JPH01309680A - 新規なバチルス菌株ａ３０，それを含有する殺虫剤組成物及び植物保護法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な細菌株に関し、特に細菌バチルス・スリ
ンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅ
ｎｓｉｓの新規菌株及びその使用に関する。

細菌バチルス・スリンジエンシスは昆虫を殺滅する結晶
蛋白質である菌体内毒素（エンドトキシンともいう）を
産生ずる。しかしながら、該菌体内毒素は哺乳動物に対
しては毒性がない。従って、該菌体内毒素は農業用殺虫
剤として、特に鱗翅目昆虫に対する殺虫剤として非常に
有用であり、バチルス・スリンジエンシスの１種又は２
種以上の菌株が長い間農業用殺虫剤として使用されて来
た。

市販品として最も一般に使用されるバチルス・スリンジ
エンシスの菌株は）ＩＤ−１（米国農務省に保存されて
いるバチルス・スリンジエンシス菌株類の保存菌から入
手できる）である。この公知の菌株ＨＤ−１の全般的な
菌学的性質は’Ｍｉｃｒｏ−ｂｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ
　ｏｆ　Ｐｅ５ｔｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａ
ｓｅｓ　１９７０−１９８０Ｊ　（Ｈ，Ｄ、Ｂｕｒｇｅ
ｓ　ｍ、＾ｃａｄｅｎ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（ロンドン
）発行、１９８１年）の第３５〜４４頁’Ｉｄｅｎｔｉ
ｆｉ−ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈ５ｅｒｏｔｙｐｅ　ｏｆ
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ」に
記載されている。本発明者らは今般公知の菌株ＨＤ−１
に概ね似た菌学的性質を有するが、一連の鱗翅目の害虫
に対して向上した殺虫活性を有することによってＨＤ−
１菌株と区別されるバチルス・スリンジエンシスの新規
菌株を見出した。

すなわち、本発明の要旨によれば、ナショナル・コレク
ション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バ
クテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　
ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｔａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ）に寄託番号ＮＣＩＢ　１２５７２とし
て寄託されたバチルス・スリンジエンシスの新規菌株Ａ
３０が提供される。また別の要旨によれば、前記の新規
菌株Ａ３０によって産生されたδ−菌体内毒素を含有す
ることを特徴とする新規殺虫剤組成物が提供されるもの
であり、更に昆虫の被害から植物を保護する方法であっ
て該昆虫を前記の新規菌株Ａ３０によって産生されたδ
−菌体内毒素に接触させることからなる昆虫の被害から
植物を保護する方法が提供される。

本発明の新規菌株Ａ３０はカナダ国オンタリオ州ダルリ
ンプル（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ）で採取した破砕した穀類
から単離された微生物である。本発明の新規菌株Ａ３０
はコロニーの形態学的性状において公知の菌株ＨＤ−１
に全般的に類似している。本発明の新規菌株Ａ３０と公
知の菌株Ｉ（Ｄ−１の形態学的性状の比較を第１表に示
す。

本発明の新規菌株Ａ３０と公知菌株ＨＤ　−１の生化学
的性質の比較を第２表〜第４表に示す。

員−Ｕ マイクロタイター平板培地（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｐ
ｌａｔｅ）での生化学的特性 一：陰性反応を表わす； ＋：陽性反応を表わす （＋）二部公的な反応を表わす： Ｙ：黄色になっていることを表わす 第一１−表 ＩＤ−ＩＤＥＮＴ平板培地での生化学的特性ｒｌＤ−Ｉ
ＤＥＮＴ　ＪはＡＰＩ　Ａｎａｌｙｔａｂ　Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ社の商標である。

第−土一表 ｒＡＰＩ−ＺＹＭＥＪはＡＰＩ　Ａｎａｌｙｔａｂ　Ｐ
ｒｏｄｕｃｔ５社の商標である。

０：反応しないことを表わす　　＋：陽性反応を表わす
前記の類似性があることの点からみて、同一の菌種に属
するにも拘わらず、新規菌株Ａ３０が鱗翅目害虫に対し
て、公知菌株ＨＤ−１と比べて著しく向上した殺虫活性
を示すことは意外である。

本発明の新規菌株Ａ３０はザ・ナショナル・コレクショ
ンズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バク
テリアから入手できるＮＣＩＢ　１２５７２の菌株試料
を適当な培地中で適当な条件下で培養することによって
必要量を製造できる。培養条件及び培地は当業者には周
知である。培地は、例えば一般に窒素源（例えば魚肉蛋
白）や炭水化物源例えばデンプンを含有する。適当な培
養条件としては１５〜４５°Ｃの範囲の温度とほぼ中性
のｐＨが挙げられる。培養は回分式で代表的には１〜３
日間行なうのが都合がよい。

本発明の殺虫剤組成物は新規菌株Ａ３０の培養液を濃縮
することによって、例えば遠心分離するか又は濾過し、
次いで所望の適当な配合剤を加えることによって製造す
ることができる。有用であり得る配合剤としては、例え
ば界面活性剤、例えば湿潤剤、固体希釈剤、分散剤及び
紫外線安定剤が挙げられる。所望ならば、公知の方法で
固体製剤製造することができる。

本発明の鱗翅目の昆虫による虫害から植物を保護する方
法は一般に昆虫が蔓延した植物に又は蔓延しそうな植物
を水のような希釈剤で希釈した上記の殺虫剤組成物で処
理する（例えば噴霧する）ことによって行なう。該殺虫
剤の有効成分は有毒性のδ−菌体内毒素である。所望な
らば、該殺虫剤は有毒性のδ−菌体内毒素を産生ずる細
菌から独立して、植物に又は蔓延する昆虫に施用するこ
とができる。しかし、前記の細菌から結晶性蛋白を分離
することは一般に必要がない。

本発明の鱗翅目の昆虫による被害から植物を保護する方
法を実施する一つの方法は、昆虫の被害に感受性の植物
がその生体内の現場でδ−菌体内毒素を産生ずるように
植物を調整することである。

これは新規菌株ＮＣＩＢ　１２５７２からδ−菌体内毒
素の遺伝子を公知の方法でクローニングし、植物体内に
該遺伝子の発現を生起させる適当なプロモーター（例え
ばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）を該遺伝子に具備させ
、次いで植物を公知の方法（例えばＴｉプラスミドの使
用）で形質転換することによって行なわれる。上記のこ
とを具現させるような方法は欧州特許出願（ＥＰＡ）第
１４２９２４号明細書くＡｇｒｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社）
により詳しく記載されており、その開示内容の記載は本
明細書に引用される。

本発明の方法で撲滅し得る昆虫は鱗翅目（ｃｏｌｅｏｐ
ｔｅｒａ）例えば以下の第５表に挙げた昆虫である。

ウオーム（Ｃｏｒｎ　　　　ｈｏｗａｒｄｉＲｏｏ　ｔ
ｗｏｒｒａ） ワタミハナゾウムシ　ＡｎｔｈＯｎＯｍｌｓｑｒａｎａ
ｉｓ本発明の方法は鱗翅目昆虫が蔓延しやすい広範囲の
植物を保護するのに使用することができる。

本発明の方法で保護される市販の重要な植物の具体例は
トウモロコシ及び球果植物、並びにワタ、ジャガイモ、
稲、小穀粒穀物例えば小麦及び大麦、並びにレタス、ト
マト及びテンサイを含めた野菜類である。

本発明を以下の実施例によって説明する。

カナダ国オンタリオ州ダルリンプル（Ｄａｌｒｙｎ＋ｐ
ｌｅ）で採取した穀類の破砕した試料を取り、その５．
０ｇを０．０５％ペプトン水４５ｄを入れた希釈ビンに
装入し１０−１希釈液を得た。次いでこの希釈液試料を
６０°Ｃの水浴に移して１０分間熱処理した。更に高希
釈するために上記の希釈液試料０．５　ｄを採取し、そ
れを０．０５％ペプトン水４．５ｉに加えることによっ
て更に希釈した希釈液を調製した（すなわち、上記の１
０−１希釈液Ｑ、５ｍｌをペプトン希釈剤４．５ｄに加
えて１０４希釈液を得る）。この希釈は１０−Ｓ希釈液
が得られる迄繰り返した。バチルス・セレウス■匹■…
ｓ　ｃｅｒｅｕｓ）　選ｔＲ培地〔バチルス・セレウス
寒天基剤、カナダ国オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）社からコ
ード（ｃｏｄｅ）ＣＭ　６１７として入手できる〕とエ
スクリン（ｅｓｃｕｌｉｎ）寒天（水１１当りのｇ数：
エスクリン１．０ｇ、クエン酸第二鉄０．５　ｇ、ペプ
トン１０ｇ、’　ＮａＣ１５ｇ、寒天２０ｇ）をｉｏ−
”　〜ｉｏ−’希釈液を平板培養するのに使用した。平
板にした試料は３０°Ｃで５日間培養し、次いで潜在し
ているバチルス・スリンジエンシスのコロニー（集落と
もいう）を調べた。スミルノフ（Ｓｎｔｒｎｏｆｆ）染
色法を用いて選択したコロニーのスライドガラス試料を
作成し、顕微鏡（油浸レンズを使用し１０００倍の倍率
で）で黒く染色された副胞子結晶（ｐａｒａｓｐｏｒａ
ｌ　ｃｒｙｓｔａｌｓ）の存在を調べた。副胞子結晶は
通常は両角錐状であるが必ずしも両角錐（ｂｉｐｙｒａ
ａ＋１ｄａｌ）の形状とは限らない。

結晶が認められた陽性（ｃｒｙｓｔａｌ−ｐｏｓｉＨｖ
ｅ）コロニーは純培養物を確実に収得するために、普通
寒天上に画線塗抹し、３０°Ｃで５日間培養した。結晶
の存在を確認し且つ純度を調べるためにスミルノフ染色
法を反復した。純化したコロニーは普通寒天斜面に移植
し、別途使用のために４０゛Ｃの冷蔵庫中で保存した。

接種試料の菌株Ａ３０を寒天斜面から、１００ｍ１のＣ
ＲＬ　Ｎα１培地〔水１１のｇ数又は−数；普通ブイヨ
ン８ｇ、グルコース６ｇ、酵母エキス５ｇ、キシロース
０．５ｇ、綿実粉（ｃｏｔｔｏｎ　５ｅｅｄ　ｆｌｏｕ
ｒ）エキス３０滅、コーン（ｃｏｒｎ）？ｉ液３．２　
ｄ、マリ−メンデルの塩混合物１ｄ〕を装入したエルレ
ンマイヤーフラスコに移植し、３４００ｒｐｍで攪拌し
なから３０°Ｃで培養した。２４時間後に、この培養液
の全量１００ｍ２を使用し、２！フラスコに入れた上記
と同一の培地１ｆｆｉに接種した。これを３０Ｏｒｐｍ
で攪拌しなから３０°Ｃで５日間培養した。次いで、細
胞、胞子及び結晶を遠心分離で集菌し、ダルメージ（Ｄ
ｕｌｍａｇｅ）法を用いてアセトンで沈降させた。

災立叶ｌ 木光朋沙１厘月皿戒立Ω呈ｌ。

前記の培養サイクルの完了時、実施例２に記載したよう
にして培養液からバチルス・スリンジエンシスの胞子と
結晶を分離するごとによってまずＡｃ１菌株を集菌した
。分離したバチルス・スリンジエンシスの胞子と結晶は
水１００　ｄに再懸濁し、次いでこれにモルウェフト（
Ｍｏｒｖｅｔ）Ｄ　−４２５（分散剤）４．９ｇ、ビー
ガム（Ｖｅｅｇｕｍ）　ＨＶ　（懸濁剤）４．９ｇ、ツ
イーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０　（湿潤剤）４．９ｄ及び
ソルボ（Ｓｏｒｂｏ）　（凍結防止剤）　２４．４７を
加えて濃厚液剤に製剤した。各成分は上記した順序で別
々に加えた。

この製剤は使用に先立って４°Ｃで保持した。対照とし
て供するため公知菌株ＨＤ−１を使用して同様の製剤を
調剤した。

後記の実施例４〜７は種々の鱗翅目昆虫に対する本発明
の新規バチルス・スリンジエンシス菌株の活性を説明す
る。

尖施舅土 ジャガイモの葉を種々の濃度の（実施例２に記載したよ
うにして得た）Ａｃ１菌株の胞子と結晶の懸濁液に浸漬
し、生後１日日（１ｄａｙ　−ｏｌｄ）のコロラドハム
シ幼虫を飼育するのに使用した。得られた結果を第６表
に示す。上記の濃度では公知菌株ＨＤ−１は効果がなか
った。

第６表 ＊薬剤未処理の対照例の供試虫に食べられた葉の面積％
と比較した供試虫に食べられた葉の面積（％）の減少率
の測定値を表わす。

皇嵐■工 菌株Ａ３０をＬ普通寒天（１２当り、トリプトン１０ｇ
、酵母エキスＬｏｇ、　ＮａＣｌ３　ｇ、寒天１０ｇ）
を入れた２１０ｍｍＸ　２１０ｍｍのベトリ皿上で３０
℃で５日間培養し、寒天表面からの融合成長（ｃｏｎｆ
ｌｕｅｎｔｇｒｏｗｔｈ）を集め、次いで凍結乾燥する
ことによってバチルス・スリンジエンシスの胞子と結晶
の混合物を調製した。この凍結乾燥した胞子と結晶を、
滅菌した８％シ＝１糖溶液と混合し最終濃度４８００ｐ
ｐｍに調製した。この溶液をウェスタン・コーン・ルー
トウオーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔｗｏ
ｒｎ＋）（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｊ］ｉ　ｆ　ｅ　ｒ　
ａ　）の食餌源として使用した。ｌ試験当り１令期の幼
虫２５匹を使用した。得られた結果を第７表に示す。

第７表 ＤＡＴは薬剤処理後の経過日数を表わす。

実施■工 実施例５に記載したようにして菌株Ａ３０の胞子と結晶
の混合物を調製した。凍結乾燥した胞子と結晶を、滅菌
した２、５％シ＝！糖溶液と混合し最終濃度２０００ｐ
ｐｍに調製した。この溶液をサザン・コーン中ルートウ
オーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔｗｏｒ
ｍ）Ｄｆａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍ　ｕｎｃｔ
ａｔａｈｏｗａｒｄｉ）の食餌源として使用した。鱗翅
目昆虫に活性なバチルス・スリンジエンシス菌株Ａ２０
（ザ・ナシゴナル・コレクショ、ンズ・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリン・バクテリアに寄託番号ＮＣ
ＩＢ　１２５７０として寄託されている）を含有する同
様の製剤を対照として使用した。

得られた結果を第８表に示す 第８表 実施例５に記載したようにして菌株Ａ３０の胞子と結晶
の混合物を調製した。凍結乾燥した胞子と結晶の混合物
を使用しこれにワタの子葉を浸漬した。次いでこのワタ
の子葉にワタミハナゾウムシＡｎｔｈｏｎｏｍｕｓ　　
ｒａｎｄｉｓの幼虫又は成虫のいずれかを蔓延させた。

３日後に記録した結果を第９表に示す。

第９表 薬剤未処理（対照）の幼虫の死出率は２％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スコットランドのザ・ナショナル・コレクションズ
   ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリ
   アに寄託番号ＮＣＩＢ１２５７２として寄託されてある
   バチルス・スリンジエンシス￥（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔ
   ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）￥の新規菌株Ａ３０。 ２、前記の新規菌株Ａ３０によって産生された殺虫性δ
   −菌体内毒素を有効成分として含有する鱗翅目害虫防除
   用殺虫剤組成物。 ３、さらに固体希釈剤又は界面活性剤を含有する請求項
   ２記載の殺虫剤組成物。 ４、鱗翅目の昆虫による被害から植物を保護する方法で
   あって、該鱗翅目昆虫を請求項１記載の新規菌株Ａ３０
   によって産生されたδ−菌体内毒素に接触させることか
   らなる、鱗翅目の昆虫による被害から植物を保護する方
   法。 ５、鱗翅目の昆虫による被害を受ける前に又は被害を受
   けている間に植物を請求項２又は３のいずれかに記載の
   組成物の殺虫有効量で処理することからなる請求項４記
   載の方法。 ６、前記のδ−菌体内毒素が請求項１記載の新規菌株Ａ
   ３０から誘導された遺伝子によって植物体内に産生され
   たものである請求項４記載の方法。 ７、前記の植物がジャガイモ又はワタである請求項４〜
   ６のいずれかに記載の方法。 ８、前記の昆虫がコロラドハムシ又はワタミハナゾウム
   シである請求項７記載の方法。 ９、前記の植物がトウモロコシである請求項４〜６のい
   ずれかに記載の方法。 １０、前記の昆虫がサザン・コーン・ルートウォームも
   しくはウェスタン・コーン・ルートウォームである請求
   項９記載の方法。