶およびＸ⁷は独立的にNH₂、OH、ア セチル、ハロゲンまたはＣ_1-10アルコキシでありそしてｑは1〜10の整数であり ； Ｒ⁶はヒドロキシル、アミノ、Ｃ_1-10アルコキシ、ベンゾキシ、ベンジルエステ ル、３，５−ジニトロベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、ハロベ ンジルエステル、アルキルベンジルエステル、チオフェンエステル、フランエス テル、ピロールエステルまたはイミダゾールエステルである〕を有する化合物； または殺虫剤上許容されるその塩。 11．前記因子が下記構造（Ｉａ） を有する、請求項10に記載の因子。 12．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子であって、前記因子または その誘導体が(a)バシラス株を醗酵させ；(b)(a)の醗酵物の上清を回収し；そし て(c)(b)の上清から前記因子またはその誘導体を単離することにより得られる、 バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子。 13．前記因子がバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）の醗酵上清から得 られる、請求項12に記載の因子。 14．前記因子がバシラス・セレウス（Bacillus cereus）の醗酵上清から得ら れる、請求項12に記載の因子。 15．前記因子がバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の醗 酵上清から得られる、請求項12に記載の因子。 16．前記因子が、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（kurstaki）、 バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（aizawai）およびバシラス・スリ ンジエンシス亜種ガレリエ（galleriae）から成る群より選択されたバシラス・ スリンジエンシスの亜種、または実質的に同じ殺虫活性を有するその変異株の醗 酵上清から得られる、請求項15に記載の因子。 17．前記因子がバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキまたは殺虫活性を 有するその変異株の醗酵上清から得られる、請求項15に記載の因子。 18．前記因子がバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキのcry^- spo^- 変異 株の醗酵上清から得られる、請求項15に記載の因子。 19．(a)バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子および(b)バシラス菌系 殺虫剤を含んで成る殺虫剤組成物であって、前記因子がBIU あたり少なくとも約 0.1 ｇの量で前記組成物中に存在する殺虫剤組成物。 20．(a)バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子および(b)バシラス菌系 殺虫剤を含んで成る殺虫剤組成物であって、前記因子がバシラス菌δ−内毒素お よび胞子１ｇあたり少なくとも約0.05 ｇの量で前記組成物中に存在する殺虫剤 組成物。 21．前記組成物が害虫に対して活性を有するウイルスを更に含んで成り、そし て前記因子が害虫に対して活性を有するウイルスの殺虫活性を更に増強する、請 求項19または20に記載の組成物。 22．前記バシラス・スリンジエンシスがバシラス・スリンジエンシス亜種クル スタキおよびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイから成る群より選択さ れる、請求項19または20に記載の組成物。 23．(a)請求項１の因子および(b)害虫に対して活性を有するウイルスを含んで 成る殺虫剤組成物。 24．(a)請求項１の因子および(b)殺虫剤担体を含んで成る殺虫剤組成物であっ て、前記因子が少なくとも約0.01重量％の量で前記組成物中に存在する殺虫剤組 成物。 25．害虫を防除する方法であって、請求項19，20，23または24の殺虫剤組成物 の害虫防除有効量に害虫を暴露することを含んで成る方法。 26．前記害虫がトランスジェニック植物上に存在する、請求項25に記載の方法 。 27．前記トランスジェニック植物がバシラス・スリンジエンシス 遺伝子を含有する、請求項26に記載の方法。 28．前記植物がバシラス・スリンジエンシス系殺虫剤に以前に暴露されたこと がある、請求項26に記載の方法。 29．バシラス・スリンジエンシス系殺虫剤に対する害虫の抵抗性を減少させる 方法であって、害虫の抵抗性を減少させるのに有効な量の請求項24の組成物に害 虫を暴露することを含んで成る方法。 30．バシラス・スリンジエンシス系殺虫剤の殺虫活性を増強する方法であって 、バシラス・スリンジエンシス系殺虫剤に暴露された害虫に、前記バシラス・ス リンジエンシス系殺虫剤の殺虫活性を増強するのに有効な量の請求項24の組成物 を投与することを含んで成る方法。 31．請求項１の因子を得る方法であって、 (a)バシラス株を醗酵させ； (b)(a)の醗酵物の上清を回収し；そして (c)(b)の上清から前記因子を単離して実質的に純粋な因子を得る ことを含んで成る方法。 32．請求項１の因子の同定方法であって、 (a)バシラス株を醗酵させ； (b)(a)の醗酵物の上清を回収し；そして (c)(b)の上清をバシラス菌系殺虫剤の増強についてアッセイする ことを含んで成る方法。 33．請求項１の因子を生産するバシラス株の変異体または変異株。 34．請求項33の変異体または変異株を得る方法であって、 (a)親株を変異原で処理し； (b)突然変異させた親株を変異株の選択に適当な培地上で増殖させ； そして (c)変異株を選択する ことを含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 207/00 8217−4Ｃ 307/00 8217−4Ｃ Ｃ１２Ｐ 13/00 2121−4Ｂ // Ｃ０７Ｃ 237/22 9547−4Ｈ (31)優先権主張番号 ０８／０９５，２４０ (32)優先日 1993年７月20日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＵ， ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 スターンズ，ロバート リー アメリカ合衆国，カリフォルニア 95834, サクラメント，リオ デル オロ レーン 418 (72)発明者 マッキントッシュ，スーザン キャリル アメリカ合衆国，カリフォルニア 95695, ウッドランド，デボラ ストリート 908

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子。 ２．前記因子が更に害虫に対して活性を有するウイルスの殺虫活性を増強する 、請求項１に記載の因子。 ３．前記因子が約100 ℃までの水中で少なくとも約５分間安定である、請求項 １に記載の因子。 ４．前記因子が直射日光に対して少なくとも約10時間安定である、請求項１に 記載の因子。 ５．前記因子が約２のｐＨで約10日間安定である、請求項１に記載の因子。 ６．前記因子が約350 〜約700 の分子量を有する、請求項１に記載の因子。 ７．前記因子が水に可溶である、請求項１に記載の因子。 ８．前記因子がバシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を少なくとも約1.5 倍増強する 、請求項１に記載の因子。 ９．前記バシラス菌系殺虫剤がバシラス株と許容される担体とを含んで成る、 請求項１に記載の因子。 10．前記バシラス株がバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis ）である、請求項９に記載の因子。 11．前記バシラス菌系殺虫剤がバシラス株の胞子と殺虫剤上許容される担体と を含んで成る、請求項１に記載の因子。 12．前記バシラス株がバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis ）である、請求項11に記載の因子。 13．前記バシラス菌系殺虫剤が、害虫に対して活性を有するバシラス株からの タンパク質またはその断片と殺虫剤上許容される担体とを含んで成る、請求項１ に記載の因子。 14．前記バシラス株からのタンパク質がバシラス・スリンジエンシスδ−内毒 素である、請求項13に記載の因子。 15．前記因子がバシラス・スリンジエンシスδ−内毒素の殺虫活性を約100 〜 約400 倍増強する、請求項14に記載の因子。 16．下記構造（Ｉ） 〔上式中、 Ｒ¹はアミノ、ヒドロキシ、Ｃ_1-10アルキル、ベンズアミド、３,５−ジニトロベ ンズアミド、ｐ−ニトロベンズアミド、ハロベンズアミド、アルキルベンズアミ ド、チオフェンアミド、フランアミド、ピロールアミド、イミダゾールアミド、 ピラゾールアミド、Ｃ_1-10アルキルアミノ、Ｃ_1-10ジアルキルアミノ、Ｃ_1-10ア ルキルもしくはベンジルエステル、ハロゲン、またはＣ_1-10アルコキシであり； Ｒ²は（CH₂）_nであり、ここでｎは０〜10の整数であり； Ｒ³とＲ⁴は独立的に（NH）_pであり、ここでｐは０または１であり； であり、ここでＸ¹，Ｘ²，Ｘ³，Ｘ⁴，Ｘ⁵，Ｘ⁶およびＸ⁷は独立的にNH₂、OH、ア セチル、ハロゲンまたはＣ_1-10アルコキシでありそしてｑは１〜10の整数であり ； Ｒ⁶はヒドロキシル、アミノ、Ｃ_1-10アルコキシ、ベンゾキシ、ベンジルエステ ル、３，５−ジニトロベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、ハロベ ンジルエステル、アルキルベンジルエス テル、チオフェンエステル、フランエステル、ピロールエステルまたはイミダゾ ールエステルである〕を有する化合物； または殺虫剤上許容されるその塩。 17．前記因子が下記構造（Ｉａ） を有する、請求項16に記載の因子。 18．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子であって、前記因子または その誘導体が(a)バシラス株を醗酵させ；(b)(a)の醗酵物の上清を回収し；そし て(c)(b)の上清から前記因子またはその誘導体を単離することにより得られる、 バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子。 19．前記因子がバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）の醗酵上清から得 られる、請求項18に記載の因子。 20．前記因子がバシラス・セレウス（Bacillus cereus）の醗酵上清から得ら れる、請求項18に記載の因子。 21．前記因子がバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の醗 酵上清から得られる、請求項18に記載の因子。 22．前記因子が、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（kurstaki）、 バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（aizawai）およびバシラス・スリ ンジエンシス亜種ガレリエ（galleriae）から成る群より選択されたバシラス・ スリンジエンシスの亜種、または実質的に同じ殺虫活性を有するその変異株の醗 酵上清から得られる、請求項21に記載の因子。 23．前記因子がバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキまたは殺虫活性を 有するその変異株の醗酵上清から得られる、請求項21に記載の因子。 24．前記因子がバシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキのcry^- spo^- 変異 株の醗酵上清から得られる、請求項21に記載の因子。 25．(a)バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子および(b)バシラス菌系 殺虫剤を含んで成る殺虫剤組成物であって、前記因子がBIU あたり少なくとも約 0.1ｇの量で前記組成物中に存在する殺虫剤組成物。 26．(a)バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子および(b)バシラス菌系 殺虫剤を含んで成る殺虫剤組成物であって、前記因子がバシラス菌δ−内毒素お よび胞子１ｇあたり少なくとも約0.05ｇの量で前記組成物中に存在する殺虫剤組 成物。 27．前記組成物が害虫に対して活性を有するウイルスを更に含んで成り、そし て前記因子が害虫に対して活性を有するウイルスのさ殺虫活性を更に増強する、 請求項25または26に記載の組成物。 28．(a)バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子および(b)バシラス菌系 殺虫剤を含んで成る殺虫剤組成物であって、前記バシラス菌がバシラス・スリン ジエンシス亜種クルスタキおよびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイか ら成る群より選択され、前記因子がBIU あたり少なくとも約0.1ｇの量で前記組 成物中に存在する殺虫剤組成物。 29．(a)バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子および(b)バシラス菌系 殺虫剤を含んで成る殺虫剤組成物であって、前記バシラス菌がバシラス・スリン ジエンシス亜種クルスタキおよびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイか ら成る群より選択され、前記因子がバシラス菌δ−内毒素および胞子１ｇあたり 少なくとも約0.05 ｇの量で前記組成物中に存在する殺虫剤組成物。 30．(a)害虫に対して活性を有するウイルスの殺虫活性を増強する因子および( b)害虫に対する活性を有するウイルスを含んで成る殺虫剤組成物。 31．(a)バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子および(b)殺虫剤担体を 含んで成る殺虫剤組成物であって、前記因子が少なくとも約0.01重量％の量で前 記組成物中に存在する殺虫剤組成物。 32．害虫を防除する方法であって、請求項25，26，28，29，30または31に記載 の殺虫剤組成物の害虫防除有効量に害虫を暴露することを含んで成る方法。 33．前記害虫が植物上に存在する、請求項32に記載の方法。 34．前記植物がトランスジェニック植物である、請求項33に記載の方法。 35．前記トランスジェニック植物がバシラス・スリンジエンシス遺伝子を含有 する、請求項34に記載の方法。 36．前記植物がバシラス菌系殺虫剤に以前に暴露されたことがある、請求項34 に記載の方法。 37．バシラス菌系殺虫剤に対する害虫の抵抗性を減少させる方法であって、害 虫の抵抗性を減少させるのに有効な量の請求項31の組成物に害虫を暴露すること を含んで成る方法。 38．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する方法であって、バシラス菌系殺 虫剤に暴露された害虫に、前記バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強するのに有 効な量の請求項31の組成物を暴露することを含んで成る方法。 39．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する実質的に純粋な因子を得る方法 であって、 (a)バシラス株を醗酵させ； (b)(a)の醗酵物の上清を回収し；そして (c)(b)の上清から前記因子を単離して実質的に純粋な因子を得る ことを含んで成る方法。 40．前記因子がカラムクロマトグラフィーにより上清から単離される、請求項 39に記載の方法。 41．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子の同定方法であって、 (a)バシラス株を醗酵させ； (b)(a)の醗酵物の上清を回収し；そして (c)(b)の上清をバシラス菌系殺虫剤の増強についてアッセイする ことを含んで成る方法。 42．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子を生産するバシラス株の変 異体または変異株であって、前記変異体または変異株により生産される因子の増 強活性が対応する親株により生産される因子の増強活性よりも大きい、前記バシ ラス株の変異体または変異株。 43．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子を生産するバシラス株の変 異体または変異株を得る方法であって、ここで前記変異体または変異株により生 産される因子の増強活性が対応する親株により生産される因子の増強活性よりも 大きく、 (a)親株を変異原で処理し； (b)突然変異させた親株を変異株の選択に適当な培地上で増殖させ； そして (c)変異株を選択する ことを含んで成る方法。 44．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子を生産するバシラス株の変 異体または変異株であって、前記変異体または変異株 により生産される前記因子の量が対応する親株により生産される因子の量よりも 多い、前記バシラス株の変異体または変異株。 45．バシラス菌系殺虫剤の殺虫活性を増強する因子を生産するバシラス株の変 異体または変異株を得る方法であって、ここで前記変異体または変異株により生 産される前記因子の量が対応する親株により生産される因子の量よりも多く、 (a)親株を変異原で処理し； (b)突然変異させた親株を変異株の選択に適当な培地上で増殖させ； そして (c)変異株を選択する ことを含んで成る方法。