JP2722236B2 - 新規な鞘翅目に活性のバシルス チューリンゲンシス単離体 - Google Patents

新規な鞘翅目に活性のバシルス チューリンゲンシス単離体

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 バシルス チューリンゲンシス(B.t.)は、δ−エン
ドトキシンとして命名される昆虫毒素を生産する。これ
はB.t.胞子形成細胞によって合成される。この毒素は、
その結晶形で感受性の昆虫の幼虫によって摂取された時
に、昆虫の消化管の消化液、蛋白分解酵素によって生物
学的に活性の部分に変換される。主要な標的は、消化管
の上皮の昆虫細胞で急速に殺される。
〔従来の技術〕
B.t.の報告されている活性スペクトラムは、鱗翅目内
の昆虫種をカバーしているが、これの多くは農業及び林
業に於ける主要な害虫である。活性スペクトラムはま
た、蚊及びブヨを含んでいる双翅目の昆虫も含んでい
る。コーチ,ティー.エル.(1980)「モスキート パ
ソゲニシティー オブ バシルス チューリンゲンシス
var.イスラエレンシス」(Developments in Industri
al Microbiology 22:61−76;ビーグル,シー.シー.,
(1978)「ユース オブ エントモゲナス バクテリア
イン ア グロエコシステムズ」Developments in In
dustrial Microbiology 20:97−104、クリーグ等、Z.an
g.Ent.(1983)96:500−508、を参照。これらは、B.t.
単離体であって、バシルス チューリンゲンシス var.
テネブリオニスと命名されているものを記載し、これは
鞘翅目の二つの甲虫に対し、活性であると報告されてい
る。これらはコロラド ポテト ビートル、Leptinotar
sa decemlineata、及びAgelastica alniである。
ヨーロッパ特許出願0 202 739には、新規な鞘翅目に
対し活性のあるB.t.単離体が開示されている。これはバ
シルス チューリンゲンシス var.サンジエゴ(B.t.s
d.)として知られている。
B.t.sd.などの鞘翅目に活性の系統は葉を食べる甲虫
を抑制するのに使用できる。コロラド ポテト ビート
ル(Leptinotarsa decemlineata)は、例えばB.t.sd.の
δ−エンドトキシンに対し感受性であり、幼虫は処理さ
れた葉っぱ上の胞子/結晶調製物の充分な投与物を摂取
することによって殺される。
数多くの作物が蛋甲虫によって攻撃される。これらの
甲虫はハムシ科decemlineataに属する。成虫は葉っぱを
食べることによって甚大な被害を生じる。
〔課題を解決する手段〕
本発明は新規なバシルス チューリンゲンシス(B.
t.)単離体であって、鞘翅類の害虫に対し活性を有する
ものに関する。例えば、新規なB.t.単離体はバシルス
チューリンゲンシスPS86B1(B.t.PS86B1)として本明細
書で知られており、これまでコロラド ポテト ビート
ル(Leptinotarsa decemlineata)に対し活性であるこ
とが示されている。より広範な宿主範囲研究は進行中で
ある。
本明細書はまた、B.t.PS86B1と同じ殺虫性を実質的に
有するB.t.PS86B1の突然変異体を包含する。突然変異体
を作る手順は微生物技術に於いて良く知られている。紫
外線及びニトロソグアニジンは、この目的に広く使用さ
れている。
更に、本発明は実質的に無傷の細胞(細胞壁が破壊さ
れていない細胞)が標的害虫の環境に適用されたときに
殺虫活性を長期化するために実質的に無傷のB.t.PS86B1
細胞を処理することも含む。そのような処理は、技法が
殺虫剤の性質に悪影響しない限り、そして殺虫剤を保護
する事に於いて細胞の能力を減少させない限り、化学的
又は物理的手段か、又は化学的又は物理的手段の組み合
わせによることが出来る。処理されたB.t.PS86B1細胞
は、殺虫毒素に対する保護被膜として作用する。この毒
素は標的昆虫によって摂取されたときに、そのまま作用
する様に出来るようになる。
本発明の新規なバシルス チューリンゲンシス単離体
は、次の特性を有している。
B.t.PS86B1の特性 コロニーの形態‥‥大きなコロニー、鈍い色の表面、典
型的なB.t.。
生育細胞形態‥‥典型的なB.t.。
培養方法‥‥B.t.に対し典型的なもの。
鞭毛血清型‥‥PS86B1はセロバール(serovar)、トル
ウァーシ(tolworthi)に属する。
封入体‥‥非屈折性の平坦なとがった楕円、プラス幾つ
かの非常に小さな封入体。
プラスミド製造‥‥アガロースゲル電気泳動のプラスミ
ド調製により、B.t.PS86B1はB.t.sd.及び他のB.t.単離
体から区別された。
アルカリ可溶性蛋白質‥‥SDSポリアクリルアミドゲル
は、61,000、68,000及び75,000ダルトンの蛋白質を示し
た。
鞘翅目の毒素‥‥生物検定はコロラド ポテト ビート
ルに対してLC50が8.4μg/mlの活性を示した。
良く知られたB.t.の系統、即ちB.チューリンゲンシス
var.クルスタキ(HD−1)、B.チューリンゲンシス
var.サンジエゴ(B.t.sd.)とB.チューリンゲンシスPS8
6B1(B.t.PS86B1)との特性の比較が表1に示される。
本明細書に開示された培養基は、アメリカ合衆国6160
4イリノイ州 ペオリア ノース ユニバーシティー 1
815のノーザン リージョナル リサーチセンターのア
グリカルチュラル リサーチ サービス パテント カ
ルチャー コレクション(NRRL)中に寄託されている。
この培養基は、37 CFR 1.14及び35 U.S.C.122の下に
権限があると米国特許商標庁長官によって決定された人
に、この特許出願の係属中に培養基の入手が可能である
事を認める条件下に寄託されている。この寄託物はその
米国出願の対応出願、又はその子孫が出願されている米
国以外の国々の特許法によって要求されるならば入手可
能である。しかしながら、寄託物が入手できる事は、行
政行為によって付与された特許権を侵してその発明を実
施する実施権を構成するものではないことが理解される
べきである。
更に、培養基寄託物は微生物の寄託に対するブタペス
ト条約の条項に従って保存され、一般に入手可能とされ
る。即ち寄託物は、寄託物が生きており、そして汚染さ
れていない様に保つのに必要なあらゆる注意をもって、
寄託物の試料を提供する最も最近の要求の後少なくとも
5年間、そしてどんな場合にも少なくとも寄託の日後30
年間の期間又は培養基を開示している発行されるあらゆ
る特許の権利行使可能な寿命の間保存される。寄託者
は、寄託所が寄託物の状態のために要求されたときに試
料を提供する事が出来ない事がある場合には、寄託物を
置き換える義務がある事を認める。この培養基寄託物の
一般への入手可能性に対する全ての制限は、これを開示
している特許が付与されることによって永久に除かれ
る。
B.t.PS86B1,NRRL B−18299は、この技術の標準の培地
及び発酵技術を用いて培養できる。発酵サイクルが完了
すると、細菌はまずB.t.胞子及び結晶をこの技術で良く
知られた手段によって発酵ブロスから分離する事によっ
て収穫できる。回収されたB.t.胞子及び結晶は水和粉
末、液体濃縮物、顆粒、又は他の処方に表面活性剤、分
散剤、不活性担体及び取り扱いと特定の標的害虫に対す
る適用とを容易にする他の成分を加える事によって処方
する事が出来る。これらの処方及び適用方法は、この技
術で全て良く知られている。
処方された生成物は、植物を食べる甲虫又は幼虫を抑
制するために葉の上にスプレーするか又は適用される。
用いる事が出来る他の方法は、B.t.PS86B1の胞子及び
結晶を誘引剤を含有している餌顆粒中に混入し、そして
これらの顆粒を土壌に住む鞘翅目を抑制するための土壌
に適用する事である。処方されたB.t.PS86B1はまた、種
子被覆又は根の処理又は全植物の処理として適用する事
も出来る。
B.t.PS86B1細胞は、細胞が標的害虫の環境に適用され
るときに、殺虫活性を長期化するために処方の前に処理
される事が出来る。そのような処理は化学的手段、物理
的手段によるか、又は化学的及び/又は物理的手段の組
み合わせであって、そのような技術が殺虫剤の性質に悪
影響を及ぼさず、また殺虫剤を保護する上での細胞の能
力を減少させない限り用いる事が出来る。化学薬剤の例
は、ハロゲン化剤、特に原子番号17〜80のハロゲンであ
る。より詳しくは、ヨウ素を温和な条件下で所望の結果
を達成するのに充分な時間使用する事が出来る。他の適
当な技術には、アルデヒドでの処理、例えばホルムアル
デヒド及びグルタルアルデヒドでの処理、抗感染剤、例
えばゼフィランクロライド、アルコール、例えばイソプ
ロピルアルコール及びエタノール、種々の組織学的な固
定剤、例えばボウインの固定剤及びヘリーの固定剤(ヒ
ューマソン,グレッチェン.エル.、動物組織技術、ダ
ブリュー.エッチ.フリーマン及びカンパニー、1967を
参照)での処理、又は物理的(加熱)及び化学剤の組み
合わせであって、細胞が標的害虫の環境に適用されたと
きに細胞中で生産される毒素の活性を長期化させるもの
での処理が含まれる。物理的な手段の例は、短波長照
射、例えばγ線照射及びX線照射、凍結、紫外線照射、
凍結乾燥などである。
以下は本発明を実施するために最良の態様を含めた手
順を説明する実施例である。これらの実施例は制限する
ものとは解釈されるべきでない。全てのパーセントは重
量により、全ての溶媒混合割合は他に記載されていない
限り容量による。
〔実施例〕
実施例1−B.t.PS86B1,NRRL B−18299の培養 B.t.PS86B1,NRRL B−18299のサブカルチャーを次の培
地、即ちペプトン、グルコース、塩培地に摂取するのに
使用する事が出来る。
バクトペプトン 7.5g/l グルコース 1.0g/l KH2PO4 3.4g/l K2HPO4 4.35g/l 塩溶液 5.0ml/l CaCl2溶液 5.0ml/l 塩溶液(100ml) MgSO4・7H2O 2.46g MnSO4・H2O 0.04g ZnSO4・7H2O 0.28g FeSO4・7H2O 0.40g CaCl2溶液(100ml) CaCl2・2H2O 3.66g pH7.2 塩溶液及びCaCl2溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ
して焼いたブロスに摂取の時に加えた。フラスコを30℃
で回転シェーカー上で200rpmにおいて64時間培養した。
上記の手順はこの技術で良く知られた方法によって、
大規模発酵器に容易にスケールアップする事が出来る。
上の発酵で得られたB.t.胞子及び結晶は、この技術で
良く知られた手順によって単離する事が出来る。良く用
いられる手順は収穫された発酵ブロスを分離技術、例え
ば遠心分離にかけることである。
実施例2−B.t.PS86B1,NRRL B−18299胞子及び結晶の試
験 B.t.PS86B1,NRRL B−18299胞子及び結晶は、コロラド
ポテト ビートル(CPB)に対し試験された。B.t.PS8
6B1はCPB検定に於いてLC508.4μg/mlを有した。コロラ
ド ポテト ビートルに対する検定は、次の様に実施さ
れた。
CPB生物検定−レプティノタルサ デセムリネアタ(L
eptinotarsa decemlineata)の初期の第二齢幼虫をバシ
ルス チューリンゲンシス調製物を含有している懸濁液
中に浸しておいた馬鈴著の葉上に置いた。幼虫を25℃で
4日間孵化し、幼虫の死亡率を記録し、プロビット分析
を用いて検定した。
【図面の簡単な説明】
第1図はB.t.sd.とB.t.PS86B1からのアルカリ可溶蛋白
の標準SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真であ
り、 第2図はB.t.PS86B1及びB.t.sd.からのプラスミド調製
物のアガロースゲル電気泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 //(C12N 1/20 C12R 1:07) (72)発明者 ジョージ ジー.ソアレス アメリカ合衆国 92129 カリフォルニ ア州 サン ディエゴ バックホィート コート 12620 (56)参考文献 特開 昭62−51981(JP,A) 欧州公開202739(EP,A1) FEMS Microbiology Letters vol.48(1987) p.311−315 Nucleic Acids Res earch vol.15(1987)p. 7183

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】鞘翅目の昆虫の害虫を、NRRL B−18299の
    同定特性を有するバシルス チューリンゲンシス(Baci
    llus thuringiensis)PS86B1又は該PS86B1と実質的に同
    じ活性を有するその突然変異体からの毒素の昆虫抑制有
    効量と接触させることからなる鞘翅目昆虫の害虫を抑制
    する方法。
  2. 【請求項2】上記昆虫の害虫を、昆虫抑制充分量のバシ
    ルス チューリンゲンシスPS86B1と接触させるにあたっ
    て、上記バシルス チューリンゲンシスPS86B1を餌の顆
    粒中に入れ、そしてその顆粒を昆虫の害虫が食べること
    が知られている植物の種子を植えるときに土壌上に置く
    か又は土壌中に入れることによって接触させる特許請求
    の範囲第1項に記載の方法。
  3. 【請求項3】(1)バシルス チューリンゲンシスPS86
    B1又は該PS86B1と実質的に同じ活性を有するその突然変
    異体、またはそれからの胞子又は結晶を含む餌顆粒を調
    製し、そして、(2)その餌顆粒を土壌上又は土壌中に
    入れることからなる鞘翅目の土壌に生息する昆虫害虫を
    抑制する方法。
  4. 【請求項4】上記餌顆粒が土壌中にトウモロコシの種が
    植えられると同じ時期に適用される特許請求の範囲第3
    項に記載の方法。
  5. 【請求項5】実質的に無傷のバシルス チューリンゲン
    シスPS86B1又は該PS86B1と実質的に同じ活性を有するそ
    の突然変異体の細胞が、該細胞が標的害虫の環境に適用
    されるときに殺虫活性を持続するように処理される特許
    請求の範囲第1項又は第3項に記載の方法。
  6. 【請求項6】殺虫剤担体と組み合わせたバシルス チュ
    ーリンゲンシスPS86B1、又は該PS86B1と実質的に同じ活
    性を有するその突然変異体、又はそれらからの胞子又は
    結晶を含んでいる組成物。
  7. 【請求項7】上記担体が甲虫食刺激剤又は誘引剤を含ん
    でいる特許請求の範囲第6項に記載の組成物。
  8. 【請求項8】種子被覆として適用される処方成分と組み
    合わせたバシルス チューリンゲンシスPS86B1、又は該
    PS86B1と実質的に同じ活性を有するその突然変異体を含
    んでいる組成物。
  9. 【請求項9】鞘翅目の昆虫害虫に対し、活性を有するNR
    RL B−18299の同定特性を有するバシルス チューリン
    ゲンシスPS86B1、又は該PS86B1と実質的に同じ活性を有
    するその突然変異体。
  10. 【請求項10】鞘翅類の害虫が貯蔵産物上に存在する特
    許請求の範囲第1項に記載の方法。
  11. 【請求項11】鞘翅類の害虫がコロラド ポテト ビー
    トルである特許請求の範囲第1項に記載の方法。
  12. 【請求項12】NRRL B−18299の同定特性を有するバシ
    ルス チューリンゲンシスPS86B1によって製造される、
    鞘翅目害虫に対し活性の毒素。
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