JPH02288814A - 新規な鞘翅目に活性のバシルス チューリンゲンシス単離体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 バシルス　チューリンケンシス（１３，ｔ、）は、δ−
エンドトキシンとして命名される昆虫毒素を生産する。

これは８．ｔ、胞子形成細胞によって合成される。

この毒素は、その結晶形で感受性の昆虫の幼虫によって
摂取された時に、昆虫の消化管の消化液、蛋白分解酵素
によって生物学的に活性の部分に変換される。主要な、
標的は、消化管の上皮の昆虫細胞で急速に殺される。

（従来の技術〕 ｅ、ｔ、の報告されている活性スペクトラムは、鱗翅目
内の昆虫種をカバーしているが、これの多くは農業及び
林業に於ける主要な害虫である。活性スペクトラムはま
た、蚊及びブヨを含んでいる双翅目の昆虫も含んでいる
。コーチ、ティー、エル。

（１９８０）　ｒモスキード　パソゲニシティー　オブ
バシルス　チューリンゲンシスｖａｒ、イスラエレンシ
スＪ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂ＋ｏｌｏｇｙ２２　：　６１−
７６　；ビーグル、シー、シー０．　（１９７８）　ｒ
ユースオブエントモゲナスバクテリア　インアグロエコ
システムズＪ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　１ｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　２０：
　９７−１０４、クリーブ等、Ｚ　、　ａｎｇ、　Ｅｎ
ｔ、　（１９８３）　９６：　５００−５０８、を参照
。これらは、Ｂ、ｔ、単離体であって、バシルス　チュ
ーリンゲンシスｖａｒ、テネブリオニスと命名されてい
るものを記載し、これは鞘翅目の二つの甲虫に対し、活
性であると報告されている。これらはコロラドポテト　
ビートル、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉ
ｎｅａｔａＳ及びＡｇｅｌａｓｔｉｃａ　ａｌｎｉであ
る・ヨーロッパ特許出願０２０２７３９には、新規な鞘
翅目に対し活性のあるＢ、ｔ、単離体が開示されている
。これはバシルス　チューリンゲンシスｖａｒ、サンジ
エゴ（Ｂ、ｔ、Ｓｄ、）として知られている。

Ｂ、ｔ、ｓｄ、などの鞘翅目に活性の系統は葉を食べる
甲虫を抑制するのに使用できる。コロラドポテト　ビー
トル（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅ
ａｔａ）は、例えばＢ、ｔ、ｓｄ、のδ−エンドトキシ
ンに対し感受性であり、幼虫は処理された葉っは上の胞
子／結晶調製物の充分な投与物を摂取することによって
殺される。

数多くの作物が蚤甲虫によって攻撃される。これらの甲
虫はハムシ科ｒｌｅｃｅｍｌ　１ｎｅａｔａに属する。

成虫は葉っばを食べることによって甚大な被害を生じる
。

〔課題を解決する手段〕

本発明は新規なバシルスチューリンゲンシス（Ｂ、ｔ、
）単離体であって、鞘翅類の害虫に対し活性を有するも
のに関する。例えば、新規なり　、　ｔ、　、単離体は
バシルス　チューリンゲンシスＰＳ８６Ｂ１（Ｂ、ｔ、
ＰＳ８６８１）として本明細書で知られており、これま
でコロラドポテト　ビートル（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓ
ａ　ｄｅｃｅｍｎｅａｔａ）に対し活性であることが示
されている。

より広範な宿主範囲研究は進行中である。

本明細書はまた、Ｂ、ｔ、、ＰＳ８６Ｂ１と同じ殺虫性
を実質的に有するＢ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ１の突然変異体を
包含する。

突然変異体を作る手順は微生物技術に於いて良く知られ
ている。紫外線及びニトロソグアニジンは、この目的に
広く使用されている。

更に、本発明は実質的に無傷の細胞（細胞壁が破壊され
ていない細胞）が標的害虫の環境に適用されたときに殺
虫活性を長期化するために実質的ζこ無傷のＢ、ｔ、Ｐ
Ｓ８６Ｂ＋細胞を処理することも含む。

そのような処理は、技法が殺虫剤の性質に悪影響しない
限り、そして殺虫剤を保護する事に於いて細胞の能力を
減少させない限り、化学的又は物理的手段か、又は化学
的又は物理的手段の組み合わせによることが出来る。処
理されたＢ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ＋細胞は、殺虫毒素に対す
る保護被膜として作用する。

この毒素は標的昆虫によって摂取されたときに、そのま
ま作用する様に出来るようになる。

本発明の新規なバシルス　チューリンゲンシス単離体は
、次の特性を有している。

Ｂ、ｔ、Ｉ’５８６ＢＩの特性 コロニーの形態・・・・大きなコロニー、鈍い色の表面
、典型的なり　、　ｔ、　、。

生育細胞形態・・・・典型的なり、ｔ、。

培養方法・・・・Ｂ　、　ｔ、　、に対し典型的なもの
。

鞭毛血清型・−・ＰＳ８６Ｂ＋はセロバール（ｓｅｒｏ
ｖａｒ）、ｌ・ルウアーシ（ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ）に属
する。

封入体・・・・非屈折性の平坦なとかった楕円、プラス
環つかの非常に小さな封入体。

プラスミド製造・・・・アガロースケル電気泳動のプラ
スミド調製により、Ｂ、ｔ、ＰＳ８６８１はＢ、ｔ、ｓ
ｄ。

及び他のＢ、ｔ、単離体から区別された。

アルカリ可溶性蛋白質・・・・Ｓ［ｌＳポリアクリルア
ミドゲルは、６１，０００．６８　、０００及び７５，
０００ダルトンの蛋白質を示した。

鞘翅類の毒素・・・・生物検定はコロラＩ・　ボテドビ
ートルに対してＬＣ５ｏが８．４Ｉｚｇ／ｍｌの活性を
示した。

良く知られたＢ　、　ｔ、　、の系統、即ちＢ、チュー
リンケンシス　ｖａｒ、クルスタキ（＋１Ｏ−１）、Ｂ
、チューリンゲンシス　ｖａｒ、サンジエゴ（Ｂ、ｔ、
Ｓｄ、）とＢ、チューリンケンシスＰＳ８６Ｂ１（Ｂ、
ｔ、ＰＳ８６Ｂ＋）との特性の比較が表１に示される。

表　Ｉ　　Ｂ、ｔ、ＨＤ−１、Ｂ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ１、
及びＢ、ｔ、ｓｄ、の比較 血清型　　　クルスタキ　）・ルウアーシ　モリソニ本
明細書に開示された培養基は、アメリカ合衆国６１６０
４イリノイ州ベオリア　ノース　ユニバージティー　１
８１５のノーザン　リージョナル　リサーチセンターの
アグリカルチュラル　リサーチ　リ゛−ヒス　パテント
　カルチャー　コレクション（ＮＲＲＬ）中しこ寄託さ
れている。

この培養基は、３７　ＣＦＲ１，１４及び３５１Ｊ、ｓ
、ｃ、　＋２２の下に権限があると米国特許商標庁長官
によって決定された人に、この特許出願の係属中に培養
基の入手が可能である事を認める条件下に寄託されてい
る。この寄託物はその米国出願の対応出願、又はその子
孫が出願されている米国以外の国々の特許法によって要
求されるならば人手可能である。

しかしながら、寄託物が入手できる事は、行政行為によ
って付与された特許権を侵してその発明を実施する実施
権を構成するものではないことが理解されるべきである
。

更に、培養基寄託物は微生物の寄託ζこ対するブタペス
Ｉ・条約の条項に従って保存され、−・般に人手可能と
される６１！ｌ］ち寄託物は、寄託物が生きており、そ
して汚染されていない様に保つのに必要なあらゆる注意
をもって、寄託物の試料を提供する最も最近の要求の後
少なくとも５年間、そしてどんな場合にも少なくとも寄
託の日後３０年間の１！ｎ間又は培養基を開示している
発行されるあらゆる特許の権利行使可能な寿命の間保存
される。寄託者は、寄託所が寄託物の状態のために要求
されたときに試料を提供する事が出来ない事がある場合
には、寄託物を置き換える義務がある事を認める。

この培養基寄託物の一般への入手可能性に対する全ての
制限は、これを開示している特許が付与されることによ
って永久に除かれる。

Ｂ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ１．　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２９９は
、この技術の標準の培地及び発酵技術を用いて培養でき
る。発酵サイクルが完了すると、細菌はまずＢ、ｔ、胞
子及び結晶をこの技術で良く知られた手段によって発酵
ブロスから分離する事によって収穫できる。回収された
Ｂ、ｔ、胞子及び結晶は水和粉末、液体濃縮物、顆粒、
又は他の処方に表面活性剤、分散剤、不活性担体及び取
り扱いと特定の標的害虫に対する適用とを容易にする他
の成分を加える事によって処方する事が出来る。これら
の処方及び適用方法は、この技術で全て良く知られてい
る。

処方された生成物は、植物を食べる甲虫又は幼虫を抑制
するために葉の上にスプレーするか又は適用される。

用いる事が出来る他の方法は、Ｂ、ｔ、、ＰＳ８６Ｂ１
の胞子及び結晶を誘引剤を含有している餌顆粒中に混入
し、そしてこれらの顆粒を土壌に住む鞘翅目を抑制する
ための土壌に適用する事である。処方されたＢ、ｔ、Ｐ
Ｓ８６Ｂ１はまた、種子被覆又は根の処理又は全植物の
処理として適用する事も出来る。

Ｂ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ１細胞は、細胞が標的害虫の環境に
適用されるときに、殺虫活性を長期化するために処方の
前に処理される事が出来る。そのような処理は化学的手
段、物理的手段によるか、又は化学的及び／又は物理的
手段の組み合わせであって、そのような技術が殺虫剤の
性質に悪影響を及ぼさず、また殺虫剤を保護する上での
細胞の能力を減少させない限り用いる事が出来る。化学
薬剤の例は、ハロゲン化剤、特に原子番号１７〜８０の
ハロゲンである。より詳しくは、ヨウ素を温和な条件下
で所望の結果を達成するのに充分な時間使用する事が出
来る。他の適当な技術には、アルデヒドでの処理、例え
ばホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドでの処理、
抗感染剤、例えばゼフイランクロライド、アルコール、
例えばイソプロピルアルコール及びエタノール、種々の
組織学的な固定剤、例えばボウインの固定剤及びヘリ−
の固定剤（ヒューマソン、グレツチェン、エル０、動物
組織技術、ダブリュー、エッチ、フリーマン及びカンパ
ニー、１９６７を参照）での処理、又は物理的（加熱）
及び化学剤の絹み合わせであって、細胞が標的害虫の環
境に適用されたときに細胞中で生産される毒素の活性を
長期イヒさせるものでの処理が含まれる。物理的な手段
の例は、短波長照射、例えばγ線照射及びＸ線照射、凍
結、紫外線照射、凍結乾燥などである。

以下は本発明を実施するために最良の態様を含めた手順
を説明する実施例である。これらの実施例は制限するも
のとは解釈されるべきでない。全てのパーセントは重量
により、全ての溶媒混合割合は他に記載されていない限
り容量による。

〔実施例〕

実施例１−Ｂ、ｔ、Ｐ３８６ＢＩ　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１
８２９９の培養Ｂ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ１．　ＮＲＲＬ、Ｂ
−１８２９９のサブカルチャーを次の培地、即ちペプト
ン、グルコース、塩培地に摂取するのに使用する事が出
来る。

バクトベプトン グルコース に１（２Ｐ０４ に２ＨＰＯ。

塩溶液 ＣａＣｌ２溶液 塩溶液（１００ｍｌ１ ００ｍ１）・７Ｈ２０ ＭｎＳ０４−８２０ ＺｎＳＯａ−７８２０ ＦｅＳＯａ４）１２０ ＣａＣＩ２溶液（１００ｍｌ） ＣａＣ１２・２Ｈ２０ ｐＨ７，２ ７，５ｇ／＋ １．０ｇ／１ ３．４ｇ／１ ４．３５ｇ／１ ５．０ｍ１１ ５．０ｍｌ／Ｉ ２．４６ｇ ０．０４ｇ ０．２８ｇ ０．４０ｇ ３．６６ｇ 塩溶液及びＣａＣｌ２溶液を濾過滅菌し、オートクレー
ブして焼いたブロスに摂取の時に加えた。フラスコを３
０℃で回転シェーカー上で２０Ｏｒｐｍにおいて６４時
間培養した。

上記の手順はこの技術で良く知られた方法によって、大
規模発酵器に容易にスケールアップする事が出来る。

上の発酵で得られたＢ、ｔ、胞子及び結晶は、この技術
で良く知られた手順によって単離する事が出来る。良く
用いられる手順は収穫された発酵ブロスを分離技術、例
えは遠心分離にかけることである。

実施例２−　Ｂ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ＋、　ＮＲＲＬ　Ｂ−
１８２９９胞子及び結晶の試験 Ｂ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ１、　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２９９胞
子及び結晶は、コロラド　ボテＩ・　ヒートル（ＣＰＢ
）に対し試験された。

Ｂ、ｔ、ＰＳ８６ＢＩはＣＰＢ検定に於いてＬＣｓｏ８
．４　）１ｇ／ｍｌを有した。コロラド　ポテト　ヒー
トルに対する検定は、次の様に実施された。

ＣＰＢ生物検定−レブティノタルサデセムリネアタ（Ｌ
ｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）
の初期の第二齢幼虫をハシルス　チューリンゲンシス調
製物を含有している懸濁液中に浸しておいた馬鈴薯の葉
上に置いた。幼虫を２５°Ｃで４日間卿化し、幼虫の死
亡率を記録し、プロヒツト分析を用いて検定した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＢ、ｔ、ｓｄ、とＢ、土、ＰＳ８（ｉＢｌから
のアルカリ可溶蛋白の標準ＳＤＳポリアクリルアミドケ
ル電気泳動の写真であり、 第２図はＢ、ｔ、ＰＳ８６Ｂ＋及びＢ、ｔ、ｓｄ、から
のプラスミド調製物のアガロースゲル電気泳動の写真で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、鞘翅目の昆虫の害虫を昆虫抑制有効量のＮＲＲＬ　
   Ｂ−１８２９９の同定特性を有するバシルスチューリン
   ゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
   ｉｓ）ＰＳ８６Ｂ１又はその突然変異体と接触させるこ
   とからなる鞘翅目昆虫の害虫を抑制する方法。 ２、上記昆虫の害虫が鞘翅目に属する特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。 ３、上記昆虫の害虫を、昆虫抑制充分量のバシルスチユ
   ーリンゲンシスＰＳ８６Ｂ１と接触させるにあたって、
   上記バシルスチューリンゲンシスＰＳ８６Ｂ１を餌の顆
   粒中に入れ、そしてその顆粒を昆虫の害虫が食べること
   が知られている植物の種子を植えるときに土壌上に置く
   か又は土壌中に入れることによって接触させる特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 ４、（１）バシルスチューリンゲンシスＰＳ８６８１又
   はその突然変異体、胞子又は結晶を含む餌顆粒を調製し
   、そして （２）その餌顆粒を土壌上又は土壌中に入れることから
   なる鞘翅目の土壌に生息する昆虫害虫を抑制する方法。 ５、上記餌顆粒が土壌中にトウモロコシの種が植えられ
   ると同じ時期に適用される特許請求の範囲第４項に記載
   の方法。 ６、実質的に無傷のバシルスチユーリンゲンシスＰＳ８
   ６Ｂ１細胞、又はその突然変異体が標的害虫の環境に適
   用されるときに殺虫活性を持続するように該細胞を処理
   する特許請求の範囲第１項又は第４項に記載の方法。 ７、殺虫剤担体と組み合わせたバシルスチューリンゲン
   シスＰＳ８６Ｂ１、又はその突然変異体、胞子又は結晶
   を含んでいる組成物。 ８、上記担体が甲虫食刺激剤又は誘引剤を含んでいる特
   許請求の範囲第７項に記載の組成物。 ９、種子被覆として適用される処方成分と組み合わせた
   バシルスチユーリンゲンシスＰＳ８６Ｂ１、又はその突
   然変異体を含んでいる組成物。 １０、鞘翅目の昆虫害虫に対し、活性を有するＮＲＲＬ
   　Ｂ−１８２９９の同定特性を有するバシルスチューリ
   ンゲンシスＰＳ８６Ｂ１、又はその突然変異体。 １１、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２９９の同定特性を有するバ
   シルスチューリンゲンシスＰＳ８６Ｂ１、又はその突然
   変異体の昆虫抑制有効量と鞘翅目の昆虫害虫を接触させ
   ることからなる鞘翅目の昆虫害虫を抑制する方法。 １２、鞘翅類の害虫が貯蔵産物上に存在する特許請求の
   範囲第１１項に記載の方法。 １３、鞘翅類の害虫がコロラドポテトビートルである特
   許請求の範囲第２項に記載の方法。 １４、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２９９の同定特性を有するバ
   シルスチューリンゲンシスＰＳ８６Ｂ１によって製造さ
   れる、鞘翅目害虫に対し活性の毒素。