JPH02270804A - 鱗翅目に活性な新規なバシラス・スリンギエンシス分離体 - Google Patents

鱗翅目に活性な新規なバシラス・スリンギエンシス分離体

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JPH02270804A
JPH02270804A JP1275131A JP27513189A JPH02270804A JP H02270804 A JPH02270804 A JP H02270804A JP 1275131 A JP1275131 A JP 1275131A JP 27513189 A JP27513189 A JP 27513189A JP H02270804 A JPH02270804 A JP H02270804A
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JP1275131A
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Jewel Payne
ジュエル ペイン
George G Soares
ジョージ ジー.ソアーズ
Henry W Talbot
ヘンリー ダブリュ.タルボット
Theresa C Olson
テレサ シー.オルソン
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    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22Bacillus
    • A01N63/23B. thuringiensis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は鱗翅目に活性な新規なバシラス・スリンギエン
シス分離体に関する。
〔従来の技術〕
(1)微生物殺虫剤 バシラス・スリンギエンシス(11,i、、)はδ−J
−ントトキシンと指定される昆虫毒素を生産する。これ
はB、t、胞子形成細胞によって合成される。この毒素
は感受性のある昆虫の幼虫によって結晶型で摂取される
と、昆虫の腸)αプロテアーセによって生物学的に活性
の部分に転換される。−次目標は昆虫の腸上皮細胞であ
り、これが急速に破壊される。
B、t、の報告された活性スペクトルは、III翅口内
の昆虫種を包含し、その多くは農林業の主要害虫である
。活性スペクトルはまた、蚊とブヨを含む双翅目(Di
pt、era)の昆虫を包含している。コウチ・ティー
・エル(Coucl1、 T、L、)(Ir180年)
「バシラス・スリンギエンシス・ハラエテ佇イスラエレ
ン 6一 シス(B、t、huringiensis var、 
1sraelensis)の蚊病原性」工業微生物学の
発展22巻l−76頁:ビーグル・シー・シー(Ree
gle、 C,C,)(1978年)「農業生態系にお
ける昆虫体内細菌の使用」工業微生物学の発展20巻G
?−104頁を参叩のこと。T+ 、 t、 、分離体
は鞘翅目の甲虫に対しても活性があることが示された。
(2)鱗翅目害虫 コナガ(diamnn旧+ack  mot、h、DI
M)(Plutel la  xylost、ella
)は、十字花科の植物に刻する鱗翅目害虫である。小さ
な幼虫は葉を食べて、葉に穴を開ける。これは、幼虫の
集団数が多いと多大の被害を生ずる。ギヤl\ツ、ブ1
コツコリ、ボクチョイ、カリフラワーのような十字花科
の全野菜作物のほか、コナガはストック、ニワナズナ(
sweet、 a!yssum)、ニオイアラセイトつ
(uallflnwer)及びキャンプ−タフトのよう
な、あろ観1!l’ +11Y物や)品室植物も攻撃す
る。
〔発明が解決しようとするr!!題〕
コナカは広く分布し、そのポスト植物が育つところなら
、事実−ヒとこでも見られる。合衆国、中米、欧州及び
アジアでは、十字花科植物の主要害虫である。これらの
地域の多くの場所で、これか品も重要な害虫となったの
は、(ヒ学殺虫剤に対して耐性を生し、効果的に防除て
きないためである。
これらの地域では、代替防除戦略かとうしても必要性で
ある。バシラス・スリンギエンシスは過去において幾分
の効果があったか、この種に合わせたより新しく、より
効力のある苗株は実質的に効能を改良でき、この害虫種
な防除するという重要な必要性を満たしうる。
〔課題を解決する手段〕
本発明は試験されだすへての鱗翅目害虫に活性のある新
規なバシラス・スリンギエンシス(B、、t、)分離体
に関する。例えは、本明細書でバシラス・スリンギエン
シスPS85AI (R91,、f”5R5Al)とし
て翔られる新規なり、t、分離体は、コナガに対して活
性があることがわかっている。
本発明はまた、殺虫性状をもったB、1..PS85A
Iの変異種をも包含する。例えは、R,1,.PS85
AIの非胞子形成変異種は、エチルメタンスルホネ−1
・(E MS)変異誘発から得られた。この変異種は、
本明細書で8.↑.PS85AI−168と呼はれてい
る。R,t.PS85AI又は[1、+5.85AI−
168のその他の変異種をつくる手1116は、微生物
学の技術で周知である。紫外光とニトログアニジンがこ
の目的に広く用いられる。
更に、本発明は実質的に無傷の細胞を目標害虫環境に施
用する時に殺虫活性を長くするために、実質的に無傷の
B、t.PS85AI又はその変異種を処理することを
包含する。このような処理は、手法が殺虫剤の性状に悪
影響しない限り、又は殺虫剤を(呆慢する細胞能力を消
滅させない限り、化学的又は物理的手段、又は化学・物
理的手段の鞘み合わせでありうる。処理された[1.t
、l’585Al細胞は、殺虫剤毒素に対する保護被覆
としての役目を果たす。
毒素は、目標害虫による摂取時にそのままで作用させる
ために利用できる。
本発明の新規なバシラス・スリンギエンシス分離体は以
下の性状をもっている。
[1’(、t.PS85Alの特性コ 集落形態−[L1、、ζこ典1り的な大集落で、表面は
くすんている。
増殖期の細胞形態−B、↑、に典型的。
鞭毛の血清型−3a3b、カースタキ。
細胞内含有物−胞子1■ε成細抱は両神!(°J結晶を
つくり、これが部分的に小さめのつ方形結晶を包んでい
る。
プラスミド製剤−プラスミド製剤の7カロースゲル電気
泳動は、B−、t.PS85AIをB 、 t、 、 
II II刊及び他のB、t、分離体から区別している
アルカリ可溶性タンパク−n、t、Ps85Alは+3
0,000ダルトンのタンパクと60,000ダルトン
のタンパクをもっている。
活性−B、t.PS85A]は試験されたずへての鱗翅
目を殺虫し、コナガに対してはB、t、HD−1より5
倍以上の活性がある。
コナガ(Plutella xylostella)生
物検定結果二〇、t、l’585AI LC50:0.
02G713/mlB、t、1Irl−I LD50 
= 0.1旧I11</m1本出願で明らかにされてい
る培養基は、61f104合衆国イリノイ州ビオリア、
ノース・ユニハーノ=10− ティ・ストリート1815番地、北部研究センター、農
業研究(ノーヒス特許培青基保存施設01RRL)に寄
託された。
培養基       受託番号  寄託日バシラス・ス
リン  NRRL B− ギエンシスPS85Al   18426   198
8年10月11日B、・スリンキエ   )IRRL 
B−ンシスPS85AI−1(i8  18427  
 1988年lO月18日本培養基は、37 CFR1
、I4及び35 USCI22の下で権限があると特許
庁長官が決定した者は、本特許出願の係属中に、培養基
を入手できることを保証されるという条件により寄託さ
れた。また、本出願又はその子孫の対応特許出願が提出
されている国々の外国特許法で要求されるとおりに、寄
託物は人手できる。しかし、寄託物が人手できるからと
いって、行政行為によって付与された特許権を損わしめ
て本発明を実施する権利を構成するものではないことを
理解すべきである。
更に、本培養基寄託物は、ブタベスト微生物寄託条約の
規定に/&って17存され、一般の人々に入手可能とさ
れる。すなわち、寄託物の試料提供に刻する最も最近の
請求後少なくとも5年間、かつどんな場合も、寄託期日
から少なくとも30年間か、又は培養基を開示して発行
される特許の権利行使可能な肋間中、これらの寄託物は
、生育可能で汚染されていない状態に保つために必要な
あらゆる配慮をもって保存されろ。要求を受けた受託施
設が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合に
は、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものである
。本培養基寄託物の一般への入手可能性に関するすべて
の制限は、これらを開示した特許の付与に際して決定的
に取り除かれる。
8.1..PS85AI(NRRL 8−18426)
及U’ B 、 1.。85AI−168(NRRL 
B−18427)は、標準的な培地及び発酵技術を用い
て培養でざる。発酵1/、+ +I11の終了後、この
技術て周知の手段で、まずR、f、 、胞子及び/又は
結晶を発酵液から分離することにより、細菌を取り入れ
ることができる。回収されたB、 t、胞子及び/又は
結晶は、表面活性剤、分散剤、不活性担体及び特定目標
害虫への施用と取扱いを容易にするためのその他の成分
の添加によって、水和剤、a原液、粒剤Yは他の処方剤
に処方することができる。これらの処方施用手順は、ず
へてこの技術で周知である。
葉を食べる甲虫類やイモムシ類を防除するには、処方製
品を葉に噴霧ないしメケ布できる。
もう一つの取るべき方法は、誘引剤を含有する粒状餌に
B、土、、r’585AI又はRyl;.PS85AI
−168の胞子及び/又は結晶を混入し、粒剤を土壌に
施用して、」―壌に生息する鱗翅目の防除を行なうこと
である。
処方済みB、f.PS85AI又はその変異種を種子被
覆や根の処理用、又は植物全体の処理用に施用できる。
細胞を[]標害虫環境に施用する時に殺虫活性を長くす
るために、H,L.PSR5A]又はB、t.PS85
Al−168細胞、叉はそれらの変異種を処方に先立っ
て処理できる。このような処理は、手法が殺虫剤の性状
に悪影響しない限り、v、は殺虫剤を保護する細胞能力
を消滅させない限り、化学的叉は物理的手段、叉は1ヒ
学・物理的手段の矧み合わせてありうる。
化学試薬の例はハロゲン化剤、特に原子番号17−80
のハロゲン類である。更に詳しくは、ヨウ素を温和な条
件下に、所望の結果を達成ζろのに十分な時間に使用で
きる。他のi車当な手法は、ボルムアルデヒドとクルタ
ルアルデヒドのようなアルデヒド類;塩化ゼフィランの
ような抗感染薬;イソプロピル7′ルコールと上タノー
ルのようなアル:1−ル類;ボウイン同定?αやヘリ−
固定γαのような種々の組織学的固定液(フマソン、ク
レッチェンーxル(Humason、Gretchen
 I7.)「動物組織の手法」ダブリュー・工・ソチ・
フリーマン社、I!767年、を参照);又は目標害虫
環境に細胞を施用する時に細胞内につくられる毒素の活
性を長びかせるような物理的手段(加熱)及び化学的薬
剤の組み合わせによる処理を包含する。物理的手段の例
は、カンマ線とX線のような短波長の放Q」線、凍結、
Uv即利、凍結乾燥等である。
〔実施例〕
Vノ1下(J、本発明の実施手順を例示した実施例であ
り、この手順には最善の態様も含まれている。
これらの実施例は、限定的シこ考えられてはならな〜 
14− い。他に注意がなけれは、全ての百分率は重量に、また
すべての溶媒混合物割合は容量による。
実施例I  R,?.PSF15AI(NRRL B−
18426)又はB、?.PS85A]168(NRR
L B−18427)の培養B、t、l’585AI(
NRRL R−18420>叉はB、t.PS85Al
−168(NRRL [(−18427)の二次培養基
を使用して次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・塩
培地に接種した。
ハクト・ペプトン    7.5 g/lフ゛ ト ウ
 糖                   1.0 
 g/lK112pH,3,4g/l K2+IPOA          4.35 g/l
塩溶液         5.0 ml/lCaCl2
1W il         5.Oml/l塩溶液(
100ml) MgSO,・711PO2,46y。
Mn5O,、−8200,04g ZnSO,−78200,28g FeSO,、−711200,40g (aclp溶液(100ml) CaC12−211203,66g pH7,2 塩溶液とCaCl2溶液な濾過滅菌し、オートクレーブ
処理し調理したフロスに、接種時に添加する。
20Orpmで操作される回転振どう機で、フラスコを
30℃、64時間培養する。
上の手順は、この技術で周知の手順により2大発酵装置
まで容易に規模拡大できる。
上の発酵で得られるB、t、胞子及び/又は結晶は、こ
の技術で周知の手順により単離できる。しばしば用いら
れる手順は、取り入れた発酵液を分離手順、例えは遠心
分離にかけることである。
実施例2  B、t.PS85Al(NRRLR−18
426)胞子及び結晶の試験 8、t.PSR5AI(NRRL B−18421i)
胞子及び結晶をコナガ(+Iaimondaback 
mof、h、 IIBM)に対して試験した。
B、t.PS85Alは−168M検定でm1当たり蛋
白質0.02G71gのLC5oをもっている。検定を
次のように行なった。
プルテラ・キシ1コステラ生物検定:胞子及び結晶ベレ
ットの希釈物をつくり、合衆国農務省の昆虫t@(技術
フレティン1528、合衆国a務省)と混合し、小ざな
プラスチックトレーに注いだ。脱皮中の第二齢幼虫を餌
混合物上に買き、25℃に保持する。死亡率を4日後に
記録する。
実施例;3B.スリンギエンシスPS85AI−168
変異種を得るための、B、スリンギエンシスPS85A
1の変異誘発 野性型B.スリンギエンシスPS85Alの非胞子形成
変異種は、エチルメタンスルホネート(EMS)変!A
誘発を通して得られた。使用手順は、ワキサカ[ワキサ
カ・ワイ(Wakisaka、 V、)(1982年)
「高収率のδ−エンドトキシンをつくる非胞子形成性バ
シラス・スリンキニンシス変異種J App1、 an
d Environmenf、al Microbio
logy 1498−15001に記述されたものの変
法であった。手順は以下のとおりである。
1、野性型口、スリンギエンシスPS85A11?:凍
結バイアルから直接に栄養寒天培地へ筋状に播種した。
2、次にプレートを30℃で72時間培養した。
3、胞子を無菌の0.05M PO4緩衝液(pH7,
0)で取り入れた。
4、次に、懸濁液を10 mlずつの5本の7リコート
に分けて、変異した胞子数を測定するためにフ゛レート
カウントを行なった。
5、次に5試料を15分間70°Cの水浴にさらして、
存在する増5ti間の細胞を殺菌した。
6、EMS(シグマ化学会社から人手したもの)を添加
したのは、これらの処理済み試料に対してである。ある
範囲の投与量を用いた。
?、EMS添加後、試料を30℃、:350 rpmで
18時間培養した。
8、次に、処理培養基を無菌蒸留水で2回洗った(8,
000 rpmで5分の遠心分*)。
9、次に最終ベレットを無菌蒸留水と40χクリセロー
ル中に再懸濁し、−70℃で保存した。
変異誘発を完了後、変異細胞を栄養培地に蒔いた。48
時間の培養期間後、集落を無作為に選ひ、所望の表現型
を求めて顕微鏡検査した。5po−cry’変異種が見
つかったら、これを栄養寒天培地上で二次培養基とし、
事実これか5IIO−Cr!/”であることを確認ずろ
ために48時間培養した。これが確認されたら、培養基
を保存用に調製し、発見された+110序に番号を付し
た。欧に、これらの菌株を生産培地中での一次選定にか
けた。生産的(毒素生産の点て)かつ非胞子形成的であ
るとわかった場合は、更に試験を行なった。これらの試
験は、最善の胞子マイナス変異種を単離するために課せ
られた基準に基づいて開発されたものである。この基準
は次のとおりである。すなわち非胞子形成的;野性型と
同じ、叉はそれ以ヒの毒素生産;野性型と同じ、又はそ
れ以トの特異的活性;低い復帰変異頻度;β−エキソト
キシンな生産しないこと;溶菌しないこと。これまで、
B.スリンギエンシスPS85Aill’i8は5pa
−cry+表現型を維持しており、野性型と同じ、又は
それより多量の毒素を一員して生産しており、野性!i
g B.スリンギエンシスPS85Alに等しい特異的
活性を維持し、]Oel+の復帰変異頻度をもち、生産
培地中でβ−エキソトキシンマイナスかつ溶菌マイナス
であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
第1図は、B、t、Hrl−1及UB、 t、 、 P
 585A I カe〕(Dプラスミド製剤の7力ロー
スゲルt4気体動の写真である。 a、 B、t、HD−1未切断。 b、 llindmで切断されたB、書4. I+ 1
1−1゜c、 R,t.PS85AI未切断。 d、 Hindmで切断されたR、f、、I’5F15
AI。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、NRRLB−18426の確認特性をもったB.ス
    リンギエンシスPS85A1、又はその変異種の昆虫防
    除有効量を鱗翅類の昆虫の害虫に接触させることを含め
    てなる、鱗翅類の昆虫の害虫の防除法。 2、該害虫が鱗翅目に属している、特許請求の範囲第1
    項に記載の方法。 3、該昆虫の害虫がコナガ(diamondback 
    moth)である、特許請求の範囲第2項に記載の方法
    。 4、害虫が食べることがわかっている植物を播種する時
    に、B.スリンギエンシスPS85A1を粒状餌に混入
    して、土上に置くか又は土中に入れることにより、B.
    スリンギエンシスPS85A1又はその変異種の昆虫防
    除有効量に該昆虫の害虫を接触させる、特許請求の範囲
    第1項に記載の方法。 5、(1)B.スリンギエンシスPS85A1又はその
    変異種の胞子又は結晶を含めてなる粒状餌をつくり;か
    つ (2)該粒状餌を土上に置くか又は土中に入れる; ことを含めてなる、土壌に生息する鱗翅目害虫の防除法
    。 6、該粒状餌が土中にトウモロコシ種子を蒔くのと同じ
    時期に施用される、特許請求の範囲第5項に記載の方法
    。 7、実質的に無傷のB.t.PS85A1細胞又はその
    変異種が、目標害虫環境に施用される時に、殺虫活性を
    のばすために処理される、特許請求の範囲第1項又は第
    5項に記載の方法。 8、殺虫剤担体と組み合わせたB.スリンギエンシスP
    S85A1、又はその変異種、胞子又は結晶を含めてな
    る物質の組成物。 9、該担体が甲虫の食欲刺激剤又は誘引剤を含めてなる
    、特許請求の範囲第8項に記載の物質の組成物。 10、種子被覆剤として使用される処方剤成分と組み合
    わせたB.スリンギエンシスPS85A1又はその変異
    種を含めてなる、物質の組成物。 11、鱗翅目昆虫害虫に対して活性のあるNRRLB−
    18426の確認特性をもったB.スリンギエンシスP
    S85A1、又はその変異種。 12、該鞘翅類害虫が貯蔵製品上に存在する、特許請求
    の範囲第1項に記載の方法。 13、NRRLB−18426の確認特性をもったB.
    スリンギエンシスPS85A1によって生産される、鱗
    翅類害虫に対して活性のある毒素。 14、該変異種が非胞子形成変異種である、特許請求の
    範囲第1項に記載の方法。 15、該非胞子形成変異種がB.t.PS85A1−1
    68と指定される、特許請求の範囲第14項に記載の方
    法。 16、該変異種が非胞子形成変異種である、特許請求の
    範囲第5項に記載の方法。 17、該非胞子形成変異種がB.t.PS85A1−1
    68と指定される、特許請求の範囲第16項に記載の方
    法。 18、該変異種が非胞子形成変異種である、特許請求の
    範囲第7項に記載の方法。 19、該非胞子形成変異種がB.t.PS85A1−1
    68と指定される、特許請求の範囲第18項に記載の方
    法。 20、殺虫剤担体と組み合わせたB.スリンギエンシス
    PS85A1の非胞子形成変異種、又はその変異種、又
    は結晶を含めてなる物質の組成物。 21、該非胞子形成変異種が、殺虫剤担体と組合わせた
    バシラス・スリンギエンシスPS85A1−168、又
    はその変異種、胞子、及び/又は結晶と指定される、特
    許請求の範囲第20項に記載の物質の組成物。 22、該担体が甲虫の食欲刺激剤又は誘引剤を含めてな
    る、特許請求の範囲第21項に記載の物質の組成物。 23、該変異種が非胞子形成変異種である、特許請求の
    範囲第10項に記載の組成物。 24、該非胞子形成変異種がB.t.PS85A1−1
    68と指定される、特許請求の範囲第23項に記載の組
    成物。 25、バシラス・スリンギエンシスPS85A1又はそ
    の変異種の、非胞子形成変異種。 26、特許請求の範囲第25項に記載のバシラス・スリ
    ンギエンシスPS85A1の非胞子形成変異種であるバ
    シラス・スリンギエンシスPS85A1−168。
JP1275131A 1988-10-25 1989-10-24 鱗翅目に活性な新規なバシラス・スリンギエンシス分離体 Pending JPH02270804A (ja)

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